1232

1996年 か ら1997年2月 まで に岩 手 県 で分 離 した

腸 管 出血 性 大 腸 菌0157:H7の ゲ ノタ イプ分 析

岩手医科大学歯学部口腔微生物学講座

根本 優 子 小林 昌彦 金 子 克

(平成9年7月9日 受付)

(平成9年9月9日 受理)

Key words : enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) 0157 : H7, pulsed-field

gel electrophoresis (PFGE) , Shiga-like toxin, genotype, southern blotting

要 旨

1996年7月 か ら1997年2月 までの 間 に,岩 手 県 内で発 生 した11例 の散発例 の腸 炎 患者,お よび一例 の

集 団感 染 か ら分 離 した腸 管 出血性 大腸 菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7計

38株 に つい て,1992年 に分離 したEHECO157:H71株 お よび0157:NM2株 とと もにパ ルス フィー

ル ドゲル電 気泳 動(PFGE)を 行 い,ゲ ノ タイ プ を比較 検討 した.さ らにPFGEパ ター ンに よる分 類 を

補 足 す るた めに,Shiga-like toxin遺 伝子(stx)の ゲ ノムDNAへ の組 み込 み部 位 をサ ザ ンプ ロ ッ ト法

で解析 した.そ の結 果,stx1は2株 を除 いて約130kbのXbaIDNA断 片 に存在 し,一 方,stx2は600kbか

ら155kbの 長 さの異 な る11のDNA断 片 に存 在 し,組 み込 み部 位 が多様 で あ る こ とが 明 らか とな った.以

上 の検 討か ら,岩 手 県 内で分離 したEHEC O157:H7は7つ のゲ ノタ イプ に分 け られ た.ま た,集 団感

染例 の分 離株 を含 めて,半 数 のEHEC O157:H7が1992年 の分離 株 と同 じゲ ノ タイ プで あ るこ とか ら,

同 タイ プの菌 株 が大迫 町,盛 岡市 を中心 として岩手 県 内で 広が りつ つ あ るこ とが示 唆 され た.

序 文

1996年 には腸管出血性大腸菌(enterohemorr-

hagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7に よる

集団感染が全国で16件 発生 し1),そ のなかで9月

に発生 した盛岡市立M小 学校の事例は,給食献立

からEHEC O157:H7を 分離 し,感 染経路が確定

できたまれな事例であった.当 講座では集団感染

が確認 された当初 に,患 者,健 康保菌者,お よび

給 食 か ら分離 したEHEC O157:H7の パ ル ス

フイール ドゲル電気泳動(PFGE)に よる遺伝子解

析を行い,こ の集団感染は同一菌に起因すること

を岩手県腸管出血性大腸菌0157原 因究明専門家

検討会議 に報告 した.岩 手県では9月 に発生 した

集団感染例 と前後 して,1996年 には合計10件 の散

発例の腸炎患者か ら,ま た,1997年2月 に散発例

の腸炎患者1例 か らEHEC O157:H7を 分離 し

た.

本研究では上記の集団感染例,お よび散発例の

腸炎患者か ら分離したEHEC O157:H7の ゲノタ

イプ分析を,PFGEとShiga-like toxin 1,2遺 伝

子(stx1,stx2)の ゲノムDNAへ の組み込み部位 を

検索することにより行 った.

材料 と方法

1.供 試菌株

岩手県で1996年7月 から1997年2月 までの問に

散発例の腸炎患者から分離したEHECO157:H7

11株,ま た,集 団発生例からは224株 分離 したが,

本研究では給食献立のサラダ とソースか ら分離 し

た各々2株(分 離株総数4株),給 食を取 り感染 し

た患者由来の13株(分 離株総数118株),感 染保菌

者由来の5株(分 離株総数97株),2次 感染患者由

別刷請求先:(〒020)盛 岡市中央通1-3-27

岩手医科大学歯学部 口腔微生物学講座

根本 優子

感染症学雑誌 第71巻 第12号

EHECO157:H7の ゲ ノ タ イ プ分析 1233

Table 1 Classification of EHEC 0157 by PFGE and Southern blotting of the stx genes

No. 1-11 and No. 13 are EHEC 0157 : H7 isolated from sporadic cases. No. 1 is EHEC 0157 : H7, designated 92N, and No.

14-18 are EHEC 0157 : H7 isolated from the food-poisoning outbreak : No. 14, an adult carrier ; No. 17, a patient ; No. 18, a

carrier, the mother of No. 17. No. 12 and No. 19 are EHEC 0157 : NM. aExistence of the stx genes was confirmed by PCR. b

No positive signal was observed. 'Aomori Prefecture. n.r. : not recorded.

来の2株(分 離株総数2株)と2次 感染保菌者由

来の3株(分 離株総数3株)の 計27株 を用いた.

さらに1992年4月 に盛岡赤十字病院小児科 を受診

した出血性腸炎患児から分離 したEHECO157:

H792N株2),岩 手県松尾村で保菌者か ら分離した

EHECO157:NM1株,青 森県十和田市で散発例

の腸炎患者か ら分離 したEHECO157:NM1株

を用いた.以 上合計41株 のEHECO157分 離株 に

ついて解析 した.

2.方 法

PFGEは 第1日 目に分離菌株 を2xYT培 地 で

37℃,16時 間培養後,2日 目に定法によりアガロー

スゲルブロックを作成 し,プ ロテアーゼK処 理,

phenylmethylsulfonyl fluoride処 理を行 った後,

ゲノムDNAのXbalに よる切断を37℃,2時 間

行った.つ いで10℃,16時 間,1～80秒 パルス時

問 でPFGEを 行 い,第3日 目 にエ チ ジ ウム ブ ロ マ

イ ドで 染 色 し結 果 を得 た3).

DNA断 片 はHybondN+(Amersham, Arlin-

gton Heights, IL)に 転 写 し,42℃,4時 間 プ レ

ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 っ た.つ い で フル オ

レセ イ ン標 識stx1,ま た はstx2 DNAプ ロー ブ で16

時 間 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 い,stxを ア ル

カ リフ ォ ス フ ァ タ ー ゼ標 識 抗 フル オ レセ イ ン抗 体

とCDP-Star(Amersham)を 用 い て検 出 し た.

DNAプ ロー ブ は,Table 1のNo.15株 の ゲ ノ ム

DNAを テ ン プ レ ー トと し て,stx1,stx2各 々 に特 異

的 なPCRプ ラ イ マ ー4)を 用 い てPCRプ ロ ダ ク ト

を増 幅 した 後 に,フ ル オ レ セ イ ン11-dUTP存 在 下

で ラ ン ダ ム プ ラ イ ム法(Gene Images random

prime labelling module, Amersham)に よ り作

製 した.DNAシ ー クエ ン シ ング の 結 果,No.15株

平成9年12月20日

1234 根本 優子 他

Fig. 1 PEGE analysis of EHEC 0157 : 117 and 0157 : NM strains. Numbers

represent the patients in Table 1. Sizes in kb of the DNA fragments containing

either the stx, or stx, gene are written at the right side.

のstx2DNA配 列 はJacksonら5)の 報 告 と 同 一 で

あ っ た(根 本,未 発 表).

結 果

1996年,岩 手 県 にお け る散 発 例 の腸 炎 患 者 か ら

のEHECO157:H7の 分 離 報 告 は7月 か ら始 ま

り,10月 ま で に10例 の報 告 が あ っ た.さ ら に1997

年2月 に1名 の腸 炎 患 者 か らEHECO157;H7を

分 離 した.患 者 年 齢 は1歳 か ら77歳 で,3歳 以 下

5名,10代1名,20代2名,50代1名,70代2名

で,幼 児 の 発 症 が顕 著 で あ っ た.男 女 比 は5:6

で 血 便 が7例 に み られ た が,全 て の症 例 は続 発 症

を起 こす こ とな く完 治 した(Tablel) .

以 上 の 散 発 例 の11株,盛 岡 市 集 団 感 染 例 由 来 の

27株,92N株,お よ びEHECO157:NMの2株

につ い てPFGEを 行 っ た.集 団感 染 例 由来 株 の う

ち,2次 感 染 保 菌 者 由 来 の1株 を除 く26株 は 全 て

Fig.1,lanes14～17に 示 したPFGEパ タ ー ン を

示 した.一 方,2次 感 染 保 菌 者 由来 の1株 で は380

kbと210kbの 新 た な バ ン ドが 観 察 さ れ た(Fig .

1,1ane18).散 発例 の腸 炎 患 者 由来 の分 離株 で は,

92N株(Fig.1,lane1)とNo.4,5,8,9,10

株(Fig.1,lanes4,5,8,9,10)が ほ ぼ 同 一 の

PFGEパ タ ー ン を示 した .さ ら に,こ れ ら分 離 株

のPFGEパ タ ー ン は集 団 感 染 例 由 来 株 のPFGE

パ ター ン と も類 似 した.

そ の 他 の 散 発 例 由 来 の 分 離 株 で はNo.6株

(Fig.1,lane6)とNo.7株(Fig.1,lane7)で

PFGEパ タ ー ン の 類 似 が 見 ら れ た が,EHEC

O157:NM2株 を 含 む そ の 他 の6株(Fig.1,

Ianes2,3,11,12,13,19)は 全 て異 な るPFGE

パ タ ー ン を示 した.

PCRに よ る 解 析 で は0157:NMのNo .19株

がstx1-,stx2-,0157:H7のNo.2,No.3株 と

0157:NMのNo.12株 がstx1-,stx2+で あ り,

残 りのEHECO157:H737株 は8tx1+,stx2+で

あ っ た(Table1).

PFGE後,stxの サ ザ ン プ ロ ッ トを行 った(Fig .

2).そ の 結 果,stx1はNo.7株 で330kbDNA断 片

に,ま た,No.11株 で は500kb断 片 に存 在 した が,

これ ら以 外 の 菌 株 で は約130kbのDNA断 片 に 存

在 す る こ とが 示 され た.一 方,stx,はXbaI切 断 に

よ っ て得 られ る最 長 のDNA断 片 に存 在 す る分 離

株 が 多 く,集 団感 染 例 の分 離 株No-14株 か らNo.

18株 まで は600kb断 片,No.1,4,5,8,10株 で

は555kb,No.9株 は550kb,No.6株 は410kb,No.

13株 は200kb,そ してNo.7株 で は185kb断 片 に

存 在 した.さ らにNo.2株 で は530と155kbの2断

片 に,No.11株 で は300,230,お よ び155kbの3

つ のDNA断 片 に シ グ ナ ル を認 め た .し た が っ て

No.2とNo.11株 は 少 な く と も2コ ピ ー以 上 の

感染症学雑誌 第71巻 第12号

EHEC O157:H7の ゲ ノタ イ プ分析 1235

Fig. 2 Southern blotting of the stx genes. XbaI-cleaved genome DNA shown in Fig. 1 was

transferred to Hybond N+ membrane, and then hybridized with (a) the fluorescein-labeled-stx1,and (b)-stx2 specific DNA probes.

a

stx2を 保 有 す る もの と考 え られ た.

PCRでstx1-で あ ったNo.2,3,12,19株 お よ

びPCRでstx2-で あ っ たNo.19株 で は,サ ザ ン

プ ロ ッ トで もPCRの 結 果 に 一 致 し て,そ れ ぞ れ

の遺 伝 子 に対 応 す る シ グ ナ ル は認 め なか っ た.一

方,PCRでstx2+で あ っ たNo.3株 とNo.12株

は サ ザ ン プ ロ ッ トで は シグ ナ ル が 検 出 で きず,こ

れ らの2株 はstx25)と は異 な る5偽DNA配 列 を

持 つ こ とが 示 唆 され た.

考 察

岩 手 県 で は1996年 か ら1997年2月 まで の 問 に 医

療 機 関 で 治 療 を 受 け,届 け 出 の あ っ たEHEC

O157:H7感 染 患 者 は集 団 感 染 例 で41名6)お よ び散

発 例 の 腸 炎 患 者11名 の 合 計52名 で あ った.重 症 化

した 患 者 は な く,全 て の 患 者 が 完 治 した.

EHECO157:H7を 含 む 病 原 細 菌 の 分 子 疫 学 の

方 法 とし て,PFGEは 最 も識 別 力 が 高 く,有 用 な

方 法 とな っ て い る3)7)～9).1996年 に 日本 各 地 で分 離

したEHECO157:H7に つ い て のPFGEパ タ ー

ン は和 田1)に よ り報 告 され て い る.一 方,今 回 の検

討 か らEHEC O157:H7分 離 株 のPFGEパ タ ー

ン は14日 間 とい う極 め て短 期 間 に変 化 し う る こ と

b

が 明 らか とな っ た.し た が っ てEHEC O157:H7

のPFGEで 示 さ れ るゲ ノ タ イ プ は,我 々 が考 えて

い る以 上 に変 化 しや す い も の と考 え られ,PFGE

パ タ ー ン解 析 時 に は,変 異 に よ るパ ター ンの 変 化

に 注意 す る必 要 が あ る.

最 近,大 腸 菌 を 含 む 細 菌 は,比 較 的 高 い遺 伝 子

変 異 能 を 自然 界 に お け る集 団 内 で保 持 して お り,

これ に よ り環 境 適 応 の 手 段 と して い る可 能 性 が 報

告 され た10)11).LeClercら12)は 実 際 に,通 常 の 培 養

条 件 下 で 約4%のEHEC O157:H7分 離 株 が 高 い

変 異 率 を持 つ こ と を示 して お り,今 後,本 邦 に お

け る分 離 株 に つ い て も,同 様 な検 討 が 必 要 で あ る

と考 え る.

よ り 広 範 囲 で 長 期 間 に わ た っ て 分 離 し た

EHEC O157:H7のPFGEパ タ ー ン に よ る分 子 疫

学 分 析 を補 足 す る た め に,本 研 究 で はstxの 組 み

込 み部 位 に つ い て検 討 した.こ れ ら2種 類 の 解 析

方 法 か ら得 ら れ た 結 果 か ら,検 討 し たEHEC

O157:H7の 分 離 株 は7つ の ゲ ノ タ イ プ に 分 け ら

れ た(Table1).No.6株 とNo,7株 はPFGEパ

タ ー ン は類 似 して い た が,stx組 み込 み 部 位 が 異

な る こ とか ら,異 な るゲ ノ タ イ プ に分 類 した.こ

平成9年12月20日

1236 根本 優子 他

Fig. 3 A map of municipalities around Iwate

Prefecture where EHEC O157 strains were iso-

lated. 1, Towada ; 2, Ninohe ; 3, Kuzumaki ; 4,

Matuo ; 5, Morioka ; 6, Ohazama ; 7, Towa ; 8,

Esashi ; 9, Isawa. Letters from A to I are

genotypes of EHEC O157 strains described in

Table 1. One letter corresponds to a patient. A*

is the food-poisoning outbreak.

れ ら2株 以外 の分離株で は,PFGEパ ターンと

stxの 組み込み部位の違いが0致 していた.

集団感染例由来の分離株 を同一クローンとする

と,検 討 したEHEC O157:H712株 の うち6株

(50%)がAタ イプであ り,Aタ イプが岩手県での

EHEC O157:H7に よる感染性腸炎の主要な起炎

菌 となっていることが明 らかとなった.

患者の居住地 と分離株ゲノタイプをFig.3に

示した.こ れか らEHEC O157:H7は 岩手県の沿

岸地域から分離されず,一 方,内 陸の主に国道4

号線沿いの市町村 において分離 した ことがわか

る.さ らにAタ イプの菌株 は盛岡市 と大迫町を中

心 とした比較的近い市町(江 刺市,葛 巻町)で 分

離 してお り,Aタ イプの菌が1992年 から大迫町,

盛岡市を中心 として岩手県内で広が りつつあるこ

とが示唆された.

これに対 して,Aタ イプ以外の散発例の腸炎患

者からのEHEC O157:H7(ゲ ノタイプB,C,

D,E,F,H),お よびEHEC O157:NM(ゲ ノ

タイプG,1)は いずれも一症例のみか らの分離で

あり,こ れらの菌は現在の ところ各地域に限局 し

ているものと考えられる.

集団感染があったにもかかわ らず,岩 手県にお

け る52名 のEHEC O157:H7感 染 患 者 の う ち,続

発 症 例 が な か っ た こ との要 因 と し て,各 医 療 機 関

に お け る治 療 措 置 が 迅 速 で適 切 で あ っ た こ とが あ

げ られ る.加 えてAタ イ プEHEC O157:H7の 病

原 性 の 弱 さ も推 察 され,今 後,Stx1お よびStx2の

細 胞 毒 性 の 検 討 を含 め て,続 発 症 の 発 症 機 構 と こ

れ ら菌 株 の 病 原 性 の検 討 が 必 要 で あ る と考 え る.

謝辞:EHEC O157:H7の 分離株 を御提供 ください まし

た一 ノ渡義巳博士(前 岩手 県衛生研究所長),玉 田清治博 士

(現岩手県衛生研究所長)に 深謝致 します.

文 献

1) 和田昭仁: PFGE法(パ ルス フィール ドゲ ル電気

泳動法)に よる遺伝子型別判定 と分子疫学 マー カー としての有用性

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2) 田中 完, 佐々木哲哉, 飯島 仁:腸 管出血性大

腸 菌O157に よ る 出 血 性 腸 炎 の2例. 小 児 科

1993; 34: 189-193.

3) 小林 昌彦, 根本優子, 金子 克:メ チシリン耐性

黄色 ブ ドウ球菌のパルスフィール ドゲル電気泳動

およびAP-PCRに よるゲノムタイ ピング. 感染症

誌1997; 71: 620-627.

4) 小林一 寛: 腸管出血性 大腸菌 のPCR法 に よる検

出. 臨床 と微生物1991; 18: 507-513.

5) Jackson MP, Neill RJ, O'Brien AD, Holmes

RK, Newland JW : Nucleotide sequence anal-

ysis and comparison of the structural genes for

Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II en-

coded by bacteriophages from Escherichia coli.

FEMS Microbiol Lett 1987 ; 44 : 109-114.

6) 一ノ渡義 巳, 吉 田耕次, 田頭 滋, 熊谷 学, 斎

藤幸一, 五 日市恵里:腸 管 出血性 大腸菌O157:

H7に よる集団感染事例 について―岩手県. 病原微

生物検出情報 月報1997; 18: 30.

7) Bohm H, Karch H : DNA fingerprinting of

Escherichia coli O157 : H7 strains by pulsed-

field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 1992 ;

30 : 2169-21721.

8) 諸 岡 達 也, 甲斐 明 美, 又 野 浩美, 他:1994年 に福

岡市 お よ ひ近 郊 で 分 離 され たvero毒 素 産 生 性 大

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esisに よ る解 析. 感 染 症 誌1996; 70: 7-9 .

9) Watanabe H, Wada A, Inagaki Y, Itoh K,Tamura K : Outbreaks of enterohaemorr-hagic Escherichia coli 0157 : H7 infection by

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10) Taddei F, Radman M, Maynard-Smith J ,Toupance B, Gouyou PH, Godelle B : Role ofmutator alleles in adaptive evolution. Nature

感染症学雑誌 第71巻 第12号

EHEC O157:H7の ゲ ノ タ イプ分 析 1237

1997 ; 387: 700-702.

11) Sniegowski PD, Gerrish PJ, Lenski RE : Evo-

lution of high mutation rates in experimental

populations of E. coll. Nature 1997 ; 387: 703-

705.

12) LeClerc JE, Li B, Payne WL, Cebula TA :

High mutation frequencies among Escherichia

coli and Salmonella pathogens. Science 1996 ;

274 : 1208-1211.

Genotype Analysis of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Strains

Isolated in Iwate Prefecture from 1996 to February 1997

Yuko OHARA-NEMOTO, Masahiko KOBAYASHI & Masaru KANEKO

Department of Microbiology, School of Dentistry, Iwate Medical University

Genotypes of 38 isolates of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 isolated

from 11 sporadic cases and one outbreak in Iwate Prefecture from 1996 to February 1997 were

studied by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), in comparison with a strain of EHEC O157:H7isolated in 1992 in Ohazama-Cho, Iwate Prefecture, and two isolates of EHEC O157:NM. In order

to substantiate the genotypes classified by PFGE, Southern blotting was performed to investigate

integration sites of the Shiga toxin genes (stx) in the XbaI-digested genome DNA fragments. The

stx1 gene existed on an approximately 130 kb fragment in all isolates except two ones. On theother hand, the stx2 gene was observed on 11 DNA fragments in different length from 600 kb to

155 kb, indicating that the stx2 gene integrates into more heterogeneous sites of genome DNA

than stx1 does. From these analyses, EHEC O157:H7 isolates examined were classified into 7

genotypes. Since half of the isolates were the same genotype as that of the isolate in 1992, it issuggested that this type of EHEC O157:H7 strain is expanding from Ohazama-Cho and Morioka

City in Iwate Prefecture.

平成9年12月20日