עמאד עווד נור חוסין

מעבדה ביו כימיה

SDS PAGEהרצה של דוגמאות האנזים ליזוזים שהופק על ג'ל .

רקע

במשך המעבדות חקרנו את הפעילות של האנזים ליזוזים, אנזים ליזוזים מסחרי ואנזים

מן החי אשר הפקנו אותו מחלבון ביצה, במעבדה בדקנו את הפעילות האופטימלית

של ליזוזים מסחרי הפקת הליזוזים מחלבון ביצה ובדיקת פעילותו והשפעת המעכבים

על הליזוזים וקביעת ריכוז הליזוזים בשיטת ברדפורד, הליזוזים הוא אנזים אשר

הוא אנזים אשר נמצא בנוזליהליזוזים תפקידו לשמש כמעטפת הגנה ראשונית בגוף,

הגוף וברקמות , אנזים זה תפקידו הוא לפרק את הדפנות של תאי החיידקים , הליזוזים

נמצא בריכוזים גדולים בתוך החלבון של ביצה וגם נמצא בדמעות , בפה)ריר( , באף

תפקידו בגוף האדם הוא להיות מעטפת הגנה ראשונית לגוף אשר מפרק חומרים זרים

החודרים לגוף דרך האף ,הפה , העין.

באנזים יש אתר פעיל שהוא בקע אשר אליו נקשר הסובסטרת אליו נקשר

הסובסטרט, הליזוזים פועל על דופן התא של החיידקים על ידי פירוק השרשרות

הסוכריות )פוליסכרידים(, שהן המרכיב העיקרי שלו, באמצעות ניתוק הידרוליטי של

הקשרים המחברים בין היחידות הבסיסיות המרכיבות את השרשרות הסוכריות. בכך

הוא הורס את דופן תא החיידק.

, ואילו בפעולה5 האופטימלי לפעילותו של ליזוזים על סובסטרטים פשוטים הוא pHה-

האופטימלי יכול להיות יותר גבוה.pHעל חיידקים שלמים ה-

, טמפרטורה וריכוז האנזיםPHהגורמים המשפיעים על האנזים הם רמת חומציות

והסובסטרט.

בקביעת הפעילות של אנזים אנו לא מודדים את פעילות האנזים אלא מודדים את

הפעילות בצורה עקיפה, מכוון שהאנזים מפרק דפנות תאים אנו מודדים את קצב

פירוק התאים, למטרה זאת אנו משתמשים בספקטרופוטומטר אשר מודדים את

הבליעה של התמיסה ומכוון שהתמיסה עכורה והאנזים מפרק את דפנות התאים

התמיסה הולכת ונהיית צלולה.

עמאד עווד נור חוסין

מעבדות ושיטות

מבוא )רקע תיאורטי(:

: הינה תמיסה שמורכבת מחומצה חלשה והמלח שלה או מבסיס חלשתמיסת בופר pHוהמלח שלו, והיא שומרת על יציבות החומציות ומונעת עליות או ירידות חדות ב-.

.pKb או ה- pKaהבופר עושה את זה על ידי שינוי ערך ה-

למשל מערכת הדם בגוף שומרת על רמת חומציות קבועה על ידי הכנסת והוצאתיונים שיכולים ליצור תרקובות ותוצרים חומציים ובסיסיים.

מוגדר ככמות המולים של חומצה או בסיס שצריך להוסיף לליטר שלקיבול בופר: תמיסת בופר כדי לשנות את רמת החומציות שלה ביחידה אחת, הבופר יעיל ביותר

ברמת חומציות הקרובה לערך ה-

pKa.של החומצה או הבסיס שמרכיבים אותו

: הריכוזים של מרכיבי הבופר ושינוי יחסיהפרמטרים שמשפיעים על קיבול הבופרהריכוזים ביניהם

*לבופרים יש חשיבות מאוד גדולה במערכות ביולוגיות, הם משפיעים על חלבונים, אנזימים, ויטמינים ועוד, לכל כל שינוי מערכם יכול לגרום לנזק לחלבונים והאנזימים, שינוי זה עלול להיות בלתי הפיך למשל הריסת המבנה של החלבון והפסקת פעילותו,

דבר זה יגרום לעוד ועוד בעיות במערכות הביולוגיות, לכו חשוב מאוד לשמור על קבוע.pHסביבה עם

*הבופר עובד לפי עקרון לה-שטליה הקובע כי כאשר מוציאים מערכת כימית משיווי משקל לכיוון כלשהו )על ידי הוספת מגיב או תוצר, שינוי טמפ'וכו'( המערכת תגיב בכך

שתסיט את התגובה לכיוון המגיבים או התוצרים, כך שהסטיה משיווי המשקל תקטן. אז לגבי עבודת הבופר התמיסה מכילה חומצה חלשה כלשהי ואת הבסיס המצומד שלה,ואנחנו יודעים שהחומצה מגיבה עם מים כדי לתת את הבסיס ויון הידורוניום,

ומצד שני הבסיס מגיב עם יוני הידורונים לתת חזרה את החומצה, ובכך מונעים שינויחד בערך החומציות של התמיסה.

למדנו הרבה שיטות שלפיהם ניתן לקבוע פעילות אופטימלית של אנזים, למשל** התבקשנו לעקוב אחר הפעילות של אנזים פוספטאז חומצי,2במעבדה מספר

הפוספטאז הוא שם כללי לקבוצת אנזימים המזרזים הידרוליזה של קבוצת פוספט

עמאד עווד נור חוסין

. אנזימים6 ל- 3.8מסובסטרטים שונים, לאנזים הזה פעילות אופטימלית בתחום בין אלו מצויים בגוף האדם במערכת המרה, מעי, עצם ושליה. לאנזימים האלה חשיבות

מאוד גדולה כך שכל שינוי ברמה שלהם מעיד על אבחנה וטיפול של המחלות באיברים שהם נמצאים בהם. אחת הדרכים לקבוע את הפעילות של של האנזים היא

על ידי מדידת קצב העלמות הסופסטרט או על ידי קצב הופעת התוצר, במלים אחרות אפשר לעשות זאת ע"י מעקב אחר כמות התוצר שנוצרת ולמדוד את הבליעה שלה

בכל פרק של זמן, וזאת ע"י מכשיר הספקטרופוטומטר. האנזימים מורדים את אנרגיית האקטיבציה של התגובה הכימית ולכן מזרזים את התגובה, אבל קבוע שיווי המשקל

של התגובה נשאר קבוע. המהירות לפי משוואת מיכאליס-ומנטין היא:V=Vmax*[S]/)[S]*Km(

קבענו את הפעילות האופטימלית של ליזוזים מסחרי, בדקנו כמה3במעבדה מספר ** גורמים שמשפיעים על עבודת האנזים כמו ריכוז האנזים, טמפרטורה, וחומציות,

הליזוזים הוא אנזים אשר נמצא בחלבון הביצה, בנוזלי הגוף וברקמות,אנזים זה תפקידו הוא לפרק את הדפנות של תאי החיידקים , הליזוזים נמצא בריכוזים גדולים בתוך

החלבון של ביצה וגם נמצא בדמעות, בפה)ריר(, באף תפקידו בגוף האדם הוא להיות מעטפת הגנה ראשונית לגוף אשר מפרק חומרים זרים החודרים לגוף דרך האף ,הפה

והעין. במעבדה הזו בדקנו הרבה גורמים שמשפיעים על האנזימים, בהתחלה בדקנו את השפעת ריכוז האנזים ע"י הכנסת כמות שונה של אנזים לתןך קוויטה בכל פעם,

בהתחלה התמיסה היא עקורה, אחר זמן מה האנזים מתחיל לפרק את דפנות החיידקים שבתמיסה ואז התמיסה נהיית צלולה יותר, ולכן הבליעה יורדת, קצב

הפירוק ומדידת הבליעה נותנים לנו מידע על רמת הפעילות של האנזים, באותה דרך בדקנו גם את השפעת ריכוז הסובסטרט. כדי לבדוק את תחום הפעילות האופטימלית של האנזים בדקנו את השפעת החומציות על פעילות האנזים, הכנסנו אמספר קוויטות

כמות שווה של אנזים אבל בסביבה עם רמת חומציות שונה, על ידי קצב הפירוק .pH=5והבליעה שקיבלנו מצאנו שתחום הפעילות האופטימלי של הליזוזים הוא ב-

לגבי השפעת הטמפרטורה עשינו אותו דבר וקיבלנו שהליזוזים הכי פעיל בטמפ' של מעלות. רק להזכיר שטמפרטורות גבוהות מדי גורמות לשינוי במבנה המרחבי של60

החלבונים וכךעלולה להיפגע ההתאמה בין האתר הפעיל לסובסטרט.

: במעבדה ההיא היפקנו חלבון ליזוזים מחלבון ביצה וניקינו4לגבי מעבדה מספר ***אותו, ההפרדה והניקוי בוצעו לפי מספר דרכים שנדבר עליהם כרגע.

סינון, בהתחלה העברנו את חלבון הביצה דרך מסננת מולקולריתהשיטה הראשונה: כך שהחלבונים הגדולים לא יעברו את המסננת ונקבל נוזל שיש בו חלבונים קטנים, אז

2הניקוי הגס הוא שלב ניקוי ראשון בו אנו מפרדים בדרך כלל את תמיסת המקור ל קבוצות, הניקוי הגס נועד להפרדה ראשונית על מנת להקל על ההפרדה בשלבים

הבאים .

צנטריפוגה, היא נעשאת לפי מתקן שמשמש להפרדת חומרים,השיטה השנייה: בעיקר חלקיקים זעירים, המרחפים בנוזל. ההפרדה נעשית באמצעות סיבוב החומר

במבחנה )ב-אפנדורף( סביב ציר מרכזי, ושימוש בכוח הצנטריפוגלי להפרדת החומרים על פי צפיפותם, לכן חומרים בעלי צפיפות גבוהה יותרכלומר הכבדים

עמאד עווד נור חוסין

רכוז ומשתמשים יותרנעים ומצטברים קרוב בתחתית המבחנה. לפעולה זו קוראים ס9 בה רבות במחקר הביולוגיעל מנת להפריד חומרים שונים, למשל להפריד חלבון

מסוים משאר החלבונים שנמצאים איתו בנוזל מסוים.

כרומוטוגרפיה מסוג מחליף יונים, במעבדה שלנו ניקינו אתהשיטה השלישית: הליזוזים על ידי שימוש בקולונה מחליפת קטיונים, חלבון הליזוזים הוא טעון חיובית לכן

יש לנו את הקולונה שבתוכה יש יונים שליליים, אז כאשר מכניסים את תמצית החומרים והחלבונים לתוכה כל החומרים שמטענם מנוגד למטען היונים בקולונה

יישארו בתוכה, וכל השאר יעברו. השיטה הזאת נקראת מחליפת קטיונים, אם היונים היו טעונים חיובית אז השיטה היתה נקראת מחליפת אניונים. השתמשנו בניסוי שלנו

בשני בופרים בעלי רמת חומציות שונה, אחד בסיסי מאוד והשני פחות בסיסי, כדי לנקות את החלבון משאר הלבונים והחומרים שנמצאים איתו אז נכניס אותם לתוך

קולונה מחליפת קטיונים, ידוע שהנקודה האיזואלקטרית של הליזוזים היא מאוד גבוהה, ואילו שאר החלבונים האחרים בעלי נקודה איזואלקטרית נמוכה מזו שיש לו,

, בתנאים אלוpH=8.2אז כדי להפריד אותו משארהחלבונים נשטוף אותם בבופר בעל הליזוזים יקשר חזק לקולונה מכיווןשהוא טעון חיובי ואילו שאר החלבונים ירדו החוצה,

נמוך מ-pH. אז כאשר ה- pHכי הנקודה האיזואלקטרית שלהם פחות נמוכה מערך ה- plלחלבון יהיה מטען חיובי. בסוף השתמשנו בבופר השני היותר בסיסי בעל pH=10.5

וזאת כדי לגרום לחלבון לרדת ולא להיקשר לקולונה, ככל שלחלבון מטען שלילי יותר או חיובי יותר אז צריך ריכוז גבוה יותר של מלח כדי לשחררו מהקולונה ולכן הוא ייצא

האופייני לו, לכן ניתן להכניס את תערובתplמאוחר יותר. אז לכל חלבון יש ערך של של החלבון אותו צריך להפריד, מן התערובת,pl השווה ל- pHהחלבונים לבופר בעל

החלבון ישקע, ואז ניתן לבודד אותו ע"י סינון או סירכוז, לשטוף באותו פעמים נוספותבאותו הבופר להרחקת שאריות החלבונים האחרים ובסוף לייבש.

: במעבדה הזו בחרנו במספר פרקציות שיש בהם חשד5לגבי מעבדה מספר *** למציאת אנזים הליזוזים בריכוז גבוה, בנינו גרף שמתאר את הבליעה של התמיסות

)בפרקציות שנבחרו( כנגד זמן, ובחרנו בפרקציה שיש לה גרף עם השיפוע הגדול מבין שאר הגרפים, כי שיפוע גדול מעיד על פירוק גדול של דפנות החיידקים, כלומר

התמיסה נהיית יותר צלולה ולכן ירידה בערך הבליעה, וזה מעיד על הימצאות ריכוז יש בה ריכוז גדול של אנזים לכן מהלנו3גדול של אנזים הליזוזים, קיבלנו שפרקציה

אותה ומדדנו בליעה, ואז קיבלנו גרף עם שיפוע בטווח הרצוי. אחר כך בדקנו את פעילות האנזים במצב של הימצאות מעקב או לא, בנוסף לכך בדקנו במצב שבו שינינואת הריכוז של המעקב, ולבסוף עשינו עוד בדיקה שבה שינינו את הריכוז של הליזוזים.

***כרגע נדבר בקיצור על מעכבי אנזימים: )למשל תרופות(

מעכבי אנזימים:

מעכבי אנזימים הם מולקולות שנקשרות לאנזים ומורידות את פעילותו היקשרותו של מעכב עשויה לעצור כניסתו של סובסטרט לאתר הפעיל של האנזים ו/או להפריע את זירוז התגובה של האנזים. מעכבי אנזימים נחלקים לשתי קבוצות - מעכבים הפיכים

ובלתי הפיכים:

עמאד עווד נור חוסין

נקשרים באופן לא קוולנטי ונקשרים באתרים הפעילים של האנזיםמעכבים הפיכים : וכך מפריעים לסובסטרט מכוון שהמעכב נקשר לאותו אתר אשר נקשר אליו

הסובסטרט .

נקשרים לאנזים באתרים אשר משנים את המבנה המרחבי שלמעכבים לא הפיכים: האנזים והשינוי במבנה של האנזים יכול לשנות את יעילות האנזים ואף לשתק אותו

בכך שלא יהיה מסוגל יותר לתפקד כאנזים.

במעכבים הפיכים יש שני סוגים של מעכבים, מעכב תחרותי ומעכב לא תחרותי ,

הוא אשר נקשר לאתר הפעיל באנזים וכך למעשה מתחרה מולהמעכב התחרותי הסובסטרט על הקישור לאנזים כדי לעקוף ולנטרל כמה שיותר את השפעתו של

S )אם נוסיף מספיק לא משתנה- Vmaxהמעכב נגדיל את הכמות של הסובסטרט , כדיS )בנוכחות מעכב דרוש יותר גדל - Vmax ,)Km הוא יגיע לאותו Iשיתחרה עם

(.Vmaxלהגיע לאותו ה-

מתרחש כאשר המעכב נקשר לתצמיד האנזים-סובסטרט )המעכב הלא תחרותי ES-אך לא לאנזימים חופשיים; קומפלקס ה ,)EISלא פעיל קטליטית. סוג עיכוב זה

.Km והן ב-Vmaxגורם לירידה הן ב-

SDS PAGE הרצה של דוגמאות האנזים ליזוזים שהופק על ג'ל

המצוייםחומריםאלקטרופורזה היא תופעה אלקטרוקינטית המאפשרת הפרדת

, ביולוגיה מולקולרית ובכימיה אנליטית ידועה בתחום תערובתב

הוא גילה כי חלקיקי חומר נעים ומתפזרים1809נצפתה לראשונה על ידי רוס בשנת

בתוך תווך מימי תחת השפעה של שדה חשמלי .

אלקטרופורזה מבוססת על פיזורם של חלקיקים ותנועתם תחת השפעה של שדה

חשמלי במרחב הומוגני , במרחב אי הומוגני תנועה זאת קוראים לה די אלקטרופורזה .

האלקטרופורזה נוצרת בגלל הפיזור

של החלקיקים בשדה.

בדרך כלל החלקיקים נושאים מטען

חשמלי כך שהשדה החשמלי מפעיל

על החלקיק כוח אלקטרוסטטי

הנקרא כוח קולומב, מחקרים

אחרים גם טוענים שלא צריך

עמאד עווד נור חוסין

שהחלקיק יהיה טעון על מנת לבצע אלקטרופורזה ,יש חלקיקים שהם נייטרלים

היכולים לתאר ולהציג תופעה זו .

במבנים מסוימים של מים בשטח הפנים הכוח האלקטרוסטטי הקולומבי המופעל על

המטען מצומצם על ידי כוח נגדי שהוא גם אלקטרוסטטי , לפי התיאוריה של שכבות

( . זאת אומרת שבתוך תווך מסוים יש שתי שכבותDouble Layer Theoryכפולות )

מקבילות עם מטענים שונים.

כל המטענים על פני שטח בזרם המועבר בג'ל משתקפים ע"י משטח מפוזר.

משטח זה יש לו את המטען האבסולוטי אבל בסימן הפוך גם הכוח הכולל הוא אותו

כוח אלקטרוסטטי אבל בכוון הפוך מהראשון.

לא כל הכוחות האלו משפיעות על החלקיק שאנו רוצים לבדוק כך שהכוחות האלו

משפיעות יותר על האניונים שמפוזרים במשטח . יונים אלה נמצאים במרחק לא גדול

מפני השטח של החלקיק כך שהם מעבירים חלק מהכוח האלקטרוסטטי לפני השטח

של החלקיק כוח זה קוראים לו :

electrophoretic retardation force

האניונים הם אלה שמעבירים חלק מהכוח האלקטרוסטטי .

Electrophoretic retardationהכוח אשר מופעל על החלקיק נקרא כוח אלקטרופרוטי

force

כוחות אלו מיוצבות ע"י החיכוך ההידרודינמי שמשפיע על גופים נעים בזרמים צמיגיים

עם

מספר רינולדס נמוך .

פרופוציונלית לעוצמת השדה החשמלי , כאשר השדה החשמלי לאvמהירות התנועה

חזק בצורה גדולה. השימוש בהנחה זו מאפשר לנו לחשב מקדם המוביליות

האלקטרופורטי

μe=vE

v מהירות החלקיק

E שדה חשמלי

SDS-PAGE , sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

עמאד עווד נור חוסין

טכניקה המשומשת במידה מרובה ב ביוכימיה, כימיה פורנסית, גנטיקה וביולוגיה

שלהם.הפרדתelectrophoretic mobility מולקולרית כדי להפריד בין חלבונים לפי

דוגמאות בעלות מטען חשמלי זהה בניגוד למסה שלהם גורמת להפרדה לפי גודל

הדוגמה.

ניתן לומר ששיטה זו הינה המשומשת ביותר בתחום הביוכימיה.

פרוצדורה

, שמהווה יון דטרגנטSDSהתמיסה שמכילה את החלבונים לניתוח מעורבבת עם

שעובר תהליך דנטורציה משני ושיש בו מבנה שלישוני ללא קשר דיסולפידי, והמכיל

עלוליםSDSמטען חשמלי נגטיבי לכל חלבון בהתייחסות למסה שלו. ללא טיפול ב-

, למשל, עלולים להיתקעכדורייםחלבונים בעלי גודל זהה לנדוד בצורה שונה; חלבונים

מונע תופעה זו ,כמו שלכלSDSבחריצים הזעירים שבג'ל ולנדוד באיטיות. הטיפול ב-

חלבון יש נקודה איזואלקטרית ומשקל מולקולרי ייחודי למבנה הבסיסי שלו. זה ידוע כ

Native PAGE הוספת .SDSפותר את הבעיה הזו, כמו שהוא קושר ופורש את החלבון

וכמעט נותן לו מטען חשמלי נגטיבי אחיד לכל אורך הפוליפפטיד.

גרם חלבון הנותן בערך משקל מטען1.0 עבור SDS גרם 1.4 מעורבב ביחס SDSה

חשמלי אחיד לרוב החלבונים, כדי להניח שהמרחק של הנדידה דרך הג'ל קשור

ישירות רק למידת החלבון.אפשר להוסיף אינדיקטור צבע לתמיסת החלבון כדי

לאפשר לנסיין לעקוב אחרי ההתקדמות של תמיסת החלבון דרך הג'ל במשך הרצת

האלקטרופורזה.

מהלך הניסוי

SDS-PAGEהרצת ג'ל

הכנו את הג'ל להרצה על ידי הוספת בופר ההרצה במיכל העליון והתחתון , בבארית

כולל, l20 דוגמאות חלבון, בנפח ( g) 2-10מסמן ובכל שאר הבאריות l5 הראשונה הטענו

מיליאמפר במשך כשעה וחצי60בטמפרטורת בתנאי זרם קבוע של הרצנו את הג'ל ליזוזים מסחרי .

עד שחזית הצבע הכחול קרובה לקצה התחתון של הג'ל .

צביעת הג'ל בתום ההרצה

עמאד עווד נור חוסין

הפסקנו את ספק הכוח ופתחנו את הגל באמצעות ספסר וסימנו את הג'ל על ידי חיתוך בצד

ימינה למטה) בדוגמה שלנו אשר המדריכה הדגימה את ההפרדה נקרע לנו את החלק הימני

עם קצת מהאזור של סמן הגודל לכן אנו חתכנו בצדו השמאלי כדי לשמן את הגל, העברנו

את הגל לקופסה כדי לצבוע את הג'ל וכך לקבוע את ריכוז החלבונים וזהותם על ידי משקלם

המולקולרי והפסים הנוצרים בכל בארית.

תמונה של משטח הג'ל שקיבלנו וגם אינדקציה של סמן הגודל

ניתוח התוצאות

בבארית הראשונה הטענו סמן הגודל אשר דרכו אנו נקבע את המשקל המולקולרי של

החלבונים אשר מופיעים בהפרדה כל פס מסמן משקל מולקולקי מסוים , אשר נמדד

ב קילו דלטון יחידת משקל האופיינית ומשתמשים בה לשקילת חלבונים , אשר

החלבונים במשקל הנמוך ביותר נעים ונראים מסומנים בקצה התחתון של פרוסת

הג'ל הצבועה.

עמאד עווד נור חוסין

לדוגמת הג'ל הטענו בבאריות דוגמאות שונות אשר מכילות גם את החלבון ליזוזים.

– מכילה ליזוזים מסחרי2בארית מס

, רואים שיש פס המופיעmg/ml 0.5בבארית הזו אנו הטענו ליזוזים מסחרי בריכוז של

, רואים שיש עוד שניKda 14.4 ,ולפי הספרות משקל הליזוזים הוא Kda 15באזור ה

פסים אלו מצביעיםKda 30פסים הגבוהים מזה של הליזוזים אשר נמצאים באזור ה

על דימרים או מומומרים אשר נוצרים כתוצאה של דנטורציה בחלבון אשר החלבון

משנה את צורתו המרחבית , ולפי התוצאה של הפסים אנו רואים כי במהלך

הדנטורציה שני מונומרים של החלבון נקשרו ביחד ויצרו דימר אשר משקלו הממוצע

כפול מזה של ליזוזים בערך.

μl/0.5μg – מיצוי חלבון בריכוז 3בארית מס

בבארית הזו אנו הטענו מיצוי חלבון הליזוזם אשר הפקנו אותו מחלבון ביצה, הריכוז של

ומעלה פסיםKda 50 רואים שיש הרבה פסים עבים בטווח המשקל μl/0.5μgהחלבון

אלו מצביעים שיש עוד מרכיבים אשר נמצאים בטווח הפסים , מרכיבים אלו הם

חלבונים אחרים אשר התקבלו עם הפרדת הליזוזים, יתכן וההפרדה בקולונה שעשינו

מורידה עם הליזוזים עוד חלבונים אחרים או שההפרדה לא היתה באיכות הטובה ,

אחד החלבונים שנמצא בכמות גבוהה בתוך חלבון הביצה הוא חלבון אשר נקרא

Ovalbumin 45 % מנפח הכללי של חלבון הביצה משקל החלבון 54אשר תופס Kda

משקל מולקולרי זה שייך לחלבון Kda 75( , בנוסף רואים עוד פס באזור 1בערך )

conalbumin בנוסף יש את ( ,2 % מנפח הכללי של חלבון הביצה )12אשר טופס

4, הפסים נראים כהים מאשר בבארית מס )kDa )3 14הפס של הליזוזים באזור ה

וזה בגלל שהריכוז של מיצוי היה יותר מרוכז זה אומר ככל שהפסים יותר כהים כך

הריכוז יותר גבוה.

μl/0.1 μg – מיצוי חלבון בריכוז 4בארית מס

מופיע גם פסים של חלבונים אחרים אשר נמצאים במיצוי וגם3בדומה לבארית מס

כי הפסים הםפחות כהים3 , להבדיל מבארית מס 14Kdaכן הליזוים שנמצא באזור ה

, כך4 ל 3אפילו בהירים מאוד , זה נובע מההבדל מהריכוזים בין המיצוי בבארית

שמיצוי שנמצא בריכוז נמוך יותר הוא בהיר יותר, וזה מאשרר לנו את הטענה כי צבע

הפס קשור לריכוז החומר המוזרק לבארית.

עמאד עווד נור חוסין

בהתאמה μl/0.5μg , μl/0.1μg – שטיפת קולונה בריכוז 6 ו 5בארית מס

הטענו דוגמאות משטיפת מהקולונה בריכוזים שונים דוגמאות בריכוז6 ו 5באריות

μl/0.5μg , μl/0.1μgבהתאמה רואים כייש לנו רק את הפסים אשר מצביעים שיש בהם

אשר נמצאים יותר גבוה בבארית בגללovalbumin , conalbuminאת החלבונים

משקלם המולקולרי היותר גבוה , אנו רואים כי הפסים בבארית שהזרקנו אליה ריכוז

יותר נמוך הם יותר בהירים ועוד פעם זה מאשר את הטענה שריכוז גבוה משמעותו פס

כהה יותר , במדידת הריכוז בשיטת ברדפורד ראינו שיש כמות מסוימת של חלבון

הנמצאת בתמיסה,למרות שאין לנו פס המצביע על הימצאות החלבון ליזוזים באותה

תמיסה ,הערך שהיה לנו בחישוב הוא יחסית גבוה זה נובע מהימצאות החלבונים

ovalbumin , conalbuminאשר השפיעו על הריכוז בתמיסה מכוון ששיטת ברדפורד

מודדת את הריכוז הכללי של החלבון או ליתר דיוק גם הצבע אשר משתמשים בו

בעיקר לחומצות אמינו בסיסיות וארומטיות במיוחד לחומצה אמיניתבשיטה זו נקשר

מכילים חומצות אמינו אשר נקשרות לצבע conalbumin, וovalbuminארגנין , החלבון

וזה מקור השינוי בבליעה אשר גרם לקבלת תוצאה גבוהה של ריכוז בדוגמת שטיפת

הקולונה.

– פרקציה פעילה 7בארית מס

אשר בה הבחנו בפעילות הגבוהה ביותר של3הפרקציה הפעילה היא פרקציה מס

הליזוזים אשר פירק את דפנות תאי החיידקים , את הפעילות קבענו דרך בחינת קצב

שינוי הבליעה לאורך של שתי דקות )מצורף נספח עם תוצאות הקביעה( ,רואים שיש

אולם הצבע של הפס בהיר אשר מסמן Kda 14פס מרוח באזור המשקל המולקולרי

שהריכוז של הליזוזים בתמיסה לא גבוה )לאות תוצאות של הריכוזים בנספח( גם כן לא

נראו עקבות של חלבונים אחרים אשר היו לנו בדוגמאות האחרות ) מיצוי ושטיפה ( זה

מצביע כי ההפרדה בוצעה בצורה טובה אשר נתנה ליזוזים טהור בתמיסה.

הטענו דוגמה של פרקציה אשר בבדיקת הפעילות הצביעה על פעילות מספקת של

ליזוזים

אבל לפי הפרדת החלבונים בבארית היא ללא כל סימן אפילו קטן של הימצאות

חלבונים בה, ההשערה היא כי ההטענה או גורם אחר השפיע על התוצאה של פרקציה

6 לא היתה מדויקת מכוון שבמעבדה מס 5זו יתכן גם כי הקביעה שלנו במעבדה מס

היו סימנים על הימצאות חלבונים לפי שיטת ברדפורד, המדידה שלנו נכשלה

בפרקציה זו מסיבה אשר לא ברורה לי באופן מדויק.

עמאד עווד נור חוסין

מסקנות מהמעבדות

והפעילות שלו ובחינת התכונות שלו במעבדות האחרונות עסקנו בהפקת הליזוזים

ועוד עסקנו גם בהתנהגות ועד לריכוז שלו , חומציות, בתנאים שונים משינוי טמפ

הליזוזים בהימצאות מעכב אשר משפיע על איכות הפעילות של האנזים.

נתחיל את הניתוח מליזוזים מסחרי אשר מצאנו כי רמת החומציות משפיעה במידה אשר בו האנזים פועל בצורהPHרבה על פעילות האנזים וכי יש טווח מסוים של

, לפי הגרף אשר בנינו אותו מוצאים כי לאנזים פעילות אופטימלית ב אופטימלית PH=5

5.3 4 5.4 5 5.5 6 5.6 7 5.7 8 5.80

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

2seireS

גם כן טמפרטורה מזפיעה בצורה גדולה מאוד כי בטמפרטורה גבוהה החלבונים עוברים תהליך אשר קשרים מתפרקים וחדשים נוצרים וזה גורם לקריסת המבנה השלישיוני של

מעלות צלזיוס60החלבון וכתוצאה מעיוות זה נפגמת יעילות האנזים, בטמפרטורה של נצפתה הפעילות הטובה ביותר לאנזים, ריכוז האנזים גם כן משפיע וככל שהריכוז גבוהה יותר

כך נצפה פעילות יותר גבוה בדוגמה ודפנות תאים התפרקו והתמיסה הפכה להיות יותרצלולה .

הימצאות מעכבים פגעה בפעילות של האנזים אשר ריכוז גבוה של מעכב פגע בצורה גדולה ביותר בפעילות האנזים גם כן ריכוז האנזים משפיע וככל שהריכוז גבוה יותר כך השפעת המעכב קטנה יותר , במעבסדה אשר בדקנו בה את ריוז החלבון לפי ברדפורד נתנה לנו

אינדקציה טובה לריכוזים של החלבון למרות שבשיטה הזאת לא תהיה מספיק מדויקת אם כךSDS PAGEימצא יותר מחלבון אחד בתוך התמיסה את זה ראינו בהפרדת החלבון ב

שבשטיפת הקולונה לא היה לנו אינדקציה להימצאות ליזוזים אבל מצאנו עקבות של חלבונים אחרים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר , חלבונים אלו הראו בשיטת ברדפורד שיש ריכוז גבוה של חלבון ) נספח( אשר בלי בדיקת ההפרדה במעבדה האחרונה היינו מוטעים וחושבים שזה

ליזוזים, גם כן צבע הפסים אישר לנו כי הריכוז הגבוה של אנזים תורם לפעילות גבוהה שלו .

עמאד עווד נור חוסין

נספח

הפרקציה הפעילה ביותר – היא 3פרקציה מס

emit ecnabrosbA

0415.052.0394.0

5.0444.057.0714.0

1973.052.1343.0

5.1903.057.1682.0

2562.0

05.015.125.20

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

766666666660415.0 + x 333333333337031.0 − = )x)f686401434027299.0 = ²R

ecnabrosbA

emiT

D.O

עמאד עווד נור חוסין

ביבלוגרפיה

)1), )2) ,)3) Li-Chan, E. C. Y., Powrie, W. D., & Nakai, S. )1995). The chemistry of

eggs and egg products. In W. J. Stadelman & O. J. Cotterill )Eds.), Egg

science and technology )4th ed., pp. 105–175). New York, US: The

Haworth Press.

The Life of Sir Alexader Fleming by Andre Maurios,, 1959