8 (hplc)
DESCRIPTION
analisis instrumenTRANSCRIPT
04/10/23 1
Materi 6
(High Performance Liquid Chromatography)
High Price Liquid Chromatography
KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
04/10/23 2
Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain;
• Tidak mudah menguap (insufficiently volatile)
• Tidak dapat melewati kolom
• Tidak tahan panas (Thermally unstable)
• Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC.
HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer, dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS)
.
04/10/23 3
Teori HPLC
Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa.
K =Cs
CmCs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam
Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak
Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah’
1. Kompetisi fasa gerak
2. Temperatur
3. Jenis fasa diam
04/10/23 4
Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram.
Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom.
VR = F x TrVR = Volume retensi
Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa
04/10/23 5
Sistem HPLC1. Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem)
2. Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor)
3. Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim)
Waktu Retensi
Ratio Pelarut
B 100 %
A 0 Waktu RetensiA 0
Ratio Pelarut
B 100 %
04/10/23 6
Rangkaian Dasar HPLC
PompaWadah fasa
gerak
Injektor
KolomDetektor
Wadah Pembuangan
Rekorder atau data prosesor
04/10/23 7
Wadah fasa gerak1. Tunggal (isokratik)
2. Lebih dari satu (gradient)
1. Piston tunggal
2. Piston ganda
1. 50 – 100 L (analitik)
2. 500 L - 5 ml (preparatif)
Pompa
Injektor
Kolom
1. Prekolom
2. Standard
3. Radial Compression
4. Narrow Bore
5. Short
Detektor
1. RI (refractive Index)
2. UV-Vis
3. Flourescence
4. PDA (Photo Diode Array)
5. Amperometric
04/10/23 8
Jenis-jenis kolom HPLC
N0 Nama kolom Jenis adsorban
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ultrasil-Si
Ultrasil-octyl
Ultrasil-ODS
LiChrosorb Si
LiChrosorb RP-2
LiChrosorb RP-8
LiChrosorb RP-18
LiChrosorb NH2
LiChrosorb CN
SiO2 (silika)
Octana (C8)
Octadecana (C-18)
SiO2 (silika)
Etana (C-2)
Octana (C8)
Octadecana (C-18)
Amina
Cyano
04/10/23 9
Mekanisme pemisahan pada HPLC
Fasa gerak
Fasa diam
Kolom
Fasa gerak ke detektor
Waktu retensi (min)
Sampel A dan B
Sinyal pada rekorder
A dan B mulai terpisah
BA
04/10/23 10
Syarat fasa gerak (pelarut/elusi) HPLC
Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan
Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem
detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun
tekanan
04/10/23 11
Macam-macam tampilan puncak senyawa pada kromatogram
1. Tajam (sharp)
2. Kembar (twin)
3. Berbahu (Shoulder)
4. Melebar (slope)
04/10/23 12
Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki, bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0,1 mg/g, sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g, sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar.
h
Axis waktu
ba10 % h
AF = b/a = 1
Axis waktu
h
a b10 % h
AF = b/a = 2
AF = asimetri faktor
04/10/23 13
Kolom selektifitas, efesiensi, ratio pemisahan
Selektifitas cukup, tetapi efesiensi rendah
Selektifitas dan efesiensi baik
Selektifitas rendah, tetapi efesiensi baik
04/10/23 14
Cara-cara mengatasi permasalah pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC
1. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak.
2. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak.
3. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom.
4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan.
4. Menambah panjang kolom (double column)
04/10/23 15
Kalkulasi hasil kromatogram HPLC
Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol (standard).
1. Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi)
2. Garis regresi linier
04/10/23 16
Keuntungan-keuntungan melakukan analisa dengan HPLC
a. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam)
b. Daya pisahnya (migrasi) baik
c. Peka, detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence dapat mendeteksi sampai jumlah g)
d. Kolom dapat dipakai kembali
e. Ideal untuk molekul besar, ion yang tidak bisa dengan GC
f. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel)