遺伝子配列の１塩基の違いを見つけ出す人工遺伝子遺伝子配列の１塩基の違いを見つけ出す人工遺伝子

鳥取大学鳥取大学

大学院工学研究科大学院工学研究科

化学・生物応用工学専攻化学・生物応用工学専攻准教授准教授

櫻井櫻井

敏彦敏彦

研究背景研究背景

dsDNA

Code region

transcription

exon

intron

RNA splicingmRNA

protein

translation

nucleus

Non-coding RNA

miRNAsiRNA

miRNA gene(transcription)

mRNA

Transcription factor

・development・differentation

transcription

5’RNA

3’

5’ 3’

Nuclear export

nucleus

5’mRNA

3’

Dicer

3’5’

AAAAAA

RISC

本研究では・生体内で作用する遺伝子治療薬を目指した”新し

い人工核酸”の設計と遺伝子発現制御の誘起・これまでに、多くの人工核酸が合成されているも

のの、生体内において1塩基の違いを認識すること

ができなかった。また、細胞に対する毒性も高い。

C-terminal

ペプチド核酸(PNA)3’-end5’-end

O OP

O

Nucleobase

O

O-

N-terminal

N H

N

O

Nucleobase

O

DNA

代表的な人工核酸代表的な人工核酸

PNA・DNAやRNAとの安定な二重鎖形成能

・高いミスマッチ選択性・核酸二重鎖への相互作用

PNAの特徴である・DNAやRNAとの安定な二重鎖形成能

・高いミスマッチ選択性

遺伝子の特定箇所をターゲットとする20塩基程度では

・高い融解温度・1塩基の違いにより変化する温度域が高いTm

= 30˚C 

37˚C

Tm

= 50˚C 

8 bp

40˚C 

50˚C 

60˚C 

70˚C 

30˚C 

Tm

= 70˚C 

Tm

= 60˚C 

16 bp温度

20˚C 

ゲノム上で1カ所

特定するには

14 ‐20 bp必要

16 bpでは→37℃近傍で1塩基

認識能は示さない

従来の人工核酸モデルの問題点従来の人工核酸モデルの問題点

dsDNA

mRNAprotein

PNA-PEG conjugates

(antisense mRNA)

antigene

遺伝子の発現制御遺伝子の発現制御

PNA-PEG conjugate4~8base PNA

PEG

11塩基認識能を有する人工核酸の設計と遺伝子発現制御塩基認識能を有する人工核酸の設計と遺伝子発現制御

・pseudo long-type artifical nucleic acid model・global hybridaization

hybridization

・functionalization

・solubility・non-specific adsorption

Antigene, transcription facter modelAntisense mRNA, ncRNA inhibitor

Invasion

dsDNA

PNA

triplex duplex invasion double duplex invasion triplex invasion

homopyrimideine PNA homopurine PNA pcPNA

PNAPNAの特徴の特徴

AAAGGGGG

Purine-type PNA8 : puPNA8

HATU

COMU

純度；36.5 %

純度；60.1 %

HPLC elution profile of PNA-PEG conjugate synthesized with a) HATU and b) COMU. Condition: GLscience ODS-3 (250 x 4.6 mm), 4 ml/min, UV at 260 nm. Elute: A) 0.1 %TFA/H2 O, B) 0.1 % TFA/ACN, 5-45 % B (5-55 min).

Time (min)0 5 10 15 20 25

a)

b)

Time (min)0 5 10 15 20 25 30 35

PNAPNA合成合成

NO

N

N

CNO

O

+

PF6

-O

+

PF6

-

NO

N N

NN

N

-

+

p-NB

NNH

OO

OHO

O

O

O

Fmoc, Bhoc- protected monomer

市販の・PNAモノマー(Fmoc-PNA(Bhoc))・活性化剤(COMU) を用いて

の合成が可能・高収率・プリンリッチPNA

PNAPNA--PEGPEGコンジュゲートの塩基配列設計コンジュゲートの塩基配列設計

Ampr

pIVEX2.3d Luc+

5’ 3’

ATGLuc+T7PRBS His6 -tag

ori

T7T T7 promoter region

C N

1) ATTATGCT

PEG12

TATCCCTC

: PP_T72) ATTATGCT

PEG 12

TATCACTC

: PP_T7_MM

5’

3’

ATTAATACGA

CTCACT ATAGGGAGAC

CCATGGAAGA

CGCCAA AAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGA3)

TACCTTCT

- PEG12 -

TTTGTATT

: PP_ATG014)

TACATTCT

- PEG12 -

TTTGTATT

: PP_ATG01_MM5)

TACCTTCT

: PNA-C6) TTTGTATT

: PNA-N7)

TACCTTCTGCGGTTTT

: PNA16

8)

TACATTCTGCGGTTTT

: PNA16

_MM9)

TACCTTCTGCGGTTTT

- PEG12 : PNA16

-PEG10) TACATTCTGCGGTTTT

- PEG12 : PNA16

-PEG_MM11) TACCTTCT

PEG12

GCGACCTT

: PP_ATG02

ATG region5’

3’

T7ATG

PNAPNA--PEGPEGコンジュゲートコンジュゲート

Purity and mass analysis of PNA oligomers and PNA-PEG conjugates..

PP_T7

PP_T7_MM

PP_ATG01

PP_ATG01_MM

PNA-C

PNA-N

PNA16

PNA16 _MM

PNA16 -PEG

PNA16 -PEG_MM

PP_ATG02

Sequence

ATTATGCT-PEG12 -TATCCCTC

ATTATGCT-PEG12 -TATCACTC

TACCTTCT-PEG12 -TTTGTATT

TACATTCT-PEG12 -TTTGTATT

TACCTTCT

TTTGTATT

TACCTTCTGCGGTTTT

TACCTTATGCGGTTTT

TACCTTCTGCGGTTTT-PEG12

TACCTTATGCGGTTTT-PEG12

TACCTTCT-PEG12 -GCGACCTT

Purity (%)

95

94

92

≈

100

98

98

92

≈

100

99

99

94

4853.82

4877.84

4874.83

4898.90

2111.08

2204.11*

4301.18

4325.20

4900.86

4924.89

4854.81

4852.94

4876.86

4873.92

4897.36

2111.05

2202.90*

4300.38

4322.84

4900.94

4923.93

4851.24

Masscalcd. found

* = (M+ + Na)+

血清含有培地における安定性血清含有培地における安定性

Comparison of the stability of synDNA and typical PNA-PEG conjugate in guinea pig serum: a) synDNA (1 kbp) detected by agarose gel electrophoresis; b) PP_ATG01 detected by RPLC, and c) time dependency of intensity ratio.

a)M C 0 h 1 h 2h

b)

0 h2 h

4 h

10 15 20time / min

c)

Inte

nsity

ratio

0 2 4time / h

1.01.0

0.5

synDNA

PNA-PEG conjugate

Gene expression in cell

Reaction

T7 polymerase

ribosomes

mRNA

supply

DNAcircular

linear

mRNAuncapped

capped

・transfection・intercellular mechanism ・evaluation of gene expression

etc.

DNA

NucleusRibosome

EndosomeProtein

mRNA

PNA-PEG

Lysosome

Cell

TransfectRegants?

Complex

Toxity

PNA-PEG

Cell-free protein synthesis system

Template

Protein

無細胞蛋白質合成システム無細胞蛋白質合成システム

Ampr

pIVEX2.3d Luc+

5’ 3’

ATGLuc+T7PRBS His6 -tag

ori

T7T

T7ATG

T7 promoter region

ATTATGCT

PEG12

TATCCCTC

: PP_T7

5’

3’

ATTAATACGA

CTCACT ATAGGGAGAC

CCATGGAAGA

CGCCAA AAACATAAAG

TACCTTCT

- PEG12 -

TTTGTATT

: PP_ATG01

ATG region5’

3’ 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

control PP_T7

1 M10 M50 M

Rel

ativ

e Lu

min

esce

nce

Luminescence intensity ratio of luciferase in cell free protein synthesis system with PNA-PEG conjugate.

C N

PP_ATG01PP_T7-MM

C N

ATTATGCT

PEG 12

TATCACTC

: PP_T7-MM

遺伝子発現制御遺伝子発現制御

(1)(1)

Ampr

pIVEX2.3d Luc+

5’ 3’

ATGLuc+T7PRBS His6 -tag

ori

T7T

ATG

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

control PP_ATG01 and MM

1 M10 M50 M

Luminescence intensity ratio of luciferase in cell free protein synthesis system with PNA-PEG conjugate.

PNA16 and MM PNA-C PNA-N C & N*

( 2 M*)( 20 M*)(100 M*)

遺伝子発現制御遺伝子発現制御

(2)(2)

CCATGGAAGA

CGCCAA AAACATAAAG

TACCTTCT

- PEG12 -

TTTGTATT

: PP_ATG01TACATTCT

- PEG12 -

TTTGTATT

: PP_ATG01_MMTACCTTCT

: PNA-CTTTGTATT

: PNA-NTACCTTCTGCGGTTTT

: PNA16

TACATTCTGCGGTTTT

: PNA16

_MMTACCTTCTGCGGTTTT

- PEG12 : PNA16

-PEGTACATTCTGCGGTTTT

- PEG12 : PNA16

-PEG_MM

ATG region 5’

3’

PNA16 -PEG and MM

遺伝子発現制御の機構遺伝子発現制御の機構

Ampr

Luc+

T7 Promoter

T7 terminater

5256 bp

His tag

642 bp760 bp

Gel-shift assay for the formation of invasion complexes of PNA derivatives. a) PCR clean-up product of 119-mer double strand DNA (dsDNA) and invasion with model-PNA (5’-AAAGAAAGG-3’). b) dsDNA with PNA derivatives. Invasion conditions: [119-mer double- stranded DNA] = 100 nM, [each of PNA derivatives] = 2000 nM, treated at 30 ˚C for 4 h in 5 mM HEPES buffer (pH 7.0).

PCR reaction.1. 98 ˚C, 10 sec2. 55 ˚C, 10 sec3. 75 ˚C, 15 sec

Primer・5’-ACCACAACGGTTTCCCTCTA-3’・5’-GTTCCATCTTCCAGCGGATA-3’

a)

M 30 50 30 50with without

PCR product(dsDNA)

+

PNA

b)

contr

olPP_A

TG01PP_A

TG01_M

M

PNA_CPNA_NPP_A

TG01PP_A

TG01_M

M

PNA_CPNA_N

with dsDNA without dsDNA

with dsDNA without dsDNA

contr

olPP_A

TG02PP_A

TG02_M

M

PNA 16PNA 16

_MM

PP_ATG02

PP_ATG02

_MM

PNA 16PNA 16

_MM

遺伝子発現制御の機構遺伝子発現制御の機構

Tm of PNA-PEG conjugates and PNA oligomer.

PP_ATG01

PP_ATG01_MM

PNA16 -PEG

PNA16 -PEG_MM

*synDNA: 5’-CCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’*synRNA: 5’-CCAUGGAAGACGCCAAAAACAUAAAG-3’* total strand concentration: 10 M.

synDNA

39.5

29.1

74.2

63.3

synRNA

56.0

38.1

86.8

75.9

Sequence

TACCTTCT-PEG12 -TTTGTATT

TACATTCT-PEG12 -TTTGTATT

TACCTTCTGCGGTTTT -PEG12

TACCTTATGCGGTTTT-PEG12

dsDNA

mRNA(antigene)protein

PNA-PEG conjugates

(antisense mRNA)

PNA16

Chemical structure of sulforhodamine B acid chloride (SRB).

TTATGTTT – PEG12 – TCTTCCAT

8base PNA

PEG

+

O

N O

SO

PNA

-O3 S

N

細胞内輸送機構細胞内輸送機構

細胞膜

エンドソーム核

アクチン重合

マクロピノサイトーシス誘起化合物

サイトソル

リソソーム：分解ゴルジ体：返送など

マクロピノソーム

核

エンドサイトーシス誘起化合物

Cellular uptake of PNA-PEG conjugate (SRB-PPC) in the presence of FITC-Transferrin (Tf), FITC-Cholera toxine (CTx), or FITC-Dextran (Dx) into Hela cell. [SRB-PPC] = 50 g/ml, [FITC-Tf] = 10 g/ml, [FITC-CTx] = 5 g/ml, and [FITC-Dx] = 25 g/ml. Conditions: 1.0 x 105 cell in glass bottom 35 mm dish with 10 % FBS D-MEM. Incubation time: 5min.

FITC SRB Merge

Tf

CTx

Dx

細胞内輸送機構細胞内輸送機構

新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較

・その他の人工核酸と比較して，生体条件下における1塩基認識

能が向上しているだけでなく，従来のPNAと比較すると溶解性

も向上している。

・複雑な人工核酸の合成が必要なく，市販されているＰＮＡモ

ノマーを用いて比較的安価に合成することができる。

・2本鎖DNAへ侵入（インベージョン）することから，アンチ

センスとしてだけでなく，アンチジーンとしての遺伝子発現制

御が可能。

・網羅的にRNA/DNAと相補鎖を形成することが可能なため，

アンチmicroRNAとして用いることができる。

・生体内でSNPsをターゲットとすることが可能となる。

想定される用途想定される用途

1)

アンチジーン・アンチセンス・anti-microRNA効果によ

る遺伝子発現制御

2)

新しい遺伝子操作技術への転用

3)

1塩基多型(SNPs)原因疾患への治療薬

4)

SNPsタイピングを目的とした人工核酸モデル

実用化に向けた課題実用化に向けた課題

・細胞内，組織内，生体への適合性について，特に細胞毒性に

関して詳細に検討する必要があり，高い細胞毒性の場合には，

これらの有機化合物を細胞内トランスフェクト技術の確立，あ

るいは人工核酸側の分子設計を行う必要がある。

・SNPsをターゲットとした場合，塩基配列依存的に1塩基を認

識しにくい配列がある可能性がある。

想定される企業想定される企業

・利用，対象：

製薬企業，創薬ベンチャー企業

生命化学・生化学分野における遺伝子に関する検出試薬

企業への期待（共同研究）企業への期待（共同研究）

・遺伝子操作の新技術を模索している研究所

・SNPs等をターゲットとした遺伝子治療薬製薬メーカー

・有機合成による複雑な人工核酸合成が可能な企業

・ターゲットとするSNPsの評価系を持っている研究所

本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権

名称：

1塩基認識能を増幅する人工核酸コンジュゲート

出願番号：特願2011-027898

出願人：国立大学法人

鳥取大学

発明者：櫻井

敏彦

問い合わせ先問い合わせ先

鳥取大学

大学院工学研究科

化学・生物応用工学専攻

准教授

櫻井

敏彦

Tel: 0857-31-5633, FAX: 0857-31-5633e-mail: sakurai@bio.tottori-u.ac.jp

鳥取大学

産学・地域連携推進機構

知的財産管理運用部門長・教授

三須

幸一郎

Tel: 0857-31-6000, FAX: 0857-31-5474e-mail: chizai＠adm.tottori-u.ac.jp