6.11.14 doktorat_final-final

294
Aleksandra GRUCA Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells to the cytotoxic effects of ionizing radiation Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN 1

Upload: aleksandra-gruca

Post on 15-Apr-2017

453 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: 6.11.14 doktorat_final-final

Aleksandra GRUCA

Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne

związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne

działanie promieniowania jonizującego

Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells

to the cytotoxic effects of ionizing radiation

Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK

Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN

Gliwice 2014

1

Page 2: 6.11.14 doktorat_final-final

Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego Politechniki Śląskiej.

Praca finansowana była ze środków UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01 w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki współfinansowanego ze środków Europejskiego

Funduszu Społecznego. Stypendium doktoranckie współfinansowane było z projektu DoktoRIS - Program stypendialny na rzecz innowacyjnego Śląska.

Praca doktorska została wykonana w Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej - Curie,

oddział w Gliwicach.

2

Page 3: 6.11.14 doktorat_final-final

Podziękowania

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. Zdzisławowi Krawczykowi za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania niniejszej pracy doktorskiej, cierpliwość i wyrozumiałość oraz motywację do krytycznego spojrzenia na problematykę

badawczą. Szczególne podziękowania pragnę złożyć Panu Profesorowi za pomoc w jasnym formułowaniu myśli naukowej oraz inspirację do zgłębiania zagadnień naukowych.

Chciałam wyrazić głęboką wdzięczność Pani dr Aleksandrze Rusin, bez której niniejsza praca nie mogłaby powstać. Dziękuję za inspirację do badań, niezastąpioną pomoc w planowaniu

doświadczeń oraz kreatywne podejście w poszukiwaniu rozwiązań problemów biologicznych. Pragnę również podziękować za pomoc w redagowaniu pracy oraz motywację

do opracowania samodzielnych koncepcji na tle istniejącej literatury naukowej.

Dziękuję Panu prof. dr hab. inż. Wiesławowi Szeji za udostępnienie związków do doświadczeń oraz umożliwienie wykonywania badań w ramach współpracy pomiędzy Katedrą Chemii

Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej w Gliwicach a Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

w Centrum Onkologii w Gliwicach.

Pragnę podziękować Panu prof. dr hab. n. med. Leszkowi Miszczykowi, kierownikowi Zakładu Radioterapii Centrum Onkologii w Gliwicach za udostępnienie przyspieszacza

liniowego, dzięki czemu możliwe było wykonanie doświadczeń do niniejszej pracy.

Szczególne wyrazy wdzięczności składam pracownikom Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów oraz Katedry Chemii Organicznej, Bioorganicznej

i Biotechnologii Wydziału Chemii Politechniki Śląskiej w Gliwicach za przekazaną wiedzę, pomoc w zakresie technik eksperymentalnych oraz prawdziwie naukową atmosferę w pracy.

W szczególności pragnę podziękować Pani dr Agnieszce Gogler-Pigłowskej, Panu prof. dr hab. Markowi Rusinowi, Pani mgr Annie Habryce, Pani dr Iwonie Domińczyk,

Panu mgr Radosławowi Kitlowi oraz Panu dr Piotrowi Świerkowi za pomoc i życzliwość.

.

Chciałabym również podziękować rodzinie oraz przyjaciołom, za nieustanne wsparcie oraz motywację. W szczególności dziękuję mojej Mamie za pomoc w wyborze drogi zawodowej

oraz nigdy niegasnącą wiarę we mnie.

Niniejszą pracę pragnę dedykować mojej Mamie, której wieloletnie nauki wyrażone są słowami Jana Pawła II: „Tam, gdzie jest człowiek cierpiący, musi znaleźć się człowiek,

który otoczy cierpiącego wsparciem”.3

Page 4: 6.11.14 doktorat_final-final

SPIS TREŚCI

SKRÓTY 6STRESZCZENIE 8

SUMMARY 13I. WSTĘP 17

I.1. Genisteina jako potencjalny farmaceutyk..................................................................................17

I.1.1. Badania in vitro, in vivo oraz próby kliniczne opisujące właściwości

przeciwnowotworowe genisteiny.....................................................................................19

I.1.2. Mechanizmy przeciwnowotworowego działania genisteiny............................................24

I.2. Radiooporność komórek nowotworowych................................................................................28

I.2.1. Mechanizm cytotoksycznego działania promieniowania jonizującego............................29

I.2.2. Mechanizmy radiooporności komórkowej.......................................................................31

I.2.3. Radiooporność zależna od EGFR.....................................................................................33

I.2.4. Przezwyciężanie radiooporności.......................................................................................42

I.2.5. Mechanizmy radiouwrażliwiania nowotworów................................................................43

I.2.6. Inhibitory EGFR jako substancje radiouwrażliwiające....................................................49

I.2.7. Trucizny topoizomerazy II jako potencjalne radiouczulacze.........................................53

I.3. Stosowanie genisteiny w kombinacji z terapiami konwencjonalnymi......................................55

II. CEL PRACY 63

III. MARIAŁY I METODY 64III.1. Substancje chemiczne................................................................................................................64

III.2. Przygotowanie związków do badań...........................................................................................66

III.3. Przeciwciała stosowane do immunodetekcji.............................................................................66

III.4. Linie komórkowe.......................................................................................................................67

III.5. Warunki hodowli linii nowotworowych i przygotowanie komórek do doświadczeń...............69

III.6. Ekspozycja komórek nowotworowych na działanie promieniowania jonizującego.................70

III.7. Zastosowanie testu klonogenności w celu wyznaczenia wartości IC50 testowanych związków i

promieniowania jonizującego w programie CalcuSyn..............................................................71

III.8. Ocena efektów kombinacji promienowania jonizującego z pochodnymi genisteiny z

wykorzystaniem programu CalcuSyn........................................................................................75

4

Page 5: 6.11.14 doktorat_final-final

III.9. Ocena wpływu pochodnych genisteiny samodzielnie i w kombinacji z IR na aktywność oraz

poziom wybranych białek w metodzie „western blot”..............................................................79

III.9.1. Przygotowanie komórek do doświadczenia.................................................................79

III.9.2. Przygotowanie lizatów komórkowych.........................................................................80

III.9.3. Oznaczenie stężenia białka...........................................................................................81

III.9.4. Frakcjonowanie elektroforetyczne białek w żelu poliakrylamidowym........................81

III.9.5. Immunodetekcja białek na błonie nitrocelulozowej bądź PVDF.................................82

III.9.6. Analiza densytometryczna............................................................................................83

III.10. Test „immunoband depletion”..............................................................................................84

III.11. Skład buforów, roztworów, żeli stosowanych w doświadczeniach......................................85

IV. WYNIKI 87IV.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz promieniowania

jonizującego...............................................................................................................................89

IV.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym....................................90

IV.3. Hamowanie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR przez genisteinę

i jej pochodne.............................................................................................................................96

IV.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR..........................102

IV.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę

i jej pochodne...........................................................................................................................106

IV.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne............................110

IV.7. Podsumowanie badań przesiewowych....................................................................................114

V. DYSKUSJA 118

V.1. Zdolność pochodnych genisteiny do hamowania aktywności EGFR......................................125

V.2. Zdolność pochodnych genisteiny do hamowania aktywności TOPO II..................................130

V.3. Radiouczulające właściwości badanych związków.................................................................133

V.4. Bezpieczeństwo stosowania pochodnych genisteiny w terapii...............................................140

V.5. Czy pochodna RAM-5 może być kandydatem na lek?...........................................................143

VI. NAJWAŻNIEJSZE WYNIKI I WNIOSKI 148

VII. BIBLIOGRAFIA 149

5

Page 6: 6.11.14 doktorat_final-final

SKRÓTY

AKT kinaza serynowo-treoninowa znana również jako PKB (ang. protein kinase B) aktywująca ścieżki prożyciowe

ATM kinaza serynowo-treoninowa (ang. ataxia telangiectasia mutated) zaangażowana w proces naprawy podwójnych pęknięć

ATR kinaza serynowo treoninowa (ang. ataxia telangiectasia and Rad3 related) uczestnicząca w naprawie DSB

CI indeks kombinacji (ang. combination index)

CSC nowotworowe komórki macierzyste (ang. cancer stem cells)

DMSO dimetylosulfotlenek (ang. dimethyl sulfoxide), ze względu na właściwości silnie solwatujące stosowany jako rozpuszczalnik

DNA-PK kinaza uczestnicząca w naprawie pęknięć DNA (ang. DNA-dependent protein kinase)

DSB podwójne pęknięcia nici DNA (ang. double strand breakes)

et al. i wsp., i współpracownicy, i inni (łac. et alii)

ED50 dawka obniżająca efekt do 50% efektu maksymalnego (ang. half maximal effective dose)

EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy (ang. ethylenediaminetetraacetic acid), wykazuje właściwości chelatujące jony metali, stosowany w hodowli komórkowej

EGF naskórkowy czynnik wzrostu (ang. epidermal growth factor), ligand przyłączający się do EGFR i wywołujący jego aktywację

EGFR receptor naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor), błonowa kinaza tyrozynowa wykazująca nadekspresję w wielu nowotworach

EGFRvIII wariant III mutacji EGFR, delecja eksonów 2-7 genu dla EGFR (delecja 801 par zasad – nukleotydy z pozycji 275-1075)

ER receptor estrogenowy (ang. estrogen receptor)

ERK 1/2 kinaza regulowana przez czynniki pozakomórkowe 1 i 2 (ang. extracellular signal-regulated kinase 1/2)

FBS płodowa surowica wołowa (ang. fetal bovine serum), stosowana jako składnik pożywki używanej w hodowli komórkowej

FDA amerykańska Agencja Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration)

h godzina

HIF-1 czynnik indukowany hipoksją (ang. hypoxia induced factor 1)

HRP peroksydaza chrzanowa (ang. horseradish peroxidase)

IC50 stężenie substancji wywołujące zahamowanie procesu biologicznego o 50% (ang. half maximal inhibitory concentration)

IR promieniowanie jonizujące (ang. ionising irradiation)

logP logarytm współczynnika podziału n–oktanol/woda

MAPK kinaza aktywowana mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinase)

min minuty

6

Page 7: 6.11.14 doktorat_final-final

MTT tetrazol będący barwnym substratem używanym w kolometrycznej metodzie badania cytotoksyczności związku (ang. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

NF-κB czynnik transkrypcyjny zaangażowany w szlaki przekazu sygnału prowadzące do kancerogenezy (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)

NHEJ naprawa DNA na drodze niehomologicznego łączenia końców (ang. non-homologous end joining)

NSCLC niedrobnokomórkowy rak płuca (ang. non-small-cell lung carcinoma)

PBS wodny roztwór soli fizjologicznej (NaCl) buforowany fosforanami (ang. phosphate buffered saline)

PI3K kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (ang. posphoinositide 3-kinase)

ppm stężenie bardzo rozcieńczonych związków chemicznych określające ile cząsteczek związku chemicznego przypada na 1 milion cząsteczek roztworu (ang. parts per milion), 1 ppm = 1/10-6 = 10-4 %

PTK białkowe kinazy tyrozynowe (ang. protein tyrosine kinase)

PVDF polifluorek winylidenu (ang. polyvinylidene fluoride)

RAS błonowa GTP-aza odpowiedzialna za stymulację licznych ścieżek sygnałowych (ang. kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)

ROS reaktywne formy tlenu (ang. reactive oxygen species)

SAR zależność aktywności od struktury związku (ang. structure activity relationship)

SDS laurylosiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulphate), stosowany jako detergent

SSB pojedyncze pęknięcia nici DNA (ang. single strand breaks)

SSD odległość od źródła napromieniania do punktu wejścia wiązki w napromieniany obszar (ang. source to surface distance)

TOPO II topoizomeraza II

TKI inhibitor kinaz tyrozynowych (ang. tyrosine kinase inhibitor)

TRIS trihydroksymetyloaminometan (ang. tris(hydroxymethyl)aminomethane), składnik buforów

TTBS bufor oparty o TRIS z dodatkiem roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i Tween 20 (ang. Tween 20 / tris buffered saline)

7

Page 8: 6.11.14 doktorat_final-final

STRESZCZENIE

Rozwój wiedzy w dziedzinie onkologii umożliwił scharakteryzowanie w komórkach

wielu typów nowotworów potencjalnych celów molekularnych dla chemoterapii. Dzięki

poznaniu mechanizmów odpowiedzialnych za inicjację, promocję i progresję nowotworową

możliwe jest wycelowanie terapii w konkretne białka i enzymy i upośledzanie bądź

blokowanie ich funkcji. Częstą strategią stosowaną obecnie w poszukiwaniu związków

przeciwnowotworowych jest ich projektowanie w taki sposób, aby modulowały aktywność

ściśle określonych celów molekularnych. Zastosowanie dodatkowej chemoterapii celowanej

w kombinacji z radioterapią jest szczególnie uzasadnione w przypadku pacjentów, u których

niepowodzenie radioterapii związane jest z istnieniem w masie guza komórek radioopornych,

a zwiększenie dawki energii promieniowania jonizującego do wartości umożliwiającej

ich wyeliminowanie nie jest możliwe ze względu na równoczesny wzrost toksyczności terapii

względem tkanek prawidłowych. Jeśli znane są mechanizmy radiooporności komórkowej

w danym typie nowotworu, możliwe jest zastosowanie związków promieniouwrażliwiających

celujących właśnie w te ściśle określone cele molekularne, bez dodatkowego zwiększania

toksyczności terapii.

Koncepcja niniejszej pracy łączy ze sobą dwie strategie poszukiwania leków

do zastosowania w kombinacji z radioterapią, szeroko eksplorowane w ostatnich latach:

poszukiwanie radiouczulaczy wśród związków o znanych celach molekularnych, które

to cele zostały równocześnie określone w literaturze jako determinanty komórkowej

radiooporności;

projektowanie analogów związków pochodzenia naturalnego w oparciu o analizę SAR

(ang. structure activity relationship, związek pomiędzy strukturą chemiczną

a właściwościami biologicznymi) z nadzieją na otrzymanie pochodnych o ulepszonych

właściwościach biologicznych i farmakokinetycznych oraz równocześnie

przewidywanej niskiej toksyczności ogólnoustrojowej.

Kontrola promienioczułości komórek nowotworowych za pomocą związków

naturalnych mogłaby zwiększyć skuteczność radioterapii oraz równocześnie ograniczyć

efekty uboczne prowadząc do poprawy wyników leczenia. Wśród licznych mechanizmów

molekularnych determinujących radiooporność nowotworów wymienia się często

nadekspresję genów prożyciowych oraz hiperaktywację białek prożyciowych, między innymi

czynników wzrostowych. Substancje radiouczulające celują w rozmaite mechanizmy

radioprotekcyjne, niektóre upośledzają również podstawowe funkcje komórkowe, takie 8

Page 9: 6.11.14 doktorat_final-final

jak replikacja DNA, prowadząc do zablokowania podziałów komórek i w efekcie

zahamowania wzrostu guza. Z tego względu genisteina jako związek naturalny zdolny

do hamowania aktywności równocześnie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)

oraz enzymu uczestniczącego w replikacji DNA – topoizomerazy II, a jednocześnie blokujący

cykl komórkowy w najbardziej radiowrażliwej fazie G2/M, wydaje się wyjątkowo

interesująca jako potencjalny radiouczulacz. Należy przy tym podkreślić, że, pomimo

że genisteinę testowano w kombinacji z radioterapią w badaniach przedklinicznych,

nie są znane prace, w których pokazano by, że mechanizmem odpowiedzialnym

za jej właściwości radiouczulające jest zdolność do hamowania aktywności EGFR

czy topoizomerazy II.

EGFR jest znanym celem dla terapii przeciwnowotworowej – hiperaktywację EGFR

obserwuje się w wielu typach nowotworów, a dodatkowo aktywność EGFR pobudzana jest

po zastosowaniu promieniowania jonizującego, co zostało opisane w literaturze jako jeden

z nowotworowych mechanizmów radiooporności. Co więcej, aktywowany EGFR prowadzi

do uruchomienia ważnych dla radiooporności komórkowej ścieżek przekazu sygnału, w tym

RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT oraz oddziałuje z enzymem odpowiedzialnym za naprawę

uszkodzeń DNA w jądrze – kinazą DNA-PK. Zablokowanie funkcji EGFR skutkuje

obniżeniem poziomu proliferacji i wzrostu komórek nowotworowych, obniżeniem odporności

na czynniki indukujące śmierć komórkową, spadkiem poziomu inwazyjności komórek

nowotworowych oraz ich zdolności do rozsiewu i adhezji, może też ograniczać zdolność

komórek do naprawy uszkodzeń DNA.

Topoizomeraza II, jako enzym regulujący topologię DNA, uczestniczy

w podstawowych procesach komórkowych takich jak replikacja DNA, transkrypcja,

rekombinacja oraz utrzymanie struktury chromatyny. Zahamowanie jej funkcji przez związek

z grupy „trucizn” TOPO II wywołuje powstanie podwójnych pęknięć w nici DNA, co może

prowadzić do śmierci komórki.

Pomimo trwających od około 20 lat intensywnych badań opisujących rozmaite funkcje

i właściwości przeciwnowotworowe genisteiny, izoflawon nie został dotychczas wdrożony

do leczenia. Wśród głównych przeszkód wymienia się zbyt niską aktywność genisteiny, czyli

działanie w zbyt wysokich stężeniach niemożliwych do osiągnięcia w osoczu krwi oraz niską

biodostępność izoflawonu i jego słabe wchłanianie z przewodu pokarmowego. W celu

poprawy właściwości farmakokinetycznych genisteiny od prawie dwóch dekad prowadzone

9

Page 10: 6.11.14 doktorat_final-final

są badania, których celem jest uzyskanie skutecznego analogu, który wykazywałby większą

stabilność w ustroju oraz działał przeciwnowotworowo w niższych stężeniach.

W poniższej pracy opisane zostały wyniki doświadczeń przeprowadzonych

dla genisteiny oraz jej dziesięciu cukrowych pochodnych zsyntezowanych w zespole

kierowanym przez prof. dr hab. inż. Wiesława Szeję z Katedry Chemii Organicznej,

Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej. Badania

opisują zdolność związków do zwiększania cytotoksycznego działania promieniowania

jonizującego oraz oceniają czy właściwość ta może być, przynajmniej częściowo, zależna

od obniżania aktywności EGFR, AKT, ERK 1/2 i/lub topoizomerazy II przez poszczególne

analogi. Badania miały zasadniczo charakter przesiewowy, a ich głównym celem było

wyodrębnienie związku/związków o najlepszych właściwościach radiouczulających oraz

określenie prawdopodobnego mechanizmu działania.

Do badań wybrano dwie linie szybko proliferujących komórek nowotworowych,

a zatem zawierających wysokie stężenie topoizomerazy II, oraz o wysokim poziomie

ekspresji EGFR – linię raka gruczołu krokowego DU145 oraz raka jelita grubego HCT116.

Równocześnie były to linie wykazujące zróżnicowaną radiooporność. Co więcej, dane

z piśmiennictwa pokazują, że w przypadku nowotworów gruczołu krokowego i jelita grubego

obserwuje się słabsze efekty działania inhibitorów EGFR w kombinacji z promieniowaniem

w porównaniu do innych typów nowotworów, racjonalne jest więc poszukiwanie związków

o potencjalnej większej skuteczności terapeutycznej w odniesieniu do tych typów

nowotworów. Dodatkowo linię HCT116 wybrano do badań ze względu na występowanie

mutacji aktywujących w genach K-RAS oraz PI3CK, które powodują konstytutywną

aktywację szlaków RAF-MAPK oraz PI3K-AKT niezależnie od poziomu aktywności EGFR.

Związki wytypowane do badań niniejszej pracy są pochodnymi genisteiny powstałymi

poprzez wprowadzenie dodatkowych grup chemicznych w pozycjach najczęściej

modyfikowanych w cząsteczce genisteiny – przy grupach hydroksylowych występujących

przy węglach C-7 oraz C-4’. Grupy ramnalowe przyłączono poprzez łącznik alkilowy

do cząsteczki aglikonu wiązaniem O-glikozydowym bądź C-glikozydowym. W jednym

wypadku – związku referencyjnego G21 – grupę laktalową przyłączono bezpośrednio

do cząsteczki genisteiny w pozycji C-7.

Jako metodę określenia wartości IC50 dla każdego ze związków oraz promieniowania

jonizującego wybrano test klonogenności. Dzięki zastosowaniu programu CalcuSyn możliwe

było określenie które ze związków i w jakich stężeniach będą zwiększały

10

Page 11: 6.11.14 doktorat_final-final

przeciwnowotworowy efekt działania radioterapii w sposób synergistyczny, a zatem

związków o właściwościach radiouczulających. Technika „western blot” została użyta w celu

wykrycia poziomu ekspresji oraz fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu oraz

aktywności białek stanowiących elementy szlaków sygnałowych zależnych od EGFR – AKT

oraz ERK 1/2. Test „immunoband depletion” zastosowano w celu sprawdzenia czy pochodne

genisteiny mogą mieć charakter „trucizn” topoizomerazy II stabilizujących kompleksy

topoizomerazy II z DNA.

Dla pochodnych podstawionych przy węglu C-7 obserwowano zależność pomiędzy

zdolnością do hamowania aktywności EGFR a zwiększaniem cytotoksycznego wpływu

promieniowania jonizującego na komórki nowotworowe w linii HCT116. Podobnych

zależności nie obserwowano w linii DU145. Dla pochodnych cukrowych podstawionych przy

węglu C-4’ nie obserwowano właściwości hamowania aktywności EGFR. Uzyskane efekty

silnie synergistyczne w kombinacji z promieniowaniem jonizującym w linii DU145 muszą

zależeć od innych mechanizmów.

Tylko dwie pochodne hamowały aktywność topoizomerazy II w obu liniach

komórkowych indukując kowalencyjne kompleksy enzymu z DNA: G21 oraz RAM-5. Tylko

RAM-5 wywoływał obniżenie aktywności AKT oraz ERK 1/2 w obu testowanych liniach

komórkowych.

Spośród dziesięciu testowanych pochodnych wyselekcjonowano jedną, która

powodowała wystąpienie efektów synergistycznych w kombinacji z radioterapią oraz

równocześnie w najniższych stężeniach (5 μM) spośród wszystkich związków hamowała

aktywność EGFR, AKT, ERK 1/2 oraz topoizomerazy II. Była to pochodna oznaczona

RAM-5. Pochodną tą wytypowano spośród badanych analogów genisteiny jako związek

o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w kombinacji z radioterapią. Ze względu

na obiecujące wyniki badań in vitro istnieją wystarczające przesłanki do rozpoczęcia badań

in vivo, których celem byłoby określenie ewentualnej przydatności klinicznej związku.

Pomimo istotnych różnic w budowie chemicznej ramnalowych analogów genisteiny

badanych w niniejszej pracy, większość pochodnych powodowała powstanie efektów

synergistycznych w kombinacji z promieniowaniem jonizującym. Pomimo,

że nie dla wszystkich badanych związków udało się określić prawdopodobny mechanizm

działania, a na postawie zebranych danych nie udało się określić zależności struktury

od aktywności biologicznej (analiza SAR) dla wszystkich pochodnych, wyniki niniejszej

pracy pokazują, że poszukiwanie potencjalnych leków wśród analogów związków

11

Page 12: 6.11.14 doktorat_final-final

naturalnych o udokumentowanym działaniu przeciwnowotworowym stanowi strategię

racjonalną i skuteczną. Badania niniejszej pracy pozwoliły na wytypowanie spośród

dziesięciu analogów genisteiny związku skutecznie hamującego proliferację komórek

HCT116 oraz DU145, o dobrych właściwościach radiouczulających, działającego in vitro

w stężeniu możliwym do osiągnięcia w ustroju oraz określić, przynajmniej częściowo,

mechanizm jego działania. Należy przy tym podkreślić, że wszystkie obserwowane wyniki

z badań in vitro muszą zostać potwierdzone w badaniach z użyciem modeli zwierzęcych.

12

Page 13: 6.11.14 doktorat_final-final

SUMMARY

The last few decades has led to significant advances in cancer research including

identification of molecular targets for chemotherapy. Understanding the mechanisms

of cancer development, initiation, promotion and progression has been crucial for developing

strategies targeting specific proteins and enzymes. Impairing or blocking the activity

of specific molecular targets is a common strategy currently used in anticancer drugs

development. The combined use of targeted chemotherapy with radiotherapy is especially

justified for patients who failed radiotherapy due to existence of radioresistant cancer cells.

In the same time increasing the dose of ionizing radiation energy is not possible due

to the simultaneous increase in toxicity. Radiosensitizers are drugs intended to enhance

tumour cell death while having much less effect on normal tissues. The mechanism of action

of radiosensitizers is based on precise targeting of specific molecular targets without

increasing the toxicity of radiation therapy.

The concept of this study combines two strategies for development of anticancer

agents for use in chemotherapy widely explored in recent years:

• search of radiosensitizers within drugs with known molecular targets simultaneously defined

as determinants of cellular radioresistance;

• design of analogues of compounds of natural origin based on structure activity relationship

with the hope to obtain derivatives with improved biological and pharmacokinetic properties

and at the same time low toxicity.

The ability to control radiosensitivity of tumour cells by natural compounds could

enhance the effectiveness of radiotherapy and simultaneously reduce its side effects leading

to improved treatment results. Among the numerous molecular mechanisms determining

cancer radioresistance, overexpression and hyperactivity of survival pathways are pointed.

Radiosensitizer increase the therapeutic effect of radiation in various mechanisms, some

compromise the basic cellular functions such as DNA replication leading to the blockage

of cell division and thus result in tumour growth inhibition. Therefore, genistein as a natural

compound capable of inhibiting the activity of both the epidermal growth factor receptor –

EGFR, and an enzyme involved in the replication of DNA - topoisomerase II, while blocking

the cell cycle at the most radiosensitive G2/M phase, appears to be particularly interesting

as potential radiosensitizer. It should be noted that, although that genistein was tested

in combination with radiation therapy in preclinical studies, there are no studies showing that

13

Page 14: 6.11.14 doktorat_final-final

the mechanisms responsible for its radiosensitizing properties are its ability to inhibit EGFR

activity or topoisomerase II activity.

EGFR is a well-known target for anti-cancer therapy – hyperactivity of EGFR

is observed in many tumour types and in addition ionizing radiation stimulates the activity

of EGFR, which has been described as one of the mechanisms of tumour radioresistance.

Moreover, the phosphorylated EGFR activates radioresistance signal transduction pathways

including RAS-RAF-MAPK and PI3K-AKT pathways and interacts with the enzyme

responsible for the DNA repair – DNA-PK. Blocking EGFR activity results in reduced level

of cell proliferation and tumour cell growth, a reduced resistance to cell death-inducing

agents, reduced level of metastasis and adhesion of tumour cells, it can also limit the ability

of cells to repair DNA damage.

Topoisomerase II, an enzyme that regulates DNA topology, is involved in the basic

cellular processes such as DNA replication, transcription, recombination and maintenance

of chromatin structure. Inhibition of the function of TOPO II by the compound acting

as TOPO II poison could lead to induction of double strand breaks in DNA and eventually

to cancer cell death.

Although the intensive research in anticancer properties of genistein have been

conducted for about 20 years, isoflavone have not yet been introduced for the cancer

treatment. Among the main obstacles mentioned are the low activity and bioavailability

of genistein and its poor absorption from the gastrointestinal tract. In order to improve

the pharmacokinetic properties of genistein, researches are carried out for almost two decades

with the hope to obtain an efficient analogue which would exhibit greater stability in human

body and activity at lower concentrations.

In this paper the results of experiments carried out for genistein and its ten sugar

derivatives synthesized in the laboratory of Professor Wieslaw Szeja at the Department

of Organic Chemistry, Bioorganic Chemistry and Biotechnology, Silesian University

of Technology are described. The ability of tested compounds to increase the cytotoxic effects

of ionizing radiation was analysed and whether this property can be at least partially

dependent on the reduction of the activity of EGFR, AKT, ERK 1/2 and/or topoisomerase II

by various analogues was assessed. The research was essentially the nature of screening,

and the main aim was to select the compound of the best radiosensitizing properties

and to determine its probable mechanism of action.

14

Page 15: 6.11.14 doktorat_final-final

Cancer lines selected for studies were DU145 and HCT116 – two rapidly proliferating

lines (and thus containing a high concentration of topoisomerase II) and with high level

of EGFR expression. At the same time DU145 and HCT exhibit a diverse radioresistance

(line of high radioresistance and radiosensitive line respectively). Moreover, data from

the literature show that in prostate and colorectal cancers, the effect of EGFR inhibitors

in combination with radiation compared to other types of cancers are weaker, it is therefore

rational to search for compounds with potential therapeutic efficacy increased. Additionally,

HCT116 line was selected for analysis due to the presence of activating mutations in K-RAS

genes and PI3CK that cause constitutive activation of RAF-MAPK and the PI3K-AKT

pathways irrespectively of the level of EGFR activity.

The compounds selected for studies were derived from genistein. Modifications were

made by the introduction of additional chemical moieties to the molecule. Chemical moieties

were substituted with the hydroxyl groups present at the C-7 and C-4'. Rhamnal groups were

attached through an alkyl linker to aglycone with O-glycosidic or C-glycosidic bond. In one

case – the reference compound G21 – laktal group was attached directly to the genistein

at C-7.

Clonogenic assay was used to calculate IC50 values for each compound

and the ionizing radiation. CalcuSyn software was used to determine radiosensitizing

properties of tested compounds. Western blot analysis was used to detect the level

of expression and phosphorylation of EGFR and the activity of EGFR-dependent proteins

AKT and ERK 1/2 in cells pre-treated with genistein derivatives. Immunoband depletion test

was used to determine TOPO II poisons among genistein derivatives.

Among the derivatives tested one was selected for in vivo studies. RAM-5 produced

synergistic effects in combination with radiotherapy and at the same time inhibited

the activity of EGFR, AKT, ERK 1/2 and topoisomerase II at low concentrations (5 μM).

For derivatives substituted at C-7 relationship between the ability to inhibit EGFR

activity and increasing the cytotoxic effect of ionizing radiation in the tumour cell line

HCT116 was observed. A similar correlation was not observed in the DU145 cancer cell line.

Derivatives substituted at C-4' did not inhibit EGFR activity. Strong synergistic effects

produced in combination with ionizing radiation in the line DU145 must depend on other

mechanisms.

15

Page 16: 6.11.14 doktorat_final-final

Only two derivatives inhibited topoisomerase II activity in both cancer cell lines.

RAM-5 and G21 induced covalent complexes of TOPO II and DNA. Only RAM-5 induced

decrease in the activity of AKT and ERK1/ 2 in both cancer cell lines.

The compound selected for potential clinical use in combination with radiotherapy

is RAM-5. Due to the promising results of in vitro studies, there is sufficient evidence

to initiate an in vivo studies to determine the potential clinical utility of the compound.

Despite significant differences in the chemical structure of Rhamnal analogues

of genistein, most derivatives produced synergistic effects when combined with ionizing

radiation. Although it was not possible to determine the probable mechanism of action

for all of the tested compounds and on the basis of the data collected the structure-activity

relationship could not be determined, the results of this study show that the search

for potential drugs among analogues of natural compounds with proven antitumor activity

is rational and an effective strategy. Screening studies described here allowed for the selection

of analogue (RAM-5) with effective inhibitory activity on HCT116 and DU145 cell

proliferation and radiosensitizing properties in vitro and acting in concentrations achievable

in human serum (5 μM). It was also possible to define, at least partially, the mechanism

of its action. It should be emphasized that all of the observed results from in vitro studies must

be confirmed in vivo.

16

Page 17: 6.11.14 doktorat_final-final

I. WSTĘP

I.1. Genisteina jako potencjalny farmaceutyk

Genisteina jest pod względem chemicznym trójhydroksylową pochodną

3-fenylochromen-4-onu i zaliczana jest do izoflawoinoidów, jednej z podgrup izoflawonów.

Genisteina, wraz z licznymi związkami o potencjalnym działaniu biologicznym, występuje

u wielu gatunków roślin, z których jedynie kilka ma istotne znaczenie jako składniki ludzkiej

diety. Najbogatszym źródłem genisteiny są nasiona soi (łac. Glycine max). Genisteina

występuje w niesfermentowanych sojowych produktach spożywczych głownie w postaci

glikokoniugatów w stężeniu od 0.2-1mg/g . Ze względu

na funkcjonalne i strukturalne podobieństwo do estrogenów ssaków genisteinę zalicza

się do fitoestrogenów . Strukturę genisteiny przedstawiono na rycinie I.1.

Rycina I.1. Struktura chemiczna genisteiny.

W roku 1931 wykazano, że genisteina jest głównym fitoestrogenem występującym

w soi , a w kolejnych latach stwierdzono, że obecność izoflawonów

w pożywieniu owiec oraz gepardów może korelować z pojawiająca się u nich niepłodnością.

W poszukiwaniu przyczyn obserwowanego zjawiska wykazano, że substancje pochodzenia

roślinnego o słabym działaniu estrogenowym mogą wywoływać u ssaków efekt

antyestrogenny, którego konsekwencją jest obniżenie

ich zdolności reprodukcyjnych.

Obecnie wiadomo, że genisteina zachowuje się jak agonista lub antagonista receptora

estrogenowego (ang. estrogen receptor, ER) zależnie od tkanki docelowej oraz środowiska

hormonalnego, co oznacza, że stymuluje bądź hamuje aktywność ER. Ta właściwość

klasyfikuje genisteinę do grupy selektywnych modulatorów receptora estrogenowego

(ang. selective estrogen receptor modulator, SERM) . Receptory estrogenowe występują w

dwóch izoformach: ERα oraz ERβ, których dystrybucja w tkankach jest niejednorodna.

Receptor ERα występuje w przewadze w macicy, przysadce mózgowej, wątrobie, jądrach,

nadnerczach i nerkach, podczas gdy ERβ w gruczole krokowym, płucach, śledzionie,

pęcherzu moczowym oraz przewodzie pokarmowym. Ekspresję obu typów receptora

17

Page 18: 6.11.14 doktorat_final-final

obserwuje się w kościach, gruczole piersiowym oraz

w mózgu. Wzajemne proporcje ERα i ERβ w komórce decydują o efekcie proliferacyjnym

wywoływanym przez SERM (stymulowaniu lub zahamowaniu podziału komórki) oraz

o oporności na leczenie hormonalne. Selektywność SERM warunkowana jest ponadto

zróżnicowanym wpływem związku na receptory ERα i ERβ oraz ilościowym i jakościowym

składem koaktywatorów i korepresorów transkrypcji w tkance .

Według danych z piśmiennictwa powinowactwo genisteiny do ERα w porównaniu

z estradiolem jest równe 4%, a do ERβ aż 87%, a odpowiednie stałe dysocjacji Ki wynoszą

2.6 nM oraz 0.3 nM . Oznacza to, że ERβ wiąże genisteinę z takim samym powinowactwem,

jakie wykazuje w stosunku do swego endogennego ligandu – estronu (E1). Mechanizm

działania genisteiny polega na konkurowaniu z ligandem o jego miejsce wiązania w ER

(inhibicja kompetycyjna). Niski poziom ERβ w macicy sugeruje,

że wybiórcze agonistyczne działanie genisteiny względem tej izoformy receptora nie niesie

za sobą zwiększonego ryzyka zachorowania na endometrialnego raka macicy (Messina,

2014). Już około dwie dekady temu wykazano, że w komórkach raka piersi MCF7 genisteina

obniża poziom mRNA receptora estrogenowego, co w konsekwencji prowadzi do obniżonej

odpowiedzi na estradiol, a w ten sposób do obniżenia proliferacji komórkowej oraz ryzyka

zachorowania na raka .

Zainteresowanie genisteiną jako potencjalnym związkiem przeciwnowotworowym

pojawiło się w wyniku wykrycia w kulturach bakterii z rodzaju Streptomyces nieznanej

substancji indukującej różnicowanie mysich komórek białaczkowych, a dzięki temu

obniżającej liczbę nieprawidłowych komórek nowotworowych krwi. Substancja ta nie

wykazywała toksyczności ogólnej u myszy i została nazwana differenolem A . Wkrótce

okazało się, że jest to genisteina. Kluczowym odkryciem w historii badań

nad genisteiną, jako związkiem hamującym wzrost komórek nowotworowych, było

wykazanie w badaniach z wykorzystaniem testów bezkomórkowych, że genisteina wykazuje

zdolność do specyficznego hamowania aktywności białkowych kinaz tyrozynowych,

nie wpływając bądź hamując w stopniu nieistotnym aktywność kinaz serynowo/treoninowych

. Ponieważ wiele onkogenów koduje białkowe kinazy tyrozynowe, odkrycie nowej substancji,

która hamuje aktywność tej klasy enzymów dawało nadzieję

na włączenie genisteiny do grupy leków przeciwnowotworowych. Powyższe wyniki

zaowocowały zainicjowaniem licznych badań i w konsekwencji publikacji prac opisujących

właściwości genisteiny istotne z farmakologicznego punktu widzenia.

18

Page 19: 6.11.14 doktorat_final-final

W 1989 roku Markovits et al. (1989) wykazali, że genisteina jest inhibitorem

topoizomerazy II, a cztery lata później pojawiła się praca , w której opisano zdolność

izoflawonu do zwiększania akumulacji leków w komórkach wykazujących odporność

wielolekową MDR (ang. non P-glycoprotein mediated multidrug resistance).

Z kolei dane z równolegle prowadzonych badań epidemiologicznych sugerowały, że dieta

bogata w produkty sojowe może korelować w krajach azjatyckich z niższą zachorowalnością

(i umieralnością) na choroby układu krążenia i nowotwory, które występują z dużą

powszechnością w społeczeństwach zachodnich . Największe różnice w statystykach

zachorowalności pomiędzy populacjami azjatycką

a amerykańską dotyczą choroby wieńcowej, raka piersi i raka gruczołu krokowego . W 1995

roku NCI (ang. National Cancer Institute) wydał rekomendację w zakresie prowadzenia

badań nad genisteiną jako czynnikiem chemoprewencyjnym . Chociaż dotychczas genisteina

nie została zarejestrowana jako lek , znajduje się ona w sprzedaży w postaci

standaryzowanego ekstraktu izoflawonów z soi, jako suplement diety.

I.1.1. Badania in vitro, in vivo oraz próby kliniczne opisujące właściwości

przeciwnowotworowe genisteiny

Plejotropowe właściwości biologiczne genisteiny powodują, że jej ewentualne

medyczne zastosowanie było i jest nadal rozpatrywane w odniesieniu do chorób o rozmaitej

etiologii, w tym głównie chorób nowotworowych, krążeniowych, chorób i dolegliwości

związanych z okresem pokwitania, chorób genetycznych, takich jak mukowiscydoza

czy mukopolisacharydoza oraz innych dolegliwości, takich jak alergie i zwłóknienia .

Badania właściwości antyproliferacyjnych genisteiny pokazały, że izoflawon hamuje

wzrost wielu typów komórek nowotworowych. W badaniach in vitro wykazano

antyproliferacyjny efekt genisteiny względem komórek nowotworowych: piersi z linii

niezależnych od estrogenów BT-549, MDA-MB-231, HCC-1143, HCC-1937 oraz zależnych

od estrogenów MCF7 , gruczołu krokowego PC3 oraz DU145 , jelita grubego HT29 oraz

HCT116 , jajnika SKOV3 , szyjki macicy HeLa i CaSki , komórek

z linii chłoniakowych Ramos oraz Jurkat , czerniaka z linii B16 oraz linii A375 i 451Lu ,

przy czym w ostatniej cytowanej pracy genisteina występowała w postaci ekstraktu sojowego

(ang. BSE biotransformated soy extract). W wymienionych badaniach hamowanie proliferacji

komórek nowotworowych obserwowano dla stężeń genisteiny w zakresie mikromolowym.

19

Page 20: 6.11.14 doktorat_final-final

W najnowszych badaniach in vitro pokazano również na linii nowotworowej MKN45

raka żołądka, że genisteina zmienia poziom ekspresji Gli1 oraz CD44 – markerów

powierzchniowych nowotworowych komórek macierzystych (ang. cancer stem cells, CSC).

W cytowanej pracy sugerowano, że genisteina może stanowić skuteczny czynnik

terapeutyczny w leczeniu raka żołądka poprzez zmianę charakterystyki CSC, a zatem poprzez

indukcję różnicowania komórkowego. W innej pracy pokazano, że genisteina stosowana

w stężeniu 15μM hamuje samoodnowę CSC raka żołądka oraz obniża chemooporność

komórek nowotworowych na fluorouracyl i cisplatynę, a zjawisko to może być związane

z hamowaniem ekspresji genu ABCG2 (ang. ATP-binding cassette sub-family G member 2)

oraz aktywności kinazy ERK 1/2 (ang. extracellular signal-regulated kinases) . Podobne

właściwości genisteiny obserwowano w przypadku komórek raka prostaty PCa. W pracy

obserwowano obniżanie zawartości CD44 oraz hamowanie aktywności ścieżki Hedgehog-

Gli1 zarówno w badaniach in vitro jak i in vivo. Podobne wyniki badań przestawiono na

modelach mysich ksenograftów wywodzących

się z linii MCF7. W pracy wykazano, że genisteina podawana bezpośrednio

do guza (20-50 mg/kg masy ciała) zmniejsza pulę BCSC (ang. breast cancer stem-like cells),

a sugerowany mechanizm związany jest z hamowaniem aktywności ścieżki Hedgehog-Gli1.

Badania prowadzone in vivo również pokazują, że genisteina może wywoływać efekt

przeciwnowotworowy w odniesieniu do guzów o różnej etiologii. Zdolność do hamowania

wzrostu guzów czerniaka przez genisteinę udowodniono ponad 15 lat temu. W pracy

pokazano, że genisteina hamuje wzrost guza wywodzącego się z linii B16

u myszy karmionych tym izoflawonem przez tydzień przed oraz tydzień po inokulacji

komórek nowotworowych. Stężenie genisteiny w osoczu wynosiło 1.1 μM, co było wartością

podobną do osiąganej u ludzi spożywających dietę bogatą w produkty sojowe. Ostatnio

w badaniach na modelach mysich ksenograftów wywodzących się z linii MCF7 wykazano,

że genisteina podawana do guza (20-50 mg/kg masy ciała) hamuje jego wzrost .

Na modelach zwierzęcych potwierdzono także chemoprewencyjne właściwości

genisteiny. Wykazano, że karmienie myszy genisteiną w stężeniu 250 mg/kg masy ciała przez

dwa tygodnie przed implantacją komórek nowotworowych piersi (linia SHR) zmniejszało

o około 60% liczbę zwierząt, u których rozwinął się nowotwór w porównaniu do grupy

kontrolnej, której dieta nie zawierała genisteiny . Podobnie w badaniach myszy

transgenicznych z gluczolakorakiem prostaty (TRAMP, ang. transgenic adenocarcinoma of

mouse prostate) wykazano, że genisteina podawana przez około

20

Page 21: 6.11.14 doktorat_final-final

4 miesiące zwierzętom w stężeniu 300 mg/kg oraz 750 mg/kg masy ciała działa

chemoprewencyjnie obniżając liczbę zachorowań na ten nowotwór w sposób zależny

od stężenia. Należy przy tym zaznaczyć, że zmniejszenie liczby zachorowań (70% u grupy

kontrolnej, 47% u grupy karmionej niską dawką genisteiny oraz 32% u grupy karmionej

wysoką dawką genisteiny) obserwowane było wyłącznie u myszy z prawidłową formą

receptora estrogenowego . W innej pracy z wykorzystaniem modelów mysich pokazano, że

genisteina obniża rozmiar guzów wywodzących

się z komórek raka żołądka MGC-803, jeżeli podawana jest w dawce 1.5 mg/kg masy ciała

doguzowo na drodze iniekcji. Przeciwnowotworowe właściwości genisteiny obserwowano

również u myszy w odniesieniu do komórek białaczkowych (ATL, ang. adult T-cell leukemia)

, w przypadku nerwiaków (ang. neuroblastoma) oraz czerniaków wywodzących się z linii

B16 .

Pomimo zdolności do hamowania wzrostu komórek nowotworowych w warunkach

in vitro oraz przytoczonych powyżej danych z badań in vivo wskazujących

na przeciwnowotworowe właściwości związku, genisteina nie zawsze wywołuje podobny

efekt w doświadczeniach opartych o modele zwierzęce. Dane z badań in vivo

są niejednoznaczne i nie dają rozstrzygającej odpowiedzi na pytanie czy genisteina może być

uznana za efektywny związek przeciwnowotworowy. Już w początkowym okresie

intensywnych badań nad genisteiną pokazano, że związek ten w niskich stężeniach (10 nM,

100 nM) może stymulować proliferację komórek nowotworowych piersi zależnej

od estrogenów linii MCF7, a dopiero w stężeniach powyżej 20 μM hamuje ich wzrost.

W tej samej pracy wykazano, że podawanie myszom genisteiny w stężeniu 750 ppm przez

5 dni stymuluje wzrost guzów piersi . Podobny wynik uzyskano

w kolejnych eksperymentach , w których myszom podawano genisteinę w stężeniu 750 μg/g

masy ciała w AIN-93G (dieta opracowana przez American Institute

of Nutrition) przez trzy dni przed inokulacją komórek nowotworowych raka piersi

niezależnych od estrogenów MDA-MB-231 (stężenie związku w osoczu wynosiło średnio

1 μM). W badaniach tych wykazano również, że u myszy karmionych genisteiną w dawkach

do 6000 μg/g masy ciała zawartość związku w osoczu rośnie proporcjonalnie do stężenia

osiągając maksymalną wartość 7 μM, podczas gdy zawartość wolnej (aktywnej) formy

genisteiny wynosiła maksymalnie 2 μM u myszy karmionych genisteiną w stężeniu 6000 μg/g

masy ciała. Według niektórych danych literaturowych genisteina w stężeniach poniżej 10 M

stymuluje, podczas gdy w stężeniach wyższych hamuje proliferację komórek

21

Page 22: 6.11.14 doktorat_final-final

nowotworowych piersi . Jedna z najnowszych prac opisujących badania

in vivo z użyciem modeli ksenograftów mysich wywodzących się z linii MCF7 pokazuje,

że długoterminowa konsumpcja niskich dawek genisteiny (≤500 ppm) promuje proliferację

komórek nowotworowych piersi i skutkuje powstaniem guzów o bardziej agresywnym

fenotypie . Dodatkowo w badaniach in vitro z użyciem komórek raka piersi z estrogeno-

zależnej linii MCF7 oraz komórek raka jelita grubego HT29 wykazano,

że genisteina stosowana w stężeniach mikromolowych (10 μM oraz 1 μM) nie tylko wywołuje

stymulację proliferacji tych komórek, ale również hamuje cytotoksyczny efekt działania

cisplatyny. Obserwowano, że w komórkach MCF7, ale nie HT29, estradiol neutralizował

ten efekt . Dane te mogą sugerować, że genisteina przy niedoborze estradiolu, czyli w

sytuacji, jaka występuje u kobiet w okresie pomenopauzalnym, może obniżać

przeciwnowotworową aktywność cisplatyny względem nowotworów piersi. Należy

przy tym podkreślić, że badania tej pracy pokazały, że genisteina stosowana w stężeniach

znacząco wyższych, 100 μM, wywoływała skuteczne zahamowanie proliferacji komórkowej

i działała addytywnie w kombinacji z cisplatyną hamując wzrost komórek obu badanych linii.

W najnowszej pracy z wykorzystaniem modelu drugorzędowych ksenograftów mysich

pokazano, że genisteina sprzyja progresji nowotworów powstałych

z implantowanych komórek ludzkiego raka stercza uzyskanych od pacjenta. Zbiór

piśmiennictwa przedstawiony powyżej pokazuje, że możliwą przyczyną obserwowanego

w niektórych doświadczeniach braku efektu przeciwnowotworowego genisteiny może

być niskie stężenie tego związku osiągane w osoczu zwierząt.

Obok danych z badań in vitro oraz in vivo w piśmiennictwie dostępne są prace

opisujące wyniki prób klinicznych z użyciem genisteiny. Zakończone dotychczas testy

kliniczne z zastosowaniem genisteiny dotyczyły, w znacznej przewadze, jej potencjalnego

użycia w leczeniu objawów pomenopauzalnych oraz oceny wpływu związku na ryzyko

zachorowania na raka piersi, gruczołu krokowego, endometrium czy pęcherza. W badaniach

klinicznych genisteiny ocenia się również bezpieczeństwo spożywania tego związku i/lub

produktów sojowych, szczególnie w przypadku pacjentek z podwyższonym ryzykiem

wystąpienia nowotworu piersi. Genisteina, jako agonista receptora estrogenowego ERα, może

teoretycznie wywoływać progresję choroby u pacjentek z ER-pozytywnym nowotworem

piersi. Podsumowanie badań klinicznych dotyczących znaczenia genisteiny u kobiet

w okresie przekwitania znajduje się w pracach , natomiast dane z badań klinicznych

22

Page 23: 6.11.14 doktorat_final-final

opisujących wpływ związku na ryzyko zachorowania

na nowotwory oraz potencjalne znaczenie chemoprewencyjne zebrano w następujących

pracach przeglądowych: . Należy przy tym zauważyć, że trwające od ponad 20 lat badania nie

rozstrzygają kwestii ewentualnego skutecznego zastosowania genisteiny w

chemoprewewncji . Obecnie trwają badania kliniczne nad zastosowaniem genisteiny w

prewencji raka gruczołu krokowego, jelita grubego, pęcherza, piersi i endometrium

(http/www.clinicaltrials.gov), jednak na razie nie są znane raporty podsumowujące ostateczne

wyniki tych badań.

Niespójne wyniki badań uzyskiwane dla genisteiny w różnych modelach

doświadczalnych mogą, przynajmniej częściowo, wyjaśniać wyniki eksperymentów

przedstawione w pracy . W badaniach klinicznych II fazy porównywano przemiany

metaboliczne izoflawonów sojowych w organizmie ludzkim z przemianami następującymi w

modelach mysich. Wyniki pokazały, że znacząco większe stężenia biologicznie aktywnej

formy genisteiny (nieskoniugowanej) obserwuje się u zwierząt. Stężenie aktywnej genisteiny

u szczurów Sprague-Dawley, myszy C57BL/6, nagich

i transgenicznych myszy AngptL4B6 było odpowiednio 20, 23, 58, i 150 razy większe

niż u ludzi.

Przytoczony przegląd literaturowy pokazuje, że odpowiedź komórek nowotworowych

na działanie genisteiny jest zróżnicowania, złożona i wielokierunkowa i może zależeć między

innymi od rodzaju nowotworu bądź typu linii komórkowej czy użytego modelu badawczego

(linia komórkowa / modele zwierzęce / badania kliniczne u ludzi), jak również użytego

stężenia związku. W celu wyjaśnienia mechanizmu działania genisteiny oraz określenia

jej ewentualnej przydatności klinicznej konieczne są dalsze badania.

I.1.2. Mechanizmy przeciwnowotworowego działania genisteiny

Pomimo relatywnie prostej budowy chemicznej cząsteczki genisteiny, mechanizm

jej działania na poziomie molekularnym nie został dokładnie poznany. Liczne dane

eksperymentalne pokazują, że genisteina może modulować przebieg różnych procesów

biochemicznymi i przebieg różnych ścieżek przekazywania sygnału, innymi słowy genisteina

jest związkiem o działaniu plejotropowym, zmieniającym aktywność wielu potencjalnych

celów molekularnych dla terapii przeciwnowotworowej (Mahmoud et al., 2014, Wang, et al.,

2013). Spośród licznych celów molekularnych genisteiny zidentyfikowanych do tej pory,

najczęściej badanymi i najszerzej opisanymi w literaturze są, oprócz wymienionych wcześniej

23

Page 24: 6.11.14 doktorat_final-final

receptorów estrogenowych – białkowe kinazy tyrozynowe (ang. protein tyrosine kinases,

PTK), w tym głównie receptor naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth

factor receptor, EGFR) oraz topoizomeraza typu II (ang. topoisomerase II, TOPOII).

EGFR jest receptorem kontrolującym istotne dla przeżycia komórki szlaki przekazu

sygnału, w tym ścieżki RAS-RAF-MAPK, PI3K-AKT, JAK-STAT oraz PCK-kalmodulina.

W wielu typach nowotworów EGFR ulega nadekspresji i hiperaktywacji, dlatego jego

zwiększony poziom u diagnozowanych chorych uważany jest za niekorzystny czynnik

prognostyczny . Co więcej, nadmierna aktywacja EGFR w komórkach poddawanych

działaniu promieniowania jonizującego jest jednym

z czynników zwiększających radiooporność komórek . Stąd też EGFR jest szczególnie

intersujących celem molekularnym, ponieważ poprzez hamowanie jego aktywności można

hamować przebieg procesów istotnych dla transformacji oraz progresji nowotworowej, a

mianowicie zmniejszać tempo proliferacji, wzrostu oraz inwazyjności komórek, osłabiać

oporność komórek

na czynniki indukujące śmierć, a także ograniczać zdolność komórek do naprawy uszkodzeń

DNA . Właściwość hamowania przez genisteinę aktywności EGFR pozwala na

zaklasyfikowanie tego izoflawonu do grupy inhibitorów EGFR o potencjalnej przydatności

klinicznej . Szczegółowe informacje na temat EGFR, jego funkcji w komórce oraz zdolności

genisteiny do hamowania aktywności tej kinazy są przedstawione w dalszej części „Wstępu”

(podrozdział I.2.3).

Interesujące badania kliniczne II fazy ocieniające wpływ genisteiny na aktywność

receptora naskórkowego czynnika wzrostu i podległych mu szlaków przekazu sygnału

w prawidłowej tkance nabłonkowej pęcherza oraz w tkance nowotworu opisano w pracy . W

próbie wzięło udział 59 pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego (średnia

wieku 71 lat), którym przez 14 do 21 dni przed operacją podawano doustnie genisteinę w

postaci oczyszczonego ekstraktu sojowego w stężeniach

300 lub 600 mg/dobę. Grupa kontrolna otrzymywała placebo. Badania pokazały, że genisteina

była dobrze tolerowana przez pacjentów. Związek ten wykrywano w osoczu i moczu

pacjentów w stężeniach większych niż u osób otrzymujących placebo, ale nie obserwowano

zależności od dawki. Niezwykle ciekawe były wyniki analizy poziomu pEGFR w tkance

nowotworowej, które pokazały, że poziom fosforylacji EGFR spada w grupie pacjentów

otrzymującej 300 mg/dzień genisteiny, ale nie 600 mg/dzień w porównaniu z pacjentami

otrzymującymi placebo. Pomiary wykonano również dla prawidłowej tkanki nabłonka

24

Page 25: 6.11.14 doktorat_final-final

pęcherza, nie obserwując istotnych różnic w zawartości pEGFR pomiędzy grupami

spożywającymi genisteinę w różnych stężeniach a grupą kontrolną. W tkance nowotworowej

nie stwierdzono istotnych różnic w zawartości białek COX-2, Ki-67, aktywowanej kaspazy-3,

AKT, pAKT, kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) czy p-MAPK. Praca

ta pokazuje, że genisteina może obniżać fosforylację EGFR w tkance nowotworowej raka

pęcherza u ludzi w stężeniach możliwych do osiągnięcia w ustroju, a jednocześnie

nie zmieniać zawartości pEGFR w tkance zdrowej, co może sugerować pewną selektywność

związku.

Topoizomeraza II, drugi cel molekularny dla genisteiny testowany w badaniach

niniejszej pracy, jest enzymem katalizującym reakcje przecinania oraz łączenia nici DNA.

TOPO II uczestniczy w istotnych procesach komórkowych takich jak replikacja DNA,

transkrypcja, rekombinacja oraz utrzymanie struktury chromatyny . Zablokowanie funkcji

topoizomerazy II może zatem doprowadzić

do zahamowania wzrostu komórkowego, a nawet śmierci komórek. Genisteina jest zaliczana

do grupy inhibitorów topoizomerazy II nazywanych „truciznami” TOPO II, czyli związków

stabilizujących kompleksy DNA-topoizomeraza II poprzez wiązanie się z tymi kompleksami.

Związki będące truciznami TOPO II mogą wywoływać powstanie podwójnych pęknięć w nici

DNA i zapobiegać ich naprawie, co w konsekwencji prowadzi do śmierci komórki .

Szczegółowe informacje na temat topoizomerazy II,

jej funkcji w komórce oraz zdolności genisteiny do hamowania jej aktywności zostały

przedstawione w dalszej części „Wstępu” (rozdział I.2.7). Nie są znane żadne badania

kliniczne oceniające wpływ genisteiny na zawartość TOPO II w tkankach ludzkich.

Oprócz wymienionych powyżej głównych celów molekularnych genisteiny wykazano

lub sugerowano w szeregu badań, że związek ten może modulować działanie wielu innych

białek o rozmaitych funkcjach. Do znanych lub domniemanych celów molekularnych

genisteiny można zaliczyć: białka regulujące proces apoptozy , białka kontrolujące progresję

cyklu komórkowego , czynniki transkrypcyjne , elementy szlaków przekazu sygnału, w tym

kinazy AKT czy MAPK oraz białka regulujące status oksydacyjny komórki . Wykazano

ponadto, że genisteina może powodować zmiany epigenetyczne poprzez koordynację

demetylacji promotorów wyciszonych genów . Poznane

do tej pory cele molekularne dla genisteiny pogrupowano według funkcji, jaką pełnią

w komórce i przedstawiono w tabeli I-1.

25

Page 26: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela I-1. Wybrane cele molekularne dla genisteiny wraz z zaznaczonym efektem działania genisteiny: hamowanie (↓) bądź stymulowanie (↑) funkcji białka. Cele molekularne pogrupowano, w zależności od regulowanych procesów komórkowych, na czynniki uczestniczące w apoptozie, regulacji cyklu komórkowego, czynniki transkrypcyjne oraz inne czynniki, które nie zaliczają się do żadnej z powyższych grup. Podano również główne cele molekularne dla genisteiny. Tabela została przygotowana w oparciu o przegląd literaturowy przedstawiony w pracy oraz uzupełniona o informacje przedstawione w pracach wymienionych w powyższym paragrafie.

Główne cele molekularne Apoptoza Czynniki

transkrypcyjneCykl komórkowy Inne

↑ Bax ↓ ↓ NF-κB ↓ Cyklina B1 ↓ Akt↓ EGFR ↓ Bcl-2 ↑ Nrf1 ↓ Cyklina D1 ↓ AR↓ TOPO II ↓ Bcl-xl ↑ Nrf2 ↑ p21WAF1 ↓ PSA↓ ER ↑ PARP ↓ STAT-3 ↑ p27KIP1 ↓ COX-2

↓ Surwiwina ↓ STAT-5 ↑ p16INK4α ↓ MMP-9↓ IAP ↓ IGF-1R ↑ Myt-1 ↓ MMP-2↓ XIAP ↓ Ape-1/Ref ↓ Wee-1 ↓ p38 MAPK↑ BAD ↓ Wnt ↓ CDK-1 ↓ ERK 1/2↑ Aktywne kaspazy ↓ vNotch-2 ↑ Chk1 ↑ GPx↑ ER regulatory stresu ↓ AP-1 ↑ Chk2 ↑ kangai-1

↓ CREB ↑ ATM ↓ Endoglina↑ GADD153 ↑ ATR ↓ RANK/RANK-L↓ HIF-1α ↓ PTEN

Różnorodność i liczność celów molekularnych genisteiny powoduje, że końcowy efekt

biologiczny wywoływany in vitro oraz in vivo jest, jak się sądzi, wypadkową modulowania

przebiegu różnych procesów. W kontekście przeciwnowotworowego działania genisteiny

do najlepiej poznanych skutków ekspozycji komórek nowotworowych na ten związek jest

hamowanie cyklu komórkowego z ewentualną indukcją procesu apoptozy.

W literaturze istnieją liczne dane wyjaśniające mechanizm, w którym genisteina

wywołuje blok cyklu komórkowego w fazie G2/M. Najczęściej za przyczynę tego zjawiska

podaje się zdolność izoflawonu do obniżania ekspresji genów kodujących cyklinę A oraz

cyklinozależną kinazę CDK2, które odpowiadają za progresję cyklu komórkowego z fazy

G2 do mitozy . Udowodniono również, że w liniach gruczołu krokowego LNCAP oraz PC-3

genisteina wpływa na poziom p21 (inhibitor CDK) prowadząc do bloku w fazie G2/M.

W linii DU145 po użyciu genisteiny obserwowano indukcję p21 oraz p27, redukcję CDK4

oraz umiarkowaną inhibicję CDK2, cykliny D1 oraz cykliny E (przegląd w Mahmoud et al.

(2014)). W badaniach z użyciem komórek nowotworowych jajnika

HO-8910 pokazano, że genisteina wywołuje aktywację kinaz serynowo-treoninowych

26

Page 27: 6.11.14 doktorat_final-final

uczestniczących w hamowaniu progresji cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenia

DNA: ATM (ang. ataxia telangiectasia mutated) oraz ATR (ang. ataxia telangiectasia

and Rad3-related protein) oraz wzrost fosforylacji i aktywację białek Chk1, Chk2

(ang. checkpoint kinase 1, checkpoint kinase 2), inhibitorów fosfataz Cds25C oraz Cdc25A,

a przez to inaktywację CDC2, prowadząc do obserwowanego zahamowania progresji cyklu

w fazie G2/M. W pracy Zhang et al. (2013) pokazano, że genisteina indukuje specyficzny

blok cyklu w G2/M na drodze zależnej od p53 w procesie aktywacji krzyżowej (ang. cross

talk) pomiędzy ATM a p53/p21. Jak pokazuje powyższy przegląd literaturowy – blokowanie

komórek w fazie G2/M cyklu komórkowego przez genisteinę jest procesem złożonym.

Zatrzymanie cyklu komórkowego przez genisteinę umożliwia komórce naprawę,

a jeśli naprawa jest niemożliwa – kieruje komórkę na drogę apoptozy. Szybko proliferujące

komórki nowotworowe poddane ekspozycji na genisteinę często ulegają apoptozie . Śmierć

komórek może być związana ze zdolnością genisteiny do hamowania aktywności

topoizomerazy II (indukowanie podwójnych pęknięć

w nici DNA), inhibicji PTK, czy interferowania z białkami stanowiącymi elementy szlaków

przekazu sygnału, np. AKT, NF-κB, które uczestniczą w ochronie komórek przed apoptozą.

Ponadto genisteina zmienia równowagę poziomu białek apoptotycznych, wywołując spadek

ekspresji genów kodujących białka antyapoptotyczne (Bcl-2) oraz wzrost ekspresji genów

kodujących białka proapoptotyczne (Bax), hamuje również ekspresję genu surwiwyny

(Cimino, et al., 2012).

I.2. Radiooporność komórek nowotworowych

Choroby onkologiczne są jedną z dwóch głównych przyczyn zgonów na świecie .

Ponad połowa chorych

na którymś z etapów leczenia, poddawana jest radioterapii , a według aktualnych ocen dzięki

jej stosowaniu uzyskuje się około 40% wyleczeń,

a więc niemal tyle, ile przypisuje się chirurgii onkologicznej (49%) i znacząco więcej

niż w przypadku stosowania chemoterapii (około 11%) . Współczesna radioterapia dzięki

zaawansowanym technikom obrazowania, trójwymiarowemu systemowi planowania leczenia

w połączeniu z tomografią, a także możliwością perfekcyjnego

i powtarzalnego unieruchomienia pacjenta pozwala na ograniczanie marginesu

napromienianych tkanek zdrowych poza zmianą nowotworową do 0.5-1.0 mm. Równocześnie

stosowanie technik konformalnych z możliwością naświetlania zmiany nowotworowej

27

Page 28: 6.11.14 doktorat_final-final

szeregiem wiązek z różnych stron umożliwia kumulowanie terapeutycznej dawki

promieniowania jonizującego w guzie nowotworowym, przy równocześnie słabej ekspozycji

na promieniowanie jonizujące tkanek prawidłowych .

Pomimo istotnego postępu technicznego w dziedzinie radioterapii, u znacznego

odsetka chorych odpowiedź na terapeutyczne działanie promieniowania jonizującego jest

uznawana za niedostateczne zadowalającą. Jako przyczynę niedostatecznie dobrej odpowiedzi

na terapię radiacyjną u niektórych pacjentów uważa się obecność radioopornych klonów

komórek w masie guza, których wyeliminowanie wymagałoby podwyższenia dawki energii

promieniowania jonizującego do wartości nieakceptowanych, powodujących wzrost

toksyczności względem tkanek prawidłowych i w konsekwencji wystąpienie poważnych

efektów ubocznych .

Od wielu lat prowadzone są badania zmierzające do poznania molekularnych

i komórkowych mechanizmów modulujących stopień wrażliwości komórek na działanie

promieniowania jonizującego. Wyodrębnienie determinant komórkowej radiooporności

i radiowrażliwości mogłoby zwiększyć skuteczność radioterapii i ograniczyć występowanie

efektów ubocznych poprzez zmniejszanie wrażliwości komórek nowotworowych

i zwiększanie radioooporności komórek prawidłowych na cytotoksyczne działanie

promieniowania jonizującego .

Przedmiotem szczególnie intensywnych badań przedklinicznych i klinicznych

w zakresie poszukiwań substancji, które mogłyby być stosowane w leczeniu kombinowanym

z chemo- i radioterapią są inhibitory naskórkowego czynnika wzrostu . Z badań klinicznych

wynika,

że stosowanie inhibitorów EGFR może korzystnie wpływać na wynik leczenia, jednak

związki stosowane obecnie, blokujące ścieżkę sygnałowa zależną od EGFR, mogą

powodować nadmierne reakcje uboczne . Stąd też prowadzone są intensywne badania

zmierzające do opracowania nowych związków, które działając jako alternatywne inhibitory

EGFR wykazywałyby pożądany efekt radiouczulający bez wywoływania zbyt silnych

efektów ubocznych. Uwaga kierowana jest między innymi na związki pochodzenia

naturalnego i ich syntetyczne pochodne niewykazujące toksyczności ogólnoustrojowej . Do

substancji naturalnych

o właściwościach inhibitorów EGFR zalicza się genisteina.

28

Page 29: 6.11.14 doktorat_final-final

I.2.1. Mechanizm cytotoksycznego działania promieniowania jonizującego

Czynnikiem cytotoksycznym indukującym śmierć komórkową w czasie stosowania

radioterapii jest promieniowanie jonizujące i, w zależności od stosowanej strategii

terapeutycznej, może to być promieniowane elektromagnetyczne (bezcząstkowe,

np. promieniowanie X, γ) lub korpuskularne (emitowane przez cząstki obdarzone ładunkiem,

np. promieniowanie α i β). Śmierć komórek, zarówno nowotworowych jak i prawidłowych,

w wyniku działania promieniowania jonizującego w dawkach letalnych, spowodowana jest

uszkodzeniem przez dostarczoną energię makrocząsteczek i struktur subkomórkowych

. Radioterapia eliminuje komórki głównie na drodze apoptozy bądź katastrofy mitotycznej,

ale część komórek eliminowana jest w wyniku nekrozy, starzenia komórkowego bądź

autofagii . Skutki, jakie na poziomie molekularnym wywołuje interakcja kluczowych

makrocząsteczek z promieniowaniem jonizującym, i które mogą być przyczyną śmierci

komórek, przedstawiono w tabeli I-2.

Promieniowanie jonizujące może uszkadzać makrocząsteczki w wyniku

bezpośredniego rozrywania wiązań oraz pośrednio, poprzez wolne rodniki oraz reaktywne

formy tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) (•OH, H•, H2O2) powstające w wyniku

radiolizy wody. Proporcje między interakcjami bezpośrednimi i pośrednimi zależą od typu

promieniowania. W przypadku promieniowania o małej gęstości jonizacji,

np. promieniowania X, za powstawanie uszkodzeń makrocząsteczek w 70-90%

odpowiedzialne jest działanie pośrednie. Natomiast w przypadku działania na komórki

promieniowania charakteryzującego się dużą gęstością jonizacji, a więc pod wpływem

działania neutronów, protonów i cząsteczek α uszkodzenia makrocząsteczek powstają

w ponad 90% w wyniku działania bezpośredniego. Decydujący wpływ na udział efektu

pośredniego ma stan natlenienia komórki, ponieważ tlen jest niezbędnym substratem

w tworzeniu ROS. Szacuje się, że największy udział w generowaniu uszkodzeń pośrednich

ma rodnik hydroksylowy, a nieco mniejsze tlen singletowy oraz nadtlenek wodoru .

Tabela I-2. Efekty ekspozycji komórek na działanie promieniowania jonizującego: przemiany biocząsteczek. Na podstawie:

Biocząsteczki Skutek interakcji z promieniowaniem jonizującym

DNA degradacja w wyniku utraty zasad, modyfikacja zasad, rozpad wiązań wodorowych oraz wiązań fosforowo-cukrowych, powstawanie wiązań krzyżowych DNA-DNA i/lub DNA-białko; powstawanie podwójnych oraz pojedynczych pęknięć nici, formowanie guanylu, tymidylu oraz rodników cukrowych

29

Page 30: 6.11.14 doktorat_final-final

Białka degradacja oraz modyfikacja aminokwasów, pęknięcia łańcuchów, powstawanie wiązań krzyżowych, denaturacja, modyfikacja masy molekularnej, zmiany rozpuszczalności

Lipidy peroksydacja oraz rearanżacja wiązań węglowych, tworzenie skoniugowanych dienów, tworzenie aldehydów, tworzenie wiązań krzyżowych między lipidami, wzrost mikrolepkości, przerwanie ciągłości błon komórkowych

Polisacharydy rozpad wiązań glikozydowych, depolimeryzacja monomerów, oksydacja alkoholi do aldehydów

Spośród makrocząsteczek uszkadzanych w wyniku działania promieniowania

jonizującego największy wpływ na powstanie efektu letalnego przypisuje się uszkodzeniom

DNA. Bezpośrednie oddziaływanie promieniowania jonizującego bądź ROS z cząsteczką

DNA prowadzi do powstania pojedynczych (ang. single strand break, SSB) i podwójnych

(ang. double strand break, DSB) pęknięć nici DNA. Generowanie wolnych rodników

w bezpośrednim sąsiedztwie chromatyny może prowadzić do powstawania wiązań

poprzecznych DNA-białko .

Promieniowanie jonizujące oddziałując z zasadami azotowymi w DNA prowadzi

do powstania zmodyfikowanych pochodnych, które mogą tworzyć komplementarne wiązania

z nieprawidłowymi nukleotydami, co w konsekwencji może prowadzić do powstawania

mutacji typu transwersji. Natomiast uszkodzenia chromatyny wywołują rozległe, rozmaite

zmiany w przebiegu procesów komórkowych, w tym zaburzenia procesów naprawy,

replikacji oraz transkrypcji, o rozmiarach i konsekwencjach (ze śmiercią komórek włącznie)

zależnych od mocy dawki, tła genetycznego napromienianych komórek, kontekstu

molekularnego i stanu mikrośrodowiska komórek .

Istotne znaczenie dla wrażliwości komórki na promieniowanie jonizujące ma faza

cyklu, w jakiej znajduje się komórka napromieniona. Największą radiowrażliwością wykazują

się komórki w późnej fazie G2 i mitozie, najmniejszą w późnej fazie S. Wrażliwość komórek

w fazie G1 jest zróżnicowana: na początku tej fazy komórki są stosunkowo oporne, potem

stają się bardziej wrażliwe . Przyczyny różnej radiowrażliwości komórek w poszczególnych

fazach cyklu komórkowego nie są do końca poznane, wiążą się jednak ze zmianami

organizacji chromatyny oraz zmianami poziomu białek regulujących progresję cyklu

komórkowego .

Zastosowanie radioterapii oprócz oczywistych korzyści terapeutycznych w niektórych

przypadkach może jednak wywoływać powstawanie nowotworów wtórnych u pacjentów.

Stopień ryzyka powstania guza przerzutowego zależy od rodzaju guza pierwotnego, wieku

30

Page 31: 6.11.14 doktorat_final-final

pacjenta oraz rodzaju stosowanej terapii. Badania pokazują, że u dzieci z nowotworami

mózgu lub białaczkami leczonych promieniowaniem jonizującym mogą powstawać

nowotwory wtórne ośrodkowego układu nerwowego (28%), mięsaki (25%) i białaczki

(19%) .

I.2.2. Mechanizmy radiooporności komórkowej

Radiooporność komórek można podzielić na wrodzoną i nabytą w czasie progresji

procesu nowotworowego lub w wyniku leczenia. Istnienie zjawiska radiooporności

skutkującego słabą kontrolą miejscową, możliwym rozsiewem komórek nowotworowych

bądź powstawaniem nowotworów wtórnych u chorych, którzy w przeszłości otrzymali

terapeutyczną dawkę promieniowania jonizującego uzasadnia potrzebę ciągłego doskonalenia

metod radiouczulania i poszukiwania nowych związków radiouczulających .

Do głównych czynników wpływających na skuteczność radioterapii należą:

wydajność systemów naprawy uszkodzeń DNA (ang. repair),

redystrybucja komórek w różnych fazach cyklu komórkowego (ang. redistribution),

szybkość repopulacji (ang. repopulation),

stopień reoksygenacji obszarów hipoksyjnych wewnątrz guza (ang. reoxygenation),

endogenna wrażliwość (wewnętrzna radiooporność) komórek na działanie

promieniowania jonizującego (ang. intrinsisc radiosensitivity).

Zespół tych czynników definiowany jest obecnie jako tak zwana zasada „5 R” będąca

rozszerzeniem sformułowanej pierwotnie zasady „4 R” . Dotychczasowe badania wskazują,

że na gruncie molekularnym i komórkowym zasada „5 R” w odniesieniu do radioopornych

komórek nowotworowych oznacza, że radiooporność związana jest z następującymi

mechanizmami:

zwiększaniem sprawności systemów rozpoznawania i naprawy uszkodzeń DNA albo

zapobiegania tym uszkodzeniom poprzez wzrost aktywności enzymów wychwytujących

wolne rodniki,

zachodzeniem zjawisk zmieniających proporcje komórek w poszczególnych fazach cyklu

komórkowego, w tym zmniejszeniem się subpopulacji komórek w radiowrażliwej

fazie M, przy jednoczesnym wzroście liczby komórek w najbardziej radioopornej fazie

cyklu – fazie S (podczas replikacji DNA aktywne są systemy naprawcze DNA),

istnieniem wewnątrz guza obszarów niedotlenionych, hipoksyjnych, bowiem w centrum

dużych i szybko proliferujących guzów powstają regiony słabo unaczynione i natlenione.

31

Page 32: 6.11.14 doktorat_final-final

Komórki nowotworowe rosnące w mikrośrodowisku hipoksyjnym wykazują 2-3 krotnie

zwiększoną radiooporność,

występowaniem przyspieszonej repopulacji polegającej na szybkim wzroście komórek

w okresach pomiędzy stosowaniem poszczególnych frakcji napromieniania.

W komórkach o zwiększonej szybkości proliferacji dochodzi do zwiększonej stymulacji

czynników wzrostu i selekcji klonów opornych, co z kolei prowadzi do szybkiego

wyłonienia się oporności. W dodatku szybko proliferujące guzy zawierają dużą liczbę

radioopornych komórek w fazie S cyklu.

Radiooporność jest zjawiskiem złożonym, na które wpływ mogą mieć zróżnicowane

mechanizmy molekularne, jednak nie są one w pełni poznane . Częstymi zmianami

molekularnymi w komórkach nowotworowych o słabej odpowiedzi

na radioterapię są:

mutacje w genie TP53 ;

amplifikacja genów naprawy DNA oraz zwiększona aktywność enzymów

naprawczych ;

podwyższony poziom czynników obniżających poziom ROS ;

zwiększona aktywność białek onkogennych promujących przeżycie, w tym np.

EGFR ;

zmieniona aktywność szeregu innych białek związanych z funkcjonowaniem ścieżek

prożyciowych i antyapoptotycznych, np. aktywacja AKT , PI3K , ERK 1/2 , białka RAS ,

czynnika NF-κB , a w komórkach CSC zmieniona aktywność ścieżki kanonicznej Wnt/β-

katenina oraz białka Bmi1 , które odpowiadają za zdolność CSC do samoodnowy.

I.2.3. Radiooporność zależna od EGFR

Rosnąca liczba danych wskazuje, że istotne znaczenie w powstawaniu radiooporności

ma status EGFR . Receptor naskórkowego czynnika wzrostu jest jednym z ważnych

elementów systemu kontrolującego istotne dla przeżycia komórki szlaki przekazu sygnału. W

wielu typach nowotworów EGFR ulega hiperaktywacji, dlatego,

jak już wspomniano, uważany jest za niekorzystny czynnik prognostyczny .

EGFR należy do rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych ERBB zaangażowanych

w odpowiedź komórki na sygnały ze środowiska zewnętrznego. Do rodziny ERBB należą

cztery białka: ERBB-1, ERBB-2, ERBB-3 oraz ERBB-4 nazywane też odpowiednio EGFR,

HER-2, HER-3, HER-4. Mają one trójmodułowy schemat budowy, a więc domenę

32

Page 33: 6.11.14 doktorat_final-final

zewnątrzkomórkową mogącą oddziaływać z ligandem, domenę transbłonową zakotwiczającą

receptor w błonie komórkowej oraz domenę wewątrzcytoplazmatyczną wykazującą

po transformacji receptora aktywność kinazy tyrozynowej .

EGFR (rycina I.2) jest białkiem niezbędnym dla prawidłowego rozwoju i bierze udział

w procesach odpowiadających między innymi za wzrost i regenerację komórek, implantację

zarodka, kontroluje kluczowe procesy komórkowe, w tym proliferację, migrację, adhezję,

angiogenezę, różnicowanie oraz przeżycie komórki .

Rycina I.2. Schematyczna budowa receptora czynnika wzrostu EGFR oraz zależność pomiędzy miejscem fosforylacji w domenie cytoplazmatycznej a ścieżką sygnałową, która zostaje aktywowana. Cys-rich – miejsca bogate w cysteinę, odpowiadające za dimeryzację; COOH – C-końcowy fragment łańcucha polipeptydowego; NH2 – N-końcowy fragment łańcucha polipeptydowego; EGF (ang. epidermal grow factor) – naskórkowy czynnik wzrostu, ligand dla EGFR; Tyr845, 947, 992, 1045, 1068, 1086, 1148, 1173 – lokalizacje miejsc fosforylacji białka w aktywowanym dimerze, liczby odpowiadają numerom kolejnych tyrozyn w łańcuchu polipeptydowym EGFR. Fosforylacja konkretnej tyrozyny w domenie wewnątrzkomórkowej aktywuje konkretną, ściśle określoną ścieżkę sygnałową; Ser1046, 1047, 1057, 1142 – lokalizacje miejsc fosforylacji białka w aktywowanym dimerze, liczby odpowiadają numerom kolejnych aminokwasów (seryn) w łańcuchu polipeptydowym

33

Page 34: 6.11.14 doktorat_final-final

EGFR; P – PO43- reszty fosforanowe; AP-2 (ang. activating protein 2) – czynnik transkrypcyjny;

Cbl (ang. casitas B-lineage lymphoma) – rodzina ligaz związanych z ubikwityną; Gab1 (ang. Grb2-associated-binding protein 1) – białko zakotwiczające; Grb2 (ang. growth factor receptor binding protein 2) – białko wiążące receptor czynnika wzrostu 2; p85 – podjednostka regulatorowa kinazy PI3K (ang. phosphoinositide 3-kinase); PLCγ (ang. phospholipase C gamma) – fosfolipaza C gamma; PCK (ang. Protein kinase C) – białkowa kinaza C; Shc (ang. Src homology 2 domain containing) – rodzina białek łącznikowych; STAT5b (ang. signal transducers & activators of transcrition) – przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji 5b; SHP1 (ang. Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1) – fosfataza; CaMKI i II (ang. calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1) – kinazy białkowe zależne od wapnia/kalmoduliny. Powyższy schemat został pobrany ze strony internetowej http://media.cellsignal.com/pdf/4407.pdf oraz zmodyfikowany.

Regulacja procesów prożyciowych przez EGFR jest złożona, a aktywny EGFR może

przekazywać sygnały do układu transkrypcyjnego uruchamiając przekaz sygnału biegnący

kilkoma szlakami. Głównymi ścieżkami przekazu sygnału zależnego od EGFR są: ścieżka

RAS-RAF-MAPK, ścieżka PI3K-AKT, ścieżka JAK-STAT i ścieżka

PLC-DAG-wapń/kalmodulina-PCK .

Wiadomo również, że EGFR oddziałuje z enzymem DNA-PK (ang. DNA-protein

kinase) występującym w jądrze komórkowym i odpowiedzialnym za naprawę podwójnych

pęknięć w nici DNA w mechanizmie niehomologicznego łączenia końców (NHEJ,

ang. non-homologus end joining). W domenie transbłonowej EGFR zidentyfikowano sygnały

lokalizacji jądrowej, które odpowiadają za translokację białka do jądra prawdopodobnie przez

jądrowe kompleksy błonowe bądź interakcję z jądrowymi receptorami, takimi jak importyny

α/β1 oraz eksportyny. Dokładny mechanizm oddziaływań EGFR z DNA-PK nie został jednak

dotychczas opisany . W badaniach in vitro z wykorzystaniem komórek nabłonka oskrzeli linii

HBEC oraz komórek nowotworowych linii NSCLC wykazano,

że naprawa podwójnych pęknięć zależna jest od fosforylacji reszty treoninowej T2609

w kinazie DNA-PK zależnej od kinazy ATM (ang. ataxia telangiectasia mutated, kinaza

serynowo-treoninowa). Wyniki tej pracy sugerują, że EGFR moduluje funkcjonowanie

DNA-PK stabilizując fosforylację T2609 i w ten sposób pośredniczy w indukcji NHEJ . W

innych badaniach pokazano, że jądrowy EGFR hamuje aktywność rybonukleazy PNPazy

(fosforylaza polinukleotydowa, ang. polynucleotide phosphorylase), która wykazuje

aktywność 3' do 5' egzorybonukleazy wobec mRNA c-MYC. Czynnik transkrypcyjny c-MYC

z kolei uczestniczy w regulacji progresji cyklu komórkowego, progresji nowotworowej oraz

apoptozy. Hamowanie aktywności PNPazy przez EGFR zachodzi poprzez fosforylację DNA-

PK przy serynie 776. W konsekwencji dochodzi

do zwiększenia mRNA c-MYC, co prowadzi do wzrostu poziomu proliferacji komórkowej

i w konsekwencji przyczynia się do radiooporności komórek nowotworowych .

34

Page 35: 6.11.14 doktorat_final-final

Aktywacja EGFR może przebiegać na drodze zależnej bądź niezależnej od liganda,

przy czym druga sytuacja dotyczy receptorów noszących mutacje odpowiadające

za ich konstytutywną aktywność bądź zachodzi po zadziałaniu czynników stresowych, takich

jak promieniowanie jonizujące .

Dotychczas zidentyfikowano około trzech tysięcy substancji/związków będących

agonistami receptorów z grupy ERBB, a ich wspólną cechą jest obecność przynajmniej

jednej ewolucyjnie konserwatywnej domeny podobnej do EGF (ang. EGF-like domain).

Ligandy te wykazują zróżnicowane powinowactwo do poszczególnych białek wymienionej

rodziny, przy czym ligandami o wyłącznym powinowactwie do EGFR są EGF, TGF-α oraz

amfiregulina, natomiast ligandami zarówno EGFR jak i HER-4 są epiregulina, betacelulina

oraz HB-EGF (ang. heparin binding – epidermal growth factor, czynnik wzrostu naskórka

wiążący heparynę) .

Aktywacja zależna od liganda prowadzi do auto- bądź trans-fosforylacji EGFR

w domenie zewnątrzkomórkowej i zmiany konformacji cząsteczki w domenie

cytoplazmatycznej polegającej na odsłonięciu obszaru katalitycznego. Zmiana konformacji

umożliwia przyłączenie enzymów i białek adaptorowych i zakotwiczających

odpowiedzialnych za wiązanie białek docelowych w obrębie kompleksów receptorowych.

Kinazy ERBB mogą dimeryzować z innymi monomerami z rodziny tworząc homo- oraz

heterodimery .

O ile prawidłowe funkcjonowanie receptorów z rodziny ERBB zapewnia prawidłowy

rozwój organizmu, o tyle zaburzenie funkcji tych białek skutkujące wzmocnieniem

aktywności zależnych od nich ścieżek sygnałowych może, jak już wspomniano powyżej,

prowadzić do rozwoju choroby nowotworowej. Do mechanizmów odpowiedzialnych

za nadmierną aktywność EGFR obserwowaną w komórkach nowotworowych zalicza się:

1. zwiększony poziom ekspresji genu kodującego EGFR,

2. wadliwy mechanizm hamowania aktywności receptora,

3. podwyższone stężenie liganda,

4. proces autokrynnej stymulacji EGFR (ang. autocrine switch),

5. heterodimeryzację EGFR z innymi białkami z rodziny ERBB,

6. wymianę sygnałów pomiędzy receptorami (ang. cross-talk),

7. fosforylację krzyżową, transfosforylację (ang. cross-phosphorylation),

8. mutację genów kodujących EGFR.

35

Page 36: 6.11.14 doktorat_final-final

Poniżej omówione zostały najważniejsze aspekty związane z mechanizmami hiperaktywacji

receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR.

Ad.1. Nadmierną ekspresję genu kodującego EGFR stwierdzono w komórkach wielu typów

nowotworów, w tym nowotworów złośliwych okolic głowy i szyi, niedrobnokomórkowego

raka płuca (NSCLC), raka jelita grubego, szyjki macicy, gruczołu krokowego, piersi, jajnika,

żołądka, trzustki oraz glejaka wielopostaciowego . Nadekspresja EGFR implikuje większą

inwazyjność komórek nowotworowych w porównaniu do komórek o niższym poziomie

ekspresji tego genu. Zwiększona zawartość białka w błonach może

być również związana z amplifikacją genu kodującego EGFR

Ad.2. Jednym z mechanizmów regulujących poziom błonowy receptora EGF jest endocytoza.

Białkami zaangażowanymi w proces degradacji EGFR są Grb2 (ang. growth factor receptor-

bound protein 2, białko adaptorowe) oraz Cbl (ang. Casitas B-lineage Lymphoma, rodzina

ligaz ubikwitynowych). Zarówno w przypadku endocytozy zależnej od klatryny jak

i niezależnej od klatryny receptory EGF z przyłączoną ubikwityną sortowane

są pęcherzyków: ILV (ang. intraluminal vesicles), a nie ubikwitylowane do MVE

(ang. multivesticular endosomes). W pierwszym przypadku receptory ulegają degradacji

lizosomalnej, w drugim natomiast transportowane są z powrotem do błony komórkowej.

Rodzina ligaz ubikwitynowych Cbl pełni kluczową rolę w pośredniczeniu w ubikwitynacji

receptorowych kinaz tyrozynowych (ang. receptor tyrosine kinase, RTK), a ponadto

oddziałuje z aktywowanym receptorem bezpośrednio bądź pośrednio poprzez białko Grb2.

Pomimo, że proces regulacji obrotu receptora (ang. turnover) nie został dotychczas dokładnie

poznany, opisano rozmaite białka, które mogą uczestniczyć w rozpoznawaniu oraz

sortowaniu ubikwitynylowanych receptorów. Szczegółowy opis znajduje się w pracy Haglund

& Dikic, (2012). Jeśli zachwiana zostanie równowaga pomiędzy poziomem transportu EGFR

do błony a poziomem jego degradacji, może dochodzić do wzmocnienia sygnału zależnego od

EGFR .

Ad.3. W różnych typach nowotworów wykrywa się podwyższone stężenie liganda często

współistniejące z nadekspresją genu kodującego sam receptor. Nadmierną ekspresję TGF-α

wykryto w nowotworach złośliwych głowy i szyi (HNSCC). Nadekspresja ligandów

oddziałujących z EGFR jest często rozważana jako potencjalny marker predykcyjny .

36

Page 37: 6.11.14 doktorat_final-final

Ad.4. Mechanizm autokrynnego pobudzenia EGFR polega na zmianie rodzaju oddziaływania

receptora z ligandem. W warunkach prawidłowych stymulacja receptora zachodzi zwykle

parakrynnie. Po transformacji nowotworowej następuje zwiększenie ekspresji genów

kodujących ligandy dla EGFR i możliwe jest ich wiązanie z receptorem występującym

na powierzchni tej samej komórki. Równocześnie możliwe jest zwiększenie poziomu syntezy

EGFR (ekspresji genu kodującego receptor), które będą przyłączały wytworzone wcześniej

przez tę samą komórkę ligandy .

Ad.5. Zjawiskiem szczególnie istotnym w kształtowaniu złośliwego fenotypu komórek

nowotworowych jest powstawanie heterodimerycznych form receptorów z rodziny ERBB .

Do tej pory nie zidentyfikowano liganda dla receptora HER-2, który cechuje się

konstytutywnie otwartą konformacją umożliwiającą heterodimeryzację. Z drugiej strony

receptor HER-3

nie wykazuje aktywności kinazowej. Oznacza to, że homodimeryzacja HER-3/HER-3

nie wywołuje kaskady sygnałów dojądrowych, która pojawia się jednak po utworzeniu

heterodimeru receptorów HER-2/HER-3 . Możliwością heterodimeryzacji EGFR z HER-2

tłumaczy się gorsze rokowanie

u chorych na raka piersi z nadekspresją HER-2 . Homodimery EGFR/EGFR ulegają szybszej

endocytozie i szybszemu unieczynnieniu niż heterodimery receptorów z rodziny ERBB. Co

więcej, utworzenie heterodimeru EGFR/HER-2 wywołuje dłuższą oraz silniejszą aktywację

ścieżki sygnałowej w porównaniu do homodimeru EGFR/EGFR, co tłumaczone jest

zwiększeniem powinowactwa liganda, zmniejszeniem dynamiki internalizacji kompleksu oraz

ułatwieniem ponownego wykorzystania receptora (ang. turnover) .

Ad.6. Heterodimeryzacja umożliwia wystąpienie zjawiska fosforylacji krzyżowej.

Warunkiem trasnfosforylacji jest występowanie tego samego komponentu (białka)

w ścieżkach sygnałowych obu receptorów. Następstwem fosforylacji krzyżowej jest

pobudzenie białka będącego poniżej w kaskadzie przekazu sygnału przez sygnał z dwóch

szlaków należących do dwóch różnych receptorów. W ten sposób dochodzi do wzmocnienia

sygnału . Ścieżki sygnałowe są specyficzne

dla konkretnych dimerów i zależne od typu receptorów będących składowymi dimeru.

Dla przykładu homodimer EGFR/EGFR przyłącza białka z rodziny białek łącznikowych

Shc, z rodziny ligaz ubikwitynowych Cbl, czy białko adaptorowe Grb2. Z kolei heterodimer

EGFR/HER-4 wiąże białko Shc, ale nie wiąże białek Cbl i Grb2 .

37

Page 38: 6.11.14 doktorat_final-final

Ad.7. Wymiana sygnałów pomiędzy komponentami ścieżek sygnałowych (ang. cross-talk)

może prowadzić do aktywacji komponentów ścieżek zależnych od EGFR nawet w sytuacji,

kiedy on sam nie uległ aktywacji . Zjawisko krzyżowej aktywacji może przebiegać na drodze

dwóch mechanizmów:

aktywacji białek będących elementami szlaku/szlaków sygnałowych receptora z rodziny

ERBB na drodze fosforylacji przez domeny kinazowe receptorów z innej rodziny;

pobudzenie receptora z rodziny ERBB przez receptor z innej rodziny bądź białka

stanowiące składowe szlaku sygnałowego receptora z innej rodziny.

Zjawisko cross-talk opisano dla oddziaływań EGFR z wieloma receptorami bądź zależnymi

od nich ścieżkami sygnałowymi, w tym ścieżkami zależnymi od EGFR i VEGFR. Aktywacja

EGFR powoduje wzrost syntezy VEGFR, który następnie działając parakrynnie na komórki

otaczające śródbłonka promuje ich migrację i proliferację wywołując angiogenezę . Podobne

zjawisko opisano dla EGFR oraz kinazy MET (kinaza receptorowa dla czynnika wzrostu

hepatocytów) w komórkach raka płuc (NSCLC)

z linii 293, 293TN, H460, A549, H1299 oraz Calu-1 oraz EGFR,

IGF-IR oraz ER w komórkach raka piersi MCF7 . Szczegółowe informacje zebrane zostały w

cytowanych pracach.

Ad. 8. Konstytutywna aktywność receptora jest często wynikiem mutacji aktywujących

domenę kinazową. Dla EGFR opisuje się trzy najczęstsze mutacje prowadzące do ciągłej

aktywności EGFR niezależnie od statusu fosforylacji: delecję kodonów 6-7, mutację

punktową L858R w eksonie 21 oraz wariant III mutacji (EGFRvIII) polegający na delecji

fragmentu DNA zawierającego eksony 2-7 kodujące miejsce wiążące ligand .

Hiperaktywacja ścieżek sygnałowych zależnych od receptora naskórkowego czynnika

wzrostu przyspiesza progresję choroby i jest często przyczyną oporności na działanie

promenowania jonizującego. Udowodniono, że promieniowanie jonizujące indukuje

aktywność EGFR w wielu typach nowotworów, a przez to ograniczona jest skuteczność

radioterapii. Komórki poddane działaniu promieniowania jonizującego uruchamiają

mechanizmy obronne zależne od EGFR (rycina I.3), w tym:

1. indukowaną promieniowaniem jonizującym translokację EGFR do jądra komórkowego

i interakcję z enzymem naprawiającym podwójne pęknięcia: DNA-PK ,

38

Page 39: 6.11.14 doktorat_final-final

2. zależną od EGFR aktywację szlaku sygnałowego PI3K/AKT i zahamowanie procesu

apoptozy indukowanej uszkodzeniami DNA ,

3. aktywację szlaków sygnałowych RAS/RAF/MEK/ERK oraz STAT, które prowadzą

do szybszej proliferacji komórek w przerwach pomiędzy kolejnymi dawkami frakcyjnymi

promieniowania (zjawisko repopulacji) .

Rycina I.3. Zależne od EGFR ścieżki warunkujące komórkową radiooporność. Opis w tekście.

Należy przy tym zauważyć, że EGFR może ulegać fosforylacji przy różnych

tyrozynach w domenie cytoplazmatycznej (rycina I.2). Szczegółowy opis następstw

fosforylacji domeny cytoplazmatycznej przy określonych tyrozynach wraz z przeglądem

literaturowym przedstawiono w pracy , poniżej opisano pokrótce następstwa przyłączenia

grupy fosforanowej PO34- do konkretnej tyrozyny w domenie cytoplazmatycznej EGFR.

Fosforylacja EGFR przy Tyr845 w domenie kinazowej prowadzi do stabilizacji pętli

aktywacji, utrzymania stanu aktywnego enzymu oraz zapewnienia powierzchni wiążącej

dla białek substratowych. Fosforylacja w tym miejscu aktywuje białka STAT (ang. signal

transducers and activators of transcription). W fosforylacji EGFR w Tyr845 uczestniczy

kinaza c-Src (ang. proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src).

39

Page 40: 6.11.14 doktorat_final-final

Fosforylacja przy Tyr992 prowadzi do przyłączenia domeny SH2 białka PLCγ

(ang. phospholipase C gamma, fosfolipaza C gamma) w tym miejscu receptora EGFR,

co skutkuje aktywacją szlaku zależnego od PKC (ang. Protein kinase C, białkowa kinaza

C), a następnie MAPK/ERK.

Fosforylacja EGFR przy Tyr1045 umożliwia wiązanie białka adaptorowego

c-Cbl (ang. casitas B-lineage lymphoma), co prowadzi do ubikwitynacji receptora EGFR

i jego degradacji.

Białko adaptorowe Grb2 (ang. growth factor receptor binding protein 2, białko wiążące

receptor czynnika wzrostu 2) wiąże EGFR przy pTyr1068 i wywołuje aktywację szlaku

sygnałowego zależnego od MAPK. Ponadto oddziaływanie Grb2 z Grb1 prowadzi

do aktywacji PI3K. Pokazano również, że fosforylacja w tym miejscu prowadzi

do aktywacji białek STAT.

Fosforylacja przy Tyr1148 i Tyr1173 prowadzi do wiązania białka

Shc (ang. Src homology 2 domain containing, rodzina białek łącznikowych) i aktywacji

ścieżki przekazu sygnału zależnej od kinazy MAP. Ponadto dowiedziono, że fosforylacja

przy tyrozynie 1173 jest istotna w regulowaniu procesu endocytozy receptora.

Fosforylacja przy Tyr1086 indukuje wiązanie białka zakotwiczającego

Gab1 (ang. Grb2-associated-binding protein 1) oraz aktywację ścieżki sygnałowej zależnej

od AKT.

Fosforylacja EGFR przy określonych serynach i treoninach tłumi aktywność kinazową

receptora. Reszty Ser1046 i Ser1047 w domenie C-końcowej EGFR ulegają fosforylacji

przez kinazę CaMK II (ang. calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 2, kinaza

białkowa zależna od wapnia/kalmoduliny). Mutacja któregokolwiek genu kodującego

powyżej wymienione seryny skutkuje zwiększeniem poziomu autofosforylacji w domenie

tyrozynowej EGFR. Fosfataza SHP1 (Src homology region 2 domain-containing

phosphatase-1) wiążąc się z fosforylowaną tyrozyną 1173 uczestniczy w defosforylacji

EGFR i negatywnej regulacji szlaku sygnałowego zależnego od receptora.

W badaniach pokazano, że fosforylacja przy tyrozynie 1068 (pEGFR-Tyr1068) może

być markerem prognostycznym w ocenie odpowiedzi klinicznej

na leczenie inhibitorami EGFR zwłaszcza u pacjentów z zawansowanym rakiem płuca

NSCLC z EGFR typu dzikiego. W badaniach immunohistochemicznych pokazano,

40

Page 41: 6.11.14 doktorat_final-final

że u pacjentów, u których wykrywano pEGFR-Tyr1068 współczynnik przeżycia PFS

(ang. progression-free survival) po terapii TKI (ang. tyrosine kinase inhibitor, inhibitor

domeny kinazowej) był niemal siedmiokrotnie wyższy niż w porównaniu do pacjentów

pEGFR-Tyr1068 negatywnych (mediana PFS 7.0 miesięcy versus 1.2 miesięcy, p <0.001).

W innych badaniach pokazano, że w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące istotną rolę

odgrywają dwie reszty tyrozynowe Tyr992 oraz Tyr1173 . Tyr1173 służy jako główne

miejsce wiązania Shc, białka zaangażowanego w przekaz sygnału pomiędzy EGFR i RAS.

Ponadto Tyr1173 jest miejscem wiązania dla Shc i PLCγ, jest więc zaangażowana w

aktywację MAPK, która, jak już wspominano, uczestniczy w warunkowaniu komórkowej

radiooporności.

I.2.4. Przezwyciężanie radiooporności

Wzrostu skuteczności radioterapii upatruje się w opracowaniu nowych strategii

radiouwrażliwiających komórki nowotworowe. Chemoterapia stosowana jest w leczeniu

chorych z nowotworami ośrodkowego układu nerwowego, pęcherza, endometrium, piersi,

odbytu oraz jelit, zaawansowanych zlokalizowanych nowotworów szyjki macicy oraz płuca,

zawansowanych chłoniaków, a także mięsaków tkanek miękkich oraz nowotworów u dzieci .

Zastosowanie radioterapii w kombinacji

z chemoterapią jest zasadne z kilku powodów. Chemoterapia ma często na celu zastąpienie

interwencji chirurgicznej (zmniejszenie objętości guza, a tym samym pola naświetlań)

w przypadku guzów nieoperacyjnych lub dla zachowania organu. Lek może wykazywać

właściwości radiouczulające zwiększając kontrolę miejscową i umożliwiając eliminację

populacji radioopornych. Chemoterapeutyki ograniczają też powstawanie odległych

przerzutów . Zastosowanie chemoterapii jest szczególnie uzasadnione, jeżeli możliwe jest

uzyskanie efektu synergistycznego .

Idealny radiouczulacz powinien działać w niskim stężeniu, wykazywać minimalną

toksyczność ogólnoustrojową czy narządową (kardiotoksyczność, neurotoksyczność) oraz

selektywność w stosunku do tkanek nowotworowych . Chemoterapeutyki, jeśli nie są

stosowane w ramach terapii celowanej, zwykle penetrują tkanki zdrowe w takim samym

stopniu jak objęte zmianą nowotworową. W celu zwiększenia selektywności chemoterapii

rozważa się wprowadzenie do leczenia nośników rozpoznających specyficzne markery

nowotworowe . Alternatywną strategią jest stosowanie związków naturalnych

41

Page 42: 6.11.14 doktorat_final-final

niewykazujących toksyczności ogólnoustrojowej,

dla których charakterystyczna jest jednak zdolność do hamowania wzrostu guza .

I.2.5. Mechanizmy radiouwrażliwiania nowotworów

Chemoterapeutyki stosowane w kombinacji z radioterapią mogą działać na drodze

różnych mechanizmów promując powstawanie specyficznego bądź kilku równoległych

efektów cytotoksycznych. Mechanizmy, poprzez które rozmaite chemoterapeutyki zwiększają

promienioczułość komórek nowotworowych omówione są obszernie w pracy , poniżej

wymienione są jedynie najważniejsze, natomiast cytostatyki, które uruchamiają te

mechanizmy wymienione są w tabeli I-3. Do mechanizmów działania najczęściej

stosowanych związków promieniouwrażliwiających należą:

1. zwiększenie liczby uszkodzeń DNA i/lub hamowanie procesów naprawy DNA

wywołanych promieniowaniem,

2. wpływ na przebieg cyklu komórkowego,

3. zmiana statusu tlenowego komórki,

4. ograniczanie procesu repopulacji,

5. hamowanie procesów prożyciowych indukowanych promieniowaniem jonizującym,

w tym zależnych od czynników wzrostu oraz aktywacja procesu apoptozy,

6. obniżanie aktywności angiogennej,

7. inne mechanizmy, niezaliczane do żadnej z powyższych grup.

Ad. 1. Najliczniejszą grupą radiouczulaczy są związki uszkadzające DNA oraz związki

obniżające skuteczność naprawy uszkodzeń indukowanych promieniowaniem jonizującym.

Uszkodzenia struktury DNA mogą mieć różny charakter , przy czym cytotoksyczny związek

może:

wiązać się z cząsteczką DNA stanowiąc zawadę dla kompleksów enzymatycznych

replikacji i transkrypcji , a wiążąc się w pobliżu pęknięć utrudniać eliminację uszkodzeń

przez systemy naprawcze ,

tworzyć wiązania krzyżowe ,

metylować DNA wywołując zwiększenie zawartości heterochromatyny .

W celu obniżenia sprawności systemów naprawczych można stosować substancje

hamujące syntezę nukleotydów i/lub nukleozydów (np. reduktazę rybonukleotydową) bądź

42

Page 43: 6.11.14 doktorat_final-final

trafiające w specyficzne czynniki molekularne zaangażowane w odpowiedź komórki na

uszkodzenia, w tym: kinazę ATM fosforylującą kluczowe białka inicjujące aktywację

punktów kontrolnych cyklu komórkowego

(ang. checkpoints) w odpowiedzi na DSB bądź

DNA-PK, enzym odpowiedzialny za naprawę podwójnych pęknięć DNA w mechanizmie

NHEJ . Zastosowanie związków uszkadzających cząsteczkę DNA i związków blokujących

systemy naprawcze prowadzi do zwielokrotnienia liczby uszkodzeń oraz rozpoznania ich

przez komórkę jako uszkodzenia, których naprawa jest niemożliwa i w konsekwencji

uruchomienia programu śmierci komórkowej. Związki

te wymienione są w tabeli I-3 (pozycje 1-9).

Ad.2. Związki radiouczulające zaburzające przebieg cyklu komórkowego dzieli się na dwie

grupy: substancje preferencyjnie uszkadzające komórki w najbardziej radioopornej fazie S

zwiększające globalną liczbę uszkodzeń w populacji komórek nowotworowych oraz związki

majce właściwość synchronizowania cyklu komórkowego, co skutkuje wzrostem populacji

komórek znajdujących się w najbardziej radiowrażliwej fazie G2/M . Związki te wymienione

są w tabeli I-3 (pozycje 2, 4, 6, 8, 10, 22).

Ad.3. Zwiększenie stanu utlenowania komórek nowotworowych podwyższa poziom wolnych

rodników i ROS powstających na skutek działania promieniowania jonizującego. Redukcja

radioopornych obszarów hipoksyjnych zwiększa zatem wrażliwość komórki

na promieniowanie . Radiouczulacze modyfikujące stan oksygenacji bądź procesów

biegnących w środowisku hipoksyjnym (wymienione w tabeli I-3, pozycje 10-13) mogą

działać poprzez mechanizmy szczegółowo opisane w pracy i pokrótce omówione poniżej.

Związki z tej grupy mogą:

wywoływać reoksygenację nowotworu. Związki wywołujące masową apoptozę

eliminujące komórki natlenione wywołują również dodatkową korzyść – umożliwiają

dostęp do tlenu komórkom hipoksyjnym ;

selektywnie eliminować komórki hipoksyjne. Dla przykładu tripazamina w

warunkach hipoksji ulega enzymatycznej redukcji prowadzącej do powstania jej

rodnikowej formy anionowej. Anionorodnik tripazaminy w komórkach niedotlenionych

uszkadza DNA,

a w komórkach w stanie normoksji natychmiast ulega utlenieniu z udziałem tlenu ;

43

Page 44: 6.11.14 doktorat_final-final

uczulać komórki hipoksyjne na działanie promieniowania jonizującego poprzez

naśladowanie efektu tlenowego i zwiększenie uszkodzeń radiacyjnych. Związki

naśladujące tlen (ang. oxygen mitigators) są zdolne do dyfuzji do słabo unaczynionych

obszarów guza, ponieważ, w przeciwieństwie to tlenu, nie są szybko metabolizowane

przez komórki nowotworu, przez które dyfundują. Związki naśladujące tlen mogą

przenikać dalej niż tlen i docierać do wszystkich niedotlenienionych komórek guza ;

hamować aktywność HIF-1 (ang. hypoxia induced factor 1, czynnik transkrypcyjny

aktywowany hipoksją), który stymuluje aktywność genów prożyciowych .

Ad. 4. U podłoża procesu repopulacji leży hiperaktywacja receptorów czynników wzrostu

oraz aktywowanych przez nie ścieżek sygnałowych, w tym receptora EGF , receptora VGF ,

czy białka K-RAS będącego elementem prożyciowej ścieżki sygnałowej zależnej od EGFR .

Związki hamujące aktywność tych receptorów i/lub zależnych od nich ścieżek sygnałowych

mogą obniżać szybkość proliferacji, inwazyjność i przeżywalność komórek nowotworowych.

Związki

te wymienione są w tabeli I-3 (pozycje 14-16, 22).

Zahamowanie procesu repopulacji można też uzyskać stosując inną strategię,

a mianowicie poprzez blokowanie prawidłowych mechanizmów podziałów komórek. Związki

należące do tej grupy cytostatyków mogą np. hamować syntezę nukleotydów , uniemożliwiać

przecinanie nici DNA blokując aktywność topoizomeraz bądź zaburzać strukturę centromeru

w wyniku wiązania tubulin i blokowania dynamiki mikrotubul . Przykładowe związki

należące do tej grupy cystatyków wymienione są w tabeli I-3 (pozycje 1-9, 22).

Ad.5. Związki indukujące apoptozę mogą promować ekspresję genów kodujących białka

efektorowe apoptozy, hamować transdukcję sygnału prowadzącą do apoptozy , obniżać

poziom białek antyapoptotycznych takich jak Bcl-2 lub hamować aktywność surwiwiny

zapobiegającej apoptozie w mechanizmie niezależnym od kaspaz . Związki te wymienione są

w tabeli I-3 (pozycje 17, 18, 21, 22).

Ad.6. Substancje uszkadzające naczynia krwionośne bądź hamujące proces angiogenezy

ograniczają dostawę substancji odżywczych i tlenu do guza, co prowadzi do śmierci komórek

nowotworowych. Związki antyangiogenne mogą działać poprzez mechanizm obniżania

44

Page 45: 6.11.14 doktorat_final-final

aktywności podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów bFGF i/lub czynnika wzrostu

nabłonka naczyniowego (VEGFR) . Związki te wymienione są w tabeli I-3 (pozycja 16).

Ad.7. Wraz z rozwojem wiedzy w obszarze radiooporności komórkowej wzrasta liczba

specyficznych celów molekularnych dla chemoterapii kojarzonej z radioterapią. Dotychczas

jako potencjalne radiouczulacze testowano między innymi inhibitory białek opiekuńczych

szoku cieplnego HSP , inhibitory farnezylotransferazy czy inhibitory cyklooksygenazy .

Związki te wymieniono w tabeli I-3 (pozycje 14, 19, 20).

Interesującą grupą związków radiouczulających są inhibitory epigenetyczne

zwiększające poziom kondensacji chromatyny, a przez to obniżające poziom ekspresji genów.

Do związków z tej grupy zalicza się substancje modyfikujące poziom ekspresji genów

kodujących deacetylazy histonów, a w efekcie obniżające zdolność komórek do naprawy

indukowanych promieniowaniem uszkodzeń DNA , jak również związki hamujące aktywność

metylotransferaz DNA (DNMT), które wyciszają ekspresję genów poprzez ich metylację przy

resztach cytozynowych. Zablokowanie tego enzymu wywołuje powstanie nieusuwalnych

adduktów MT-aza-DNA i śmierć komórki . Związki te wymienione są w tabeli I-3 (pozycje

19-21).

45

Page 46: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela I-3. Wykaz związków radiouczulających i znanych bądź domniemanych mechanizmów zwiększania przez nie wrażliwości na IR komórek nowotworowych.

Lp. Nazwa związku Mechanizm działania Cytowane prace

1Analogi platynyCisplatyna

Tworzenie między- i wewnątrzniciowych wiązań krzyżowych uniemożliwiających komórce prowadzenie procesów replikacji i transkrypcji. Komórka klasyfikuje łatwo usuwalne zmiany SSB jako uszkodzenia letalne.

,

2 5-fluorouracylInkorporacja do cząsteczki DNA, co uniemożliwia replikację i transkrypcję. Inhibicja aktywności syntazy tymidylowej. Uszkadzanie preferencyjnie komórek w najbardziej radioopornej fazie cyklu komórkowego – fazie S.

,

3 Telozolomid Uszkadzanie DNA, metylacja guaniny w pozycji O-6.

4Inhibitory topoizomerazyKamptotecyna ipochodne oraz etopozyd

Indukcja SSB, DSB. Stabilizacja kompleksu rozszczepiającego DNA/topoizomeraza I prowadząca do blokowania elongacji transkrypcji RNA, replikacji DNA i regulacji oraz tworzenia wyższorzędowych struktur DNA niezbędnych dla utrzymania stabilności genomu. Uszkadzanie preferencyjnie komórek w najbardziej radioopornej fazie cyklu komórkowego – fazie S.

5 Gemcytabina Hamowanie syntezy nukleotydów, inhibicja reduktazy rybonukleotydowej.

6 Hydroksymocznik Inhibicja reduktazy rybonukleotydowej. Uszkadzanie preferencyjnie komórek w najbardziej radioopornej fazie cyklu komórkowego – fazie S.

7 Pemetreksed Inhibicja syntazy tymidylowej, reduktazy dihydrofolowej oraz formylotransferazy rybonukleotydu glicynamidowego. ,

8Inhibitory kinazy ATMCP466722, kafeina

Inhibicja białek zaangażowanych w odpowiedź komórki na uszkodzenia, blokowanie progresji cyklu komórkowego w odpowiedzi na DSB.

9 Inhibitory kinazy DNA-PK Inhibicja białek zaangażowanych w odpowiedź komórki na uszkodzenia, blokowanie procesu niehomologicznego łączenia końców (NHEJ).

10 Taksany: taksol, docetaksel, paklitaksel

Synchronizowanie komórek nowotworowych w fazie najbardziej radiowrażliwej w wyniku hamowania depolimeryzacji tubuliny. Eliminowanie dobrze natlenionych komórek nowotworowych, co powoduje reoksygenację nowotworu.

11 Tirapazamina Redukcja radioopornych obszarów hipoksyjnych. .

12Nitroimidazole:mizonidazol, nimorazol

Redukcja radioopornych obszarów hipoksyjnych: uczulanie komórek hipoksyjnych na działanie promieniowania jonizującego.

46

Page 47: 6.11.14 doktorat_final-final

132-metoksyestradiolTopotekan

Zahamowanie aktywności HIF-1, czynnika transkrypcyjnyego aktywowanego hipoksją modulującego aktywność genów prożyciowych. ,

14 Inhibitory farnezylotransferazy

Inhibicja wiązania hiperaktywnego białka RAS z błoną, hamowanie transdukcji sygnału zależnego od RAS.

15Antysensowne oligonukleotydy przeciwko RAF-1

Hamowanie RAF-1, kinazy serynowo-treoninowej zaangażowanej w transdukcję sygnałów proliferacji i przeżycia do jądra.

16 Celekoksyb, bewazucymab, talidomid

Obniżanie aktywności podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów bFGF oraz receptora czynnika wzrostu nabłonka naczyniowego (VEGFR), co prowadzi do zahamowania procesu angiogenezy.

17GossypolOblimersen

Inhibicja białek antyapoptotycznych, np. Bcl-2.

18Inhibitory surwiwinyLY2181308, YM155

Inhibicja aktywności surwiwiny, białka odpowiedzialnego za hamowanie apoptozy w mechanizmie niezależnym od kaspaz oraz promowanie proliferacji. .

19Inhibitory HSPGeldanamycynaRadicikol

Hamowanie ekspresji HSP, który w warunkach stresu promuje procesy prożyciowe.

20 Inhibitory cyklooksygenazy Hamowanie ekspresji cyklooksygenazy, która warunkuje zwiększoną agresywność nowotworu.

21

Inhibitory epigenetyczne:5-AzaDecytabinaZebularynaKwas walproinowy

Promowanie apoptozy w wyniku przywracania ekspresji białek efektorowych apoptozy bądź ekspresji apoptotycznych ścieżek sygnałowych (5-Aza przywraca ekspresję kaspazy 8, której hipermetylację obserwuje się komórkach neoplatycznych). Redukcja radioopornych obszarów hipoksyjnych, celowanie w specyficzne cele molekularne: inhibicja metylotransferazy DNA (DNMT), modyfikacje histonów, przywrócenie ekspresji VHL.

,

22 Inhibitory EGFRSpecyficzne cele molekularne. Hamowanie procesów prożyciowych. Indukcja apoptozy.Redukcja radioopornych obszarów hipoksyjnych. Hamowanie naprawy DNA.

47

Page 48: 6.11.14 doktorat_final-final

I.2.6. Inhibitory EGFR jako substancje radiouwrażliwiające

Tabela I-4. Inhibitory EGFR stosowane w leczeniu onkologicznym. Na podstawie danych z opracowania (http://www.accessdata.fda.gov/).

Nazwa Typ Cel molekularny

Wskazania FDA oraz rok wydania zgody na stosowanie w leczeniu klinicznym

GefitynibZD1839(Iressa)

TKIodwracalny

EGFR2003 Miejscowo zaawansowany metastatyczny NSCLC, po niepowodzeniu zarówno terapii opartej na platynie jak i opartej na docetakselu.

ErlotynibOSI-774Tarceva

TKIodwracalny

EGFR

2004 W monoterapii u pacjentów z NSCLC po niepowodzeniu przynajmniej jednej pierwszorzędowej chemoterapii.2005 Zaawansowany rak trzustki w kombinacji z gemcytabiną, u pacjentów, którzy nie byli poddani wcześniejszej chemoterapii.

Cetuksymab (Erbitux)

C225

przeciwciało chimeryczne

mysio-ludzkieEGFR

2004 Pacjenci z CRC wykazującym ekspresję EGFR, opornym na leczenie irinotekanem 2006 Miejscowo bądź regionalnie zaawansowany HNSCC w kombinacji z radioterapią.

PanitumumabABX-EGF,

Vectibix

przeciwciało ludzkie EGFR

2006 Metastatyczny rak jelita grubego wykazujący ekspresję EGFR oporny na standardowe chemoterapeutyki.

LapatinibGW572016

Tykerb

TKI odwracalny EGFRHER2

2007 Metastatyczny rak piersi w kombinacji z kapecytabiną, u pacjentów z nadekpsresją HER-2, którzy uzyskali pierwszorzędową terapię, w tym antracyklinę, taksan oraz trastuzumab.

WandetanibZD6474Zactima

TKIEGFR

VEGFR2RET-TK

2011 Pacjenci z metastatycznym rakiem rdzeniastym tarczycy, niekwalifikującym się do operacji.

Afitynib TKI nieodwracalny EGFR

2013 Do leczenia pierwszego rzutu u pacjentów z przerzutowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC), u których guzy posiadają zmutowaną formę EGFR delecję w eksonie 19 lub substytucję eksonu 21 (L858R).

Po raz pierwszy blokowanie ścieżek sygnałowych zależnych od EGFR jako strategię

terapeutyczną testowano już trzy dekady temu, kiedy to w celu zahamowania aktywności EGFR

użyto przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z domeną zewnątrzkomórkową receptora.

Związanie się przeciwciała z receptorem uniemożliwiało przyłączenie do niego liganda

i powodowało zablokowanie początkowych etapów przekazywania sygnału . Od tego czasu

poznano wiele cząsteczek o właściwościach hamowania aktywności EGFR i ścieżki sygnałowej

zależnej od tego receptora, a badania w tym kierunku prowadzone są intensywnie nadal .

48

Page 49: 6.11.14 doktorat_final-final

Związki o właściwościach inhibitorów EGFR już stosowane w klinice bądź testowane

w badaniach przedklinicznych i klinicznych, zalicza się do jednej z czterech grup: przeciwciał

monoklonalych, małych inhibitorów aktywności kinazowej (ang. tyrosine kinase inhibitors, TKI),

związków wiążących ligandy oraz antysensowych oligonukleotydów indukujących proces

interferencji RNA , przy czym jedynie związki z dwóch pierwszych grup mają obecnie

zastosowanie w leczeniu onkologicznym. Obecnie prowadzone są liczne próby kliniczne II i III

fazy oceniające terapeutyczną przydatność inhibitorów EGFR

w monoterapii oraz w kombinacji z chemoterapią lub radioterapią . Spośród zbadanych

dotychczas inhibitorów EGFR, amerykańska Agencja Żywności

i Leków, FDA (Food and Drug Administration) dopuściła dotychczas do zastosowania

klinicznego jedynie 7 związków (tabela I-4).

Właściwości przeciwciał anty-EGFR

Po raz pierwszy mysie przeciwciało monoklonalne anty-EGFR zostało użyte w badaniach

1983 roku . Badacze wykazali in vitro, że przeciwciało to silnie hamuje proliferację komórek

nowotworowych A431 linii wykazującej 200-krotnie większą ekspresję genu kodującego EGFR w

stosunku do komórek prawidłowych. Także w badaniach in vivo wykazano, że wymienione

przeciciało hamuje u myszy wzrost guzów wywodzących się z komórek A431 (linia ludzkiego

raka naskórkowego) . Powyższe obserwacje stały się podstawą do skonstruowania

humanizowanego mysiego przeciwciała, któremu nadano nazwę C225, znanego obecnie bardziej

pod nazwą cetuksymab  (ErbituxR; ImClone System, Princeton, NJ). Jak wykazano, monomery

EGFR z przyłączonym przeciwciałem C225 nie dimeryzują

i w konsekwencji nie jest uruchamiana kaskada fosforylacji prowadząca do przekazania sygnału

do jądra . Obecnie opracowywane są inne przeciwciała monoklonalne wiążące EGFR, w tym

matuzumab oraz nimotuzumab , które podobnie

jak cetuksymab stanowią humanizowane przeciwciała mysie. Najnowszą wersją przeciciała

anty-EGFR stosowaną w klinice jest otrzymane metodami inżynierii genetycznej całkowicie

ludzkie przeciwciało o nazwie panitumumab (VectoibixR; Abgenix, Fremont, CA) .

Właściwości niskocząsteczkowych inhibitorów EGFR

Do drugiej grupy związków blokujących ścieżkę przekazu sygnału zależną od EGFR,

używanych w leczeniu, należą małe cząsteczki hamujące aktywność kinazową, mogące

odwracalnie bądź trwale łączyć się z miejscem wiązania ATP w domenie wenątrzkomórkowej

49

Page 50: 6.11.14 doktorat_final-final

receptora. Związki z tej grupy nazywane w skrócie TKI (ang. tyrosine kinase inhibitors) działają

specyficznie na cząsteczkę EGFR (np. gefitynib, erlotynib) bądź hamują aktywność więcej

niż jednego receptora z rodziy ERBB (np. lapatynib, wandetanib, AE788). Gefitynib (ZD1839,

IressaR, Astra Zeneca, Wilmington, DE) hamuje aktywność EGFR w stężeniach nanomolarnych

w mechanizmie inhibicji kompetycyjnej. Związek ten nie wywołuje internalizacji czy degradacji

EGFR, nie zmienia więc puli komórkowej EGFR. Przykładem innego stosowanego leku

onkologicznego z grupy TKI jest erlotynib (OSI-774, Tarceva™, OSI Pharmaceuticals

in collaboration with Genentech & Roche) wiążący się z domeną kinazową EGFR oraz EGFRvIII.

Najnowszym nieodwracalnym inhibitorem EGFR oraz HER-2 zaakceptowanym do leczenia raka

płuca w terapii pierwszej linii jest afitynib (Gilotrif™, Boehringer Ingelheim) .

Blokowanie uruchamiania przekazu zależnego od EGFR przez niskocząsteczkowe

inhibitory może zachodzić poprzez rozmaite mechanizmy szczegółowo opisane w następujących

pracach . Do efektów komórkowych wynikających z blokowania aktywności EGFR zalicza się,

oprócz hamowania proliferacji komórkowej, hamowanie migracji

i inwazyjności komórek oraz hamowanie angiogenezy, a także uwrażliwianie komórek

na działanie promieniowania jonizującego. Najnowsze opracowania podsumowujące wyniki

wieloletnich obserwacji klinicznych oraz dane z najnowszych badań wskazują, że zastosowanie

inhibitorów EGFR samodzielnie bądź w kombinacji z radioterapią czy chemoterapią

konwencjonalną poprawia efekty terapeutyczne w przypadku wielu typów nowotworów,

w szczególności w przypadku nowotworów głowy i szyi . Słabsze niż oczekiwano rezultaty

obserwuje się w przypadku stosowania inhibitorów EGFR w leczeniu chorych z nowotworami

gruczołu krokowego i jelita grubego . Przyczyną odmiennej odpowiedzi guzów różnych typów

na inhibitory EGFR mogą być między innymi:

powstawanie alternatywnych szlaków transdukcji sygnału prowadzących do nabycia

odporności przez komórki nowotworowe na lek,

zróżnicowane efekty powstające w mikrośrodowisku guza bądź dostawie składników

odżywczych do guza,

immunogeniczność przeciwciał chimerycznych,

różnice w farmakokinetyce i dystrybucji inhibitorów w guzie,

odmienne działanie czynników terapeutycznych na nowotworowe komórki macierzyste.

Szczegóły dotyczące tych mechanizmów opisano w pracy Krause et al. (2009).

Na podstawie najnowszych opracowań, w których starano się przeanalizować wyniki

dotychczasowych badań oraz ustalić przyczyny niedostatecznie efektywnego działania

50

Page 51: 6.11.14 doktorat_final-final

inhibitorów EGFR i stąd słabszych niż oczekiwane efektów terapeutycznych wśród

najważniejszych przyczyn wymienia się:

nieskuteczne hamowanie aktywności katalicznej zmutowanych wariantów receptora,

w tym najczęściej wymienianego wariantu III (EGFRvIII) po zastosowaniu przeciwciał,

mutacje w genach komponentów szlaków sygnałowych zależnych od EGFR prowadzące

do konstytutywnej aktywności ścieżki (np. mutacja w genach K-RAS czy PI3KCA),

blokowanie przez niektóre inhibitory EGFR cyklu komórkowego także w fazie, w której

komórki są bardziej oporne na działanie promieniowania jonizującego (faza G1).

Jednymi z najczęstszych przyczyn nieefektywności inhibitorów EGFR są mutacje w genie

kodującym KRAS w kodonie 12 lub 13 wywołujące konstytutywną aktywację białka skutkującą

ciągłą aktywnością ścieżki sygnałowej zależnej od EGFR oraz mutacje w genie PI3KCA

skutkujące hiperfosforylacją AKT . Należy zauważyć, że w raku jelita grubego status mutacji

KRAS może być w znaczący sposób powiązany z wynikiem leczenia, podczas gdy takiej

zależności nie obserwuje się dla NSCLC . W niektórych badaniach obserwowano, że pacjenci z

ekspresją niezmutowanej formy KRAS w kodonie 12/13 również nie odpowiadają na leczenie

inhibitorami EGFR. Możliwe jest, że sam proces leczenia inhibitorami EGFR może indukować

powstawanie mutacji w KRAS . W innych badaniach wykryto częste, równoczesne występowanie

mutacji w genach KRAS oraz PI3KCA, co pozwala sądzić, że zablokowanie obu ścieżek

równocześnie mogłoby poprawić wynik terapeutyczny .

Przedstawione powyżej dane wskazują na konieczność prowadzenia dalszych badań nad

mechanizmami działania inhibitorów EGFR na modelach nowotworów gruczołu krokowego

i jelita grubego w celu wyłonienia nowych inhibitorów o większej skuteczności radiouczulającej

w odniesieniu do wymienionych nowotworów. Ponadto jakkolwiek stosowane obecnie w leczeniu

onkologicznym inhibitory EGFR uważane są za bezpieczne, to u chorych leczonych tymi

cytostatykami obserwuje się efekty uboczne, głównie dolegliwe reakcje skórne oraz biegunki .

Dlatego, jako alternatywne dla obecnie stosowanych w klinice selektywnych inhibitorów EGFR

proponuje się nietoksyczne związki pochodzenia naturalnego lub ich syntetyczne pochodne.

Jednym z najważniejszych związków wskazywanych jako związek wiodący, głównie z uwagi na

właściwość hamowania aktywności kinaz tyrozynowych oraz topoizomerazy II, jest genisteina.

I.2.7. Trucizny topoizomerazy II jako potencjalne radiouczulacze

Topoizomeraza II jest enzymem kontrolującym zmiany w strukturze DNA w wyniku

katalizowania reakcji przecinania oraz przemieszczania szkieletu fosfodiestrowego cząsteczki

51

Page 52: 6.11.14 doktorat_final-final

DNA. Rozplatanie helisy DNA udostępnia enzymom replikacyjnym i transkrypcyjnym matrycę,

topoizomeraza II uczestniczy więc w podstawowych czynnościach komórki, takich jak podział,

synteza białka, rekombinacja, odpowiedzialna jest też za utrzymanie struktury chromatyny .

Topoizomeraza II przeprowadza proces uwalniania nici DNA w mechanizmie dwóch

reakcji transestryfikacji. Na wstępie TOPO II rozpoznaje odpowiedni fragment DNA na podstawie

sekwencji zasad i topologii nici polinukleotydowej, następnie przecina nić tworząc wiązanie

diestrowe pomiędzy grupą OH tyrozyny a wolną resztą fosforanową 3'- lub 5'- nukleotydu

w DNA. W ten sposób powstaje przejściowy kompleks nazywany kompleksem rozszczepialnym

(ang. cleavable complex, CC). W CC topoizomeraza II przyłączona jest dwoma wiązaniami

fosfodiestrowymi do DNA. Następnie dochodzi do rozsunięcia i rozplecenia helisy,

a po uwolnieniu obu helis następuje ligacja dwuniciowego pęknięcia .

Zahamowanie aktywności topoizomerazy II prowadzi do śmierci komórki bądź poważnych

zmian mutacyjnych: translokacji, delecji czy insercji. Związki hamujące aktywność topoizomeraz

klasyfikowane są do dwóch grup: inhibitorów cyklu katalitycznego oraz inhibitorów nazywanych

„truciznami” DNA. Pierwsza grupa związków hamuje aktywność topoizomerazy wywołując

śmierć komórkową. Związki z grupy trucizn przyłączają się do kompleksów CC wywołując

ich stabilizację i uniemożliwiają ligację nici DNA, co w konsekwencji prowadzi do powstania

pęknięć w nici DNA. Należy przy tym zauważyć, że szczególnie wrażliwe na „trucizny”

są komórki zawierające duży poziom topoizomeraz, a zatem szybko proliferujące. „Trucizny”

topoizomerazy II działają więc z pewną selektywnością na komórki nowotworowe szczególnie

te zdolne do repopulacji, stąd też wynika zasadność zastosowania tych inhibitorów w terapii

przeciwnowotworowej .

Spośród inhibitorów cyklu katalitycznego topoizomerazy II wymienić można kwasy

polikarboksylowe, indolokarbazole, spiroketale, bisdioksopiperazyny czy barbiturany.

Do „trucizn” DNA zalicza się akrydyny, antracykliny (doksorubicyna, daunomycyna),

antrapirazole, imidazoloakrydynony, epipodofilotoksyny, aktynomycyny, amonafidy,

chinoksaliny, benzimidazole i inne . Obecnie do leczenia przeciwnowotworowego FDA dopuściła

6 związków należących do grupy inhibitorów topoizomerazy II: etopozyd, tenipozyd,

doksorubicynę, idarubicynę, epirubicynę oraz mitoksantron (szczegółowe dane dotyczące tych

inhibitorów można znaleźć na stronie internetowej FDA, www.fda.gov).

Inhibitory topoizomerazy II są popularnymi lekami stosowanymi w chemoterapii oraz

w kombinacji z innymi technikami. Zdolności radiouczulające doksorubicyny oraz etopozydu

znane są od ponad 20 lat. Etopozyd wykazuje lepsze właściwości radiouwrażliwiające w stosunku

52

Page 53: 6.11.14 doktorat_final-final

do komórek nowotworowych szybko proliferujących . Etopozyd stosowany jest powszechnie w

kombinacji z innymi lekami oraz radioterapią. W ostatnich latach testuje

się skuteczność stosowania tego związku w leczeniu raka stercza opornego na kastrację

, mięska Kaposiego u dzieci i innych nowotworów, jak również w kombinacji z innymi

chemoterapeutykami . Etopozyd jest testowany do użycia z radioterapią w leczeniu

zaawansowanych grasiczaków czy nowotworów płuca u starszych pacjentów .

Doksorubicyna była testowana pod kątem zdolności radiouczulających w ostatnich latach

wielokrotnie, szczególnie w badaniach opisujących nową formulację leku. W pracy

z wykorzystaniem sferoidów otrzymanych z komórek raka płuca linii A549 pokazano,

że zamknięta w micelach doksorubicyna jest skuteczniej dostarczana do komórek w porównaniu

do związku wolnego i wywołuje lepszy efekt promieniouwrażliwiający .

W innych badaniach testowano wpływ doksorubicyny dostarczanej do guza w liposomach

na odpowiedź hipoksyjnych obszarów mysich ksenograftów raka prostaty wywodzących się z linii

CWR22. Doksorubicynę podawano w stężeniu 3.5 mg/kg masy ciała w kombinacji z radioterapią

(2 Gy/dzień przez 5 dni). Doksorubicyna znacząco poprawiała efekt radioterapii szczególnie

w warunkach hipoksyjnych, wywołując istotne obniżenie objętości guzów . W podobnych

badaniach sprawdzano wpływ zamykania doksorubicyny w liposomach

na odpowiedź komórek nowotworowych mózgu z użyciem ortopowych ksenograftów glejaków.

W najnowszych badaniach pokazano, że nowa formulacja leku może zwiększyć efekty

radioterapii również w odniesieniu do nowotworów mózgu . Przeprowadzono również badania

kliniczne dotyczące zastosowania doksorubicyny w kombinacji z innymi lekami i

promieniowaniem jonizującym u pacjentów z mięsakami pęcherza czy chłoniakami ALCL (ang.

anaplastic large-cell lymphoma) .

W obu pracach pokazano, że testowane kombinacje zwiększają przeżywalność pacjentów.

Pomimo, że inhibitory topoizomerazy II są szeroko stosowane w terapii

przeciwnowotworowej, ich użycie w terapii może wiązać się z powstaniem niepożądanych

skutków ubocznych. Inhibitory II mogą indukować białaczki oraz nowotwory wtórne niezwiązane

z nowotworem pierwotnym . Jedną

z przyczyn indukowania białaczek przez inhibitory TOPO II są translokacje w obrębie genu MLL

(ang. Mixed Lineage Leukemia) , które, jak się ocenia, są przyczyną około 80% przypadków

białaczek dziecięcych ALL (ang. acute myeloid leukemia) oraz

65% przypadków białaczek AML (ang. acute myeloid leukemia) . W krajach azjatyckich ryzyko

zapadnięcia na AML lub ALL jest dwukrotnie wyższe niż w krajach zachodnich, podejrzewa się

53

Page 54: 6.11.14 doktorat_final-final

zatem, że może być to skorelowane z dietą obfitszą w izoflawony . Z tego powodu pojawia się

wymóg, aby analogi genisteiny o potencjale terapeutycznym były poddawane szczególnie uważnej

ocenie pod kątem ich genotoksyczności .

I.3. Stosowanie genisteiny w kombinacji z terapiami konwencjonalnymi

Terapia kombinowana polega na równoczesnym stosowaniu dwóch lub większej liczby

technik terapeutycznych w celu zwiększenia całkowitego efektu terapeutycznego. Zastosowanie

terapii kombinowanej jest szczególnie zasadne, jeżeli możliwe jest uzyskanie efektu

synergistycznego bądź co najmniej addytywnego. Chemoterapia w połączeniu z radioterapią może

zwiększać kontrolę miejscową guza i zwiększać szansę na eliminację populacji komórek

radioopornych .

Jedną z obecnie stosowanych strategii onkologicznych jest wprowadzanie do terapii

przeciwnowotworowych substancji naturalnych, które mogą poprawiać wyniki leczenia metodami

konwencjonalnymi . W przypadku nowotworów odpowiadających słabo na radioterapię czy

chemoterapię zwiększanie odpowiednio stężeń cytotoksycznych leków czy dawek

promieniowania jonizującego nie jest skuteczne, ponieważ zwiększa toksyczność leczenia

względem tkanek prawidłowych oraz może indukować wykształcanie mechanizmów oporności

przez komórki nowotworowe na dany czynnik terapeutyczny. Związki występujące w ludzkiej

diecie nie wywołują skutków ubocznych w stężeniach osiąganych w ustroju bądź ich toksyczność

jest znacząco niższa niż standardowych chemoterapeutyków. Dlatego też wprowadzenie tego typu

związków (w stężeniach wyższych niż występujące w diecie) do terapii nie powinno znacząco

zwiększać ogólnej toksyczności leczenia,

a nawet może prowadzić do jej obniżenia, jeśli osiągane efekty kombinacji byłyby synergistyczne.

Genisteinę testowano do tej pory jako związek o potencjalnym zastosowaniu w terapii

kombinowanej z chemoterapią i radioterapią głównie w badaniach przedklinicznych.

W piśmiennictwie istnieją jedynie nieliczne dane z badań klinicznych lub pilotażowych opisujące

zdolność genisteiny do zmniejszania skutków ubocznych chemoterapii oraz radioterapii

. Ponadto dotychczas nie prowadzono prób klinicznych oceniających właściwości radiouczulające

izoflawonu, jedynie w kilku próbach oceniano zdolności chemouwrażliwiające genisteiny.

Spośród 53 prób klinicznych zarejestrowanych obecnie w ClinicalTrials.gov (program U.S.

National Instututes of Health,

www. http://clinicaltrials.gov/), w których badana jest genisteina, 27 ma związek z chorobami

onkologicznymi. Genisteinę badano w kontekście chemouwrażliwiania w kombinacji

54

Page 55: 6.11.14 doktorat_final-final

z gemcytabiną u kobiet w IV stadium nowotworu piersi (numer badania w Clinicaltrials.gov.

NCT00244933, wyniki badań nie zostały opublikowane) oraz w kombinacji z erlotynibem

i gemcytabiną w miejscowo zaawansowanym raku trzustki (NCT00376948). W badaniach

klinicznych II fazy wzięło udział 20 pacjentów (16 pacjentów

w IV stadium choroby), którym podawano gemcytabinę w stężeniu 1000 mg/m² w dniach

1, 8 i 15, erlotynib w stężeniu 150 mg raz na dobę od dnia 1 do 28 oraz izoflawony sojowe

(Novasoy ®) w dawce 531 mg dwa razy dziennie, zaczynając dnia 7 do końca udziału w badaniu.

Badania pokazały, że genisteina nie zmienia długości przeżycia pacjentów (średnio 5.2 miesiąca)

w porównaniu do grupy nieotrzymującej suplementacji sojowej. Obecnie rozpoczęto próby

kliniczne (NCT01628471), w których genisteina będzie badana w kombinacji z decytabiną

w leczeniu raka płuca NSCLC (ang. non-small-cell lung carcinoma) i innych guzów

nowotworowych.

Pomimo, że w piśmiennictwie niewiele jest danych z badań klinicznych dotyczących

właściwości chemouwrażliwiających genisteiny, liczne wyniki badań in vivo oraz in vitro sugerują

potencjalną przydatność genisteiny w uczulaniu komórek nowotworowych na działanie

standardowych chemoterapeutyków bądź innych substancji o potencjalnym znaczeniu

przeciwnowotworowym. W badaniach in vitro z wykorzystaniem komórek nowotworowych

gruczołu krokowego (linia LNCaP) pokazano, że genisteina stosowana w kombinacji

z topotekanem hamuje proliferację komórek oraz indukuje generowanie reaktywnych form tlenu

w stopniu znacząco wyższym niż każda z tych substancji zastosowana samodzielnie . W innej

pracy wykazano, że genisteina w stężeniu 10 μM uczulała komórki raka płuca (linia A549)

hodowane w warunkach in vitro na działanie trichostatyny A wywołując wzrost aktywności

kaspazy 3 . W jeszcze innych badaniach pokazano, że łączenie genisteiny w stężeniu 25 μM z

cisplatyną w stężeniu 250 nM skutkuje zwiększonym efektem antyproliferacyjnym w stosunku do

komórek raka szyjki macicy (linia HeLa). Genisteina wzmacniała efekt działania cisplatyny w

mechanizmie zależnym od hamowania aktywności ścieżek NF-κB, AKT/mTOR .

Interesujące wyniki badan in vitro przedstawiono dla linii raka gruczołu krokowego

LNCaP oraz linii wywodzącej się z przerzutu komórek nowotworowych prostaty LNCaP do kości

C4-2B . Genisteina stosowana w kombinacji z innym izoflawonem sojowym, daidzeiną, w

stężeniach 50 μM / 50 μM hamowała proliferację komórek nowotworowych oraz indukowała

apoptozę i hamowała progresję cyklu komórkowego znacznie wydajniej, niż jeśli każdy ze

związków podawano komórkom osobno. W badaniach

z wykorzystaniem 3 różnych linii komórek nowotworowych płuca NSCLC o różnym statusie

55

Page 56: 6.11.14 doktorat_final-final

mutacji EGFR: H3255 (L858R), H1650 (del E746-A750), oraz H1781 (dzika forma EGFR)

pokazano, że genisteina wzmacnia przeciwnowotworowe działanie inhibitorów EGFR (TKI).

Komórki traktowano erlotynibem, gefitynibem, genisteiną albo kombinacją każdego

z TKI z genisteiną. Wyniki pokazały, że genisteina wykazała działanie antyproliferacyjne

we wszystkich liniach komórkowych, ale znacznie większe, jeśli stosowana była w kombinacji

z erlotynibem czy gefitynibem. Obie kombinacje (erlotynib-genisteina oraz gefitynib-genisteina)

obniżały aktywność NF-κB w linii H3255 znacznie lepiej, niż jeśli związki stosowano

samodzielnie. Ponadto kombinacja genisteiny z każdym z TKI zmniejszała ekspresję genu EGFR,

poziom pAKT, COX-2, i PGE2.

Zastosowanie kombinacji genisteiny z gemcytabiną w linii kostniakomięsaka MNNG/HOS

in vitro oraz in vivo wywoływało silniejszą inhibicję wzrostu oraz indukcję apoptozy na drodze

zależnej od NF-κB oraz AKT, niż gdy każdy ze związków stosowano w monoterapii .

Zastosowanie genisteiny w kombinacji z cisplatyną dawało in vitro efekty synergistyczne w

odniesieniu do komórek raka wątroby (linia HCCLM3). W badaniach in vivo kombinacja

genisteiny oraz cisplatyny skutkowała obniżeniem zdolności komórek raka

wątrobowokomórkowego linii HCCLM3 do przerzutowania oraz częstości nawrotów guzów

u myszy po operacyjnym usunięciu płatów zajętych nowotworem (hepatektomia) . W innych

badaniach pokazano, że genisteina zwiększa ekspresję genu kodującego

proapoptotyczne białko Bax oraz powoduje wzrost efektywności działania kabazitakselu

w stosunku do komórek raka gruczołu krokowego (linia mCRPC) in vivo w układzie modelowym

ksenograftów mysich . Ponadto, także w układzie modelowym ksenograftów mysich wykazano,

że genisteina wstrzykiwana doguzowo w dniu 0 oraz 7 leczenia w dawce

10 μM uczula komórki raka pęcherza moczowego (linia TCCSUP) na hydroksykamptotecynę

stosowaną w stężeniu 3 μg/ml . Szczegółowe informacje dotyczące właściwości genisteiny jako

związku chemouwrażliwiającego przedstawiono pośród innych związków pochodzenia roślinnego

w pracy .

Oprócz właściwości chemouwrażliwiających genisteina wykazuje w próbach

przedklinicznych właściwości radiouwrażliwiające. W piśmiennictwie dostępne są liczne wyniki

badań in vivo oraz in vitro opisujące zdolność genisteiny do zwiększania przeciwnowotworowego

działania promieniowania jonizującego. W badaniach in vitro pokazano, że genisteina zwiększa

promienioczułość komórek nowotworowych raka płuca (linia A549) na radioterapię, jeżeli

stosowana jest w stężeniach w zakresie 0.01 μM – 10 μM (maksymalne dawki stosowane

klinicznie) . Dla porównania, w w badaniach in vitro

56

Page 57: 6.11.14 doktorat_final-final

z wykorzystaniem linii komórkowych raka piersi MCF-7 (komórki ER-dodatnie,

z prawidłową formą białka p53) i MDA-MB-231 (ER-ujemne, posiadające mutację w genie TP53)

pokazano, że genisteina stosowana w stężeniu 10 μM indukuje blok cyklu komórkowego w fazie

G2/M w mechanizmie polegającym na aktywacji szlaku ATM/CHK2/Cdc25C/Cdc2 i ostatecznie

zwiększa promienioczułość zarówno ER-ujemnych i ER-dodatnich komórek raka piersi. W innych

badaniach zauważono, że ekspozycja komórek nowotworowych raka szyki macicy (linia CaSki)

na promieniowanie jonizujące wywołuje blok cyklu komórkowego w radioopornej fazie G1.

Podanie komórkom genisteiny (w rosnących stężeniach 0-200 μM) dwie doby przed

ich napromienianiem powodowało spadek liczby komórek znajdujących się w fazie G1

i równoczesny wzrost liczby komórek w bardziej radiowrażliwej fazie G2. Ponadto łączenie tych

dwóch czynników terapeutycznych (genisteina i promieniowanie) wywoływało wzrost ekspresji

genów kodujących p53, p21 oraz Cdc2 odpowiadających za zahamowanie progresji cyklu

komórkowego. Równocześnie obserwowano wzrost zawartości białek proapoptotycznych oraz

spadek zawartości białek antyapoptotycznych, a także aktywację kaspaz 3 oraz 9, co prowadziło

do podwyższenia poziomu apoptozy w porównaniu do monoterapii . W innych badaniach z

wykorzystaniem dwóch linii raka szyjki macicy Me180 oraz CaSki pokazano,

że wpływ genisteiny na promienioczułość był zależny od zastosowanego stężenia. Kombinacja

genisteiny w stężeniu 40 μM z promieniowaniem jonizującym obniżała frakcję komórek

przeżywających do 5% w linii Me180. Najbardziej znaczące zwiększenie promienioczułości

zaobserwowano w komórkach CaSki, jeśli genisteinę w stężeniach 20 μM i 40 μM kombinowano

z IR w dawkach odpowiednio 500 cGy i 800 cGy. Kombinacja genisteiny z IR prowadziła

do obniżenia fosforylacji AKT (Thr 308) w komórkach CaSki .

Najnowsze badania pokazują, że właściwości radiouczulające genisteiny w komórkach

hipoksyjnych linii MCF7 mogą wynikać ze zdolności izoflawonu do supresji indukowanego

promieniowaniem czynnika NF-κB oraz innych czynników odpowiedzialnych za radiooporność

komórek nowotworowych, w tym eNos, ERK 1/2, SOD2, AKT1/2/3, p50, p65, pIκBα, TNFα .

Podobne obserwacje poczyniono dla linii gruczołu krokowego PC3. Genisteina obniżała

indukowaną IR aktywację NF-κB wywołując apoptozę oraz blokadę cyklu komórkowego . W

przypadku komórek raka gruczołu krokowego (linia DU145) genisteina działała radiouczulająco

poprzez zwiększanie liczby komórek apoptotycznych, blok cyklu w fazie G2/M oraz obniżenie

wydajności naprawy DNA .

Dane z doświadczeń in vivo również dostarczają dowodów na zasadność łączenia

genisteiny z radioterapią. W badaniach na zwierzętach dowiedziono, że genisteina w kombinacji

57

Page 58: 6.11.14 doktorat_final-final

z IR wywołuje synergistyczną inhibicję wzrostu nowotworów pierwotnych i metastatycznych

w ortotypowych modelach raka nerek . W tej samej grupie badawczej pokazano, że kombinacja

soi (podawanie doustne 1 mg/kg masy ciała) i IR (10 Gy) powodowała znacznie silniejsze

zahamowanie rozwoju guzów nowotworowych wywodzących się z komórek A549 w płucach

myszy nagich w porównaniu do warunków, w których każdą technikę stosowano oddzielnie .

Podobne obserwacje opisano w pracy Hillman & Singh-Gupta (2011). Komórki A549 podawane

myszom dożylnie formowały guzki w płucach. Myszy noszące nowotwory płuca napromieniano

dawką 12 Gy (tylko lewe płuco, dzień 22), a dietę sojową

w dawce 1 mg/dzień stosowano przez 30 dni (dni 20-22 oraz 23-49 od wstrzykiwania komórek

nowotworowych). Analiza histologiczna płuc pobranych od grup kontrolnych myszy ujawniła

występowanie dużych guzków nowotworowych w skrawkach badanej tkanki. Widoczne były

charakterystyczne cechy morfologiczne gruczolakoraka zbudowanego z dużych pleomorficznych

komórek nowotworowych. W komórkach występowały liczne wakuole oraz duże jądra

z widocznymi jąderkami. W grupie zwierząt, którym podawano wyłącznie dietę sojową

obserwowano w tkance płuc nieprawidłowe wielojądrzaste komórki nowotworowe i znaczne

nacieki komórek zapalnych, na które składały się głównie się limfocyty. W przypadku myszy,

które były jedynie napromieniane obserwowano w płucach mniejsze guzki, zmiany degeneracyjne

w cytoplazmie (duża liczba wakuol) oraz jądra komórek nowotworowych z naciekami zapalnymi.

W przypadku, kiedy myszy były eksponowane równocześnie na IR oraz karmione dietą sojową,

w płucach nie wykrywano guzków nowotworowych bądź guzki miały niewielkie rozmiary.

W badaniach in vitro sprawdzających zdolności radiouczulające genisteiny stosowana jest

podobna metodyka. Związek w ustalonych wcześniej stężeniach wprowadzany jest do pożywki

hodowlanej zwykle przed ekspozycją komórek nowotworowych na działanie promieniowania

jonizującego. Preinkubacja komórek ze związkiem w określonym czasie przed napromienianiem

ma na celu zwiększenie ich czułości na IR. Czas inkubacji z genisteiną w omawianych powyżej

pracach był różny, jednak w zakresie 1-24 h. Dla przykładu w pracy Zha et al. (2010) inkubacja

z genisteiną trwała 24 h (stężenie genisteiny 10 μM), w doświadczeniach opisanych w pracy – 1 h

(stężenie genisteiny 100 μM), natomiast w eksperymentach opisanych w pracy komórki

eksponowano na genisteinę przez 1 h przed napromienianiem, a następnie 1 h po napromienianiu

(stężenie genisteiny 100 μM), a w pracy Raffoul et al. (2007) stosowano 24 h inkubację komórek

z roztworem sojowym zawierającym 43% genisteiny.

Schemat podawania czystej genisteiny w badaniach in vivo różni się w przedstawionych

pracach. W pracy Hillman & Singh-Gupta (2011) myszy karmiono soją w dawce 1 mg/dzień

58

Page 59: 6.11.14 doktorat_final-final

przez 3 dni (20-22 dzień) po wstrzyknięciu komórek nowotworowych A549. Po 22 dniach od

iniekcji komórek nowotworowych lewe płuco myszy naświetlano promieniowaniem fotonowym

w dawce 12 Gy, a następnie od dnia 23-49 podawano genisteinę w dawce jak poprzednio. W innej

pracy tego samego zespołu stosowano podobny schemat podawania czystej genisteiny. Myszy

wstępnie karmiono genisteiną w dawce 5 mg/dzień/mysz przez 3 dni (dni 12-14), a następnie

po napromienieniu guza (w nerkach) dawką 8 Gy wznowiono podawanie genisteiny co drugi

dzień w dawce 5 mg/dzień/mysz. Myszy zabijano w dniu 28, aby ocenić wpływ terapii na guzy

pierwotne i przerzuty. Z kolei w badaniach innej grupy opisanych w pracy zwierzęta wstępnie

napromieniano dawką jednorazową 18 Gy, a następnie natychmiast rozpoczynano podawanie

genisteiny w stężeniu 750 mg/kg masy ciała. W pracy tej założono biodostępność związku około

20-25%, co oznaczało, że szczury powinny wchłonąć

20-25 mg związku na 1 kg masy ciała. Wstępne wyniki badań tej grupy sugerowały, że już cztery

dawki genisteiny w stężeniu 50 mg/kg masy ciała podane dootrzewnowo bezpośrednio po

napromienianiu, a następnie codziennie przez następne 3 dni zapewniały pewną ochronę po

zastosowaniu promieniowania w dawkach 15,5 i 18 Gy.

Oprócz właściwości radiouczulających w piśmiennictwie opisywane są również

radioprotekcyjne właściwości genisteiny względem tkanek prawidłowych .

W badaniach in vivo pokazano, że genisteina wstrzykiwana dożylnie myszom w stężeniu

200 mg/kg masy ciała 24 h przed eksponowaniem ich na letalną jednorazową dawkę

promieniowania (7.75 Gy) zapobiegała wystąpieniu ostrej mielotoksyczności poprzez

zapobieganie starzeniu komórek szpiku kostnego LSK(+) odpowiadających za repopulację . W

innych badaniach pokazano, że zastosowanie genisteiny w diecie szczurów

w stężeniu 750 mg/kg masy ciała po napromienianiu ich całkowitą dawką promieniowania 18 Gy

skutkuje redukcją indukowanej IR ekspresji cytokin zapalnych, w tym TNF-α, IL-1β oraz TGF-β

w płucach, czego skutkiem jest ochrona DNA przed uszkodzeniami .

W jeszcze innej pracy pokazano, że genisteina podawana myszom podskórnie w dawce 200 mg/kg

masy ciała dzień przed napromienianiem zapobiega powstawaniu uszkodzeń w jelitach oraz

chroni przed powstaniem nieprawidłowych zmian w tkance jąder i umożliwia zajście prawidłowej

spermatogenezy zapobiegając apoptozie komórek rozrodczych .

W pracy pokazano, że pojedyncze domięśniowe wstrzyknięcie nanocząsteczkowej zawiesiny

genisteiny w soli (150 mg/kg masy ciała) myszom CD2F1 24 h przed ekspozycją

na promieniowanie gamma emitowane przez izotop kobaltu (60) CO w dawce 9.25 Gy skutkuje

zwiększeniem współczynnika 30-dniowego przeżycia do 95% w porównaniu z 25% w przypadku

59

Page 60: 6.11.14 doktorat_final-final

zwierząt kontrolnych. U myszy poddanych promieniowaniu w dawce 7 Gy nanocząsteczki

genisteiny powodowały wzrost liczby komórek szpiku kostnego od około 2.9% (grupa kontrolna)

do 28.3% w 7 dniu po napromienianiu. W pracy Day et al. (2013) pokazano, że 8.25 Gy TBI

(ang. total body irradiation) generowane przez bombę kobaltową spowodowało 0% przeżycia

po 30 dniach u nieleczonych myszy. Jedna iniekcja podskórna genisteiny 24 h przed TBI

zwiększała przeżycie u myszy do 72%. Podawanie kaptoprilu w wodzie do picia począwszy

od 1 godziny przez 30 dni po napromienianiu zwiększało przeżywalność do 55%. Genisteina

stosowana w kombinacji z kaptoprilem wywoływała wzrost przeżywalności myszy

napromienianych do 95%.

W piśmiennictwie obecne są również prace opisujące badania kliniczne oceniające

radioprotekcyjny charakter genisteiny. W badaniach klinicznych opisanych w pracy , w których

uczestniczyło 42 pacjentów z rakiem prostaty, sprawdzano czy suplementacja sojowa w

kombinacji z promieniowaniem jonizującym zwiększy skuteczność leczenia i/lub obniży

toksyczność radioterapii. Pacjentów losowo przydzielono do grupy otrzymującej

200 mg/dobę/osobę izoflawonów sojowych (grupa 1) lub placebo (grupa 2) przez 6 miesięcy

poczynając od pierwszego dnia radioterapii. Pacjenci otrzymywali dawki frakcjonowane

1.8 do 2.5 Gy oraz dawkę łączną 73.8 do 77.5 Gy. U pacjentów otrzymujących suplementację

sojową obserwowano istotną poprawę w zakresie łagodzenia takich efektów ubocznych

radioterapii jak nietrzymanie moczu czy pojawianie się biegunek. Szczegółowe informacje

podsumowujące potencjalne radioprotekcyjne znacznie genisteiny (obok innych związków

pochodzenia roślinnego) można znaleźć w pracy .

Jak pokazuje powyższy przegląd piśmiennictwa, dane z badań przedklinicznych

i klinicznych sugerują, że izoflawony sojowe są bezpiecznymi związkami naturalnymi, które

nie tylko mogą działać jako środki przeciwnowotworowe, ale również jako związki chroniące

prawidłowe tkanki przed toksycznością radioterapii. Przegląd prac dotyczących tej tematyki

przedstawiono w podsumowaniu . Pomimo, że genisteina jest znanym inhibitorem aktywności

receptora naskórkowego czynnika wzrostu oraz topoizomerazy II, dotychczas nie badano tych

właściwości w kontekście zwiększania radiowrażliwości komórek nowotworowych.

Pomimo, że genisteina wykazuje obiecujące właściwości przeciwnowotworowe i liczne

badania in vitro oraz in vivo pokazują jej przydatność terapeutyczną, związek nie został wdrożony

do leczenia. Do najistotniejszych ograniczeń zastosowania tego izoflawonu jako leku należy jego

niska biodostępność wynikająca ze słabej absorpcji z jelit, szybkie metabolizowanie w ustroju

oraz nieefektywna akumulacja w komórkach . W celu przezwyciężenia wymienionych powyżej

60

Page 61: 6.11.14 doktorat_final-final

ograniczeń stosuje się strategię polegającą na wprowadzeniu

do cząsteczki genisteiny dodatkowych grup chemicznych z nadzieją na poprawę właściwości

farmakokinetycznych struktury podstawowej. Przegląd piśmiennictwa dotyczącego strategii

wykorzystywanych w projektowaniu pochodnych genisteiny oraz przegląd najistotniejszych,

w kontekście niniejszej pracy, analogów genisteiny zsyntezowanych do tej pory został

szczegółowo omówiony w rozdziale „Dyskusja”. Na tle tych informacji możliwe było wyjaśnienie

przyczyn, dla których do badań niniejszej pracy zakwalifikowano cukrowe, a konkretnie

ramnalowe, pochodne genisteiny oraz przedyskutowanie ich przewagi nad innymi pochodnymi

genisteiny zsyntezowanymi dotychczas.

61

Page 62: 6.11.14 doktorat_final-final

II. CEL PRACY

Podstawą przeciwnowotworowych terapii kombinowanych jest oczekiwanie, że stosowane

czynniki terapeutyczne, działając na różne procesy komórkowe, mogą w połączeniu wykazywać

działanie synergistyczne lub przynajmniej addytywne, bez wywoływania nieakceptowalnych

reakcji ubocznych. W przypadku radioterapii poszukuje się leków, które zwiększając

promienioczułość komórek nowotworowych mogłyby ograniczać moc dawki przy zachowaniu

pożądanego efektu terapeutycznego oraz równocześnie zmniejszać skutek ekspozycji

na promieniowanie jonizujące tkanek prawidłowych znajdujących w otoczeniu zmiany

nowotworowej. Poszukując związków, które mogłyby być stosowane w chemo- i radioterapii

kombinowanej szczególną uwagę zwraca się na związki naturalne, które działałyby równocześnie

na kilka celów molekularnych. Do takich związków należy izoflawonoid genisteina, której główny

efekt cytotoksyczny w stosunku do komórek nowotworowych wynika ze zdolności do hamowania

aktywności kinaz tyrozynowych oraz topoizomerazy II, jak również blokowania cyklu

komórkowego w fazie G2/M.

Pierwszym celem niniejszej pracy było zbadanie czy i w jakim stopniu glikozydowe

pochodne genisteiny zsyntezowane w Katedrze Chemii Organicznej, Bioorganicznej

i Biotechnologii Politechniki Śląskiej wykazują zwiększoną właściwość hamowania wzrostu

komórek nowotworowych w porównaniu ze związkiem macierzystym, genisteiną.

Aby to wyjaśnić dla każdego z badanych związków określono wartość IC50.

Drugim celem niniejszej pracy było zbadanie czy i które ze związków hamujących

proliferację komórek nowotworowych w niższym stężeniu niż genisteina wykazują właściwość

uwrażliwiania komórek nowotworowych na działanie promieniowania jonizującego, a zatem

czy mogą być brane pod uwagę jako potencjalne radiouczulacze.

Trzecim celem pracy było określenie mechanizmu działania glikozydowych pochodnych

genisteiny. W tym celu dla każdego z badanych związków określono:

właściwość modulowania poziomu EGFR oraz aktywności/fosforylacji EGFR;

właściwość hamowania aktywności/fosforylacji elementów szlaków zależnych od

EGFR: AKT oraz MAPK;

właściwość hamowania aktywności topoizomerazy II.

Badania niniejszej pracy miały charakter przesiewowy. Badania miały umożliwić

przeprowadzenie analizy SAR i/lub doprowadzić do wyselekcjonowania związku/związków

o najlepszych właściwościach radiouczulających, które w następnej kolejności można

by zakwalifikować do badań in vivo.62

Page 63: 6.11.14 doktorat_final-final

III. MARIAŁY I METODY

III.1. Substancje chemiczne

W doświadczeniach wykonywanych w ramach niniejszej pracy wykorzystano związki

chemiczne zsyntezowane w grupie prof. dr hab. inż. Wiesława Szeji z Katedry Chemii

Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej.

Uzyskane substancje stanowią pochodne genisteiny, której strukturę chemiczną wykorzystano

jako podstawową w projektowaniu kandydatów na lek. Pochodne powstały poprzez wprowadzenie

dodatkowych grup chemicznych w pozycjach najczęściej modyfikowanych

w cząsteczce genisteiny – przy grupach hydroksylowych występujących przy węglach C-7 oraz

C-4’. Wzór strukturalny genisteiny przedstawiono na rycinie I.1. w rozdziale „Wstęp”.

Do badań włączono cukrowe pochodne genisteiny, które w doświadczeniach wstępnych

wykazywały większą aktywność w liniach nowotworowych niż genisteina:

4 związki z wiązaniem O–glikozydowym w pozycji C-7, których właściwości

antyproliferacyjne sprawdzano uprzednio w testach in vitro (Gruca, 2009, praca magisterska,

Rusin et al., 2009, Rusin et al., 2011, Gogler-Pigłowska et al., 2012), w tym glikozyd G21

z przyłączonym dwucukrem (laktal z acetylowanymi resztami hydroksylowymi) bezpośrednio

do cząsteczki genisteiny; oraz pochodne ramnalowe, w których grupa cukrowa

(z acetylowanymi grupami OH) została oddalona od struktury wyjściowej łącznikiem

węglowym różnej długości odpowiadającej liczbie w nazwie związku: pochodne RAM-2,

RAM-3 oraz RAM-5;

3 nowe związki stanowiące analogi powyżej wymienionych pochodnych ramnalowych,

w których wiązanie O-glikozydowe przy węglu C-7 zastąpione zostało wiązaniem

C-glikozydowym, czyli teoretycznie bardziej opornym na hydrolizę enzymatyczną

prowadzoną przez β–glukozydazy, a dzięki temu nadającym cząsteczce zwiększoną

stabilność: RAM-C-3α, RAM-C-4α, oraz RAM-C-5α;

3 związki należące do szeregu pochodnych z przyłączoną do aglikonu resztą cukrową

w pozycji C-4’ poprzez łącznik węglowy, należące do grupy związków z wiązaniem

O-glikozydowym: pochodne ramnalowe: RAM-2’, RAM-3’, RAM-5’.

Pełne nazwy związków chemicznych wraz z podziałem na klasy, stosunkiem anomerów oraz

odnośnikami literaturowymi do opisów syntez zebrano w tabeli III-1. Szczegółowe wyjaśnienie

przyczyn, dla których konkretne związki zostały wybrane do doświadczeń niniejszej pracy zostało

przedstawione w rozdziale „Dyskusja”.

63

Page 64: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela III-5. Związki chemiczne używane w doświadczeniach. W tabeli przedstawiono pełne nazwy chemiczne związków, stosunek anomerów α/β, podział na grupy w zależności od miejsca podstawienia i rodzaju wiązania glikozydowego w strukturze związku oraz odnośniki literaturowe, w których opisana została procedura chemicznej syntezy każdej pochodnej.

Klasa Nazwa Nazwa wg IUPAC Stosunek anomerów

Opis syntezy

Stru

ktur

a w

iodą

ca

Genisteina 5,7-dihydroksy-3-(4-hydroksyfenylo)chromen-4-on - -

Wią

zani

e O

-glik

ozyd

owe

pods

taw

ieni

e pr

zy C

-7

G21 7–O–(2,3,4,6–tetra–O–acetylo–β–D–galaktopiranozylo)–(14)–(6–O–acetylo–heks–2–en–α–D–erytro–piranozylo) genisteina

tylko α Rusin et al., 2009

RAM-2 5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)–2–O–etoksy]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 10/1

Rusin et al., 2011

RAM-3 5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)–3–O–propyloksy]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 4.2/1

RAM-5 5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks––enopiranozylo)–5–O–pentyloksy]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 4/1

Wią

zani

e C

-glik

ozyd

owe

pods

taw

ieni

e pr

zy C

-7

RAM-C-3α 5–hydroksy–7–O–[3–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)propylo]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α

Rusin et al., 2014

RAM-C-4α 5–hydroksy–7–O–[4–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)butylo]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α

RAM-C-5α 5–hydroksy–7–O–[5–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2enopiranozylo)pentylo]–3–(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α

Wią

zani

e O

-glik

ozyd

owe

pods

taw

ieni

e pr

zy C

-4’

RAM-2’ 5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–β–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)–2–etoksyfenylo]–chromen–4–on

α/β = ¼

Byczek et al., 2013

RAM-3’ 5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)–3–propyloksyfenylo]–chromen–4–on

α/β = 6/1

RAM-5’ 5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–enopiranozylo)–5–pentyloksyfenylo]–chromen–4–on

α/β = 6/1

III.2. Przygotowanie związków do badań64

Page 65: 6.11.14 doktorat_final-final

Pochodne genisteiny rozpuszczano w celu użycia do doświadczeń w DMSO

(dimetylosulfotlenek, (CH3)2SO, ang. dimethyl sulfoxide, Sigma). Rozpuszczalnik ten został

wybrany ze względu na właściwości aprotyczne silnie solwatujące. Roztwory substancji

przechowywano w temperaturze -20oC. Bezpośrednio przed doświadczeniami z roztworu

podstawowego (100mM) przygotowywano roztwory robocze o stężeniach 10 mM i/lub 1mM

związków i odpowiednią objętość tych roztworów wprowadzano do pożywki hodowlanej. Użycie

DMSO jako rozpuszczalnika dla testowanych związków powoduje, że do pożywki hodowlanej

wprowadzany jest dodatkowy związek chemiczny, co oznacza, że komórki eksponowane

są na działanie dodatkowego czynnika. Dane literaturowe oraz doświadczenia wstępne pokazują,

że DMSO w stężeniu równym bądź niższym od 0.5% nie wpływa na przeżywalność i proliferację

komórkową.

W doświadczeniach wykonywanych w ramach niniejszej pracy używano możliwie najwyżej

stężonego roztworu roboczego badanych związków (100 mM, 10 mM), aby obniżyć stężenie

DMSO w pożywce. Jednocześnie roztwory związków, które przechowywano do dalszych

doświadczeń miały na tyle niskie stężenia (100 – 250 mM), by zredukować zjawisko wytrącania

substancji w czasie ich przechowywania.

W niektórych doświadczeniach jako związek referencyjny wykorzystywano również

etopozyd, związek chemiczny będący trucizną topoizomerazy II, stosowany w chemoterapii

nowotworów.

III.3. Przeciwciała stosowane do immunodetekcji

W celu wykrycia antygenów w komórkach nowotworowych traktowanych różnymi

pochodnymi genisteiny i/lub promieniowaniem jonizującym (ang. irradiation, IR) stosowano

dostępne komercyjnie przeciwciała. Spis przeciwciał przedstawiono w tabeli III-2. Przeciwciała

pierwszorzędowe używane w doświadczeniach wykonywanych w ramach niniejszej pracy

wykrywały różne formy EGFR, białek należących do szlaku przekazu sygnału zależnego

od EGFR: ERK 1/2 oraz AKT, różne izoformy topoizomerazy II oraz białka referencyjne HSC70

bądź aktynę. W eksperymentach stosowano przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z HRP

(ang. horseradish peroxidase, peroksydaza chrzanowa) anty-królicze oraz anty-mysie.

65

Page 66: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela III-6. Stosowane w badaniach niniejszej pracy przeciwciała. W tabeli zamieszczono nazwę producenta oraz proporcję, w jakiej przeciwciało stosowano w analizach „western blot”.

Rodzaj przeciwciała Producent /numer seryjny Stężenie

królicze poliklonalne przeciwciało wykrywające EGFRMillipore 06-847

1:3000

królicze monoklonalne przeciwciało wykrywające fosforylowaną przy tyrozynie 1068 formę EGFR

Millipore 04-339

1:250

mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające fosforylowaną przy tyrozynie 1173 formę EGFR

Millipore05-483

1:1000

królicze przeciwciało monoklonalne wykrywające fosforylowaną przy tyrozynie 473 formę AKT

Thermo ScientificOMA1-03061

1:500

królicze rekombinowne przeciwciało monoklonalne wykrywające fosforylowaną przy treoninie 202 oraz tyrozynie 204 (42/44) formę ERK ½

Millipore05-797R

1:1000

mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające ludzką topoizomerazę II α

NovocasraNCL-L-TOPOIIA

1:300

mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające ludzką topoizomerazę II β

Santa Cruz Biotechnologysc-25330

1:300

mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające HSC70Santa Cruz Biotechnologysc-7298

1:6000

mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające aktynęSigma-AldrichA3853

1:1000

poliklonalne przeciwciało drugorzędowe antykrólicze skoniugowane z HRP

Millipore 12-348

1:5000

poliklonalne przeciwciało drugorzędowe antymysie skoniugowane z HRP

Millipore12-349

1:5000

III.4. Linie komórkowe

Badania prowadzano na dwóch liniach komórkowych: DU145 oraz HCT116 pochodzących

z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) i przechowywanych w banku komórkowym

Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii,

Oddział w Gliwicach. Komórki obu linii wykazują adhezję do podłoża i rosną w postaci

monowarstwy. Nowotworowa linia gruczołu krokowego DU145 wyizolowana została

z przerzutów do mózgu, linia HCT116 Z jelita grubego dorosłego mężczyzny. W badaniach

wstępnych określono czas podwajania komórek HCT116 oraz DU145 na odpowiednio 28 godziny

oraz 32 godziny.

66

Page 67: 6.11.14 doktorat_final-final

Ze względu na to, że badania niniejszej pracy koncentrowały się na ocenie zdolności

genisteiny i jej pochodnych do uczulania komórek nowotworowych na promieniowanie jonizujące

oraz hamowania funkcji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i topoizomerazy II,

przesłanki, którymi kierowano się przy wyborze powyżej wymienionych linii nowotworowych

do badań były następujące:

Do badań wybrano dwie linie szybko proliferujące, a zatem o dużym stężeniu TOPO II,

wykazujące wysoką agresywność oraz o wysokim poziomie ekspresji EGFR oraz syntezujące

i wydzielające ligandy dla EGFR: EGF i TGF-α (strona internetowa ATCC;

http://www.atcc.org/, .

Linie DU145 oraz HCT116 są często wybieranym modelem do badań potencjalnych

inhibitorów EGFR .

W badaniach wstępnych (Gruca, 2009, praca magisterska) potwierdzono zdolność genisteiny

oraz jej pochodnych G21 oraz RAM-3 do hamowania aktywności EGFR w wymienionych

liniach nowotworowych.

W piśmiennictwie oraz własnych badaniach wstępnych pokazano, że genisteina hamuje

aktywność topoizomerazy II w stężeniu 200 μM w komórkach DU145 , a w pracy wiązano

zdolność do hamowania TOPO II

w stężeniu 37.5 μM w testach bezkomórkowych z hamowaniem proliferacji w linii HCT116.

Można było zatem podejrzewać, że pochodne genisteiny będą w tych szybko proliferujących

liniach nowotworowych wywoływały podobny bądź lepszy efekt hamujący aktywność

TOPO II. Należy zauważyć, że inhibitory TOPO II są częściowo selektywne, ponieważ

w komórkach repopulujących stężenie topoizomerazy II jest znacząco wyższe niż w tkankach

prawidłowych .

linia komórkowa HCT116 posiada mutacje w genach K-RAS oraz PI3KCA, które kodują

białka stanowiące elementy ścieżek sygnałowych zależnych od EGFR . Mutacje te prowadzą

do konstytutywnej aktywności szlaków sygnałowych PI3K-AKT oraz RAS-RAF-ERK

niezależnie od EGFR. Ze względu na istniejące w piśmiennictwie dane podkreślające, że

przyczyną niepowodzenia terapii inhibitorami EGFR różnych typów nowotworów mogą być

właśnie powyżej wymienione mutacje linia HCT116 jest dobrym modelem do badań

związków, których mechanizm oparty jest o hamowanie aktywności EGFR . Linia DU145 nie

nosi powyżej wymienionych mutacji, co umożliwia porównanie działania pochodnych

genisteiny na komórki nowotworowe w zależności od statusu mutacji w tych genach.

67

Page 68: 6.11.14 doktorat_final-final

Dane z piśmiennictwa pokazują, że zastosowanie inhibitorów EGFR poprawia efekty

terapeutyczne w przypadku wielu typów nowotworów, jednak słabiej niż oczekiwano

w przypadku nowotworów gruczołu krokowego i jelita grubego . W statystykach

zachorowalności na nowotwory raki gruczołu krokowego i jelita grubego zajmują

odpowiednio drugą (u mężczyzn) i trzecią (ogólnie) pozycję na świecie. Wymienione typy

nowotworów cechują się wysoką radioopornością (Ghotra, et al., 2013).

Linie komórkowe HCT116 i DU145 cechują się zróżnicowaną radioopornością, co umożliwia

porównanie skutków działania testowanych pochodnych genisteiny w komórkach o różnym

stopniu promienioczułości. Dane literaturowe pokazują, że linia komórkowa HCT116 jest

linią radiowrażliwą w porównaniu do innych linii nowotworowych jelita grubego , podczas

gdy linia komórkowa DU145 wykazuje zwiększoną radiooporność

w porównaniu do innych linii nowotworowych gruczołu krokowego .

III.5. Warunki hodowli linii nowotworowych i przygotowanie komórek do doświadczeń

68

Page 69: 6.11.14 doktorat_final-final

Komórki hodowano w naczyniach przeznaczonych do hodowli komórkowych

adherentnych z modyfikowaną powierzchnią wzrostu (Nunclone ™Δ, Dania). Stosowano

naczynia o powierzchni 25 cm2 i 75 cm2. Pożywka wzrostowa zawierała RPMI 1640 (Roswell

Park Memorial Institute Medium 1640, Sigma, suplementowany NaHCO3 w stężeniu 2 mg/l),

10% płodową surowicę wołową (FBS, ICN Pharmaceuticals) oraz antybiotyk – gentamycynę

(KRKA, Novo Mesto, Slovenia) w stężeniu 1µl/ml. Komórki hodowano w inkubatorze (Heraeus,

KENDROMED), w którym utrzymywana była stała temperatura 37oC, stały poziom CO2 (5%)

oraz wysoka wilgotność (85%).

Komórki pasażowano po osiągnięciu przez nie 90% pokrycia powierzchni naczynia.

Po usunięciu zużytej pożywki wzrostowej komórki płukano 1-3 ml (w zależności od powierzchni

wzrostowej naczynia hodowlanego) 0.02% EDTA w 1x PBS pH 7.4 (137 mM NaCl; 2.7 mM

KCl; 8.1 mM NaH2PO4; 1.5 mM KH2PO4). EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy,

ang. ethylenediaminetetraacetic acid) kompleksuje jony wapnia ułatwiając odczepienie komórek

od podłoża. Po usunięciu roztworu EDTA w 1x PBS inkubowano komórki w temperaturze

37oC z roztworem trypsyny (0.05% trypsyny, 0.04% KCl, 0.8% NaCl, 0.035% NaHCO3,

0.1% glukozy) degradującej białka adherentne. W przypadku naczyń hodowlanych o powierzchni

25 cm2 stosowano 1 ml trypsyny, w przypadku 75 cm2 – 3 ml trypsyny. Po uzyskaniu zawiesiny

komórek trypsynę neutralizowano przez dodanie pożywki wzrostowej w stosunku objętościowym

– trypsyna : pożywka wzrostowa – 1:3 (3 i 9 ml dla naczyń o powierzchni odpowiednio

25 cm2 i 75 cm2). Zawarta w pożywce surowica hamowała aktywność enzymu chroniąc przed

degradacją inne białka komórkowe. Po usunięciu 4/5 objętości zawiesiny komórkowej

(która mogła być następnie użyta do doświadczeń), uzupełniano pozostałość świeżą pożywką

do końcowej objętości 4 ml i 12 ml pożywki wzrostowej dla naczyń o powierzchni odpowiednio

25 cm2 i 75 cm2 i prowadzono dalszą hodowlę w warunkach opisanych powyżej. Komórki obu

linii pasażowano co 2-3 dni.

69

Page 70: 6.11.14 doktorat_final-final

Uzyskaną w wyniku trypsynizacji zawiesinę komórek w ustalonej wcześniej objętości

przenoszono do odpowiednich naczyń hodowlanych (Nunclone ™Δ, Dania) o powierzchni

zależnej od zaprojektowanego doświadczenia (naczynia o średnicy 6 cm lub 6-dołkowe,

o średnicy 3 cm). Przed ekspozycją komórek na badane związki hodowano je przez dobę

w inkubatorze w celu umożliwienia im adhezji do podłoża. W celu określenia wyjściowej liczby

komórek wysiewanych na naczynia hodowlane używano komorę Bürkera lub licznik komórek

i cząsteczek (Beckman Coulter, Z1 Coulter Particle Counter). Liczbę komórek wysiewanych

na płytki dobierano w serii eksperymentów wstępnych, w ten sposób, aby badania prowadzone

były w porównywalnych warunkach (porównywalna gęstość komórek). Dokładna liczba komórek

wysiewana na naczynia hodowlane do konkretnych doświadczeń została podana w dalszej części

rozdziału.

III.6. Ekspozycja komórek nowotworowych na działanie promieniowania jonizującego

70

Page 71: 6.11.14 doktorat_final-final

Komórki nowotworowe używane do doświadczeń hodowano w pomieszczeniach

laboratoryjnych Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

(CBTiBMN) Centrum Onkologii, Oddział w Gliwicach. Komórki napromieniane były natomiast

w Zakładzie Radioterapii Centrum Onkologii, Oddział w Gliwicach za zgodą kierownika

prof. dr hab. n. med. Leszka Miszczyka. Przyspieszacz liniowy Clinac 600C/D firmy Varian,

wykorzystywany również w leczeniu pacjentów onkologicznych, uruchamiali technicy. Komórki

przenoszono w naczyniach hodowlanych w pojemnikach styropianowych do pomieszczeń

Zakładu Radioterapii. Nie otwieranie naczyń hodowlanych podczas ich transportu zapewniało

komórkom sterylność. Każdorazowo przed napromienianiem komórek wymieniano pożywkę

na świeżą, wprowadzając zawszę tę samą objętość pożywki do naczyń hodowlanych, w celu

zachowania jednakowych warunków doświadczalnych (wysokość pożywki nad komórkami).

Komórki poza inkubatorem znajdowały się do 20 minut. Czas ten potrzebny był na ich transport

oraz napromienienie (przyspieszacz liniowy dostarcza dawkę 1Gy/min). Pole napromieniania

wynosiło 30x30 cm, w polu tym mieściło się 20 płytek hodowlanych o średnicy 6 cm bądź

3 naczynia 6-dołkowe. Komórki po napromienianiu hodowane były w inkubatorze

w pomieszczeniach hodowli komórkowej CBTiBMN. Dawki promieniowania ustalono

w doświadczeniach wstępnych. Komórki nowotworowe poddawano działaniu promieniowania

jonizującego o energii fotonów równej 6 MV. Promieniowanie generowane było przez

przyspieszacz liniowy dostarczający 1 Gy/min. Wartość parametru SSD (odległość od źródła

napromieniania do punktu wejścia wiązki w napromieniany obszar) wynosiła 100.5 cm.

W doświadczeniach z wykorzystaniem linii HCT116 i DU145 stosowano dawki równe

1 Gy, 2 Gy oraz 4 Gy. Dawki absorbowane przez komórki miały wartość ekwiwalentną do dawek

mierzonych w warunkach dozymetrycznych.

III.7. Zastosowanie testu klonogenności w celu wyznaczenia wartości IC50 testowanych

związków i promieniowania jonizującego w programie CalcuSyn.

W eksperymentach poprzedzających badania niniejszej pracy przeprowadzone zostały

analizy metodą MTT umożliwiające wstępne określenie właściwości antyproliferacyjnych

kilkudziesięciu związków (serie stężeń w zakresie od 0.1 μM do 100 μM) oraz określenie stężeń

dla wybranych związków, w zakresie których mogły one uzyskać wartość IC50 w liniach

komórkowych HCT116 oraz DU145. Wartość IC50 określa takie stężenie związku, które powoduje

obniżenie mierzonego efektu, tu proliferacji komórkowej, o połowę. Dla potrzeb niniejszego

projektu jako metodę określenia wartości IC50 dla każdego ze związków

71

Page 72: 6.11.14 doktorat_final-final

oraz promieniowania jonizującego wybrano test klonogenności. W teście tym ocenia się zdolność

komórek do tworzenia klonów w zaprojektowanych warunkach doświadczalnych. Należy

przy tym zauważyć, że test klonogenności jest preferencyjnie stosowany przy ocenie wpływu

promieniowania użytego samodzielnie oraz w kombinacji z innymi czynnikami terapeutycznymi

na przeżycie komórek nowotworowych. Test klonogenności mierzy zdolność indywidualnej

komórki do nieskończonych podziałów i formowania kolonii złożonych z klonów komórek.

W nowotworach jest to krytyczny wskaźnik komórkowej żywotności, ponieważ jedynie komórki

klonogenne mają zdolność do wywoływania nawrotów oraz tworzenia przerzutów .

72

Page 73: 6.11.14 doktorat_final-final

Komórki DU145 oraz HCT116 wysiewano do naczyń hodowlanych 6-dołkowych o średnicy

dołka równej 3 cm (Nunclone ™Δ) w liczbie 500 komórek na dołek w 3 ml pożywki. Zawiesinę

komórek mieszano oraz pipetowano, dzięki czemu komórki nie tworzyły agregatów i przyczepiały

się do podłoża pojedynczo. Po dobie inkubacji w standardowych warunkach hodowlanych

pojedyncze komórki poddawano 24-godzinnej ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. W celu

wyznaczenia wartości IC50, czyli takiej wartości stężenia, dla której liczba klonów będzie

stanowiła połowę w odniesieniu do liczby klonów tworzonych przez komórki kontrolne

(nietraktowane) zastosowano 3 stężenia dla każdego związku wcześniej ustalone w teście MTT.

Stężenia te przedstawiono w poniższej tabeli (III-3). Ponadto w opisanym doświadczeniu

sprawdzano wpływ promieniowania jonizującego na badane linie komórkowe. Testowane dawki

promieniowania (IR, ang. irradiation) (1, 2, 4 Gy) wybrano na podstawie danych literaturowych

oraz wyników badań wstępnych. Komórki były eksponowane na IR w pożywce pozbawionej

testowanych związków. W czasie

24 godzinnej ekspozycji innych komórek (pozostałe warianty eksperymentalne) na wybrane

stężenia pochodnych, komórki przeznaczone do napromieniania hodowano w pożywce

pozbawionej tych związków. Komórki eksponowano na IR po 48 h od wysiania, po wymianie

pożywki na świeżą (w objętości 3 ml). Czas napromieniania wahał się w zależności od użytej

dawki IR od 1-4 minut (przyspieszacz Clinac 600C/D dostarcza 1 Gy/min).

Tabela III-7. Stężenia związków w μM oraz dawki promieniowania jonizującego (IR) w Gy użyte do wyznaczenia wartości IC50 w teście klonogenności oraz z pomocą programu CalcuSyn. Komórki były eksponowane na testowane związki w wymienionych stężeniach przez 24 h. Dla każdego stężenia wykonywano 2 powtórzenia techniczne w każdym eksperymencie.

IR Genisteina G21 RAM-2

RAM-3

RAM-5

RAM-C-3α

RAM-C-4α

RAM-C-5α

RAM-2’

RAM-3’

RAM-5’

1 25 2.5 10 5 2.5 12.5 3.75 10 2.5 12.5 5

2 50 5 20 10 5 25 7.5 20 5 25 10

4 100 10 40 20 10 50 15 40 10 50 20

73

Page 74: 6.11.14 doktorat_final-final

Po upływie czasu inkubacji z testowanym związkiem (lub po ekspozycji komórek na IR),

pożywkę wymieniano na świeżą i komórki hodowano 7-10 dni, do czasu powstania kolonii

o liczbie komórek powyżej 50. Następnie z płytek usuwano pożywkę, kolonie płukano 2-krotnie

1x PBS (2 ml) i utrwalano lodowatym metanolem (2 ml) przez 5 min. Wszystkie kolonie o liczbie

komórek powyżej 50-ciu zliczano, a następnie w programie CalcuSyn wyliczano wartości IC50

dla każdego z wariantów traktowania.

Program CalcuSyn (http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm) oparty na algorytmach

opracowanych przez Chou-Talalaya oraz odnośniki podane

w wymienionych pracach) pozwala na zdefiniowanie relacji pomiędzy określoną dawką/stężeniem

czynnika (D) a efektem biologicznym (równanie 1).

fa/fu = (D/Dm)m [Równanie 1]

fu (ang. fraction unaffected) – frakcja komórek nowotworowych, na które czynnik

nie zadziałał. Wartość tego parametru otrzymuje się poprzez przedstawienie danych

uzyskanych w teście klonogenności (liczba kolonii) w postaci wartości z zakresu (0;1).

W tym celu liczbę kolonii w każdym wariancie doświadczalnym należało odnieść do liczby

kolonii wyrosłych w wariancie kontrolnym (liczba kolonii w próbie / liczba kolonii

w kontroli);

fa (ang. fraction affected) – frakcja komórek nowotworowych dotkniętych działaniem

testowanego czynnika (związku bądź promieniowania jonizującego), fa = 1-fu;

D – dawka/stężenie zastosowanego czynnika (stężenie/dawka użyta w eksperymencie).

Wartość Dm w programie CalcuSyn odpowiada wartości IC50, zasadniczo w niniejszej pracy

można te symbole stosować zamiennie;

m – wykładnik potęgi wyznaczający kształt krzywej „efekt-dawka”, który jest determinowany

kątem nachylenia wykresu „mediana efektu”.

Równanie 1 można przekształcić w inną postać:

fa = 1/[1+ (Dm/D)m] [Równanie 2]

lub

Dx = Dm[fa/(1-fa)]1/m [Równanie 3]

74

Page 75: 6.11.14 doktorat_final-final

Z równania 2, przy założeniu ze znana jest wartość Dm (= IC50) oraz m, można wyznaczyć wartość

efektu (fa) dla dowolnej dawki (D). Z równania 3, o ile znane jest Dm oraz m, dla dowolnego

efektu (fa) można wyliczyć dawkę (Dx, dawka/stężenie czynnika, które wywołuje zahamowanie

obserwowanego efektu, tu obniżenie liczby klonów o x%). Korzystając z tych algorytmów

program dokonuje obliczeń, na podstawie których wykreśla wykresy przedstawione poniżej.

Na rycinie III.1A przedstawiono zależność efektu od dawki, a w podpunkcie B wykres mediana

efektu. Oba wykresy wykreślone zostały przez program CalcuSyn dla przykładowego czynnika

(factor1), dla którego znane były wartości zastosowanych dawek oraz osiągnięty efekt w zakresie

(0;1). Wykres mediana efektu jest wykresem x = log (D) od y = log (fa/fu) przedstawionym przez

Chou w 1976 roku. Bazuje na równaniu logarytmicznym (równanie 4):

log (fa/fu) = m log (D) – m log (Dm) [Równanie 4]

i ma formę linii prostej: y = mx+b.

Równocześnie program wylicza wartość Dm (IC50) z otrzymanego równania krzywej, jak również

stężeń dla innych efektów (0.02-0.99) (rycina III.2)

A.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-1.0

-0.5

0

0.5

1.0

log(D)

Median-effect plot

log(fa

/fu)

FACTOR1 B.

Rycina III.4. Obrazy wykresów otrzymane w programie CalcuSyn dla przykładowego czynnika terapeutycznego „factor1”. Na podstawie danych doświadczalnych (czerwone krzyżyki) program wykreśla zależność dawka-efekt (A) oraz wykres mediany efektu (B). Dose – dawka, Effect – efekt (podawany w zakresie 0-1).

75

0 1.0 2.0 3.0 4.00

0.20

0.40

0.60

0.80

Dose

Dose-effect curve

Effec

t

FACTOR1

Page 76: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina III.5. Przykład obliczeń wykonanych przez program CalcuSyn dla przykładowego czynnika „factor1” otrzymanych na podstawie 3 punktów doświadczalnych. Program umożliwia wyliczenie wartości Dm (IC50) oraz stężeń wywołujących inne efekty od 0.02-0.99 (rubryka „Dose”).

III.8. Ocena efektów kombinacji promienowania jonizującego z pochodnymi genisteiny

z wykorzystaniem programu CalcuSyn

76

Page 77: 6.11.14 doktorat_final-final

Program CalcuSyn, stosowany uprzednio w celu wyznaczenia wartości IC50 związków,

został ponownie użyty w celu wyznaczenia interakcji wynikających z zastosowania kombinacji

dwóch czynników: promieniowania jonizującego oraz testowanych związków chemicznych.

Celem łączenia różnych technik terapeutycznych jest zwiększenie efektów ich działania względem

komórek nowotworowych w stopniu większym niż wynikający z sumy tych efektów (otrzymanie

efektu synergistycznego). Doświadczenie prowadzono zgodnie z procedurą, jaką opisano

uprzednio dla terapii samodzielnych. Badanie te różniło się schematem traktowania komórek

nowotworowych, a mianowicie komórki wstępnie traktowano przez 24 godziny testowanym

związkiem, a następnie, po usunięciu zużytej pożywki i dodaniu świeżej (3 ml), komórki

napromieniano. Należy przy tym zauważyć, że najniższe wymienione w tabeli III-3 stężenie

każdego ze związków kombinowano z IR w dawce 1 Gy, stężenia pośrednie z IR w dawce 2 Gy,

natomiast stężenia najwyższe z IR w dawce 4 Gy. Podczas projektowania doświadczenia

kierowano się wytycznymi podawanymi w metodyce Chou-Talalaya, co umożliwiło wybranie

stężeń związków oraz dawek promieniowania tak, aby możliwe było wyznaczenie efektów

kombinacji. Zgodnie z zaleceniami Chou-Talalaya do analizy należy tak wybrać stężenia/dawki

czynników terapeutycznych, aby ich zakres obejmował wartość IC50. Ponadto w metodyce

tej zaleca się, aby zachować stały stosunek stężenia jednego czynnika do drugiego, aby możliwe

było wykreślenie przez program CalcuSyn symulacji Fa-CI.

Projektując doświadczenie określono dawki promieniowania jonizującego w ten sposób,

aby były możliwie najbardziej zbliżone do dawek stosowanych w radioterapii klinicznej,

ale również obejmowały IC50 wyznaczone dla linii komórkowych: ~ 2 Gy dla HCT116 i ~ 4 Gy

dla DU145 (aby możliwe było wykonanie analizy). Zatem arbitralnie ustalono dawki

promieniowania jonizującego dla obu linii na 1 Gy, 2 Gy oraz 4 Gy. Ujednolicenie dawek miało

umożliwić porównanie wyników pomiędzy liniami. Stężenia związków stosowanych

w kombinacji z promieniowaniem jonizującym pozostawały w stałym stosunku do dawek

promieniowania. W serii doświadczeń wstępnych wybrano zakres stężeń dla każdego

ze związków stosowanych w kombinacji z promieniowaniem jonizującym tak, aby żadne

z zastosowanych stężeń nie powodowało spadku liczebności klonów (ang. fraction afected fa)

do 0.

77

Page 78: 6.11.14 doktorat_final-final

Dzięki zastosowaniu programu CalcuSyn możliwe było określenie które ze związków

i w jakich stężeniach będą zwiększały przeciwnowotworowy efekt działania radioterapii w sposób

synergistyczny. Ocena synergistycznych efektów badanych pochodnych zastosowanych

w kombinacji z radioterapią miała na celu wyłonienie spośród testowanych pochodnych genisteiny

związków o właściwościach radiouczulających. Algorytm obliczeniowy zastosowany

w programie CalcuSyn oparty jest na prawie działania mas. Szczegółowy opis programu CalcuSyn

został przedstawiony w metodyce dołączonej do programu (CalcuSyn for Windows, Biosoft, pdf

oraz zawarte referencje).

Dzięki przekształceniom wzoru ogólnego (równanie 1, podrozdział, III.7) możliwe

jest wyprowadzenie równań dla efektu kombinacji czynników terapeutycznych. Nowy parametr:

współczynnik kombinacji (CI, ang. combination index) określa czy otrzymany efekt wynika

z sumowania efektów powstałych przez zastosowanie każdego z czynników samodzielnie

lub czy jest wyższy bądź niższy od niego. Współczynnik kombinacji obliczany jest matematycznie

jako suma ilorazów stężeń powodujących 50% zahamowanie wzrostu kolonii przez czynniki

zastosowane w skojarzeniu oraz pojedynczo (Równanie 5).

CI = (D)1 / (Dx)1 + (D)2 / (Dx)2 [Równanie 5]

(Dx)1 oraz (Dx)2 – stężenia dwóch różnych substancji prowadzące do zahamowania wzrostu

komórek o 50%, gdy stosowane oddzielnie (wartości te zostały uprzednio wyliczone

w programie CalcuSyn podczas określania wartości IC50 dla każdego ze związków);

(D)1 oraz (D)2 – stężenia dwóch różnych czynników stosowanych w kombinacji wywołujące

zahamowanie wzrostu komórek o 50%;

Można również zamiast IC50 zastosować jako punkt oceny inne wartości efektu,

jak na przykład IC75 lub IC90.

Korzystając z powyższego równania można wykreślić izobologramy, czyli wykresy

prezentujące graficznie synergizm, addytywizm lub antagonizm. Izobologramy wykreślone

dla kombinacji przykładowych czynników w programie CalcuSyn przedstawiono na rycinie III.3.

Na jednej z osi zaznaczona jest wartość stężenia pierwszego czynnika, przy którym obserwuje

się efekt 50% zahamowania wzrostu komórek, natomiast na drugiej osi – wartość stężenia

drugiego czynnika, dla którego obserwowano 50% efekt. Następnie punkty te łączone są linią

nazywaną izobolą (kolor czerwony). W ten sam sposób program wykreśla izobole odpowiadające

75% (linia zielona) i 90 % zahamowaniu proliferacji (linia niebieska).

78

Page 79: 6.11.14 doktorat_final-final

Dla dowolnej kombinacji stężeń dwóch czynników program określa następnie wartość

efektu i zaznacza go jako punkt na wykresie. Położenie tego punktu względem izoboli obrazuje

w przejrzysty sposób czy efekt jest synergistyczny czy antagonistyczny. Jeśli punkt leży

na izoboli, to mamy do czynienia z efektem addytywnym. Jeśli punkt przesunięty jest w lewo

od izoboli to efekt jest synergistyczny, jeżeli na prawo, to efekt jest antagonistyczny. Górny panel

na rycinie III.3 pokazuje przykładowy izobologram dla dwóch czynników, które działają

synergistycznie, natomiast dolny panel przedstawia izobologram dla czynników o działaniu

antagonistycznym. Dla zachowania przejrzystości, przy dużej ilości analizowanych wariantów

w programie CalcuSyn tworzone są tabele fa-CI bądź wykresy oparte na tych samych równaniach.

Na rycinie III.4 przedstawiono podsumowanie wyników, jakie program CalcuSyn wylicza

dla kombinacji dowolnych dwóch czynników.

79

Page 80: 6.11.14 doktorat_final-final

A.

0 20 40 600

3

6

9

12

FACTOR2

IsobologramFA

CTOR

1

ED50 ED75 ED90

0 2.0 4.0 6.0 8.00

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Dose

Dose-effect curve

Effec

t

FACTOR1+2 FACTOR1 FACTOR2

B.

0 10 20 30 40 500

20

40

60

80

100

FACTOR3

Isobologram

FACT

OR1

ED50 ED75 ED90

0 1.0 2.0 3.0 4.00

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Dose

Dose-effect curve

Effec

t

FACTOR1+3 FACTOR1 FACTOR3

Rycina III.6. Wykresy otrzymane w programie CalcuSyn. Program wykreśla izobole poprzez połączenie linią prostą punktów odpowiadających 50%, 75%, 90% zahamowania efektu przez dwa różne czynniki (dokładny opis w tekście powyżej). Jeśli kombinacja tych czynników pozwala na osiągnięcie wartości efektu znajdującego się na wykreślonej prostej, otrzymany efekt będzie addytywny. Jeśli wartość znajdzie się w polu poniżej prostej: synergistyczny, a powyżej: antagonistyczny. Dla porównania pokazano również wykresy dawka-efekt. A. Czynniki factor1 i factor2 pozwalają na otrzymanie efektów synergistycznych przy każdej wartości ED. B. Kombinacja factor1 z factor3 powoduje powstanie efektów antagonistycznych.

Rycina III.7. Tabela podsumowująca wyniki otrzymane w programie CalcuSyn dla dwóch przykładowych czynników factor1 oraz factor2. Wartości CI podawane są dla efektów ED50, ED75 oraz ED90. Wartość Dm (=IC50) określa stężenie czynnika/czynników wywołujące zahamowanie efektu o połowę. Wartość m stanowi wykładnik wyznaczający kształt krzywej efekt-dawka determinowany

80

Page 81: 6.11.14 doktorat_final-final

kątem nachylenia wykresu mediana efektu, wartość r to współczynnik dopasowania, który w przypadku kultur tkankowych powinien być wyższy od 0.9.

Współczynnik kombinacji równy 1 odpowiada efektowi addytywnemu, gdy jego wartość jest

mniejsza od jedności występuje synergizm, natomiast gdy większa – zachodzi antagonizm.

Dodatkowe podziały ze względu na wartość współczynnika kombinacji zestawiono w tabeli

III-4. Podział ten został zaproponowany przez Chou-Talalaya.

Tabela III-8. Zależność pomiędzy wartością współczynnika kombinacji CI a relacją wynikającą z zastosowania dwóch technik w kombinacji. Na podstawie metodyki dołączonej do programu (CalcuSyn for Windows, Biosoft, pdf oraz zawarte referencje).

Wartość współczynnika

kombinacji

Interakcja wynikająca z zastosowania kombinacji dwóch

technik

<0.1 bardzo silny synergizm

0.1-0.3 silny synergizm

0.3-0.7 synergizm

0.7-0.85 umiarkowany synergizm

0.85-0.90 słaby synergizm

0.90-1.10 prawie addytywizm

1.10-1.20 słaby antagonizm

1.20-1.45 umiarkowany antagonizm

1.45-3.3 antagonizm

3.3-10 silny antagonizm

>10 bardzo silny antagonizm

III.9. Ocena wpływu pochodnych genisteiny samodzielnie i w kombinacji

z IR na aktywność oraz poziom wybranych białek w metodzie „western blot”

Technika „western blot” została użyta w celu wykrycia poziomu białka oraz stopnia

fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz aktywności białek

stanowiących elementy szlaków sygnałowych zależnych od EGFR: AKT oraz ERK 1/2.

81

Page 82: 6.11.14 doktorat_final-final

III.9.1. Przygotowanie komórek do doświadczenia

Komórki wysiewano na naczynia hodowlane o średnicy 6 cm (Nunclone ™Δ, Dania)

w liczbie 25x104 i hodowano przez 24 godziny w standardowych warunkach w celu

umożliwienia im adhezji do podłoża. Po tym czasie usuwano starą pożywkę i wymieniano

ją na świeżą pozbawioną surowicy w celu zwiększenia poziomu fosforylacji EGFR

. Do pożywki dodawano określone stężenia związków, na które miały być eksponowane

komórki. Dla każdego związku wybrano stężenia, które spełniały poniżej założone warunki:

dla wszystkich pochodnych wybierano co najmniej 4 stężenia, w taki sposób,

aby w tym zakresie mieściły się wartości IC50 wyznaczone w teście klonogenności

dla obu testowanych linii. Stężenia te ujednolicono dla obu linii, aby możliwe było

porównanie efektów pomiędzy liniami;

ustalano zakres stosowanych stężeń w serii doświadczeń wstępnych w ten sposób,

aby możliwe było określenie stężenia, które wywołuje obniżenie fosforylacji receptora

o połowę, ale równocześnie aby zastosowane stężenia nie były wyższe od 4-krotności

IC50 ustalonego doświadczalnie w teście klonogenności. Ze względu na nieprzewidziane

wyniki doświadczeń dla pochodnej G21 (która nie dawała oczekiwanych efektów w linii

DU145) użyto stężeń znacznie przekraczających wartość równą 4-krotności IC50

(do 20 μM, co stanowi ok. 7x IC50 dla DU145 oraz ok. 16x IC50 dla HCT116);

dla trzech pochodnych (O-glikozydy postawione przy C7) zastosowano stężenia

nanomolarne (100 nM), ze względu na wyniki doświadczeń wstępnych oraz

przewidywane rezultaty. Doświadczenia wstępne pozwalały sądzić, że związki te mogą

wywoływać oczekiwany efekt hamujący fosforylację EGFR już w stężeniach

nanomolarnych;

w doświadczeniach, w których testowano wpływ pochodnych na poziom pAKT oraz

pERK 1/2 stosowano dwa stężenia związków, przy których obserwowano istotne

obniżenie fosforylacji EGFR, a w przypadku pochodnych niewywołujących inhibicji

aktywności EGFR wybierano stężenia najwyższe.

W ten sposób wybrano do doświadczeń stężenia związków przedstawione

w tabeli III-5. Stężenia używane do analizy poziomu fosforylacji AKT oraz ERK 1/2

(oraz w późniejszych doświadczeniach – aktywności TOPO II) wyróżniono w tabeli.

82

Page 83: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela III-9. Stężenia związków użyte w doświadczeniach „western blot”. Wyróżniono stężenia używane w analizie fosforylacji pAKT, pERK 1/2 (oraz TOPO II). Wszystkie podane poniżej stężenia związków stosowano w testach dotyczących analizy poziomu fosforylacji EGFR.

IR Genisteina G21 RAM-3

RAM-5

RAM-C-4α

RAM-C-5α

RAM-2’

RAM-3’

RAM-5’

5 0.1 0.1 0.1 - - - - -

10 1 1 1 3.75 5 1.25 6.25 2.5

1 25 5 5 5 7.5 10 2.5 12.5 5

2 50 10 10 10 15 20 5 25 10

4 100 20 20 20 30 40 10 50 20

83

Page 84: 6.11.14 doktorat_final-final

W doświadczeniach, w których sprawdzano zdolność pochodnych do obniżania

indukowanej IR aktywacji EGFR zastosowano dawki promieniowania bliskie IC50 dla każdej

z linii (2 Gy dla HCT116 oraz 4 Gy dla DU145). W doświadczeniach tych stosowano

sekwencyjnie wstępnie 24-godzinną inkubację komórek z pochodnymi genisteiny (pożywka

bez FBS w celu stymulacji aktywności EGFR), następnie pożywkę zastępowano świeżą

pozbawioną pochodnych (oraz nadal pozbawioną FBS) i komórki napromieniano

w warunkach opisanych powyżej. Białko izolowano z komórek po 24 godzinach

od napromieniania (24 h „recovery”).

Komórki tuż przed izolacją białka stymulowano przez 15 minut 50 ng/ml EGF

rozpuszczonym w 0.1% BSA dostarczanym w pożywce bez FBS. EGF jest ligandem dla

EGFR, a jego dodanie do pożywki zwiększa aktywację EGFR.

III.9.2. Przygotowanie lizatów komórkowych

Przed izolacją białka komórki pukano roztworem 1x PBS, co umożliwiało odpłukanie

niezwiązanego z EGFR liganda. W celu zahamowania procesów wewnątrzkomórkowych,

w tym przekazu sygnału zależnego od EGFR, komórki umieszczano na lodzie. Komórki

oddzielano mechanicznie od podłoża oraz izolowano białko z użyciem buforu lizującego

o składzie: 50 mM Tris pH 8.0; 120 mM NaCl; 0.5% NP40; 1:100 inhibitory

proteaz (CompleteTM Roche); 1:100 inhibitory fosfataz (Sigma); 1 mM PMSF. Komórki

zawieszone w buforze przenoszono do probówek dodatkowo rozbijając błony komórkowe

mechanicznie intensywnym pipetowaniem. Po 15 min inkubacji w temperaturze 4oC

z buforem lizującym próbki wirowano z prędkością 20 tys. g przez 15 min w temperaturze

4oC. Nadsącz z wyizolowanym białkiem przenoszono do nowych probówek. Po oznaczeniu

stężenia białka (opis poniżej, III.9.3) do próbki dodawano 3x bufor redukujący (150 mM Tris

pH 6.8; glicerol 30%; SDS 6%; błękit bromofenolowy 0.01%; β-merkaptoetanol 7.5%)

w objętości bufor: lizat komórkowy 1:2 oraz denaturowano w temperaturze 95oC przez

5 min (rozfałdowanie łańcuchów polipeptydowych białka). Tak przygotowane do analizy

próbki nie ulegały zniszczeniu przy wielokrotnym rozmrażaniu, przechowywane były

w temperaturze -70oC.

III.9.3. Oznaczenie stężenia białka

84

Page 85: 6.11.14 doktorat_final-final

W celu oznaczenia stężenia białka korzystano z odczynnika Bradforda (Bio-Rad).

1 µl białka wprowadzano do 1 ml roztworu sterylnej wody dejonizowanej i odczynnika

Bradforda w proporcji 4:1, a następnie spektrofotometrycznie sprawdzano absorbancję próbek

przy długości fali 595 nm. Do próby ślepej zamiast białka wprowadzano bufor do lizy.

Stężenie białka obliczano na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej według instrukcji

załączonej do odczynnika Bradforda przez producenta.

III.9.4. Frakcjonowanie elektroforetyczne białek w żelu poliakrylamidowym

W elektroforezie stosowano 1.5 mm rozdzielające żele poliakrylamidowe 8%, które

umożliwiały wykrycie wszystkich analizowanych w doświadczeniu białek EGFR (175 kDa),

pAKT (60 kDa) oraz pERK 1/2 (42-44 kDa). W doświadczeniu stosowano 5% żele

zagęszczające z 15 kieszonkami, do których wprowadzano odpowiednią objętość lizatu

komórkowego (do 20 μl), tak, aby w każdej kieszonce znajdowała się równa ilość białka.

W analizie używano 60 μg białka. Rozmrożone próbki w buforze redukującym nanoszono

do odpowiednich kieszonek w żelu zagęszczającym w kolejności ustalonej podczas

projektowania doświadczenia (w kolejności rosnących stężeń związków). Elektroforezę

przeprowadzano w buforze do elektroforezy (124 mM Tris; 959 mM glicyna; 17 mM SDS)

przy napięciu 80-100 V. Niższe napięcie stosowano podczas przechodzenia białka przez żel

zagęszczający, podczas gdy wyższe, kiedy białko znajdowało się w żelu rozdzielającym o

wyższej gęstości. Jako wzorca mas używano dostępnego komercyjnie zestawu peptydów SM-

6071 (Fermentas) zawierającego peptydy o masie 5-170 kDa.

85

Page 86: 6.11.14 doktorat_final-final

III.9.5. Immunodetekcja białek na błonie nitrocelulozowej bądź PVDF

Rozdzielone w żelu poliakrylamidowym białka przenoszono na błonę nitrocelulozową

(Whatman; bądź BA85 Schleicher & Schuell, Dassel) bądź PVDF (Thermo-Scientific)

o porach wielkości 0.4 µm. Polifluorek winylidenu (ang. polyvinylidene fluoride) ze względu

na wysoką hydrofobowość wymagał uprzedniego traktowania metanolem (30 sekund),

a następnie sterylną wodą dejonizowaną (1 minuta). Elektrotransfer przeprowadzano

w aparacie do transferu firmy Biorad (Mini-PROTEAN 3) w czasie 2 h 15 min przy natężeniu

prądu 370 mA w buforze do transferu (25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% metanol). Białka

ulegały przeniesieniu z żelu na membranę zgodnie z kierunkiem przepływającego prądu

(od anody do katody). Po zakończonym transferze każdorazowo sprawdzano efektywność

procesu wybarwiając blot odczynnikiem kowalencyjnie wiążącym się z białkami: ponceau

red (Sigma). Dzięki zastosowaniu wzorca mas białek możliwe było pocięcie blotu

w zależności od masy wykrywanych białek na fragmenty. Po odpłukaniu barwnika

(3x 10 min TTBS) przeprowadzano 45-minutowe blokowanie membrany w temperaturze

pokojowej 5% roztworem odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w TTBS

(150 mM NaCl; 1 mM Tris pH 7.4; 0.5% Tween20) na platformie rotacyjnej w celu

uniknięcia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną. Następnie błony

inkubowano w temperaturze 4oC przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze

5% odtłuszczonego mleka w TTBS lub BSA w zależności od zaleceń producenta. Do użytych

przeciwciał pierwszorzędowych należały przeciwciała wykrywające EGFR, pEGFR-Tyr1068,

pEGFR-Tyr1173, pAKT-Ser473, pERK 1/2-Thr202/Tyr204 oraz HSC70 bądź aktynę

(dwa ostatnie wymienione przeciwciała wykrywają białka będące kontrolą eksperymentu,

ang. loading control). Dokładny opis przeciwciał podano w tabeli III-2 (podrozdział III.3).

86

Page 87: 6.11.14 doktorat_final-final

Po zakończeniu inkubacji nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego w mleku

usuwano opłukując filtry w buforze TTBS (3x 15 min). W kolejnym etapie wprowadzano

przeciwciała drugorzędowe mysie bądź królicze skoniugowane z peroksydazą chrzanową

(Pierce) w proporcji 1:5000. Inkubacja trwała 1.5 godziny, następnie błony płukano TTBS

(3x 15 min). W celu uzyskania obrazu prążków bloty przenoszono do plastikowej folii

i nakładano roztwór substratu nadtlenku wodoru i luminolu (SuperSignal West Pico

Chemiluminescent Substrate) w stosunku objętościowym 1:1 (400 μl roztworu nakrapiano

na cały blot). Folię przenoszono do kasety do autoradiografii. W ciemni do folii przykładano

kliszę rentgenowską stosując ekspozycję od kilku sekund do 20 minut w zależności od siły

sygnału, a następnie kliszę wywoływano w automacie do klisz rentgenowskich.

III.9.6. Analiza densytometryczna

Klisze rentgenowskie skanowano bądź fotografowano, a otrzymane pliki

jpg analizowano w programie ImageJ (NIH, program pobrany ze strony

http://imagej.nih.gov/ij/, na podanej stronie internetowej znajduje się również opis metodyki

oraz zastosowania programu). Program umożliwia wykonanie pomiarów grubości prążków

uzyskanych metodą „western blot” na kliszach. Po zaznaczeniu pola pomiaru obejmującego

prążek program wykreśla densytogram, jak na rycinie III.5. Po usunięciu tła z obrazu

densytogramów (odcięcie tła jak na rycinie poniżej linią poziomą) możliwe jest użycie

narzędzia obliczającego pole pod wykresem wyrażające w sposób liczbowy grubość prążków

(okno „Results”, kolumna „Area”. Podana wartość określa liczbę zliczonych pikseli).

Po normalizacji względem białka będącego kontrolą eksperymentu (ang. loading control,

w badaniach niniejszych pracy HSC70 lub aktyna) możliwe jest odniesienie uzyskanych

wartości względem kontroli (komórki nietraktowane) oraz przedstawienie danych w postaci

procentowej na wykresach bądź w tabelach w programie Excel.

87

Page 88: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina III.8. Obraz densytogramu otrzymany dla przykładowego prążka wraz z wyznaczoną przez program wartością liczbową odpowiadającą polu pod wykresem („Results”) oraz obrazem blotu i sposobu zaznaczania pola pomiaru obejmującego prążek (po lewej).

III.10. Test „immunoband depletion”

88

Page 89: 6.11.14 doktorat_final-final

Test „immunoband depletion” zastosowano w celu sprawdzenia czy pochodne

genisteiny mogą mieć charakter „trucizny” topoizomerazy II. Test ten z technicznego punktu

widzenia jest wariantem metody „western blot” i pozwala na wykrycie kompleksów

topoizomerazy II z DNA powstających na skutek działania związku o charakterze „trucizny”.

Powstanie potrójnego kompleksu (ang. ternary complex) złożonego z wymienionych powyżej

komponentów (DNA/TOPO II/testowany związek) uniemożliwia zajście procesu ligacji,

a zatem łączenie przeciętych nici DNA, co może wywoływać powstawanie podwójnych

pęknięć w nici DNA (DSB, ang. double strand breaks) i śmierć komórek.

Komórki do doświadczenia wysiewano na naczynia hodowlane o średnicy

6 cm w liczbie 25x104. Po dobie inkubacji w standardowych warunkach hodowlanych

komórki poddawano 24-godzinnej ekspozycji na związki w dwóch stężeniach ustalonych

w poprzednich doświadczeniach (tabela III-5, stężenia zaznaczone na szaro, podrozdział

III.9.1). Dla każdego wariantu traktowania wykonywano dwa powtórzenia techniczne. W celu

wyizolowania białka na początku komórki trypsynizowano na płytkach 6 cm (procedura

zgodna z opisem znajdującym się powyżej, podrozdział III.5). Komórki płukano

0.8 ml EDTA, do trypsynizacji używano 0.8 ml trypsyny, a do neutralizacji tego enzymu

2.4 ml pożywki wzrostowej z FBS. Otrzymaną w ten sposób zawiesinę komórek w pożywce

(ok. 3.4 ml) przenoszono do probówek o pojemności 10 ml. W liczniku komórek określano

liczbę komórek w 1 ml zawiesiny. W tym celu do 9.9 ml izotonu w specjalnym naczyniu

wprowadzano 100 μM zawiesiny komórkowej i analizowano w liczniku płytek. Dla każdego

wariantu przeprowadzano co najmniej 3 zliczenia, otrzymane wartości uśredniano.

Do nowych probówek przenoszono objętość zawiesiny, w której znajdowało

się 25x104 komórek, a następnie komórki wirowano przez 2-4 min przy prędkości 1.5 tys.

rpm. Znad peletki komórek usuwano pożywkę, komórki płukano 1x PBS, wirowano

jak uprzednio, usuwano 1x PBS, a następnie przenoszono komórki na lód. Na lodzie

izolowano białko używając 400 μl buforu lizującego o składzie: 50 mM Tris/HCl, pH 6.8,

15% sacharoza, 12 mM EDTA, 3% SDS, 10% β-merkaptoetanol, 1:100 inhibitory proteaz

(CompleteTM Roche) oraz 0.01% błękit bromofenolowy. Lizaty komórkowe denaturowano

w temperaturze 95oC przez 5 minut, a następnie w celu pozbycia się pęcherzyków powietrza

łagodnie wirowano. Mieszaninę homogenizowano używając strzykawek z igłami

insulinowymi 31G 0.25 x 5 mm (BD). Wyizolowane białko przechowywano w temperaturze -

70oC. Do kieszonek w żelu zagęszczającym wprowadzano 40 μl tak przygotowanego lizatu

komórkowego.89

Page 90: 6.11.14 doktorat_final-final

Elektroforetyczne frakcjonowanie białek w żelu akrylamidowym przeprowadzano jak

w procedurze opisanej uprzednio (podrozdział III.9.4) z tą różnicą, że stosowano żele

rozdzielające 6.5% ze względu na dużą masę molekularną topoizomerazy II (180 kDa). Żele

te posiadały większe kieszonki niż w poprzednich doświadczeniach, w liczbie 10-ciu,

co umożliwiało wprowadzenie większej objętości lizatu (40 μl). Topoizomeraza II

kowalencyjnie połączona z DNA (w kompleksie z testowanym związkiem) nie migrowała

w żelu (kompleksy potrójne pozostawały w kieszonkach żelu zagęszczającego). Zwiększenie

frakcji związanej z DNA wywołane działaniem „trucizny” skutkowało uszczupleniem frakcji

topoizomerazy niezwiązanej (aktywnej), czyli wykrywanej w żelu. Obniżenie zawartości

topoizomerazy niezwiązanej wyrażało się obniżeniem grubości wykrywanego prążka

w warunkach, w których obecna była „trucizna” w porównaniu do kontroli. Metodyka

transferu białka, immunodetekcji oraz analizy densytometrycznej była identyczna jak opisana

dla pozostałych wykrywanych białek (podrozdział III.9.5-6). Do przeciwciał zastosowanych

w eksperymencie należały przeciwciała wykrywające ludzką topoizomerazę II α, II β oraz

białko HSC70 (kontrola eksperymentu, ang. loading control) oraz przeciwciało drugorzędowe

anty-mysie skoniugowane z HRP. Szczegółowy opis przeciwciał przedstawiono w tabeli

III-2, podrozdział III.3.

III.11. Skład buforów, roztworów, żeli stosowanych w doświadczeniach

Pożywka hodowlana RPMI 1640 (z dodatkiem 2 mg/l NaHCO3), 10% FBS, 1μl/ml gentamycyna

Trypsyna 0.05% trypsyna, 0.04% KCl, 0.8% NaCl, 0.035% NaHCO3, 0.1% glukoza

Roztwór EDTA 0.02% EDTA, 1x PBS1x PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM NaH2PO4, 1.5 mM KH2PO4

bufor lizujący 50 mM Tris pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.5% NP40, 1:100 inhibitory proteaz (CompleteTM Roche), 1:100 inhibitory fosfataz (Sigma), 1 mM PMSF

bufor lizujący umożliwiający wykrycie TOPO II

50 mM Tris/HCl pH 6.8, 15% sacharoza, 12 mM EDTA, 3% SDS, 10% β-merkaptoetanol, 1:100 inhibitory proteaz (CompleteTM Roche) oraz 0.01% błękit bromofenolowy

bufor 3x redukujący 150 mM Tris pH 6.8, 30% glicerol, 6% SDS, 0.01% błękit bromofenolowy, 7.5% β-merkaptoetanol

10x bufor do elektroforezy 124 mM Tris, 959 mM glicyna, 17 mM SDSbufor do transferu 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% metanolżel 6.5%-8% rozdzielający 375 mM Tris pH 8.8, 6.5-8% akrylamid. 0.1% SDS, 0.1% APS, 1µl/ml

TEMED, woda

90

Page 91: 6.11.14 doktorat_final-final

żel 5% zagęszczający 125 mM Tris pH 6.8, 5% akrylamid, 0.1% SDS, 0.1% APS, 1µl/ml TEMED,

TTBS 150 mM NaCl, 1 mM Tris pH 7.4, 0.5% Tween20

91

Page 92: 6.11.14 doktorat_final-final

IV. WYNIKI

W niniejszej pracy doktorskiej badaniami przesiewowymi objęto 10 pochodnych

genisteiny zsyntetyzowanych w zespole prof. Wiesława Szeji (tabela III-1 w rozdziale

„Materiały i Metody” oraz tabela IV-1). Modyfikacja cząsteczki genisteiny polegała

na wprowadzeniu podstawników przy węglu C-7 oraz C-4’. Podstawnikami były reszty

cukrowe ramnalowe bądź laktalowe związane z aglikonem wiązaniem O–glikozydowym

lub C–glikozydowym. Pochodne genisteiny, które poddano badaniom biologicznym

w niniejszej pracy doktorskiej można zaklasyfikować do czterech grup:

Grupa I, to glikozydy genisteiny, w których reszta cukrowa połączona jest z

aglikonem w pozycji C-7. Ta grupa reprezentowana jest przez pochodną o nazwie G21.

Pochodna G21 traktowana jest w niniejszej pracy jako związek referencyjny, wybrany

na podstawie wcześniejszych badań (Rusin et al., 2009; Gogler-Pigłowska et al., 2012).

G21 w początkowych badaniach zaklasyfikowano jako strukturę wiodącą, która

mogłaby zostać wykorzystana do nowych syntez chemicznych (Gogler-Pigłowska et al.,

2012).

Grupa II to glikokoniugaty podstawione w pozycji C-7, w których reszta cukrowa jest

oddalona od cząsteczki genisteiny poprzez alkilowy łańcuch, przy czym reszta cukrowa

połączona jest z łącznikiem wiązaniem O-glikozydowym. W tej grupie znajdują

się badane pochodne o nazwie RAM-2, RAM-3 i RAM-5.

Grupa III to analogi omówionych uprzednio O-glikokoniugatów podstawione w

pozycji C-7, w których reszta cukrowa połączona jest z łącznikiem alkilowym poprzez

wiązanie C-glikozydowe. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-

C-3α, RAM-C-4α i RAM-C-5α. Zastąpienie wiązania O-glikozydowego, potencjalnie

wrażliwego na hydrolizę enzymatyczną, wiązaniem C-glikozydowym miało na celu

zwiększenie stabilności pochodnych w komórkach i/lub krwioobiegu.

Grupa IV to glikokoniugaty genisteiny, w których reszta cukrowa połączona

z łącznikiem alkilowym wiązaniem O-glikozydowym podstawiona jest w pozycji C-4’

genisteiny. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-2’, RAM-3’

i RAM-5’.

Szczegółowa charakterystyka związków wraz z ich pełnymi nazwami chemicznymi znajduje

się w rozdziale „Materiały i Metody” (tabela III-1, podrozdział III.1). Przyczyny, dla których

badano konkretne pochodne cukrowe genisteiny będą dyskutowane w rozdziale V.

92

Page 93: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela IV-10. Wykaz związków chemicznych testowanych w niniejszej pracy.

Nazwa związku Wzór strukturalny

Związek macierzysty - GENISTEINA

Związki z wiązaniem O-glikozydowym podstawione przy węglu C-7

Związki z wiązaniem C-glikozydowym podstawione przy węglu C-7

Związki z wiązaniem O-glikozydowym podstawione przy węglu C-4’

Doświadczenia prowadzono na komórkach dwóch linii nowotworowych: raka

gruczołu krokowego (linia DU145) oraz raka jelita grubego (linia HCT116) pochodzących

z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) utrzymywanych w banku

komórkowym Centrum Onkologii. Szczegółowe informacje na ten temat linii komórkowych

93

G21

RAM-2

RAM-3 RAM-5

RAM-C-5α

RAM-C-3α RAM-C-4α

RAM-5’

RAM-3’RAM-2’

Page 94: 6.11.14 doktorat_final-final

oraz przyczyn, dla których zostały wybrane do badań przedstawiono w rozdziale „Materiały

i Metody” (podrozdział III.4).

IV.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny

oraz promieniowania jonizującego

Właściwości cytotoksyczne pochodnych genisteiny oraz ich wpływ na wrażliwość

komórek nowotworowych na promieniowanie jonizujące badano stosując test klonogenności.

Test ten umożliwia oszacowanie odsetka komórek zdolnych do nieograniczonej proliferacji

i jest preferencyjnie stosowany w badaniach wpływu promieniowania jonizującego

na potencjał klonogenny komórek nowotworowych. W celu wykonania badania komórki

wysiewano na naczynia hodowlane 6-dołkowe (Nunclone ™Δ, powierzchnia 9.6 cm2)

w liczbie 750 na dołek. Po 24 godzinach do pożywki wprowadzano badane związki i komórki

hodowano w ich obecności przez dobę. Następnie pożywkę wymieniano na prawidłową

i przez 7-10 dni prowadzono dalszą hodowlę w celu uwidocznienia liczby kolonii powstałych

z pojedynczych komórek, opornych na działanie badanych pochodnych genisteiny. Stężenia

badanych związków dobrano w serii doświadczeń wstępnych, a szczegółową metodykę

przedstawiono w rozdziale „Materiały i metody” (podrozdział III.7).

W teście klonogenności wyznaczano wartość IC50, która odpowiada stężeniu substancji

(lub dawce promieniowania jonizującego), dla którego obserwuje się zahamowanie wzrostu

50% kolonii komórek, w porównaniu do nietraktowanych komórek kontrolnych.

Wyznaczając wartość IC50 posługiwano się programem CalcuSyn, który dokonuje

dopasowania krzywej teoretycznej do punktów doświadczalnych. Szczegółowy opis zasad

stosowania wymienionego programu zamieszczono w rozdziale „Materiały i metody”.

Wartości IC50 dla każdego związku oraz promieniowania jonizującego przedstawiono

w tabeli IV-2.

Otrzymane dane pokazały, że 8 spośród 10 badanych pochodnych genisteiny

wywoływało znacząco silniejsze działanie cytotoksyczne niż związek macierzysty, genisteina.

Równocześnie żaden z badanych związków nie obniżał potencjału klonogennego komórek

silniej niż referencyjna pochodna G21. Ogólnie, komórki HCT116 były bardziej wrażliwe

na działanie badanych pochodnych i jedynie związki RAM-C-4α i RAM-C-5α wykazywały

silniejszy (RAM-C-4α) lub zbliżony (RAM-C-5α) efekt cytotoksyczny w stosunku

do komórek DU145.

94

Page 95: 6.11.14 doktorat_final-final

W przypadku linii HCT116 najsilniej ograniczającymi potencjał klonogenny komórek

były dwie pochodne, a mianowicie RAM-3 (IC50 = 2.63 ± 1.52) oraz RAM-2’

(IC50 = 3.32 ± 0.88). W przypadku komórek DU145 najsilniej cytotoksycznie działała

pochodna RAM-C4α (IC50 = 3.82 ± 1.00). Na podstawie przedstawionych powyżej wyników

do dalszych badań wybrano 8 związków, dla których IC50 było istotnie niższe

niż dla genisteiny. Związki wyeliminowane z dalszych analiz to RAM-2 i RAM-C-3α.

Tabela IV-11. Wartości IC50 [µM] wraz z odchyleniami standardowymi wyznaczone w teście klonogenności dla genisteiny oraz jej pochodnych, na które eksponowane były komórki linii nowotworowych jelita grubego HCT116 oraz gruczołu krokowego DU145. Komórki inkubowano z pochodnymi przez 24 h. Wartości obliczone zostały na podstawie danych uzyskanych z przynajmniej 3 niezależnych eksperymentów. Na czerwono zaznaczono pochodną o najniższej wartości IC50. Czcionką pogrubioną zaznaczono wartości IC50 niższe od 5 μM, czyli, zgodnie z danymi literaturowymi, możliwe do osiągnięcia w ustroju (Duffy et al., 2007).

Oddzielnie

wykonano

doświadczenie, w którym wyznaczono wartości IC50

dla komórek poddanych działaniu promieniowania jonizującego. Wartość IC50 dla komórek

HCT116 i DU145 wyniosła odpowiednio 1.97 ± 0.39 Gy oraz 3.30 ± 0.65 Gy. Zatem większą

radiowrażliwością cechowała się linia nowotworowa ludzkiego raka jelita grubego,

zaś obniżenie potencjału klonogennego komórek ludzkiego raka gruczołu krokowego

o połowę wymagało zastosowania dwukrotnie większej dawki promieniowania jonizującego.

IV.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym

W celu określenia czy badane pochodne genisteiny wykazują zdolność do zwiększania

cytotoksycznego efektu promieniowania jonizującego zastosowano test klonogenności. 95

Badany związekIC50

(komórki HCT116)IC50

(komórki DU145)

GENISTEINA 31.3 ± 5.5 35.0 ± 8.8

G21 1.2 ± 0.3 3.0 ± 0.3

RAM-2 27.0 ± 8.2 43.8 ± 23.0

RAM-3 2.6 ± 1.5 11.0 ± 6.0

RAM-5 5.9 ± 0.1 11.0 ± 2.0

RAM-C-3α 19.4 ± 1.6 39.1 ± 4.4

RAM-C-4α 6.5 ± 0.8 3.8 ± 1.0

RAM-C-5α 12.5 ± 3.2 11.5 ± 4.3

RAM-2' 3.3 ± 0.9 5.1 ± 0.5

RAM-3' 13.2 ± 1.0 18.9 ± 5.1

RAM-5' 7.00 ± 0.1 6.7 ± 0.8

Page 96: 6.11.14 doktorat_final-final

Porównano też zdolność hamowania wzrostu komórek HCT116 i DU145 przez

promieniowanie jonizujące oraz badane związki pojedynczo z efektem antyproliferacyjnym

powstałym po zastosowaniu kombinacji obu czynników. Eksperyment zaprojektowano

w następujący sposób: komórki inkubowano wstępnie przez dobę z badanymi substancjami,

następnie poddawano je działaniu promieniowania jonizującego. Hodowlę prowadzono przez

kolejne 7-10 dni i po tym czasie zliczano wyrosłe kolonie komórek.

 W doświadczeniach zastosowano stężenia/dawki czynników terapeutycznych dobrane

w serii eksperymentów wstępnych w ten sposób, aby możliwe było określenie efektów

kombinacji dwóch zastosowanych czynników (promieniowanie jonizujące oraz badany

związek chemiczny). Oznacza to, że zastosowane stężenia zmieniały się w sposób

proporcjonalny do zastosowanych dawek IR wybranych arbitralnie: 1, 2 oraz 4 Gy.

Zachowanie stałego współczynnika proporcjonalności umożliwia wyznaczenie wartości

Dm (stężenie czynnika terapeutycznego, które powoduje zahamowanie potencjału

klonogennego o połowę) oraz symulacji Fa-CI (Fa, ang. fraction affected;

CI, ang. combination index) w programie CalcuSyn. Według metodyki Chou-Talalaya

do doświadczeń należy wybierać tak stężenia/dawki badanych czynników terapeutycznych,

aby obejmowały wartość IC50 wyznaczoną uprzednio w programie. Z tego powodu wartości

dawek promieniowania jonizującego obejmowały IC50 wyznaczone dla tego czynnika

(i innych) dla każdej z linii komórkowych (2 Gy dla HCT116 oraz 4 Gy DU145) oraz zostały

ujednolicone dla obu linii w celu porównania efektywności działania związków pomiędzy

liniami. Co więcej, kombinacje stężenie związku/dawka promieniowania jonizującego zostały

dobrane tak, aby w przypadku kombinacji dawki promieniowania 4 Gy (najwyższa użyta

dawka) z najwyższym stężeniem badanego związku frakcja komórek przeżywających

(tworzących kolonie) była większa od 0. Dokładny opis metodyki znajduje się w rozdziale

„Materiały i Metody” (podrozdział III.8). Wyniki testu klonogennego obrazujące odsetek

przeżywających komórek w odniesieniu do komórek nietraktowanych (kontrolnych)

zamieszczono na rycinach IV.1 (komórki HCT116) oraz IV.2 (komórki DU145).

Przedstawione wyniki pokazują, że połączone działanie badanych związków

i promieniowania jonizującego wywoływało silniejszy efekt cytotoksyczny, niż kiedy

komórki eksponowane były na działanie każdego z czynników (IR lub badany związek)

oddzielnie. Jeżeli, oceniając wyniki przeprowadzonego doświadczenia, odrzuci się wartości

uzyskane w wyniku ekspozycji komórek na największą dawkę promieniowania i najwyższe

zastosowanie stężenie badanego związku (wartości skrajne), to w przypadku komórek 96

Page 97: 6.11.14 doktorat_final-final

HCT116 najsilniejszy efekt cytotoksyczny obserwowano dla kombinacji RAM-5

w stężeniach 2.5 oraz 5 μM z dawką IR odpowiednio 1 Gy lub 2 Gy.

Dla wszystkich pozostałych związków obserwowano poprawę efektu cytotoksycznego

kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii, jednak w stopniu słabszym niż dla RAM-5.

Najsłabszy efekt cytotoksyczny występował w przypadku pochodnej RAM-5’ stosowanej

w kombinacji z promieniowaniem. Należy zaznaczyć, że dla pochodnych RAM-5

i RAM-C-4α w kombinacji z promieniowaniem efekt cytotoksyczny występował już przy

stężeniach zbliżonych do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt

występował dla stężeń przekraczających wartość IC50.

Rycina IV.9. Przeżycie klonogenne komórek linii HCT116 po ekspozycji na genisteinę lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze osiągnięte efekty kombinacji.

97

Page 98: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina IV.10. Przeżycie klonogenne komórek linii DU145 po ekspozycji na genisteinę lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze osiągnięte efekty kombinacji.

W przypadku komórek DU145 najsilniejszy kombinowany efekt cytotoksyczny

obserwowano dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ oraz, przeciwnie niż w komórkach

HCT116, RAM-5’. Dla pozostałych związków poza G21 oraz RAM-C-5α obserwowano

poprawę efektu cytotoksycznego kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii. Należy

zaznaczyć, że w przypadku pochodnych RAM-5 i RAM-2’ kombinowany efekt

cytotoksyczny występował już dla stężeń zbliżonych do wartości IC50 i niższych, natomiast

dla pozostałych efekt występował dla stężeń przekraczających tę wartość.

Z porównania danych przedstawionych na rycinach IV.1 i IV.2 wynika,

że w badanych warunkach jedynie pochodne RAM-5 i RAM-3’ wykazywały silny

kombinowany efekt cytotoksyczny zarówno wobec komórek HCT116 jak i komórek DU145,

98

Page 99: 6.11.14 doktorat_final-final

przy czym jedynie pochodna RAM-5 wykazywała kombinowany efekt toksyczny

przy stężeniach zbliżonych lub niższych niż wartość IC50. Należy zauważyć, że powyższe

dane zaznaczają jedynie tendencję osiąganych efektów, dlatego niezbędne było

przeprowadzenie analizy uzyskanych wyników w programie CalcuSyn.

W celu określenia jaki charakter (działanie addytywne lub synergistyczne) ma efekt

łączenia działania promieniowania jonizującego z pochodnymi genisteiny wyznaczono indeks

kombinacji metodą Chou-Talalaya korzystając z programu CalcuSyn. Metoda Chou-Talalaya

jest rutynowo stosowana w ocenie efektu współdziałania substancji cytotoksycznych,

a szczegóły metodyczne podane są w rozdziale „Materiały i metody” (podrozdział III.8).

Wartości indeksu kombinacji (CI) pozwalają określić rodzaj efektu kombinacji, i tak:

wartości CI powyżej 1.1 oznaczają antagonizm,

CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza efekt addytywny,

CI w zakresie 0.7-0.9 wskazuje na słaby synergizm,

wartości CI poniżej 0.7 wskazują na istnienie synergizmu.

Wartości CI wyznaczane są w programie CalcuSyn dla poszczególnych efektów ED50,

ED75, ED90, czyli dla efektu wywołującego obniżenie potencjału klonogennego o kolejno

50%, 75% oraz 90%. Wyniki analizy efektu kombinacji dla komórek HCT116 przedstawiono

w Tabeli IV-3, a dla komórek DU145 w Tabeli IV-4.

Tabela IV-12. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50, ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii HCT116. CI określa rodzaj interakcji pomiędzy różnymi terapiami: CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza addytywność, CI > 1.1 antagonizm; CI = 0.9-0.7 słaby synergizm; CI < 0.7 synergizm. W tabeli przedstawiono średnie z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów wraz z odchyleniami standardowymi. Kolorem czerwonym zaznaczono wartości wskazujące na synergizm, natomiast kolorem czarnym wartości wskazujące umiarkowany efekt synergistyczny.

HCT116 CI ED50 ED75 ED90

GENISTEINA 1.4 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1

G21 0.7 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.18

RAM-3 1.0 ± 0.6 0.9 ± 0.5 0.8 ± 0.5

RAM-5 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.5 ± 0.2

RAM-C-4α 1.2 ± 0.04 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1

RAM-C-5α 1.2 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1

RAM-2' 1.1 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2

RAM-3' 1.2 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1

RAM-5' 1.5 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1

99

Page 100: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela IV-13. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50, ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii DU145. Wartość indeksu kombinacji określa rodzaj interakcji pomiędzy różnymi terapiami: CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza addytywność, CI > 1.1 antagonizm. Wartości CI w zakresie 0.9-0.7 oznaczają słaby synergizm, podczas gdy wartości CI < 0.7 synergizm. W tabeli przedstawiono dane uzyskane na podstawie obliczeń w programie CalcuSyn wraz z odchyleniami standardowymi. Wartości policzone na podstawie danych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kolorem zielonym zaznaczono wartości wskazujące na silny synergizm, kolorem czerwonym synergizm.

DU145 CI ED50 ED75 ED90

GENISTEINA 1.2 ± 0.5 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.3

G21 1.1 ± 0.2 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.3

RAM-3 1.0 ± 0.5 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1

RAM-5 0.7 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.0

RAM-C-4α 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.3

RAM-C-5α 0.9 ± 0.2 0.6 ± 0.3 0.5 ± 0.3

RAM-2' 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.0

RAM-3' 0.9 ± 0.3 0.3 ± 0.1 0.5 ± 0.1

RAM-5' 1.1 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1

Wartości indeksu kombinacji przedstawione w poniższych tabelach pokazują,

że synergistyczne, cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego i badanych

związków częściej występowało w odniesieniu do komórek raka gruczołu krokowego DU145

niż komórek raka jelita grubego HCT116.

W przypadku komórek DU145 synergizm występował dla większości badanych

związków (wyjątkiem była genisteina i pochodna G21) przy wartościach dawki efektywnej

ED75 i ED90. Dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ i RAM-5’ synergizm można

określić jako silny – wartości indeksu kombinacji CI w zakresie od 0.15 (przy ED90)

dla RAM-3’ do 0.36 (przy ED50) dla RAM-5.

Należy zauważyć, że w linii HCT116 (ale nie w DU145) zastosowanie kombinacji

testowanych związków z promieniowaniem jonizującym w większości przypadków

powodowało powstawanie antagonizmu przy ED50. Trzeba tutaj podkreślić,

że, w przeciwieństwie to powyższej tendencji, dwie pochodne, RAM-5 oraz G21, w niskich

stężeniach nie działały antagonistycznie w kombinacji z niskimi dawkami promieniowania,

ale powodowały powstawanie efektów addytywnych bądź słabo synergistycznych. Wartości

CI wskazujące na występowanie silnego synergizmu zaznaczone są w tabeli IV-4 kolorem

zielonym. Podkreślenia wymaga, że znaczący efekt synergistyczny obserwowano także

przy ED50 dla pochodnych RAM-2’ (CI = 0.5) i RAM-5 (CI = 0.7) w linii DU145.

100

Page 101: 6.11.14 doktorat_final-final

Wyniki badania cytotoksycznego efektu, jaki wywierały łącznie badane związki

i promieniowanie jonizujące na komórki HCT116 i DU145 można podsumować następująco:

pochodne genisteiny znacząco silniej wzmagają cytotoksyczny efekt promieniowania

jonizującego niż związek macierzysty, genisteina;

w stosunku do komórek DU145, o których wiadomo, że są bardziej radio-

i chemooporne niż komórki HCT116, działanie cytotoksyczne pochodnych genisteiny

w połączeniu z promieniowaniem jonizującym jest bardziej efektywne niż w odniesieniu

do komórek HCT116;

spośród badanych pochodnych genisteiny związki o najsilniej wyrażonej właściwości

radiouczulającej (najniższy wskaźnik CI przy jednoczesnej najwyższym efekcie)

to dla komórek DU145: RAM-5, RAM-2', RAM-3', RAM-5'; a dla komórek HCT116:

G21, RAM-5;

spośród badanych związków jeden, a mianowicie RAM-5, wykazuje znaczący efekt

radiouczulający wobec komórek obu badanych linii.

IV.3. Hamowanie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR przez

genisteinę i jej pochodne

Radiooporność w wielu typach nowotworów związana jest z nadmierną aktywnością

czynników wzrostu, w tym EGFR, stąd w leczeniu nowotworów często stosowane

są w kombinacji z radioterapią substancje o właściwościach inhibitorów receptora

naskórkowego czynnika wzrostu. Równocześnie genisteina jest znanym inhibitorem EGFR.

Wyniki wstępnych badań O-glikozydowych pochodnych genisteiny wskazywały, że G21 oraz

RAM-3 mogą zwiększać antyproliferacyjne efekty działania promieniowania jonizującego

(Gruca, 2009, praca magisterska). W niniejszej pracy doktorskiej objęto badaniami szereg

innych cukrowych pochodnych genisteiny, dla których obserwowano właściwości

antyproliferacyjne w testach MTT.

Badania wstępne (Gruca, 2009, praca magisterska, także wyniki niepublikowane)

wskazywały, że niektóre glikozydowe pochodne genisteiny mogą hamować, w stopniu

znacznie bardziej nasilonym niż genisteina, aktywność kinaz tyrozynowych, w tym kinazy

będącej przedmiotem badań niniejszej pracy doktorskiej, a mianowicie receptora

naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR. Ponieważ najważniejszym mechanizmem

aktywującym tę kinazę, jest spowodowana jej oddziaływaniem z ligandem autofosforylacja,

zatem kolejnym etapem pracy doktorskiej było zbadanie czy i w jakim stopniu pochodne

101

Page 102: 6.11.14 doktorat_final-final

genisteiny mogą blokować fosforylację EGFR. W badaniach niniejszej pracy analizowano

fosforylację EGFR przy resztach tyrozynowych 1068 i 1173. Przyczyny wyboru tych miejsc

fosforylacji w cząsteczce EGFR zostały szczegółowo opisane w rozdziale „Wstęp”

(podrozdział I.2.3).

W celu zwiększenia odpowiedzi komórek na EGF (ligand dla EGFR) komórki

HCT116 oraz DU145 w czasie ekspozycji na testowane pochodne genisteiny hodowano

w pożywce pozbawionej surowicy. W celu stymulacji aktywności EGFR (zwiększania

stopnia autofosforylacji) komórki inkubowano z EGF przez 15 minut. Następnie komórki

poddawano działaniu buforu lizującego, izolowano białka i frakcjonowano w warunkach

denaturujących w żelu poliakrylamidowym. Po przeniesieniu białek na błonę nitrocelulozową

lub błonę PVDF formy EGFR fosforylowane przy tyrozynie 1068 i 1173 wykrywano

za pomocą swoistych przeciwciał. Jako drugorzędowe przeciwciało zastosowano przeciwciało

skoniugowane z peroksydazą chrzanową (HRP). Szczegółowy opis zastosowanej procedury

immunodetekcji znajduje się w rozdziale „Materiały i metody” (podrozdział III.9.5).

Wpływ badanych pochodnych genisteiny na fosforylację EGFR oceniano stosując

kilka wybranych stężeń każdego związku (sposób doboru stężeń przedstawiono w rozdziale

„Materiały i Metody”, podrozdział III.9.1, tabela III-5).

Zawartość aktywnej formy EGFR (fosforylowanej przy tyrozynie 1068 lub 1173)

wyrażona była intensywnością sygnału prążków elektroforetycznych, uwidocznionych

na kliszach rentgenowskich. Na rycinie IV.3 pokazano przykładowe wyniki analizy

obrazujące: brak istotnego wpływu badanego związku na poziom fosforylacji EGFR (panel

górny), oceniany arbitralnie, jako wpływ pośredni (panel środkowy), oraz silny efekt

blokujący fosforylację (panel dolny).

Wszystkie otrzymane obrazy poddano analizie densytometrycznej z zastosowaniem

programu ImageJ (NIH, http://imagej.nih.gov/ij/), a następnie obróbce numerycznej w celu

wyznaczenia intensywności sygnału prążków elektroforetycznych. Wartość intensywności

sygnału odczytywano z densytogramów, a wyniki z trzech niezależnych doświadczeń

uśredniano. Wyniki analizy przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na

rycinie IV.4 (dla HCT116) oraz rycinie IV.5 (dla DU145).

Z danych przedstawionych na rycinie IV.4 wynika, że dwa spośród badanych

związków, a mianowicie RAM-2’ oraz RAM-3’ nie hamowały fosforylacji EGFR

przy Tyr 1068 i Tyr 1173 w linii HCT116, a genisteina i pochodna RAM-5’ hamowały

fosforylację w stopniu umiarkowanym.

102

Page 103: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina IV.11 Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wzory strukturalne związków z opowiadającymi im przykładowymi wynikami analiz „western blot”. Testowano poziom EGFR fosforylowanego przy tyrozynie 1068 oraz 1173. Białkiem kontrolnym było HSC70. Komórki traktowane były genisteiną lub jej pochodnymi przez 24 h. Bloty obrazują przykładowe wyniki uzyskane dla związku wywołującego brak istotnego wpływu badanego związku na poziom fosforylacji EGFR (RAM-3’, panel górny); oceniany arbitralnie, jako wpływ pośredni (genisteina, panel środkowy), oraz silny efekt blokujący fosforylację (RAM-C-4α, panel dolny). Związkiem referencyjnym przedstawionym na rycinie jest genisteina. Wszystkie stężenia podano w μM.

Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności EGFR

okazał się RAM-5 wywołujący w obu liniach komórkowych spadek poziomu fosforylacji

białka przy obu badanych tyrozynach o połowę w najniższym zastosowanym stężeniu

(100 nM). RAM-5 szczególnie silnie obniżał poziom fosforylacji EGFR przy tyrozynie 1173

– w stężeniu 20 µM o ok. 90% (w porównaniu do komórek kontrolnych). Należy podkreślić,

że efekt hamowania fosforylacji EGFR przez RAM-5 ujawniał się w stężeniach znacznie

niższych od wartości IC50.

Pozostałe związki, a mianowicie RAM-3, RAM-C-4α, RAM-C-5α oraz G21 można

uznać za hamujące fosforylację EGFR w stopniu obiecującym. Pochodne te stosowane

w stężeniach przekraczających 2-4 krotnie wartość IC50 ograniczały poziom fosforylacji

Tyr 1068 oraz Tyr 1173 w zakresie od około 50% do około 20% całkowitej aktywności.

Interesująco, wszystkie badane pochodne hamowały silniej fosforylację Tyr 1173

niż Tyr 1068, przeciwnie niż związek macierzysty, genisteina.

103

Page 104: 6.11.14 doktorat_final-final

Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności EGFR

w komórkach DU145 okazała się, tak jak w przypadku komórek HCT116, pochodna RAM-5,

przy czym pochodna ta w linii DU145 hamowała fosforylację Tyr 1068 i Tyr 1173 w równym

stopniu. Stosunkowo silne zahamowanie fosforylacji EGFR obserwowano po zastosowaniu

pochodnej RAM-3, dla której efekt hamowania ujawniał się, podobnie jak w przypadku

pochodnej RAM-5, już w stężeniach niższych od wartości IC50.

Rycina IV.12. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Ramkami zaznaczono najsilniejsze efekty (spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

104

Page 105: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina IV.13. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono najsilniejsze efekty (spadek zawartości pEGFR II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

W podsumowaniu wyników przedstawionego powyżej badania należy stwierdzić, że:

komórki HCT116 odpowiadały obniżeniem poziomu fosforylacji receptora

naskórkowego czynnika wzrostu na większą liczbę pochodnych niż linia DU145.

stopień hamowania fosforylacji EGFR przez najsilniej działające pochodne był również

silniejszy w przypadku komórek linii HCT116.

najsilniej działający związek RAM-5 hamował aktywność EGFR w stężeniach

wielokrotnie niższych od wartości IC50 w linii HCT116 oraz w stężeniu

odpowiadającemu około 1/2 wartości IC50 w linii DU145.

Ze względu na niespodziewanie wysoką aktywność RAM-5 względem badanych

celów molekularnych związek ten w dalszych badaniach stosowano w stężeniach niższych

niż wynikających z wielokrotności IC50 szacowanych dla pozostałych związków.

105

Page 106: 6.11.14 doktorat_final-final

Przedstawione powyżej wyniki badań wymagały ustalenia czy przyczyną

obserwowanego zmniejszania się poziomu fosforylowanych form EGFR jest rzeczywiście

blokowanie aktywności kinazy tyrozynowej tego receptora przez badane pochodne

genisteiny. Wykonując opisane powyżej doświadczenie nie można było bowiem a priori

wykluczyć, że glikokoniugaty genisteiny mogą np. hamować ekspresję genu EGFR (na etapie

transkrypcji bądź translacji) lub przyspieszać jego degradację, a w takich przypadkach spadek

zawartości pEGFR mógł być, przynajmniej częściowo, spowodowany zmniejszaniem

się całkowitej puli komórkowej badanego receptora EGF.

Rycina IV.14. Analiza całkowitej zawartości receptora EGFR w komórkach HCT116 (powyżej) oraz DU145 (poniżej) poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Na wykresach przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot”. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom EGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM.

Aby wyjaśnić czy badane związki wpływają na całkowity poziom EGFR

przeprowadzano analizę „western blot”, tak jak opisano powyżej stosując przeciwciało

specyficznie rozpoznające EGFR. Jak uprzednio wykonywano analizę densytometryczną

106

Page 107: 6.11.14 doktorat_final-final

obliczając całkowity poziom EGFR. Poziom EGFR wyznaczano jedynie dla dwóch

wybranych stężeń, przy których obserwowano najsilniejszy spadek poziomu form

fosforylowanych. Dla tych pochodnych, w przypadku których nie obserwowano obniżenia

poziomu fosforylowanych form EGFR zastosowano stężenia odpowiadające wartościom

około 2x IC50 oraz 4x IC50. Komórki eksponowane były na działanie badanych związków

w takich samych warunkach, w jakich prowadzono badania opisane powyżej. Wyniki analizy

całkowitej zawartości EGFR przedstawiono na rycinie IV.6.

Jak wynika z danych przedstawionych na rycinie IV.6 żaden ze związków

nie zmieniał w sposób istotny poziomu ekspresji receptora w żadnej z badanych linii

komórkowych. Tym samym można założyć, że najbardziej prawdopodobną przyczyną

zmniejszania się poziomu pEGFR-Tyr 1068 i pEGFR-Tyr 1173 w komórkach traktowanych

pochodnymi genisteiny jest hamowanie przez te pochodne aktywności kinazowej związanej

z tym receptorem.

IV.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR

Porównanie wyników uzyskanych w doświadczeniach opisanych powyżej

wskazywało na to, że pochodna RAM-5 wywołująca najsilniejszy cytotoksyczny efekt

synergistyczny w kombinacji z promieniowaniem jonizującym, to związek, który został

wcześniej wskazany jako najwydajniej hamujący poziom fosforylacji EGFR. Z danych

z piśmiennictwa wiadomo, że promieniowanie jonizujące może być czynnikiem

zwiększającym poziom aktywności EGFR. Na podstawie powyższych informacji można było

sądzić, że jednym z elementów mechanizmu uwrażliwiania badanych komórek HCT116

i DU145 na działanie promieniowania jonizującego może być hamowanie aktywności EGFR.

W świetle tych danych istotne było ustalenie czy te pochodne genisteiny, które wykazują

właściwość silnego uczulania komórek na działanie promieniowania jonizującego

równocześnie powodują znaczące obniżanie poziomu fosforylacji EGFR indukowanej

promieniowaniem. Aby to wyjaśnić wykonano analizę „western blot”, której celem było

oznaczenie poziomu fosforylowanych form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR w komórkach

traktowanych przez 24 godziny pochodnymi genisteiny, a następnie poddanych działaniu

promieniowania jonizującego. W doświadczeniu stosowano związki w takich samych

stężeniach, jakie analizowano uprzednio, dla wariantu terapii samodzielnej. Przykładowe

obrazy z analizy „western blot” przedstawiono na rycinie IV.7. Podobnie jak wcześniej

107

Page 108: 6.11.14 doktorat_final-final

wykonano analizę densytometryczną, a wyniki przedstawiono w formie wykresów

słupkowych na rycinach IV.8 (dla linii komórkowej HCT116) i IV.9 (dla komórek DU145).

Rycina IV.15. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne przez 24 godziny, a następnie napromienionych (2 Gy). Przedstawiono przykładowe wyniki analizy „western blot” pokazujące poziom pEGFR fosforylowanego przy tyrozynie 1068 oraz 1173 oraz poziom białka stanowiącego kontrolę: HSC70. Powyżej obrazy dla wybranych związków: związku referencyjnego (genisteiny), związku niewywołującego zahamowania fosforylacji EGFR indukowanej promieniowaniem jonizującym (RAM-3’) oraz związku powodującego zmniejszenie poziomu pEGFR w sposób efektywny (RAM-C-5α).

Analizując dane zawarte na rycinach IV.8 oraz IV.9 można zauważyć,

że w komórkach HCT116 poddanych działaniu promieniowania jonizującego w dawce 2 Gy,

ale nietraktowanych badanymi związkami wzrasta poziom obu fosforylowanych form EGFR

w zakresie do około 30%, a w komórkach DU145 traktowanych promieniowaniem w dawce

4 Gy nawet do około 50% w porównaniu do komórek nieeksponowanych na działanie

promieniowania. Otrzymane wyniki pokazują, że tak, jak opisano w literaturze dla innych

linii komórek nowotworowych, i tu obserwuje się indukowaną promieniowaniem aktywację

EGFR. Jeśli jednak przed ekspozycją na promieniowanie jonizujące komórki traktowane

są genisteiną lub jej pochodnymi, wtedy, w zależności od linii komórkowej i stosowanych

dawek związku, poziom fosforylowanych form EGFR ulega obniżeniu co najmniej

do poziomu występującego w komórkach nietaktownych, a w przypadku kilku pochodnych

do poziomu poniżej 50% poziomu występującego w komórkach kontrolnych.

108

Page 109: 6.11.14 doktorat_final-final

Porównując dane pokazane na rycinach IV.4 z IV.8 (komórki HCT116) oraz rycinach

IV.5 z IV.9 (komórki DU145) można zauważyć, że te same związki, które najefektywniej

obniżały poziom form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR w komórkach HCT116 i DU145

w doświadczalnym wariancie, w którym nie stosowano promieniowania jonizującego, były

także skuteczne w hamowaniu aktywności EGFR w komórkach napromienianych.

Rycina IV.16. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (2 Gy). Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność EGFR (spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

109

Page 110: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina IV.17. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (4 Gy). Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot”. Z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność EGFR (spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

Jako związki najskuteczniej hamujące fosforylację EGFR w linii HCT116

wytypowano RAM-5, G21 oraz RAM-3, które nie tylko zmniejszały zawartość pEGFR

do poziomu komórek kontrolnych (nietraktowanych), ale powodowały jego spadek

do połowy tej wartości w zakresie stosowanych stężeń. Podobne efekty obserwowano w linii

DU145 po zastosowaniu RAM-5, przy czym należy zaznaczyć, że po 24-godzinnej ekspozycji

komórek DU145 na tę pochodną, a następnie ich napromienianiu poziom pEGFR-Tyr 1068

spadał jedynie do poziomu komórek nienapromienianych. Spośród pozostałych pochodnych

jedynie RAM-C-5α w najwyższych zastosowanych stężeniach wywoływał obniżenie

zawartości pEGFR poniżej poziomu komórek kontrolnych. Jedynym spośród badanych

110

Page 111: 6.11.14 doktorat_final-final

związków, który efektywnie obniżał indukowaną promieniowaniem aktywność EGFR

zarówno w komórkach HCT116 jak i DU145 był RAM-5.

Wyniki omawianego doświadczenia pokazują, że jednym z mechanizmów

odpowiadającym za właściwości radiouczulające pochodnej RAM-5 może być hamowanie

aktywności kinazy EGFR w komórkach HCT116 oraz DU145.

Podsumowując przedstawione powyżej wyniki badań można stwierdzić, że:

w obu testowanych liniach komórkowych obserwuje się indukowany

promieniowaniem wzrost poziomu fosforylacji EGFR;

w komórkach obu linii nowotworowych genisteina powoduje obniżenie zawartości

pEGFR do poziomu komórek kontrolnych;

w przypadku linii HCT116 dla czterech pochodnych (RAM-5, RAM-C-3α, RAM-C-

4α, RAM-C-5α) obserwowano równoczesną zdolność do obniżania poziomu pEGFR

oraz wywoływania efektu synergistycznego w kombinacji z IR, przy czym większy

efekt synergistyczny obserwowany był w przypadku pochodnych o lepszych

właściwościach do hamowania aktywności EGFR. Podobnych zależności nie

obserwowano w linii DU145;

pochodne O-glikozydowe z podstawnikiem cukrowym przy C-4’ modulują efekty

promieniowania jonizującego w mechanizmie niezależnym od EGFR;

spośród analizowanych związków najskuteczniej radiouczulącym zarówno komórki

HCT116 jak i DU145 prawdopodobnie w mechanizmie zależnym od EGFR jest

RAM-5;

pochodne G21 oraz RAM-3 działają efektywnie jedynie w linii HCT116.

IV.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez

genisteinę i jej pochodne

Oddziaływanie receptora naskórkowego czynnika wzrostu z ligandem aktywuje kilka

cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych stymulujących procesy związane z proliferacją

komórek, różnicowaniem, potencjałem migracyjnym i przeżyciem. Tym samym nadmierna

aktywność EGFR może przyczyniać się do zwiększania tumorogennego potencjału komórek

nowotworowych. Szlakami sygnałowymi aktywowanymi w wyniku fosforylacji EGFR

są między innymi ścieżki sygnałowe RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT powodujące

zwiększanie poziomu proliferacji, różnicowania, ruchliwości, zdolności do przerzutowania

komórek nowotworowych oraz zwiększające potencjał prożyciowy komórek nowotworowych

111

Page 112: 6.11.14 doktorat_final-final

poprzez modulowanie procesów programowanej śmierci komórkowej. Jak pokazują dane

literaturowe konstytutywna aktywność ścieżek RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT

spowodowana mutacjami w genach K-RAS oraz PI3KCA może być przyczyną niepowodzenia

w leczeniu z zastosowaniem inhibitorów EGFR. Schemat sygnalizacji komórkowej zależnej

od EGFR oraz wpływ zaburzenia prawidłowego funkcjonowania tych szlaków na proces

nowotworowy przedstawiono w rozdziale „Wstęp” (podrozdział I.2.3).

Pożądaną właściwością pochodnych genisteiny, w kontekście ich potencjalnego

zastosowania jako inhibitorów EGFR, byłaby ich zdolność do hamowania kinaz znajdujących

się poniżej w szlaku przekazywania sygnału, w tym kinazy AKT i ERK 1/2 (MAPK 42/44).

Należy przy tym zauważyć, że wspomniane szlaki przekazu sygnału stanowią skomplikowaną

sieć oddziaływań pomiędzy ich poszczególnymi elementami, a zahamowanie aktywności

EGFR jest tylko jednym z wielu możliwych czynników modulujących aktywność kinaz AKT

czy ERK 1/2.

W celu określenia czy zahamowanie fosforylacji EGFR przez testowane pochodne

zmniejsza aktywność szlaków zależnych od EGFR, zbadano poziom fosforylacji kinaz AKT

oraz ERK 1/2 (MAPK 42/44) w komórkach inkubowanych przez 24 godziny

z analizowanymi związkami. Użyte do doświadczeń stężenia związków odpowiadały

wartościom, dla których obserwowano wyraźne obniżenie zawartości pEGFR bądź,

w przypadku związków, które nie modyfikowały aktywności EGFR, wartościom około

2x oraz 4x IC50. Jak w poprzednich doświadczeniach posłużono się metodą „western blot”

stosując przeciwciała pierwszorzędowe swoiście rozpoznające fosforylowane formy badanych

białek. Przykładowe obrazy z analizy „western blot” przedstawiono na rycinie IV.10.

Przykładowe wyniki wykonanej analizy obrazują: brak istotnego wpływu badanego związku

na poziom fosforylacji EGFR (panel górny), oceniany arbitralnie, jako wpływ pośredni (panel

środkowy) oraz silny efekt blokujący fosforylację (panel dolny).

Wszystkie obrazy z klisz rentgenowskich poddano analizie densytometrycznej

z zastosowaniem programu ImageJ (NIH, http://imagej.nih.gov/ij/), a następnie obróbce

numerycznej. Wyniki analizy przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują

się na rycinach IV.11 dla pAKT oraz IV.12 dla pERK 1/2.

Jak wynika z ryciny IV.11 w przypadku komórek HCT116 tylko pochodna RAM-5

w zdecydowany sposób obniżała poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Inną pochodną,

która hamowała aktywację AKT, jednak znacznie słabiej niż RAM-5, był związek G21.

Spośród innych związków, które obniżały zawartość pEGFR (RAM-C4α oraz RAM-C5α),

żaden nie powodował istotnych zmian w poziomie fosforylowanej (aktywnej) formy AKT.

112

Page 113: 6.11.14 doktorat_final-final

Inne związki, które nie hamowały aktywacji EGFR, nie powodowały także zmian w poziomie

aktywnej formy kinazy AKT. Interesujące jest, że w przypadku traktowania komórek

HCT116 pochodną RAM-5’ dochodziło do pobudzenia aktywności kinazy AKT.

Rycina IV.18. Analiza zawartości pAKT oraz pERK 1/2 w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne przez 24 h. Przedstawiono wzory strukturalne związków z odpowiadającymi im przykładowymi wynikami analiz „western blot”. Jako kontrolę zastosowano HSC70. Bloty obrazują przykładowe wyniki uzyskane dla związku referencyjnego, genisteiny, oraz związków powodujących obniżenie poziomu pAKT oraz pERK 1/2, RAM-5 oraz G21. Wszystkie stężenia podano w μM.

W przypadku komórek DU145, również tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany

sposób obniżała poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Spośród innych związków, które

we wcześniejszych badaniach hamowały fosforylację EGFR (RAM-3, RAM-C-4α oraz

RAM-C-5α) jedynie RAM-3 i RAM-C4α hamowały aktywację kinazy AKT. Można także

zauważyć, że inaczej niż w przypadku komórek HCT116, również pochodna G21, jakkolwiek

w stosunkowo wysokim stężeniu, znacznie obniżała zawartość pAKT.

Jak wynika z danych zamieszczonych na rycinie IV.12 badane pochodne zasadniczo

w podobny sposób hamują aktywność kinazy ERK 1/2 (pERK 1/2) i kinazy AKT (pAKT).

I w tym przypadku związkiem najwydajniej blokującym fosforylację ERK 1/2 okazała

się pochodna RAM-5. Pochodna RAM-5’, która niespodziewanie zwiększała poziom

fosforylowanej formy AKT w komórkach HCT116, nie wykazywała takiego efektu

113

Page 114: 6.11.14 doktorat_final-final

w stosunku do kinazy ERK 1/2. Co interesujące, odkryto, że niektóre z pochodnych

zwiększają aktywność kinazy ERK 1/2. W przypadku komórek HCT116 obserwowano

wzrost zawartości pERK 1/2 po zastosowaniu RAM-C-4α oraz RAM-5’, w przypadku

DU145: RAM-C-4α, RAM-2’ oraz w mniejszym stopniu RAM-5’. Związek RAM-5’

powodował również wzrost zawartości pAKT w linii HCT116.

Rycina IV.19. Analiza poziomu fosforylacji AKT w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami zaznaczono związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność AKT o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek najefektywniejszy. Wszystkie stężenia podano w μM.

114

Page 115: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina IV.20. Analiza poziomu fosforylacji kinazy ERK 1/2 w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami zaznaczono związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność ERK 1/2 o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek najefektywniejszy.

IV.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne

Genisteina, jako związek o działaniu plejotropowym (informacje zamieszczone

w rozdziale „Wstęp”, podrozdział I.1), oddziałuje z wieloma celami molekularnymi.

Do najważniejszych celów molekularnych w kontekście blokowania proliferacji komórek

nowotworowych należy, oprócz kinaz tyrozynowych, topoizomeraza II. Genisteina, podobnie

jak etopozyd, zaliczana jest do związków określanych jako „trucizny” topoizomerazy II.

Genisteina podana komórkom przyłącza się do związanej kowalencyjnie z DNA

topoizomerazy II tworząc potrójny kompleks (ang. ternary complex). W ten sposób genisteina

blokuje etap łączenia przeciętych nici DNA (faza ligacji) prowadząc do powstania

115

Page 116: 6.11.14 doktorat_final-final

podwójnych pęknięć w nici DNA, a to z kolei może prowadzić do śmierci komórek.

We wcześniejszych badaniach wykazano, że pochodna genisteiny G21 wykazuje właściwość

inhibitora topoizomerazy II (Gogler-Pigłowska et al., 2012). Ta oryginalna obserwacja

wskazywała na fakt, że obecność dużego podstawnika przy węglu C-7 genisteiny

nie przeszkadza, jak sugerowano w literaturze, w hamowaniu aktywności topoizomerazy II

przez związek. Można było zatem oczekiwać, że także inne pochodne genisteiny badane

w niniejszej pracy również mogą wykazywać właściwość trucizn topoizomerazy.

Rycina IV.21. Analiza zawartości niezwiązanej formy topoizomerazy II α oraz β w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wzory strukturalne związków z opowiadającymi im przykładowymi wynikami analiz „western blot”. Jako kontroli użyto HSC70. Komórki traktowane były genisteiną lub jej pochodnymi przez 24 h. Bloty obrazują przykładowe wyniki uzyskane dla związków referencyjnych, etopozydu oraz genisteiny i G21 oraz związku, dla którego obserwowano zdolność do hamowania aktywności topoizomerazy II, RAM-5. Wszystkie stężenia podano w μM.

W celu określenia wpływu wprowadzonych do cząsteczki genisteiny modyfikacji

na jej zdolność do hamowania aktywności topoizomerazy II zastosowano test nazywany

„immunoband depletion”, który z powodu braku obowiązującego polskiego terminu

stosowany jest w niniejszej pracy w brzmieniu angielskim. W komórkach, w których

zdolność topoizomerazy II do ligacji DNA jest hamowana przez badaną substancję występują

liczne kowalencyjne kompleksy DNA-TOPO II. Po wyizolowaniu białek komórkowych

i wykonaniu elektroforetycznego frakcjonowania w żelu akrylamidowym, białka przenosi

116

Page 117: 6.11.14 doktorat_final-final

się na membranę nitrocelulozową, a następnie wykrywa topoizomerazę II za pomocą

swoistego przeciwciała. Jeśli topoizomeraza II jest kowalencyjnie połączona z DNA,

nie migruje w żelu poliakrylamidowym, co powoduje, że prążek odpowiadający niezwiązanej

z DNA TOPO II znika lub jego intensywność jest mniejsza niż prążka odpowiadającego

kontroli. Test „immunoband depletion”, z technicznego punktu widzenia, jest wariantem

metody „western blot”.

Rycina IV.22. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β w komórkach linii HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form topoizmoerazy II = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.

Aby ocenić zdolność badanych w niniejszej pracy pochodnych genisteiny

do hamowania aktywności TOPO II komórki HCT116 oraz DU145 inkubowano

z testowanymi związkami przez 24 godziny, a stężenia użyte w tym doświadczeniu były takie

same jak użyte w poprzednim doświadczeniu (hamowanie aktywacji kinaz AKT i ERK 1/2,

117

Page 118: 6.11.14 doktorat_final-final

tabela III-5). W doświadczeniach wykonywanych w ramach niniejszej pracy analizowano

wpływ pochodnych na obie izoformy topoizomerazy II – α oraz β. Wyniki opracowane

jak poprzednio przedstawiono na rycinach IV.13 oraz IV.14 dla HCT116 oraz IV.15

dla DU145.

Rycina IV.23. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β w komórkach linii DU145 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form topoizomerazy = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.

Wyniki przedstawione na rycinach IV.14 i IV.15 pokazują, że wpływ badanych

związków na aktywność TOPO II α i TOPO II β jest w komórkach HCT116 i DU145

podobny. W obu liniach spośród związków referencyjnych (etopozyd, genisteina i pochodna

G21) najsilniejsze działanie hamujące aktywność topoizomerazy II wykazał etopozyd,

118

Page 119: 6.11.14 doktorat_final-final

lek rutynowo stosowany w leczeniu przeciwnowotworowym. Genisteina i G21 hamowały

aktywność topoizomerazy II, jednak istotny efekt pojawiał się jedynie, jeśli związki te były

stosowane w najwyższych badanych stężeniach. Spośród testowanych pochodnych genisteiny

jedynie RAM-5 wykazywał silny efekt hamujący aktywność TOPO II, przy czym silniejszy w

odniesieniu do formy β. Stosunkowo niskie stężenia RAM-5 (5 μM), przy których

zahamowanie aktywności topoizomerazy jest znaczące wskazują, że pochodna ta może być

rozważana jako interesujący obiekt dalszych badań przedklinicznych. Inne badane pochodne

genisteiny nie wpływały na aktywność żadnej z form topoizomerazy II lub obserwowany

efekt hamujący był nieznaczny.

IV.7. Podsumowanie badań przesiewowych

Pochodnymi zdecydowanie najsłabiej działającymi na wybrane do badań cele

molekularne była grupa związków O-glikozydowych podstawionych grupą ramnalową przy

węglu C-4’. W przypadku związków tej serii obserwowano ponadto pogarszanie właściwości

cytotoksycznych wraz z wydłużaniem łącznika węglowego w cząsteczce. Pochodne

te nie hamowały aktywności ani EGFR, ani zależnych od niego szlaków sygnałowych,

ani topoizomerazy II. Mimo to w przypadku komórek linii DU145 działały synergistyczne

z promieniowaniem jonizującym. Efekt ten musiał zatem zależeć od działania tych

pochodnych na inne cele molekularne niż badane w niniejszej pracy doktorskiej.

Pochodne O-glikozydowe podstawione przy węglu C-7 modulowały aktywność EGFR

zarówno samodzielnie, jaki i w kombinacji z promieniowaniem znacząco efektywniej

w komórkach linii HCT116 niż w komórkach linii DU145. Z drugiej strony to w linii DU145

po zastosowaniu pochodnych genisteiny osiągnięto efekty silnie synergistyczne, podczas

gdy w linii HCT116 jedynie synergistyczne. Efekt działania pochodnych C-glikozydowych

(RAM-C-4α, RAM-C-5α) można ocenić jako umiarkowany, jednak słabszy niż ich analogów

O-glikozydowych (RAM-3, RAM-5). Spośród pochodnych obniżających aktywność EGFR

w obu liniach komórkowych (RAM-3, RAM-5, RAM-C-4α, RAM-C-5α) jednie RAM-5

hamował także aktywność kinaz znajdujących się poniżej w szlaku sygnałowym zależnym

od EGFR, również w linii HCT116, w której szlaki sygnałowe AKT oraz MAPK

są konstytutywnie aktywne ze względu na występowanie mutacji w genach K-RAS oraz

PI3KCA.

Najważniejsze wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej

zostały podsumowane w tabelach IV-5 (komórki HCT116) oraz IV-6 (komórki DU145).

119

Page 120: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela IV-14. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek HCT116. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).

*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach nietraktowanych (brak efektu „-”))+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości w komórkach kontrolnych „0”)

ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-Tyr 1068

pEGFR- Tyr 1173

pEGFR-Tyr 1068 + IR

pEGFR-Tyr 1173 + IR pAKT pERK 1/2 TOPO II α TOPO II β

EFEKT Z IRED50/ED75/ED90

GENISTEIN 31.30 ± 5.47 0 + 0 + / 0 + / 0 0 0 + + + - / 0 / 0

G21 1.24 ± 0.34 0 + + ++ + + /+ + +

+ + + /+ + + +

+ + + + + + + + + / + + / + +

RAM-3 2.63 ± 1.52 0 + + + + + ++ + + /+ + +

+ + + /+ +

0 0 0 słaby + 0 / 0 / +

RAM-5 5.89 ± 0.07 0 + + + + + + + ++ + + + /

+ + ++ + + + /+ + + +

+ + + + + + + + + + 0 / + + / + +

RAM-2’ 3.32 ± 0.88 0 0 0 0 / - 0 / - 0 0 0 0 0 / 0 / + +

RAM-3’ 13.17 ± 0.94 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 - / 0 / +

RAM-5’ 7.00 ± 0.06 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 - / - / 0

RAM-C-4α 6.52 ± 0.79 0 + + + + / słaby + +/słaby + 0 + 0 0 - / + / + +

RAM-C-5α 12.54 ± 3.16 0 + + + + + + / słaby + +/słaby + 0 0 - 0 - / + / + +

120

Page 121: 6.11.14 doktorat_final-final

Tabela IV-15. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek DU145. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).

*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach nietraktowanych (brak efektu „-”))+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości w komórkach kontrolnych „0”)

ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-Tyr 1068

pEGFR-Tyr 1173

pEGFR-Tyr 1068 + IR

pEGFR-Tyr 1173 + IR pAKT pERK ½ TOPO II α TOPO II β

EFEKT Z IRED50/ED75/ED90

GENISTEINA 35.02 ± 8.77 0 0 Słaby + + / 0 * + / 0 0 0 + + + + - / 0 /+

G21 2.96 ± 0.28 0 + + Słaby + 0 / - * + / 0 + + + + + + - / 0 / +

RAM-3 10.97 ± 5.92 0 + + + + + + 0 / - + + / + + 0 0 słaby + 0 / + + / + +

RAM-5 10.95 ± 2.03 0 + + + + + + + + + / 0 + + / + + + + + + + + + + + + + / + + + / + + +

RAM-2’ 5.08 ± 0.45 0 0 - + / 0 0 / - 0 - 0 0 + + / + + + / + + +

RAM-3’ 18.86 ± 5.14 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 0 / + + + / + + +

RAM-5’ 6.70 ± 0.81 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 0 / + + + / + + +

RAM-C-4α 3.82 ± 1.00 0 + + + + / 0 + + / + + - 0 0 + / + + / + +

RAM-C-5α 11.49 ± 4.27 0 + + + + / 0 + / 0 0 0 - 0 0 / + / + +

121

Page 122: 6.11.14 doktorat_final-final

Ostatecznie, na podstawie wyników opisanych w niniejszej pracy można wskazać

do dalszych badań in vivo jeden związek, a mianowicie RAM-5.

Pochodna RAM-5 hamowała aktywność wszystkich badanych celów molekularnych

najsilniej spośród wszystkich związków zarówno kiedy stosowana była samodzielnie jak

i w kombinacji z promieniowaniem jonizującym. Efekty kombinacji z promieniowaniem

jonizującym były synergistyczne bądź silnie synergistyczne w obu liniach. Związek

wywoływał powstanie obserwowanych efektów molekularnych w stężeniu ok. 5 μM w linii

komórkowej raka jelita grubego HCT116 oraz raka gruczołu krokowego DU145.

Jest to stężenie odpowiadające wartości ok IC50 oraz 1/2 IC50 odpowiednio, podczas

gdy dla pozostałych związków efekty pojawiały się dopiero przy wartościach około 2x bądź

4x IC50. Jest to również najniższa wartość liczbowa w porównaniu do pozostałych związków.

122

Page 123: 6.11.14 doktorat_final-final

V. DYSKUSJA

Obecnie w poszukiwaniu leków do zastosowania w terapii onkologicznej

wykorzystuje się kilka strategii, które ogólnie można podzielić na strategie oparte o:

szerokie badania przesiewowe, porównawcze i selekcyjne; badaniami przesiewowymi

obejmuje się leki obecnie stosowane w terapii innych chorób niż stany nowotworowe oraz

wszystkie nowoodkryte oraz nowozsyntezowane leki (Drug Developmental Therapeutics

Program of the National Cancer Institute, zapoczątkowany w latach 30. XX wieku)

(http://dtp.nci.nih.gov/, Frei, 1982),

projektowanie leków przeciwnowotworowych w oparciu o znane selektywne mechanizmy

patofizjologiczne odpowiedzialne za procesy kancerogenezy .

Strategią, która łączy elementy badań przesiewowych oraz projektowania leków

w oparciu o istniejącą wiedzę o procesach molekularnych odpowiedzialnych za powstawanie

i rozwój nowotworu jest poszukiwanie leków wśród analogów związków

przeciwnowotworowych stosowanych obecnie w leczeniu lub analogów związków

o potencjalnym znaczeniu terapeutycznym, którego jednak nie można osiągnąć ze względu

na pewne ograniczenia wynikające z charakterystyki cząsteczki. Strategia ta w ogólnym

zarysie polega na wprowadzeniu do struktury chemicznej znanej substancji (struktury

wiodącej) takich modyfikacji, które znacząco poprawią jej cechy, na przykład

rozpuszczalność w wodzie bądź tłuszczach, czas występowania w krwioobiegu,

przechodzenie przez błonę komórkową, stabilność bądź spowodują wystąpienie pożądanych

efektów biologicznych przy zastosowaniu niższych stężeń analogu. Powstające pochodne

mogą być syntezowane z nadzieją na uzyskanie nowej cząsteczki działającej samodzielnie lub

też pro-leku uwalniającego w komórce aktywny lek. Często modyfikuje się związki

pochodzenia naturalnego, których znaczącą przewagą w porównaniu do leków stosowanych

obecnie jest brak bądź występowanie jedynie nieznacznej toksyczności ogólnoustrojowej.

Pożądaną tendencją w projektowaniu leków w oparciu o strukturę wiodącą związku

występującego w naturze jest wprowadzanie do tej cząsteczki takich nowych grup

chemicznych, które również są nietoksyczne . Należy przy tym podkreślić, że modyfikowanie

struktury cząsteczek związków naturalnych jest strategią powszechną i skuteczną w

poszukiwaniu związków przeciwnowotworowych,

co potwierdzają dane dotyczące obecnie stosowanych w onkologii leków. Według danych

szacunkowych 50-70% substancji stosowanych obecnie w przeciwnowotworowej terapii

klinicznej to właśnie związki pochodzenia naturalnego bądź ich pochodne . Spośród leków

123

Page 124: 6.11.14 doktorat_final-final

będących pochodnymi związków naturalnych, a więc takich, których modyfikacja chemiczna

umożliwiła wprowadzenie do leczenia klinicznego, wymienić można między innymi:

idarubicynę, pochodną danorubicyny uzyskiwaną ze Streptomyces peucetius vel cesius,

epirubicynę, pochodną doksorubidyny uzyskiwaną ze Streptomyces peucetius

(zmutowany z użyciem N-nitrozo-N-metylomocznika),

mitoksantron oraz pikodsnyton, pochodne antrachinonu z kory kruszyny pospolitej

(Frangula alnus) oraz ożanki czosnkowej (Teucrium scordium),

winorelibinę, pochodną winblastyny z barwnika różowego (Vinca resea),

irynotekan i topotekan, pochodne kamptotecyny z drzewa Camptotheca acumninat,

etopozyd i tenipozyd, pochodne podofilotoksyny z roślin iglastych (Juniperus)

oraz berberysowatych (Podophyllum).

Szczegółowe dane dotyczące powyższych leków znajdują się na stronach internetowych

amerykańskiej agencji rządowej National Cancer Institute – National Instututes of Health

(http://www.cancer.gov/cancertopics/druginfo/alphalist).

Leki pochodzenia roślinnego oraz ich pochodne są często stosowane w kombinacji

z lekami o innym mechanizmie działania lub z radioterapią, dlatego też coraz częściej testuje

się przydatność nowych związków naturalnych jako komponentów terapii kombinowanej .

Jednym

z najintensywniej badanych związków roślinnych, również pod kątem wprowadzenia

do leczenia jako komponentu uzupełniającego konwencjonalną terapię, jest genisteina

. Równocześnie genisteina jest strukturą wyjściową w projektowaniu potencjalnych leków od

około ćwierć wieku . Do strategii stosowanych dotychczas w projektowaniu pochodnych

genisteiny wlicza się:

wprowadzenie do struktury wiodącej takich modyfikacji chemicznych, które mogą

zwiększyć aktywność związku względem znanego celu molekularnego dla genisteiny

(najczęściej kinaz tyrozynowych oraz topoizomerazy II),

prowadzenie badań przesiewowych wielu nowych pochodnych genisteiny w celu

wyselekcjonowania związku o właściwościach antyproliferacyjnych i działającego

w znacząco niższych stężeniach niż genisteina w badaniach in vitro, a następnie próba

oceny mechanizmu molekularnego,

projektowanie związków z nadzieją na otrzymanie analogów będących pro-lekami, które

mają zwiększać dokomórkowy transport genisteiny, a we wnętrzu komórki uwalniać

„lek”, czyli wolną cząsteczkę genisteiny.

124

Page 125: 6.11.14 doktorat_final-final

Pierwsze pochodne genisteiny zsyntezowano z nadzieją na poprawę zdolności

związku do hamowania aktywności kinaz tyrozynowych . Pochodne

te, w liczbie 23, powstały na drodze dołączenia w pozycji C-2 szkieletu izoflawonoidowego

podstawników organicznych. Niektóre związki wzbogacono o grupy estrowe bądź metylowe

w pozycji C-4’, w jednym przypadku grupy przy węglu C-5 i C-7 acetylowano. Pomimo,

że żaden z otrzymanych związków nie okazał się lepszym inhibitorem kinaz tyrozynowych,

podstawienie związków różnymi grupami chemicznymi w różnych miejscach cząsteczki

genisteiny dostarczyło wstępnych informacji o zależności aktywności związku od jego

budowy chemicznej (SAR, ang. structure activity relationship). Wykazano, że krytyczną

grupą chemiczną odpowiedzialną za właściwość TKI (ang. tyrosine kinase inhibitor, inhibitor

kinaz tyrozynowych) jest grupa OH przy węglu C-5 oraz obecność niepodstawionych grup

OH przy węglu C-7 oraz C-4’ .

Ponownie próbę zsyntezowania pochodnych genisteiny o lepszych właściwościach

TKI podjęto 10 lat później otrzymując serię związków o różnych wzorach metoksylacji oraz

oksygenacji w pierścieniu fenylowym. Niestety także i w tym przypadku żadna z pochodnych

nie wykazywała istotnej aktywności cytotoksycznej względem komórek nowotworowych

jelita grubego, a tylko jedna hamowała aktywność kinaz tyrozynowych, jednak słabiej

niż genisteina .

Dotychczas zsyntetyzowano dziesiątki pochodnych genisteiny, jednak

nie wykazywały one, poza kilkoma wyjątkami, oczekiwanych właściwości. Wyczerpujące

informacje o otrzymanych dotychczas pochodnych genisteiny oraz ich właściwościach

biologicznych, w tym właściwościach cytotoksycznych wobec komórek nowotworowych,

opisano w pracach przeglądowych . Poniżej przytoczone będą jedynie wybrane informacje

konieczne w prowadzeniu dyskusji wyników niniejszej pracy doktorskiej.

Biorąc pod uwagę poznane wcześniej właściwości genisteiny, a mianowicie

jej zdolność do hamowania proliferacji komórek nowotworowych i jednocześnie

jej ograniczoną biodostępność, grupa prof. dr hab. Grzegorza Grynkiewicza (Instytut

Farmaceutyczny, Warszawa) zaproponowała modyfikację genisteiny poprzez glikozylację .

Glikozydy okazały się interesującą grupą pochodnych genisteiny, które były w późniejszym

czasie wielokrotnie badane również przez inne zespoły . Otrzymane przez grupę prof.

Grzegorza Grynkiewicza pochodne genisteiny opisane w pracy różniły się lipofilowością,

która jest kluczowym parametrem regulującym pasywną dyfuzję przez błony biologiczne.

Oczekiwano, że w wyniku zaproponowanych modyfikacji uda się zwiększyć

wewnątrzkomórkowe stężenie genisteiny poprzez łatwiejsze przenikanie pochodnych przez

125

Page 126: 6.11.14 doktorat_final-final

błonę komórkową. Co więcej, wewnątrz komórki acetylowane reszty cukrowe połączone z

genisteiną wiązaniem biodegradowalnym powinny ulegać odłączeniu w wyniku działania

wewnątrzkomórkowych hydrolaz, uwalniając tym samym aktywny izoflawon. Biorąc pod

uwagę oczekiwany schemat działania glikozylowanych pochodnych genisteiny stanowiły one

pro-leki (Polkowski et al., 2004).

Koncepcja zwiększania wewnątrzkomórkowego stężenia genisteiny przedstawiona

w pracy Polkowskiego mieściła się z jednej strony w nurcie badań nad syntezą i badaniem

właściwości glukokoniugatów (przegląd w: )), a z drugiej nad ich potencjalnym

zastosowaniem w chemoterapii nowotworów (przegląd w: ).

Przesłanką do opracowywania i syntezy glukokoniugatów mogących działać jako leki

hamujące wzrost komórek nowotworowych lub indukujące ich śmierć jest zmiana

metaboliczna często występująca w wielu typach komórek nowotworowych, polegająca

na wykorzystywaniu do generowania energii zgromadzonej w ATP głównie procesu glikolizy

(przegląd w pracy także w ) z jednoczesnym obniżeniem poziomu fosforylacji oksydacyjnej.

Zjawisko to określane jest od nazwiska odkrywcy „efektem Warburga” i występuje nawet w

obecności tlenu . Wydaje się, że „efekt Warburga” związany jest z upośledzeniem funkcji

mitochondriów,

a inicjowany jest hipoksją występującą wewnątrz guza nowotworowego i w konsekwencji

aktywacją czynnika transkrypcyjnego HIF-1 (czynnik indukowany hipoksją, ang. hypoxia

induced factor 1), który następnie uaktywnia liczne geny, w tym geny kodujące enzymy

glikolityczne. Nasilona glikoliza wywołuje wzrost produkcji kwasu mlekowego, obniżenie

pH tkanki i zwiększenie zdolności komórek nowotworowych do przerzutowania

.

Ze względu na zwiększony metabolizm glukozy w komórkach o fenotypie

glikolitycznym występuje zwiększone zapotrzebowanie na glukozę i inne cukry, zatem jak

można oczekiwać, przyłączenie reszt cukrowych (głównie glukozy) do cząsteczek

chemoterapeutyków powinno nasilać ich dokomórkowe wchłanianie przez swoiste receptory.

Ze względu na większe zapotrzebowanie na glukozę komórek nowotworowych w porównaniu

do komórek prawidłowych, oczekiwano, że dodatkową zaletą stosowania glikokoniugatów

może być ich ograniczona toksyczność ogólnoustrojowa .

Badania opisane w pracy pokazały, że hydroksylowe glikokoniugaty wykazywały

niższą aktywność od wolnego aglikonu, a glikozydy lipofilowe były znacząco bardziej

aktywne od genisteiny, co świadczyło o tym, że acetylacja grup OH

w strukturze reszty cukrowej zwiększająca liofilowość może odpowiadać za nasilenie

126

Page 127: 6.11.14 doktorat_final-final

dokomórkowego, przypuszczalnie biernego wnikania związków. O aktywności otrzymanych

pochodnych, jak wykazały badania, decydował również rodzaj podstawionej grupy cukrowej,

przy czym najbardziej aktywne były pochodne zawierające grupę cukrową z podwójnym

wiązaniem. Najlepsze właściwości cytotoksyczne względem badanych komórek

nowotworowych wykazywały dwa związki nazwane G21 oraz G30. Szczególnie interesującą

glikopochodną wydawał się związek G21, w którego strukturze występuje laktal, ponieważ

całkowicie blokował proliferację komórek nowotworowych ludzkiej białaczki

promielocytowej HL-60, jelita grubego Colo-205, gruczołu krokowego PC-3 oraz raka piersi

MCF-7 już w stężeniu 10 μM . Równocześnie G21 nie hamował wzrostu komórek

prawidłowych z linii fibroblastów Balb/c 3T3 .

Pomimo, że pierwotnym zamiarem grupy prof. Grzegorza Grynkiewicza było

otrzymanie pochodnych genisteiny, które miałyby efektywniej wnikać do komórek

niż genisteina, a następnie hydrolizować z uwolnieniem aglikonu, to dalsze badania pokazały,

że najbardziej aktywny związek, G21, jest strukturą stabilną, a zatem za efekt cytotoksyczny

odpowiada najprawdopodobniej cała cząsteczka. Wyniki badań – prowadzonych przez zespół,

w którym pracuję – nad wyjaśnieniem mechanizmu cytotoksycznego działania pochodnej

G21 były dużym zaskoczeniem. Okazało się, że ta glikopochodna genisteiny ma właściwości

antymitotyku uszkadzającego strukturę wrzeciona podziałowego

i w przeciwieństwie do związku wyjściowego powoduje powstawanie mikrojąder

zawierających markery centromerowe, a zatem wykazuje właściwości aneugeniczne

.

Poznanie właściwości związku G21 stało się bodźcem do syntezy przez zespół

kierowany przez prof. dr hab. inż. Wiesława Szeję (Wydział Chemiczny Politechniki Śląskiej)

wielu nowych pochodnych genisteiny, w których do aglikonu dołączano poprzez wiązanie

glikozydowe reszty wybranych glikali, a mianowicie laktalu, galaktalu lub ramnalu.

Na podstawie wyników wstępnych badań (dane niepublikowane) jako najbardziej obiecujące

uznano pochodne ramnalowe. Po pierwsze, pochodne te wykazywały silniejszy efekt

cytotoksyczny niż pochodne innych badanych cukrów. Po drugie, synteza pochodnych

ramnalowych genisteiny okazała się łatwiejsza niż pochodnych z przyłączoną resztą laktalu

lub galaktalu. Wreszcie, po trzecie, biorąc pod uwagę ograniczoną i w znacznym stopniu

selektywną biologiczną aktywność ramnozy wobec komórek ludzkich można było założyć,

że reszta ramnalowa połączona z genisteiną będzie strukturą biologicznie bierną. Reszty

hydroksylowe w strukturze cukru acetylowano.

127

Page 128: 6.11.14 doktorat_final-final

Ponadto, opierając się na wynikach grupy , a także badań wstępnych prowadzonych w

zespole, do którego należę, podstawniki cukrowe połączone zostały z genisteiną łącznikami 2,

3, 4 lub 5-cio węglowymi. W cytowanej powyżej pracy sprawdzano czy i w jaki sposób

długość łącznika alkilowego pomiędzy węglem C-7 genisteiny oraz przyłączoną aminą

wpływa na właściwości cytotoksyczne rozmaitych pochodnych genisteiny (nie badano

glikokoniugatów genisteiny). Zaobserwowano, że tylko kilka pochodnych wykazywało

większą aktywność od genisteiny. Najbardziej aktywny okazał się związek z łącznikiem

trójwęglowym.

Z kolei w badaniach prowadzonych przez zespół, do którego należę, w ramach

równoległego projektu sprawdzono czy i jaka relacja występuje pomiędzy długością łącznika

w strukturze pochodnej a wartością log P, czyli współczynnika podziału n-oktanol/woda,

a cytotoksyczną aktywnością glikopochodnych genisteiny. Badania te prowadzone były

na serii pochodnych genisteiny podstawionych tymi samymi resztami cukrowymi

i połączonych z genisteiną łącznikami o różnej długości . Jak wykazały badania, aktywność

analizowanych pochodnych genisteiny rosła wraz z wydłużaniem łącznika. Jednocześnie

wstępne badania pochodnej ramnalowej z łącznikiem 3-węglowym (RAM-3) pokazały, że

związek ten, podobnie jak pochodna G21, destabilizował mikrotubule oraz wywoływał

aberracje wrzeciona podziałowego (dane niepublikowane). Przytoczone obserwacje

pozwalały sądzić, że RAM-3 działa, podobnie jak wcześniej badana pochodna G21, jako

struktura samodzielna i nie ulega rozpadowi w komórce.

W badaniach opisanych w niniejszej pracy doktorskiej skupiono się na ocenie

zdolności wybranych analogów genisteiny do hamowania EGFR oraz topoizomerazy II,

dwóch podstawowych celów molekularnych genisteiny, starając się wyjaśnić czy mogą one

być także celami nowych glikopochodnych genisteiny. Oczekiwano, że spośród badanych

pochodnych uda się wyselekcjonować związki, które wobec wymienionych celów

molekularnych wykazywałyby silniejszy efekt hamujący niż genisteina, i które w związku

z tym mogłyby mieć istotniejsze niż genisteina znaczenie w uczulaniu komórek

nowotworowych na działanie promieniowania jonizującego.

Spośród rozmaitych pochodnych genisteiny zsyntetyzowanych przez zespół

kierowany przez prof. Wiesława Szeję do badań będących przedmiotem niniejszej pracy

doktorskiej wybrano te, które po analizie piśmiennictwa opisującego krytyczne cechy

chemiczne struktury pochodnych genisteiny decydujące o ich potencjalnie większej

aktywności względem wymienionych celów molekularnych oraz porównaniu tych danych

z wynikami badań zespołu, w którym pracuję, wydawały się najbardziej obiecujące. Dane

128

Page 129: 6.11.14 doktorat_final-final

z piśmiennictwa sugerowały, że aby modyfikowane cząsteczki genisteiny mogły efektywnie

hamować aktywność EGFR powinny zawierać niezmienioną grupę hydroksylową przy węglu

C-5 oraz nie posiadać dużego podstawnika przy grupie OH przy C-7 .

Z kolei nasze wstępne badania pokazały jednak, że pochodne genisteiny glikozylowane przy

węglu C-7 nie tracą aktywności inhibitorowej (Gruca, 2009, praca magisterska). Równolegle

prowadzone badania w zespole, w którym pracuję wykazały także, że podstawienie grupy

hydroksylowej genisteiny przy węglu C-4’ nie stanowi przeszkody dla zachowania przez

związek właściwości inhibitora topoizomerazy II (Siepetowska, 2011, praca magisterska),

jak początkowo sugerowano w piśmiennictwie . Podczas projektowania doświadczeń

niniejszej pracy miano jednak na uwadze wyniki opisane

w pracach , które pokazywały,

że efekty działania inhibitorów topoizomeraz obserwowane w warunkach bezkomórkowych

nie muszą przekładać się bezpośrednio na ich efekty komórkowe. Z tego powodu również

postanowiono otrzymane w testach bezkomórkowych wyniki zweryfikować w testach

w warunkach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych.

Oryginalne wyniki opisanych powyżej badań zespołu, do którego należę

spowodowały, że do analizy włączone zostały związki zmodyfikowane przy węglach C-7

oraz C-4’. Pochodne genisteiny zawierały grupę ramnalową przyłączaną do wymienionych

pozycji cząsteczki genisteiny wiązaniem O-glikozydowym poprzez łącznik o długości

2, 3, 4 lub 5 węgli. Na wybór pochodnych przeznaczonych do badań niniejszej pracy

doktorskiej miała wpływ także otrzymana na wczesnym etapie pracy informacja, że pochodna

RAM-3 może wykazywać stosunkowo słaby efekt cytotoksyczny wobec komórek

nowotworowych in vivo przy podaniu systemowym, natomiast znacznie silniejszy efekt

cytotoksyczny uzyskuje się przy podaniu doguzowym (Joanna Wietrzyk, dane

niepublikowane). Przyczyny braku skutecznego cytotoksycznego działania RAM-3 in vivo

są na razie nieznane, należało jednak wziąć pod uwagę między innymi to, że RAM-3 w czasie

wędrówki in vivo do miejsca objętego zmianą nowotworową może być hydrolizowany, ulegać

przemianom metabolicznym lub nie być efektywnie dostarczany z krwioobiegu do komórek

nowotworowych. W celu zwiększenia trwałości glikokoniugatów genisteiny in vivo

wydawało się istotne zaproponowanie syntezy pochodnych, w których wiązanie

O-glikozydowe zastąpiono by wiązaniem C-glikozydowym, które nie ulega hydrolizie.

Ponieważ dla analogów O-glikozydowych RAM-3 oraz G21 obserwowano w badaniach

wstępnych poprawę właściwości radiouczulających w porównaniu do genisteiny (Gruca,

129

Page 130: 6.11.14 doktorat_final-final

2009, praca magisterska), oczekiwano, że analogi C-glikozydowe również będą skutecznymi

związkami uczulającymi komórki nowotworowe na działanie promieniowania jonizującego.

Ostatecznie w niniejszej pracy doktorskiej badaniami objęto następujące pochodne

O-glikozydowe genisteiny: RAM-2, RAM-3, RAM-5, RAM-2’, RAM-3’, RAM-5’, pochodne

C-glikozydowe: RAM-C-3α, RAM-C-4α oraz RAM-C-5α oraz związek referencyjny, którego

właściwości poznano wcześniej: G21. Struktura wymienionych pochodnych przedstawiona

została w tabelach III-1 oraz IV-1.

V.1. Zdolność pochodnych genisteiny do hamowania aktywności EGFR

Jak opisano szerzej w rozdziale „Wstęp” (podrozdział I.1) najczęściej wymienianymi

w piśmiennictwie mechanizmami, które w wyniku modulowania przez genisteinę potęgują

efekty działania promieniowania jonizującego jest hamowanie szeregu komórkowych

szlaków sygnałowych, w tym ścieżek zależnych od kinaz tyrozynowych. Ponieważ wstępne

dane uzyskane przeze mnie w czasie wykonywania pracy magisterskiej wskazywały,

że glikokoniugaty genisteiny mogą hamować aktywność EGFR, głównym celem pracy

doktorskiej była próba wyselekcjonowania nowej pochodnej genisteiny, która wykazywałaby

silny efekt hamujący aktywność tej kinazy tyrozynowej. Jak wielokrotnie podkreślano

w niniejszej pracy, EGFR jest szczególnie istotnym celem dla wielu terapeutyków, a jego

hiperaktywacja jest jednym z najważniejszych mechanizmów nowotworowej radiooporności

(„Wstęp” podrozdział I.2.3).

Ponieważ ujawnienie się kinazowej aktywności EGFR wymaga, aby reszty tyrozynowe

w domenie kinazowej zostały autofosforylowane, jako metodę badawczą pozwalającą wykryć

czy pochodne genisteiny blokują fosforylację białka, w niniejszej pracy zastosowano technikę

„western blot”. Metoda ta pozwala wykrywać poszczególne fosforylowane formy EGFR przy

użyciu wysoce swoistych przeciwciał, a także określać ich poziom w badanych warunkach.

Należy przy tym zauważyć, że testowane w poniższej pracy miejsca fosforylacji EGFR,

a mianowicie przy tyrozynach 1068 oraz 1173, uruchamiają ścieżki sygnałowe MAPK oraz

AKT warunkujące komórkową radiooporność zależną od EGFR , są też preferencyjnie

wybierane do badań z wykorzystaniem promieniowania jonizującego , a w ostatnich

badaniach dowiedziono, że profil fosforylacji przy tyrozynie 1068 może być potencjalnym

markerem prognostycznym w ocenie odpowiedzi klinicznej na leczenie inhibitorami EGFR .

Jak pokazano w rozdziale „Wyniki” dla pochodnej RAM-5 obserwowano równoczesne

zahamowanie poziomu fosforylacji (zahamowanie aktywności) EGFR oraz zahamowanie

130

Page 131: 6.11.14 doktorat_final-final

przeżycia komórek nowotworowych obu linii DU145 oraz HCT116 w teście klonogenności

zarówno w warunkach, w których pochodną stosowano samodzielnie, jak i w przypadku

komórek poddanych działaniu promieniowania jonizującego. Równocześnie stopień

obniżenia poziomu pEGFR oraz zahamowanie wzrostu komórek były znaczne i zależne

od stężenia, dlatego można wnioskować, że efekt antyproliferacyjny osiągany

po zastosowaniu RAM-5 jest związany ze zdolnością tej pochodnej do hamowania

aktywności EGFR. Należy również zauważyć, że pochodna ta obniżała również poziom

pAKT oraz pERK 1/2, co dodatkowo daje podstawy sądzić, że RAM-5 skutecznie hamuje

ścieżkę sygnałową zależną od EGFR. Problematyka ta będzie dyskutowana w dalszej części

podrozdziału.

Mechanizm działania pochodnej G21 został już uprzednio opisany w pracach (Gogler-

Pigłowska et al., 2012, Rusin et al., 2009), można jednak zauważyć, że w linii HCT116

obserwuje się równoczesne znaczne obniżenie przeżycia klonogennego i spadek poziomu

pEGFR. Wydaje się jednak, że mechanizm radiouczulania wywoływany przez ten związek

jest jedynie częściowo związany z jego wpływem na poziom pEGFR, a zależy w większym

stopniu od jego zdolności antymitotycznych.

O ile w przypadku wariantu doświadczeń, w których testowano związki w terapii

samodzielnej (nie stosowano promieniowania jonizującego) można zauważyć równoczesne

obniżenie potencjału klonogennego komórek nowotworowych obu linii oraz obniżenie

poziomu pEGFR po zastosowaniu pochodnych ramnalowych podstawionych przy węglu C-7

(RAM-3, RAM-C-4α, RAM-C-5α), a stopień obniżania wzrostu komórek wydaje

się korelować ze stopniem zahamowania aktywacji EGFR, o tyle podobnych efektów

nie obserwuje się bądź obserwuje się w znacznie mniej wyraźnej zależności w wariantach

doświadczalnych, w których stosowano kombinację tych związków i promieniowania

jonizującego. Szczególnie w linii DU145 wymienione pochodne znacznie słabiej hamują

fosforylację EGFR przy Tyr 1068 lub nie wywołują zahamowania fosforylacji

przy tej tyrozynie (dla porównania RAM-5 obniża poziom pEGFR-Tyr1068 do poziomu

komórek kontrolnych). Niemniej jednak, pochodne podstawione przy C-7 wykazują zdolność

do obniżania fosforylacji przy Tyr 1173 przynajmniej do poziomu komórek kontrolnych

(nienapromienionych oraz nietraktowanych pochodnymi). Należy również zauważyć, że efekt

zahamowania wzrostu klonogennego przez omawiane związki w komórkach

napromienionych obu linii jest znaczący, a otrzymywane efekty łączenia terapii

są synergistyczne przy ED75 i ED90 (za wyjątkiem RAM-3 w linii HCT116, dla którego przy

ED75 otrzymuje się efekt addytywny). Być może zdolność do obniżania fosforylacji EGFR

131

Page 132: 6.11.14 doktorat_final-final

indukowanej IR tylko w miejscu fosforylacji przy tyrozynie 1173 wpływa w pewnym stopniu

na zahamowanie wzrostu komórek DU145, wydaje się jednak, że za powstawanie efektu

antyproliferacyjnego muszą być odpowiedzialne również inne procesy. Należy zauważyć,

że wszystkie pochodne ramnalowe podstawione przy węglu C-7 wywołują blokadę cyklu

komórkowego w radiowrażliwej fazie G2/M (szerzej omówiono tę tematykę w podrozdziale

V.3), możliwe więc, że końcowy efekt antyproliferacyjny obserwowany w teście

klonogennym jest sumą wymienionych mechanizmów działania tych pochodnych. Możliwe,

że istnieje jeszcze inny dotychczas niepoznany mechanizm działania tych związków.

Dla pozostałych pochodnych trudne bądź niemożliwe było znalezienie zależności

pomiędzy poziomem pEGFR a potencjałem klonogennym komórek nowotworowych.

Pochodne podstawione przy węglu C-4’ skutecznie ograniczały proliferację napromienionych

komórek nowotworowych i pozwalały na osiągnięcie znaczących efektów synergistycznych

szczególnie w przypadku komórek DU145, jednak nie obniżały poziomu testowanych form

pEGFR. Mechanizm działania tych pochodnych musi być niezależny od EGFR. Złożoność

tej problematyki będzie dyskutowana w dalszej części rozdziału.

Dyskutując przedstawione powyżej wyniki badań należy pamiętać o istotnej różnicy

pomiędzy komórkami DU145 i HCT116 w odniesieniu do statusu ścieżki przekazywania

sygnału zależnego od EGFR. W komórkach linii DU145 aktywacja EGFR uruchamia przekaz

prożyciowego sygnału, tak więc zahamowanie aktywacji (fosforylacji w domenie kinazowej)

EGFR hamuje proliferację tych komórek. Przykładem może być hamowanie proliferacji

komórek DU145 przez cetuksymab czy erlotynib

i gefitynib . Z inną sytuacją mamy do czynienia w przypadku komórek linii HCT116 (Rycina

V.1). Komórki tej linii mają aktywującą mutację

w 13 kodonie genu K-RAS . Białko K-RAS jest elementem ścieżki sygnałowej zależnej od

EGFR i znajduje się na tej ścieżce poniżej EGFR. Aktywujące mutacje genu K-RAS

powodują, że ścieżka ta, przekazująca sygnał prożyciowy, jest aktywna konstytutywnie także,

jeśli na komórki działa się inhibitorami EGFR . Komórki linii HCT116 mają także mutację w

genie kodującym inne białko znajdujące

się na prożyciowej ścieżce przekazywania sygnału zależnej od EGFR, a mianowicie w genie

kodującym kinazę PI3K. Obecna w komórkach HCT116 mutacja H1047R w 20 eksonie genu

kodującym domenę kinazową białka powoduje, że zmutowana kinaza wywołuje stałą

aktywność ścieżki sygnałowej, niezależnie od statusu EGFR . Stąd, aktywujące mutacje w

genie K-RAS oraz genie PIK3CA są przyczyną nieefektywności stosowania inhibitorów

132

Page 133: 6.11.14 doktorat_final-final

EGFR w leczeniu nowotworów . Zablokowanie obu ścieżek równocześnie mogłoby zatem w

znaczącym stopniu poprawić wynik terapeutyczny .

Jeżeli zatem niektóre z testowanych pochodnych genisteiny hamowały proliferację

komórek HCT116 i jednocześnie blokowały ścieżkę sygnałową zależną od EGFR poniżej

K-RAS oraz PI3K to, jak można przypuszczać, mogły one blokować przekaz sygnału

działając na inne cele molekularne. W badaniach niniejszej pracy pokazano, że pochodna

RAM-5 hamuje przepływ sygnału znacznie poniżej EGFR, a mianowicie na poziomie kinazy

ERK 1/2 oraz kinazy AKT. Wpływ tej pochodnej na szlak przekazu sygnału zależny

od EGFR przedstawiono schematycznie na rycinie V.1 (wyróżniono kolorem zielonym).

W literaturze wielokrotnie pokazano, że pod wpływem promieniowania jonizującego

aktywacji ulegają kinazy AKT oraz ERK 1/2, które przekazując prożyciowe sygnały

dojądrowe uruchamiają mechanizmy chroniące komórki przed toksycznymi efektami

promieniowania. Aktywacja wymienionych kinaz może promować uwolnienie regulatorów

parakrynnych (np. hereguliny), wtórnie aktywujących receptory z rodziny ERBB

w komórkach poddanych działaniu promieniowania jonizującego. Tym samym aktywacja

kinaz AKT oraz ERK 1/2 może prowadzić do indukcji oporności komórek nowotworowych

na działanie inhibitorów EGFR i sprzyjać proliferacji komórek nowotworowych . Ze względu

na ujawnione w niniejszej pracy doktorskiej właściwości RAM-5 postanowiono, w ramach

badań dodatkowych prowadzonych w innym projekcie, sprawdzić wpływ pochodnej RAM-5

w kombinacji z promieniowaniem jonizującym na aktywność kinaz AKT oraz ERK 1/2 w

komórkach linii HCT116

(Gruca et al., 2014, publikacja wstępnie zaakceptowana do druku). Ograniczając się jedynie

do zbadania pochodnej RAM-5, jako wykazującej najsilniejszy efekt na ścieżki zależne

od EGFR, wykazano, że w przeciwieństwie do genisteiny, RAM-5 wywołuje istotny spadek

indukowanej promieniowaniem jonizującym fosforylacji ERK 1/2 oraz AKT. RAM-5

w stężeniu 5 μM obniżał poziom pAKT o około 2/3 w porównaniu do kontroli i o połowę

poziom pERK 1/2 w napromienionych komórkach HCT116 (Gruca et al., 2014, publikacja

wstępnie zaakceptowana do druku).

133

Page 134: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina V.1. Mutacje aktywujące w genach K-RAS oraz PI3KCA kodujących białka należące do ścieżki przekazywania sygnału zależnej od EGFR. Mutacje te obecne w komórkach linii HCT116 wywołują konstytutywną aktywność dwóch ścieżek zależnych od EGFR niezależnie od statusu fosforylacji EGFR. Na rysunku zaznaczono efekt działania pochodnej RAM-5 (wyróżniono kolorem zielonym) na białka, których aktywność ten związek hamuje w komórkach HCT116. Jak pokazano na rysunku, RAM-5 wywołuje zahamowanie sygnału biegnącego poniżej konstytutywnie aktywnych białek RAS oraz PI3K. Obraz pobrano z pracy (Metha, 2012), zmodyfikowano.

Powyższe właściwości wielokierunkowego, hamującego działania w odniesieniu

do elementów ścieżek przekazywania sygnału zależnych od EGFR powodują, że pochodna

RAM-5 staje się szczególnie interesującym kandydatem na lek o potencjalnym zastosowaniu

w kombinacji z innymi chemoterapeutykami lub promieniowaniem jonizującym. Ostatnio

opublikowane dane wskazują, że, istotnie, stosowanie łączne inhibitorów EGFR (cetuksymab)

oraz inhibitorów MAPK i AKT (BAY 86-9766) wywołuje znacznie silniejszy efekt

przeciwnowotworowy niż stosowanie wymienionych inhibitorów oddzielnie . Powyższe

badania prowadzone były na modelu myszy nagich obarczonych nowotworem powstałym z

implantacji komórek nowotworowych kilku linii, w tym HCT116 wywodzących się z raka

jelita grubego. W innych badaniach pokazano, że hamowanie równocześnie ścieżek RAF-

MEK-ERK i PI3K-AKT ma szczególnie istotne znaczenie w znoszeniu radiooporności

komórek nowotworowych. W badaniach tej pracy pokazano, że hamowanie aktywności tylko

jednej z wymienionych ścieżek prowadzi

134

Page 135: 6.11.14 doktorat_final-final

do kompensacyjnej aktywacji drugiej w komórkach różnych typów nowotworów pochodzenia

nabłonkowego. W świetle powyższych wyników związek RAM-5 zdolny do równoczesnego

hamowania dwóch tak istotnych ścieżek prożyciowych determinujących komórkową

radiooporność, staje się szczególnie interesujący jako potencjalny radiouczulacz.

Należy także wspomnieć, że jakkolwiek obecność mutacji w 12 i 13 kodonie genu

KRAS uważana jest za czynnik decydujący o nieefektywności leczenia chorych

z nowotworem jelita grubego na działanie inhibitorów EGFR (np. cetuksymab,

panitumumab), to najnowsze badania sugerują, że u niektórych chorych z mutacją w kodonie

13 (G13D) inhibitory EGFR mogą hamować wzrost nowotworu .

W wymienionej pracy wykazano także, że komórki linii HCT116 mające mutację G13D

są częściowo wrażliwe na działanie panitumumabu i cetuksymabu. Obserwacja ta wydaje się

być zgodna z wynikami badań niniejszej pracy doktorskiej, w których wykazano,

że niektóre pochodne genisteiny także hamują proliferację wymienionych komórek.

V.2. Zdolność pochodnych genisteiny do hamowania aktywności TOPO II

Drugim aspektem badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej było

sprawdzenie czy i w jakim stopniu nowe pochodne genisteiny mogą modyfikować aktywność

topoizomerazy II, ugruntowanego w literaturze celu molekularnego genisteiny. Pożądaną

właściwością pochodnych o potencjalnym znaczeniu, jako związki przeciwnowotworowe

byłby silniejszy niż obserwowany dla genisteiny efekt blokowania aktywności TOPO II.

Jak opisano szerzej w rozdziale „Wstęp” (podrozdział I.2.7) genisteina należy do klasy

inhibitorów topoizomerazy II klasyfikowanych jako „trucizny” tego enzymu. Do tej klasy

inhibitorów należy także etopozyd stosowany w badaniach niniejszej pracy jako związek

kontrolny. Genisteina, podobnie jak używany w klinice etopozyd, wiąże się niekowalencyjnie

z kompleksem DNA-topoizomeraza II, uniemożliwiając zajście ligacji przeciętych

fragmentów DNA. Zablokowanie etapu ligacji skutkuje gromadzeniem uszkodzeń DNA typu

pojedynczych i podwójnych pęknięć, zablokowaniem podziałów komórkowych (blok w fazie

G2/M) i może powodować śmierć komórek . W porównaniu do etopozydu, genisteina

wywołuje jednak słabszy efekt cytotoksyczny

i genotoksyczny ,

co tłumaczy się krótszym czasem trwania kompleksów enzym-DNA po zastosowaniu

izoflawonu.

135

Page 136: 6.11.14 doktorat_final-final

Radiouczulający wpływ inhibitorów topoizomerazy II, w tym półsyntetycznego

związku GL331 wykazano w komórkach ludzkiego glejaka oraz etopozydu w komórkach

raka płuca (Kim et al., 2002). Z danych z piśmiennictwa wynika,

że genisteina jest wydajnym inhibitorem topoizomerazy II, wykazuje nieco silniejsze

działanie w stosunku do formy TOPO II β niż TOPO I . Ostatnio także pojawiła się praca, w

której sugerowano, że genisteina może hamować proliferację komórek HCT116 w

mechanizmie zależnym od blokowania aktywności topoizomerazy II . W opublikowanych

niedawno badaniach zespołu, do którego należę wykazano, że w komórkach DU145 nie tylko

genisteina, ale także pochodna G21 hamują aktywność topoizomerazy II . Także wyniki

badań naszego zespołu wskazywały, że również inne glikopochodne mogą hamować (w

testach bezkomórkowych) aktywność topoizomerazy II (Siepetowska, 2011, praca

magisterska).

Ponieważ właściwości radiouczulające genisteiny są znane i, jak się sądzi, mogą

przynajmniej częściowo wiązać się z hamowaniem przez ten związek aktywności TOPO II,

można było oczekiwać, że niektóre z badanych w niniejszej pracy pochodnych tego

izoflawonu będą wykazywały silniejszy efekt hamujący aktywność TOPO II niż genisteina

i być może także silniejszy efekt radiouczulający.

W badaniach niniejszej pracy wpływ pochodnych genisteiny na aktywność

topoizomerazy II analizowano stosując test „immunoband depletion”, który pozwala mierzyć

poziom aktywności tego enzymu wyrażony poziomem jego związania z DNA w komórkach.

W wymienionym teście po elektroforetycznym frakcjonowaniu w żelu poliakrylamidowym

białek wyizolowanych z komórek traktowanych testowanymi związkami określa się poziom

topoizomerazy II niezwiązanej kowalencyjne z DNA, a więc potencjalnie aktywnej. Metoda

ta jest podobna do zastosowanej wcześniej przez inny zespół . W cytowanych pracach po

wirowaniu poprzez warstwę chlorku cezu lizatów komórek traktowanych genisteiną poziom

TOPO II kowalencyjnie związanej

z DNA oceniano za pomocą metody „slot blot”. Metoda stosowana w badaniach niniejszej

pracy jest oceniana jako bardziej czuła, ponieważ frakcjonowanie białek przed

immuodetekcją topoizomerazy II zmniejsza możliwość powstania fałszywie dodatnich

wyników, które w teście „slot blot” mogą pojawiać się jako efekt reakcji krzyżowych użytych

przeciwciał. Jednocześnie, w odróżnieniu od oznaczeń aktywności TOPO II prowadzonych

w układzie bezkomórkowym, test „immunoband depletion” powinien w bardziej

wiarygodnym stopniu oceniać status tego enzymu w komórkach nowotworowych. Należy

wspomnieć, że zastosowana w niniejszych badaniach technika wykazała, że pochodne

136

Page 137: 6.11.14 doktorat_final-final

z podstawioną grupą OH przy węglu C-4’ genisteiny nie mają właściwości hamowania

aktywności topoizomerazy II zarówno w komórkach DU145 jak i HCT116, natomiast

w badaniach z użyciem testów bezkomórkowych taka aktywność była obserwowana

(Siepetowska, 2011, praca magisterska).

Jak wykazano w niniejszej pracy doktorskiej spośród badanych pochodnych genisteiny

jedynie RAM-5 oraz G21 powodowały istotny spadek zawartości niezwiązanej formy

topoizomerazy II, co może wskazywać na zdolność tych analogów do hamowania aktywności

TOPO II na etapie ligacji przeciętych łańcuchów. Hamowanie aktywności topoizomerazy II

przez RAM-5 obserwowano dla obu badanych linii komórkowych, natomiast efekt hamujący

pochodnej G21 był słabszy w komórkach HCT116. Należy zauważyć, że dla takich samych

stężeń pochodnych RAM-5 i G21 obserwuje się podobny stopień hamowania aktywności

topoizomerazy II.

Jedną z interesujących obserwacji niniejszej pracy jest wykazanie, że pochodna RAM-5

hamuje aktywność topoizomerazy II przy stężeniu niższym niż stosowany klinicznie etopozyd

(odpowiednio 5μM i 10μM versus 25μM i 50μM). Jednocześnie pochodne RAM-5 i G21

hamują aktywność topoizomerazy II przy co najmniej 10 krotnie niższych stężeniach

niż genisteina. Wyniki uzyskane w niniejszej pracy dla genisteiny dotyczące jej zdolności

do hamowania TOPO II są zgodne z wynikami opublikowanymi ostatnio (Mizushina et al.,

2013).

Należy zaznaczyć, że chociaż większość badanych w niniejszej pracy doktorskiej

pochodnych genisteiny nie wykazywała cech trucizny topoizomerazy II, a więc działającej

według mechanizmu przypisywanego genisteinie, to a priori nie można założyć,

że nie hamują one aktywności tego enzymu na innych etapach działania topoizomerazy II.

Inhibitory topoizomerazy II stosowane jako potencjalne związki radiouczulające

zatrzymują proliferację komórek głównie, jak się sądzi, poprzez zatrzymanie cyklu

komórkowego w fazie G2/M (Mizushina et al., 2013, . W naszych wcześniejszych badaniach

wykazaliśmy, że inkubowanie komórek HCT116

z pochodną G21 (Rusin et al., 2009) lub RAM-5 (Rusin et al., 2011) powoduje wzrost puli

komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym w fazie G2/M. Nie jest jednak jasne skąd

biegnie sygnał do zatrzymania cyklu w tej fazie po zastosowaniu RAM-5, a mianowicie

czy spowodowany jest uszkodzeniem DNA w wyniku zahamowania aktywności

topoizomeraz, czy też spowodowany uszkodzeniem elementów wrzeciona podziałowego,

jak to ma miejsce w przypadku G21, czy mechanizm działania RAM-5 jest całkiem

odmienny, ponieważ takie badania nie były do tej pory prowadzone. Można sądzić,

137

Page 138: 6.11.14 doktorat_final-final

że zwiększona pula komórek zatrzymanych w fazie G2/M pod pływem działania RAM-5 jest

raczej wynikiem zahamowania aktywności topoizomerazy II. Wniosek ten oparty jest

na obserwacjach poczynionych dla innej pochodnej, a mianowicie RAM-3, która powoduje

aberracje wrzeciona podziałowego, jakkolwiek słabiej niż G21 (Rusin et al., 2011),

ale nie jest zbyt efektywnym inhibitorem topoizomerazy II (niniejsza praca doktorska).

Dla RAM-3 obserwuje się silniejszy blok komórek w fazie G2/M niż w przypadku pochodnej

RAM-5. Tematyka wpływu pochodnych genisteiny na cykl komórkowy będzie szerzej

dyskutowana w dalszej części rozdziału (podrozdział V.3). W celu określenia czy RAM-5

wywołuje w komórkach nowotworowych podwójne pęknięcia DNA bądź powoduje aberracje

wrzeciona podziałowego niezbędne są dalsze analizy.

V.3. Radiouczulające właściwości badanych związków

Wstępne dane wskazujące, że niektóre pochodne genisteiny mogą zwiększać

antyproliferacyjny efekt promieniowania jonizującego w sposób synergistyczny otrzymano

badając pochodne G21 i RAM-3 (Gruca, 2009, praca magisterska). Jednocześnie

na podstawie otrzymanych wyników można było sądzić, że co najmniej częściowo efekt

ten wynika z obniżania aktywności EGFR. Kontynuując badania w ramach niniejszej pracy

doktorskiej wykazano, że kombinacja genisteiny z promieniowaniem jonizującym generuje

efekty słabo antagonistyczne bądź addytywne w liniach komórkowych HCT116 oraz DU145,

podczas gdy niektóre z badanych nowych pochodnych w kombinacji z promieniowaniem

wywołują, zgodnie z oczekiwaniem, efekty synergistyczne.

Badania niniejszej pracy doktorskiej pokazały, że w układzie in vitro niektóre nowe

ramnalowe pochodne genisteiny uczulają komórki HCT116 i DU145 na działanie

promieniowania jonizującego, a jednocześnie kilka z nich wywołuje efekt synergistyczny.

Pochodnymi wywołującymi efekty synergistyczne już przy ED50 (wartości indeksu

kombinacji CI w zakresie 0.5 - 0.8) były:

wobec komórek HCT116: G21 (CI = 0.7 ± 0.2) i RAM-5 (CI = 0.8 ± 0.2),

wobec komórek DU145: RAM-5 (CI = 0.7 ± 0.1) i RAM-2’ (CI = 0.5 ± 0.1).

W przypadku komórek linii HCT116 większość pochodnych powodowała

powstawanie efektu synergistycznego dopiero przy ED75 i ED90. W przypadku komórek linii

DU145 wszystkie badane pochodne przy ED75 i ED90 w kombinacji z IR wywoływały

synergizm (CI w zakresie 0.5 - 0.8 dla ED50) lub bardzo silny synergizm (CI w zakresie

0.2 - 0.4).

138

Page 139: 6.11.14 doktorat_final-final

Jak wykazano w niniejszej pracy jedyną pochodną, która działała synergistycznie

z promieniowaniem zarówno w komórkach HCT116 jak i DU145 już przy ED50 była

pochodna RAM-5. Wartość IC50 dla tej pochodnej w przypadku komórek HCT116 wynosi

około 6 μM, a dla komórek DU145 około 11-12 μM, natomiast wartości CI obserwowane

przy ED50 dla komórek obu linii są podobne (około 0.8 dla HCT116 i 0.7 dla DU45).

Pochodna ta okazała się być także jedynym z badanych związków, który hamował zarówno

aktywność EGFR, AKT, ERK 1/2 oraz topoizomerazy II w komórkach obu badanych linii

w stężeniu 5 μM.

Jeśli porówna się właściwość uczulania komórek na toksyczne działanie

promieniowania jonizującego przez badane pochodne z ich samodzielną cytotoksycznością,

nie obserwuje się klarownych zależności pomiędzy efektem synergistycznym a IC50.

Dla przykładu w przypadku komórek DU145 pochodna RAM-3’ wywoływała słaby efekt

synergistyczny (IC50 około 19 μM; CI przy ED50 około 0.9), podczas gdy efektu

synergistycznego nie obserwowano dla pochodnej G21, która działa antyproliferacyjnie

w stężeniach znacznie niższych (IC50 około 3 μM; CI dla ED50 około 1.1). Podobnie,

w przypadku tych samych komórek pochodna RAM-5 (IC50 około 11 μM; CI około 0.7)

wykazywała silniejszy efekt synergistyczny niż pochodna o niższej wartości IC50 – RAM-4α

(IC50 około 3.8; CI około 0.9). Jak pokazały wyniki badań wielkość uzyskanego efektu

zależała od linii komórkowej i efekt ten był znacznie wyraźniejszy w przypadku linii DU145.

O ile w przypadku pochodnych hamujących cykl komórkowy w fazie G2/M efekt

zwiększania cytotoksyczności promieniowania jonizującego można wytłumaczyć

zwiększaniem przez nie puli komórek w najbardziej radiowrażliwej fazie cyklu, to nieco

trudniej wyjaśnić dlaczego związki zwiększające pulę komórek znajdujących się w fazie G1

także wykazują efekt radiouczulający. Co ciekawe, pochodne hamujące cykl komórkowy

w fazie G1, to pochodne z podstawioną grupą OH przy węglu C-4’ genisteiny, które,

jak pokazują wyniki niniejszej pracy, nie hamują aktywności EGFR, AKT, pERK 1/2

czy topoizomerazy II, dlatego też trudny jest do wyjaśnienia mechanizm radiouczulania tych

związków. Należy zaznaczyć, że, jak wielokrotnie pokazano w literaturze, najbardziej

radiowrażliwymi fazami cyklu komórkowego są fazy G2/M oraz późna faza G1. Największą

radiooporność wykazują komórki w fazie S . Możliwe więc, że związki podstawione przy

węglu C-4’ umożliwiają zatem zahamowanie progresji cyklu również w fazie o dużej

promienioczułości, wymaga

to jednak dalszych analiz.

139

Page 140: 6.11.14 doktorat_final-final

Podsumowując, do pochodnych blokujących cykl komórkowy w fazie G2/M zalicza

się związki podstawione przy C-7: G21, RAM-3 oraz RAM-5 (Rusin et al., 2009, Rusin et al.,

2011) oraz pochodne z wiązaniem C-glikozydowym RAM-C-4α oraz RAM-C-5α

(Rusin et al., 2014). Pochodne hamujące cykl komórkowy w fazie G1 to pochodne

podstawione przy węglu C-4’: RAM-2’, RAM-3’ oraz RAM-5’ (Byczek et al., 2013). Poniżej

zamieszczono tabelę zawierającą informacje uzyskane na podstawie analizy cytometrycznej

(Tabela V-1). Wyniki przedstawione w pierwszej kolumnie (0 h) zostały uprzednio

przedstawione w cytowanych powyżej pracach, podczas gdy dane z drugiej kolumny

(24 h „recovery”) są wynikami dotychczas niepublikowanymi uzyskanymi przeze mnie

w badaniach prowadzonych w ramach innego projektu.

Tabela V-1. Tabela przedstawiająca wpływ testowanych związków na cykl komórkowych. W pierwszym przypadku cykl komórkowy analizowano zaraz po usunięciu związków z pożywki, w drugim po 24 godzinach „recovery”. B. Graficzne przedstawienie wpływu związków na cykl komórkowy (bez „recovery”). Obraz zaczerpnięto z pracy (Byczek et al., 2013), zmodyfikowano.

Badany związek 0h 24 h

„recovery”GENISTEINA G2/M G2/M

G21 G2/M G2/MRAM-3 G2/M G1RAM-5 G2/M G1

RAM-C-4α G2/M G1RAM-C-5α G2/M G1

RAM-2' G1 G1RAM-3' G1 G1RAM-5' G1 G1

Powyższa tabela pokazuje, że zatrzymanie cyklu komórkowego jest trwałe i utrzymuje

się po 24 h od usunięcia testowanych związków z pożywki. W przypadku związków RAM-3,

RAM-5, RAM-C-4α oraz RAM-C-5α zauważono, ze po 24 godzinach od usunięcia związków

z pożywki dochodzi do zmiany obrazu cyklu komórkowego, w dalszym ciągu obserwowany

jest jednak blok cyklu, jednak w innej fazie (G2/M G1). Nieznane są przyczyny tego

zjawiska, wymaga ono dalszej analizy.

Warte podkreślenia jest, że wśród analogów genisteiny testowanych przez inne grupy

badawcze znajdują się również takie związki, które hamują cykl komórkowy w innej

niż struktura wiodąca fazie, a mianowicie w fazie G1. Jako przykład można podać pochodną

dFMGEN (ang. 7-difluoromethyl-5,4'-dimethoxygenistein), która wywołuje obniżenie

140

Page 141: 6.11.14 doktorat_final-final

poziomu CDK4 oraz cykliny D1 spowodowane wzrostem poziomu inhibitorów CDK, w tym

p15, p21 oraz p27 (Pent et al., 2013).

Do tej pory nie jest znany mechanizm wyjaśniający dlaczego testowane związki

wykazują zdolność hamowania cyklu w różnych fazach. Z drugiej strony wpływ struktury

izoflawonów na obraz cyklu komórkowego był przedmiotem wielu prowadzonych dotychczas

badań. W pracy Casagrande & Darbon (2001) jako cechę krytyczną odpowiadającą

za zahamowanie cyklu komórkowego w określonym punkcie kontrolnym cyklu wskazuje

się obecność bądź brak grupy hydroksylowej w pozycji C-3’ pierścienia B. Występowanie

w tym miejscu grupy OH (kwercetyna i luteolina) wskazano jako cechę odpowiadającą

za blokowanie cyklu w fazie G1, podczas gdy brak grupy OH w tej pozycji (kaempferol oraz

apigenina) – w fazie G2. Badania przedstawione w pracy pokazały jednak, że również inne

właściwości strukturalne muszą być odpowiedzialne za blokadę cyklu w G1. Badana w tej

pracy tangeretyna pomimo braku grupy hydroksylowej przy C-3’ wywoływała blokadę cyklu

w fazie G1. W piśmiennictwie wskazywano również na istnienie zależności pomiędzy

obecnością bądź brakiem grupy OH przy węglu C-5, a wpływem związku na obraz cyklu

komórkowego (Aguero et al., 2005). Daidzeina, w której strukturze w pozycji C-5

nie występuje grupa OH wywołuje blokadę cyklu w G1, natomiast genisteina, w której

strukturze występuje grupa OH w tym miejscu powoduje zahamowanie progresji cyklu

w fazie G2/M. Jak się jednak okazuje opisane powyżej cechy strukturalne nie są jedynymi,

które decydują o obrazie cyklu komórkowego po zastosowaniu związku należącego do grupy

izoflawonów. Fenoksodiol, syntetyczny izoflawon nieposiadający OH przy C-5 również

blokuje cykl komórkowy w G1 , a badania prowadzone przez zespół,

do którego należę potwierdzają złożoność tej problematyki.

Pochodne genisteiny są związkami, w których strukturze, tak jak w genisteinie,

w miejscu C-5 występuje grupa OH, a w miejscu C-3’ brak jest grupy OH. Zgodnie

z powyższym powinny więc wywoływać blokadę cyklu w fazie G2. Wyniki badań zespołu,

do którego należę pokazują jednak, że radioizomeryczne podstawienie przy C-4’ oraz C-7

stanowi kluczowy regulator typu działania izoflawonoidów. Podstawienie genisteiny dużą

grupą przy C-4’ prowadzi do zablokowania cyklu komórkowego w fazie G1 (Byczek et al.,

2013), zaś podstawienie genisteiny przy C-7, z niemodyfikowanymi grupami

hydroksylowymi przy C-5 oraz C-4’, wywołuje zablokowanie cyklu w fazie G2/M (Rusin

et al, 2011, Rusin et al, 2013) bądź mitozie (Rusin et al., 2009). Badania pochodnych

genisteiny podstawionych w różnym miejscach w strukturze wiodącej umożliwiły

141

Page 142: 6.11.14 doktorat_final-final

nam scharakteryzowanie kolejnej cechy struktury cząsteczki izoflawonu decydującej

o jej wpływie na cykl komórkowy.

W licznych badaniach opisanych w dostępnym piśmiennictwie sprawdzano wpływ

genisteiny na ekspresję genów i aktywność białek kontrolujących cykl komórkowy,

a szczegółowe informacje na ten temat przedstawiono w rozdziale „Wstęp” (podrozdział

I.1.2). Zablokowanie cyklu komórkowego przez genisteinę oraz następująca apoptoza

są związane z aktywacją ścieżek odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W badaniach z użyciem

komórek nowotworowych jajnika HO-8910 pokazano, że genisteina wywołuje wzrost

fosforylacji i aktywacji różnych białek odpowiedzialnych za blokowanie komórek w G2/M, w

tym aktywację białek ATM oraz ATR oraz obniżenie fosforylacji AKT. W badaniach

prowadzonych równolegle w innym projekcie potwierdziłam zdolność genisteiny do

aktywowania kinazy ATM w linii komórkowej HCT116. Równocześnie pokazałam, jako

współautor cytowanej poniżej pracy, że genisteina zwiększa poziom białka p53, poziom jego

fosforylowanej przy serynie 15 formy, jak również zwiększa zawartości p21

w linii komórkowej HCT116 (Byczek et al., 2013). Wyniki te są zgodne z otrzymanymi

w innym zespole (Zhang et al., 2013), w którym pokazano, że genisteina indukuje

specyficzny blok cyklu w G2/M w procesie aktywacji krzyżowej (ang. cross talk) pomiędzy

ATM a p53/p21. Należy przy tym podkreślić, że w przypadku naszych badań

nie obserwowano wpływu związków podstawionych przy C-4’ i wywołujących blokadę cyklu

komórkowego w G1 na wymienione powyżej kluczowe regulatory cyklu komórkowego

(p21 czy p53). Ponieważ omawiane badania były prowadzone w czasie, kiedy nieznane były

wyniki analiz niniejszego projektu, wyselekcjonowany w poniższej pracy związek RAM-5 nie

był jeszcze badany pod tym kątem.

Pomimo, że dane, które uzyskaliśmy do tej pory są zbyt fragmentaryczne, aby w pełni

wyjaśnić mechanizm działania pochodnych podstawionych przy węglu C-4’, wykluczono

indukcję DSB przez te związki. Obserwacja indukcji autofagii może raczej sugerować,

że progresja cyklu komórkowego może być zatrzymywana z powodu niewydajnego

dostarczania substancji odżywczych do komórki. W komórkach, w których obserwuje

się stres metaboliczny progresja do fazy S jest zatrzymywana, a po długim okresie głodzenia

następuje autofagia. Wyniki otrzymane w zespole, w którym pracuję wskazują

na to, że podstawione przy C-4’ pochodne genisteiny indukowały autofagię manifestującą

się jako charakterystyczny pęcherzykowy wzór rozmieszczenia białka LC3 oraz znacząco

obniżona objętość cytoplazmy (Rusin, dane niepublikowane). Testowane pochodne promują

procesy kataboliczne, ale mechanizm nie jest znany. Wzór indukcji białek związanych

142

Page 143: 6.11.14 doktorat_final-final

z cyklem komórkowym: p53, p21, MDM-2 jest podobny do indukowanego przez AICAR,

związek naśladujący AMP (Zajkowicz et al., 2011), co sugeruje, że nowe pochodne

genisteiny mogą modulować funkcjonowanie maszynerii cyklu komórkowego poprzez ścieżki

związane z odżywianiem komórkowym.

Wyjaśnienie mechanizmu działania testowanych w niniejszej pracy związków

w odniesieniu do cyklu komórkowego wymaga dalszej analizy, ze szczególnym

uwzględnieniem wpływu ścieżek MAPK oraz AKT na obraz cyklu komórkowego.

W literaturze istnieją dane świadczące o tym, że jednym z istotnych w regulacji cyklu

komórkowego mechanizmów szczególne w fazach G1 oraz G2/M jest ścieżka sygnałowa

MAPK (Hatashita et al., 2014, Wang et al., 2014, Hseu et al., 2012) Równocześnie

z literatury (Kim et al., 2009) oraz doświadczeń własnych wiadomo, że genisteina

ma zdolność do regulowania ścieżek zależnych od MAPK. Należy tutaj wyjaśnić, że białka

należące do rodziny MAPK są pogrupowane w 4 subrodziny, a podział opiera się na różnych

aktywatorach tych białek. Do rodziny kinaz MAPK zalicza się: ERK 1/2, JNK/SAPK, p38

oraz ERK 5. W badaniach genisteiny na immortalizowanej linii komórek nabłonkowych

pokazano, że izoflawon aktywuje p38 MAPK oraz równocześnie inaktywuje kinazę ERK 1/2

(Frey, 2003). Zdolność genisteiny do aktywacji p38 MAPK została potwierdzona

w komórkach makrofagów w pracy . Co jednak ciekawe w pracy tej nie obserwowano zmian

w poziomie fosforylacji pozostałych białek z rodziny MAPK.

Dla porównania, w pracy wykazano, że genisteina może wywoływać blok cyklu

komórkowego nie na drodze inhibicji, ale przeciwnie – aktywacji ścieżki MAPK/ERK,

a konkretnie ERK 1/2 w linii nowotworowej piersi MDA-MB-231. W literaturze ścieżkę

MAPK najczęściej wiąże się z procesami odpowiedzialnymi za przeżycie komórki, jednak

jej znaczenie w cyklu komórkowym jest w dalszym ciągu niejasne. W pracy z

wykorzystaniem linii DU145 obserwowano dla porównania zależne

od stężenia izoflawonu obniżanie zawartości pERK 1/2. Możliwe, że wpływ genisteiny

na aktywność ERK 1/2 jest specyficzny względem linii komórkowej albo zależy

od zastosowanego stężenia związku. W pracy obserwowano, że genisteina w stężeniach do

12.5 μM aktywowała ERK, 1/2 podczas gdy w stężeniach wyższych

(50 i 100 μM) powodowała spadek poziomu pERK 1/2 w komórkach

RWPE-1 nietumorogennego nabłonka gruczołu krokowego.

W piśmiennictwie pokazano też, że zahamowanie PI3K/AKT oraz MEK/ERK aktywuje

czynniki transkrypcyjne FOXO będące supresorami nowotworowymi wywołującymi

zahamowanie progresji cyklu komórkowego oraz indukcję apoptozy (Burgering, 2008).

143

Page 144: 6.11.14 doktorat_final-final

FOXO są negatywnie regulowane poprzez fosforylację zależną od PKB/AKT. Równocześnie

w piśmiennictwie dostępne są dane pokazujące, że izoflawony sojowe są zdolne

do modulowana ekspresji genów z rodziny FOXO (przegląd prac w Mahmoud et al. (2014))

poprzez zahamowanie ekspresji MAPK w komórkach linii LNCaP, co wpływa na obniżenie

zależnej od MAPK fosforylacji FOXO i może wyjaśniać zdolność tych izoflawonów

do wywoływania wzrostu ekspresji genów zależnych od FOXO. Dodatkowo w pracy

Qu et al. (2011) pokazano, że genisteina hamuje zależną od EGF proliferację, co prowadzi

do defosforylacji i zatrzymywania czynnika transkrypcyjnego FOXO3 w jądrze komórkowym

komórek raka jelita, a zatem prowadzi do indukcji śmierci komórkowej. Genisteina hamowała

fosforylację FOXO3 poprzez ścieżkę PI3K/AKT (obniżanie poziomu pAKT).

Badania niniejszej pracy z wykorzystaniem linii DU145 oraz HCT116 nie miały

na celu wyjaśnienia mechanizmu, w którym poszczególne pochodne hamują cykl

komórkowy, dostarczyły jednak fragmentarycznych informacji i umożliwiły określenie

dalszych perspektyw badań. Trzeba zauważyć, że pomimo, że w przypadku genisteiny

hamującej cykl w G2/M (w stężeniach do 100 μM) nie obserwowano istotnego spadku

zawartości pERK 1/2 czy pAKT, to w przypadku pochodnej G21, która hamuje cykl

komórkowy w G2/M silniej niż genisteina, obserwowano zdolność do silniejszego obniżania

zawartości pERK 1/2 oraz pAKT. Podkreślenia wymaga również, że, blokowanie komórek

w fazie G2/M przez dwa powyżej wymienione związki zostało przez nas już wcześniej

powiązane z ich wpływem hamującym na aktywność topoizomerazy II oraz wywoływaniem

uszkodzeń DNA (genisteina) bądź wrzeciona podziałowego (G21). Właściwość obniżania

aktywności kinaz ERK 1/2 oraz AKT może zatem stanowić jedynie dodatkowy mechanizm,

częściowo jedynie wpływający na obserwowany efekt wywoływany przez testowane związki

na cykl komórkowy.

W przypadku pochodnej RAM-5, która najskuteczniej obniżała zawartość pERK 1/2

oraz pAKT również obserwowano zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G2/M

już w stężeniach 10 μM. Pochodne C-4’, hamujące cykl w fazie G1 nie wpływały

na zawartość pERK 1/2 bądź pAKT bądź w niektórych przypadkach wywoływały stymulację

aktywności tych białek. Być może efekt blokowania cyklu przez RAM-5 jest efektem

sumarycznym wynikającym ze zdolności tego związku do hamowania aktywności zarówno

TOPO II jak i ERK 1/2 i AKT. Na obecnym etapie badań nie jest możliwe wyjaśnienie

mechanizmu hamowania cyklu przez badane w niniejszej pracy pochodne. Regulacja cyklu

komórkowego jest procesem złożonym, dlatego mechanizmy prowadzące do gromadzenia

144

Page 145: 6.11.14 doktorat_final-final

komórek w jednej z dwóch faz cyklu G1 bądź G2/M po zastosowaniu poszczególnych

pochodnych należy poddać szczegółowej analizie w kolejnych badaniach.

V.4. Bezpieczeństwo stosowania pochodnych genisteiny w terapii

W literaturze liczne są dane opisujące jedną z podstawowych strategii

radioterapeutycznych prowadzącą do ograniczenia szkodliwości leczenia względem tkanek

zdrowych, a mianowicie włączenie do terapii związków umożliwiających obniżenie dawek

promieniowania przy zachowaniu pożądanego efektu terapeutycznego . W dalszym ciągu

niektóre substancje radiouczulające wywołują zróżnicowane efekty uboczne. Substancje

stosowane w klinice jako inhibitory EGFR wywołują biegunki oraz reakcje skórne .

Inhibitory aktywności topoizmoerazy II mogą wywoływać zahamowanie czynności szpiku

kostnego, toksyczność żołądkowo-jelitową, ryzyko uszkodzenia serca

i wtórnej białaczki .

W literaturze istnieją dane wskazujące na to, że również genisteina może być przyczyną

białaczek niemowlęcych i jest to czasem argument podnoszony przeciwko jej ewentualnemu

wdrożeniu do kliniki. Mając na uwadze powyższe dane postanowiono, w ramach innego,

niezależnego projektu wstępnie sprawdzić bezpieczeństwo stosowania pochodnej RAM-5. Ze

względu na przedstawione powyżej informacje oraz pokazaną w niniejszej pracy zdolność

RAM-5 do hamowania EGFR, do wstępnych testów MTT wybrano linię komórek

prawidłowych HaCaT (immortalizowane komórki naskórka). Linia ta, jak pokazano w

literaturze, jest zależna od EGFR i jest często wybieranym modelem do badań wpływu

różnorodnych związków na poziom ekspresji i aktywności EGFR .

Testy MTT pokazały, że RAM-5 nie wpływa na wzrost komórek prawidłowych

do stężenia ok. 20 μM (Gruca, dane niepublikowane), podczas gdy efekt terapeutyczny

w komórkach nowotworowych HCT116 oraz DU145 osiągany jest w stężeniu 4-krotnie

niższym (dane niniejszej pracy). IC50 związku jest co najmniej 4-krotnie wyższe w linii

prawidłowej komórek naskórka w porównaniu do tej wartości dla HCT116 i DU145

(5.9 ± 0.1 oraz 11 ± 2.0 odpowiednio, tabela V-1) i wynosi ok 40 μM. Dla porównania

te same badania pokazały, że pochodna G21 uszkadzająca wrzeciono podziałowe

w komórkach nowotworowych, w linii HaCaT wywoływała efekt cytotoksyczny

już w stężeniach 0.5 μM, (IC50 ok. 1.5μM), czyli takich, jak w przypadku komórek

nowotworowych, podczas gdy struktura wyjściowa, genisteina, działała hamująco na komórki

prawidłowe HaCaT dopiero w stężeniu 50 μM, (IC50 ok. 200 μM, co jest wartością

145

Page 146: 6.11.14 doktorat_final-final

6-7-krotnie wyższą niż w porównaniu do opisanych w poniższej pracy komórek

nowotworowych). Badania te mogą sugerować, że pochodna RAM-5 w stężeniu 5 μM

wykazuje selektywne działanie antyproliferacyjne w stosunku do linii nowotworowych.

Podobne wyniki opublikowano w pracy , w której pokazano, że inhibitor EGFR – AG1478

ma zdolność do hamowania proliferacji linii nowotworowej HSC-1 (raka

płaskonabłonkowego skóry), ale nie hamuje proliferacji HaCaT, co, jak sugerowano, może

świadczyć o jego selektywnym działaniu przeciwnowotworowym.

Pochodna RAM-5 zwraca uwagę jako potencjalny lek użyteczny w radiouwrażliwianiu

komórek nowotworowych również ze względu na lepszą charakterystykę hamowania EGFR

w porównaniu do genisteiny. W niskich stężeniach RAM-5 nie stymuluje fosforylacji EGFR

w przeciwieństwie do genisteiny (wyniki niniejszej pracy), może więc posiadać lepszy profil

bezpieczeństwa in vivo. Niektóre prace pokazują, że po zastosowaniu niskich stężeń

genisteiny dochodzi do stymulacji EGFR, a szlaki przekazu sygnału zależne od EGFR mogą

być zaangażowane w stymulację proliferacji nowotworowej . Co więcej wzrost proliferacji

komórek nowotworowych

po zastosowaniu niskich stężeń tego izoflawonu jest czasami podnoszony jako argument

przeciw suplementacji genisteiną . W tym kontekście użycie nowej pochodnej

niewywołującej efektu stymulującego EGFR w niskich dawkach nie powinno

być kontrowersyjne.

Badania wstępne z użyciem linii komórek prawidłowych HaCaT pokazały również,

że RAM-5 nie zmienia poziomu fosforylacji EGFR do stężenia 20 μM (dane

niepublikowane). Może to dodatkowo potwierdzać hipotezę, że pochodna RAM-5 może

w pewnym stopniu działać z większą selektywnością na komórki nowotworowe. W pracy

pokazano, że inhibitory EGFR mogą wywoływać w linii komórek prawidłowych HaCaT

wzrost ekspresji EGFR. Oznacza to, ze efekt działania inhibitorów EGFR jest zależny od

rodzaju testowanej linii komórkowej, a więc niektóre inhibitory EGFR mogą działać

selektywnie względem komórek nowotworowych, co jest zgodne ze wstępnymi wynikami

uzyskanymi dla pochodnej RAM-5. Należy przy tym podnieść, że właściwości

radioprotekcyjnie struktury wyjściowej, genisteiny, są szeroko opisane w dostępnej literaturze

(szczegółowy przegląd piśmiennictwa przedstawiono w rozdziale „Wstęp, podrozdział I.3), a

zatem również pod tym kątem należałoby przyjrzeć się pochodnej RAM-5.

Równie interesujące wyniki analizy pochodnych genisteiny uzyskano w innym modelu

badawczym – Procariota (Gruca, publikacja w przygotowaniu). Izoflawony uważa

się za związki o działaniu plejotropowym, wykazujące właściwości antybiotyczne rozumiane

146

Page 147: 6.11.14 doktorat_final-final

jako zdolność do hamowania wzrostu nieprawidłowych komórek nowotworowych

(eukariotycznych) oraz komórek bakteryjnych (prokariotycznych) . Ponieważ w licznych

pracach wskazuje się na zdolność wyciągu sojowego i izoflawonów , genisteiny oraz jej

pochodnych do hamowania wzrostu szczepów bakteryjnych,

a jednocześnie wiadomo, że u pacjentów onkologicznych ze względu na osłabioną odpowiedź

immunologiczną częste jest występowanie infekcji bakteryjnych , postanowiono sprawdzić

zdolność wybranych analogów genisteiny do hamowania wzrostu bakterii.

Dodatkową przesłanką do badań z użyciem szczepów bakteryjnych były dane

z piśmiennictwa pokazujące, że związki, które mają zdolność do hamowania topoizomerazy II

w komórkach linii nowotworowych są często równie aktywnymi czynnikami

bakteriostatycznymi bądź bakteriotoksycznymi, ponieważ również w tym modelu hamują

aktywność gyrazy (bakteryjnej topoizmoerazy II) . Do badań wybrano kilka szczepów

bakterii gram-dodatnich oraz gram-ujemnych,

w tym szczepy z rodziny Baciliaceae, których wzrost jest hamowany przez genisteinę,

jak pokazano w literaturze . Związkami, które wykazywały zdolność do hamowania wzrostu

B. subtilis oraz B. mycoides w hodowlach płynnych były jedynie RAM-5 oraz genisteina.

Wyniki uzyskane dla genisteiny są zgodne z przedstawionymi w pracy innego zespołu ,

w której również pokazano zdolność genisteiny do hamowania wzrostu B. subtilis, jednak z

wykorzystaniem innej metody badawczej, a mianowicie z zastosowaniem krążków

bibułowych nasączonych genisteiną bądź jej kompleksami z cyklodekstrynami

na powierzchni płytki agarowej. Jak wiadomo z literatury izoflawony podawane w postaci

wolnej słabo dyfundują w agarze, dlatego w moich badaniach posłużyłam się metodą hodowli

płynnych, jak sugerowano w pracy . Badania te pokazały, że RAM-5, jako jedyna spośród

zbadanych pochodnych, zachowuje przeciwbakteryjne właściwości charakterystyczne dla

struktury wyjściowej, genisteiny, i ogranicza wzrost komórek bakteryjnych z rodziny

Bacilliaceae w stopniu zależnym od stężenia, a efekt ten jest przynajmniej częściowo

związany z obniżaniem aktywności gyrazy, co pokazano w testach bezkomórkowych

(Topogen, Gyrase Assay Kit) (Gruca, publikacja w przygotowaniu). Zagadnienie

przeciwbakteryjnych właściwości RAM-5 wymaga szerszych badań.

W szczególności istotne byłoby sprawdzenie, czy RAM-5 działa

bakteriostatycznie/bakteriotoksycznie względem mikroorganizmów patogennych,

jak to pokazano dla genisteiny w pracy .

V.5. Czy pochodna RAM-5 może być kandydatem na lek?

147

Page 148: 6.11.14 doktorat_final-final

RAM-5 jest związkiem, w którym aglikon (genisteina) związany jest z resztą cukrową

poprzez łącznik węglowy wiązaniem O-glikozydowym, podatnym na hydrolizę. Jak pokazały

badania in vivo pochodnej RAM-3, różniącej się od RAM-5 wyłącznie długością łącznika

węglowego, mimo dużej skuteczności in vitro Gruca, 2009, praca magisterska), związek ten

nie wykazywał działania przeciwnowotworowego in vivo (Wietrzyk, dane niepublikowane).

Duże nadzieje wiązano więc ze związkami C-glikozydowymi, które

w przewodzie pokarmowym cechowałyby się większa stabilnością. Jak pokazały badania

niniejszej pracy C-glikozydy działały w porównywalnym stopniu z O-glikozydami w testach

klonogenności. Dla porównania pochodna RAM-3 i jej analog RAM-C-4α pozwalały

na osiągnięcie wartości współczynnika kombinacji:

0.6 i 0.7 odpowiednio przy ED75 oraz 0.4 i 0.7 przy ED90 w linii DU145

0.9 i 0.8 odpowiednio przy ED75 oraz 0.8 i 0.6 przy ED90 w linii HCT116 (wszystkie

wartości w zakresie oznaczającym synergizm – 0.9-0.3, przy czym 0.7-0.9 oznacza słaby

synergizm) (tabela V-3 i V-4).

Porównując wartości IC50 uzyskane dla analogów O-glikozydowych oraz

C-glikozydowych ciężko wskazać na konkretną zależność. O ile dla analogów RAM-2

i RAM-C-3α, wartości IC50 były przybliżone (porównywalne z IC50 genisteiny), w przypadku

RAM-3 i RAM-C-4α można zauważyć zależność efektu od linii. RAM-3 działał znacząco

lepiej w komórkach HCT116 (RAM-3 – IC50 równe 2.6 ± 1.5 versus RAM-C-4α – IC50 równe

6.5 ± 0.8), podczas gdy RAM-C-4α w linii DU145 (RAM-3 – IC50 równe 11.0 ± 6.0 versus

RAM-C-4α – IC50 równe 3.8 ± 1.0) (tabela V-1). W testach oceniających wpływ

C-glikozydów na fosforylację pEGFR (bez promieniowania) związki te również dawały

podobne efekty w porównywalnych stężeniach do ich O-glikozydowych odpowiedników

w linii HCT116, jednak słabsze w przypadku linii DU145. W pozostałych testach

C-glikozydy były mniej aktywne, nie hamowały aktywności wszystkich testowanych

w poniższej pracy celów molekularnych bądź wywoływały efekt w stężeniach znacząco

wyższych w porównaniu do ich O-glikozydowych odpowiedników.

Należy tutaj pamiętać, że testowane w niniejszej pracy C-glikozydy to związki

o konfiguracji α, podczas gdy ich ramnalowe odpowiedniki O-glikozydowe są mieszaninami

anomerów (RAM-2 α/β = 10/1, RAM-3 α/β = 4.2/1, RAM-5 α/β = 4/1). Możliwe zatem,

że to skład izomerów związków decyduje o ostatecznym efekcie uzyskiwanym w liniach

komórkowych. Mając na uwadze możliwe odmienne efekty działania dwóch różnych

izomerów tego samego związku opisane już wcześniej w literaturze dla innych związków

(Ito et al., 2010), w dalszych badaniach należy określić czy efekt obserwowany w badaniach

148

Page 149: 6.11.14 doktorat_final-final

in vitro jest wywoływany przez któryś z anomerów RAM-5 (formę α bądź β), czy też przez

ich mieszaninę.

Podkreślić należy, że analogiem C-glikozydowym dla RAM-5, który został

wytypowany jako związek najkorzystniej działający w testowanych liniach komórkowych,

byłby RAM-C-6α. Oceniane w niniejszej pracy jako pożądane efekty działania związków

C-glikozydowych wzrastały wraz z wydłużaniem łącznika (wartość CI, zdolność

do hamowania fosforylacji EGFR), możliwe wiec, że dla pochodnej RAM-C-6α możliwe

byłoby osiągnięcie efektów podobnych jak w przypadku RAM-5. Niestety wraz

z wydłużaniem łącznika węglowego spada rozpuszczalność związków, co znacząco obniża

przydatność terapeutyczną substancji. Już w przypadku RAM-C-5α napotkano trudności w

rozpuszczeniu substancji w DMSO (dane niepublikowane). RAM-C-6α nie mógłby być

zastosowany w leczeniu klinicznym ze względu na zbyt niską rozpuszczalność.

Wydaje się, że analog genisteiny RAM-5 spełnia podstawowe oczekiwania

dla nowych kandydatów na lek. Użycie programu molinspiration (http://molinspiration.com/)

umożliwiło określenie podobieństwa cząsteczki do obecnie stosowanych leków (ang. drug-

likeness). Właściwość ta może być zdefiniowana jako złożony bilans różnych właściwości

molekularnych i cech strukturalnych cząsteczki chemicznej, które determinują, czy konkretny

związek jest podobny do znanych leków oraz czy istnieje prawdopodobieństwo, że będzie

aktywnym lekiem w organizmie ludzkim. W programie określane są takie parametry jak masa

molekularna związku, wartość parametru logP, czy liczba donorów i akceptorów wiązań

wodorowych. Przekroczenie wartości określonych w programie jako maksymalne pozwala

na wyeliminowanie związków, które nie mogłyby zostać wprowadzone do leczenia.

W programie wykorzystuje się regułę Lipińskiego (Lipiński et al., 2001).

Jak pokazano na rycinie V.3 charakterystyka cząsteczki pochodnej RAM-5 jest

znacznie lepsza niż jej teoretycznego analogu C-glikozydowego. Jak pokazuje symulacja,

RAM-5 spełnia wymogi dla potencjalnych kandydatów na lek określone regułą Lipińskiego.

149

Page 150: 6.11.14 doktorat_final-final

Rycina V.3. Analiza właściwości cząsteczek w programie molinspiration przeprowadzona dla RAM-5 (panel górny) oraz teoretycznego analogu RAM-C-6α (panel dolny). Program wylicza podstawowe parametry dla cząsteczki chemicznej, które określają czy dana struktura chemiczna spełnia podstawowe kryteria dla leku. Jeśli wartość więcej niż jednego z parametrów jest przekroczona (znacznie – kolor czerwony, nieznacznie – kolor pomarańczowy), uznaje się, że taka cząsteczka ma małą szansę na zostanie aktywnym lekiem. logP – współczynnik podziału oktanol-woda określa hydrofobowość cząsteczki (wartość maksymalna do 5), TPSA – suma atomów polarnych na powierzchni cząsteczki (ang. topological polar surface area) określa zdolność przechodzenia cząsteczki przez błonę (wartość maksymalna do 140 A2), n atoms – liczba atomów, MW – masa molekularna (ang. molecular weight) (wartość maksymalna do 500 Da), nON – liczba akceptorów wiązań wodorowych (maksymalna dopuszczalna wartość – 10), nOMNH liczba donorów wiązań wodorowych (wszystkich wiązań azot-wodór i tlen-wodór) (maksymalna dopuszczalna wartość – 5), nviolations – liczba przekroczonych wartości dla analizowanych parametrów (maksymalna dopuszczalna wartość – 1), nrotb – liczba wiązań obrotowych (ang. numer rotable bonds), volume – objętość cząsteczki.

Ze względu na wszystkie przedstawione powyżej dane oraz przewidywaną potencjalną

przydatność kliniczną związku, wydaje się, że dla pochodnej RAM-5, w której strukturze

występuje wiązanie O-glikozydowe podatne na hydrolizę enzymatyczną, należy rozważyć

opracowanie właściwej formulacji uniemożliwiającej degradację związku w układzie

pokarmowym. Można tu rozważać podawanie związku w postaci zamkniętej w liposomach, w

postaci kompleksów z tłuszczami, białkami, czy w postaci mikrosfer. Interesujące

rozwiązanie zaproponowano dla cząsteczki genisteiny w najnowszej pracy . Genisteinę

zamykano w kapsułkach zbudowanych z cyklodekstryn w celu przezwyciężenia ograniczenia,

jakim jest słaba rozpuszczalność związku w wodzie.

Ta metoda podnosiła skuteczność działania genisteiny względem komórek nowotworowych

150

Page 151: 6.11.14 doktorat_final-final

oraz bakteryjnych. Podobne rozwiązanie mogłoby zostać opracowane dla pochodnych

genisteiny, które zamknięte w otoczkach dekstrynowych nie ulegałyby degradacji w układzie

pokarmowym, i byłyby lepiej wchłaniane, jak pokazano dla genisteiny również w pracy . Jeśli

pojawią się trudności związane z opracowaniem odpowiedniej postaci farmaceutycznej

związku, RAM-5 można traktować jako strukturę wyjściową

do dalszych syntez.

Szczególnie ważnym wynikiem niniejszej pracy jest informacja, że RAM-5 pozwala

na uzyskanie istotnego efektu synergistycznego w kombinacji z promieniowaniem

jonizującym już w stężeniu 5 μM, które jest możliwe do osiągnięcia w osoczu krwi,

przy założeniu, że cząsteczka RAM-5 jest stabilna i nie ulega degradacji podczas obiegu

w układzie krążenia. Dane literaturowe pokazują, że cytotoksyczność związków

radiouczulających wobec komórek nowotworowych in vitro jest zróżnicowana i ujawnia

się w zakresie stężeń od nanomolarnych do mikromolarnych . Stężenia efektywne RAM-5

mieszczą się w zakresie stężeń mikromolarnych, co pozwala zaklasyfikować związek do

kandydatów na leki o umiarkowanych właściwościach cytotoksycznych. Jeśli brak

toksyczności ogólnoustrojowej zostanie potwierdzony

w badaniach in vivo, pochodna ta może być brana pod uwagę jako związek korzystniejszy

niż większość stosowanych chemoterapeutyków o wysokiej toksyczności systemowej,

których aplikowanie odbywa się z przerwami, co wydłuża okres terapii.

Podkreślenia wymaga, że równolegle prowadzone badania w Katedrze Chemii

Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej

pozwoliły na opracowanie nowej, prostszej syntezy związku RAM-5 (prof. Wiesław Szeja, dr

Piotr Świerk, informacja ustna).

W podsumowaniu należy podkreślić, że w przypadku pochodnych testowanych

w niniejszej pracy nie udało się dotychczas określić zależności struktura-aktywność

(SAR, ang. structure activity relationship), czyli przypisać określonych właściwości

biologicznych konkretnemu, pojedynczemu parametrowi w strukturze chemicznej związków.

Nawet niewielkie różnice w budowie związku, na przykład długość łącznika, czy wystąpienie

różnych atomów (na przykład tlen bądź węgiel, rycina III.3) mogą powodować powstanie

odmiennych efektów biologicznych o różnym nasileniu. Złożoność problemu rośnie również

w wyniku obserwacji, że efekt biologiczny wywoływany przez pochodne jest specyficzny

względem linii komórkowych. Podobne trudności w określeniu SAR zdarzały się już

uprzednio dla rozmaitych związków i zostały opisane miedzy innymi w pracach . Jednak,

pomimo powyższych trudności, badania poniższej pracy pozwoliły na wyselekcjonowanie

151

Page 152: 6.11.14 doktorat_final-final

spośród testowanych pochodnych związku o potencjalnej przydatności klinicznej. Powyżej

przedstawione wyniki badań dają również podstawy do rozpoczęcia badań in vivo pochodnej

RAM-5.

152

Page 153: 6.11.14 doktorat_final-final

VI. NAJWAŻNIEJSZE WYNIKI I WNIOSKI

1. Pomimo, że badania niniejszej pracy nie pozwoliły na określenie zależności aktywności

biologicznej od struktury ramnalowych pochodnych genisteiny, badania przesiewowe

umożliwiły wyłonienie spośród testowanych analogów genisteiny związku o obiecującej

aktywności antyproliferacyjnej. Równocześnie pokazano, że w linii HCT116 istnieje

zależność pomiędzy hamowaniem aktywności EGFR a zwiększaniem cytotoksycznego

wpływu promieniowania jonizującego na komórki nowotworowe po zastosowaniu

pochodnych podstawionych przy węglu C-7. W komórkach HCT116 obserwowano

silniejszy synergizm dla związków wydajniej hamujących fosforylację EGFR. Podobnej

korelacji nie obserwowano w linii DU145 w przypadku tej serii związków. Inna grupa

związków, a mianowicie pochodne ramnalowe genisteiny podstawione przy węglu C-4’

nie hamowały aktywności EGFR, zatem uzyskane efekty silnie synergistyczne

w kombinacji z IR w linii DU145 muszą zależeć od innych mechanizmów.

2. Tylko dwie spośród badanych pochodnych hamowały aktywność topoizomerazy II

indukując kowalencyjne kompleksy enzymu z DNA w obu liniach komórkowych. Były

to związki G21 oraz RAM-5. Pochodne te należy poddać dalszym analizom (szczególnie

in vivo), których celem byłoby określenie potencjalnego zastosowania G21 oraz RAM-5

jako „trucizn” TOPO II.

3. Spośród testowanych w niniejszej pracy ramnalowych pochodnych genisteiny do dalszych

badań in vivo wytypowano RAM-5, który okazał się najskuteczniejszym związkiem

promieniouwrażliwiającym komórki nowotworowe linii HCT116 oraz DU145.

Jednocześnie określono mechanizm promieniouczulania wywoływanego w liniach

komórkowych przez tę pochodną – pokazano, że RAM-5 działa plejotropowo wywołując

równoczesne zahamowanie aktywności EGFR, AKT, ERK 1/2 oraz topoizomerazy II.

Wszystkie obserwowane efekty RAM-5 wywołuje przy najniższych wartościach stężeń

(w porównaniu do pozostałych pochodnych) – 5 μM – co jest wartością możliwą

do osiągnięcia w osoczu krwi człowieka.

4. Stosowanie ramnalowych pochodnych genisteiny w kombinacji z promieniowaniem

jonizującym jest strategią racjonalną umożliwiającą osiągnięcie efektów synergistycznych

w nowotworowych liniach komórkowych.

153

Page 154: 6.11.14 doktorat_final-final

VII. BIBLIOGRAFIA

ACUNZO, M., ROMANO, G., PALMIERI, D., LAGANA, A., GAROFALO, M., BALATTI, V., DRUSCO, A., CHIARIELLO, M., NANA-SINKAM, P. and CROCE, C. M. 2013. Cross-talk between MET and EGFR in non-small cell lung cancer involves miR-27a and Sprouty2. Proc Natl Acad Sci U S A, 110, 8573-8.

1. ADDERSON, E. E., BOUDREAUX, J. W. and HAYDEN, R. T. 2008. Infections caused by coryneform bacteria in pediatric oncology patients. Pediatr Infect Dis J, 27, 136-41.

2. ADJAKLY, M., NGOLLO, M., BOITEUX, J. P., BIGNON, Y. J., GUY, L. and BERNARD-GALLON, D. 2013. Genistein and daidzein: different molecular effects on prostate cancer. Anticancer Res, 33, 39-44.

3. AFFOLTER, A., DRIGOTAS, M., FRUTH, K., SCHMIDTMANN, I., BROCHHAUSEN, C., MANN, W. J. and BRIEGER, J. 2013. Increased radioresistance via G12S K-Ras by compensatory upregulation of MAPK and PI3K pathways in epithelial cancer. Head Neck, 35, 220-8.

4. AGUERO, M. F., FACCHINETTI, M. M., SHELEG, Z. and SENDEROWICZ, A. M. 2005. Phenoxodiol, a novel isoflavone, induces G1 arrest by specific loss in cyclin-dependent kinase 2 activity by p53-independent induction of p21WAF1/CIP1. Cancer Res, 65, 3364-73.

5. AHMAD, I. U., FORMAN, J. D., SARKAR, F. H., HILLMAN, G. G., HEATH, E., VAISHAMPAYAN, U., CHER, M. L., ANDIC, F., ROSSI, P. J. and KUCUK, O. 2010. Soy isoflavones in conjunction with radiation therapy in patients with prostate cancer. Nutr Cancer, 62, 996-1000.

6. AKIYAMA, T., ISHIDA, J., NAKAGAWA, S., OGAWARA, H., WATANABE, S., ITOH, N., SHIBUYA, M. and FUKAMI, Y. 1987. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem, 262, 5592-5.

7. AL-TRAWNEH, S. A., ZAHRA, J. A., KAMAL, M. R., EL-ABADELAH, M. M., ZANI, F., INCERTI, M., CAVAZZONI, A., ALFIERI, R. R., PETRONINI, P. G. and VICINI, P. 2010. Synthesis and biological evaluation of tetracyclic fluoroquinolones as antibacterial and anticancer agents. Bioorg Med Chem, 18, 5873-84.

8. ALCORN, S., WALKER, A. J., GANDHI, N., NARANG, A., WILD, A. T., HALES, R. K., HERMAN, J. M., SONG, D. Y., DEWEESE, T. L., ANTONARAKIS, E. S. and TRAN, P. T. 2013. Molecularly targeted agents as radiosensitizers in cancer therapy--focus on prostate cancer. Int J Mol Sci, 14, 14800-32.

9. ALI, R., MIRZA, Z., ASHRAF, G. M., KAMAL, M. A., ANSARI, S. A., DAMANHOURI, G. A., ABUZENADAH, A. M., CHAUDHARY, A. G. and SHEIKH, I. A. 2012. New anticancer agents: recent developments in tumor therapy. Anticancer Res, 32, 2999-3005.

10. AN, Z., MUTHUSAMI, S., YU, J. R. and PARK, W. Y. 2014. T0070907, a PPAR gamma inhibitor induced G2/M Arrest Enhances the Effect of Radiation in Human Cervical Cancer Cells Through Mitotic Catastrophe. Reprod Sci.

11. ANDRADE, J. E., JU, Y. H., BAKER, C., DOERGE, D. R. and HELFERICH, W. G. 2014. Long-term exposure to dietary sources of genistein induces estrogen-independence in the human breast cancer (MCF-7) xenograft model. Mol Nutr Food Res.

12. ANTONARAKIS, E. S., CARDUCCI, M. A. and EISENBERGER, M. A. 2010. Novel targeted therapeutics for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Lett, 291, 1-13.

13. ARAFA, H. M. 2010. Possible contribution of beta-glycosidases and caspases in the cytotoxicity of novel glycoconjugates in colon cancer cells. Invest New Drugs, 28, 306-17.

14. ARAVINDAN, S., NATARAJAN, M., HERMAN, T. S., AWASTHI, V. and ARAVINDAN, N. 2013. Molecular basis of 'hypoxic' breast cancer cell radio-sensitization: phytochemicals converge on radiation induced Rel signaling. Radiat Oncol, 8, 46.

15. ASAHI, K., ONO, I., KUSAKABE, H., NAKAMURA, G. and ISONO, K. 1981. Studies on differentiation inducing substances of animal cells. I. Differenol A, a differentiation inducing substance against mouse leukemia cells. J Antibiot (Tokyo), 34, 919-20.

16. AUFDERKLAMM, S., MILLER, F., GALASSO, A., STENZL, A. and GAKIS, G. 2014. Chemoprevention of prostate cancer by isoflavonoids. Recent Results Cancer Res, 202, 101-8.

17. AZAD, A., JACKSON, S., CULLINANE, C., NATOLI, A., NEILSEN, P. M., CALLEN, D. F., MAIRA, S. M., HACKL, W., MCARTHUR, G. A. and SOLOMON, B. 2011. Inhibition of DNA-dependent protein kinase induces accelerated senescence in irradiated human cancer cells. Mol Cancer Res, 9, 1696-707.

18. AZAROVA, A. M., LIN, R. K., TSAI, Y. C., LIU, L. F., LIN, C. P. and LYU, Y. L. 2010. Genistein induces topoisomerase IIbeta- and proteasome-mediated DNA sequence rearrangements: Implications in infant leukemia. Biochem Biophys Res Commun, 399, 66-71.

154

Page 155: 6.11.14 doktorat_final-final

19. BACHE, M., KAPPLER, M., SAID, H. M., STAAB, A. and VORDERMARK, D. 2008. Detection and specific targeting of hypoxic regions within solid tumors: current preclinical and clinical strategies. Curr Med Chem, 15, 322-38.

20. BAI, J., GUO, X. G. and BAI, X. P. 2012. Epidermal growth factor receptor-related DNA repair and radiation-resistance regulatory mechanisms: a mini-review. Asian Pac J Cancer Prev, 13, 4879-81.

21. BAILLY, C. 2012. Contemporary challenges in the design of topoisomerase II inhibitors for cancer chemotherapy. Chem Rev, 112, 3611-40.

22. BALDWIN, E. L. and OSHEROFF, N. 2005. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Curr Med Chem Anticancer Agents, 5, 363-72.

23. BANDELE, O. J. and OSHEROFF, N. 2007. Bioflavonoids as poisons of human topoisomerase II alpha and II beta. Biochemistry, 46, 6097-108.

24. BANDELE, O. J. and OSHEROFF, N. 2008. The efficacy of topoisomerase II-targeted anticancer agents reflects the persistence of drug-induced cleavage complexes in cells. Biochemistry, 47, 11900-8.

25. BANERJEE, S., LI, Y., WANG, Z. and SARKAR, F. H. 2008. Multi-targeted therapy of cancer by genistein. Cancer Lett, 269, 226-42.

26. BARNES, S., PETERSON, T. G. and COWARD, L. 1995. Rationale for the use of genistein-containing soy matrices in chemoprevention trials for breast and prostate cancer. J Cell Biochem Suppl, 22, 181-7.

27. BARROS, F. F., ABDEL-FATAH, T. M., MOSELEY, P., NOLAN, C. C., DURHAM, A. C., RAKHA, E. A., CHAN, S., ELLIS, I. O. and GREEN, A. R. 2014. Characterisation of HER heterodimers in breast cancer using in situ proximity ligation assay. Breast Cancer Res Treat, 144, 273-85.

28. BARTHELEMY, P., LEBLANC, J., GOLDBARG, V., WENDLING, F. and KURTZ, J. E. 2014. Pertuzumab: development beyond breast cancer. Anticancer Res, 34, 1483-91.

29. BASKAR, R., LEE, K., YEO, R. and YEOH, K. 2012. Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int J Med Sci, 9, 193-199.

30. BATEY, M. A., ZHAO, Y., KYLE, S., RICHARDSON, C., SLADE, A., MARTIN, N. M., LAU, A., NEWELL, D. R. and CURTIN, N. J. 2013. Preclinical evaluation of a novel ATM inhibitor, KU59403, in vitro and in vivo in p53 functional and dysfunctional models of human cancer. Mol Cancer Ther, 12, 959-967.

31. BAUMANN, M., KRAUSE, M., DIKOMEY, E., DITTMANN, K., DORR, W., KASTEN-PISULA, U. and RODEMANN, H. P. 2007. EGFR-targeted anti-cancer drugs in radiotherapy: preclinical evaluation of mechanisms. Radiother Oncol, 83, 238-48.

32. BEGG, A. C., STEWART, F. A. and VENS, C. 2011. Review Strategies to improve radiotherapy with targeted drugs. Nat Rev Cancer, 11, 239-253.

33. BEHLOUL, N. and WU, G. 2013. Genistein: a promising therapeutic agent for obesity and diabetes treatment. Eur J Pharmacol, 698, 31-8.

34. BEHMAND, B., WAGNER, J. R., SANCHE, L. and HUNTING, D. J. 2014. Cisplatin intrastrand adducts sensitize DNA to base damage by hydrated electrons. J Phys Chem B, 118, 4803-8.

35. BENNETTS, H. W., UNDERWOOD, E. J. and SHIER, F. L. 1946. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Aust Vet J, 22, 2-12.

36. BEREZOWSKA, S. and SCHLEGEL, J. 2011. Targeting ErbB receptors in high-grade glioma. Curr Pharm Des, 17, 2468-87.

37. BERG, M. and SOREIDE, K. 2012. EGFR and downstream genetic alterations in KRAS/BRAF and PI3K/AKT pathways in colorectal cancer: implications for targeted therapy. Discov Med, 14, 207-214.

38. BERNIER, J., HALL, E. J. and GIACCIA, A. 2004. Review Radiation oncology: a century of achievements. Nat Rev Cancer, 4, 737-747.

39. BHATIA, N. and AGARWAL, R. 2001. Detrimental effect of cancer preventive phytochemicals silymarin, genistein and epigallocatechin 3-gallate on epigenetic events in human prostate carcinoma DU145 cells. Prostate, 46, 98-107.

40. BHATTACHARYA, A., TOTH, K., DURRANI, F. A., CAO, S., SLOCUM, H. K., CHINTALA, S. and RUSTUM, Y. M. 2008. Hypoxia-specific drug tirapazamine does not abrogate hypoxic tumor cells in combination therapy with irinotecan and methylselenocysteine in well-differentiated human head and neck squamous cell carcinoma a253 xenografts. Neoplasia, 10, 857-65.

41. BILIR, B., KUCUK, O. and MORENO, C. S. 2013. Wnt signaling blockage inhibits cell proliferation and migration, and induces apoptosis in triple-negative breast cancer cells. J Transl Med, 11, 280.

42. BISCHOF, M., HUBER, P., STOFFREGEN , C., WANNENMACHER, M. and WEBER, K. J. 2003. Radiosensitization by pemetrexed of human colon carcinoma cells in different cell cycle phases. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 57, 289-292.

155

Page 156: 6.11.14 doktorat_final-final

43. BITO, T., SUMITA, N., ASHIDA, M., BUDIYANTO, A., UEDA, M., ICHIHASHI, M., TOKURA, Y. and NISHIGORI, C. 2011. Inhibition of Epidermal Growth Factor Receptor and PI3K/Akt Signaling Suppresses Cell Proliferation and Survival through Regulation of Stat3 Activation in Human Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. Journal of Skin Cancer, 2011, 11.

44. BITTO, A., POLITO, F., SQUADRITO, F., MARINI, H., D'ANNA, R., IRRERA, N., MINUTOLI, L., GRANESE, R. and ALTAVILLA, D. 2010. Genistein aglycone: a dual mode of action anti-osteoporotic soy isoflavone rebalancing bone turnover towards bone formation. Curr Med Chem, 17, 3007-18.

45. BOBOLA, M. S., KOLSTOE, D. D., BLANK, A. and SILBER, J. R. 2010. Minimally cytotoxic doses of temozolomide produce radiosensitization in human glioblastoma cells regardless of MGMT expression. Mol Cancer Ther, 9, 1208-18.

46. BOJKO, A., REICHERT, K., ADAMCZYK, A., LIGEZA, J., LIGEZA, J. and KLEIN, A. 2012. The effect of tyrphostins AG494 and AG1478 on the autocrine growth regulation of A549 and DU145 cells. Folia Histochem Cytobiol, 50, 186-95.

47. BONNER, J. A. and LAWRENCE, T. S. 1990. Doxorubicin decreases the repair of radiation-induced DNA damage. Int J Radiat Biol, 57, 55-64.

48. BOOTH, C., HARGREAVES, D. F., HADFIELD, J. A., MCGOWN, A. T. and POTTEN, C. S. 1999. Isoflavones inhibit intestinal epithelial cell proliferation and induce apoptosis in vitro. Br J Cancer, 80, 1550-7.

49. BOZEC, A., PEYRADE, F. and MILANO, G. 2013. Molecular targeted therapies in the management of head and neck squamous cell carcinoma: recent developments and perspectives. Anticancer Agents Med Chem, 13, 389-402.

50. BRASSESCO, M. S., PEZUK, J. A., DE OLIVEIRA, J. C., VALERA, E. T., DE OLIVEIRA, H. F., SCRIDELI, C. A., UMEZAWA, K. and TONE, L. G. 2013. Activator Protein-1 Inhibition by 3-[(Dodecylthiocarbonyl)Methyl]-Glutamaride Impairs Invasion and Radiosensitizes Osteosarcoma Cells In Vitro. Cancer Biother Radiopharm.

51. BRIDGES, K. A., TONIATTI, C., BUSER, C. A., LIU, H., BUCHHOLZ, T. A. and MEYN, R. E. 2014. Niraparib (MK-4827), a novel poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitor, radiosensitizes human lung and breast cancer cells. Oncotarget, 5, 5076-86.

52. BROBEIL, A., KOCH, P., EIBER, M., TAG, C. and WIMMER, M. 2014. The known interactome of PTPIP51 in HaCaT cells-inhibition of kinases and receptors. Int J Biochem Cell Biol, 46, 19-31.

53. BRODNIEWICZ, T. and GRYNKIEWICZ, G. 2012. Plant phenolics as drug leads -- what is missing? Acta Pol Pharm, 69, 1203-17.

54. BYCZEK, A., ZAWISZA-PUCHALKA, J., GRUCA, A., PAPAJ, K., GRYNKIEWICZ, G., RUSIN, M., SZEJA, W. and RUSIN, A. 2013. Genistein Derivatives Regioisomerically Substituted at 7-O- and 4&#x2032;-O- Have Different Effect on the Cell Cycle. Journal of Chemistry, 2013, 12.

55. CALVARESI, E. C. and HERGENROTHER, P. J. 2013. Glucose conjugation for the specific targeting and treatment of cancer. Chem Sci, 4, 2319-2333.

56. CALVELEY, V. L., JELVEH, S., LANGAN, A., MAHMOOD, J., YEUNG, I. W., VAN DYK, J. and HILL, R. P. 2010. Genistein can mitigate the effect of radiation on rat lung tissue. Radiat Res, 173, 602-11.

57. CARRION-SALIP, D., PANOSA, C., MENENDEZ, J. A., PUIG, T., OLIVERAS, G., PANDIELLA, A., DE LLORENS, R. and MASSAGUER, A. 2012. Androgen-independent prostate cancer cells circumvent EGFR inhibition by overexpression of alternative HER receptors and ligands. Int J Oncol, 41, 1128-38.

58. CASALINI, P., IORIO, M. V., GALMOZZI, E. and MENARD, S. 2004. Role of HER receptors family in development and differentiation. J Cell Physiol, 200, 343-50.

59. CASSELL, A. and GRANDIS, J. R. 2010. Investigational EGFR-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma. Expert Opin Investig Drugs, 19, 709-22.

60. CHAGALUKA, G., STANLEY, C., BANDA, K., DEPANI, S., NIJRAM'MADZI, J., KATANGWE, T., ISRAELS, T., BAILEY, S., MUKAKA, M. and MOLYNEUX, E. 2014. Kaposi's sarcoma in children: an open randomised trial of vincristine, oral etoposide and a combination of vincristine and bleomycin. Eur J Cancer, 50, 1472-81.

61. CHANG, L., GRAHAM, P. H., HAO, J., NI, J., BUCCI, J., COZZI, P. J., KEARSLEY, J. H. and LI, Y. 2013. Acquisition of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes is associated with activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway in prostate cancer radioresistance. Cell Death Dis, 4, e875.

62. CHAPMAN, T. R. and KINSELLA, T. J. 2011. Ribonucleotide reductase inhibitors: a new look at an old target for radiosensitization. Front Oncol, 1, 56.

156

Page 157: 6.11.14 doktorat_final-final

63. CHAPONIS, D., BARNES, J. W., DELLAGATTA, J. L., KESARI, S., FAST, E., SAUVAGEOT, C., PANAGRAHY, D., GREENE, E. R., RAMAKRISHNA, N., WEN, P. Y., KUNG, A. L., STILES, C. and KIERAN, M. W. 2011. Lonafarnib (SCH66336) improves the activity of temozolomide and radiation for orthotopic malignant gliomas. J Neurooncol, 104, 179-89.

64. CHASTAGNER, P., SUDOUR, H., MRIOUAH, J., BARBERI-HEYOB, M., BERNIER-CHASTAGNER, V. and PINEL, S. 2014. Preclinical Studies of Pegylated- and Non-Pegylated Liposomal Forms of Doxorubicin as Radiosensitizer on Orthotopic High-Grade Glioma Xenografts. Pharm Res.

65. CHEN, C. Y., JAN, C. I., LO, J. F., YANG, S. C., CHANG, Y. L., PAN, S. H., WANG, W. L., HONG, T. M. and YANG, P. C. 2013a. Tid1-L inhibits EGFR signaling in lung adenocarcinoma by enhancing EGFR Ubiquitinylation and degradation. Cancer Res, 73, 4009-19.

66. CHEN, P., HU, M. D., DENG, X. F. and LI, B. 2013b. Genistein reinforces the inhibitory effect of Cisplatin on liver cancer recurrence and metastasis after curative hepatectomy. Asian Pac J Cancer Prev, 14, 759-64.

67. CHEN, W., LIN, Y. C., MA, X. Y., JIANG, Z. Y. and LAN, S. P. 2014. High concentrations of genistein exhibit pro-oxidant effects in primary muscle cells through mechanisms involving 5-lipoxygenase-mediated production of reactive oxygen species. Food Chem Toxicol, 67, 72-9.

68. CHEN, W., QIU, J. and SHEN, Y. M. 2012. Topoisomerase IIalpha, rather than IIbeta, is a promising target in development of anti-cancer drugs. Drug Discov Ther, 6, 230-7.

69. CHEN, X., SHEN, B., XIA, L., KHALETZKIY, A., CHU, D. and WONG, J. 2002. Activation of nuclear factor kappaB in radioresistance of TP53-inactive human keratinocytes. Cancer Res, 62, 1213-1221.

70. CHEN, Y., LIN, T. Y., CHEN, J. C., YANG, H. Z. and TSENG, S. 2006a. GL331, a topoisomerase II inhibitor, induces radiosensitization of human glioma cells. Anticancer Res, 26, 2149-2156.

71. CHEN, Y., LIN, T. Y., CHEN, J. C., YANG, H. Z. and TSENG, S. H. 2006b. GL331, a topoisomerase II inhibitor, induces radiosensitization of human glioma cells. Anticancer Res, 26, 2149-56.

72. CHIKAMORI, K., GROZAV, A. G., KOZUKI, T., GRABOWSKI, D., GANAPATHI, R. and GANAPATHI, M. K. 2010. DNA topoisomerase II enzymes as molecular targets for cancer chemotherapy. Curr Cancer Drug Targets, 10, 758-71.

73. CHIN, Y. P., TSUI, K. C., CHEN, M. C., WANG, C. Y., YANG, C. Y. and LIN, Y. L. 2012. Bactericidal activity of soymilk fermentation broth by in vitro and animal models. J Med Food, 15, 520-6.

74. CHIYOMARU, T., YAMAMURA, S., FUKUHARA, S., YOSHINO, H., KINOSHITA, T., MAJID, S., SAINI, S., CHANG, I., TANAKA, Y., ENOKIDA, H., SEKI, N., NAKAGAWA, M. and DAHIYA, R. 2013. Genistein inhibits prostate cancer cell growth by targeting miR-34a and oncogenic HOTAIR. PLoS One, 8, e70372.

75. CHOI, E. J., JUNG, J. Y. and KIM, G. H. 2014. Genistein inhibits the proliferation and differentiation of MCF-7 and 3T3-L1 cells via the regulation of ERalpha expression and induction of apoptosis. Exp Ther Med, 8, 454-458.

76. CHOU, T. C. 2010. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res, 70, 440-6.

77. CHOU, T. C. and TALALAY, P. 1984. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul, 22, 27-55.

78. CHURCH, D. N. and TALBOT, D. C. 2012. Survivin in solid tumors: rationale for development of inhibitors. Curr Oncol Rep, 14, 120-128.

79. CICENAS, J. 2008. The potential role of Akt phosphorylation in human cancers. Int J Biol Markers, 23, 1-9.

80. CICHOCKI, M., SZAEFER, H., KRAJKA-KUZNIAK, V. and BAER-DUBOWSKA, W. 2014. The effect of resveratrol and its methylthio-derivatives on EGFR and Stat3 activation in human HaCaT and A431 cells. Mol Cell Biochem.

81. CIMINO, S., SORTINO, G., FAVILLA, V., CASTELLI, T., MADONIA, M., SANSALONE, S., RUSSO, G. I. and MORGIA, G. 2012. Polyphenols: Key Issues Involved in Chemoprevention of Prostate Cancer. Oxid Med Cell Longev, 2012, 1-43.

82. CIPOLLA, L., PERI, F. and AIROLDI, C. 2008. Glycoconjugates in cancer therapy. Anticancer Agents Med Chem, 8, 92-121.

83. CLIFFORD, B., BELJIN, M., STARK, G. R. and TAYLOR, W. R. 2003. G2 arrest in response to topoisomerase II inhibitors: the role of p53. Cancer Res, 63, 4074-81.

84. COWELL, I. G. and AUSTIN, C. A. 2012. Mechanism of generation of therapy related leukemia in response to anti-topoisomerase II agents. Int J Environ Res Public Health, 9, 2075-91.

157

Page 158: 6.11.14 doktorat_final-final

85. CRAGG, G. M., GROTHAUS, P. G. and NEWMAN, D. J. 2014. New horizons for old drugs and drug leads. J Nat Prod, 77, 703-23.

86. CRON, K. R., ZHU, K., KUSHWAHA, D. S., HSIEH, G., MERZON, D., RAMESEDER, J., CHEN, C. C., D'ANDREA, A. D. and KOZONO, D. 2013. Proteasome inhibitors block DNA repair and radiosensitize non-small cell lung cancer. PLoS One, 8, e73710.

87. CUI, S., WIENHOEFER, N. and BILITEWSKI, U. 2014. Genistein induces morphology change and G2/M cell cycle arrest by inducing p38 MAPK activation in macrophages. Int Immunopharmacol, 18, 142-50.

88. CURTIN, N. 2007. Therapeutic potential of drugs to modulate DNA repair in cancer. Expert Opin Ther Targets, 11, 783-799.

89. D'ARPA, P. and LIU, L. F. 1989. Topoisomerase-targeting antitumor drugs. Biochim Biophys Acta, 989, 163-77.

90. DANCIU, C., BORCAN, F., BOJIN, F., ZUPKO, I. and DEHELEAN, C. 2013. Effect of the isoflavone genistein on tumor size, metastasis potential and melanization in a B16 mouse model of murine melanoma. Nat Prod Commun, 8, 343-6.

91. DANCIU, C., SOICA, C., OLTEAN, M., AVRAM, S., BORCAN, F., CSANYI, E., AMBRUS, R., ZUPKO, I., MUNTEAN, D., DEHELEAN, C. A., CRAINA, M. and POPOVICI, R. A. 2014. Genistein in 1:1 inclusion complexes with ramified cyclodextrins: theoretical, physicochemical and biological evaluation. Int J Mol Sci, 15, 1962-82.

92. DARUHAZI, A. E., KISS, T., VECSERNYES, M., SZENTE, L., SZOKE, E. and LEMBERKOVICS, E. 2013. Investigation of transport of genistein, daidzein and their inclusion complexes prepared with different cyclodextrins on Caco-2 cell line. J Pharm Biomed Anal, 84, 112-6.

93. DAVIS, B. G. 1999. Recent developments in glycoconjugates. J. Chem. Soc., Perkin Trans, 1, 3215–3237.94. DAVIS, T. A., MUNGUNSUKH, O., ZINS, S., DAY, R. M. and LANDAUER, M. 2008. Genistein

induces radioprotection by hematopoietic stem cell quiescence. Int J Radiat Biol, 84, 713-726.95. DAY, R. M., DAVIS, T. A., BARSHISHAT-KUPPER, M., MCCART, E. A., TIPTON, A. J. and

LANDAUER, M. R. 2013. Enhanced hematopoietic protection from radiation by the combination of genistein and captopril. Int Immunopharmacol, 15, 348-56.

96. DEFAZIO-ELI, L., STROMMEN, K., DAO-PICK, T., PARRY, G., GOODMAN, L. and WINSLOW, J. 2011. Quantitative assays for the measurement of HER1-HER2 heterodimerization and phosphorylation in cell lines and breast tumors: applications for diagnostics and targeted drug mechanism of action. Breast Cancer Res, 13, R44.

97. DEMAIN, A. L. and VAISHNAV, P. 2011. Natural products for cancer chemotherapy. Microbial Biotechnology, 4, 687-699.

98. DEORUKHKAR, A. and KRISHNAN, S. 2010. Targeting inflammatory pathways for tumor radiosensitization. Biochem Pharmacol, 80, 1904-1914.

99. DESAI, A., WEBB, B. and GERSON, S. L. 2014. CD133+ cells contribute to radioresistance via altered regulation of DNA repair genes in human lung cancer cells. Radiother Oncol, 110, 538-45.

100. DESANTIS, C. E., LIN, C. C., MARIOTTO, A. B., SIEGEL, R. L., STEIN, K. D., KRAMER, J. L., ALTERI, R., ROBBINS, A. S. and JEMAL, A. 2014. Cancer treatment and survivorship statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 64, 252-71.

101. DESJARDINS, A., REARDON, D. A., PETERS, K. B., THREATT, S., COAN, A. D., HERNDON, J. E., 2ND, FRIEDMAN, A. H., FRIEDMAN, H. S. and VREDENBURGH, J. J. 2011. A phase I trial of the farnesyl transferase inhibitor, SCH 66336, with temozolomide for patients with malignant glioma. J Neurooncol, 105, 601-6.

102. DHUPKAR, M. P. 2011. Effects of epidermal growth factor receptor antibody Cetuximab (C225) in prostate cancer cells, ProQuest, UMI Dissertation Publishing.

103. DIAZ, L. A. J., WILLIAMS, R. T., WU, J., KINDE, I., HECHT, J. R., BERLIN, J., ALLEN, B., BOZIC, I., REITER, J. G., NOWAK, M. A., KINZLER, K. W., OLINER, K. S. and VOGELSTEIN, B. 2012. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature, 486, 537-540.

104. DIENSTMANN, R., BRANA, I., RODON, J. and TABERNERO, J. 2011. Toxicity as a biomarker of efficacy of molecular targeted therapies: focus on EGFR and VEGF inhibiting anticancer drugs. Oncologist, 16, 1729-40.

105. DOBES, P., PODHOREC, J., COUFAL, O., JURECKOVA, A., PETRAKOVA, K., VOJTESEK, B. and HRSTKA, R. 2014. Influence of mutation type on prognostic and predictive values of TP53 status in primary breast cancer patients. Oncol Rep.

158

Page 159: 6.11.14 doktorat_final-final

106. DONG, X., XU, W., SIKES, R. A. and WU, C. 2013. Combination of low dose of genistein and daidzein has synergistic preventive effects on isogenic human prostate cancer cells when compared with individual soy isoflavone. Food Chem, 141, 1923-1933.

107. DORSEY, K. and AGULNIK, M. 2013. Promising new molecular targeted therapies in head and neck cancer. Drugs, 73, 315-25.

108. DUFFY, C., PEREZ, K. and PARTRIDGE, A. 2007. Implications of phytoestrogen intake for breast cancer. CA Cancer J Clin, 57, 260-77.

109. EBA, J., KENMOTSU, H., TSUBOI, M., NIHO, S., KATAYAMA, H., SHIBATA, T., WATANABE, S., YAMAMOTO, N., TAMURA, T. and ASAMURA, H. 2014. A Phase III trial comparing irinotecan and cisplatin with etoposide and cisplatin in adjuvant chemotherapy for completely resected pulmonary high-grade neuroendocrine carcinoma (JCOG1205/1206). Jpn J Clin Oncol, 44, 379-82.

110. EDWIN, F., WIEPZ, G. J., SINGH, R., PEET, C. R. and CHATURVEDI, D. 2006. A historical perspective of the EGF receptor and related systems. Methods Mol Biol, 327, 1-24.

111. EFFERTH, T. 2011. Natural Products as Inhibitors of Epidermal Growth Factor Receptor. 2, 281-301.112. EKE, I., SCHNEIDER, L., FORSTER, C., ZIPS, D., KUNZ-SCHUGHART, L. A. and CORDES, N. 2013.

EGFR/JIP-4/JNK2 signaling attenuates cetuximab-mediated radiosensitization of squamous cell carcinoma cells. Cancer Res, 73, 297-306.

113. EL-RAYES, B. F., PHILIP, P. A., SARKAR, F. H., SHIELDS, A. F., FERRIS, A. M., HESS, K., KASEB, A. O., JAVLE, M. M., VARADHACHARY, G. R., WOLFF, R. A. and ABBRUZZESE, J. L. 2011. A phase II study of isoflavones, erlotinib, and gemcitabine in advanced pancreatic cancer. Invest New Drugs, 29, 694-9.

114. EL SHEIKH, S. S., DOMIN, J., ABEL, P., STAMP, G. and LALANI EL, N. 2004. Phosphorylation of both EGFR and ErbB2 is a reliable predictor of prostate cancer cell proliferation in response to EGF. Neoplasia, 6, 846-53.

115. ERIC J. HALL, A. J. G. Radiobiology for the Radiologist 2011. LWW; Seventh edition.116. EVANS, M., ELLIOTT, J. G., SHARMA, P., BERMAN, R. and GUTHRIE, N. 2011. The effect of

synthetic genistein on menopause symptom management in healthy postmenopausal women: a multi-center, randomized, placebo-controlled study. Maturitas, 68, 189-96.

117. EZOE, S. 2012. Secondary leukemia associated with the anti-cancer agent, etoposide, a topoisomerase II inhibitor. Int J Environ Res Public Health, 9, 2444-53.

118. FAN, P., FAN, S., WANG, H., MAO, J., SHI, Y., IBRAHIM, M. M., MA, W., YU, X., HOU, Z., WANG, B. and LI, L. 2013a. Genistein decreases the breast cancer stem-like cell population through Hedgehog pathway. Stem Cell Res Ther, 4, 146.

119. FAN, Y., HUANG, Z., FANG, L., MIU, L., LIN, N., GONG, L., YU, H., YANG, H. and MAO, W. 2013b. Chemotherapy and EGFR tyrosine kinase inhibitors for treatment of brain metastases from non-small-cell lung cancer: survival analysis in 210 patients. Onco Targets Ther, 6, 1789-803.

120. FLANAGAN, S. A., COOPER, K. S., MANNAVA, S., NIKIFOROV, M. A. and SHEWACH, D. S. 2012. Short hairpin RNA suppression of thymidylate synthase produces DNA mismatches and results in excellent radiosensitization. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 84, e613-20.

121. FLANAGAN, S. A., ROBINSON, B. W., KROKOSKY, C. M. and SHEWACH, D. S. 2007. Mismatched nucleotides as the lesions responsible for radiosensitization with gemcitabine: a new paradigm for antimetabolite radiosensitizers. Mol Cancer Ther, 6, 1858-68.

122. FORTUNE, J. M. and OSHEROFF, N. 2000. Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 64, 221-53.

123. FREI, E., 3RD 1982. The National Cancer Chemotherapy Program. Science, 217, 600-6.124. FUNAKOSHI, T., LATIF, A. and GALSKY, M. D. 2014. Safety and efficacy of addition of VEGFR and

EGFR-family oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors to cytotoxic chemotherapy in solid cancers: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Cancer Treat Rev, 40, 636-47.

125. FURUGAKI, K., YASUNO, H., IWAI, T., MORIYA, Y., HARADA, N. and FUJIMOTO-OUCHI, K. 2014. Melting curve analysis for mutations of EGFR and KRAS. Anticancer Res, 34, 613-21.

126. GABALLAH, K., OAKLEY, R., HILLS, A., RYAN, A. and PARTRIDGE, M. 2009. The antiangiogenic agent ZD4190 prevents tumour outgrowth in a model of minimal residual carcinoma in deep tissues. Br J Cancer, 101, 418-423.

127. GADGEEL, S. M., ALI, S., PHILIP, P. A., WOZNIAK, A. and SARKAR, F. H. 2009. Genistein enhances the effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors and inhibits nuclear factor kappa B in nonsmall cell lung cancer cell lines. Cancer, 115, 2165-76.

159

Page 160: 6.11.14 doktorat_final-final

128. GALVANI, E., ALFIERI, R., GIOVANNETTI, E., CAVAZZONI, A., LA MONICA, S., GALETTI, M., FUMAROLA, C., BONELLI, M., MOR, M., TISEO, M., PETERS, G. J., PETRONINI, P. G. and ARDIZZONI, A. 2013. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors: current status and future perspectives in the development of novel irreversible inhibitors for the treatment of mutant non-small cell lung cancer. Curr Pharm Des, 19, 818-32.

129. GAN, H. K., CVRLJEVIC, A. N. and JOHNS, T. G. 2013. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Febs j, 280, 5350-70.

130. GANGEMI, S., FRANCHINA, T., MINCIULLO, P. L., PROFITA, M., ZANGHÌ, M., DAVID, A., KENNEZ, I. and ADAMO, V. 2013. IL-33/IL-31 axis: A new pathological mechanisms for EGFR tyrosine kinase inhibitors-associated skin toxicity. J Cell Biochem, 114, 2673-2676.

131. GARRIDO-LAGUNA, I., HONG, D. S., JANKU, F., NGUYEN, L. M., FALCHOOK, G. S., FU, S., WHELER, J. J., LUTHRA, R., NAING, A., WANG, X. and KURZROCK, R. 2012. KRASness and PIK3CAness in patients with advanced colorectal cancer: outcome after treatment with early-phase trials with targeted pathway inhibitors. PLoS One, 7, e38033.

132. GEORGETTI, S. R., CASAGRANDE, R., VICENTINI, F. T., BARACAT, M. M., VERRI, W. A., JR. and FONSECA, M. J. 2013. Protective effect of fermented soybean dried extracts against TPA-induced oxidative stress in hairless mice skin. Biomed Res Int, 2013, 340626.

133. GHATTASS, K., ASSAH, R., EL-SABBAN, M. and GALI-MUHTASIB, H. 2013. Targeting hypoxia for sensitization of tumors to radio- and chemotherapy. Curr Cancer Drug Targets, 13, 670-85.

134. GLYNNE-JONES, R., MAWDSLEY, S. and HARRISON, M. 2010. Cetuximab and chemoradiation for rectal cancer--is the water getting muddy? Acta Oncol, 49, 278-86.

135. GOGLER-PIGŁOWSKA, A., RUSIN, A., BOCHENEK, D. and KRAWCZYK, Z. 2012. Aneugenic effects of the genistein glycosidic derivative substituted at C7 with the unsaturated disaccharide. Cell Biol Toxicol, 28, 331-342.

136. GOLDBERG, S. B., OXNARD, G. R., DIGUMARTHY, S., MUZIKANSKY, A., JACKMAN, D. M., LENNES, I. T. and SEQUIST, L. V. 2013. Chemotherapy with Erlotinib or chemotherapy alone in advanced non-small cell lung cancer with acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Oncologist, 18, 1214-20.

137. GRAVINA, G. L., FESTUCCIA, C., MARAMPON, F., POPOV, V. M., PESTELL, R. G., ZANI, B. M. and TOMBOLINI, V. 2010. Biological rationale for the use of DNA methyltransferase inhibitors as new strategy for modulation of tumor response to chemotherapy and radiation. Mol Cancer, 9, 305.

138. GROSELJ, B., SHARMA, N. L., HAMDY, F. C., KERR, M. and KILTIE, A. E. 2013. Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers: effects on DNA damage signalling and repair. Br J Cancer, 108, 748-754.

139. GRUCA, A. 2009. Zmiana poziomu fosforylacji kinazy tyrozynowej EGFR w komórkach nowotworowych poddanych działaniu pochodnych genisteiny i promieniowania jonizującego. Uniwersytet Śląski. Wydział Biologii i Ochrony Środowiska. Praca magisterska.

140. GRUCA, A., KRAWCZYK, Z., SZEJA, W., GRYNKIEWICZ G., RUSIN A. 2014. Synthetic genistein glycosides inhibiting EGFR phosphorylation enhance the effect of radiation in HCT 116 colon cancer cells. Molecules, publikacja wstępnie zaakceptowano do druku.

141. GRYNKIEWICZ, G., SZEJA, W. and BORYSKI, J. 2008. Synthetic analogs of natural glycosides in drug discovery and development. Acta Pol Pharm, 65, 655-76.

142. GUO, A., VILLÉN, J., KORNHAUSER, J., LEE, K. A., STOKES, M. P., RIKOVA, K., POSSEMATO, A., NARDONE, J., INNOCENTI, G., WETZEL, R., WANG, Y., MACNEILL, J., MITCHELL, J., GYGI, S. P., RUSH, J., POLAKIEWICZ, R. D. and COMB, M. J. 2008. Signaling networks assembled by oncogenic EGFR and c-Met. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105, 692-697.

143. GUPTA, C. and PRAKASH, D. 2014. Phytonutrients as therapeutic agents. J Complement Integr Med.144. GUTTMANN, D. M. and KOUMENIS, C. 2011. The heat shock proteins as targets for radiosensitization

and chemosensitization in cancer. Cancer Biol Ther, 12, 1023-1031.145. HA, C. T., LI, X. H., FU, D., XIAO, M. and LANDAUER, M. R. 2013. Genistein nanoparticles protect

mouse hematopoietic system and prevent proinflammatory factors after gamma irradiation. Radiat Res, 180, 316-25.

146. HAAS-KOGAN, D. A., BANERJEE, A., POUSSAINT, T. Y., KOCAK, M., PRADOS, M. D., GEYER, J. R., FOULADI, M., BRONISCER, A., MINTURN, J. E., POLLACK, I. F., PACKER, R. J., BOYETT, J. M. and KUN, L. E. 2011. Phase II trial of tipifarnib and radiation in children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine gliomas. Neuro Oncol, 13, 298-306.

147. HAGTVET, E., ROE, K. and OLSEN, D. R. 2011. Liposomal doxorubicin improves radiotherapy response in hypoxic prostate cancer xenografts. Radiat Oncol, 6, 135.

160

Page 161: 6.11.14 doktorat_final-final

148. HAGLUND, K. and DIKIC, I. 2012. The role of ubiquitylation in receptor endocytosis and endosomal sorting. J Cell Sci, 125(Pt 2), 265-275.

149. HAMALAINEN, M., NIEMINEN, R., VUORELA, P., HEINONEN, M. and MOILANEN, E. 2007. Anti-inflammatory effects of flavonoids: genistein, kaempferol, quercetin, and daidzein inhibit STAT-1 and NF-kappaB activations, whereas flavone, isorhamnetin, naringenin, and pelargonidin inhibit only NF-kappaB activation along with their inhibitory effect on iNOS expression and NO production in activated macrophages. Mediators Inflamm, 2007, 45673.

150. HAMBLEY, T. W. and HAIT, W. N. 2009. Is anticancer drug development heading in the right direction? Cancer Res, 69, 1259-62.

151. HAN, J., KURITA, Y. and ISODA, H. 2013. Genistein-induced G2/M cell cycle arrest of human intestinal colon cancer Caco-2 cells is associated with Cyclin B1 and Chk2 down-regulation. Cytotechnology, 65, 973-8.

152. HAO, F., KUMAR, S., YADAV, N. and CHANDRA, D. 2014. Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment. Biochim Biophys Acta, 1846, 247-257.

153. HARBRON, R. W., FELTBOWER, R. G., GLASER, A., LILLEY, J. and PEARCE, M. S. 2014. Secondary malignant neoplasms following radiotherapy for primary cancer in children and young adults. Pediatr Hematol Oncol, 31, 259-67.

154. HARJES, U., BENSAAD, K. and HARRIS, A. L. 2012. Endothelial cell metabolism and implications for cancer therapy. Br J Cancer, 107, 1207-12.

155. HARRABI, S., COMBS, S. E., BRONS, S., HABERER, T., DEBUS, J. and WEBER, K. J. 2013. Temozolomide in combination with carbon ion or photon irradiation in glioblastoma multiforme cell lines - does scheduling matter? Int J Radiat Biol, 89, 692-7.

156. HARTMANN, J. T., HAAP, M., KOPP, H. G. and LIPP, H. P. 2009. Tyrosine kinase inhibitors - a review on pharmacology, metabolism and side effects. Curr Drug Metab, 10, 470-481.

157. HARTMANN, J. T., KOLLMANNSBERGER, C., CASCORBI, I., MAYER, F., SCHITTENHELM, M. M., HEEGER, S. and BOKEMEYER, C. 2013. A phase I pharmacokinetic study of matuzumab in combination with paclitaxel in patients with EGFR-expressing advanced non-small cell lung cancer. Invest New Drugs, 31, 661-8.

158. HATANPAA, K. J., BURMA, S., ZHAO, D. and HABIB, A. A. 2010. Epidermal growth factor receptor in glioma: signal transduction, neuropathology, imaging, and radioresistance. Neoplasia, 12, 675-84.

159. HAZRA, B., GHOSH, S., KUMAR, A. and PANDEY, B. N. 2011. The prospective role of plant products in radiotherapy of cancer: a current overview. Front Pharmacol, 2, 94.

160. HE, X. Y., LIU, X. J., CHEN, X., BIAN, L. G., ZHAO, W. G., SHEN, J. K. and SUN, Q. F. 2013. Gambogic acid induces EGFR degradation and Akt/mTORC1 inhibition through AMPK dependent-LRIG1 upregulation in cultured U87 glioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 435, 397-402.

161. HEISIG, P. 2009. Type II topoisomerases--inhibitors, repair mechanisms and mutations. Mutagenesis, 24, 465-9.

162. HERMANN, R. M., FEST, J., CHRISTIANSEN, H., HILLE, A., RAVE-FRANK, M., NITSCHE, M., GRUNDKER, C., VIERECK, V., JARRY, H. and SCHMIDBERGER, H. 2007. Radiosensitization dependent on p53 function in bronchial carcinoma cells by the isoflavone genistein and estradiol in vitro. Strahlenther Onkol, 183, 195-202.

163. HICKS, K. O., SIIM, B. G., JAISWAL, J. K., PRUIJN, F. B., FRASER , A., PATEL, R., HOGG, A., LIYANAGE , H. D., DORIE, M. J., BROWN, J. M., DENNY, W. A., HAY, M. P. and WILSON, W. R. 2010. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling identifies SN30000 and SN29751 as tirapazamine analogues with improved tissue penetration and hypoxic cell killing in tumors. Clin Cancer Res, 16, 4946-4957.

164. HIJIYA, N., NESS, K. K., RIBEIRO, R. C. and HUDSON, M. M. 2009. Acute leukemia as a secondary malignancy in children and adolescents: current findings and issues. Cancer, 115, 23-35.

165. HILAKIVI-CLARKE, L., ANDRADE, J. E. and HELFERICH, W. 2010. Is soy consumption good or bad for the breast? J Nutr, 140, 2326s-2334s.

166. HILLMAN, G. G. and SINGH-GUPTA, V. 2011. Soy isoflavones sensitize cancer cells to radiotherapy. Free Radic Biol Med, 51, 289-98.

167. HILLMAN, G. G., SINGH-GUPTA, V., HOOGSTRA, D. J., ABERNATHY, L., RAKOWSKI, J., YUNKER, C. K., ROTHSTEIN, S. E., SARKAR, F. H., GADGEEL, S., KONSKI, A. A., LONARDO, F. and JOINER, M. C. 2013. Differential effect of soy isoflavones in enhancing high intensity radiotherapy and protecting lung tissue in a pre-clinical model of lung carcinoma. Radiother Oncol, 109, 117-25.

161

Page 162: 6.11.14 doktorat_final-final

168. HILLMAN, G. G., WANG, Y., CHE, M., RAFFOUL, J. J., YUDELEV, M., KUCUK, O. and SARKAR, F. H. 2007. Progression of renal cell carcinoma is inhibited by genistein and radiation in an orthotopic model. BMC Cancer, 7, 4.

169. HOMEY, B., GERBER, P. A., WOLLENBERG, A., DIRSCHKA, T., HASSEL, J. C., BOLKE, E., HAUSCHILD, A. and GUTZMER, R. 2012. Escalating therapy of cutaneous side effects of EGFR inhibitors: experience of German reference centers. J Dtsch Dermatol Ges, 10, 559-63.

170. HONDA, N., YAGI, K., DING, G. R. and MIYAKOSHI, J. 2002. Radiosensitization by overexpression of the nonphosphorylation form of IkappaB-alpha in human glioma cells. J Radiat Res, 43, 283-92.

171. HONG, B., LUI, V. W., HUI, E. P., NG, M. H., CHENG, S. H., SUNG, F. L., TSANG, C. M., TSAO, S. W. and CHAN, A. T. 2011. Hypoxia-targeting by tirapazamine (TPZ) induces preferential growth inhibition of nasopharyngeal carcinoma cells with Chk1/2 activation. Invest New Drugs, 29, 401-10.

172. HONG, H., LANDAUER, M. R., FORISKA, M. A. and LEDNEY, G. D. 2006. Antibacterial activity of the soy isoflavone genistein. J Basic Microbiol, 46, 329-35.

173. HONG, L., HAN, Y. and BRAIN, L. 2013. Epidermal growth factor receptor: an important target in esophageal cancer. Expert Opin Ther Targets, 17, 1179-85.

174. HORMANN, V., KUMI-DIAKA, J., DURITY, M. and RATHINAVELU, A. 2012. Anticancer activities of genistein-topotecan combination in prostate cancer cells. J Cell Mol Med, 16, 2631-6.

175. HOSSEINIMEHR, S. J. 2014. Beneficial effects of natural products on cells during ionizing radiation. Rev Environ Health.

176. HSIEH, C. Y., SANTELL, R. C., HASLAM, S. Z. and HELFERICH, W. G. 1998. Estrogenic effects of genistein on the growth of estrogen receptor-positive human breast cancer (MCF-7) cells in vitro and in vivo. Cancer Res, 58, 3833-8.

177. HU, X. J., XIE, M. Y., KLUXEN, F. M. and DIEL, P. 2014. Genistein modulates the anti-tumor activity of cisplatin in MCF-7 breast and HT-29 colon cancer cells. Arch Toxicol, 88, 625-35.

178. HUANG, G., WANG, H. and YANG, L. X. 2010. Enhancement of radiation-induced DNA damage and inhibition of its repair by a novel camptothecin analog. Anticancer Res, 30, 937-44.

179. HUANG, W., WAN, C., LUO, Q., HUANG, Z. and LUO, Q. 2014. Genistein-inhibited cancer stem cell-like properties and reduced chemoresistance of gastric cancer. Int J Mol Sci, 15, 3432-43.

180. HWANG, Y. W., KIM, S. Y., JEE, S. H., KIM, Y. N. and NAM, C. M. 2009. Soy food consumption and risk of prostate cancer: a meta-analysis of observational studies. Nutr Cancer, 61, 598-606.

181. HWANGBO, W., LEE, J. H., AHN, S., KIM, S., PARK, K. H., KIM, C. H. and KIM, I. 2013. EGFR Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Ductal Carcinoma of the Breast. Korean J Pathol, 47, 107-15.

182. IIDA, K., NAKAYAMA, K., RAHMAN, M. T., RAHMAN, M., ISHIKAWA, M., KATAGIRI, A., YEASMIN, S., OTSUKI, Y., KOBAYASHI, H., NAKAYAMA, S. and MIYAZAKI, K. 2011. EGFR gene amplification is related to adverse clinical outcomes in cervical squamous cell carcinoma, making the EGFR pathway a novel therapeutic target. Br J Cancer, 105, 420-7.

183. IKEDA, M., MATSUMOTO, K., NIIBE, Y., SATOH, T., FUJITA, T., IWAMURA, M., ISHIYAMA, H., KOTANI, S., HAYAKAWA, K. and BABA, S. 2011. The radiotherapy with methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin treatment is an effective therapeutic option in patients with advanced or metastatic bladder cancer. J Radiat Res, 52, 674-9.

184. IRACE, C., MARINI, H., BITTO, A., ALTAVILLA, D., POLITO, F., ADAMO, E. B., ARCORACI, V., MINUTOLI, L., DI BENEDETTO, A., DI VIESTE, G., DE GREGORIO, C., GNASSO, A., CORRAO, S., LICATA, G. and SQUADRITO, F. 2013. Genistein and endothelial function in postmenopausal women with metabolic syndrome. Eur J Clin Invest, 43, 1025-31.

185. ITO, T., ANDO H., SUZUKI T., OGURA T., HOTTA K., IMAMURA Y., YAMAGUCHI Y., HANDA H.2010. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science, 327:5971, 1345-1350.

186. JACKSON, S. P. and BARTEK, J. 2009. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature, 461, 1071-1078.

187. JAVVADI, P., MAKINO, H., DAS, A. K., LIN, Y. F., CHEN, D. J., CHEN, B. P. and NIRODI, C. S. 2012. Threonine 2609 phosphorylation of the DNA-dependent protein kinase is a critical prerequisite for epidermal growth factor receptor-mediated radiation resistance. Mol Cancer Res, 10, 1359-68.

188. JAYAKUMAR, S., KUNWAR, A., SANDUR, S. K., PANDEY, B. N. and CHAUBEY, R. C. 2014. Differential response of DU145 and PC3 prostate cancer cells to ionizing radiation: role of reactive oxygen species, GSH and Nrf2 in radiosensitivity. Biochim Biophys Acta, 1840, 485-94.

162

Page 163: 6.11.14 doktorat_final-final

189. JEDLINSKI, A., ANSELL, A., JOHANSSON, A. C. and ROBERG, K. 2013. EGFR status and EGFR ligand expression influence the treatment response of head and neck cancer cell lines. J Oral Pathol Med, 42, 26-36.

190. JEMAL, A., BRAY, F., CENTER, M. M., FERLAY, J., WARD, E. and FORMAN, D. 2011. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 61, 69-90.

191. JHAWER, M., GOEL, S., WILSON, A. J., MONTAGNA, C., LING, Y.-H., BYUN, D.-S., NASSER, S., ARANGO, D., SHIN, J., KLAMPFER, L., AUGENLICHT, L. H., SOLER, R. P. and MARIADASON, J. M. 2008. PIK3CA Mutation/PTEN Expression Status Predicts Response of Colon Cancer Cells to the Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab. Cancer Research, 68, 1953-1961.

192. JOHNSON, D. E. 2012. Targeting proliferation and survival pathways in head and neck cancer for therapeutic benefit. Chin J Cancer, 31, 319-326.

193. JOINER, M. C., VAN DER KOGEL, A. J. and STEEL, G. G. 2009. Introduction: the significance of radiobiology and radiotherapy for cancer treatment. In: JOINER, M. C. and VAN DER KOGEL, A. J. (eds.) Basic Clinical Radiobiology. 4th edition. London: Hodder Arnold.

194. JU, Y. H., ALLRED, C. D., ALLRED, K. F., KARKO, K. L., DOERGE, D. R. and HELFERICH, W. G. 2001. Physiological concentrations of dietary genistein dose-dependently stimulate growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) tumors implanted in athymic nude mice. J Nutr, 11, 131.

195. KALMAN, B., SZEP, E., GARZULY, F. and POST, D. E. 2013. Epidermal growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma. Neuromolecular Med, 15, 420-34.

196. KAO, J., GENDEN, E. M., POLICARPIO, E. L., BURRI, R. J., RIVERA, M., GURUDUTT, V., SOM, P. M., TENG, M. and PACKER, S. H. 2011. Phase 2 trial of concurrent 5-fluorouracil, hydroxyurea, cetuximab, and hyperfractionated intensity-modulated radiation therapy for locally advanced head and neck cancer. Cancer, 117, 318-326.

197. KARIKAS, G. A. 2010. Anticancer and chemopreventing natural products: some biochemical and therapeutic aspects. J BUON, 15, 627-638.

198. KASID, U. and DRITSCHILO, A. 2003. RAF antisense oligonucleotide as a tumor radiosensitizer. Oncogene, 22, 5876-5884.

199. KATO, S., KIMURA, M., KAGEYAMA, K., TANAKA, H. and MIWA, N. 2012. Enhanced radiosensitization by liposome-encapsulated pimonidazole for anticancer effects on human melanoma cells. J Nanosci Nanotechnol, 12, 4472-7.

200. KAWAMOTO, T., SATO, J. D., LE, A., POLIKOFF, J., SATO, G. H. and MENDELSOHN, J. 1983. Growth stimulation of A431 cells by epidermal growth factor: identification of high-affinity receptors for epidermal growth factor by an anti-receptor monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 1337–1341.

201. KESARI, S., ADVANI, S. J., LAWSON, J. D., KAHLE, K. T., NG, K., CARTER, B. and CHEN, C. C. 2011. DNA damage response and repair: insights into strategies for radiation sensitization of gliomas. Future Oncol, 7, 1335-46.

202. KETRON, A. and OSHEROFF, N. 2014. Phytochemicals as anticancer and chemopreventive topoisomerase II poisons. Phytochemistry Reviews, 13, 19-35.

203. KHAGHANZADEH, N., MOJTAHEDI, Z., RAMEZANI, M., ERFANI, N. and GHADERI, A. 2012. Umbelliprenin is cytotoxic against QU-DB large cell lung cancer cell line but anti-proliferative against A549 adenocarcinoma cells. Daru, 20, 69.

204. KIL, W. J., CERNA, D., BURGAN, W. E., BEAM, K., CARTER, D., STEEG, P. S., TOFILON, P. J. and CAMPHAUSEN, K. 2008. In vitro and in vivo radiosensitization induced by the DNA methylating agent temozolomide. Clin Cancer Res, 14, 931-938.

205. KIM, E. J., SHIN, H. K. and PARK, J. H. 2005a. Genistein inhibits insulin-like growth factor-I receptor signaling in HT-29 human colon cancer cells: a possible mechanism of the growth inhibitory effect of Genistein. J Med Food, 8, 431-8.

206. KIM, E. J., SHIN, H. K. and PARK, J. H. 2005b. Genistein inhibits insulin-like growth factor-I receptor signaling in HT-29 human colon cancer cells: a possible mechanism of the growth inhibitory effect of Genistein. J Med Food, 8, 431-438.

207. KIM, J. S., HEO, K., YI, J. M., GONG, E. J., YANG, K., MOON, C. and KIM, S. H. 2012. Genistein mitigates radiation-induced testicular injury. Phytother Res, 26, 1119-1125.

208. KIM, M. J., BYUN, J. Y., YUN, C. H., PARK, I. C., LEE, K. H. and LEE, S. J. 2008. c-Src-p38 mitogen-activated protein kinase signaling is required for Akt activation in response to ionizing radiation. Mol Cancer Res, 6, 1872-80.

163

Page 164: 6.11.14 doktorat_final-final

209. KIM, S. H., KIM, S. H., KIM, Y. B., JEON, Y. T., LEE, S. C. and SONG, Y. S. 2009. Genistein inhibits cell growth by modulating various mitogen-activated protein kinases and AKT in cervical cancer cells. Ann N Y Acad Sci, 1171, 495-500.

210. KIM, S. H., SHIM, H. S., CHO, J., JEONG, J. H., KIM, S. M., HONG, Y. K., SUNG, J. H., HA, S. J., KIM, H. R., CHANG, H., KIM, J. H., TANIA, C. and CHO, B. C. 2013. A phase I trial of gefitinib and nimotuzumab in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer, 79, 270-5.

211. KIM, W., SEONG, K. M. and YOUN, B. 2011. Phenylpropanoids in radioregulation: double edged sword. Exp Mol Med, 43, 323-33.

212. KLAUSER, E., GULDEN, M., MASER, E., SEIBERT, S. and SEIBERT, H. 2014. Additivity, antagonism, and synergy in arsenic trioxide-induced growth inhibition of C6 glioma cells: effects of genistein, quercetin and buthionine-sulfoximine. Food Chem Toxicol, 67, 212-21.

213. KMA, L. 2014. Plant extracts and plant-derived compounds: promising players in a countermeasure strategy against radiological exposure. Asian Pac J Cancer Prev, 15, 2405-25.

214. KO, K. P., KIM, S. W., MA, S. H., PARK, B., AHN, Y., LEE, J. W., LEE, M. H., KANG, E., KIM, L. S., JUNG, Y., CHO, Y. U., LEE, B., LIN, J. H. and PARK, S. K. 2013. Dietary intake and breast cancer among carriers and noncarriers of BRCA mutations in the Korean Hereditary Breast Cancer Study. Am J Clin Nutr, 98, 1493-501.

215. KOBUNAI, T., WATANABE, T. and FUKUSATO, T. 2011. REG4, NEIL2, and BIRC5 gene expression correlates with gamma-radiation sensitivity in patients with rectal cancer receiving radiotherapy. Anticancer Res, 31, 4147-53.

216. KOIVISTO, L., JIANG, G., HAKKINEN, L., CHAN, B. and LARJAVA, H. 2006. HaCaT keratinocyte migration is dependent on epidermal growth factor receptor signaling and glycogen synthase kinase-3alpha. Exp Cell Res, 312, 2791-805.

217. KOPPENOL, W. H., BOUNDS, P. L. and DANG, C. V. 2011. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer, 11, 325-37.

218. KOUKOURAKIS, M. I., GIATROMANOLAKI, A., PITIAKOUDIS, M. K., KOUKLAKIS, G., TSOUTSOU, P., ABATZOGLOU, I., PANTELIADOU, M., SISMANIDOU, K., SIVRIDIS, E. and BOULIKAS, T. 2010. Concurrent liposomal cisplatin (Lipoplatin), 5-fluorouracil and radiotherapy for the treatment of locally advanced gastric cancer: a phase I/II study. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 78, 150-155.

219. KRAUSE, M., GURTNER, K., DEUSE, Y. and BAUMANN, M. 2009. Heterogeneity of tumour response to combined radiotherapy and EGFR inhibitors: differences between antibodies and TK inhibitors. Int J Radiat Biol, 85, 943-54.

220. KRAUSE, M., OSTERMANN, G., PETERSEN, C., YAROMINA, A., HESSEL, F., HARSTRICK, A., VAN DER KOGEL, A. J., THAMES, H. and BAUMANN, M. 2005. Decreased repopulation as well as increased reoxygenation contribute to the improvement in local control after targeting of the EGFR by C225 during fractionated irradiation. Radiother Oncol, 76, 162-167.

221. KUBOTA, K., HIDA, T., ISHIKURA, S., MIZUSAWA, J., NISHIO, M., KAWAHARA, M., YOKOYAMA, A., IMAMURA, F., TAKEDA, K., NEGORO, S., HARADA, M., OKAMOTO, H., YAMAMOTO, N., SHINKAI, T., SAKAI, H., MATSUI, K., NAKAGAWA, K., SHIBATA, T., SAIJO, N. and TAMURA, T. 2014. Etoposide and cisplatin versus irinotecan and cisplatin in patients with limited-stage small-cell lung cancer treated with etoposide and cisplatin plus concurrent accelerated hyperfractionated thoracic radiotherapy (JCOG0202): a randomised phase 3 study. Lancet Oncol, 15, 106-13.

222. KUIPER, G. G., LEMMEN, J. G., CARLSSON, B., CORTON, J. C., SAFE, S. H., VAN DER SAAG, P. T., VAN DER BURG, B. and GUSTAFSSON, J. A. 1998. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology, 139, 4252-63.

223. KUNOS, C. A. 2014. Novel biological radiochemotherapy approaches in locally advanced-stage cervical cancer management. Discov Med, 17, 179-86.

224. LA FERLA, B., AIROLDI, C., ZONA, C., ORSATO, A., CARDONA, F., MERLO, S., SIRONI, E., D'ORAZIO, G. and NICOTRA, F. 2011. Natural glycoconjugates with antitumor activity. Nat Prod Rep, 28, 630-48.

225. LACOMBE, J., AZRIA, D., MANGE, A. and SOLASSOL, J. 2013. Proteomic Approaches to Identify Biomarkers Predictive of Radiotherapy Outcomes. Expert Rev Proteomics, 10, 33-42.

226. LAIMER, K., SPIZZO, G., GASTL, G., OBRIST, P., BRUNHUBER, T., FONG, D., BARBIERI, V., JANK, S., DOPPLER, W., RASSE, M. and NORER, B. 2007. High EGFR expression predicts poor

164

Page 165: 6.11.14 doktorat_final-final

prognosis in patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx: a TMA-based immunohistochemical analysis. Oral Oncol, 43, 193-198.

227. LAMARTINIERE, C. A. 2000. Protection against breast cancer with genistein: a component of soy. Am J Clin Nutr, 71, 1705S-7S; discussion 1708S-9S.

228. LANGENBACHER, M., ABDEL-JALIL, R. J., VOELTER, W., WEINMANN, M. and HUBER, S. M. 2013. In vitro hypoxic cytotoxicity and hypoxic radiosensitization. Efficacy of the novel 2-nitroimidazole N,N,N-tris[2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethyl]amine. Strahlenther Onkol, 189, 246-54.

229. LANOIX, J.-P., PLUQUET, E., LESCURE, F., BENTAYEB, H., LECUYER, E., BOUTEMY, M., DUMONT, P., JOUNIEAUX, V., SCHMIT, J., DAYEN, C. and DOUADI, Y. 2011. Bacterial infection profiles in lung cancer patients with febrile neutropenia. BMC Infectious Diseases, 11, 183.

230. LARSEN, A. K., OUARET, D., EL OUADRANI, K. and PETITPREZ, A. 2011. Targeting EGFR and VEGF(R) pathway cross-talk in tumor survival and angiogenesis. Pharmacol Ther, 131, 80-90.

231. LEBEDEVA, I. V., SU, Z. Z., EMDAD, L., KOLOMEYER, A., SARKAR, D., KITADA, S., WAXMAN, S., REED, J. C. and FISHER, P. B. 2007. Targeting inhibition of K-ras enhances Ad.mda-7-induced growth suppression and apoptosis in mutant K-ras colorectal cancer cells. Oncogene, 26, 733-744.

232. LEE, P. C., CHIOU, Y. C., WONG, J. M., PENG, C. L. and SHIEH, M. J. 2013. Targeting colorectal cancer cells with single-walled carbon nanotubes conjugated to anticancer agent SN-38 and EGFR antibody. Biomaterials, 34, 8756-65.

233. LEPRI, S. R., ZANELATTO, L. C., DA SILVA, P. B., SARTORI, D., RIBEIRO, L. R. and MANTOVANI, M. S. 2014. The effects of genistein and daidzein on cell proliferation kinetics in HT29 colon cancer cells: the expression of CTNNBIP1 (beta-catenin), APC (adenomatous polyposis coli) and BIRC5 (survivin). Hum Cell, 27, 78-84.

234. LETHABY, A., MARJORIBANKS, J., KRONENBERG, F., ROBERTS, H., EDEN, J. and BROWN, J. 2013. Phytoestrogens for menopausal vasomotor symptoms. Cochrane Database Syst Rev, 12, Cd001395.

235. LI, B., YUAN, M., KIM, I. A., CHANG, C. M., BERNHARD, E. J. and SHU, H. K. 2004. Mutant epidermal growth factor receptor displays increased signaling through the phosphatidylinositol-3 kinase/AKT pathway and promotes radioresistance in cells of astrocytic origin. Oncogene, 23, 4594-602.

236. LI, F., ZHAO, C. and WANG, L. 2014. Molecular-targeted agents combination therapy for cancer: developments and potentials. Int J Cancer, 134, 1257-69.

237. LI, H., XU, W., HUANG, Y., HUANG, X., XU, L. and LV, Z. 2012a. Genistein demethylates the promoter of CHD5 and inhibits neuroblastoma growth in vivo. Int J Mol Med, 30, 1081-6.

238. LI, H. F., KIM, J. S. and WALDMAN, T. 2009. Radiation-induced Akt activation modulates radioresistance in human glioblastoma cells. Radiat Oncol, 4, 43.

239. LI, H. Q., LUO, Y. and QIAO, C. H. 2012b. The mechanisms of anticancer agents by genistein and synthetic derivatives of isoflavone. Mini Rev Med Chem, 12, 350-62.

240. LI, H. Q., XUE, J. Y., SHI, L., GUI, S. Y. and ZHU, H. L. 2008a. Synthesis, crystal structure and antimicrobial activity of deoxybenzoin derivatives from genistein. Eur J Med Chem, 43, 662-7.

241. LI, J., YANG, C. X., MEI, Z. J., CHEN, J., ZHANG, S. M., SUN, S. X., ZHOU, F. X., ZHOU, Y. F. and XIE, C. H. 2013a. Involvement of cdc25c in cell cycle alteration of a radioresistant lung cancer cell line established with fractionated ionizing radiation. Asian Pac J Cancer Prev, 14, 5725-30.

242. LI, L. and LEUNG, P. S. 2014. Use of herbal medicines and natural products: An alternative approach to overcoming the apoptotic resistance of pancreatic cancer. Int J Biochem Cell Biol, 53c, 224-236.

243. LI, Q. S., LI, C. Y., LI, Z. L. and ZHU, H. L. 2012c. Genistein and its synthetic analogs as anticancer agents. Anticancer Agents Med Chem, 12, 271-81.

244. LI, T. K. and LIU, T. F. 2001. LI T.K., LIU L.F. Annu Rev Phamacol Toxicol,, 41, 3-77.245. LI, Y., CHEN, H., HARDY, T. M. and TOLLEFSBOL, T. O. 2013b. Epigenetic regulation of multiple

tumor-related genes leads to suppression of breast tumorigenesis by dietary genistein. PLoS One, 8, e54369.

246. LI, Z., JIN, K., LAN, H. and TENG, L. 2011. Heterogeneity in primary colorectal cancer and its corresponding metastases: a potential reason of EGFR-targeted therapy failure? Hepatogastroenterology, 58, 411-6.

247. LI, Z., LI, J., MO, B., HU, C., LIU, H., QI, H., WANG, X. and XU, J. 2008b. Genistein induces G2/M cell cycle arrest via stable activation of ERK 1/2 pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Cell Biol Toxicol, 24, 401-9.

248. LIANG, C., LI, H., SHEN, C., LAI, J., SHI, Z., LIU, B. and TAO, H. M. 2012. Genistein potentiates the anti-cancer effects of gemcitabine in human osteosarcoma via the downregulation of Akt and nuclear factor-κB pathway. Anticancer Agents Med Chem, 12, 554-563.

165

Page 166: 6.11.14 doktorat_final-final

249. LICCARDI, G., HARTLEY, J. A. and HOCHHAUSER, D. 2011. EGFR nuclear translocation modulates DNA repair following cisplatin and ionizing radiation treatment. Cancer Res, 71, 1103-1114.

250. LINKOUS, A. G. and YAZLOVITSKAYA, E. M. 2012. Novel radiosensitizing anticancer therapeutics. Anticancer Res, 32, 2487-99.

251. LIPINSKI, C.A., LOMBARDO F., DOMINY B.W., FEENEY P.J. 2001. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev, 46 (1-3), 3–26

252. LIU, W., FAN, L. X., ZHOU, X., SWEENEY, W. E., JR., AVNER, E. D. and LI, X. 2012a. HDAC6 regulates epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytic trafficking and degradation in renal epithelial cells. PLoS One, 7, e49418.

253. LIU, X., SUN, C., JIN, X., LI, P., YE, F., ZHAO, T., GONG, L. and LI, Q. 2013a. Genistein enhances the radiosensitivity of breast cancer cells via G(2)/M cell cycle arrest and apoptosis. Molecules, 18, 13200-17.

254. LIU, Y. L., ZHANG, G. Q., YANG, Y., ZHANG, C. Y., FU, R. X. and YANG, Y. M. 2013b. Genistein induces G2/M arrest in gastric cancer cells by increasing the tumor suppressor PTEN expression. Nutr Cancer, 65, 1034-41.

255. LIU, Z. G., LIU, L., XU, L. H., YI, W., TAO, Y. L., TU, Z. W. and LI, M. Z. 2012b. Bmi-1 induces radioresistance in MCF-7 mammary carcinoma cells. Oncol Rep, 27, 1116-1122.

256. LOMAX, M. E., FOLKES, L. K. and O'NEILL, P. 2013. Biological consequences of radiation-induced DNA damage: relevance to radiotherapy. Clin Oncol (R Coll Radiol), 25, 578-85.

257. LONG, W. and LIU, P. 2010. Quantitative structure activity relationship modeling for predicting radiosensitization effectiveness of nitroimidazole compounds. J Radiat Res, 51, 563-72.

258. LORIOT, Y., MORDANT, P., BROWN, B. D., BOURHIS, J., SORIA, J. C. and DEUTSCH, E. 2010. Inhibition of BCL-2 in small cell lung cancer cell lines with oblimersen, an antisense BCL-2 oligodeoxynucleotide (ODN): in vitro and in vivo enhancement of radiation response. Anticancer Res, 30, 3869-3878.

259. MAHMOUD, A. M., YANG, W. and BOSLAND, M. C. 2014. Soy isoflavones and prostate cancer: a review of molecular mechanisms. J Steroid Biochem Mol Biol, 140, 116-32.

260. MAK, L., LIGGI, S., TAN, L., KUSONMANO, K., ROLLINGER, J. M., KOUTSOUKAS, A., GLEN, R. C. and KIRCHMAIR, J. 2013. Anti-cancer drug development: computational strategies to identify and target proteins involved in cancer metabolism. Curr Pharm Des, 19, 532-77.

261. MALAGON, I., ONKENHOUT, W., KLOK, M., VAN DER POEL, P. F., BOVILL, J. G. and HAZEKAMP, M. G. 2006. Rhamnose and rhamnitol in dual sugar permeability tests. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 43, 265-6.

262. MALAPELLE, U., CARLOMAGNO, C., DE LUCA, C., BELLEVICINE, C. and TRONCONE, G. 2014. KRAS testing in metastatic colorectal carcinoma: challenges, controversies, breakthroughs and beyond. J Clin Pathol, 67, 1-9.

263. MARINELLI, M., PERAGINE, N., DI MAIO, V., CHIARETTI, S., DE PROPRIS, M. S., RAPONI, S., TAVOLARO, S., MAURO, F. R., DEL GIUDICE, I., GUARINI, A. and FOA, R. 2013. Identification of molecular and functional patterns of p53 alterations in chronic lymphocytic leukemia patients in different phases of the disease. Haematologica, 98, 371-5.

264. MARKOVITS, J., LINASSIER, C., FOSSE, P., COUPRIE, J., PIERRE, J., JACQUEMIN-SABLON, A., SAUCIER, J. M., LE PECQ, J. B. and LARSEN, A. K. 1989. Inhibitory effects of the tyrosine kinase inhibitor genistein on mammalian DNA topoisomerase II. Cancer Res, 49, 5111-7.

265. MARTIN-CORDERO, C., LOPEZ-LAZARO, M., PINERO, J., ORTIZ, T., CORTES, F. and AYUSO, M. J. 2000. Glucosylated isoflavones as DNA topoisomerase II poisons. J Enzyme Inhib, 15, 455-60.

266. MASUI, H., KAWAMOTO, T., SATO, J. D., WOLF B, B., SATO, G. and MENDELSOHN, J. 1984. Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res, 44, 1002-1007.

267. MATSUKURA, H., AISAKI, K., IGARASHI, K., MATSUSHIMA, Y., KANNO, J., MURAMATSU, M., SUDO, K. and SATO, N. 2011. Genistein promotes DNA demethylation of the steroidogenic factor 1 (SF-1) promoter in endometrial stromal cells. Biochem Biophys Res Commun, 412, 366-72.

268. MAZUMDER, K., TANAKA, K. and FUKASE, K. 2013. Cytotoxic activity of ursolic acid derivatives obtained by isolation and oxidative derivatization. Molecules, 18, 8929-44.

269. MCCALL, J. L., BURICH, R. A. and MACK, P. C. 2010. GCP, a genistein-rich compound, inhibits proliferation and induces apoptosis in lymphoma cell lines. Leuk Res, 34, 69-76.

166

Page 167: 6.11.14 doktorat_final-final

270. MCCLENDON, A. K. and OSHEROFF, N. 2007. DNA topoisomerase II, genotoxicity, and cancer. Mutat Res, 623, 83-97.

271. MEERAN, S. M. and KATIYAR, S. K. 2008. Cell cycle control as a basis for cancer chemoprevention through dietary agents. Front Biosci, 13, 2191-202.

272. MERLE, P., EVRARD, B., PETITJEAN, A., LEHN, J. M., TEULADE-FICHOU, M. P., CHAUTARD, E., DE CIAN, A., GUITTAT, L., TRAN, P. L., MERGNY, J. L., VERRELLE, P. and TCHIRKOV, A. 2011. Telomere targeting with a new G4 ligand enhances radiation-induced killing of human glioblastoma cells. Mol Cancer Ther, 10, 1784-95.

273. MESSINA, M. 2014. Soy foods, isoflavones, and the health of postmenopausal women. Am J Clin Nutr.274. MESSINA, M. J., PERSKY, V., SETCHELL, K. D. and BARNES, S. 1994. Soy intake and cancer risk: a

review of the in vitro and in vivo data. Nutr Cancer, 21, 113-31.275. MESSING, E., GEE, J. R., SALTZSTEIN, D. R., KIM, K., DISANT'AGNESE, A., KOLESAR, J.,

HARRIS, L., FAERBER, A., HAVIGHURST, T., YOUNG, J. M., EFROS, M., GETZENBERG, R. H., WHEELER, M. A., TANGREA, J., PARNES, H., HOUSE, M., BUSBY, J. E., HOHL, R. and BAILEY, H. 2012. A phase 2 cancer chemoprevention biomarker trial of isoflavone G-2535 (genistein) in presurgical bladder cancer patients. Cancer Prev Res (Phila), 5, 621-30.

276. MESSNER, I., CADEDDU, G., HUCKENBECK, W., KNOWLES, H. J., GABBERT, H. E., BALDUS, S. E. and SCHAEFER, K. L. 2013. KRAS p.G13D mutations are associated with sensitivity to anti-EGFR antibody treatment in colorectal cancer cell lines. J Cancer Res Clin Oncol, 139, 201-9.

277. METHA, V. K. 2012. Radiotherapy and erlotinib combined: review of the preclinical and clinical evidence. Front Oncol, 2, 31.

278. METZGER-FILHO, O., WINER, E. P. and KROP, I. 2013. Pertuzumab: optimizing HER2 blockade. Clin Cancer Res, 19, 5552-6.

279. MILAS, L., HUNTER, N. R., MASON, K. A., MILROSS, C. G., SAITO, Y. and PETERS, L. J. 1995. Role of reoxygenation in induction of enhancement of tumor radioresponse by paclitaxel. Cancer Res, 55, 3564-3568.

280. MILAS, L., RAJU, U., LIAO, Z. and AJANI, J. 2005. Targeting molecular determinants of tumor chemo-radioresistance. Semin Oncol, 32, S78-81.

281. MILLER, R. P., TADAGAVADI, R. K., RAMESH, G. and REEVES, W. B. 2010. Mechanisms of Cisplatin nephrotoxicity. Toxins (Basel), 2, 2490-518.

282. MINEHAN, K. J. and BONNER, J. A. 1993. The interaction of etoposide with radiation: variation in cytotoxicity with the sequence of treatment. Life Sci, 53, Pl237-42.

283. MING, L. G., CHEN, K. M. and XIAN, C. J. 2013. Functions and action mechanisms of flavonoids genistein and icariin in regulating bone remodeling. J Cell Physiol, 228, 513-21.

284. MINJGEE, M., TOULANY, M., KEHLBACH, R., GIEHL, K. and RODEMANN, H. P. 2011. K-RAS(V12) induces autocrine production of EGFR ligands and mediates radioresistance through EGFR-dependent Akt signaling and activation of DNA-PKcs. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 81, 1506-14.

285. MISRA, S. and SHARMA, K. 2014. COX-2 signaling and cancer: new players in old arena. Curr Drug Targets, 15, 347-59.

286. MITSUDOMI, T. and YATABE, Y. 2010. Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR gene and cancer. Febs j, 277, 301-8.

287. MIURA, K., SAKATA, K., SOMEYA, M., MATSUMOTO, Y., MATSUMOTO, H., TAKAHASHI, A. and HAREYAMA, M. 2012. The combination of olaparib and camptothecin for effective radiosensitization. Radiat Oncol, 7, 62.

288. MIZUSHINA, Y., SHIOMI, K., KURIYAMA, I., TAKAHASHI, Y. and YOSHIDA, H. 2013. Inhibitory effects of a major soy isoflavone, genistein, on human DNA topoisomerase II activity and cancer cell proliferation. Int J Oncol, 43, 1117-24.

289. MODJTAHEDI, H., CHO, B., MICHEL, M. and SOLCA, F. 2014. A comprehensive review of the preclinical efficacy profile of the ErbB family blocker afatinib in cancer. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, 387, 505-521.

290. MOELLER, B. J. and DEWHIRST, M. W. 2006. HIF-1 and tumour radiosensitivity. Br J Cancer, 95, 1-5.291. MOLINARI, F., FELICIONI, L., BUSCARINO, M., DE DOSSO, S., BUTTITTA, F., MALATESTA, S.,

MOVILIA, A., LUONI, M., BOLDORINI, R., ALABISO, O., GIRLANDO, S., SOINI, B., SPITALE, A., DI NICOLANTONIO, F., SALETTI, P., CRIPPA, S., MAZZUCCHELLI, L., MARCHETTI, A., BARDELLI, A. and FRATTINI, M. 2011. Increased detection sensitivity for KRAS mutations enhances the prediction of anti-EGFR monoclonal antibody resistance in metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res, 17, 4901-14.

167

Page 168: 6.11.14 doktorat_final-final

292. MOLINSKI, T. F., DALISAY, D. S., LIEVENS, S. L. and SALUDES, J. P. 2009. Drug development from marine natural products. Nat Rev Drug Discov, 8, 69-85.

293. MOORTHY, N. S., SOUSA, S. F., RAMOS, M. J. and FERNANDES, P. A. 2013. Farnesyltransferase inhibitors: a comprehensive review based on quantitative structural analysis. Curr Med Chem, 20, 4888-923.

294. MORRISON, D. K. 2012. MAP kinase pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol, 4.295. NAGARAJU, G. P., ZAFAR, S. F. and EL-RAYES, B. F. 2013. Pleiotropic effects of genistein in

metabolic, inflammatory, and malignant diseases. Nutr Rev, 71, 562-72.296. NAKAMURA, H., WANG, Y., XUE, H., ROMANISH, M. T., MAGER, D. L., HELGASON, C. D. and

WANG, Y. 2013. Genistein versus ICI 182, 780: an ally or enemy in metastatic progression of prostate cancer. Prostate, 73, 1747-60.

297. NAKAMURA, H., WANG, Y. W., KURITA, T., ADOMAT, H., CUNHA, Y. Z. and WANG, Y. Z. 2011. Genistein increases epidermal growth factor receptor signaling and promotes tumor progression in advanced human prostate cancer. PloS one, 6, e20034.

298. NAMBIAR, D., RAJAMANI, P. and SINGH, R. P. 2011. Effects of phytochemicals on ionization radiation-mediated carcinogenesis and. Mutat Res, 728, 139-157.

299. NECHUTA, S. J., CAAN, B. J., CHEN, W. Y., LU, W., CHEN, Z., KWAN, M. L., FLATT, S. W., ZHENG, Y., ZHENG, W., PIERCE, J. P. and SHU, X. O. 2012. Soy food intake after diagnosis of breast cancer and survival: an in-depth analysis of combined evidence from cohort studies of US and Chinese women. Am J Clin Nutr, 96, 123-32.

300. NIJKAMP, M. M., SPAN, P. N., BUSSINK, J. and KAANDERS, J. H. 2013a. Interaction of EGFR with the tumour microenvironment: implications for radiation treatment. Radiother Oncol, 108, 17-23.

301. NIJKAMP, M. N., SPAN, P. N., BUSSINK, J. and KAANDERS, J. H. 2013b. Interaction of EGFR with the tumour microenvironment: Implications for radiation treatment. Radiother Oncol, 108, 17-23.

302. O'SULLIVAN, C. C. and CONNOLLY, R. M. 2014. Pertuzumab and its accelerated approval: evolving treatment paradigms and new challenges in the management of HER2-positive breast cancer. Oncology (Williston Park), 28, 186-94, 196.

303. OGAWA, K., YOSHIOKA, Y., ISOHASHI, F., SEO, Y. and YOSHIDA , K. 2013. Radiotherapy targeting cancer stem cells: current views and future perspectives. Anticancer Res, 33, 747-754.

304. OGAWARA, H., AKIYAMA, T., WATANABE, S., ITO, N., KOBORI, M. and SEODA, Y. 1989. Inhibition of tyrosine protein kinase activity by synthetic isoflavones and flavones. J Antibiot (Tokyo), 42, 340-3.

305. OJIMA, E., INOUE, Y., WATANABE, H., HIRO, J., TOIYAMA , Y., MIKI, C. and KUSUNOKI, M. 2006. The optimal schedule for 5-fluorouracil radiosensitization in colon cancer cell lines. Oncol Rep, 16, 1085-1091.

306. OKAMOTO, I. 2010. Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR-targeted anticancer therapy. Febs j, 277, 309-15.

307. OKAMOTO, K., OKAMOTO, I., TAKEDA, M., KOBAYASHI, S., TAKEDA, K., NAKAMATSU, K., NISHIMURA, Y. and NAKAGAWA, K. 2014. A Phase I Study of Split-dose Cisplatin and Etoposide with Concurrent Accelerated Hyperfractionated Thoracic Radiotherapy in Elderly Patients with Limited-disease Small Cell Lung Cancer. Jpn J Clin Oncol, 44, 743-8.

308. OKAMOTO, W., YOSHINO, T., TAKAHASHI, T., OKAMOTO, I., UEDA, S., TSUYA, A., BOKU, N., NISHIO, K., FUKUOKA, M., YAMAMOTO, N. and NAKAGAWA, K. 2013. A phase I, pharmacokinetic and pharmacodynamic study of nimotuzumab in Japanese patients with advanced solid tumors. Cancer Chemother Pharmacol, 72, 1063-71.

309. OMENN, G. S., GUAN, Y. and MENON, R. 2014. A new class of protein cancer biomarker candidates: Differentially expressed splice variants of ERBB2 (HER2/neu) and ERBB1 (EGFR) in breast cancer cell lines. J Proteomics.

310. OPPEGARD, L. M., NGUYEN, T., ELLIS, K. C. and HIASA, H. 2012. Inhibition of human topoisomerases I and II by simocyclinone D8. J Nat Prod, 75, 1485-9.

311. OUYANG, G., YAO, L., RUAN, K., SONG, G., MAO, Y. and BAO, S. 2009. Genistein induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis of human ovarian cancer cells via activation of DNA damage checkpoint pathways. Cell Biol Int, 33, 1237-44.

312. OWONIKOKO, T. K., AISNER, J., WANG, X. V., DAHLBERG, S. E., RUBIN, E. H., RAMALINGAM, S. S., GOUNDER, M., RAUSCH, P. G., AXELROD, R. S. and SCHILLER, J. H. 2014. E5501: phase II study of topotecan sequenced with etoposide/cisplatin, and irinotecan/cisplatin sequenced with etoposide for extensive-stage small-cell lung cancer. Cancer Chemother Pharmacol, 73, 171-80.

168

Page 169: 6.11.14 doktorat_final-final

313. OZCELIK, B., KARTAL, M. and ORHAN, I. 2011. Cytotoxicity, antiviral and antimicrobial activities of alkaloids, flavonoids, and phenolic acids. Pharm Biol, 49, 396-402.

314. PALACIOS, D. A., MIYAKE, M. and ROSSER, C. J. 2013. Radiosensitization in prostate cancer: mechanisms and targets. BMC Urol, 13, 4.

315. PALUMBO, M. 2004. Anticancer agents: towards the future. Curr Med Chem Anticancer Agents, 4, 425-7.316. PALUMBO, S., TINI, P., TOSCANO, M., ALLAVENA, G., ANGELETTI, F., MANAI, F., MIRACCO,

C., COMINCINI, S. and PIRTOLI, L. 2014. Combined EGFR and Autophagy Modulation Impairs Cell Migration and Enhances Radiosensitivity in Human Glioblastoma Cells. J Cell Physiol.

317. PAN, M. H., CHEN, W. J., LIN-SHIAU, S. Y., HO, C. T. and LIN, J. K. 2002. Tangeretin induces cell-cycle G1 arrest through inhibiting cyclin-dependent kinases 2 and 4 activities as well as elevating Cdk inhibitors p21 and p27 in human colorectal carcinoma cells. Carcinogenesis, 23, 1677-84.

318. PANG, D., NICO, J. S., KARAM, L., TIMOFEEVA, O., BLAKELY, W. F., DRITSCHILO, A., DIZDAROGLU, M. and JARUGA, P. 2014. Significant disparity in base and sugar damage in DNA resulting from neutron and electron irradiation. J Radiat Res.

319. PANGANIBAN, R. A., SNOW, A. L. and DAY, R. M. 2013. Mechanisms of radiation toxicity in transformed and non-transformed cells. Int J Mol Sci, 14, 15931-58.

320. PAVESE, J. M., KRISHNA, S. N. and BERGAN, R. C. 2014. Genistein inhibits human prostate cancer cell detachment, invasion, and metastasis. Am J Clin Nutr, 100, 431s-436s.

321. PAWLIK, T. M. and KEYOMARSI, K. 2004. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 59, 928-42.

322. PEETERS, M., DOUILLARD, J. Y., VAN CUTSEM, E., SIENA, S., ZHANG, K., WILLIAMS, R. and WIEZOREK, J. 2013. Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol, 31, 759-65.

323. PENDLETON, M., LINDSEY, R. H., JR., FELIX, C. A., GRIMWADE, D. and OSHEROFF, N. 2014a. Topoisomerase II and leukemia. Ann N Y Acad Sci, 1310, 98-110.

324. PEREZ-SOLER, R., ZOU, Y., LI, T. and LING, Y. H. 2011. The phosphatase inhibitor menadione (vitamin K3) protects cells from EGFR inhibition by erlotinib and cetuximab. Clin Cancer Res, 17, 6766-77.

325. PERRI, F., PACELLI, R., DELLA VITTORIA SCARPATI, G., CELLA, L., GIULIANO, M., CAPONIGRO, F. and PEPE, S. 2014. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head Neck.

326. PEUVREL, L., BACHMEYER, C., REGUIAI, Z., BACHET, J. B., ANDRE, T., BENSADOUN, R. J., BOUCHE, O., YCHOU, M. and DRENO, B. 2012. Semiology of skin toxicity associated with epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors. Support Care Cancer, 20, 909-21.

327. PIGNON, J.-C., KOOPMANSCH, B., NOLENS, G., DELACROIX, L., WALTREGNY, D. and WINKLER, R. 2009. Androgen Receptor Controls EGFR and ERBB2 Gene Expression at Different Levels in Prostate Cancer Cell Lines. Cancer Research, 69, 2941-2949.

328. POGORELCNIK, B., PERDIH, A. and SOLMAJER, T. 2013a. Recent advances in the development of catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha as novel anticancer agents. Curr Med Chem, 20, 694-709.

329. POGORELCNIK, B., PERDIH, A. and SOLMAJER, T. 2013b. Recent developments of DNA poisons--human DNA topoisomerase IIalpha inhibitors--as anticancer agents. Curr Pharm Des, 19, 2474-88.

330. POINDESSOUS, V., OUARET, D., EL OUADRANI, K., BATTISTELLA, A., MEGALOPHONOS, V. F., KAMSU-KOM, N., PETITPREZ, A., ESCARGUEIL, A. E., BOUDOU, P., DUMONT, S., CERVERA, P., FLEJOU, J. F., ANDRE, T., TOURNIGAND, C., CHIBAUDEL, B., DE GRAMONT, A. and LARSEN, A. K. 2011. EGFR- and VEGF(R)-targeted small molecules show synergistic activity in colorectal cancer models refractory to combinations of monoclonal antibodies. Clin Cancer Res, 17, 6522-30.

331. POLET, F. and FERON, O. 2013. Endothelial cell metabolism and tumour angiogenesis: glucose and glutamine as essential fuels and lactate as the driving force. J Intern Med, 273, 156-65.

332. POLKOWSKI, K. and MAZUREK, A. P. 2000. Biological properties of genistein. A review of in vitro and in vivo data. Acta Pol Pharm, 57, 135-55.

333. POLKOWSKI, K., POPIOLKIEWICZ, J., KRZECZYNSKI, P., RAMZA, J., PUCKO, W., ZEGROCKA-STENDEL, O., BORYSKI, J., SKIERSKI, J. S., MAZUREK, A. P. and GRYNKIEWICZ, G. 2004a. Cytostatic and cytotoxic activity of synthetic genistein glycosides against human cancer cell lines. Cancer Lett, 203, 59-69.

169

Page 170: 6.11.14 doktorat_final-final

334. POLKOWSKI, K., POPIOŁKIEWICZ, J., KRZECZYŃSKI, P., RAMZA, J., PUCKO, W., ZEGROCKA-STENDEL, O., BORYSKI, J., SKIERSKI, J. S. and MAZUREK, A. P. 2004b. Cytostatic and cytotoxic activity of synthetic genistein glycosides against human cancer cell lines. Cancer Lett, 203, 59-69.

335. POMMIER, Y., LEO, E., ZHANG, H. and MARCHAND, C. DNA Topoisomerases and Their Poisoning by Anticancer and Antibacterial Drugs. Chemistry and Biology, 17, 421-433.

336. POPIOLKIEWICZ, J., POLKOWSKI, K., SKIERSKI, J. S. and MAZUREK, A. P. 2005. In vitro toxicity evaluation in the development of new anticancer drugs-genistein glycosides. Cancer Lett, 229, 67-75.

337. POSADZKI, P., LEE, M. S., ONAKPOYA, I., LEE, H. W., KO, B. S. and ERNST, E. 2013. Dietary supplements and prostate cancer: a systematic review of double-blind, placebo-controlled randomised clinical trials. Maturitas, 75, 125-30.

338. PRICE, P., SIKORA, K. and ILLIDGE, T. 2008. Treatment of Cancer, London.339. PRIETSCH, R. F., MONTE, L. G., DA SILVA, F. A., BEIRA, F. T., DEL PINO, F. A., CAMPOS, V. F.,

COLLARES, T., PINTO, L. S., SPANEVELLO, R. M., GAMARO, G. D. and BRAGANHOL, E. 2014. Genistein induces apoptosis and autophagy in human breast MCF-7 cells by modulating the expression of proapoptotic factors and oxidative stress enzymes. Mol Cell Biochem, 390, 235-42.

340. QI, W., WEBER CR, C. R., WASLAND, K. and SAVKOVIC , S. D. 2011a. Genistein inhibits proliferation of colon cancer cells by attenuating a negative effect of epidermal growth factor on tumor suppressor FOXO3 activity. BMC Cancer, 11, 219.

341. QI, W., WEBER, C. R., WASLAND, K. and SAVKOVIC, S. D. 2011b. Genistein inhibits proliferation of colon cancer cells by attenuating a negative effect of epidermal growth factor on tumor suppressor FOXO3 activity. BMC Cancer, 11, 219.

342. QI, W. T., WEBER, C. R., WASLAND, K. and SAVKOVIC, S. D. 2011c. Genistein inhibits proliferation of colon cancer cells by attenuating a negative effect of epidermal growth factor on tumor suppressor FOXO3 activity. BMC cancer, 11, 219.

343. QI, X., TANG, J., PRAMANIK, R., SCHULTZ, R. M., SHIRASAWA, S., SASAZUKI, T., HAN, J. and CHEN, G. 2004. p38 MAPK Activation Selectively Induces Cell Death in K-ras-mutated Human Colon Cancer Cells through Regulation of Vitamin D Receptor. Journal of Biological Chemistry, 279, 22138-22144.

344. RABEN, D. and HELFRICH, B. 2004. Angiogenesis inhibitors: a rational strategy for radiosensitization in the treatment of non-small-cell lung cancer? Clin Lung Cancer, 6, 48-57.

345. RAFFOUL, J. J., BANERJEE, S., SINGH-GUPTA, V., KNOLL, Z. E., FITE, A., ZHANG, H., ABRAMS, J., SARKAR, F. H. and HILLMAN, G. G. 2007. Down-regulation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1 expression by soy isoflavones enhances prostate cancer radiotherapy in vitro and in vivo. Cancer Res, 67, 2141-9.

346. RAFFOUL, J. J., WANG, Y., KUCUK, O., FORMAN, J. D., SARKAR, F. H. and HILLMAN, G. G. 2006. Genistein inhibits radiation-induced activation of NF-kappaB in prostate cancer cells promoting apoptosis and G2/M cell cycle arrest. Radiat Res, 166, 73-80.

347. RAINEY, M. D., CHARLTON, M. E., STANTON, R. V. and KASTAN, M. B. 2008. Transient inhibition of ATM kinase is sufficient to enhance cellular sensitivity to ionizing radiation. Cancer Res, 68, 7466-7474.

348. RALEIGH, D. R. and HAAS-KOGAN, D. A. 2013. Molecular targets and mechanisms of radiosensitization using DNA damage response pathways. Future Oncol, 9, 219-33.

349. RAM, R., FARBMAN, L., LEIBOVICI, L., RAANANI, P., YESHURUN, M., VIDAL, L., GAFTER-GVILI, A., PECK, A., SHPILBERG, O. and PAUL, M. 2012. Characteristics of initial compared with subsequent bacterial infections among hospitalised haemato-oncological patients. Int J Antimicrob Agents, 40, 123-6.

350. RAVAUD, A., GROSS-GOUPIL, M. and BELLMUNT, J. 2013. Combination therapy in metastatic renal cell cancer. Semin Oncol, 40, 472-81.

351. RAVIRAJ, J., BOKKASAM, V. K., KUMAR, V. S., REDDY, U. S. and SUMAN, V. 2014. Radiosensitizers, radioprotectors, and radiation mitigators. Indian J Dent Res, 25, 83-90.

352. RECORD, I. R., BROADBENT, J. L., KING, R. A., DREOSTI, I. E., HEAD, R. J. and TONKIN, A. L. 1997. Genistein inhibits growth of B16 melanoma cells in vivo and in vitro and promotes differentiation in vitro. Int J Cancer, 72, 860-4.

353. RICH, T. A. and KIRICHENKO, A. V. 2001. Camptothecin schedule and timing of administration with irradiation. Oncology (Williston Park), 15, 37-41.

354. RINGBORG, U., BERGQVIST, D., BRORSSON, B., CAVALLIN-STÅHL, E., CEBERG, J., EINHORN, N., FRÖDIN, J. E., JÄRHULT, J., LAMNEVIK, G., LINDHOLM, C., NORLUND, NORLUND, A.,

170

Page 171: 6.11.14 doktorat_final-final

NYLÉN, U., ROSÉN, M., SVENSSON, H. and MÖLLER, T. R. 2003. The Swedish Council on Technology Assessment in Health Care (SBU) systematic overview of radiotherapy for cancer including a prospective survey of radiotherapy practice in Sweden 2001—summary and conclusions. Acta Oncol, 42, 357–365.

355. ROBERTS, P. J. and STINCHCOMBE, T. E. 2013. KRAS mutation: should we test for it, and does it matter? J Clin Oncol, 31, 1112-1121.

356. ROCKWELL, S. 2011. Tumor Cell Survival. In: TEICHER, B. A. (ed.) Tumor Models in Cancer Research. Humana Press.

357. ROHRER BLEY, C., FURMANOVA, P., ORLOWSKI, K., GROSSE, N., BROGGINI-TENZER, A., MCSHEEHY, P. M. and PRUSCHY, M. 2013. Microtubule stabilising agents and ionising radiation: multiple exploitable mechanisms for combined treatment. Eur J Cancer, 49, 245-253.

358. ROMIER, B., VAN DE WALLE, J., DURING, A., LARONDELLE, Y. and SCHNEIDER, Y. J. 2008. Modulation of signalling nuclear factor-kappaB activation pathway by polyphenols in human intestinal Caco-2 cells. Br J Nutr, 100, 542-51.

359. ROSKOSKI, R., JR. 2014. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacol Res, 87c, 42-59.

360. ROSS, J. A. 2000. Dietary flavonoids and the MLL gene: A pathway to infant leukemia? Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 4411-3.

361. RUSIN, A., GOGLER, A., GLOWALA-KOSINSKA, M., BOCHENEK, D., GRUCA, A., GRYNKIEWICZ, G., ZAWISZA, J., SZEJA, W. and KRAWCZYK, Z. 2009. Unsaturated genistein disaccharide glycoside as a novel agent affecting microtubules. Bioorg Med Chem Lett, 19, 4939-43.

362. RUSIN, A. and KRAWCZYK, Z. 2011. Genistein Derivatization - From a Dietary Supplement to a Pharmaceutical Agent, INTECH Open Access Publisher.

363. RUSIN, A., KRAWCZYK, Z., GRYNKIEWICZ, G., GOGLER, A., ZAWISZA-PUCHALKA, J. and SZEJA, W. 2010. Synthetic derivatives of genistein, their properties and possible applications. Acta Biochim Pol, 57, 23-34.

364. RUSIN, A., ZAWISZA-PUCHALKA, J., KUJAWA, K., GOGLER-PIGLOWSKA, A., WIETRZYK, J., SWITALSKA, M., GLOWALA-KOSINSKA, M., GRUCA, A., SZEJA, W., KRAWCZYK, Z. and GRYNKIEWICZ, G. 2011. Synthetic conjugates of genistein affecting proliferation and mitosis of cancer cells. Bioorg Med Chem, 19, 295-305.

365. RUSSO, M., SPAGNUOLO, C., TEDESCO, I. and RUSSO, G. L. 2010. Phytochemicals in cancer prevention and therapy: truth or dare? Toxins (Basel), 2, 517-51.

366. SAHIN, K., TUZCU, M., BASAK, N., CAGLAYAN, B., KILIC , U., SAHIN, F. and KUCUK, O. 2012. Sensitization of Cervical Cancer Cells to Cisplatin by Genistein: The Role of NFκB and Akt/mTOR Signaling Pathways. J Oncol, 461562.

367. SAHLBERG, S. H., SPIEGELBERG, D., GLIMELIUS, B., STENERLOW, B. and NESTOR, M. 2014. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One, 9, e94621.

368. SAIKA, K. and SOBUE, T. 2013. [Cancer statistics in the world]. Gan To Kagaku Ryoho, 40, 2475-80.369. SAMBADE, M. J., CAMP, J. T., KIMPLE, R. J., SARTOR, C. I. and SHIELDS, J. M. 2009. Mechanism

of lapatinib-mediated radiosensitization of breast cancer cells is primarily by inhibition of the Raf>MEK>ERK mitogen-activated protein kinase cascade and radiosensitization of lapatinib-resistant cells restored by direct inhibition of MEK. Radiother Oncol, 93, 639-44.

370. SAMUELS, Y., DIAZ, L. A., JR., SCHMIDT-KITTLER, O., CUMMINS, J. M., DELONG, L., CHEONG, I., RAGO, C., HUSO, D. L., LENGAUER, C., KINZLER, K. W., VOGELSTEIN, B. and VELCULESCU, V. E. 2005. Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell, 7, 561-73.

371. SANTARPIA, L., LIPPMAN, S. M. and EL-NAGGAR, A. K. 2012. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets, 16, 103-19.

372. SANTELL, R. C., KIEU, N. and HELFERICH, W. G. 2000. Genistein inhibits growth of estrogen-independent human breast cancer cells in culture but not in athymic mice. J Nutr, 130, 1665-9.

373. SARTORE-BIANCHI, A., MARTINI, N., MOLINARI, F., VERONESE, S., NICHELATTI, M., ARTALE, S., DI NICOLANTONIO, F., SALETTI, P., DE DOSSO, S., MAZZUCCHELLI, L., FRATTINI, M., SIENA, S. and BARDELLI, A. 2009. Frattini M, Siena S, Bardelli A. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res, 69, 1851-1857.

171

Page 172: 6.11.14 doktorat_final-final

374. SATO, J. D., KAWAMOTO, T., LE, A. D., MENDELSOHN, J., POLIKOFF, J. and SATO, G. H. 1983. Sato JD, et al. Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors. Mol Biol Med, 1, 511–529.

375. SAWADOGO, W. R., SCHUMACHER, M., TEITEN, M. H., CERELLA, C., DICATO, M. and DIEDERICH, M. 2013. A survey of marine natural compounds and their derivatives with anti-cancer activity reported in 2011. Molecules, 18, 3641-73.

376. SCHNEIDER, M. R. and WOLF, E. 2009. The epidermal growth factor receptor ligands at a glance. J Cell Physiol, 218, 460-6.

377. SEITER, K. 2005. Toxicity of the topoisomerase II inhibitors. Expert Opin Drug Saf, 4, 219-234.378. SEIWERT, T. Y., SALAMA, J. K. and VOKES, E. E. 2007. The concurrent chemoradiation paradigm--

general principles. Nat Clin Pract Oncol, 4, 86-100.379. SERTEL, S., PLINKERT, P. K. and EFFERTH, T. 2010. Natural products derived from traditional chinese

medicine as novel inhibitors of the epidermal growth factor receptor. Comb Chem High Throughput Screen, 13, 849-54.

380. SETCHELL, K. D., BROWN, N. M., ZHAO, X., LINDLEY, S. L., HEUBI, J. E., KING, E. C. and MESSINA, M. J. 2011. Soy isoflavone phase II metabolism differs between rodents and humans: implications for the effect on breast cancer risk. Am J Clin Nutr, 94, 1284-94.

381. SETCHELL, K. D., GOSSELIN, S. J., WELSH, M. B., JOHNSTON, J. O., BALISTRERI, W. F., KRAMER, L. W., DRESSER, B. L. and TARR, M. J. 1987. Dietary estrogens--a probable cause of infertility and liver disease in captive cheetahs. Gastroenterology, 93, 225-33.

382. SHANLE, E. K. and XU, W. 2010. Selectively targeting estrogen receptors for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev, 62, 1265-76.

383. SHANMUGAM, M. K., DAI, X., KUMAR, A. P., TAN, B. K., SETHI, G. and BISHAYEE, A. 2014. Oleanolic acid and its synthetic derivatives for the prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical evidence. Cancer Lett, 346, 206-16.

384. SHARMA, R. 2011. Nitroimidazole radiopharmaceuticals in hypoxia: part II cytotoxicity and radiosensitization applications. Curr Radiopharm, 4, 379-93.

385. SHIAU, R. J., CHEN, K. Y., WEN, Y. D., CHUANG, C. H. and YEH, S. L. 2010. Genistein and beta-carotene enhance the growth-inhibitory effect of trichostatin A in A549 cells. Eur J Nutr, 49, 19-25.

386. SHIGEMATSU, N., KAWATA, T., IHARA, N., KAWAGUCHI, O., KUTSUKI, S., ISHIBASHI, R., KUBO, A. and ITO, H. 2001. Effect of combined treatment with radiation and low dose etoposide on cell survival. Anticancer Res, 21, 325-8.

387. SHIMURA, T., KAKUDA, S., OCHIAI, Y., NAKAGAWA, H., KUWAHARA, Y., TAKAI, Y., KOBAYASHI, J., KOMATSU, K. and FUKUMOTO, M. 2010. Acquired radioresistance of human tumor cells by DNA-PK/AKT/GSK3beta-mediated cyclin D1 overexpression. Oncogene, 29, 4826-37.

388. SHIN, J. I., SHIM, J. H., KIM, K. H., CHOI, H. D., KIM, J. W., LEE, H. G., KIM, B. Y., PARK, S. N., PARK, O. J. and YOON, D. Y. 2008. Sensitization of the apoptotic effect of gamma-irradiation in genistein-pretreated CaSki cervical cancer cells. J Microbiol Biotechnol, 18, 523-31.

389. SHIN, J. U., PARK, J. H., CHO, B. C. and LEE, J. H. 2012. Treatment of epidermal growth factor receptor inhibitor-induced acneiform eruption with topical recombinant human epidermal growth factor. Dermatology, 225, 135-40.

390. SI, H. and LIU, D. 2007. Phytochemical genistein in the regulation of vascular function: new insights. Curr Med Chem, 14, 2581–2589.

391. SIEGEL, R., DESANTIS, C., VIRGO, K., STEIN, K., MARIOTTO, A., SMITH, T., COOPER, D., GANSLER, T., LERRO, C., FEDEWA, S., LIN, C., LEACH, C., CANNADY, R. S., CHO, H., SCOPPA, S., HACHEY, M., KIRCH, R., JEMAL, A. and WARD, E. 2012. Cancer treatment and survivorship statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 62, 220-41.

392. SIEGEL, R., MA, J., ZOU, Z. and JEMAL, A. 2014. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 64, 9-29.393. SIEPETOWSKA, K. 2011. Nowe pochodne genisteiny jako potencjalne leki przeciwnowotworowe.

Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny. Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii. Praca Magisterska.

394. SIMONS, A. L., RENOUF, M., MURPHY, P. A. and HENDRICH, S. 2010. Greater apparent absorption of flavonoids is associated with lesser human fecal flavonoid disappearance rates. J Agric Food Chem, 58, 141-147. .

395. SINGH-GUPTA, V., ZHANG, H., BANERJEE, S., KONG, D., RAFFOUL, J. J., SARKAR, F. H. and HILLMAN, G. G. 2009. Radiation-induced HIF-1alpha cell survival pathway is inhibited by soy isoflavones in prostate cancer cells. Int J Cancer, 124, 1675-84.

172

Page 173: 6.11.14 doktorat_final-final

396. SINGH, I., AMIN, H., RAH, B. and GOSWAMI, A. 2013. Targeting EGFR and IGF 1R: a promising combination therapy for metastatic cancer. Front Biosci (Schol Ed), 5, 231-46.

397. SKANDALIS, S. S., AFRATIS, N., SMIRLAKI, G., NIKITOVIC, D., THEOCHARIS, A. D., TZANAKAKIS, G. N. and KARAMANOS, N. K. 2014. Cross-talk between estradiol receptor and EGFR/IGF-IR signaling pathways in estrogen-responsive breast cancers: Focus on the role and impact of proteoglycans. Matrix Biol, 35, 182-93.

398. SKINNER, H. D., SANDULACHE, V. C., OW, T. J., MEYN, R. E., YORDY, J. S., BEADLE, B. M., FITZGERALD, A. L., GIRI, U., ANG, K. K. and MYERS, J. N. 2012. TP53 disruptive mutations lead to head and neck cancer treatment failure through inhibition of radiation-induced senescence. Clin Cancer Res, 18, 290-300.

399. SLUSARZ, A., JACKSON, G. A., DAY, J. K., SHENOUDA, N. S., BOGENER, J. L., BROWNING, J. D., FRITSCHE, K. L., MACDONALD, R. S., BESCH-WILLIFORD, C. L. and LUBAHN, D. B. 2012. Aggressive prostate cancer is prevented in ERalphaKO mice and stimulated in ERbetaKO TRAMP mice. Endocrinology, 153, 4160-70.

400. SMINIA, P., KUIPERS, G., GELDOF, A., LAFLEUR, V. and SLOTMAN , B. 2005. COX-2 inhibitors act as radiosensitizer in tumor treatment. Biomed Pharmacother, 59, S275-S275.

401. SOLOMON, M. T., SELVA, J. C., FIGUEREDO, J., VAQUER, J., TOLEDO, C., QUINTANAL, N., SALVA, S., DOMINGEZ, R., ALERT, J., MARINELLO, J. J., CATALA, M., GRIEGO, M. G., MARTELL, J. A., LUACES, P. L., BALLESTEROS, J., DE-CASTRO, N., BACH, F. and CROMBET, T. 2013. Radiotherapy plus nimotuzumab or placebo in the treatment of high grade glioma patients: results from a randomized, double blind trial. BMC Cancer, 13, 299.

402. SON, T. G., GONG, E. J., BAE, M. J., KIM, S. D., HEO, K., MOON, C., YANG, K. and KIM, J. S. 2013. Protective effect of genistein on radiation-induced intestinal injury in tumor bearing mice. BMC Complement Altern Med, 13, 103.

403. SONG, C. W., LEE, H., DINGS, R. P., WILLIAMS, B., POWERS, J., SANTOS, T. D., CHOI, B. H. and PARK, H. J. 2012. Metformin kills and radiosensitizes cancer cells and preferentially kills cancer stem cells. Sci Rep, 2, 362.

404. SONG, H., HUANG, L., ZHANG, M., WANG, X., SONG, S. and YANG, L. 2014. Transphosphorylation of EGFR at Y845 plays an important role in its autophosphorylation and kinase activity. Oncol Rep, 31, 2393-8.

405. SOOBRATTEE, M. A., NEERGHEEN, V. S., LUXIMON-RAMMA, A., ARUOMA, O. I. and BAHORUN, T. 2005. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutat Res, 579, 200-13.

406. STEEL, G. G., MCMILLAN, T. J. and PEACOCK, J. H. 1989. The 5Rs of radiobiology. Int J Radiat Biol, 56, 1045-8.

407. STEEL, G. G. and PECKHAM, M. J. 1979. Exploitable mechanisms in combined radiotherapy-chemotherapy: the concept of additivity. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 5, 85-91.

408. STEELE, V. E., PEREIRA, M. A., SIGMAN, C. C. and KELLOFF, G. J. 1995. Cancer chemoprevention agent development strategies for genistein. J Nutr, 125, 713s-716s.

409. STEENSMA, A., NOTEBORN, H. P. and KUIPER, H. A. 2004. Comparison of Caco-2, IEC-18 and HCEC cell lines as a model for intestinal absorption of genistein, daidzein and their glycosides. Environ Toxicol Pharmacol, 16, 131-9.

410. STURLA, L.-M., AMORINO, G., ALEXANDER, M. S., MIKKELSEN, R. B., VALERIE, K. and SCHMIDT-ULLRICHR, R. K. 2005. Requirement of Tyr-992 and Tyr-1173 in Phosphorylation of the Epidermal Growth Factor Receptor by Ionizing Radiation and Modulation by SHP2. Journal of Biological Chemistry, 280, 14597-14604.

411. SU, D., JIAO, S. C., WANG, L. J., SHI, W. W., LONG, Y. Y., LI, J. and BAI, L. 2014. Efficacy of nimotuzumab plus gemcitabine usage as first-line treatment in patients with advanced pancreatic cancer. Tumour Biol, 35, 2313-8.

412. SUN, G. G., HU, W. N., WANG, Y. D., YANG, C. R. and LU, Y. F. 2012a. Bidirectional regulation of manganese superoxide dismutase (MnSOD) on the radiosensitivity of esophageal cancer cells. Asian Pac J Cancer Prev, 13, 3015-3023.

413. SUN, X., YANG, C., LIU, H., WANG, Q., WU, S. X., LI, X., XIE, T., BRINKMAN, K. L., TEH, B. S., BUTLER, E. B., XU, B. and ZHENG, S. 2012b. Identification and characterization of a small inhibitory peptide that can target DNA-PKcs autophosphorylation and increase tumor radiosensitivity. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 84, 1212-9.

173

Page 174: 6.11.14 doktorat_final-final

414. SUN, Y., ST CLAIR, D. K., FANG, F., WARREN, G. W., RANGNEKAR, V. M., CROOKS, P. A. and ST CLAIR, W. H. 2007. The radiosensitization effect of parthenolide in prostate cancer cells is mediated by nuclear factor-kappaB inhibition and enhanced by the presence of PTEN. Mol Cancer Ther, 6, 2477-86.

415. SUPIOT, S., THILLAYS, F., RIO, E., GOUARD, S., MORGENSTERN, A., BRUCHERTSEIFER, F., MAHE, M. A., CHATAL, J. F., DAVODEAU, F. and CHEREL, M. 2007. Gemcitabine radiosensitizes multiple myeloma cells to low let, but not high let, irradiation. Radiother Oncol, 83, 97-101.

416. SUZUKI, K., GERELCHULUUN, A., HONG, Z., SUN, L., ZENKOH, J., MORITAKE, T. and TSUBOI, K. 2013. Celecoxib enhances radiosensitivity of hypoxic glioblastoma cells through endoplasmic reticulum stress. Neuro Oncol, 15, 1186-99.

417. SZEJA, W., GRYNKIEWICZ, G., BIEG, T., SWIERK, P., BYCZEK, A., PAPAJ, K., KITEL, R. and RUSIN, A. 2014. Synthesis and cytotoxicity of 2,3-enopyranosyl C-linked conjugates of genistein. Molecules, 19, 7072-93.

418. SZUMIEL, I. 2006. Epidermal growth factor receptor and DNA double strand break repair: the cell's self-defence. Cell Signal, 18, 1537-48.

419. TACYILDIZ, N., OZYORUK, D., YAVUZ, G., UNAL, E., DINCASLAN, H., DOGU, F., SAHIN, K. and KUCUK, O. 2010. Soy isoflavones ameliorate the adverse effects of chemotherapy in children. Nutr Cancer, 62, 1001-5.

420. TAMIYA, A., MATSUMURA, A., TSUJI, T., MORIMOTO, M., ASAMI, K., OKISHIO, K., SHIMIZU, S., YOON, H. E., ATAGI, S., AKIRA, M., KITAICHI, M. and KAWAGUCHI, T. 2014. A pilot study of Cisplatin and Etoposide with and without radiotherapy for advanced malignant thymoma. Anticancer Res, 34, 2023-7.

421. TAN, G., GYLLENHAAL, C. and SOEJARTO, D. D. 2006. Biodiversity as a source of anticancer drugs. Curr Drug Targets, 7, 265-277.

422. TANIZAKI, J., OKAMOTO, I., SAKAI, K. and NAKAGAWA, K. 2011. Differential roles of trans-phosphorylated EGFR, HER2, HER3, and RET as heterodimerisation partners of MET in lung cancer with MET amplification. Br J Cancer, 105, 807-13.

423. TARHINI, A. A., ZAHOOR, H., MCLAUGHLIN, B., GOODING, W. E., SCHMITZ, J. C., SIEGFRIED, J. M., SOCINSKI, M. A. and ARGIRIS, A. 2013. Phase I trial of carboplatin and etoposide in combination with panobinostat in patients with lung cancer. Anticancer Res, 33, 4475-81.

424. TAYLOR, C. K., LEVY, R. M., ELLIOTT, J. C. and BURNETT, B. P. 2009. The effect of genistein aglycone on cancer and cancer risk: a review of in vitro, preclinical, and clinical studies. Nutr Rev, 67, 398-415.

425. THARIAT, J., YILDIRIM, G., MASON, K. A., GARDEN, A. S., MILAS , L. and ANG, K. K. 2007. Combination of radiotherapy with EGFR antagonists for head and neck carcinoma. Int J Clin Oncol, 12, 99-110.

426. THEIL, C., BRIESE, V., GERBER, B. and RICHTER, D. U. 2011. The effects of different lignans and isoflavones, tested as aglycones and glycosides, on hormone receptor-positive and -negative breast carcinoma cells in vitro. Arch Gynecol Obstet, 284, 459-65.

427. TIAN, S., SIMON, I., MORENO, V., ROEPMAN, P., TABERNERO, J., SNEL, M., VAN'T VEER, L., SALAZAR, R., BERNARDS, R. and CAPELLA, G. 2013. A combined oncogenic pathway signature of BRAF, KRAS and PI3KCA mutation improves colorectal cancer classification and cetuximab treatment prediction. Gut, 62, 540-9.

428. TIPPAYAMONTRI, T., KOTB, R., PAQUETTE, B. and SANCHE, L. 2013. Efficacy of cisplatin and Lipoplatin in combined treatment with radiation of a colorectal tumor in nude mouse. Anticancer Res, 33, 3005-14.

429. TOFILON, P. J. and CAMPHAUSEN, K. 2009. Molecular targets for tumor radiosensitization. Chem Rev, 109, 2974–2988.

430. TOULANY, M., BAUMANN, M. and RODEMANN, H. P. 2007. Stimulated PI3K-AKT signaling mediated through ligand or radiation-induced EGFR depends indirectly, but not directly, on constitutive K-Ras activity. Mol Cancer Res, 5, 863-72.

431. TOULANY, M., MIHATSCH, J., HOLLER, M., CHAACHOUAY, H. and RODEMANN, H. P. 2014. Cisplatin-mediated radiosensitization of non-small cell lung cancer cells is stimulated by ATM inhibition. Radiother Oncol, 111, 228-36.

432. TOULANY, M. and RODEMANN, H. P. 2013. Potential of Akt mediated DNA repair in radioresistance of solid tumors overexpressing erbB-PI3K-Akt pathway. Translational Cancer Research, 2, 190-202.

174

Page 175: 6.11.14 doktorat_final-final

433. TRARBACH, T., PRZYBOREK, M., SCHLEUCHER, N., HEEGER, S., LUPFERT, C. and VANHOEFER, U. 2013. Phase I study of matuzumab in combination with 5-fluorouracil, leucovorin and cisplatin (PLF) in patients with advanced gastric and esophagogastric adenocarcinomas. Invest New Drugs, 31, 642-52.

434. TROIANI, T., NAPOLITANO, S., VITAGLIANO, D., MORGILLO, F., CAPASSO, A., SFORZA, V., NAPPI, A., CIARDIELLO, D., CIARDIELLO, F. and MARTINELLI, E. 2014. Primary and Acquired Resistance of Colorectal Cancer Cells to Anti-EGFR Antibodies Converge on MEK/ERK Pathway Activation and Can Be Overcome by Combined MEK/EGFR Inhibition. Clin Cancer Res, 20, 3775-86.

435. TUNDIS, R., LOIZZO, M. R. and MENICHINI, F. 2014. An overview on chemical aspects and potential health benefits of limonoids and their derivatives. Crit Rev Food Sci Nutr, 54, 225-50.

436. ULANOWSKA, K., TKACZYK, A., KONOPA, G. and WEGRZYN, G. 2006. Differential antibacterial activity of genistein arising from global inhibition of DNA, RNA and protein synthesis in some bacterial strains. Arch Microbiol, 184, 271-8.

437. URIBE, P. and GONZALEZ, S. 2011. Epidermal growth factor receptor (EGFR) and squamous cell carcinoma of the skin: molecular bases for EGFR-targeted therapy. Pathol Res Pract, 207, 337-42.

438. UZOIGWE, J. and SAUTER, E. R. 2012. Cancer prevention and treatment using combination therapy with plant- and animal-derived compounds. Expert Rev Clin Pharmacol, 5, 701-9.

439. VALDES, G. and IWAMOTO, K. S. 2013. Re-evaluation of cellular radiosensitization by 5-fluorouracil: high-dose, pulsed administration is effective and preferable to conventional low-dose, chronic administration. Int J Radiat Biol, 89, 851-62.

440. VARDI, A., BOSVIEL, R., RABIAU, N., ADJAKLY, M., SATIH, S., DECHELOTTE, P., BOITEUX, J. P., FONTANA, L., BIGNON, Y. J., GUY, L. and BERNARD-GALLON, D. J. 2010. Soy phytoestrogens modify DNA methylation of GSTP1, RASSF1A, EPH2 and BRCA1 promoter in prostate cancer cells. In Vivo, 24, 393-400.

441. VEHRESCHILD, M. J., LISS, B. J. and CORNELY, O. A. 2013. Intestinal colonisation and blood stream infections due to vancomycin-resistant enterococci (VRE) and extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae (ESBLE) in patients with haematological and oncological malignancies. Infection, 41, 1049-50.

442. VELA, E. M., BOWICK, G. C., HERZOG, N. K. and ARONSON, J. F. 2008. Genistein treatment of cells inhibits arenavirus infection. Antiviral Res, 77, 153-6.

443. VERDRENGH, M., COLLINS, L. V., BERGIN, P. and TARKOWSKI, A. 2004. Phytoestrogen genistein as an anti-staphylococcal agent. Microbes Infect, 6, 86-92.

444. VERHEIJ, M. 2008. Clinical biomarkers and imaging for radiotherapy-induced cell death. Cancer Metastasis Rev, 27, 471-480.

445. VERHEIJ , M., VENS, C. and VAN TRIEST , B. 2010. Novel therapeutics in combination with radiotherapy to improve cancer treatment: rationale, mechanisms of action and clinical perspective. Drug Resist Updat, 13, 29-43.

446. VERSANTVOORT, C. H., SCHUURHUIS, G. J., PINEDO, H. M., EEKMAN, C. A., KUIPER, C. M., LANKELMA, J. and BROXTERMAN, H. J. 1993. Genistein modulates the decreased drug accumulation in non-P-glycoprotein mediated multidrug resistant tumour cells. Br J Cancer, 68, 939-46.

447. VILELA, F. M., SYED, D. N., CHAMCHEU, J. C., CALVO-CASTRO, L. A., FORTES, V. S., FONSECA, M. J. and MUKHTAR, H. 2014. Biotransformed Soybean Extract (BSE) Inhibits Melanoma Cell Growth and Viability In Vitro: Involvement of Nuclear Factor-Kappa B Signaling. PLoS One, 9, e103248.

448. VINCENT, E. E., ELDER, D. J., THOMAS, E. C., PHILLIPS, L., MORGAN, C., PAWADE, J., SOHAIL, M., MAY, M. T., HETZEL, M. R. and TAVARE, J. M. 2011. Akt phosphorylation on Thr308 but not on Ser473 correlates with Akt protein kinase activity in human non-small cell lung cancer. Br J Cancer, 104, 1755-61.

449. VINOD, B. S., MALIEKAL, T. T. and ANTO, R. J. 2013. Phytochemicals as chemosensitizers: from molecular mechanism to clinical significance. Antioxid Redox Signal, 18, 1307-48.

450. VITALE, D. C., PIAZZA, C., MELILLI, B., DRAGO, F. and SALOMONE, S. 2013. Isoflavones: estrogenic activity, biological effect and bioavailability. Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 38, 15-25.

451. WALLE, T., BROWNING, A. M., STEED, L. L., REED, S. G. and WALLE, U. K. 2005. Flavonoid glucosides are hydrolyzed and thus activated in the oral cavity in humans. J Nutr, 135, 48-52.

452. WALZ, E. 1931. Isoflavon- und Saponin-Glucoside in Soja hispida. Justus Liebigs Annalen der Chemie, 489, 118-155.

175

Page 176: 6.11.14 doktorat_final-final

453. WANG, B., LI, H., YAN, H. and XIAO, J. G. 2005. Genistein inhibited hypoxia-inducible factor-1alpha expression induced by hypoxia and cobalt chloride in human retinal pigment epithelium cells. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 27, 179-84.

454. WANG, F., WANG, S., WANG, Z., DUAN, J., AN, T., ZHAO, J., BAI, H. and WANG, J. 2012. Phosphorylated EGFR expression may predict outcome of EGFR-TKIs therapy for the advanced NSCLC patients with wild-type EGFR. J Exp Clin Cancer Res, 31, 65.

455. WANG, J., JENKINS, S. and LAMARTINIERE, C. A. 2014a. Cell proliferation and apoptosis in rat mammary glands following combinational exposure to bisphenol A and genistein. BMC Cancer, 14, 379.

456. WANG, J. F., LIU, C., ZHANG, Q. and HUANG, G. H. 2013a. Research progress in the radioprotective effect of the canonical Wnt pathway. Cancer Biol Med, 10, 61-71.

457. WANG, L., HU, H., PAN, Y., WANG, R., LI, Y., SHEN, L., YU, Y., LI, H., CAI, D., SUN, Y. and CHEN, H. 2014b. PIK3CA mutations frequently coexist with EGFR/KRAS mutations in non-small cell lung cancer and suggest poor prognosis in EGFR/KRAS wildtype subgroup. PLoS One, 9, e88291.

458. WANG, M., KERN, A. M., HULSKOTTER, M., GRENINGER, P., SINGH, A., PAN, Y., CHOWDHURY, D., KRAUSE, M., BAUMANN, M., BENES, C. H., EFSTATHIOU, J. A., SETTLEMAN, J. and WILLERS, H. 2014c. EGFR-mediated chromatin condensation protects KRAS-mutant cancer cells against ionizing radiation. Cancer Res, 74, 2825-34.

459. WANG, S. D., CHEN, B. C., KAO, S. T., LIU, C. J. and YEH, C. C. 2014d. Genistein inhibits tumor invasion by suppressing multiple signal transduction pathways in human hepatocellular carcinoma cells. BMC Complement Altern Med, 14, 26.

460. WANG, T. T., SATHYAMOORTHY, N. and PHANG, J. M. 1996. Molecular effects of genistein on estrogen receptor mediated pathways. Carcinogenesis, 17, 271-5.

461. WANG, X., CLUBBS, E. A. and BOMSER, J. A. 2006. Genistein modulates prostate epithelial cell proliferation via estrogen- and extracellular signal-regulated kinase-dependent pathways. J Nutr Biochem, 17, 204-10.

462. WANG, Y., WANG, H., ZHANG, W., SHAO, C., XU, P., SHI, C. H., SHI, J. G., LI, Y. M., FU, Q., XUE, W., LEI, Y. H., GAO, J. Y., WANG, J. Y., GAO, X. P., LI, J. Q., YUAN, J. L. and ZHANG, Y. T. 2013b. Genistein sensitizes bladder cancer cells to HCPT treatment in vitro and in vivo via ATM/NF-kappaB/IKK pathway-induced apoptosis. PLoS One, 8, e50175.

463. WANG, Z. and CHEN, H. 2010. Genistein increases gene expression by demethylation of WNT5a promoter in colon cancer cell line SW1116. Anticancer Res, 30, 4537-45.

464. WARDAKHAN, W. W. and SAMIR, E. M. 2013. The Reaction of Cyclopentanone with Cyanomethylene Reagents: Novel Synthesis of Pyrazole, Thiophene, and Pyridazine Derivatives. Journal of Chemistry, 2013, 10.

465. WEGRZYN, G., JAKOBKIEWICZ-BANECKA, J., GABIG-CIMINSKA, M., PIOTROWSKA, E., NARAJCZYK, M., KLOSKA, A., MALINOWSKA, M., DZIEDZIC, D., GOLEBIEWSKA, I., MOSKOT, M. and WEGRZYN, A. 2010. Genistein: a natural isoflavone with a potential for treatment of genetic diseases. Biochem Soc Trans, 38, 695-701.

466. WEI, F., OJO, D., LIN, X., WONG, N., HE, L., YAN, J., XU, S., MAJOR, P. and TANG, D. 2014. BMI1 attenuates etoposide-induced G2/M checkpoints via reducing ATM activation. Oncogene, 0.

467. WENG, C. J. and YEN, G. C. 2012. Flavonoids, a ubiquitous dietary phenolic subclass, exert extensive in vitro anti-invasive and in vivo anti-metastatic activities. Cancer Metastasis Rev, 31, 323-51.

468. WHEELER, D. L., DUNN, E. F. and HARARI, P. M. 2010. Understanding resistance to EGFR inhibitors - impact on future treatment strategies. Nat Rev Oncol, 7, 493-507.

469. WILSTERMANN, A. M. and OSHEROFF, N. 2001. Base excision repair intermediates as topoisomerase II poisons. J Biol Chem, 276, 17727-17731.

470. WITHERS, H. R. 1975. The four r's of radiotherapy. Adv Radiat Biol, 5, 241-247.471. WOJTUKIEWICZ, M. Z., RYBAŁTOWSKI, M. and SIERKO, E. 2008. Biologic basis of therapy targeted

to EGFR. J Oncol, 58, 260-71.472. WOUTERS, B. G. 2009. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. In: JOINER, M. and

VAN DER KOGEL, A. (eds.) Basic Clinical Radiobiology. London: Hodder Arnold.473. WOUTERS, B. G. and BEGG, A. 2009. Irradiation-inducec damage and the DNA damage response. In:

JOINER, M. and VAN DER KOGEL, A. (eds.) Basic Clinical Radiobiology. London: Hodder Arnold.474. WU, J., XU, J., HAN, S. and QIN, L. 2014. [Effects of genistein on apoptosis in HCT-116 human colon

cancer cells and its mechanism]. Wei Sheng Yan Jiu, 43, 1-5.475. XIAO, F., LUO, X., FU, X. and ZHENG, Y. 2013. Cleavage enhancement of specific chemical bonds in

DNA by cisplatin radiosensitization. J Phys Chem B, 117, 4893-4900.

176

Page 177: 6.11.14 doktorat_final-final

476. XIE, Q., ZHOU, Y., LAN, G., YANG, L., ZHENG, W., LIANG, Y. and CHEN, T. 2014. Sensitization of cancer cells to radiation by selenadiazole derivatives by regulation of ROS-mediated DNA damage and ERK and AKT pathways. Biochem Biophys Res Commun, 449, 88-93.

477. XU, L., XIANG, J., SHEN, J., ZOU, X., ZHAI, S., YIN, Y., LI, P., WANG, X. and SUN, Q. 2013. Oncogenic MicroRNA-27a is a target for genistein in ovarian cancer cells. Anticancer Agents Med Chem, 13, 1126-32.

478. XU, W. H., HAN, M., DONG, Q., FU, Z. X., DIAO, Y. Y., LIU, H., XU, J., JIANG, H. L., ZHANG, S. Z., ZHENG, S., GAO, J. Q. and WEI, Q. C. 2012. Doxorubicin-mediated radiosensitivity in multicellular spheroids from a lung cancer cell line is enhanced by composite micelle encapsulation. Int J Nanomedicine, 7, 2661-71.

479. XUE, J. P., WANG, G., ZHAO, Z. B., WANG, Q. and SHI, Y. 2014. Synergistic cytotoxic effect of genistein and doxorubicin on drug-resistant human breast cancer MCF-7/Adr cells. Oncol Rep.

480. YAMAGUCHI, H., CHANG, S. S., HSU, J. L. and HUNG, M. C. 2014. Signaling cross-talk in the resistance to HER family receptor targeted therapy. Oncogene, 33, 1073-81.

481. YAMAGUCHI, M. 2012. Nutritional factors and bone homeostasis: synergistic effect with zinc and genistein in osteogenesis. Mol Cell Biochem, 366, 201-21.

482. YAMASAKI, M., MINE, Y., NISHIMURA, M., FUJITA, S., SAKAKIBARA, Y., SUIKO, M., MORISHITA, K. and NISHIYAMA, K. 2013. Genistein induces apoptotic cell death associated with inhibition of the NF-kappaB pathway in adult T-cell leukemia cells. Cell Biol Int, 37, 742-7.

483. YAN, S. X., EJIMA, Y., SASAKI, R., ZHENG, S. S., DEMIZU, Y., SOEJIMA, T. and SUGIMURA, K. 2004. Combination of genistein with ionizing radiation on androgen-independent prostate cancer cells. Asian J Androl, 6, 285-290.

484. YANG, J. J., CHEN, H. J., YAN, H. H., ZHANG, X. C., ZHOU, Q., SU, J., WANG, Z., XU, C. R., HUANG, Y. S., WANG, B. C., YANG, X. N., ZHONG, W. Z., NIE, Q., LIAO, R. Q., JIANG, B. Y., DONG, S. and WU, Y. L. 2013. Clinical modes of EGFR tyrosine kinase inhibitor failure and subsequent management in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer, 79, 33-9.

485. YANG, S. C., CHANG, S. S., CHEN, H. Y. and CHEN, C. Y. 2011. Identification of potent EGFR inhibitors from TCM Database@Taiwan. PLoS Comput Biol, 7, e1002189.

486. YANG, X., ZHU, H., GE, Y., LIU, J., CAI, J., QIN, Q., ZHAN, L., ZHANG, C., XU, L., LIU, Z., YANG, Y., YANG, Y., MA, J., CHENG, H. and SUN, X. 2014. Melittin enhances radiosensitivity of hypoxic head and neck squamous cell carcinoma by suppressing HIF-1alpha. Tumour Biol.

487. YANG, Y., JIN, C., LI, H., HE, Y., LIU, Z., BAI, L. and DOU, K. 2012. Improved radiosensitizing effect of the combination of etanidazole and paclitaxel for hepatocellular carcinoma in vivo. Exp Ther Med, 3, 299-303.

488. YAROM, N. and JONKER, D. J. 2011. The role of the epidermal growth factor receptor in the mechanism and treatment of colorectal cancer. Discov Med, 11, 95-105.

489. YASHAR, C. M., SPANOS, W. J., TAYLOR, D. D. and GERCEL-TAYLOR, C. 2005. Potentiation of the radiation effect with genistein in cervical cancer cells. Gynecol Oncol, 99, 199-205.

490. YEWALE, C., BARADIA, D., VHORA, I., PATIL, S. and MISRA, A. 2013. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer: a review of trends and strategies. Biomaterials, 34, 8690-707.

491. YK, W., CF, G., T, Y., Z, C., XW, Z., XX, L., NL, M. and WZ, Z. 2011. Assessment of ERBB2 and EGFR gene amplification and protein expression in gastric carcinoma by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization. Mol Cytogenet, 4, 14.

492. YOSHIMURA, M., ITASAKA, S., HARADA, H. and HIRAOKA, M. 2013. Microenvironment and radiation therapy. Biomed Res Int, 2013, 685308.

493. YU, C. C., HUNG, S. K., LIAO, H. F., LEE, C. C., LIN, H. Y., LAI, H. C., LI, S. C., HO, H. C., HUANG, H. B. and SU, Y. C. 2014a. RAD001 enhances the radiosensitivity of SCC4 oral cancer cells by inducing cell cycle arrest at the G2/M checkpoint. Anticancer Res, 34, 2927-35.

494. YU, D., SHIN, H. S., LEE, Y. S., LEE, D., KIM, S. and LEE, Y. C. 2014b. Genistein attenuates cancer stem cell characteristics in gastric cancer through the downregulation of Gli1. Oncol Rep, 31, 673-8.

495. YU, H. 2012. Typical cell signaling response to ionizing radiation: DNA damage and extranuclear damage. Chin J Cancer Res, 24, 83–89.

496. YU, X., ZHU, J., MI, M., CHEN, W., PAN, Q. and WEI, M. 2012a. Anti-angiogenic genistein inhibits VEGF-induced endothelial cell activation by decreasing PTK activity and MAPK activation. Med Oncol, 29, 349-57.

497. YU, Y. L., CHOU, R. H., WU, C. H., WANG, Y. N., CHANG, W. J., TSENG, Y. J., CHANG, W. C., LAI, C. C., LEE, H. J., HUO, L., CHEN, C. H. and HUNG, M. C. 2012b. Nuclear EGFR suppresses

177

Page 178: 6.11.14 doktorat_final-final

ribonuclease activity of polynucleotide phosphorylase through DNAPK-mediated phosphorylation at serine 776. J Biol Chem, 287, 31015-26.

498. YUSUP, G., AKUTSU, Y., MUTALLIP, M., QIN, W., HU, X., KOMATSU-AKIMOTO, A., HOSHINO, I., HANARI, N., MORI, M., AKANUMA, N., ISOZAKI, Y. and MATSUBARA, H. 2014. A COX-2 inhibitor enhances the antitumor effects of chemotherapy and radiotherapy for esophageal squamous cell carcinoma. Int J Oncol, 44, 1146-52.

499. ZAIDI, S., MCLAUGHLIN, M., BHIDE, S. A., ECCLES, S. A., WORKMAN, P., NUTTING, C. M., HUDDART, R. A. and HARRINGTON, K. J. 2012. The HSP90 inhibitor NVP-AUY922 radiosensitizes by abrogation of homologous recombination resulting in mitotic entry with unresolved DNA damage. PLoS One, 7, e35436.

500. ZANDI, R., LARSEN, A. B., ANDERSEN, P., STOCKHAUSEN, M. T. and POULSEN, H. S. 2007. Mechanisms for oncogenic activation of the epidermal growth factor receptor. Cell Signal, 19, 2013-23.

501. ZERP, S. F., STOTER, R., KUIPERS, G., YANG, D., LIPPMAN, M. E., VAN BLITTERSWIJK, W. J., BARTELINK, H., ROOSWINKEL, R., LAFLEUR, V. and VERHEIJ, M. 2009. AT-101, a small molecule inhibitor of anti-apoptotic Bcl-2 family members, activates the SAPK/JNK pathway and enhances radiation-induced apoptosis. Radiat Oncol, 4, 47.

502. ZHA, L., QIAO, T., YUAN, S. and LEI, L. 2010. Enhancement of radiosensitivity by CpG-oligodeoxyribonucleotide-7909 in human non-small cell lung cancer A549 cells. Cancer Biother Radiopharm, 25, 165-70.

503. ZHAI, X., LIN, M., ZHANG, F., HU, Y., XU, X., LI, Y., LIU, K., MA, X., TIAN, X. and YAO, J. 2013. Dietary flavonoid genistein induces Nrf2 and phase II detoxification gene expression via ERKs and PKC pathways and protects against oxidative stress in Caco-2 cells. Mol Nutr Food Res, 57, 249-59.

504. ZHANG, L., LI, L., JIAO, M., WU, D., WU, K., LI, X., ZHU, G., YANG, L., WANG, X., HSIEH, J. T. and HE, D. 2012a. Genistein inhibits the stemness properties of prostate cancer cells through targeting Hedgehog-Gli1 pathway. Cancer Lett, 323, 48-57.

505. ZHANG, L. N., CAO, P., TAN, S. H., GU, W., SHI, L. and ZHU, H. L. 2008. Synthesis and antimicrobial activities of 7-O-modified genistein derivatives. Eur J Med Chem, 43, 1543-51.

506. ZHANG, L. N., XIAO, Z. P., DING, H., GE, H. M., XU, C., ZHU, H. L. and TAN, R. X. 2007. Synthesis and cytotoxic evaluation of novel 7-O-modified genistein derivatives. Chem Biodivers, 4, 248-55.

507. ZHANG, Q., PARK, E., KANI, K. and LANDGRAF, R. 2012b. Functional isolation of activated and unilaterally phosphorylated heterodimers of ERBB2 and ERBB3 as scaffolds in ligand-dependent signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13237-42.

508. ZHANG, S., WANG, Y., CHEN, Z., KIM, S., IQBAL, S., CHI, A., RITENOUR, C., WANG, Y. A., KUCUK, O. and WU, D. 2013a. Genistein enhances the efficacy of cabazitaxel chemotherapy in metastatic castration-resistant prostate cancer cells. Prostate, 73, 1681-9.

509. ZHANG, X. M., LI, Y. X., WANG, W. H., JIN, J., WANG, S. L., LIU, Y. P., SONG, Y. W., REN, H., FANG, H., ZHOU, L. Q., CHEN, B., QI, S. N., LIU, Q. F., LU, N. N., LIU, X. F. and YU, Z. H. 2013b. Favorable outcome with doxorubicin-based chemotherapy and radiotherapy for adult patients with early stage primary systemic anaplastic large-cell lymphoma. Eur J Haematol, 90, 195-201.

510. ZHANG, Y. and CHEN, H. 2011a. Genistein attenuates WNT signaling by up-regulating sFRP2 in a human colon cancer cell line. Exp Biol Med (Maywood), 236, 714-22.

511. ZHANG, Y. and CHEN, H. 2011b. Genistein, an epigenome modifier during cancer prevention. Epigenetics, 6, 888-891.

512. ZHANG, Y., CHEN, X., REN, P., SU, Z., CAO, H., ZHOU, J., ZOU, X., FU, S., LIN, S., FAN, J., YANG, B., SUN, X., ZHOU, Y., CHEN, Y., YANG, L. and WU, J. 2013c. Synergistic effect of combination topotecan and chronomodulated radiation therapy on xenografted human nasopharyngeal carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 87, 356-62.

513. ZHANG, Y., SUN, Y., WANG, L., YE, T., PAN, Y., HU, H., YU, Y., ZHAO, N., SONG, Y., GARFIELD, D. and CHEN, H. 2013d. Sequential treatment of tyrosine kinase inhibitors and chemotherapy for EGFR-mutated non-small cell lung cancer: a meta-analysis of Phase III trials. Onco Targets Ther, 6, 1771-7.

514. ZHANG, Z., WANG, C. Z., DU, G. J., QI, L. W., CALWAY, T., HE, T. C., DU, W. and YUAN, C. S. 2013e. Genistein induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis via ATM/p53-dependent pathway in human colon cancer cells. Int J Oncol, 43, 289-96.

515. ZHOU, Y., XU, Y., WANG, H., NIU, J., HOU, H. and JIANG, Y. 2014. Histone deacetylase inhibitor, valproic acid, radiosensitizes the C6 glioma cell line. Oncol Lett, 7, 203-208.

178

Page 179: 6.11.14 doktorat_final-final

516. ZHU, Y. P., YAO, X. D., ZHANG, S. L., DAI, B., ZHANG, H. L., SHEN, Y. J., ZHU, Y., SHI, G. H., LIN, G. W. and YE, D. W. 2014. Oral etoposide and oral prednisone for the treatment of castration resistant prostate cancer. Kaohsiung J Med Sci, 30, 82-5.

179