Szent István Egyetem

A génexpresszió minőségbiztosítási rendszerei:

a Nonsense-Mediated Decay mRNS bontó rendszer

szabályozó elemei

Kerényi Farkas

Gödöllő

2017

Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet

A doktori iskola

megnevezése: Biológiatudományi Doktori Iskola

tudományága: molekuláris biológia

vezetője: Dr. Nagy Zoltán

intézetvezető egyetemi tanár, az MTA doktora

SZIE, Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar,

Növénytani és Ökofiziológiai Intézet

Témavezető: Dr. Silhavy Dániel

tudományos tanácsadó, az MTA doktora

NAIK Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet

Genetikai főosztály, Növényi RNS Biológia csoport

........................................................... ...........................................................

Az iskolavezető jóváhagyása A témavezető jóváhagyása

1. TARTALOMJEGYZÉK

1. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................................. 1

2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................................... 3

3. BEVEZETÉS .............................................................................................................................. 4

4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ....................................................................................................... 6

4.1. A génexpresszió szabályozása ............................................................................................. 6

4.2. Az mRNS-ek szerkezete és lebomlása ................................................................................ 7

4.3. Citoplazmás mRNS minőségbiztosítási rendszerek ............................................................ 9

4.4. A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD)................................................................... 10

4.4.1. Az NMD jelentősége ................................................................................................. 10

4.4.2. Az NMD működése, cisz-elemei és transz-faktorai .................................................. 12

4.4.3. Az NMD korai szakasza ............................................................................................ 14

4.4.3.1. A hosszú 3'UTR alapú NMD ............................................................................. 15

4.4.3.2. Az intron alapú NMD ........................................................................................ 17

4.4.3.3. Az uORF alapú NMD ........................................................................................ 19

4.4.4. Az UPF1 foszforilációs ciklusa ................................................................................. 20

4.4.5. Az NMD kései lépései ............................................................................................... 27

4.5. A növényi NMD vizsgálatára használt tesztrendszerek .................................................... 31

4.5.1. Agroinfiltráción alapuló tranziens génexpresszió ...................................................... 32

4.5.2. Agroinfiltráción alapuló VIGS-komplementációs tranziens NMD tesztrendszer ..... 33

5. ANYAG ÉS MÓDSZER ........................................................................................................... 35

5.1. Növények ........................................................................................................................... 35

5.2. Agrobaktérium törzs .......................................................................................................... 35

5.3. Expressziós vektorok és NMD tesztkonstrukciók ............................................................. 35

5.4. PCR-mutagenezis .............................................................................................................. 35

5.5. Agroinfiltrálás .................................................................................................................... 36

5.6. Vírus indukálta géncsendesítés és VIGS-komplementáció ............................................... 36

5.7. RNS kivonás növényi szövetből ........................................................................................ 37

5.8. Northern blot ..................................................................................................................... 37

5.9. Fehérje kivonás növényi szövetből.................................................................................... 38

5.10. Western blot ..................................................................................................................... 38

5.11. Immunprecipitáció (IP) ................................................................................................... 38

5.12. Foszfofestés ..................................................................................................................... 39

6. EREDMÉNYEK ....................................................................................................................... 40

6.1. Növényi mRNS-ek 3’ nem transzlálódó régiójában helyeződő intronok

finomtérképezése ...................................................................................................................... 40

6.2. A növényi UPF1 foszforegulációja ................................................................................... 42

6.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának S/TQ potenciális foszfohelyei részt vesznek az

NMD-ben ............................................................................................................................. 43

6.2.2. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része erősen foszforilált, de nincs szerepe

az NMD-ben ........................................................................................................................ 47

6.2.3. Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő S/TQ helyek valóban

foszforiláltak, és szükségesek az NMD-hez ........................................................................ 48

6.2.4. A funkcióját vesztett N-terminális UPF1 mutánsoknak domináns-negatív hatásuk

van ........................................................................................................................................ 51

6.2.5. Az UPF1 fehérje C-terminális régiója funkciójukat tekintve redundáns részekre

bontható ............................................................................................................................... 52

6.2.6. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén különböző funkciójú S/TQ helyek

vannak .................................................................................................................................. 54

6.2.7. AZ UPF1 C-terminális régiójának C1 részén az S/TQ potenciális foszfohelyek

valóban foszforiláltak .......................................................................................................... 57

6.3. Új tudományos eredmények .............................................................................................. 58

7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ............................................................................ 59

7.1. A stop kodon és a 3'UTR-ben helyeződő intron közötti távolság szerepe a növényi NMD-

ben ............................................................................................................................................ 59

7.2. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben ............................................... 61

7.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben .............................. 61

7.2.2. Az UPF1 C-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben .............................. 63

7.2.3. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben ....................................... 65

8. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................................. 67

9. SUMMARY .............................................................................................................................. 69

MELLÉKLETEK

3

2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

A fontosabb, többször előforduló rövidítések abc sorrendben.

CBP - cap binding protein

CBC - cap binding complex

CCR4 - C-C motif chemokine receptor 4

CFP - cyan fluorescent protein

CH domain - cystein-histidin rich domain

DCP - decapping protein

DECID complex - decay inducing complex

DSE - downstream sequence element

dsRNS - double stranded RNS

EBM - EJC binding motif

eIF - eucaryote initiation factor

EJC - exon junction complex

eRF - eucaryote release factor

FRET-FLIM - fluorescence resonance energy transfer - fluorescence lifetime imaging

GFP - green fluorescent protein

MS - mass spectrometry

NGD - no-go decay

NMD - nonsense-mediated mRNA decay

NOT - negative regulator of transcription

NR - nuclear receptor

NSD - non-stop decay

PABP - poly(A)-binding protein

PDS - phytoene desaturase

PIKK kináz - phosphatidylinositol 3-kinase related kinase

PNRC2 - proline-rich nuclear receptor coregulatory protein 2

PP2A - protein phosphatase 2A

PTC - premature termination codon

RISC - RNA induced silencing complex

RNP - ribonucleoprotein

SMG - suppressor with morphogenetic effect on genitalia

SMG1C - SMG1 complex

sRNS - small RNS

SURF complex - SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3 complex

TRV - Tobacco Rattle Virus

U1DN - UPF1 dominant-negative

UPF - up frameshift

uORF - upstream open reading frame

UTR - untranslated region

VIGS - virus induced gene silencing

XRN - 5'-3' exoribonuclease

YFP - yellow fluorescent protein

4

3. BEVEZETÉS

Az eukarióta sejtekben a génexpresszió szigorúan szabályozott. A mennyiségi szabályozás mellett

nagyon fontos a minőségi ellenőrzés is, erre a feladatra alakultak ki a különféle minőségbiztosítási

rendszerek. Ezek a rendszerek azért felelnek, hogy a sejtekben csak hibátlan fehérjék legyenek

jelen. A minőségbiztosítási rendszerek a génexpresszió minden lépését ellenőrzik, közülük a

legváltozatosabbak az mRNS-eket, mert az mRNS-ek érése rendkívül bonyolult folyamat, ezért

annak során sok a hibalehetőség. A különböző hibákat különféle rendszerek ismerik föl,

melyekben az a közös, hogy a felismert hibás RNS-eket nem kijavítják, hanem azok lebontását

indukálják, mégpedig a vad típusú RNS-eket is lebontó útvonalakon keresztül. Az evolúció során

kialakult különféle minőségbiztosítási rendszerek közül az egyik, a Nonsense-Mediated mRNA

Decay (NMD), a korai stop kodont (premature termination codon - PTC) tartalmazó hibás mRNS-

eket ismeri föl. Az ilyen mRNS-ekről csonka, gyakran domináns-negatív hatású fehérjék

keletkezhetnek, melyek különböző betegségeket okozhatnak. Az NMD a hibás mRNS-ek

lebontása mellett részt vesz egyes vad típusú gének expressziójának szabályozásában is. Az NMD-

t irányító legfontosabb fehérjék (transz faktorok), az UPF1, az UPF2 és az UPF3 (up frameshift 1,

-2, -3) az élesztőtől a gerincesekig konzerváltak. A cisz elemek azonban, amik alapján az NMD

fölismeri a hibás, PTC-t tartalmazó mRNS-eket, eltérőek. Az élesztő és a gerinctelen NMD

elsősorban azokat a stop kodonokat ismeri fel koraiként, amik után a 3’UTR szokatlanul hosszú

(hosszú 3’ UTR alapú NMD). Gerincesekben viszont főként azok a stop kodonok minősülnek

korainak, amelyek után a 3'UTR-ben legalább 50 nukleotidnyi távolságra intron található, és az

intron kivágódása során az mRNS-re az exon junction complex (EJC) rakódik (intron alapú NMD).

A hibás mRNS felismerése során szerelődik össze az UPF1-UPF2-UPF3 komplex (NMD-

komplex), ami az mRNS lebontását indukálja. Állatokban a hibás mRNS felismerését és lebontását

összekötő kulcslépés az UPF1 SMG1 (suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1) általi

foszforilációja, ugyanis a foszforilált UPF1-hez tudnak kötődni a degradációért felelős faktorok,

az SMG6, az SMG5/SMG7 heterodimer és a PNRC2 (proline-rich nuclear receptor coregulatory

protein 2). Az SMG6 az mRNS endonukleolitikus hasításával, az SMG5/SMG7 komplex

deadeniláció és decapping, a PNRC2 decapping kiváltásával hoz létre szabad, fehérjék által nem

védett végű mRNS-eket, amiket az RNS bontó exonukleázok hatékonyan és gyorsan lebontanak.

Az NMD tehát egy rendkívül fontos mRNS minőségbiztosítási rendszer. Ennek megfelelően

élesztőben, Drosophilában és emlősökben alaposan tanulmányozott és nagyon sok részletében már

ismert folyamat. Csoportunk korábban kidolgozott egy hatékony tranziens NMD tesztrendszert,

ami a növényi NMD cisz elemeinek és transz faktorainak azonosítására és vizsgálatára alkalmas.

5

Ennek a kísérleti rendszernek a segítségével a csoport feltárta a növényi NMD mechanizmusának

alapjait. Bizonyították, hogy növényekben a hosszú 3’UTR alapú és az intron alapú NMD is

működik. Azonosították a növényi NMD fő transz faktorait, az UPF1, az UPF2, az UPF3, és az

SMG7 géneket. Igazolták, hogy ezek a gének kellenek mindkét típusú növényi NMD-hez, míg az

emlős EJC két összetevőjének (Y14 és Mago) ortológjai növényekben csak az intron alapú NMD-

hez szükségesek. Kiderítették, hogy nem minden 3’UTR intron okoz NMD-t növényekben, a stop

kodonhoz nagyon közeli intronok - az emlősökhöz hasonlóan – növényekben sem indukálnak

NMD-t. Valószínűsítették azt is, hogy az UPF1 növényekben is foszforegulált lehet. Kimutatták

ugyanis, hogy a növényi UPF1 N- és C-terminális régiója funkcióját tekintve redundáns, mindkettő

tud NMD-t indukálni, és mindkét régió foszforilált.

Miután kiderült, hogy növényekben is pozíció függő az, hogy a 3’UTR intronok okoznak-

e NMD-t vagy sem, illetve az is, hogy az emlős NMD-ben kulcsszerepet játszó EJC egyes fehérjéi

a növényi intron alapú NMD-hez is szükségesek, valószínűsítettük, hogy a szerkezeti

hasonlóságok miatt növényekben is körülbelül 50 nukleotid lehet az a távolság a stop kodon és az

intron kivágódásának helye között, ami már NMD-t indukál. Ezen feltételezésünket, valamint azt,

hogy az emlősökéhez hasonlóan igen-nem válasz van, vagy pedig a távolság növekedésével van

valamiféle fokozatosság, olyan NMD riporter GFP konstrukciókkal kívántuk megvizsgálni,

melyek 3'UTR-jébe a stop kodontól különböző távolságra intront klónoztunk.

Az UPF1 meglehetősen konzervatív fehérje, a növényi UPF1 N- és C-terminális régiói

ugyanúgy S/TQ potenciális foszfohelyekben gazdag, mint az emlős UPF1. Ezért kérdéses volt,

hogy vajon ezek az S/TQ helyek kellenek-e a növényi NMD-hez is, hogy ezek a helyek

foszforiláltak-e, és ha igen, a foszforilációra szükség van-e az NMD-hez. Ezek vizsgálatára pont-

és deléciós mutáns UPF1 konstrukciókat terveztünk készíteni, melyek alkalmasak az S/TQ

potenciális foszfohelyek, így az N- és C-terminális régiók funkcionális térképezésére.

Célkitűzéseink tehát pontokba szedve:

1. Meg kívántuk határozni, hogy a 3'UTR-ben helyeződő intronoknak növényekben is

a stop kodontól legalább 50 nukleotidra kell-e lenniük ahhoz, hogy NMD-t

okozhassanak, és hogy a STOP-EJC távolság növekedésével az NMD hatékonysága

is változik-e.

2. Ki akartuk deríteni, hogy az UPF1 N-, illetve C-terminális S/TQ-gazdag régióiban

az S/TQ helyekre szükség van-e az NMD-hez, és ha igen, melyek ezek; valamint azt,

hogy ezek az S/TQ helyek foszforiláltak-e, és ha igen, a foszforiláció szükséges-e az

NMD-hez.

6

4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Ebben a fejezetben legfőképp a munkám kezdetekor rendelkezésre álló ismereteket összegzem.

Az eredményeink publikálásával egy időben, illetve azóta megjelent új információkat a

"Következtetések és javaslatok" fejezetben tárgyalom.

4.1. A génexpresszió szabályozása

Az eukariótákban a génexpresszió szigorúan és több szinten szabályozott, így biztosítva, hogy egy

adott sejt típusban, az adott fejlődési stádiumban csak az ott szükséges fehérjék legyenek jelen. A

génexpresszió mennyiségi és minőségi szabályozására külön rendszerek alakultak ki.

Hagyományosan a génexpresszió szabályozása alatt a mennyiségi szabályozást értjük, mely azt

határozza meg, hogy adott helyen és időben egy génről mennyi RNS és fehérje termelődjön. Az

optimális sejtműködéshez azonban nagyon fontos a minőségi szabályozás is, ezt a feladatot

különféle minőségbiztosítási rendszerek végzik. Ezek a minőségbiztosítási rendszerek azért jöttek

létre, hogy hibás fehérjék ne termelődhessenek. Mivel az eukariótákban az mRNS érése rendkívül

komplex folyamat, a minőségbiztosítási mechanizmusok nagy része az mRNS-eket ellenőrzi. Az

evolúció során pedig úgy alakult, hogy ezen rendszerek egy része új funkciót is nyert: némely

hibátlan, vad típusú mRNS szintjét is szabályozzák.

Az mRNS-ek mennyisége a transzkripció és a degradáció intenzitásától függ. A

transzkripció szabályozásához képest a poszttranszkripciós szabályozó mechanizmusok pontos

működéséről egyelőre sokkal kevesebbet tudunk. Az eukarióta mRNS-ek fehérjékkel alkotnak

komplexet, szabad formában - normális körülmények között - nincsenek jelen a sejtben. Ezek a

fehérjék védik az RNS-t a lebomlástól, részt vesznek az mRNS érési és export folyamataiban,

valamint biztosítják a normális citoplazmás lokalizációt és transzlációt (Houseley and Tollervey,

2009). Az mRNS érésekor annak 5' végére egy sapka (cap) kerül, mely az RNS-bontó enzimektől

védi a transzkriptumot; az intronok kivágódnak (splicing); az RNS a poliadenilációs jel közelében

elvágódik és a 3' végére poliadenin(poliA)-farok szintetizálódik (Perales and Bentley, 2009). Azon

fehérjék némelyike, amik az mRNS exportjához kellenek, a transzkripció során kapcsolódik az

mRNS-hez. Ezek és a később felrakódó fehérjék az exporton kívül szerepet játszanak a sejten

belüli lokalizációban, valamint a transzláció lépéseiben. Az mRNS érésének lépései is szigorú

ellenőrzés mellett zajlanak, hogy a kellő helyen és időben megfelelő mennyiségű és minőségű

7

fehérje álljon rendelkezésre (Sonenberg and Hinnebusch, 2009, Martin and Ephrussi, 2009, Moore

and Proudfoot, 2009).

Az mRNS-ek stabilitása több tényezőtől függ, fejlődési stádiumtól és környezeti

hatásoktól függően nagyban változhat. Az mRNS-ek is szigorú kontroll alatt degradálódnak, ennek

helyét és idejét az mRNS stabilitását meghatározó cisz-elemek és a citoplazmában jelen lévő

transz-faktorok koncentrációja határozza meg. Hogy egyes mRNS-ek szabályozása mennyire

különbözhet egymástól, azt az is mutatja, hogy pl. emlősökben stressz hatására az mRNS-ek

negyedének változott az expressziós szintje, egyik felének az mRNS transzkripcióján, másik

felének a degradációján keresztül (Fan et al., 2002). Az mRNS-ek egy másik, jelentős része stressz

esetén nem lebomlik, hanem transzlációs gátlás alá esik, és vannak olyan mRNS-ek is, amelyeket

különféle mechanizmusok menekítenek ki ez alól a transzlációs gátlás alól (Spriggs et al., 2010).

4.2. Az mRNS-ek szerkezete és lebomlása

Az eukarióta mRNS-ek féléletideje változatos, de általában igen hosszú, növényekben átlagosan

csaknem 6 óra (Narsai et al., 2007). Ezt a stabilitását az mRNS molekulák zárt gyűrű szerkezete

biztosítja, mely úgy alakul ki, hogy az érés során felrakódott sapkához sapka-kötő fehérjék (cap

binding protein, CBP), míg a 3' végre szintetizálódott polyA-farokhoz polyA-kötő fehérje (polyA

binding protein, PABP) kapcsolódik, a CBP-k és a PABP pedig egymáshoz kötődnek (Moore and

Proudfoot, 2009). Ez a stabil mRNS-fehérje komplex (ribonucleoprotein, mRNP) már védve van

az RNS-bontó exonukleáz enzimektől. A gyűrű alakú szerkezet, illetve a kialakításában részt vevő

fehérjék a hatékony transzlációhoz is hozzájárulnak (Houseley and Tollervey, 2009).

A különböző lebomlási útvonalak teszik lehetővé, hogy egy sejtben az akkor éppen

meglévő mRNS készletet szükség esetén - pl. stressz hatására - gyorsan le lehessen cserélni. Az

mRNS lebontásához a zárt gyűrűstruktúra megszüntetése az első lépés. Ezt az esetek többségében

a deadenilázok váltják ki, ezért a citoplazmás mRNS lebomlásnak ez a sebesség-meghatározó

lépése. A stop kodonhoz érkezett, termináló riboszómához - megfelelő tRNS hiányában - a tRNS-

hez hasonló szerkezetű eRF1 (eucaryotic release factor 1), illetve együttműködő partnere, az eRF3

kötődik. Az eRF3 ezután a PABP-vel is kapcsolódik, ez teszi lehetővé a hatékony transzláció

terminációt. A deadeniláció szabályozásának egyik népszerű modellje szerint a deadenilázok – a

PABP közreműködésével – minden terminációs eseménynél levágnak egy darabot a polyA-

farokból (Funakoshi et al., 2007, Wolf and Passmore, 2014, Celik et al., 2015). Ha a polyA-farok

8

1. ábra. mRNS lebomlási útvonalak eukariótákban.

Az mRNS-t egy sapka védi az 5' végen és egy poliA-farok, illetve az ahhoz kötődő PABP a 3' végen. Az

mRNS lebontási folyamatokban az első lépés szinte mindig a deadeniláció. Ezt decapping és 5'-3' irányú

lebontás követi (XRN1, XRN4), vagy pedig 3'-5' irányú lebontás (exoszóma). Emlősökben létezik egy ún.

scavanger decapping is, ami a 3'-5' irányú lebomlás végén történik. Ha az mRNS-t valamilyen endonukleáz

hasítja el (ezen az ábrán ez nincs feltüntetve), a szabad mRNS végeket ugyanezek az exonukleázok

támadják: a szabad 3' vég felől az exoszóma, a szabad 5' vég felől pedig az XRN1 illetve az XRN4. A

színes nyilak a különféle organizmusok útvonalait jelölik (zöld: növények, fekete: élesztő, piros: emlősök).

Az ábrát Chiba és munkatársai munkája alapján, módosítva közlöm (Chiba and Green, 2009).

a kritikus hossz alá kerül (kb. 20 adenin), a PABP leválik az mRNS-ről, ezzel a 3' vég szabaddá

válik a 3'-5' irányú exonukleázok, az exoszóma komplexek számára (1. ábra) (Belostotsky and

Sieburth, 2009).

A transzlálódó mRNS-en a PABP a sapka-kötő komplex egyik elemével, az eIF4G-vel

kapcsolódik (Silva et al., 2008, Wells et al., 1998). A PABP leválásával PABP-kötés hiányában

megszűnik a sapka stabilitása is, vagyis a deadenilációt gyors decapping követi (Tharun, 2009).

Ezzel az mRNS 5' vége is szabaddá válik s így egyúttal támadhatóvá is az 5'-3' exonukleázok

számára (1. ábra). Élesztőben és állatokban ez az enzim az XRN1 (5'-3' exoribonuclease).

Növényekben három ilyen enzimet ismerünk: az XRN2 és az XRN3 a sejtmagban, míg az XRN4

9

a citoplazmában lokalizálódik, ennek megfelelően az XRN4 felelős a decappinget követő 5'-3'

irányú mRNS lebontásért (Souret et al., 2004).

PolyA polimerizáció a cappinggel ellentétben a citoplazmában is zajlik, ezért a

citoplazmában a deadeniláció reverzibilis, míg a decapping irreverzibilis folyamat (Garneau et al.,

2007). Ez utóbbi lehet a magyarázata annak, hogy Arabidopsis thaliana-ban az xrn4 mutánsok

fenotípusa viszonylag enyhe: a decappingen átesett mRNS-ek már nem transzlálódnak, így előbb

vagy utóbb egy másik lebontási útvonal áldozatai lesznek.

Szükség esetén a deadenilációt meg is lehet kerülni, vagy akár föl is lehet gyorsítani.

Például az RNS interferencia alapú szabályozás (lásd később) esetén az mRNS elvágódik, ezáltal

keletkezik egy szabad 3' végű és egy szabad 5' végű RNS darab, amiket az exonukleázok azonnal

támadni tudnak (Voinnet, 2009). Felgyorsult deadenilációt, vagy deadenilációtól független

decappinget okozhatnak azok a fehérjék, amelyek az mRNS-ek cisz-elemeihez tudnak kötődni,

így gyorsítva az mRNS lebomlását (Garneau et al., 2007).

4.3. Citoplazmás mRNS minőségbiztosítási rendszerek

Ha az eukarióta sejtekben képződő jelentős mennyiségű hibás mRNS transzlálódna, akkor a vad

típusútól akár jelentősen eltérő aktivitású fehérjék is termelődnének. Ezért alakulhatott ki többféle,

a hibás mRNS-eket hatékonyan felismerő, és azokat lebontó RNS minőségbiztosítási rendszer

(Doma and Parker, 2006). A keletkező mRNS-ek ellenőrzése már a sejtmagban, rögtön a

transzkripció után elkezdődik és a citoplazmában folyó transzláció végéig tart. Eukariótákban

jelenleg négyféle, a citoplazmában működő RNS-szintű minőségbiztosítási rendszert ismerünk, az

RNS interferencia, No-Go decay (NGD), a Non-Stop decay (NSD) és a Nonsense-Mediated

mRNA decay (NMD) rendszereket. Ezek más-más módon azonosítják és bontják le a különböző

hibákat tartalmazó mRNS-eket.

Az RNS interferencia rendszere (más néven géncsendesítés vagy RNS silencing) a

kétszálú RNS-eket (double stranded, dsRNS), valamint cap vagy polyA nélküli mRNS-eket

azonosít (Baulcombe, 2005). A dsRNS-eket először a DICER endonukleáz hasítja rövid, kétszálú

kis RNS-ekre (small RNS, sRNS; 21-26 nt). Ezek a végrehajtó komplexekbe egyszálú (single-

stranded, ss) formában épülnek be és biztosítják azok szekvencia-specifitását. Ez alapján találja

meg az effektor komplex a komplementer szekvenciát hordozó mRNS-eket. A legfontosabb RNS

interferencia végrehajtó komplex, a RISC (RNA induced silencing complex) az mRNS-eket az

sRNS-mRNS kétszálú régió kb. közepén elhasítja, ezáltal csökkenti a target mRNS-ek

10

expresszióját, vagyis az azokat kódoló géneket csendesíti. Előfordul, hogy az sRNS és az mRNS

nem teljesen komplementer. Ha csak egy-két mismatch van az sRNS-en, még tud hasítani a RISC,

de ha több, akkor már nem képes elvágni a target mRNS-t, csak a transzlációját gátolja. (Hutvagner

and Simard, 2008, Liu et al., 2009, Voinnet, 2008, Wassenegger and Krczal, 2006). Az RNS

interferencia nem csak a minőségbiztosításban és több saját gén expressziójának transzkripcionális

és poszttranszkripcionális szabályozásában vesz részt, hanem egyúttal a növények leghatékonyabb

antivirális rendszere is (Llave, 2010).

Az NGD azokat az mRNS-eket bontja, amelyeken a transzláció elongáció elakadt,

például hibás nukleotidok vagy erős másodlagos szerkezet miatt. Az elakadt riboszóma a

Dom34/Pelota és Hbs1 fehérjékkel együtt az mRNS riboszómához közeli helyen történő

endonukleolitikus vágását indukálja (Doma and Parker, 2006, Swisher and Parker, 2009).

Az NSD olyan mRNS-ek felismerését végzi, melyekből - mutáció, hibás átírás vagy a

transzkripció korai terminációja miatt - hiányzik a stop kodon. A riboszóma így végigmegy az

mRNS-en, transzlálja a polyA-farkat is, ezzel lelöki a PABP-t, ami pedig az mRNS zárt gyűrű

szerkezetének felbomlásához, és az mRNS lebomlásához vezet (Frischmeyer et al., 2002). A

növényi NSD és NGD rendszerek kevésbé ismertek. Az NGD fő faktorainak (Dom34/Pelota és

Hbs1) növényi ortológjait már azonosították (Siwaszek et al., 2014), és mivel ősi rendszerről van

szó, valószínűleg a növényekben is működik. A gyors és hatékony élesztő NSD-hez szükséges

Ski7 növényi ortológja hiányzik (Atkinson et al., 2008), ennek ellenére ez a rendszer hatékonyan

működik növényekben is (Szádeczky-Kardoss et al., közlésre beküldve).

Az NMD a korai in-frame stop kodont (premature termination codon, PTC) ismeri fel és

bontja az ezt tartalmazó mRNS-t, ezzel megakadályozza a csonka, sokszor domináns-negatív

hatású fehérjék termelődését (Behm-Ansmant et al., 2007b, Alonso, 2005).

4.4. A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD)

4.4.1. Az NMD jelentősége

Az NMD útvonal és annak fő faktorai konzerváltak: az összes vizsgált eukariótában

(egysejtűekben, pékélesztőben, hasadó élesztőben, fonálféregben, muslicában, halakban,

emlősökben és növényekben) van NMD (Stalder and Muhlemann, 2008).

11

Az NMD azokat a hibás mRNS-eket ismeri fel és bontja le, amelyek korai stop kodont

tartalmaznak, megakadályozva ezzel a csonka, gyakran domináns-negatív hatású fehérjék

képződését. Domináns-negatív hatású fehérjék többféleképpen is létrejöhetnek. Például úgy, hogy

a katalitikus domén átíródik, de a szabályozó régió nem, és így egy folyamatosan aktív fehérje

keletkezik. Vagy úgy, hogy az aktív rész hiányzik, így a csonka fehérje beépül ugyan a megfelelő

komplexbe, de ott már nem tudja elvégezni a feladatát, ezért befagyasztja az egész komplexet

(Miller and Pearce, 2014).

Egy korai stop kodon kialakulásának számos módja létezik. PTC-t tartalmazó mRNS

átíródhat mutáns génekről, ahol a kódoló régióban pontmutáció, frameshift vagy inzerció miatt

jött létre stop kodon. A transzkripció hibája is vezethet PTC kilakulásához, ahogy az mRNS

érésének hibája is. A monogénesen öröklődő humán betegségek nagyjából harmadát okozza PTC-

t hordozó mRNS (pl. β-thalassemia, retinitis pigmentosa, cisztás fibrózis, stb.). E betegségek

többsége recesszív, mert az NMD ezeket a hibás mRNS-eket felismeri és lebontja (Thein et al.,

1990). Azon hibás mRNS-ek azonban, amiket az NMD valami miatt nem ismer fel, domináns

mutánsként betegséget okozhatnak (Kuzmiak and Maquat, 2006).

A humán alternatív splicing termékek körülbelül harmada tartalmaz korai stop kodont, a

PTC-t hordozó mRNS-ek jelentős része innen származik. Ezen alternatív splicing termékek

többsége feltehetően hibás termék, melyeket az NMD felismer és lebont (Hillman et al., 2004,

Zhang et al., 2009, Lewis et al., 2003).

Az NMD-nek hibaelhárító szerepe mellett fontos feladata van endogén géntermékek

szabályozásában is (Behm-Ansmant et al., 2007b). A pékélesztő, a muslica és a humán gének 4-

10%-ának expressziója emelkedik szignifikánsan a különböző NMD-faktorok hiányában (He et

al., 2003, Mendell et al., 2004, Rehwinkel et al., 2005b, Rehwinkel et al., 2006). Ezen gének

termékeinek egy része direkt NMD célpont, más részük olyan indirekt target, amiket NMD-

regulált faktorok szabályoznak. Pékélesztőben a megváltozott expressziójú mRNS-eknek

nagyjából a fele állhat közvetlen NMD szabályozás alatt (Guan et al., 2006). Az NMD különböző

fajokban gyakran különböző, egymással nem feltétlenül ortológ géntermékeket szabályoz

(Rehwinkel et al., 2005b).

NMD mutáns növényekben a fehérjét kódoló mRNS-ek 2-3%-ának nő szignifikánsan az

expressziós szintje (Kurihara et al., 2009). A. thaliana-ban az mRNS-ek kb. 20%-ának van 300

nukleotidnál hosszabb 3’UTR-je. Ezek az RNS-ek valamilyen fokú NMD-szabályozás alatt

állhatnak (Kerenyi Z. et al., 2008). A növényi NMD egyes splicing faktorokat is közvetlenül

szabályoz, így közvetetten a splicingon áteső mRNS-ek expressziós szintjére is hatással lehet

(Palusa et al., 2007).

12

Intronban gazdag genomja van a gerinceseknek és a növényeknek is. Az előbbieknél, ahol

majdnem az összes génről, és az utóbbiaknál is, ahol a gének nagyjából 40%-áról képződnek

alternatív splicing termékek (Lewis et al., 2003, Filichkin et al., 2010), az NMD hiánya a legtöbb

esetben letális (Medghalchi et al., 2001, McIlwain et al., 2010, Wittkopp et al., 2009, Yoine et al.,

2006b). Ez azért lehetséges, mert az alternatív splicinggal könnyen képződhet korai stop kodon

és/vagy kerülhet a 3'UTR-be intron, így ha az NMD nem működik, sok csonka, köztük sok

domináns-negatív fehérje is képződik. Élesztőben viszont, ahol nincs (illetve alig van) alternatív

splicing, az NMD hiánynak sincs komolyabb, látható tünete (Amrani et al., 2006)

Néhány növényi NMD faktor (UPF1, UPF3, SMG7) hipomorf mutánsai A. thaliana-ban

(upf1-5, upf3-1, smg7-1) pleiotróp fenotípusúak: a fűrészes levelek, az abnormális és késői

virágzás az NMD fontos szerepét mutatja a fejlődés szabályozásában. Az upf1-3 null mutáns

viszont hamar elpusztul. Ezekben az NMD mutáns növényekben azoknak a géneknek az

expressziója is emelkedik, amelyek a szalicilsav indukálta patogén válaszban vesznek részt. Az

említett fenotípusokat valószínűleg az állandóan expresszálódó, patogén válasz útvonalaiban

szerepet játszó fehérjék okozzák: ha elrontották a patogén válasz PAD4/EDS1 útvonalát, az

menekítette a hipomorf és letális fenotípusokat is. A növényi NMD tehát gátolja a növény számára

is veszélyes, a patogén válaszban részt vevő gének kifejeződését, amik így csak a fertőzéskor, a

szükséges helyen és a szükséges időben nyilvánulnak meg (Jeong et al., 2011, Rayson et al., 2012,

Riehs-Kearnan et al., 2012, Yoine et al., 2006a, Yoine et al., 2006b).

4.4.2. Az NMD működése, cisz-elemei és transz-faktorai

Az NMD a transzláció terminációjához kapcsolt, jól ismert folyamat élesztőben, gerinctelenekben

(Drosophila, C. elegans), gerincesekben és – többek között csoportunk munkájának köszönhetően

– már növényekben is. Az eukarióta NMD központi fehérjéi (UPF1, UPF2 és UPF3) konzerváltak

(Hwang and Maquat, 2011). A legkonzerváltabb az UPF1 helikáz, amely az összes eukariótában

nélkülözhetetlen az NMD-hez. Az UPF2 és az UPF3 fehérjék szintén fontos szerepet töltenek be

az NMD-ben. Az UPF2 többek között összekötő szerepet játszik az UPF1 és az UPF3 között, de

bizonyos esetekben élesztőben és állatokban ez a kapcsolat létrejöhet UPF2 nélkül is (Amrani et

al., 2006, Shyu et al., 2008, Takahashi et al., 2008). Az UPF3-ból egy génduplikáció miatt

állatokban kettő van, UPF3a és UPF3b (4. ábra c). Az UPF3a az UPF3b szabályozása alatt áll. Ha

az UPF3b hiányzik, az UPF3a szintje megemelkedik, és – legalábbis részben – átveszi az UPF3b

feladatait. Ugyanakkor az UPF3a is befolyással van az NMD-re: mivel az UPF3b erőteljesebben

tudja aktiválni az NMD-t, az UPF3a kötődése az UPF2-höz gyengíti az NMD hatékonyságát (Chan

13

et al., 2009). A legújabb eredmények szerint az UPF3a hatékony NMD inhibitorként számos

transzkriptumot stabilizál. Az UPF3a hiányos egerekben az NMD "túlműködése" következtében

fejlődési rendellenességek figyelhetők meg, azaz ennek az NMD gátló hatásnak fontos fiziológiai

szerepe van (Shum et al., 2016).

Míg élesztőben csak az UPF1, -2 és -3 faktorok kellenek az NMD-hez, az állati NMD-

ben számos további fehérje is fontos szerepet játszik. Állatoknál az UPF1 egy foszforegulált

fehérje, az SMG1 PIKK kináz (phosphatidylinositol 3-kinase related kinase) foszforilálja

(Yamashita et al., 2001), míg az SMG5, az SMG6 és az SMG7 fehérjék az UPF1

defoszforilációjában vesznek részt (Fukuhara et al., 2005, Unterholzner and Izaurralde, 2004). Az

UPF1, UPF2, UPF3 és az SMG7 fő faktorok a növényi NMD-ben is létfontosságúak (Kerenyi Z.

et al., 2008).

Az NMD transz faktorai a cisz elemek alapján tudják megkülönböztetni a PTC-t a normál,

vad típusú stop kodontól. NMD cisz elemet nem tartalmazó mRNS transzlációjának

terminációjakor az eRF1-eRF3 fehérje komplex kapcsolódik a riboszómához. Az eRF3 az mRNS

3’ végi poly(A)-farkát kötő PABP-vel interaktál, így a termináció gyors lesz és hatékony. Az

újonnan szintetizált fehérje, a terminációs komplex, és a riboszóma pedig le tud válni a stabil

mRNS-ről. Egy korai stop kodon ezt a gyors és hatékony terminációt akadályozza meg.

Élesztőben, gerinctelenekben (Drosophila, C. elegans) és növényekben a szokatlanul hosszú

3’UTR jelöli meg koraiként a stop kodont az NMD számára (Amrani et al., 2004, Kertesz et al.,

2006, Longman et al., 2007). Gerinceseknél az NMD azokat az mRNS-eket támadja, ahol a

3’UTR-ben a stop kodontól legalább 50 nukleotidra intron van, mégpedig az exon junction

complex (EJC) segítségével (Chang et al., 2007, Nagy and Maquat, 1998). Növényekben meglepő

módon hatékonyan működik a hosszú 3’UTR alapú és az intron alapú NMD is (Kerenyi Z. et al.,

2008, Kertesz et al., 2006).

Az NMD-nek két szakasza van. A korai szakaszban történik a transzláció terminációja,

ekkor ismeri fel az UPF1 a korai stop kodonokat. Az UPF1 köti az UPF2-t és az UPF3-at,

kialakítva így egy funkcionális NMD komplexet a hibás mRNS-en. Az NMD késői szakaszában

történik a hibás mRNS lebontása. Az NMD komplex összeszerelődése után az mRNS degradációs

rendszerek felgyorsítják vagy megkerülik a deadenilációt, és gyorsan lebontják a PTC tartalmú

mRNS-t (Isken and Maquat, 2008, Muhlemann et al., 2008).

14

4.4.3. Az NMD korai szakasza

Az NMD korai szakasza két elemre bontható: (i) az UPF1 kapcsolódása a terminálódó

riboszómához (marking), (ii) az UPF1, -2 és -3 fehérjék alkotta NMD komplex kialakulása. Azok

az elemek, amelyek az UPF1 kapcsolódását vagy az NMD komplex kialakulását elősegítik,

felgyorsítják az NMD-t.

AZ UPF1 akkor tud kapcsolódni a terminálódó riboszómához, ha a transzláció befejező

lépése lassú. Ennek oka lehet a terminációt serkentő 3’UTR faktorok hiánya, vagy a terminációt

gátló 3’UTR faktorok jelenléte.

A PABP egy pozitív jelmolekula a transzláció terminációja során: ha kapcsolódni tud

hozzá az eRF3, akkor a termináció gyors, az mRNS pedig stabil marad (2. ábra a). (Amrani et al.,

2004).

A Hrp1p, ami egy, az élesztő DSE-jéhez (downstream sequence element) kapcsolódó

fehérje, valamint az emlősökben és növényekben megtalálható EJC negatív szignálként

funkcionálnak. A DSE az élesztő több génjében is megtalálható motívum. Ha egy DSE elé korai

stop kodon kerül, a DSE növeli a marking valószínűségét azáltal, hogy a hozzá kötődő Hrp1p az

UPF1-gyel is interaktál (Gonzalez et al., 2000, Ruiz-Echevarria et al., 1998). Az élesztő és

gerinctelen UPF1 önmagában kötődik az eRF3-hoz, emlősökben a SURF-komplex (SMG1-

komplex, UPF1, eRF1, eRF3) részeként. Az UPF1 kötődés önmagában nem vált ki NMD-t, ahhoz

szükség van a funkcionális UPF1-UPF2-UPF3 NMD-komplex kialakulására is, ami az emlős

NMD sebességmegszabó lépése. Az EJC-hez az UPF2 és az UPF3 kötődik, így egy EJC jelenléte

a 3’UTR-ben jelentősen felgyorsítja az NMD-komplex felépülésének sebességét, ezáltal pedig

hatékonyabbá teszi az NMD-t (Muhlemann et al., 2008, Kashima et al., 2006, Yamashita et al.,

2009).

Korábban azt feltételezték, hogy az UPF1-et a termináló riboszóma köti az eRF1-en és

eRF3-on keresztül (Kashima et al., 2006). Azonban kiderült, hogy az UPF1 közvetlenül is tud

kötődni - főleg splicingon átesett - transzkriptumokhoz, függetlenül attól, hogy azok NMD-

targetek vagy sem. E modell szerint az UPF1 leginkább a 3’UTR-ben van jelen, mivel az 5’UTR-

ről és a kódoló régióról a szkenelő majd transzláló riboszóma lelöki (Hurt et al., 2013, Kurosaki

and Maquat, 2013, Zund et al., 2013).

Emlősökben az NMD az első (pioneer) transzlációhoz kötött folyamat. Az mRNS 5'-végi

sapkájához kötődő egyik fehérje (a CBP80 - cap binding protein 80) segít a SURF-komplexnek

bekötődni a termináló riboszómához, valamint felgyorsítja az NMD-komplex kialakulását is. Az

15

első transzláció után a CBC20/80 komplexet leváltó eIF4F-komplex ezt a feladatot már nem látja

el, így a korai stop kodonnal rendelkező mRNS-eket ezután az NMD már nem tudja támadni

(Hwang et al., 2010). A. thaliana-ban CBP20- és CBP80-hiányos mutánsokban is van NMD, ami

arra utal, hogy növényekben az NMD minden egyes transzlációnál elvégzi minőségbiztosítási

feladatát (Dzikiewicz-Krawczyk et al., 2008).

4.4.3.1. A hosszú 3'UTR alapú NMD

A PTC azonosításának ez a módja főként azokban a fajokban játszik szerepet,

amelyeknek genomjában kevés az intron, így az mRNS-eken a legtöbb korai stop kodon után

intron kivágódási hely sem található (Gatfield et al., 2003). Ezek elsősorban a gerinctelenek.

Gerincesekben is előfordul ugyan, de ott sokkal kisebb a jelentősége. Ez az NMD rendszer a

szokatlanul hosszú 3’UTR-t tartalmazó mRNS-eket ismeri föl, és azonosítja koraiként a stop

kodonjukat. Ez úgy történik, hogy ha a termináló riboszómához kötődő eRF3 túl messze van a

PABP-től, az lelassítja a terminációt, és mivel a két fehérje nem, vagy csak nehezen tud

kapcsolódni, az UPF1-nek van ideje az eRF3-hoz kötődni. A stop kodon így PTC-ként lesz

megjelölve (marking) (Amrani et al., 2004, Behm-Ansmant et al., 2007a, Singh et al., 2008). A

PABP-n kívül minden bizonnyal léteznek más pozitív 3'UTR szignálok is, mivel élesztőben a nem

poliadenilált, és így PABP által nem kötött mRNS-eken is megkülönbözteti az NMD a korai stop

kodonokat a normál stop kodontól (Meaux et al., 2008). E modell szerint a transzláció

terminációjának hatékonysága szabja meg, hogy az adott mRNS-t támadja-e az NMD (Amrani et

al., 2004, Muhlemann, 2008). A lassú (és immár hibás) termináció után az eRF3-hoz kötődött

UPF1-hez az UPF2 és az UPF3 kapcsolódik. Az NMD-komplex összeszerelődése az mRNS

lebontását indukálja és egyúttal a riboszóma is kiszabadul az mRNP-ből. Az UPF1 és a PABP

végső soron versenyeznek az eRF3-ért, vagyis minél messzebb van a PABP a termináló

riboszómától, annál gyorsabban tud kialakulni az NMD komplex (2. ábra b). Egy-egy

organizmusban a 3’UTR régiók hossza viszonylag szűk határok között mozog, így a normális

hossztól való eltérés korai stop kodont jelölhet (Behm-Ansmant et al., 2007a, Longman et al.,

2007, Singh et al., 2008).

A starthoz túl közeli korai stop kodonok nem indukálnak hatékony NMD-t (Inacio et al.,

2004, Silva et al., 2006, Singh et al., 2008, Iwakawa et al., 2012). Ennek az mRNS cirkuláris

szerkezete lehet az oka. Rövid open reading frame-ek (ORF) transzlációjakor megesik, hogy az

iniciációs-komplex (eIF4F-komplex), amihez egy ideig még kötve marad a PABP, még nem

16

2. ábra. A hosszú 3'UTR alapú NMD modellje.

(a) A vad típusú, PTC-t nem tartalmazó mRNS transzlációjának terminációja - az eRF fehérjék és a PABP

interakciója miatt - gyors. (b) A túl hosszú 3’ UTR miatt a transzláció lelassul, így a termináció hibás. A

riboszómán kialakul a SURF komplex (SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3), majd az UPF2 és UPF3 kötődésével

az NMD komplex, ami az mRNS gyors lebomlását idézi elő. (Mérai Zsuzsanna rajza, módosításokkal.)

disszociált, amikor a riboszóma már a stop kodonhoz ért. Ekkor a PABP elég közel van a korai

stop kodonhoz ahhoz, hogy hatékony legyen a transzláció terminációja. A korai, ám hatékony

transzláció termináció pedig megakadályozza az NMD-komplex összeszerelődését (Silva et al.,

2008). A hosszú 3’UTR alapú NMD során tehát a PABP-eRF3 kapcsolódás kialakulásának

gyorsasága dönti el, hogy az NMD milyen hatékonyan támadja az mRNS-t.

Csoportunk korábban igazolta, hogy Nicotiana benthamiana-ban az NMD annál

hatékonyabban támadta a riporter mRNS-t, minél hosszabb volt a 3’UTR-je (Kertesz et al., 2006).

Az UPF1, UPF2, UPF3 és SMG7 fő NMD faktorok részt vesznek a hosszú 3’UTR-rel rendelkező

növényi mRNS-ek lebontásában (Kerenyi Z. et al., 2008). Növényekben még nem sikerült

kimutatni a PABP-eRF3 közvetlen kapcsolatot, viszont – csakúgy, mint a többi eukariótában – a

PABP-t mesterségesen a 3’UTR-hez kötve növényekben is ki lehetett menteni az mRNS-eket az

NMD alól (Amrani et al., 2004, Behm-Ansmant et al., 2007a, Singh et al., 2008). Ezek alapján –

más eukariótákhoz hasonlóan – növényekben is a stop-PABP távolság dönti el, hogy az adott

mRNS-t támadja-e az NMD.

17

4.4.3.2. Az intron alapú NMD

Mivel az EJC elemei gerincesekben és növényekben konzerváltak, az intron alapú NMD

valószínűleg az eukarióták közös ősében alakult ki, hiszen az ő génjeikben is sok intron volt

(Kerenyi Z. et al., 2008). Ha pedig sok intron van egy génben, akkor egy korai stop kodon után 3’

irányban jó eséllyel lesz legalább egy, s ez alapján a PTC felismerhető. A gerincesek génjeinek

túlnyomó többsége tartalmaz intront, ez pedig jelentős mértékben járulhatott hozzá ahhoz, hogy

náluk az intron alapú NMD lett a fő NMD útvonal (Lynch and Kewalramani, 2003).

Emlősökben azok az mRNS-ek NMD-targetek, amelyek 3’UTR-jukban egy (vagy több)

intront hordoznak, mégpedig a stop kodontól legalább 50 nukleotidra (Nagy and Maquat, 1998).

Az intronkivágódás (splicing) után az exon junction complex (EJC) rakódik az mRNS-re az intron

kivágódásának helyétől upstream 20-25 nukleotidra. Az EJC-t négy fő fehérje alkotja (Y14,

MAGO, eIF4AIII, Barentz), amelyek több, ideiglenesen kapcsolódó fehérjének szolgálnak

kötőhelyül, így az UPF3-nak is (Chang et al., 2007, Le Hir et al., 2000).

Az EJC-UPF3 komplex az mRNS-hez kapcsolódva kerül a citoplazmába. Az UPF2 a perinukleáris

térben kötődik ehhez a komplexhez. A transzláció során a riboszóma le tudja lökni az EJC-UPF3-

UPF2 komplexeket az 5’UTR-ről és a kódoló régióról. A 3’UTR-ben lévőket (ha azok legalább

25 nukleotidra vannak a stoptól) viszont már nem távolítja el, miután megállt a stop kodonnál (3.

ábra a) (Chang et al., 2007, Dostie and Dreyfuss, 2002). Az mRNS-en maradó EJC-k úgy

aktiválják az NMD-t, hogy az EJC-UPF3-UPF2 komplex köti az eRF1-eRF3 komplexhez

kötődött, transzlációs terminációs komplex (SURF) részeként megjelenő UPF1-et, létrehozva a

DECID (decay inducing) komplexet (Gehring et al., 2005) (3. ábra b). Ennek következményeként

az SMG1 kináz foszforilálja az UPF1-et (Kashima et al., 2006). Az SMG5, SMG6 és SMG7 rokon

fehérjék, mindhárom tartalmaz egy-egy 14-3-3 domént. Ennek a segítségével ismerik föl és

kötődnek a foszforilált UPF1-hez. Ez a kötődés végeredményben a transzkriptum lebomlásához

vezet (3. ábra c) (Muhlemann and Lykke-Andersen, 2010,). Emlősökben tehát az intronok a stoptól

legalább 50 nukleotidra downstream okoznak NMD-t, vagyis ezek az intronok pozíciófüggő cisz

elemek. Az intron alapú NMD-ben kulcsszerep jut az EJC-nek.

Élesztőben és gerinctelenekben gyakorlatilag nincs intron alapú NMD, ezért az a

feltételezés alakult ki, hogy az intron alapú NMD a gerincesekben jött létre az evolúció során. E

szerint a modell szerint az alternatív splicing megjelenése és elterjedése tette lehetővé az intron

18

3. ábra. Az emlős intron alapú NMD modellje.

(a) A korai stop kodonnál (PTC) elakadó riboszómához bekötődő eRF1/eRF3 komplexhez kapcsolódó

UPF1 valamint az SMG1C (SMG1/SMG8/SMG9 komplex) kialakítják a SURF komplexet. A 3'UTR-ben

lévő EJC-re még a sejtmagban felrakódik az UPF3, amihez az export során, már a citoplazmában kötődik

az UPF2. (b) Az EJC kötött UPF2 kapcsolódása a SURF komplexhez az UPF1 foszforilációját indukálja.

(c) A foszforilált UPF1-hez az SMG6 és az SMG5/SMG7 heterodimer kötődik, amik az SMG1C

disszociációját és végső soron a PTC-t tartalmazó mRNS gyors degradációját okozzák. Az ábrát Kervestin

és Jacobson összefoglaló munkája alapján, módosításokkal közlöm (Kervestin & Jacobson 2012).

alapú NMD kialakulását majd uralkodóvá válását. Az alternatív splicing egyre összetettebbé

válásával egyre több hibás mRNS keletkezett, melyek korai stop kodont és a 3’UTR-ben intront

hordoztak. Ez egyben a PTC hatékony azonosításával is járt, ami szintén segíthetett abban, hogy

19

az intron alapú NMD dominánssá vált. Kiderült azonban, hogy az intron alapú NMD növényekben

is működik (Kerenyi Z. et al., 2008).

Figyelembe véve, hogy a növényi gének többsége szintén tartalmaz intront (Narsai et al.,

2007), nem is olyan meglepő, hogy a növényekben is elterjedt az intron alapú NMD. Csoportunk

korábbi munkáiból kiderült, hogy növényekben is csak a 3’UTR-ben helyezkedő intronok

indukálhatnak NMD-t, és ezek is csak akkor, ha nincsenek túl közel a stop kodonhoz: 28

nukleotiddal a stop után nem, a stop kodontól 99 nukleotidra igen; hogy a növényi intron alapú

NMD-hez is szükség van az UPF1-re és az UPF2-re, valamint az SMG7-re is; hogy a növényi

UPF1 N- és C-terminális, S/TQ-gazdag régiói részt vesznek az NMD-ben és ezek a régiók

foszforiláltak; valamint az, hogy a gerinces EJC tagjainak, az Y14-nek, a Magoh-nak a homológjai

szükségesek a növényi intron alapú NMD-hez is (Kerenyi Z. et al., 2008, Kertesz et al., 2006,

Merai et al., 2013).

Több, az intron alapú NMD-ről alkotott korábbi elképzelés is változott az utóbbi időben.

D. melanogaster sejtekben a cisz elemektől függően az intron kivágódás után nem mindig rakódik

EJC az mRNS-re, (Sauliere et al., 2010). Hasadó élesztőben (Schizosaccharomyces pombe)

upstream és downstream a stop kodon közeli intronok NMD-t okoznak. Ezt a splicing során

kötődő, nem EJC-komponens fehérjék okozzák (Wen and Brogna, 2010). A transzláció-függő

UPF1-kötődést megkérdőjelezi az a tanulmány, amiben bizonyították, hogy az UPF1

transzlációtól függetlenül is kötődik a 3'UTR-hoz (Hogg and Goff, 2010).

4.4.3.3. Az uORF alapú NMD

Az eukarióta transzláció iniciációjakor a riboszóma kis alegysége megkeresi az mRNS (általában

első) AUG (start) kodonját. A GTP-t és metionin-tRNS-t már korábban megkötött nagy alegység

ezután kötődik a kis alegységhez, kialakul a transzláció iniciációs komplex, majd elkezdődik a

transzláció elongációja.

Az 5’UTR-jükben nyitott leolvasási keretet (upstream open reading frame, uORF)

hordozó mRNS-ek az NMD-targetek harmadik, speciális csoportja (Nyiko et al., 2009, Saul et al.,

2009). Az eukarióta gének 20-30%-ának 5’UTR régiójában található egy vagy több rövid uORF

(Hayden and Jorgensen, 2007, Nyiko et al., 2009). Ezeknek a cisz elemeknek is fontos szerepük

lehet a poszttranszkripciós génexpresszió szabályozásában: a főgén csak akkor transzlálódik, ha a

riboszóma átsiklik az uORF start kodonján (leaky scanning), vagy ha az uORF transzlációja után

a riboszóma kis alegysége ahelyett, hogy leválna, tovább pásztázza az mRNS-t, majd a főgén

20

startjánál ismét transzlálni kezd (reiniciáció). Az uORF start kodonja körüli szekvencia határozza

meg a leaky scanning hatékonyságát (Suzuki et al., 2000), az uORF kódoló szakaszának és az

intercisztronikus régiónak a hossza pedig a reiniciációét. Az intercisztronikus régió az uORF

stopjától a főgén startjáig tart (Kozak, 2001). Az uORF stop körüli régiója szekvenciától függően

segítheti vagy gátolhatja, a hosszabb uORF gátolja, míg a hosszabb intercisztronikus régió segíti

a reiniciációt (Grant and Hinnebusch, 1994, Rajkowitsch et al., 2004, Sachs and Geballe, 2006).

Emlősökben és növényekben egyes konzervált uORF-ekről termelődő fehérjék transz

faktorként is tudják gátolni a főgén transzlációját, gyakran olyan génekét, amelyek túlzott

kifejeződése elrákosodásához vezetne (Iacono et al., 2005, Mehta et al., 2006, Tabuchi et al.,

2006).

Az uORF-eknek növényekben is fontos szabályozó szerepük lehet, hiszen a növényi

gének körülbelül 20%-a tartalmaz uORF-et. Konzervált uORF-eket elsősorban transzkripciós

faktorok, transzlációban részt vevő fehérjék és jelátviteli útvonalak fő összetevőinek génjében

találunk (Kochetov et al., 2002, Hayden and Jorgensen, 2007).

Az uORF stopja igen messze van az mRNS poliA-farkától, mert a kódoló régió és a

3'UTR is közéjük ékelődik, ráadásul jó eséllyel intron is található bennük. Ez pedig azt jelenti,

hogy mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD-nek célpontjai lehetnek ezek az

mRNS-ek. Az emlős uORF-ek így az mRNS NMD általi lebomlását okozhatják (Mendell et al.,

2004). Bár a növényi gének kb. 20%-ában van uORF, az NMD mutáns A. thaliana vonalakban

(upf1-5, upf3-1) mégis csak a gének kb. 2%-ának nő az expressziója. A megnövekedett

expressziójú géneknek viszont már 15%-a hordoz uORF-et. Hogy egy uORF okoz-e NMD-t, az a

méretétől függ, a túl rövid ORF-ek itt is hatékonyan terminálódnak. Olyan uORF, ami kedvező

pozícióban van és elég hosszú is, csak a gének kb. 2%-ában van (Kochetov et al., 2002, Hayden

and Jorgensen, 2007, Kurihara et al., 2009, Nyiko et al., 2009).

4.4.4. Az UPF1 foszforilációs ciklusa

Az UPF1 a központi NMD faktor, szerepe van az NMD minden döntő lépésében, és

létfontosságú az NMD-hez minden vizsgált organizmusban (Avery et al., 2011, Leeds et al., 1991,

Medghalchi et al., 2001, Riehs-Kearnan et al., 2012, Wittkopp et al., 2009). A nagyméretű UPF1

fehérjének (élesztőben 109 kDa, emberben 130 kDa, A. thaliana-ban 137 kDa) két fő doménje

van, egy ciszteinben és hisztidinben gazdag domén (CH-domén) közel az N-terminális véghez, és

tőle downstream irányban egy helikáz domén (Leeds et al., 1992, Altamura et al., 1992). Mindkettő

21

elengedhetetlenül fontos az NMD-hez (4. ábra a) (Bhattacharya et al., 2000, Sun et al., 1998, Weng

et al., 1996b, Weng et al., 1996a). A CH domén a helikáz domén szabályozásában vesz részt,

valamint kötőhelyül szolgál az UPF2 számára. A helikáz domén az mRNP remodelingben is részt

vesz (Fatscher et al., 2015).

Az élesztővel ellentétben az emlős UPF1 egy foszfoprotein, melynek foszforilációs

ciklusát az SMG faktorok: az SMG1, az SMG5, az SMG6, az SMG7, az SMG8 és az SMG9

szabályozzák (6. ábra). Állatokban a helikáz doménhez tud kötődni az SMG1, ami a rendezetlen

szerkezetű N-terminális és C-terminális régiót foszforilálja. Az N-terminális régió az SMG6-nak,

míg a C-terminális régió az SMG5/7 komplexnek szolgál kötőhelyül. A PNRC2 mind az N-, mind

a C-terminális régióhoz kötődhet (4. ábra a) (Fatscher et al., 2015). Növényeknél munkám

kezdetekor ezek közül csak az SMG7 volt ismert (Grimson et al., 2004, Ohnishi et al., 2003,

Yamashita et al., 2009, Yamashita et al., 2001, Kerenyi Z. et al., 2008).

Emlősökben a pioneer transzláció során, ha a transzláció terminációs kodon 5' irányban

van egy EJC-től vagy a 3'UTR szokatlanul hosszú, az SMG1 kináz komplex (SMG1C:

SMG1/SMG8/SMG9), az UPF1 helikáz és az eRF1 és eRF3 transzláció terminációs faktorok - a

CBC-t és PABC1-et tartalmazó - mRNP-hez kötődve kialakítják az SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3

(SURF) komplexet (6. ábra b) (Kashima et al., 2006, Yamashita et al., 2009). Ebben a komplexben

a 410 kDa-os SMG1 a PIKK-doménjével kapcsolódik az UPF1 helikáz doménjéhez (4. ábra a, 5.

ábra a) (Clerici et al., 2014, Melero et al., 2014). Az eRF1 és eRF3 az UPF1 CH doménjéhez

kötődik. A CH domén pedig a helikáz doménhez kötődve gátolja annak aktivitását (4. ábra a)

(Ivanov et al., 2008, Wang et al., 2001, Czaplinski et al., 1998). A SURF-komplex

összeszerelődését a riboszómán egy, az UPF1 és a CBC80 közötti ideiglenes interakció is segíti

(Hosoda et al., 2005, Hwang et al., 2010). Az SMG1 a HEAT doménjéhez kötődő SMG8 és SMG9

(5. ábra a) gátlása alatt áll, hogy az UPF1-en nem kívánt foszforiláció ne történjen. Ezen kívül az

SMG8 az SMG1C SURF komplexbe kapcsolódásához is szükséges (Arias-Palomo et al., 2011,

Yamashita et al., 2009, Fernandez et al., 2011). A riboszómához kötődő SURF és az UPF2-UPF3-

EJC komplexek együtt alakítják ki az mRNS lebontását indukáló komplexet (decay inducing

complex, DECID) (6. ábra c) (Kashima et al., 2006, Yamashita et al., 2009). Ha a SURF

komplexhez kapcsolódni tud az EJC-kötött UPF2, az az UPF3-mal együtt a CH doménhez kötődve

egyrészt konformáció változást okoz az UPF1-en, ezáltal pedig az UPF1 helikáz funkcióját

aktiválja (4. ábra a, b, c) (Chakrabarti et al., 2011, Chamieh et al., 2008). Másrészt pedig az UPF1

foszforilációját indukálja (Pal et al., 2001, Schell et al., 2003, Kashima et al., 2006), ez pedig az

eRF1 és eRF3 disszociációjához vezet (6. ábra b, c) (Ohnishi et al., 2003). Az UPF1 foszforilációja

22

4. ábra. Az NMD fő faktorainak domén szerkezete.

(a) Az UPF1 sematikus domén szerkezete, az egyes domének feladata, a rajtuk található azonosított

kötőhelyek, és S/TQ foszforilációs motívumok. (b) Az UPF2 domén szerkezete és kötőhelyei. (c) Az UPF3

fehérjék domén szerkezete és kötőhelyeik. Az ábrát Fatscher és munkatársai összefoglaló munkája alapján,

módosításokkal közlöm (Fatscher et al., 2015).

23

mellett annak ATPáz/helikáz aktivitása is szükséges az NMD-hez, de a két funkció egymástól

független (Kashima et al., 2006, Franks et al., 2010, Isken and Maquat, 2008, Page et al., 1999).

Emlősökben az UPF1 N- és C-terminális régiójában lévő S/TQ motívumokat az SMG1

PIKK kináz UPF2-függően foszforilálja (4. ábra a, 5. ábra a; 6. ábra c, 1. szövegdoboz) (Denning

et al., 2001, Grimson et al., 2004, Page et al., 1999, Yamashita et al., 2001). Az SMG1 C-terminális

régiójának interakciója az UPF2-vel (4. ábra b, 5. ábra a) feltehetően indukálja az SMG8

disszociációját. Ezzel kiszabadítja a gátlás alól az SMG1-et, ami legalább négy S/TQ helyet

foszforilál az UPF1 fehérjén (T28, S1078, S1096 és S1116) (4. ábra a, 6. ábra c) (Matsuoka et al.,

2007, Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012, Yamashita et al., 2001). Az UPF2

fontossága mellett kimutatták azt is, hogy az NMD-target mRNS-ek egy része lebomlik UPF2

illetve UPF3a és UPF3b hiányos sejtekben is (Gehring et al., 2005, Gehring et al., 2003, Ivanov et

al., 2008, Chan et al., 2007). Ezek alapján elképzelhető, hogy az SMG1 aktiválására, és így az

UPF1 foszforilálciójára léteznek eddig még nem ismert, alternatív útvonalak is.

Az SMG5, SMG6 és SMG7 konzervált, rokon fehérjék, egy-egy 14-3-3-szerű

foszfoszerin kötő doménnel (5. ábra b, c, d), és mindhárman részt vesznek az NMD-ben (Anders

et al., 2003, Gatfield et al., 2003). A 14-3-3 fehérjék számos, eukarióta sejtben zajló folyamat

szabályozásában vesznek részt, mégpedig úgy, hogy interakciós partnerük foszforilált motívumait

ismerik föl (Sluchanko and Gusev, 2016). Az SMG5, SMG6 és SMG7 is ennek a 14-3-3 doménnek

a segítségével ismerik föl és kötődnek a foszforilált UPF1-hez. Az UPF1 N-terminális régiójában

a foszforilált T28-hoz az SMG6, míg a C-terminális S/TQ-gazdag régiójában a foszforilált S1096-

hoz az SMG5/SMG7 heterodimer kapcsolódik (4. ábra a, 5. ábra b, c, d; 6. ábra d) (Okada-

Katsuhata et al., 2012). A foszforilált UPF1-hez az SMG6 és az SMG5/SMG7 komplexek

egyszerre is tudnak kötődni. Az SMG5 és SMG7 faktorok heterodimert alkotva kötődnek a foszfo-

UPF1 C-terminális régiójában lévő S1096 foszfoszerinhez, majd deadenilációt és decappinget

okoznak (Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012, Yamashita et al., 2005). Az SMG6

leginkább az N-terminális régióban a foszforilált T28-hoz kötődik, és endonukleáz aktivitásával a

PTC közelében hasítja az mRNS-t (Eberle et al., 2009, Huntzinger et al., 2008, Okada-Katsuhata

et al., 2012). A humán PNRC2 heterodimert képez az SMG5-tel, és NR (nuclear receptor) boxán

keresztül az UPF1 C-terminálisán foszforilált S1073-hoz és S1078-hoz kötődve (6. ábra d; 4. ábra

a, 5. ábra e) deadenilációtól független decappinget indukál (Cho et al., 2012, Cho et al., 2009, Cho

et al., 2013, Lai et al., 2012). Az SMG5, az SMG6 és az SMG7 irányítja a defoszforilációt, aminek

következtében az UPF2, az UPF3 és az SMG1 disszociál. Az SMG5/SMG7 heterodimer a

tényleges defoszforilációt végző PP2A-t (protein phosphatase 2A) köti (5. ábra b, d, 6. ábra d). Az

24

1. szövegdoboz. Az emlős PIKK kinázok.

SMG6-ról egyelőre nem tudni, hogy közvetlenül köt-e egy foszfatázt, vagy közvetett hatása van

az UPF1 defoszforilációjára (Anders et al., 2003, Cali et al., 1999, Chiu et al., 2003, Fukuhara et

al., 2005, Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012). Egyelőre azt sem lehet tudni, hogy

a PNRC2-nek van-e szerepe (és ha igen, milyen) az UPF1 defoszforilációjában.

Az UPF1 defoszforilációja kiszabadítja az UPF1-et az NMD-komplexből, ami így egy

újabb NMD-ciklusba tud bekapcsolódni (6. ábra a) (Durand et al., 2007, Wilkinson, 2003). Az

UPF1 foszforilációs-defoszforilációs ciklusa az összekötő kapocs az NMD korai és kései lépései

között, ezért létfontosságú az NMD működéséhez (Anders et al., 2003, Durand et al., 2007,

Gatfield et al., 2003, Grimson et al., 2004, Yamashita et al., 2001, Ohnishi et al., 2003). Fentiek

alapján az mRNS degradációnak legalább három különböző, foszfo-UPF1 által indukált útja

lehetséges: SMG6 általi endonukleolitikus hasítás, SMG5/SMG7 által irányított deadeniláció

és/vagy decapping, valamint a PNRC2/SMG5 vezérelte decapping (7. ábra). Az egyelőre nem

ismert, hogy milyen mechanizmusok döntik el, hogy mikor melyik útvonal aktiválódik.

Az emlősöknek jelenleg hat ismert PIKK kinázuk (phosphatidylinositol 3-kinase related kinase)

van. Ezek közül egy (TRRAP) elvesztette kináz aktivitását. A másik öt a célfehérjékben lévő szerin

(Ser, S) és treonin (Thr, T) aminosavak foszforilálásával vesznek részt a jelátviteli folyamatokban.

Emlősökben az öt valóban kináz aktivitással rendelkező PIKK kináz közül négy (ATM, ATR,

DNA-PK és SMG-1) előszeretettel foszforilálja azokat a szerineket és treoninokat, amelyek után

közvetlenül egy glutamin (Gln, Q) van. Ezért ezeket a PIKK kinázokat S/TQ-specifikus kinázoknak

is szokták nevezni. Érdekesség, hogy ezen PIKK kinázok szubsztrát fehérjéi gyakran csoportokba

rendeződött S/TQ helyeket tartalmaznak, melyek közül legalább kettőt foszforilál valamelyik PIKK

kináz. Az ilyen S/TQ gazdag domének különösen a checkpoint és a DNS javító mechanizmusokban

részt vevő fehérjék között gyakoriak (Abraham, 2004). Az ötödik PIKK kináz (mTOR) - a másik

néggyel ellentétben - nem az S/TQ helyeket preferálja, hanem a kissé bonyolultabbnak tűnő

(W/Y)XX(A/P)(G/P)(S/T)*(F/P/L/W/Y/V)H motívumokat (a csillag a foszforilálódó szerint illetve

treonint jelöli) (Hsu et al., 2011). A négy S/TQ-specifikus PIKK kináz a genom és/vagy a

transzkriptom minőségbiztosításában játszik fontos szerepet, míg az mTOR az emlős sejtek

anyagcseréjének egyik központi szabályozója (Abraham, 2004).

25

5. ábra. Az UPF1 foszforilációs ciklusában szerepet játszó NMD faktorok domén szerkezete.

(a) Az SMG1 domén szerkezete és kötőhelyei. (b) Az SMG5 domén szerkezete és kötőhelyei. (c) Az SMG6

domén szerkezete és kötőhelyei. (d) Az SMG7 domén szerkezete és kötőhelyei. (e) A PNRC2 domén

szerkezete és kötőhelyei.

A foszfo-UPF1 interaktál a transzláció iniciációs komplex eIF3a alegységével is, ezáltal

gátolni tudja a transzláció iniciációját is (3. ábra c) (Isken et al., 2008). Ugyanakkor ez a

transzláció-gátlás csak mérsékelt lehet, hiszen SMG5, SMG6 vagy SMG7 hiányos sejtekben a

foszfo-UPF1 mellett a csonka, PTC-t tartalmazó mRNS által kódolt fehérjék is felhalmozódnak

(Page et al., 1999, Paillusson et al., 2005, Pulak and Anderson, 1993).

26

6. ábra. Az UPF1 foszforilációs-defoszforilációs ciklusa.

(a) Az UPF1 az NMD kulcsfaktora. (b) Korai stop kodonon elakadó riboszómán lévő eRF1-gyel, eRF3-

mal, valamint az SMG1C (SMG1/SMG8/SMG9) komplex-szel alakítja ki a SURF komplexet. A SURF

komplexhez pedig kötődni tud intronos NMD esetén az EJC-kötött, hosszú 3'UTR alapú NMD esetén a

feltehetően szabad UPF2/UPF3 komplex, ami a release faktorok disszociációjához vezet, valamint (c)

felszabadítja az SMG1-et az SMG-8 gátlása alól, így az foszforilálni tudja az UPF1 N- és C-terminális

S/TQ helyeit. (d) Ezekhez a foszforilált S/TQ helyekhez tud kapcsolódni az SMG6 (T28), az SMG5/SMG7

heterodimer (S1096), valamint a PNRC2 (S1073, S1078) (a PNRC2 ezen az ábrán nem szerepel; lásd 7.

ábra), elősegítve az SMG1C disszociációját. Az SMG5 köti a PP2A foszfatázt, ami egyrészt a transzkriptum

deadeniláció-függő decappingjét okozza, másrészt defoszforilálja az UPF1-et, ezáltal kiszabadítja az

NMD-komplexből, felhasználhatóvá téve egy újabb ciklus számára. Az SMG6 és a PNRC2 esetében még

nem ismert a defoszforiláció mikéntje. Az ábrát Kervestin és Jacobson összefoglaló munkája alapján,

módosításokkal közlöm (Kervestin & Jacobson 2012).

A növényi UPF1 foszforilációjáról munkám kezdetén igen keveset tudtunk. Csupán annyi

volt ismert, hogy az UPF1, az UPF2, az UPF3 és az SMG7 szükségesek az NMD-hez, valamint

hogy az UPF1 N- és C-terminális régiói funkcionálisan redundánsak (vagyis egyikük a másik

hiányában is elegendő az UPF1 NMD-ben betöltött szerepének végrehajtására), mindkettő részt

vesz az NMD-ben, és mindkét régió foszforilált (Kerenyi Z. et al., 2008, Merai et al., 2013)

27

4.4.5. Az NMD kései lépései

Az NMD korai szakaszában felismert és megjelölt PTC-t tartalmazó mRNS-ek lebontása a kései

szakaszban történik. A korai szakasz folyamatai és az abban részt vevő fehérjék konzerváltak, a

kései szakasz folyamatai és összetevői Drosophilában, emlősökben és növényekben többé-

kevésbé különbözőek.

Élesztőben, ha az NMD-komplex kialakult, az UPF1 deadeniláció-független decappinget

indukál. Ezután az XRN1, egy citoplazmatikus 5'-3' exonukleáz, lebontja az mRNS-t. Olykor,

deadenilációt követően, 3’-5’ irányú exoszomális degradáció is előfordulhat (Cao and Parker,

2003, Mitchell and Tollervey, 2003, Muhlrad and Parker, 1994). Az élesztő NMD targetek 5’-3’

irányú lebontása a még transzlálódó mRNS-eken is megkezdődhet (Hu et al., 2010, Hu et al.,

2009).

D. melanogasterben nincs SMG7, az SMG6 pedig a foszforilált UPF1-hez kötődve

endonukleolízissel vágja a hibásként felismert mRNS-t. Az 5' vágásterméket az exoszóma, a 3'

vágásterméket pedig az XRN1 bontja le (Eberle et al., 2009, Huntzinger et al., 2008, Rebbapragada

and Lykke-Andersen, 2009).

Emlősökben az UPF1-et az SMG1 PIKK-kináz foszforilálja, mégpedig az N-terminális

régiójában a konzervált treonin (T28), és a C-terminálisán régiójában konzervált szerin (S1096)

aminosavakat (Denning et al., 2001, Grimson et al., 2004, Yamashita et al., 2001). A foszforilált

UPF1 három, különböző lebontási útvonalat is beindíthat.

Az SMG6 az N-terminális 14-3-3 doménjével kötődik az UPF1 N-terminális

foszfotreoninjához (T28) (4. ábra a, 5. ábra c; 7. ábra a), majd a C-terminális PIN doménjével az

mRNS-t a korai stop közelében endonukleolitikusan elvágja (7. ábra b). Az így keletkezett 3’-végű

vágásterméket az exoszóma, az 5’-végű vágásterméket az XRN1 bontja le (Eberle et al., 2009,

Okada-Katsuhata et al., 2012). Az SMG6 foszforilációtól függetlenül is képes a helikáz doménhez

kötődni (Chakrabarti et al., 2014, Nicholson et al., 2014). Ráadásul az SMG6 N-terminális részén

két EBM (exon junction complex binding motif) is van, amik az UPF3b-hez hasonlóan az EJC-

hez kötődésért felel. Korábban azt gondolták, hogy ezek a motívumok szükségesek az NMD-hez,

de kiderült, hogy az endonukleolitikus hasításhoz nélkülözhetők (Kashima et al., 2010, Boehm et

al., 2014). Az eddigi eredmények alapján úgy tűnik, hogy az SMG6-nak legalább három

különböző útvonala létezik: (1) EJC-kapcsolódás az EBM-eken keresztül, (2) foszforiláltsági

állapottól független kötődés az UPF1 különböző régióihoz, (3) foszfo-specifikus kötődés az UPF1

N-terminális régiójához (T28) a 14-3-3 doménnel (Fatscher et al., 2015).

28

Az SMG7 az UPF1 C-terminális foszfoszerinjéhez szintén a 14-3-3 foszfoszerin kötő N-

terminális doménjével kötődik. A DCP2- és XRN1-függő gyors mRNS lebomlásért a C-terminális

régiója felel (4. ábra a, 5. ábra d; 7. ábra a, b). Az SMG7 kötődés az NMD kései, irreverzibilis

lépése (Fukuhara et al., 2005, Okada-Katsuhata et al., 2012, Unterholzner and Izaurralde, 2004).

Az SMG5/SMG7 komplex nélkülözhetetlen a riboszóma, az eRF1 és az eRF3, valamint az UPF2

és az EJC disszociációjához az UPF1-ről (Okada-Katsuhata et al., 2012). Az SMG5 PIN-

doménjének aktív centrumában két aminosav csere történt, ezért elvesztette endonukleáz

aktivitását, de kötni tudja a PP2A-t (5. ábra b, 7. ábra c) (Glavan et al., 2006, Ohnishi et al., 2003),

ami defoszforilálja az UPF1-et. A defoszforilált UPF1 felszabadul, és így reciklizálódva részt

vehet egy újabb NMD ciklusban (6. ábra d, a; 7. ábra c) (Wilkinson, 2003). Az SMG7 vezérelte

lebomlás első lépése a gyors deadeniláció a CCR4-NOT útvonalon keresztül, ami végső soron a

folyamatban nélkülözhetetlen decappinghez, és az azt követő XRN1 általi mRNS degradációhoz

vezet (Loh et al., 2013). Az NMD-hez szükség van mind a Pan, mind a CCR deadenilációs

komplexekre, mert a P-testekbe (lásd később) csak deadeniált mRNS-ek kerülnek be (Shyu et al.,

2008, Zheng et al., 2008). Ez az útvonal azonban akár ki is kerülhető. Bizonyos esetekben,

felgyorsított deadenilációt követően, az emlős NMD-targeteket degradálhatja az exoszóma is 3’-

5’ irányban (Lejeune et al., 2003).

Végül a foszfo-UPF1-et kötheti az SMG5-tel heterodimert képező PNRC2 fehérje is az

NR-boxon keresztül, amely a C-terminális prolin-gazdag régiójával a decapping komplexhez

kapcsolódva okoz deadenilációtól független decappinget, ami az mRNS gyors, XRN1 általi

lebontását eredményezi (4. ábra a, 5. ábra e; 7. ábra b) (Cho et al., 2009, Arribas-Layton et al.,

2013, Cho et al., 2013). Azt egyelőre nem tudjuk, hogy ha a PNRC2 útvonal aktiválódik, akkor

hogyan és mi defoszforilálja az UPF1-et.

A decappinghez és az 5'-3' irányú mRNS-bontáshoz szükséges fehérjék (DCP1, DCP2;

XRN1, XRN4) a P-testekben koncentrálódnak. Ezek a P-testek a citoplazmában vannak, membrán

nem határolja őket, összetevőik folyamatosan, dinamikusan változnak. Itt tárolódnak a transzlációs

gátlás alatt lévő mRNS-ek is az újrafelhasználásig vagy a lebontásig (Brengues et al., 2005, Goeres

et al., 2007, Kulkarni et al., 2010, Weber et al., 2008), köztük NMD-target mRNS-ek is (Durand

et al., 2007, Sheth and Parker, 2006). Több fő NMD faktorról is kimutatták, hogy főként ezekben

a P-testekben találhatóak meg: emberben az SMG5, SMG7, UPF1, UPF2 és UPF3, élesztőben az

SMG5 kivételével ugyanezek (Sheth and Parker, 2006, Unterholzner and Izaurralde, 2004).

29

7. ábra. Az NMD kései lépései: a PTC tartalmú mRNS lebontása.

(a) Az mRNS-bontást indukáló enzimek kötődése a foszfo-UPF1-hez. Az UPF1 foszforilációja után az

SMG6 a foszforilált T28-hoz, az SMG5/SMG7 heterodimer a foszforilált S1096-hoz, a PNRC2 pedig a

foszforilált S1073 és S1078 körüli részhez kötődik. (b) Különböző lebontási útvonalak. A különféle

faktorok különböző lebontási útvonalakat indukálnak. Az SMG6 endonukleolitikusan vágja az mRNS-t a

PTC közelében (piros csillag). Az SMG5/SMG7 heterodimer deadenilációt követően decappinget is

indukál, míg a PNRC2/SMG5 komplex deadenilációtól független decappinget okoz. A poli(A)-faroktól

és/vagy az 5' végi sapkától megfosztott mRNS-t az exoszóma és/vagy az XRN1 exonukleázok bontják. (c)

Az NMD-komplex szétszerelődése. Az NMD-komplex szétszerelődéséhez szükség van az UPF1 helikáz

aktivitására és defoszforilációjára. Az ábrát Schweingruber és munkatársai összefoglaló munkája alapján,

módosítva közlöm (Schweingruber et al., 2013).

30

Emlősökben az SMG7 túlexpressziója az egyébként citoplazmás UPF1-et a P-testekbe

relokalizálja (Unterholzner and Izaurralde, 2004). Az nem egyértelmű, hogy a P-testek a lebomlás

helyei vagy csak a transzlációsan gátolt, illetve degradációra kijelölt mRNS-ek tárhelyei (Eulalio

et al., 2007). Humán és élesztő sejttenyészetekben nincs feltétlenül szükség P-testekre ahhoz, hogy

az NMD targetek lebomoljanak (Decker et al., 2007, Rehwinkel et al., 2005a, Stalder and

Muhlemann, 2009). Ezt támasztja alá az is, hogy élesztőben azokat az mRNS-eket is degradálhatja

az NMD, amelyek még aktívan transzlálódnak, vagyis riboszómák kötődnek hozzájuk, de a P-

testekben nincsenek riboszómák (Hu et al., 2010).

Az SMG faktorok jelenléte állatokban is változhat, még akkor is, ha van UPF1

foszforeguláció. Pl. gerincesekben megvan az SMG5, az SMG6 és az SMG7 is, Drosophilában

nincs SMG7, míg növényekben SMG7-ből kettő is van, viszont nincs SMG5 és SMG6 (Benkovics

et al., 2011, Gatfield et al., 2003, Ohnishi et al., 2003). Növényekben ezen kívül még az SMG8,

SMG9 és PNRC2 faktorokat sem sikerült kimutatni. Az SMG1-et nemrég megtalálták minden

vizsgált növényben, az A. thaliana kivételével (Lloyd and Davies, 2013). Korábban már

bizonyítást nyert, hogy az SMG7 megtalálható növényekben is, és főleg a sejtmagban, valamint a

P-testekben lokalizál. A növényi SMG7 is tartalmaz egy 14-3-3-szerű foszfoszerin-kötő domént.

Ennek a doménnek a konzervált aminosavai feltétlenül szükségesek a növényi NMD-hez, ezért

valószínű, hogy a növényi SMG7 is ezzel doménnel köti a foszfo-UPF1-et (8. ábra). Az SMG7

kötődése az UPF1-en keresztül a PTC-hez feltehetően gyors deadenilációt okoz. A deadenilált

mRNS-eket valószínűleg az exoszóma bontja le, úgy tűnik, hogy ez a fő mRNS lebontási útvonal

a növényi NMD-ben. Olykor azonban egy kerülő útvonal is aktiválódhat, amelyben nincs szükség

az SMG7-re, az UPF1 és az XRN4 ugyanakkor nélkülözhetetlenek. Növényekben nincs SMG6,

és a PTC-tartalmú mRNS-ek endonukleolitikus hasítására sem utal semmilyen jel. Feltehetően a

növényi NMD-ben is fontos szerepet játszik az SMG7 UPF1 defoszforiláló szerepe, de ez még

nem bizonyított (8. ábra) (Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013).

31

8. ábra. A növényi NMD kései lépései.

Növényekben hiányzik az SMG5 és az SMG6 is, így valószínűleg az UPF1 N- és a C-terminális régióinak

foszforilált S/TQ helyeihez egyaránt az SMG7 kötődik, ami az UPF1-gyel együtt feltehetően a PTC

tartalmú mRNS-t is magával viszi a P-testekbe. A deadenilációt és/vagy decappinget követően az exoszóma

és/vagy az XRN1 növényi ortológja, az XRN4 bontják le az mRNS-t.

4.5. A növényi NMD vizsgálatára használt tesztrendszerek

A. thaliana-ban a leghatékonyabb módszer genetikai vizsgálatokra a T-DNS inzerciós

mutagenezis. Sok különböző mutáns hozható így létre, mivel a T-DNS véletlenszerűen épül be a

genomba. Ha a T-DNS egy gén promóterébe vagy kódoló régiójába ékelődik be, akkor jelentős

mértékben csökkenteni tudja az érintett gén működését, legtöbbször null mutációt okoz. Más

növények esetén azonban nem bizonyult sikeres módszernek (Winkler and Feldmann, 1998, Page

and Grossniklaus, 2002). Ha el akarjuk kerülni a rengeteg időt és munkát igénylő stabil,

homozigóta T-DNS mutáns növények használatát (amik aztán lehet, hogy nem is életképesek), a

tranziens génexpressziós rendszerek alkalmazása egyszerűbb és gyorsabb megoldást kínál.

32

4.5.1. Agroinfiltráción alapuló tranziens génexpresszió

Az emlős NMD vizsgálatai során nagyszerűen beváltak a tranziens expressziós módszerek, mert

kiválóan alkalmasak arra, hogy egyszerre több gént működését is megfigyeljük, és ez az NMD

tanulmányozásakor nagy előny. A növényi NMD vizsgálatához kifejlesztett tranziens

génexpressziós rendszer az agroinfiltráción alapuló tranziens NMD tesztrendszer (Kertesz et al.,

2006). A módszer lényege, hogy N. benthamiana növények leveleit agroinfiltráljuk. Riporter

génnek általában a GFP NMD-target illetve nem NMD-target konstrukcióit használjuk, így néhány

nap elteltével már szabad szemmel is könnyen értékelhető és összehasonlítható a riportergének

expressziója, és természetesen mRNS és fehérje szinten is. Ezzel a módszerrel azonosította

csoportunk a növényi NMD cisz elemeit és transz faktorait (Kertesz et al., 2006, Kerenyi Z. et al.,

2008, Nyiko et al., 2009). A rendszer hátránya, hogy a transzgének nem integrálódnak a genomba,

így csak néhány napig, és csak az infiltrált felületen expresszálódnak, a vizsgálatok ezért térben és

időben korlátozottak.

Az UPF1 helikáz doménjének egyik erősen konzervált argininjét ciszteinre cserélve

gombákban és állatokban is domináns-negatív mutációt kapunk: a helikáz aktivitás megszűnik

ugyan, de a fehérje képes beépülni az NMD-komplexbe, ami így szintén működésképtelenné válik

(Sun et al., 1998). A növényi UPF1-ben is megvan ez az arginin, amit ciszteinre cserélve (R863C)

a mutáns változat szintén domináns-negatívként hatva (U1DN) kikapcsolja a növényi NMD-t. Az

NMD rendszer tehát tranziensen kikapcsolható az U1DN együtt infiltrálásával (ko-infiltráció).

Ennek segítségével egy levélen összehasonlíthatóak az NMD tesztkonstrukciók expressziói NMD

hatás alatt és NMD hiányában (Kertesz et al., 2006).

Az agroinfiltrált transzgének expressziója növényekben indukálja az RNS interferenciát,

ami gyorsan lebontja a vad típusú és a korai stop kodont tartalmazó mRNS-eket is. Az együtt

infiltrált, Pothos latent virusból (PoLV) származó P14 silencing szupresszor ezt akadályozza meg

úgy, hogy közben nem befolyásolja az NMD működését (Kertesz et al., 2006, Merai et al., 2005).

Ezért P14 jelenlétében csak azok az mRNS-ek bomlanak le, amelyeket az NMD támadni tud. A

P14 ezen kívül a Northern- és Western-blot kísérletek során belső normalizációs kontrollként is

használható.

33

4.5.2. Agroinfiltráción alapuló VIGS-komplementációs tranziens NMD tesztrendszer

Az RNS interferencia egy nagyon specifikus géncsendesítési rendszer. A növények a

transzopzonok ellenőrzésére és a fejlődési folyamatok szigorú ellenőrzésére használják. Ezek

mellett rendkívül hatékony védekezési rendszer vírusok ellen is. Sok vírusban az evolúció során

kialakultak olyan fehérjék, amelyek e folyamat ellen hatnak. Ezek a fehérjék a silencing

szupresszorok, melyek lehetővé teszik a vírus számára, hogy hatékonyan szaporodjon a

gazdanövényben. Azok a vírusok, amelyeknek nincs ilyen fehérjéjük (vagy csak gyengén, illetve

időben vagy térben korlátozottan aktív), a fertőzés korai szakaszában szisztemikusan gyorsan

terjednek, ám néhány nap elteltével a RNS interferenciának köszönhetően a vírus szint

drasztikusan lecsökken a friss levelekben, majd a növény kigyógyul a fertőzésből (pl. Tobacco

Rattle Virus, TRV). Ha egy növényi gén egy darabját a TRV vírusba klónozzuk, és a növényt ezzel

fertőzzük, az RNS interferencia a vírus mellett támadni fogja azokat az endogén mRNS-eket is,

amelyek erősen homológok a vírusba beépített szekvenciával, vagyis a célgén expresszióját

csökkenti, csendesíti. Ez a leghatékonyabb növényi génexpressziót csökkentő, vagy esetenként

megszüntető rendszer, a vírus által indukált géncsendesítés (Virus Induced Gene Silencing, VIGS).

A VIGS ugyan nem okoz teljes génkiütést, de az általa előidézett fenotípus sokszor megegyezik a

null-mutáns fenotípusával, ami azt bizonyítja, hogy a VIGS rendkívül hatékony módszer

(Valentine et al., 2004, Ratcliff et al., 2001, Velasquez et al., 2009).

Ha N. benthamiana növényeket olyan rekombináns TRV-vírussal fertőzünk, amely

tartalmazza a karotinoid bioszintézisben résztvevő fitoén-deszaturáz (PDS) gén egy darabját, a

fertőzést követő 8-12. napra a felső levelekben a növényi PDS mRNS, és így a fehérje szint

drasztikus csökkenése miatt ezek a levelek kifehérednek. Ha a PDS mellett egy másik, csendesíteni

kívánt gén egy darabját is beépítjük a vírus genomjába, akkor mindkét génre hatni fog a VIGS, és

a PDS csendesedését RNS interferencia riporterként használhatjuk: amikor a felső levelek

fehérednek, a másik gén expressziója is csökken (Kerenyi Z. et al., 2008, Velasquez et al., 2009).

A VIGS-NMD kísérleti rendszer egy, a csoportunk által korábban kifejlesztett és sikerrel

alkalmazott hatékony depléciós-komplementációs rendszer, amely alkalmas a növényi NMD

transz faktorainak gyors azonosítására. Például UPF1 csendesített növényekben az NMD-riporter

GFP konstrukció magas expressziót mutatott. Ha az UPF1-csendesített levelekbe vad típusú

UPF1-et infiltráltak, az infiltrált foltban helyreállt az NMD, az NMD-riporter GFP konstrukció

expressziója alacsony volt. Mindez azt bizonyította, hogy az NMD-hez növényekben is

elengedhetetlen az UPF1. A PDS hiánya nincs hatással az NMD működésére, ezért használhatjuk

negatív kontrollként a csak PDS-csendesített növényeket. Ez a rendszer a megfelelő riporter

34

konstrukciók segítségével alkamas volt annak megállapítására is, hogy a vizsgált NMD faktor a

hosszú 3’UTR alapú vagy az intron alapú NMD útvonalhoz szükséges (Benkovics et al., 2011,

Kerenyi Z. et al., 2008, Merai et al., 2013). Munkám során a növényi NMD fő transz faktorának,

az UPF1-nek a funkcionális térképezésére használtam. A módszer hátránya az, hogy nem okoz

null mutációt, mert ha az akár radikálisan lecsökkent génexpresszió elég ahhoz, hogy a gén ellássa

feladatát, a valódi hatás csak nagyon nehezen vagy egyáltalán nem vizsgálható. Ha azonban a null

mutáció letális, ez már előny lehet.

Felmerül a kérdés, hogy a VIGS növények felülinfiltrálásakor, a vizsgálandó

konstrukciókkal együtt infiltrált P14 nem szünteti-e meg a VIGS-et az infiltrált foltban. A

tapasztalatok szerint nem (Kerenyi Z. et al., 2008, Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013). Ez

azért lehet így, mert a P14 valószínűleg a már kialakult RISC komplexeket nem, csak az újak

kialakulását gátolja.

35

5. ANYAG ÉS MÓDSZER

5.1. Növények

Az agroinfiltráláshoz és VIGS kísérletekhez üvegházban nevelt, 3 hetes, vad típusú N.

benthamiana növényeket használtam. VIGS infiltrálás vagy agroinfiltrálás után a növényeket

növénynevelő kamrában (Sony MLR- 351) tartottam, 24°C-on, hosszú nappalon (16 óra fény/8óra

sötét, 7000 lux).

5.2. Agrobaktérium törzs

A kanamicin rezisztens bináris vektorok agroinfiltrálásához az Agrobacterium tumefaciens

rifampicin és tetraciklin rezisztens C58C1 törzsét használtam. A bináris vektorokat három szülős

keresztezéssel juttattam az agrobaktériumba, a második szülő a bináris vektort eredetileg

tartalmazó E. coli DH5α törzse, a harmadik szülő a pRK Helper plazmidot hordozó szintén E. coli

törzs.

5.3. Expressziós vektorok és NMD tesztkonstrukciók

A vizsgált géneket a pBin61S bináris vektor HA-taggel módosított változatába (BinHASanyi), a

35S promóter és 35S terminátor közé építettem be (Silhavy et al., 2002). A BinP14 (P14) a TRV-

PDS, TRV-PDS-UPF1 vektorok, a BinU1DN (U1DN) NMD konstrukciók valamint a G-95 és G-

95I riportereket munkatársaim már korábban elkészítették és leírták (Kerenyi Z. et al., 2008,

Kertesz et al., 2006).

Az intront tartalmazó 3'UTR-ű GFP riporter konstrukciók (G-30I, G-40I, G-50I, G-60I,

G-70I és G-80I) klónozásához a pFF2R reverse és a 30cF, 40cF, 50cF, 60cF 70cF valamint a 80cF

forward primereket használtam a PCR-hez, templátként a G-95I plazmid szolgált. Restrikciós

endonukleáz (FastDigest, Thermo) emésztés után a fragmenteket BamHI/SalI helyre klónoztam a

pBin-GFP vektorba. A felhasznált primerek szekvenciáját a 2. melléklet tartalmazza.

5.4. PCR-mutagenezis

36

A PCR mutagenezist a „linker scanning mutagenesis” technikával végeztem (Sambrook and

Russell, 2001). Az egyes mutánsokhoz eredeti DNS-ként használt plazmidok és a felhasznált

primerek neveit a 3. melléklet, a primerek szekvenciáját a 2. melléklet tartalmazza. A primerek

neveiben a mutF illetve mutR jelöli a tervezett mutáció helyére a mutációt hordozó, de egyébként

komplementer primereket.

5.5. Agroinfiltrálás

A konstrukciókat tartalmazó agrobaktériumokat 5ml folyékony, szelektív LB táptalajba (25μg/ml

kanamicin, 5μg/ml tetraciklin, 10mM MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] és 20μM

acetosziringon) oltottam le, és éjszakán át 30°C-on növesztettem. A baktériumokat centrifugáltam

(3000g), a csapadékot agrobaktérium visszaoldó folyadékban (10 mM MgCl2, 10 mM MES és

150 μM acetosziringon) szuszpendáltam. Spektrofotométerrel mértem a kultúrák koncentrációját,

majd a kívánt mértékben hígítottam (az infiltráló elegyben a baktérium szuszpenziók végső

koncentrációja P14 esetén OD600=0,2, minden más esetén OD600=0,4). Infiltrálás előtt a baktérium

szuszpenziót 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltam. Az együtt infiltrálandó konstrukciókat egy

elegybe kevertem össze. Az elegyeket vad típusú (3-4 hetes) vagy VIGS-es (4-6 hetes) N.

benthamiana növények 2-2 felsőbb, fiatal leveleinek fonákján (a gázcserenyílásokon keresztül)

fecskendővel (BD Plastic) juttattam be. A növényeket 24°C-on, hosszú nappalon (16 óra fény, 8

óra sötét, 7000 lux), növénynevelő kamrában neveltem tovább. A harmadik napon lefényképeztem

az infiltrált leveleket, majd az infiltrált foltokból RNS-t és/vagy fehérjét vontam ki. A GFP

fluoreszcenciát kézi UV lámpa segítségével (UV Products, Upland) detektáltam és UV szűrőt

használva Nikon D200 digitális fényképezőgéppel dokumentáltam.

5.6. Vírus indukálta géncsendesítés és VIGS-komplementáció

Az UPF1 VIGS-es növények előállításához 3 hetes N. benthamiana növények 2-2 alsóbb levelét

három agrobaktérium kultúra (P14, TRV-RNA1, TRV-RNA2-PDS-UPF1) elegyével infiltráltam

(Ratcliff et al., 2001). A fertőzött növényeket 24°C-on, hosszú nappalon tartottam, majd kb. két

héttel később, mikor az újonnan kihajtó levelek kifehéredtek, a fehéredő friss levelek alatti

leveleket felülinfiltráltam olyan NMD riporter GFP konstrukcióval, melynek hosszú 3'UTR-jében

37

intron is van, így mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD támadja (Gc-I), mely

elegyítve volt P14 RNS interferencia szupresszorral és a vizsgált UPF1 mutáns konstrukciót

expresszáló agrobaktérium kultúrák egyikével (Kerenyi Z. et al., 2008). Az infiltrálás erős RNS

interferenciát vált ki, ami elfedhetné az NMD hatását. Ezt megelőzendő használtam a P14 RNS

interferencia szupresszort, amit aztán belső kontrollként használtam a Northern- és Western-

blotokhoz. Három nappal az infiltrálást követően a növényeket UV fényben vizuálisan értékeltem

és lefényképeztem, majd az infiltrált levélfoltokból RNS-t vontam ki.

5.7. RNS kivonás növényi szövetből

Az RNS-kivonásokat kb. 1 cm2 kiterjedésű infiltrált levélfoltokból végeztem. A levéldarabokat

folyékony nitrogén alatt összetörtem, majd kivonó pufferben (0,1 M glicin, 10 mM EDTA, 0,1 M

NaCl, 2% SDS) elkevertem. Ezután fenol és kloroform segítségével végeztem RNS kivonást a

korábban leírt módon (Szittya et al., 2002).

5.8. Northern-blot

Minden mintából 2 µg RNS-t futtattam agaróz gélben (1,5% agaróz, 0,8% formaldehid, 1x MAE),

MAE pufferben, 80 Volttal, szobahőn {1xMAE puffer összetétele: 20 mM MOPS [3-(N-

morpholino)propanesulfonic acid], 5 mM Na-acetát, 1 mM EDTA pH 7,0}. 20 percnyi 20x SSC-

ben áztatást követően az RNS mintákat kapilláris technikával blottoltam nitrocellulóz membránra

(Hybond-N, GE Healthcare) éjszakán át, 20x SSC-vel (saline-sodium citrate; 3 M nátrium-klorid,

3 mM trinátrium-citrát). Hibridizálás előtt membránokat 5x SSC-ben mostam, megszárítottam, az

RNS-eket UV keresztkötéssel a membránhoz rögzítettem. A hibridizáláshoz a próbát HexaLabel

kittel (Fermentas), α-32P izotóp (dCTP 0,74 MBq, Izotóp Int. Kft.) felhasználásával P14 és GFP

PCR termékről készítettem. A membránt a próbákat tartalmazó Church pufferben (0,5M NaPi, 7%

SDS, 1mM EDTA pH 8,0, 1%BSA,) 65 °C-on, éjszakán át hibridizáltam. Másnap a membránokat

2xSSC, 0,1% SDS oldatban mostam kétszer 15 percig 65 °C-on. A radioaktív jelet BAS Storage

Phosphor Screennel (GE Healthcare) detektáltam, Storm 840 szkennerrel (Amersham

Biosciences) olvastam le, és ImageQuant szoftverrel értékeltem. A GFP jeleket mindig a P14 jelre

normalizáltam.

38

5.9. Fehérje kivonás növényi szövetből

Az infiltrált levélfoltokból (ugyanazokból, melyekből RNS-t is izoláltam) kb. 1 cm2 területű

levéldarabokat folyékony nitrogén alatt eldörzsöltem, majd jéghideg feltáró puffert (25mM Tris

puffer (pH 7,6), 150mM NaCl, 10% glicerol, 2% PVPP, 0,15% Igepal, 5mM DTT, 1% Sigma

Plant Protease Inhibitor Cocktail) adtam hozzá. A mintákhoz 2x Laemmli oldatot (4%SDS, 20%

glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,004% brómfenolkék, 0,125M Tris HCl) adtam, 5 percig

forraltam, majd 5 perc centrifugálás (4°C, 15.000 rpm) után a felülúszót új eppendorf csőbe

pipettáztam és további felhasználásig -70°C-on tároltam.

5.10. Western-blot

A fehérje mintákat SDS poliakrilamid (12%) gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elválasztottam

(Sambrook and Russell, 2001), majd 20% metanolt tartalmazó Tris-glicin pufferben (WTB puffer)

nitrocellulóz membránra (Hybond-C, GE Healthcare) blottoltam (Fastblot B33, Biometra). A

membránt 1 óráig 5%-os tejpor oldatban blokkoltam, majd monoklonális, HRP-konjugált, HA

specifikus ellenanyaggal (anti-HA peroxidase, Roche), illetve poliklonális, nyúlban termeltetett

anti-P14 ellenanyaggal 1 órán át inkubáltam. Jelölés után 1x PBST oldatban 4x10 percig mostam.

Az ECL-kit (ECL+ Western Blotting Reagent, GE Healthcare) segítségével kapott

kemilumineszcens jeleket röntgen filmmel detektáltam.

5.11. Immunprecipitáció (IP)

Az expresszáltatni kívánt UPF1 mutánsokat (P14-gyel együtt) hat-hat, 3 hetes N. benthamiana 2-

2 levelébe agroinfiltráltam, majd három nap múlva leszedtem a leveleket, folyékony nitrogénben

eldörzsöltem és jéghideg IP puffert [25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 10% glicerol, 2%

PVPP, 0,15% Igepal, 5mM DTT, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% plant protease inhibitor (Sigma), 1

tabletta cOmplete Mini (Roche)] (Baumberger and Baulcombe, 2005) adtam hozzá és jégre tettem.

A durva extraktumot centrifugáltam (13400 rpm, 10 perc, 4°C), a felülúszót új csőbe tettem, majd

megismételtem a centrifugálást. 50 μl centrifugált extraktumot áttettem új csőbe, majd 2xLaemli

pufferrel kezeltem: 5 perc forralás után 2 perc jégbehűtés, centrifugálás (13400 rpm, 5 perc, RT).

A felülúszót óvatosan új csőbe tettem. 50 μl HA agaróz gyöngyhöz (Anti-HA Affinity Matrix,

39

Roche) 400 μl IP puffert adtam, centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), és a felülúszót pipettával

óvatosan eltávolítottam. A gyöngyökhöz adtam 175 μl IP puffert és 800 μl mintát, majd 1 órán át

síkrázón (140 rpm) inkubáltam. A csöveket centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), a felülúszót

eltávolítottam. Ezután kétszer mostam az alábbiak szerint: rámértem 800 μl jéghideg IP puffert,

rázattam (120 rpm, 1min, 4°C), centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), és a felülúszót pipettával

óvatosan eltávolítottam. A mosott gyöngyöket 50 μl 2xLaemli-vel kezeltem és az így eluált mintát

új csőbe pipettáztam.

5.12. Foszfofestés

Az expresszáltatott UPF1 mutáns fehérjék foszforiláltsági állapotát megvizsgálandó minden

eluátumot kétfelé osztottam, az egyik részt alkalikus foszfatáz enzimmel (FastAPTM, Fermentas),

a másikat - kontrollként - annak hiányában inkubáltam (1 óra, 37°C). A kezelt és kezeletlen

mintákat SDS-PAGE után ProQ Diamond foszfospecifikus festékkel (ThermoFisher) festettem a

gyártó utasításai szerint, majd PageBlueTM (ThermoFisher) festéssel határoztam meg az egyes

mintákban az összes fehérje mennyiségét, és a foszfofestéssel kapott jelet ehhez normalizáltam.

40

6. EREDMÉNYEK

Munkám során a növényi NMD szabályozásának két fontos elemét vizsgáltam. Az egyik a 3'UTR-

ben helyeződő intronok hatása a növényi NMD hatékonyságára. A másik az UPF1 fehérje

foszforilációjának szerepe az NMD által támadott mRNS-ek lebontásában.

6.1. Növényi mRNS-ek 3’ nem transzlálódó régiójában helyeződő intronok finomtérképezése

Emlősökben a stop kodontól 3' irányban legalább 50 nukleotidra lévő intronok NMD-t indukálnak

(Nagy and Maquat, 1998). Csoportunk korábbi munkájából a növényi intron alapú NMD-ről csak

azt tudtuk, hogy ha az intron 28 nukleotidra van a stop kodontól, az nem okoz NMD-t, viszont ha

99 nukleotidra, az igen (Kertesz et al., 2006). Ezért felmerült a kérdés, hogy a növényekben mi az

a kritikus távolság az intron és a stop kodon között, ami már NMD-t indukál. Tisztázni szerettük

volna azt is, hogy az emlősökéhez hasonlóan egy igen/nem válaszról van-e szó, vagy pedig

növényekben a távolság növekedésével változik az NMD hatékonysága is. Ezen kérdések

megválaszolására hat különböző riporter konstrukciót készítettünk, melyekben a burgonya LS

intront 30, 40, 50, 60, 70, vagy 80 nukleotid távolságra klónoztuk a GFP riporter génünk stop

kodonjától 3’ irányba (G-30I, G-40I, G-50I¸ G-60I, G-70I, G-80I) (9. ábra a). A stop kodontól 95

nukleotid távolságra (G-95I) intront tartalmazó konstrukciót munkatársaim már korábban

elkészítették. A 30cF, 40cF, 50cF, 60cF, 70cF és 80cF forward és a pFF2 rev reverse primerekkel

a G95I plazmid alapján létrehozott PCR termékeket BamHI-SalI helyre építettük be a pBin-GFP

bináris vektorba. A konstrukciókat úgy terveztük, hogy bár az intron távolsága a stop kodontól

változott, a teljes beépített szekvencia hossza minden konstrukció esetén azonos volt.

Konstrukcióinkat N. benthamiana agroinfiltrációs rendszerben teszteltük. Az adott

konstrukció NMD érzékenysége domináns-negatív UPF1-gyel (U1DN) együtt infiltrált mintákhoz

viszonyítva vizsgálható, mivel az U1DN fehérje inaktiválja az NMD-t (lásd 4.5.1. fejezet). Minél

erősebben támadja az NMD az adott riporterkonstrukciót, annál jobban megnövekedik a GFP

expressziója U1DN hatására. Ezért a teszt konstrukciókat önmagukban (kontroll), illetve U1DN-

val együtt egymás mellé infiltráltuk, normalizációs kontrollnak minden esetben a szintén együtt

infiltrált, az RNS interferenciát szupresszáló P14-et használtuk (Merai et al., 2005).

41

9. ábra. Növényekben a stop kodontól downstream több mint 50 nukleotidra helyeződő intronok

NMD-t okoznak.

(a) A felhasznált konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az NMD riporter konstrukciók

transzkriptumként, míg az együtt expresszáltatott konstrukciók fehérjeként szerepelnek az ábrán. A riporter

mRNS-ek 35s 3’UTR-je a 35s terminátor szekvencia 3’UTR-je. (b) Az LS intron a stop kodontól 50

nukleotidnál messzebbre klónozva intron alapú NMD-t indukál. GFP alapú NMD riporter konstrukciókat

(amik 30-95 nukleotid hosszúságú töltelékszekvenciát hordoznak a stop kodon és az LS intron között; G-

30I, G-40I, G-50I, G-60I, G-70I, G-80I és G-95I), valamint egy intront nem tartalmazó kontroll

konstrukciót együtt infiltráltunk P14 silencing szupresszorral (-) vagy P14-gyel és az UPF1 domináns-

negatív mutáns verziójával (U1DN). A P14-et azért infiltráltuk, hogy megakadályozzuk a transzgén által

indukált RNS interferenciát, továbbá belső normalizációs kontrollként használtuk a Northern-blothoz. A

blotokat P14 és GFP próbákkal hibridizáltuk. Az RNS minták mennyiségi meghatározását úgy végeztük,

hogy minden mintában az NMD riporter mRNS GFP próbával adott jelét a neki megfelelő P14 jelhez

normalizáltuk (GFP/P14). Az átlagértékek három független kísérlet eredményeiből származnak. A (-)

mintát egynek vettük, az U1DN-t ehhez viszonyítottuk (a ± a szórást jelzi). Az oszlopdiagram ezeket a

számított értékeket ábrázolja minden konstrukció esetén.

42

A G-30I és G-40I konstrukciók szintje gyakorlatilag megegyezik a kontrollban és az

U1DN-val együtt infiltrált mintákban, jelezve, hogy ezeket a mRNS-eket nem támadja az NMD

(8. ábra b). Ezzel szemben a G-50I¸ G-60I, G-70I, G-80I és G-95I konstrukciók esetében az U1DN

koexpresszált minták a GFP relatív expressziója jóval magasabb. Azaz ezeket a mRNS-eket az

NMD hatékonyan támadja. U1DN nélkül a konstrukciók expressziója a stop kodon és az intron

közötti távolság növekedésével egyre gyengébb, az U1DN expressziót növelő hatása így egyre

erőteljesebb (9. ábra b). Vagyis 50 és 95 nukleotid között az intron és a stop kodon közötti távolság

növekedése fokozatosan erősíti az NMD hatékonyságát. Negatív kontrollnak olyan konstrukciót

használtunk, melynek 95 nukleotid hosszú 3’UTR-je van, viszont intront nem tartalmaz (G-95, 9.

ábra a). U1DN-val együtt infiltrálva nem változott az expressziója (8. ábra b), vagyis nem támadja

az NMD. Ez pedig azt mutatja, hogy riporter-konstrukcióinkat pusztán a hossza miatt nem támadja

az NMD. Fentieket egybevetve megállapíthatjuk, hogy növényekben a 3’UTR-ben lévő intronok

pozíciója döntően befolyásolja az mRNS NMD érzékenységét, hiszen (1) csak a stop kodontól

legalább 50 nukleotidra helyeződő intronok indukálnak NMD-t; és (2) minél messzebb van a

3’UTR intron a stop kodontól, annál erősebben hat az NMD.

6.2. A növényi UPF1 foszforegulációja

Az UPF1 fehérje egy-egy konzervált cisztein- és hisztidin-gazdag régiót (CH domén) és ATP-

áz/helikáz domént, valamint egy többé-kevésbé konzervált N-terminális és egy kevésbé konzervált

C-terminális, S/TQ foszfohelyekben gazdag régiót tartalmaz (4. ábra a; 10. ábra). Ezek az S/TQ

helyek a PIKK-kinázok lehetséges célpontjai. Csoportunk korábban megmutatta, hogy

növényekben az N- és C-terminális régiók az NMD szempontjából funkcionálisan redundánsak,

de legalább az egyikre szükség van. Ha mind az N-, mind a C-terminális régió hiányzik (ΔNΔC),

a csonka UPF1 nem képes ellátni a feladatát, ha viszont csak a C- (U1ΔC) vagy csak az N-

terminális (U1ΔN) régió hiányzik, akkor ez az egyik oldalról csonka UPF1 már képes

komplementálni az UPF1-csendesített növényeket. Szintén csoportunk korábbi munkájából

tudjuk, hogy az N- és a C-terminális régió is foszforilált (Merai et al., 2013). Azonban az, hogy

Az UPF1 N- és C- terminális régióiban mely aminosavak foszforiláltak, és hogy ez a foszforiláció

kell-e a növényi NMD-hez, nem volt ismert.

43

10. ábra. Az A. thaliana UPF1 szerkezete.

(a) Az A. thaliana UPF1 sematikus domén szerkezete. Az S/TQ helyeket piros vonal jelzi. (b) Az A.

thaliana UPF1 szekvenciája. Az S/TQ helyek pirossal szedve. A két részre osztott N-terminális régió Nn

része feketével, az Nc része kékkel van aláhúzva, a négy részre osztott C-terminális régióban a C1 rész

szürkével, a C2 rész sárgával, a C3 rész narancssárgával, míg a C4 rész rózsaszínnel van aláhúzva. A

csillagok azon NMD-releváns S/TQ helyeket jelzik, amiket NMD-komplementációs kísérletekben

azonosítottunk. Az MS-analízis által azonosított foszforilációs helyeket a fekete téglalapok jelzik. A szürke

téglalapok a foszforilált szerineket jelölik. Megemlítendő, hogy a C-terminális régió C2, C3 és C4 részében

lévő S/TQ helyek esetleges szerepét az NMD-ben nem vizsgáltuk, ahogy foszforiláltsági állapotukat sem.

6.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának S/TQ potenciális foszfohelyei részt vesznek az NMD-ben

Hogy megvizsgáljuk és megértsük az UPF1 N-terminális régiója foszforilációjának szerepét az

NMD-ben, az A. thaliana UPF1-ben az N-terminális potenciális S/TQ foszfohelyeket rontottuk

vagy távolítottuk el. Ehhez különféle deléciós és pontmutánsokat, illetve ezek kombinációit hoztuk

létre, majd ezek aktivitását a munkatársaim által korábban már eredményesen alkalmazott VIGS-

komplementációs rendszerben vizsgáltuk (lásd 4.5.2. fejezet). Mivel az N- és C-terminális régiók

csupán egyikének jelenléte is elegendő a hatékony NMD-hez, az N-terminális régiót olyan mutáns

44

fehérjében teszteltük, amelyikből hiányzott a C-terminális rész (U1ΔC). VIGS segítségével UPF1-

csendesített N. benthamiana növényeket hoztunk létre. Ezek szisztemikus leveleibe együtt

infiltráltuk az NMD riporter GFP konstrukciónkat (Gc-I) - melynek 3'UTR-je 200 nt hosszú volt

és egy intront is tartalmazott, ezért mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD

felismeri és lebontja -, valamint az UPF1 különböző N-terminális mutánsait (11. ábra). Pozitív

kontrollként U1ΔC-t infiltráltunk együtt a Gc-I-vel. Minthogy az NMD az UPF1-csendesített

növényekben nem működik, ha a Gc-I-t önmagában, vagy egy funkcióját betölteni képtelen UPF1

mutánssal (ami így komplementálni sem tudja az UPF1 hiányát) együtt infiltráljuk, akkor a Gc-I

mRNS expressziós szintje magas lesz és erős zöld fluoreszcenciát látunk. Ha viszont a Gc-I-t egy

működőképes UPF1 mutánssal infiltráljuk együtt, akkor az komplementálja az UPF1 hiányát, és

az NMD hatékonyan tudja támadni az Gc-I mRNS-t. Következésképpen a Gc-I mRNS

expressziója alacsony lesz és gyenge zöld fluoreszcenciát látunk (11. ábra). Minden mintával

együtt infiltráltuk a P14 silencing szupresszort, hogy megakadályozzuk az agroinfiltráció által

indukált RNS interferenciát. A P14-et belső kontrollként is használtuk a Northern- és Western-

blot kísérletekben.

11. ábra. UPF1-VIGS N. benthamiana növények leveleinek infiltrálása, komplementáció.

a) Ha vad típusú növény levelébe infiltráljuk a hosszú 3'UTR-t, és abban intront is tartalmazó GFP

konstrukciót (Gc-I), azt az NMD hatékonyan támadja, ami alacsony GFP expressziót eredményez. b) Ha a

Gc-I konstrukciót UPF1-VIGS növény levelébe infiltráljuk, magas GFP expressziót tapasztalunk, mivel

UPF1 hiányában az NMD nem működik. Ha a Gc-I konstrukcióval együtt infiltráljuk a vad típusú UPF1-

et, az az infiltrált foltban helyreállítja az NMD-t, így újra alacsony GFP expressziót látunk. c) UPF1-VIGS

növények levelébe Gc-I konstrukcióval különböző mutánsokat együtt infiltrálva megállapítható, hogy az

adott mutáns be tudja-e tölteni az NMD-hez szükséges funkcióját.

45

Állatokban az UPF1-et az SMG1 PIKK kináz foszforilálja (Yamashita, 2013). Az első

három PIKK kináz target S/TQ hely és környezete konzervált, nem csak a növények között, hanem

a növények és az ember között is (4. melléklet). Ezért az A. thaliana UPF1 N-terminális régiójában

ezeket az S/TQ helyeket mutáltattuk (1. táblázat, 12. ábra a). Az A. thaliana UPF1 N-terminális

régiója négy S/TQ helyet tartalmaz: S3, S13, T29 és S105 (P1, P2, P3, P4). Megvizsgálandó ezen

helyek szerepét az NMD-ben, három pontmutánst és egy deléciós mutánst készítettünk. A

mutánsok neveiben az N utal arra, hogy N-terminálison létrehozott mutációról van szó, a P pedig

a foszfohelyeket jelöli, sorrendben 1-től 4-ig. Így az NP1-4A mutánsban mind a négy S/T

aminosavat alaninra cseréltük (a név tehát az N-terminal region Phosphorylation sites 1-4 Alanine

change rövidítése). Az NP1-2AP4A mutánsban az S3, S13 és S105 (P1, P2 és P4) szerineket

alaninra cseréltük, a T29 treonin maradt, míg az NP3A mutánsban csak a T29 treonint cseréltük

alaninra, a szerineket meghagytuk. Az NΔNn deléciós konstrukcióban az N-terminális régió N-

terminális részét - 1-35 aminosav - távolítottuk el (1. táblázat, 10. ábra b, 12. ábra a). A Western-

blot igazolta, hogy ezek a kostrukciók hasonló mértékben expresszálódnak (12. ábra d).

S3 (P1) S13 (P2) T29 (P3) S105 (P4) NMD

U1ΔC S S T S + NP1-4A A A A A -

NP1-2AP4A A A T A + NP3A S S A S + NΔNn - - - S -

1. táblázat. Az A. thaliana UPF1 N-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt

konstrukciók I.

Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt, vagy kivágott aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.

Ahogy vártuk, az U1ΔC-t Gc-I-vel (és P14-gyel) együtt infiltrálva UPF1-csendesített

levelekbe gyenge zöld fluoreszcenciát és alacsony Gc-I mRNS szintet tapasztalunk. Ez megerősíti

azt a korábbi eredményt, hogy az UPF1 a C-terminális régió hiányában funkcióképes, hiszen

hatékonyan komplementálja az UPF1 hiányát (12. ábra b, c) (Merai et al., 2013). Ezzel ellentétben,

ha az NP1-4A mutánst infiltráljuk együtt Gc-I-vel, akkor erős GFP expressziót és magas Gc-I

mRNS szintet látunk. Ez annak köszönhető, hogy az NP1-4A nem képes komplementálni az UPF1

hiányát, vagyis elvesztette az NMD-hez szükséges funkcióját (12. ábra b, c). Ebből pedig az

következik, hogy az N-terminális S/TQ helyeknek, vagy legalábbis némelyiküknek, fontos szerepe

van a növényi NMD-ben. Állatokban az SMG6-nak kötőhelyül szolgáló T28 foszforilációja

46

12. ábra. Az A. thaliana UPF1 N-terminális régiójának funkcionális térképezése.

(a) A kísérletekhez használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az NMD riporter Gc-

I erős NMD-target: 3’UTR-je hosszú, és hatékonyan kivágódó intront tartalmaz. A Gc-I mRNS-ként, a

tesztelt UPF1 mutánsok fehérjeként vannak ábrázolva. A λN és HA tagek a fehérjék egyszerű kimutatása

és más kísérletek megkönnyítése miatt vannak fuzionáltatva. (b), (c) Az N-terminális régió mutánsainak

VIGS-komplementációs vizsgálata. Az N-terminális régiót a C-terminális hiányában térképeztük (U1ΔC).

Az U1ΔC konstrukcióban vagy mind a négy (NP1‐4A), vagy három (NP1‐2A4A), vagy egy (NP3A) N-

terminális S/TQ hely lett elrontva. Az NΔNn konstrukcióban az Nn rész (1-35 aminosav, benne az első

három S/TQ hely) lett eltávolítva. (b) A funkcionális térképezéshez a konstrukciókat a Gc-I-vel és P14-

gyel infiltráltuk együtt UPF1-csendesített növények (VIGS:U1) leveleibe. A pozitív kontroll az U1ΔC volt.

Az erős fluoreszcencia inaktív NMD-t jelez, vagyis az infiltrált UPF1 mutáns nem tudja komplementálni

az endogén UPF1 hiányát. A gyenge fluoreszcencia azt mutatja, hogy az infiltrált UPF1 mutáns hatékony

NMD-re képes. (c) A Northern-blot GFP és P14 próbákkal van hibridizálva. Minden mintában a GFP jelét

a P14 jelhez normalizáltuk (GFP/P14). Az átlagok három független kísérletből adódnak, a ± a szórást jelöli.

Az U1ΔC normalizált értékét vettük egynek, a többi mintát ehhez viszonyítottuk. A mintavétel infiltrálás

után 3 nappal történt. (d) A kísérletekhez használt konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden UPF1

mutáns konstrukciónk végén HA-tag volt, így anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső

kontrollnak a P14-et használtuk.

létfontosságú az NMD szempontjából (Okada-Katsuhata et al., 2012). A növényekben a T29 felel

meg az állati T28-nak (4. melléklet). Annak kiderítésére, hogy ez a treonin a növényi UPF1-ben

is hasonlóan fontos szerepet játszik-e, illetve hogy a többi N-terminális S/TQ hely részt vesz-e a

növényi NMD-ben, a különböző pontmutánsok komplementációs képességét vizsgáltuk.

47

Megnéztük, hogyan viselkednek azon UPF1 mutánsok, melyekben vagy csak ez a treonin

volt elrontva (NP3A), vagy csak ezt hagytuk meg (NP1-2A4A). Mindkét mutáns képes volt

komplementálni az UPF1 hiányát (12. ábra b, c). Az N-terminális S/TQ helyek tehát funkciójukat

tekintve redundánsak. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a T29 (amely megfelel az állati

T28-nak) bár elégséges, hiszen egyedül is elegendő a funkció megtartásához, de nem feltétlenül

szükséges, mert a többi SQ hely a T29 hiányában is képes erre. Tehát az állatokkal ellentétben ez

a három szerin (vagy közülük valamelyik) is részt vesz az NMD-ben. Az NΔNn mutáns nem

komplementálja az UPF1 hiányát, ami azt mutatja, hogy az eltávolított Nn részben lévő három

S/TQ helynek fontos szerepe van az NMD-ben (12. ábra b, c).

6.2.2. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része erősen foszforilált, de nincs szerepe az NMD-

ben

Munkatársaim korábbi munkáiból tudjuk, hogy az UPF1 N-terminális régiója foszforilált (Merai

et al., 2013), most pedig megmutattuk, hogy az itt található S/TQ potenciális foszfohelyek részt

vesznek az NMD-ben. Ezek alapján azt feltételeztük, hogy ezek az NMD-releváns S/TQ

potenciális foszfohelyek az N-terminális régióban valóban foszforiláltak. E hipotézisünkből

kiindulva összehasonlítottuk a fent említett mutánsaink foszforiláltsági állapotát (13. ábra a, b).

Az NP1-4A, NP1-2A4A, NP3A és NΔNn konstrukciókat infiltráltuk vad típusú N. benthamiana

növények leveleibe, majd a levelekben expresszálódó fehérjéket HA ellenanyaggal (minden

konstrukciónk végén HA tag volt) immunoprecipitáltuk (IP). Az IP minták egyik felét alkalikus

foszfatázzal kezeltük, másik felét kontrollként csak pufferben inkubáltuk. A mintákat akrilamid

13. ábra. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része foszforilált.

(a) Az U1ΔC és pontmutáns változatai (NP1-4A, NP1-2A4A, NP3A) hasonló mértékben foszforiláltak. (b)

Az NΔNn deléciós mutáns, melyből hiányzik az első három, NMD-releváns potenciális foszfohely, szintén

erősen foszforilált.

gélen megfuttattuk, és festettük vagy ProQ Diamond foszfoprotein festékkel vagy kontrollként

PageBlue nem specifikus fehérjefestékkel. Pozitív kontrollnak az U1ΔC, míg negatív kontrollnak

48

a mindkét végén csonka, N- és C-terminális régióitól is megfosztott UPF1 (ΔNΔC) konstrukciót

használtuk. Az alkalikus foszfatázzal kezelt és a kezeletlen minta festődése közötti különbség

mutatja meg az adott konstrukció foszforiláltságának mértékét.

Munkatársaim korábbi eredményeivel összhangban, miszerint az UPF1 N-terminális

régiója foszforilált (Merai et al., 2013), azt találtuk, hogy az U1ΔC fehérje erősen foszforilált, míg

a ΔNΔC csak gyenge háttérfestődést mutatott (13. ábra a, b). A vizsgált mutánsok esetében viszont

várakozásainkkal ellentétben azt tapasztaltuk, hogy mindegyik, még az NP1-4A konstrukció is

(ebben az összes lehetséges S/TQ foszfohely el van rontva), valamint az NΔNn konstrukció is

(melyből az első három S/TQ hely hiányzik) erősen foszforilált (13. ábra a, b). Ezek az

eredmények pedig azt mutatják, hogy az UPF1 N-terminális régiójának C-terminális része (a

továbbiakban Nc) erősen foszforilált, és hogy legalább egy, nem S/TQ hely is foszforilált az UPF1

N-terminális régiójában.

6.2.3. Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő S/TQ helyek valóban foszforiláltak, és

szükségesek az NMD-hez

Megvizsgáltuk, hogy ennek az erősen foszforilált Nc résznek van-e szerepe az NMD-ben. Ehhez

egy újabb mutánst készítettünk, amelyikből az Nc részt távolítottuk el az U1ΔC konstrukcióból (2.

táblázat, 14. ábra a). Az NΔNc mutáns hatékonyan, az U1ΔC-vel azonos mértékben

komplementálta az UPF1 hiányát (14. ábra b, c). Ez a megfigyelés, valamint az a már fentebb

említett eredmény, miszerint az NΔNn mutáns nem komplementálta az UPF1 hiányt, azt mutatja,

hogy az Nc rész nem fontos az NMD-hez, s így a negyedik foszfohely sem (S105).

2. táblázat. Az A. thaliana UPF1 N-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt

konstrukciók II.

Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt vagy kivágott aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.

Az NΔNc mutáns fehérjéből hiányzik az erősen foszforilált rész, de tartalmazza az összes,

NMD szabályozásában szerepet játszó foszforilációs helyet, ezért komplementálni tudja az UPF1

S3 (P1) S13 (P2) T29 (P3) S105 (P4) NMD

U1ΔC S S T S + NΔNc S S T - +

NΔNcP1-3A A A A - - NΔNcP1-2A A A T - +

NΔNcP3A S S A - +

49

hiányt. Ebben a mutánsban is megvizsgáltuk az NMD-releváns S/TQ helyeket. Ezekben a

konstrukciókban ugyanolyan szisztéma szerint rontottuk el ezeket az S/TQ potenciális

foszfohelyeket, mint a teljes N-terminális rész esetén (2. táblázat, 14. ábra a). Hasonlóképpen

UPF1-VIGS növényekben vizsgáltuk, hogy képesek-e komplementálni az UPF1 hiányát, valamint

tanulmányoztuk a foszforiláltsági állapotukat is. Amikor mindhárom helyet (S3, S13, T29)

elrontottuk (NΔNcP1-3A), akkor ez a fehérje UPF1-VIGS-es növényekben nem komplementálta

az UPF1 hiányát (14. ábra b, c). Ezzel szemben a csak a harmadik (NΔNcP3A), vagy csak az első

két (NΔNcP1-2A) S/TQ foszfohelyen elrontott mutánsok az infiltrált foltban képesek voltak

helyreállítani az NMD-t (2. táblázat, 14. ábra b, c). Ezek az eredmények alátámasztják a 6.2.1.

fejezetben leírtakat, vagyis azt, hogy ez a három S/TQ hely, az S3, az S13 és a T29 szerepet

játszanak az NMD-ben. Ezek a helyek ráadásul funkciójukat tekintve redundánsak, hiszen vagy az

S3 és S13 együtt, vagy a T29 önmagában elegendő volt a megfelelő működéshez.

Ezek után ezen mutánsok (NΔNc, NΔNcP3A, NΔNcP1-2A, NΔNcP1-3A)

foszforilációját vizsgáltuk ProQ Diamond foszfofestéssel. Negatív kontrollként a ΔNΔC, pozitív

kontrollként az U1ΔC konstrukciót használtuk. Azt tapasztaltuk, hogy az NΔNc mutáns fehérje

gyengébben bár, mint az U1ΔC, de foszforilált (14. ábra e). Ebből az következik, hogy az Upf1

fehérje N-terminális régiójának Nn és Nc része is foszforilált. Az NΔNcP1-3A fehérje csak a

ΔNΔC-vel megegyező háttérfestődést mutatta, vagyis ez a fehérje nem foszforilált (14. ábra e).

Ebből az eredményből pedig az következik, hogy az Nn régióban csak az S/TQ helyek

foszforiláltak. Ezt az is megerősíti, hogy a másik két részleges mutáns (NΔNcP1-2A, NΔNcP3A)

az NΔNc-nél gyengébben bár, de jól láthatóan foszforiláltak (14. ábra e). Ezek az eredmények

együttesen pedig azt mutatják, hogy az S3, S13 és T29 NMD-releváns helyek foszforiláltak. Ezen

eredményeinket a munkatársaim által elvégzett tömegspektrometriás elemzés is megerősítette

(lásd a Következtetések és javaslatok fejezetben). A tömegspektrometriával több foszforilációs

helyet is azonosítottak, többek között az Nc részben is (10. ábra b, 5. melléklet) ám a két kísérlet

együttesen azt mutatja, hogy az NMD-ben csak az S3, S13 és T29 helyek foszforilációja játszik

szerepet (Kerenyi F. et al., 2013).

50

14. ábra. Az NMD-releváns N-terminális S/TQ helyek foszforiláltak.

(a) A kísérletekhez használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b), (c) Az Nc résztől

megfosztott UPF1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. Az U1ΔC konstrukcióból kivágtuk az Nc

részt, majd pontmutánsokat készítettünk három, kettő, vagy egy S/TQ hely elrontásával (NΔNcP1-3A,

NΔNcP1-2A és NΔNcP3A) (lásd 2. táblázat). A vizsgálat menete és a minták által adott jelek értékelése a

6.3. ábrával azonos módon történt. A (-) minta a csak Gc-I-vel és P14-gyel lett infiltrálva. (d) A

kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk

tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et

használtuk. (e) Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő, NMD-releváns S/TQ helyek

foszforiláltak. A (-) minta a csak pufferrel, a (+) minta az alkalikus foszfatázzal (AP) kezelt minta. Az

NΔNc minta foszforilált, míg az NΔNcP1-3A minta (amelyikben mind a három S/TQ hely el van rontva)

nem foszforilált. Az NΔNcP1-2A és az NΔNcP3A gyengébben bár, mint az NΔNc, de foszforiláltak.

Az aszparaginsav (Asp, D) a negatív töltése miatt hasonlít a foszforilált szerinre és a

foszforilált treoninra, ezért a szerin/treonin foszforiláció mimikálására szokták használni (Hiscott

et al., 1999, Jean et al., 2010). Megvizsgáltuk, hogy a T29 esetében a foszforiláció mimikálása

(T29D, NΔNP1-2P3D; 15. ábra a) elegendő-e az NMD-hez, vagy a valóban foszforilált treoninra

van hozzá szükség. Kísérleteink azt bizonyították, hogy a foszforiláció mimikálása nem elég az

NMD-hez (15. ábra b, c).

51

15. ábra. A foszforilációt mimikáló (T29D) mutáns UPF1 nem komplementálja az UPF1 hiányát.

(a) A kísérletben használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az első 26 aminosavat

(a P1 és P2 hellyel együtt) eltávolítottuk az U1ΔC-ből (NΔP1-2). Az NΔP1-2-ben T29-et alaninra (NΔP1-

2P3A) vagy foszforilált treonint mimikáló aszparaginsavra cseréltük (NΔP1-2P3D). (b, c) A deléciós-

aminosav cserés N-terminális UPF1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített N.

benthamiana levelekbe infiltráltunk Gc-I NMD riportert P14-gyel és valamelyik UPF1 mutánssal. A T29A

és a T29D mutációk nem képesek komplementálni az endogén UPF1 hiányát. (d) A kísérletekhez használt

UPF1 mutáns konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így

anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk. Megjegyzendő, hogy

bár a NΔP1-2P3A alig detektálható mértékben expresszálódik, mégis domináns-negatív hatása van (lásd

6.2.4. fejezet, 16. ábra).

6.2.4. A funkcióját vesztett N-terminális UPF1 mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van

A PDS-VIGS kontroll növényekben úgy láttuk, hogy azok a mutánsok, melyek nem képesek

komplementálni az UPF1 hiányát, emelik a Gc-I expressziót, ami arra utalt, hogy esetleg

domináns-negatív hatásuk van. Ezért vad típusú N. benthamiana leveleibe együtt infiltráltuk az

NP1-4A, az NP3A és az NΔNn mutánsokat a Gc-I-vel (és P14-gyel), illetve az U1ΔC pozitív

kontrollt, és vizsgáltuk a Gc-I expressziót. Azt tapasztaltuk, hogy a funkcióvesztéses NP1-4A és

NΔNn mutánsokkal együtt infiltrált Gc-I lényegesen erősebben expresszálódott, mint az U1ΔC

vagy a funkcióját megtartott NP3A mellett (16. ábra a, b). Sőt, ahogy a többi NMD-inkompetens

mutáns, az NΔNn, az NΔNP1-2P3D, valamint az igen alacsony expressziójú (15. ábra d) NΔNP1-

2P3A is domináns-negatív hatású (16. ábra c, d). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a

funkcióvesztéses N-terminális mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van. Feltehető, hogy az

UPF1 foszforilációja nem a komplexbe épüléshez, hanem a komplex aktivitásához szükséges.

52

16. ábra. Az UPF1 hiányát komplementálni nem tudó mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van.

A domináns-negatívként viselkedő mutánsok emelik a Gc-I expressziót. Vad típusú N. benthamiana

levelekbe infiltráltunk Gc-I NMD riportert P14-gyel és valamelyik UPF1 mutánssal. (a), (b) Az NΔNn és

az NP1-4A mutánsok emelik a GFP expressziót, vagyis domináns-negatívként hatnak, szemben az U1ΔC

és NP3A konstrukciókkal. (c), (d) Az NΔNP1-2P3D, valamint az NΔNP1-2P3A is domináns-negatív

hatású. Megemlítendő, hogy bár az NΔP1-2P3A mutáns fehérje alig detektálható mértékben expresszálódik

(lásd 15. ábra d), mégis domináns-negatív hatása van.

Összefoglalva az UPF1 N-terminális régióját érintő vizsgálatainkat, elmondhatjuk, hogy

a mutációs és foszforilációs kísérleteink szerint az UPF1 S3, S13 és T29 helyek foszforiláltak és

fontos szerepet játszanak az NMD-ben (NMD-relevánsak). Foszforilációjuk valószínűleg nem az

NMD-komplexbe való beépüléshez, hanem a komplex aktivitásához szükséges. Ezek az NMD-

releváns foszforilált helyek mind S/TQ kontextusban vannak, így valószínűsíthetően PIKK kináz

target helyek. Ezzel szemben az Nc részben található foszforilált aminosavak nem PIKK kináz

target S/TQ helyek, és nem is vesznek részt az NMD-ben.

6.2.5. Az UPF1 fehérje C-terminális régiója funkciójukat tekintve redundáns részekre bontható

Az emlős UPF1 C-terminális doménjében több S/TQ potenciális foszfohely van, de ezek közül

csak a S1096 szolgál az SMG7 kötőhelyeként, és elengedhetetlen az NMD-hez (Okada-Katsuhata

et al., 2012). A növényi UPF1 C-terminális régiójában szintén több S/TQ hely van. Hogy

meghatározzuk, mely potenciális foszfohelyek játszanak szerepet az NMD-ben, térképeztük a C-

53

terminális régiót. Ehhez egy olyan, az UPF1 hiány komplementálására képes mutáns

konstrukcióból indultunk ki, amelynek a teljes N-terminális régiója hiányzott (ΔNU1).

A C-terminális régiót először négy, nagyjából egyforma részre bontottuk (C1, C2, C3,

C4), majd a teljes C-terminális régiót ezen részek valamelyikével helyettesítettük (ΔNU1C1,

ΔNU1C2, ΔNU1C3, ΔNU1C4; 17. ábra a; 2. és 3. melléklet). Western-blottal igazoltuk, hogy ezek

a konstrukciók hasonló mértékben expresszálódnak (17. ábra d). Mindegyik rész négy vagy öt

S/TQ potenciális foszfohelyet tartalmazott. A konstrukciókat a már bemutatott VIGS-

komplementációs rendszerben vizsgáltuk. Mind a négy mutáns képes volt komplementálni az

endogén UPF1 hiányát (17. ábra b, c). Ez azt mutatja, hogy az UPF1 C-terminális régiója

funkcionálisan redundáns részekből áll.

17. ábra. Az UPF1 C-terminális régiója redundáns S/TQ-gazdag részekből áll.

(a) Az UPF1 C-terminális deléciós konstrukcióinak sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A C-

terminális régiót négy kb. egyforma hosszúságú részre vágtuk (C1, C2, C3 és C4), majd az egyes részeket

az N-terminális részétől megfosztott UPF1 konstrukció (ΔNU1) C-terminális régiójának helyére klónoztuk

(ΔNU1C1, ΔNU1C2, ΔNU1C3 és ΔNU1C4). (b), (c) Az UPF1 C-terminális deléciós mutánsainak VIGS-

komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített levelekbe (VIGS:U1) infiltráltuk a mutáns konstrukciókat

Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Negatív kontrollként a ΔNΔC-t használtuk. Mind a

négy konstrukció komplementálja az UPF1 hiányát. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns

konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA

ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.

54

6.2.6. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén különböző funkciójú S/TQ helyek vannak

Mivel az UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan redundáns részekből áll, a továbbiakban csak

a C1 részt vizsgáltuk részletesen. A C1 részben négy S/TQ potenciális foszfohely van: S1013,

T1056, S1076 és S1085 (C1P1, C1P2, C1P3, C1P4). Három pontmutánst készítettünk: az

egyikben mind a négy helyet alaninra cseréltük (C1P1-4A), a másikban csak az első kettőt (C1P1-

2A), a harmadikban csak a második kettőt (C1P3-4A) (3. táblázat, 18. ábra a). A VIGS-

komplementációs teszt eredményei megmutatták, hogy ha mind a négy helyet elrontjuk (C1P1-

4A), akkor ez az UPF1 mutáns konstrukció nem képes komplementálni az NMD hiányát (18. ábra

b, c). Hasonlóképp nem volt képes komplementálni az a pontmutáns sem, amelyikben csak a

harmadik és negyedik helyet rontottuk el (C1P3-4A). Az első két S/TQ helyén elrontott

konstrukciónk viszont komplementálta az UPF1 VIGS-et (18. ábra b, c). Ezen eredmények alapján

arra következtettünk, hogy a C1 régió harmadik és negyedik foszfohelyei közül vagy az egyik

vagy mindkettő szükséges az UPF1 aktivitásához, az első kettő viszont nem.

S1013 (C1P1) T1056 (C1P2) S1076 (C1P3) S1085 (C1P4) NMD

ΔNU1C1 S T S S + C1P1-4A A A A A - C1P1-2A A A S S + C1P3-4A S T A A - C1P1-3A A A A S -

C1P1-2A4A A A S A +

3. táblázat. Az A. thaliana UPF1 C-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt

konstrukciók.

Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.

Hogy kiderítsük, elegendő-e az S1076 és S1085 helyek közül az egyik az UPF1 NMD-

ben betöltött funkciójának ellátásához, további pontmutánsokat készítettünk, melyekben az első

kettő mellett vagy a harmadik (C1P1-3A) vagy a negyedik (C1P1-2AP4A) foszfohelyet is

elrontottuk (3. táblázat, 19. ábra a). UPF1-VIGS komplementációs rendszerünkben az S1085

(C1P1-3A) jelenléte nem komplementálta az UPF1 hiányát, míg az S1076 (C1P1-2AP4A)

jelenléte igen (19. ábra b, c). Azaz az UPF1 C1 régió S/TQ helyei közül a harmadik, az S1076

megléte kell az UPF1 működéséhez az NMD-ben. Mivel azonban ez a konstrukció gyengébben

komplementál, mint amiben a harmadik és a negyedik foszfohely is megvan (C1P1-2A), arra

55

18. ábra. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részében az S/TQ helyek funkciója különböző.

(a) A C1 deléciós mutáns konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A pontmutánsokban

mind a négy helyet elrontottuk (C1P1‐4A), vagy csak az első kettőt (C1P1‐2A), vagy csak a harmadikat és

negyediket (C1P3‐4A), úgy, hogy a szerint és/vagy a treonint alaninra cseréltük. (b), (c) Az UPF1 C1

mutánsainak VIGS-komplementációs vizsgálata. A mutáns konstrukciókat UPF1-csendesített levelekbe

(VIGS:U1) infiltráltuk Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Pozitív kontrollként a

ΔNU1C1-et, negatív kontrollként a ΔNΔC-t használtuk. A C1P1‐4A és a C1P3‐4A nem komplementálja

az UPF1 hiányát, míg a C1P1‐2A igen. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók fehérje

szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal könnyen

kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.

következtethetünk, hogy a negyedik foszfohelynek is van valami szerepe az NMD-ben. Ezt az is

alátámasztja, hogy az UPF1 C-terminális részén található S1076 és S1085 SQ helyek

konzerválódtak, és mind növényben, mind emberben megtalálhatók (4. melléklet).

Az UPF1 C-terminális mutánsok esetleges domináns-negatív hatását is megvizsgáltuk. A

Gc-I NMD-érzékeny riporter konstrukciónkat együtt infiltráltuk az NMD-kompetens (ΔNU1C1,

C1P1-2A) és NMD-inkompetens (C1P3-4A, C1P1-4A) mutánsokkal vad típusú N. benthamiana

leveleibe. A kísérlet eredményei azt mutatják, hogy az NMD-inkompetens mutánsok domináns-

negatív hatásúak, mivel mind a C1P1-4A, mind a C1P3-4A mutáns valamelyest emelte a Gc-I

expressziót az NMD-kompetens konstrukciókhoz viszonyítva (20. ábra a, b). Ez pedig, ahogy az

N-terminális régió esetében is, azt mutatja, hogy az UPF1 S/TQ helyeinek a foszforilációjának

valószínűleg nincs szerepe az NMD-komplex kialakulásában, annak aktivitásában viszont jelentős

szerepet játszik.

56

19. ábra. Az A. thaliana UPF1 S1076 szerinje szükséges az UPF1 NMD funkciójának betöltéséhez.

(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A C1P1-3A és a C1P1-2AP4A

konstrukciók létrehozásához a C1P1 (S1013), C1P2 (T1056) és C1P3 (S1076) helyeket vagy a C1P1, C1P2

és C1P4 (S1085) helyeket rontottuk el úgy, hogy a szerineket és a treonint alaninra cseréltük.

(b) (c) Az UPF1 C1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített levelekbe infiltráltuk

az egyes mutánsokat Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Pozitív kontrollnak a ΔNU1C1-

et, negatív kontrollnak a ΔNΔC-t használtuk. Az S1076 (C1P1-2AP4A) sokkal hatékonyan komplementálja

az UPF1 hiányát, míg az S1085 (C1P1-3A) nem. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók

fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal

könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.

20. ábra. Az NMD-inkompetens C1 mutánsok domináns-negatívként hatnak.

(a), (b) Vad típusú N. benthamiana leveleibe infiltráltuk a C1 mutáns konstrukciókat Gc-I NMD riporterrel

és P14-gyel. A ΔNU1C1, C1P1-2A funkcióképes konstrukciókkal szemben a C1P3-4A és C1P1-4A NMD-

inkompetens mutánsok emelik a GFP expressziót, domináns-negatív hatásuk van.

57

6.2.7. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén az S/TQ potenciális foszfohelyek valóban

foszforiláltak

Mivel az UPF1 C-terminális régiójának C1 része tartalmaz olyan S/TQ helyeket, melyek részt

vesznek az NMD-ben, ezért megvizsgáltuk, hogy ezek a foszfohelyek valóban foszforiláltak-e. A

ΔNU1C1, a C1P1-4A és negatív kontrollként a ΔNΔC konstrukciókat expresszáltattuk,

immunoprecipitáltuk és az így kapott fehérjemintákat ProQ Diamond foszfofestéssel vizsgáltuk.

A ΔNU1C1 erősen foszforilált, míg a ΔNΔC csak a már korábban is tapasztalt háttérfestődést

mutatja. A C1P1-4A mutáns konstrukció a ΔNU1C1-hez képest gyengén foszforilált (21. ábra).

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a C1 régió S/TQ helyei foszforiláltak.

21. ábra A C1 rész S/TQ helyei foszforiláltak.

A ΔNU1C1 erősen, míg a C1P1‐4A mutáns csak gyengén, a ΔNΔC-hez hasonló mértékben foszforilált.

58

6.3. Új tudományos eredmények

Kísérleteimben a növényi gének 3’ UTR-jében található intronok pozíciójának a növényi NMD-

ben játszott szerepét, illetve az NMD kulcs faktorának, az UPF1-nek a foszforilációját vizsgáltam.

E kísérletek eredményeként kapott új tudományos eredmények a következők:

1. Növényekben az mRNS-ek 3'UTR-jében a stop kodontól legalább ötven nukleotidra lévő

intronok okoznak csak NMD-t.

2. A növényi intron alapú NMD a kritikus távolságon túl fokozatosságot is mutat: minél nagyobb

a stop kodon és az intron közötti távolság, az NMD annál hatékonyabb.

3. A növényi UPF1 N-terminális régiójának mindkét része, az Nn és az Nc rész is foszforilált, de

a két rész foszforilációjának jellege, és az NMD-ben betöltött szerepe alapvetően különbözik. Az

Nn rész S/TQ helyei foszforiláltak és fontosak az UPF1 aktivitásához az NMD-ben; míg az NMD-

t nem befolyásoló Nc rész erős foszforilációja nem S/TQ helyekhez kapcsolódik.

4. A növényi UPF1 C-terminális régiója NMD-ben betöltött funkciójukat tekintve redundáns

részekből áll.

5. A növényi UPF1 C-terminális régiója C1 részének S/TQ potenciális foszfohelyei valóban

foszforiláltak, ezek közül az S1076 biztosan, az S1085 nagy valószínűséggel fontos az UPF1

működéséhez az NMD-ben.

6. A vizsgált NMD-inkompetens UPF1 mutáns konstrukciók domináns-negatív hatásúak.

59

7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK

7.1. A stop kodon és a 3'UTR-ben helyeződő intron közötti távolság szerepe a növényi NMD-

ben

Az mRNS-ek szokatlanul hosszú 3'UTR-je NMD-t indukál növényekben, gombákban,

gerinctelenekben és kisebb hatékonysággal bár, de gerincesekben is, míg a 3'UTR-ben helyeződő

intronok csak gerincesekben és növényekben. Eddig két eukarióta NMD evolúciós modell látott

napvilágot. Az egyik szerint a hosszú 3'UTR alapú NMD az ősi, míg az intron alapú a

gerincesekben fejlődött ki a hibás alternatív splicing termékek hatékony eliminálására (Durand

and Lykke-Andersen, 2011). Egy másik modell szerint az eukarióták utolsó közös ősében mindkét

típusú NMD jelen volt, és az intron alapú NMD-t az EJC szabályozta (Kerenyi Z. et al., 2008,

Kertesz et al., 2006, Lynch and Kewalramani, 2003). Ez utóbbi modell szerint az EJC a növényi

intron alapú NMD-ben is fontos szerepet játszik.

Csoportunk eredményei a második modellt támasztják alá, vagyis azt, hogy a

növényekben, akárcsak a gerincesekben, az intron alapú NMD-t az EJC szabályozza. A gerinces

EJC az intron kivágódás helyétől 20-25 nukleotidra 5' irányban rakódik az mRNS-re. Emlős

sejtekben igazolták, hogy a riboszóma a stop kodontól 3' irányba 20-25 nukleotid távolságra

nyúlik, vagyis ekkora távolságban még el tudja távolítani a különböző fehérjéket, fehérje

komplexeket, köztük az EJC-t is az mRNS-ről. E kettő következményeként az NMD-t indukáló

intronok a stop kodontól legalább 50 nukleotidra vannak az mRNS 3'UTR-jében. Növényeken

végzett kísérleteink hasonló eredményt adtak: a 3'UTR-ben legalább 50 nukleotidra kell, hogy

legyen a stop kodontól az intron kivágódás helye ahhoz, hogy NMD-t indukáljon. Ez pedig arra

utal, hogy a növényi NMD-t szintén egy fehérje komplex szabályozza, ami 25 nukleotidra

upstream rakódik az mRNS-re az exon-exon határtól. Ez a fehérje komplex valószínűleg az EJC,

mivel csoportunk azonosította az emlős EJC mind a négy fő összetevőjének (Y14, Mago, Barentsz,

eIF4AIII) növényi ortológját is, és bizonyította, hogy ezek növényekben szükségesek az intron

alapú NMD-hez, de a hosszú 3'UTR alapúhoz nem. Bizonyítást nyert az is, hogy a PYM nevű, az

EJC szétszerelődéséért felelős fehérje túltermeltetése a gerincesekhez hasonlóan a növényekben

is meggátolja az intron alapú NMD-t, ahogy az is, hogy szintén a gerincesekhez hasonlóan az

UPF2 és UPF3 fehérjék a növényekben is szerepet játszanak az intron alapú NMD-ben (Kerenyi

Z. et al., 2008, Nyiko et al., 2013, Gehring et al., 2009). Fentiek alapján valószínű, hogy a növényi

EJC a gerincesekhez hasonlóan az UPF2 és UPF3 fehérjék megkötésével segíti elő az NMD-

60

komplex összeszerelődését. Gerincesekben a DHX34 nevű fehérje nem csak segíteni, hanem

helyettesíteni is tudja az UPF2 funkcióját (Hug and Caceres, 2014, Melero et al., 2016), ami

megmagyarázná, hogy egyes kísérletekben miért működik az NMD UPF2 hiányában is (Gehring

et al., 2005, Gehring et al., 2003, Ivanov et al., 2008, Chan et al., 2007). Azt nem tudni, hogy

növényekben is vannak-e hasonló alternatív NMD útvonalak.

Eredményeink alapján tehát valószínű, hogy az EJC mind a növényi, mind a gerinces

intron alapú NMD-ben kulcsszerepet játszik. Bár feltételezhetjük, hogy mechanizmusát tekintve

az intron alapú NMD növényekben és gerincesekben igen hasonló lehet, van egy fontos különbség.

A gerincesektől eltérően növényekben az intron alapú NMD-ben fokozatosság is megfigyelhető:

minél messzebb van az intron a stop kodontól, az NMD annál hatékonyabb. Emlősökben az újabb

eredmények azt a modellt támasztják alá, ami szerint az UPF1 több helyen is kötődik az mRNS-

hez, függetlenül attól, hogy az NMD-target-e vagy sem, és leginkább a 3'UTR-ben vannak, ahol a

transzláló riboszóma már nem tudja őket eltávolítani (Hurt et al., 2013, Kurosaki and Maquat,

2013, Zund et al., 2013, Lee et al., 2015). Ha ez növényekben is így van, az megmagyarázná az

intronos NMD pozíció-függő hatékonyságát: minél messzebb van az intron, és így az EJC a stop

kodontól, annál több UPF1 kötődhet az mRNS 3'UTR-jéhez a stop és az EJC között, ez pedig

növelné az UPF1 bekötődésének esélyét az abnormálisan termináló riboszómához kapcsolódó

SURF-komplexbe. Ez a modell megmagyarázza a növényi intron alapú NMD fokozatosságát, bár

nem világos, hogy akkor gerincesekben ez miért nincs meg. Bármi is a különbség oka, az intronos

NMD eltérése fontos szabályozási eltéréshez vezet, a fokozatos növényi intron alapú NMD

alkalmas finomszabályozásra, az igen-nem jellegű gerinces intron alapú NMD pedig nem.

A növényi intronos NMD pozíció-függő hatékonysága lehetőséget ad a vad típusú,

3'UTR-jükben intront hordozó endogén géntermékek expressziójának finomszabályozására is.

Érdekes, hogy növényekben mind az SMG7, mind a Barentsz NMD faktor hordoz intront a 3'UTR-

jében, ami ezáltal az NMD autoregulációját is jelenti: a túl erős NMD csökkenti, míg a túl gyenge

emeli két faktorának expresszióját (Nyiko et al., 2013). Bár számos gerinces NMD faktor mRNS-

e szintén NMD érzékeny, ezek mindig hosszú 3’UTR-t tartalmaznak és nem 3’UTR intront.

A fenti eredmények, illetve csoportunk és más csoportok további eredményei arra

engednek következtetni, hogy az EJC növényekben is splicing hatására szerelődik össze, és a

3'UTR-ben lévő EJC, ha a stop kodontól legalább 50 nukleotidra van, a gerincesekhez hasonlóan

növényekben is NMD-t okozhat (Koroleva et al., 2009a, Koroleva et al., 2009b, Mufarrege et al.,

2011, Nagy and Maquat, 1998). Mindezek, illetve az, hogy az eukarióták közös ősében is nagy

valószínűséggel sok intron volt (Koonin et al., 2013), pedig azt a modellt támasztják alá, amelyik

61

szerint az eukarióták közös ősében is működött az intron alapú NMD, és azokból a szervezetekből,

amelyekből ma már hiányzik (élesztő, Drosophila), az evolúció során veszett el.

7.2. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben

Állatokban az UPF1 foszforilációja a kapocs a PTC felismerése nyomán felépülő NMD-komplex

és a hibás transzkriptum lebontási lépései között.

Csoportunk korábbi eredményei alapján, miszerint (i) az UPF1 S/TQ helyekben gazdag

N- és C-terminális régiói bár funkciójukat tekintve redundánsak, de mindketten részt vesznek az

NMD-ben, (ii) az UPF1 N- és C-terminális régiója foszforilált, (iii) az SMG7 14-3-3 foszfoszerin-

kötő doménje létfontosságú a növényi NMD-hez, valamint (iv) az SMG7 magával tudja vinni az

UPF1-et a P-testekbe (Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013), feltételeztük, hogy az UPF1 N-

és C-terminális S/TQ helyek foszforilációja kulcs szerepet játszik az NMD-komplex

felépülésében, és az SMG7 által szabályozott lebontási lépésekben. Munkám során ezen S/TQ

helyek szerepét és foszforiláltságát vizsgáltam a növényi NMD-ben. Elképzeléseinkkel

összhangban azt találtuk, hogy bizonyos S/TQ helyek az N- és a C-terminális régióban

foszforiláltak és fontos szerepük van a növényi UPF1 NMD-ben betöltött funkciójának

ellátásában. Továbbá bebizonyosodott az is, hogy az S/TQ helyek úgy az N-, mint a C-terminális

régióban szerepet játszanak az SMG7 megkötésében (lásd később).

A növényi UPF1 NMD-releváns foszforilációs helyeinek meghatározásához különféle

funkcionális NMD vizsgálati rendszereket (NMD VIGS-komplementációs rendszer, domináns-

negatív teszt) és foszforilációs vizsgálatot (foszfofestés) használtam. Ezen kísérletek eredményeit

a csoportunkkal együttműködő lengyel kutatók további vizsgálatai - MS (mass spectrometry,

tömegspektrometria), kolokalizációs vizsgálatok, FRET-FLIM (fluorescence resonance energy

transfer - fluorescence lifetime imaging) - egészítették ki (Kerenyi F. et al., 2013).

7.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben

Habár a növényi UPF1 N-terminális régiójának Nn és Nc része is foszforilált, az Nc rész nem

szükséges az NMD-hez, míg az Nn rész igen. Az Nn részben lévő mindhárom S/TQ hely (S3, S13,

T29 - potenciális PIKK kináz célpontok) szerepet játszik az NMD-ben és ezek a helyek

foszforiláltak (10. ábra b; 12. ábra; 13. ábra, 14. ábra). A foszforilációs vizsgálatok eredményeit

62

kollégáim MS vizsgálata is megerősítette (5. melléklet) (Kerenyi F. et al., 2013). Ezért arra

következtettünk, hogy nem csupán maguk az S3, S13 és T29 S/TQ motívumok, hanem azok

foszforilációja is fontos szerepet játszik a növényi NMD-ben. Ezzel összhangban van az is, hogy

az egy- és kétszikűek között az UPF1 N-terminális régiójának Nn része jól konzervált, míg az Nc

rész sokkal kevésbé (4. melléklet). Kollégáim A. thaliana protoplaszt tenyészetben az UPF1 és az

SMG7 kolokalizációjának vizsgálatai, és szintén e két fehérjével végzett FRET-FLIM (fluorescent

resonance energy transfer - fluorescent life time imaging) kísérletei azt is megmutatták, hogy az

22. ábra. Az UPF1 N-terminális régiójában lévő S/TQ helyek szükségesek az SMG7 kötődéséhez.

(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b) Az SMG7-CFP (S7-C) (balra,

kék) és a különféle UPF1-YFP (középen, sárga) fúziós fehérjék kolokalizációja A. thaliana mezofil

protoplasztban. A jobb oldali képek a két jel átfedését mutatják, valamint a kloroplasztiszok vörös

autofluoreszcenciáját. A YFP különféle UPF1 konstrukciókhoz lett fuzionáltatva: egy vad típusú UPF1-

hez (U1-Y), egy C-terminális régiójától megfosztott UPF1-hez (U1ΔC-Y), valamint egy olyan C-terminális

régiójától megfosztott UPF1-hez, aminek az N-terminális S/TQ helyei el vannak rontva (NP1-4A-Y). Az

U1-Y és az U1ΔC-Y nagy része az S7-C-vel kolokalizál a P-testekben, míg az NP1-4A-Y legfőképpen a

citoplazmában akkumulálódik. Bar 5 µm. (c) SMG7-CFP-vel és a különféle UPF1-YFP-vel együtt

transzfektált A. thaliana protoplasztokban végzett FRET-FLIM mérések eredménye. Az oszlopdiagram az

S7-C konstrukció P-testekben mért átlagos FLIM értékét ábrázolja. Az oszlopok alján (n) a megmért P-

testek mennyisége, mellette zárójelben az ehhez megvizsgált sejtek mennyisége. Az oszlopok felett az

átlagos FLIM érték (τ), a FRET hatékonysága (E) és a szignifikancia (P) van feltüntetve. Az U1-Y és az

U1ΔC-Y S7-C-vel együtt expresszáltatva csökkenti a CFP fluoreszcenciájának átlagos élethosszát, míg az

NP1-4A-Y nem.

63

N-terminális S/TQ helyeknek fontos szerepük van a növényi NMD mRNS lebontási lépéseit

irányító SMG7 megkötésében [22. ábra, részletesebb kísérleti leírásért lásd (Kerenyi F. et al.,

2013)]. Az ép S/TQ helyekkel rendelkező U1ΔC-hez tud kötődni az SMG7, míg az NP1-4A

konstrukcióhoz (melyben minden szerin és treonin alaninra volt cserélve) nem. Ezen

eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy az SMG7 a 14-3-3 foszfoszerin/foszfotreonin-

kötő doménjén keresztül kötődik az UPF1 N-terminális foszforilált S/TQ helyeihez.

Korábban azt feltételeztük, hogy a foszforiláció és a defoszforiláció is szükséges a

növényi NMD működéséhez (Merai et al., 2013). Ezzel összhangban azt az eredményt kaptuk,

hogy ha kicseréltük a 29. pozícióban lévő treonint a foszforilációt sokszor utánzó aszparaginsavra

(T29D) (Jean et al., 2010), az nem volt képes komplementálni az UPF1 hiányát UPF1-VIGS

növényekben (NΔP1-2P3D, 15. ábra). Feltételezésünk szerint azért, mert a foszforilációt utánzó

T29D mutáns egy funkcióját vesztett fehérje és nem képes teljesíteni a foszforilációs-

defoszforilációs ciklust. Ehhez hasonlóan, a többi NMD-inkompetens mutáns is valószínűleg azért

hathat domináns-negatívként, mert bár ezek a mutánsok beépülnek az NMD-komplexbe, de

funkciójukat nem képesek ellátni, ezért "befagyasztják" az NMD-komplexet.

7.2.2. Az UPF1 C-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben

Az állati és növényi UPF1 C-terminális régiója rendezetlen szerkezetű, és kevésbé

konzervált (Kalmar et al., 2012). Habár az állati és növényi UPF1 C-terminális régiója számos

S/TQ helyet tartalmaz, az emlős UPF1 C-terminális régiójában ezek közül – a kísérleteink, illetve

azok publikálásának időszakában – csak néhányról bizonyították (S1073, S1078, S1096), hogy

fontos szerepük van (Cho et al., 2013, Cho et al., 2009, Lai et al., 2012, Okada-Katsuhata et al.,

2012). Ezzel szemben mi azt találtuk, hogy a növényi UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan

redundáns szakaszokból áll (17. ábra). Ugyanakkor a C-terminális régió C1 részének

finomtérképezése azt is felfedte, hogy C1 régióban lévő S/TQ helyek funkciója nem azonos: az

S1013 és T1056 nem vesznek részt az NMD-ben, míg az S1076-nak fontos szerep jut, és

valószínűleg az S1085 is szóhoz jut (18. ábra; 19. ábra). A foszforilációs vizsgálatok azt mutatták,

hogy a C-terminális C1 részén lévő S/TQ helyek foszforiláltak (21. ábra). A kolokalizációs és

FRET-FLIM vizsgálatok bebizonyították, hogy az SMG7 az UPF1 C-terminális régiójához is tud

kötődni (23. ábra) (Kerenyi F. et al., 2013). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a

növényi UPF1 C-terminális régiójában - az N-terminálishoz hasonlóan - az S/TQ helyek

foszforiláltak és az SMG7 valószínűleg ezen foszforilált S/TQ helyek némelyikéhez (pl. S1076)

kötődik.

64

23. ábra. A növényi UPF1 C-terminális régiójának fontos szerepe van az UPF1-SMG7 kötődés

kialakulásában.

(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b) Az SMG7-CFP (S7-C) (balra,

kék) kolokalizációs vizsgálata az N-terminális régióban elrontott S/TQ helyeket hordozó, teljes hosszúságú

UPF1-YFP (NP1-4A-U1-Y) (középen, sárga) fúziós fehérjével A. thaliana mezofil protoplaszt

tenyészetben. A jobboldali kép mutatja a két konstrukciótól származó jel átfedését. A piros a

kloroplasztiszok autofluoreszcenciája. (c) SMG7-CFP-vel és az NP1-4A-UPF1-YFP-vel együtt

transzfektált A. thaliana protoplasztokban végzett FRET-FLIM mérések eredménye. Az NP1-4A-U1-Y

együtt expresszáltatva csökkenti a CFP fluoreszcenciájának átlagos élethosszát (a C-terminális szerepének

megértéséhez vesd össze a 22. ábra, NP1-4A-Y konstrukcióval). A részletes magyarázatot lásd a 22.

ábránál, illetve (Kerenyi F. et al., 2013).

Annak alapján, hogy gerincesekben az UPF1 N és C-terminális régiójának számos S/TQ

helye közül csak a N- terminális T28-nak, illetve a C- terminális S1096-nak van igazi szerepe az

NMD-ben, míg növényekben az N- és C terminális régió számos S/TQ helye foszforilált, és ezek

redundánsak, azt gondoltuk, hogy a gerinces és növényi UPF1 foszforiláció szabályozása

alapvetően különbözik. Feltételeztük, hogy gerincesekben az SMG1 PIKK kináz nagyon

szigorúan szabályozott, és csak két helyen foszforilálja az UPF1-et, míg növényekben mind az

N-, mind a C- terminálison tömegfoszforiláció folyik.

Egy egészen friss publikáció alapján azonban valószínű, hogy a növényi és gerinces

UPF1 foszforiláció hasonlóbb, mint gondoltuk. Kiderült, hogy emlősökben sem csak néhány

kitüntetett S/TQ hely foszforilálódik, hanem több, melyek közül némelyik nagyobb, mások kisebb

szerepet játszanak az NMD-ben (Durand et al., 2016). Azaz a gerinces UPF1 – a növényi UPF1-

hez hasonlóan – az NMD során tömegfoszforiláción esik át (lásd még később).

65

7.2.3. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben

A kolokalizációs és FRET-FLIM vizsgálatok megmutatták, hogy az SMG7 közvetlenül

kötődik az UPF1-hez, és hogy a két fehérje a P-testekben kolokalizálódik (Kerenyi F. et al., 2013).

Az UPF1 N- vagy a C-terminális régiója önmagában elegendő az UPF1-SMG7 komplex

kialakításához, nagy valószínűséggel foszforiláltságtól függően. Azt gyanítjuk, hogy az SMG7 a

14-3-3 doménjén keresztül tudja kötni az UPF1 foszforilált S/TQ helyeit akár az N-, akár a C-

terminális régióban, ezután pedig az SMG7 a C-terminális doménje segítségével magával viszi az

UPF1-et és vele együtt a lebontásra kijelölt mRNS-t a P-testekbe, ahol aztán az SMG7 hatására a

transzkriptum gyorsan lebontásra kerül. Nemrég kimutatták az UPF1-et a silencing-testekben is

(Moreno et al., 2013). Elképzelhető, hogy az UPF1-kötött mRNS-ek lebontása ezeken a helyeken

is megtörténik.

Emlősökben az SMG1 foszforilálja az NMD-releváns T28 és S1096 helyeket az UPF1

N- és C-terminális régiójában. Ezeket a helyeket kötik aztán a 14-3-3 doménjükkel az SMG6

(T28), az SMG5-SMG7 komplex (S1096), valamint az SMG5-höz kötődő PNRC2 (S1073, S1078)

(Okada-Katsuhata et al., 2012, Cho et al., 2013, Cho et al., 2009, Lai et al., 2012). A legfrissebb

kutatások szerint azonban nem kizárólag ezek a helyek foszforilálódnak, hanem egy, a növényihez

némileg hasonlító tömegfoszforiláció történik: minél lassabb az NMD (például valamelyik, az

mRNS lebontásához szükséges faktor hiánya miatt), annál több ideje van az SMG1-nek

foszforilálni az UPF1-et. És minél tovább dolgozhat az SMG1, annál több helyen foszforilálja az

UPF1-et, ami egyre több útvonal aktiválása révén egyre hatékonyabb mRNS lebontást

eredményez, kompenzálva az NMD lelassulását (Durand et al., 2016). A növényi UPF1 N- és C-

terminális régiója hasonlóképpen működhet: az NMD-releváns S/TQ helyek (S3, S13, T29, S1076

és feltehetően még néhány a C-terminális régióban) foszforilációja következtében az SMG7

kötődni tud az UPF1-nek akár az N-, akár a C-terminális régiójához, ami megmagyarázza a két

régió redundanciáját. Az is elképzelhető, hogy a növényekben is annál hatékonyabb az SMG7

kapcsolódása az UPF1-hez, minél több helyen van foszforilálva. A tömegfoszforiláció jelensége a

korábban gondoltnál is nagyobb hasonlóságot jelent az állati és növényi UPF1 foszforilációjában

és ezáltal az NMD szabályozásában is.

Mivel növényekben is minden NMD-releváns foszfohely egyúttal S/TQ hely is,

feltételezzük, hogy az állatokhoz hasonlóan egy PIKK kináz foszforilálja ezeket a helyeket.

Ugyanakkor A. thaliana-ban nincs SMG1, igaz, minden más vizsgált növényben (így A. lyrata-

ban is) sikerült beazonosítani az ortológokat (Lloyd and Davies, 2013, Yamashita, 2013), ami azt

jelzi, hogy A. thaliana-ban ez egy viszonylag friss génvesztés lehet. N. benthamiana-ban – a

66

csoport előzetes eredményei alapján – úgy tűnik, hogy az SMG1 expresszió kikapcsolása után is

működött az NMD. Mindez pedig akkor lehetséges, ha egy vagy több másik fehérje ki tudja váltani

az SMG1 egyébként fontos foszforilációs feladatait. Ezért azt feltételezzük, hogy nagy

valószínűséggel redundáns módon több növényi PIKK kináz is képes foszforilálni az UPF1-et.

Hogy ez valóban így van-e, és ha igen, melyek ezek a PIKK kinázok, hogy magát a foszforilációt

mik és hogyan szabályozzák, továbbá hogy a defoszforilációt mely enzimek és milyen szabályozás

alatt végzik, további kísérletek hivatottak tisztázni.

67

8. ÖSSZEFOGLALÁS

A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) egy létfontosságú eukarióta

minőségbiztosítási rendszer, ami felismeri és lebontja a korai stop kodont tartalmazó, hibás

transzkriptumokat, valamint részt vesz egyes endogén gének expressziójának szabályozásában is.

Az NMD a hibás mRNS-eket a transzláció terminációja során ismeri föl. Élesztőben a szokatlanul

hosszú 3'UTR, gerincesekben a 3'UTR-ben a stop kodontól legalább 50 nukleotidra lévő intron az

NMD indukáló cisz-elem. Ha a termináció lassú, a PABP helyett az UPF1 NMD faktor kötődik az

eRF3-hoz a terminációs komplexben, majd az UPF1 megköti az UPF2 és az UPF3 faktorokat.

Ennek következtében gerincesekben - az UPF1-UPF2-UPF3 komplexben - az UPF2 az UPF1

SMG1 általi foszforilációját indukálja. Az UPF1 foszforilált S/TQ helyeihez tud kötődni az SMG6

(T28), az SMG5/SMG7 heterodimer (S1096) és a PNRC2 (S1073 és S1078). Ezek a faktorok

segítik elő az NMD által támadott mRNS-ek lebomlását.

Munkám kezdetén növényekben ezek a folyamatokat nem ismertük ennyire részletesen.

Azt már tudtuk, hogy a 3'UTR-ben lévő intronok 28 nukleotidra a stop kodontól nem okoznak

NMD-t, míg 99 nukleotidra igen. Azt is tudtuk, hogy a növényi UPF1 N- és C-terminális régiói

funkcionálisan redundánsak, és hogy az N- és C-terminális régió is foszforilált.

Hogy megvizsgáljuk, hogy az intron távolsága hogyan befolyásolja az NMD-indukáló

hatást, olyan mutánsokat készítettünk, amikben az intront különböző távolságra klónoztuk az

NMD riporter GFP konstrukció 3'UTR-jébe a stop kodontól. Kimutattuk, hogy növényekben, a

gerincesekhez hasonlóan, a stop kodontól legalább 50 nukleotidra lévő intronok NMD-t okoznak.

Azonban az is kiderült, hogy - a gerincesektől eltérően - növényekben minél messzebb van az

intron a stop kodontól, az NMD annál hatékonyabb. Ez szabályozási szempontból igen fontos

különbség, hiszen a fokozatosan működő növényi intron alapú NMD alkalmas

finomszabályozásra, míg a gerinces intron alapú NMD nem.

Az UPF1 foszforilációjának növényi NMD-ben betöltött szerepét tisztázandó UPF1

mutánsokat készítettünk és vizsgáltuk ezek foszforiláltságát, illetve azt, hogy képesek-e elvégezni

a vad típusú UPF1 feladatát az NMD-ben. Megerősítettük, hogy a növényi UPF1 N- és C-

terminális régiói alapvető, de redundáns szerepet töltenek be az NMD-ben. Megmutattuk, hogy

bár az UPF1 N-terminális régiójában számos foszforilált hely van, az UPF1 NMD-ben betöltött

funkciójához ezek közül csak három foszforilált S/TQ hely (S3, S13 és T29) szükséges. Igazoltuk

azt is, hogy az UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan redundáns S/TQ-gazdag részekből áll,

valamint azt, hogy az S1076 - és valószínűleg az S1085 is - fontosak az UPF1 működéséhez az

68

NMD-ben. Minden NMD-ben részt vevő foszforilált hely egyben S/TQ hely is. Mivel a

kolokalizációs és a FRET-FLIM kísérletek szerint az SMG7 az UPF1 N-terminális foszfo-S/TQ

helyeihez kötődik és nagy valószínűséggel a C-terminális foszfo-S/TQ helyekhez is,

eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, miszerint a gerincesekhez hasonlóan növényekben

is az UPF1 foszforilációja az összekötő kapocs az PTC-t tartalmazó transzkriptum felismerése és

annak SMG7 által irányított lebontása között: az SMG7 az UPF1 foszforilált S/TQ helyeihez

kötődve indukálja a target transzkriptum lebontását.

69

9. SUMMARY

The Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) is an essential eukaryotic quality control

system that recognizes and degrades aberrant transcripts containing premature termination codons

(PTC) and regulates the expression of several normal transcripts. NMD-targets are selected during

translational termination. In yeasts, unusually long 3'UTRs act as NMD cis element, whereas in

vertebrates, NMD is induced by introns located >50 nt downstream from the stop codon. If

termination is slow, instead of PABP, the UPF1 NMD factor binds the eRF3 protein of the

termination complex and then recruits UPF2 and UPF3. Consequently, in the UPF1-2-3 NMD

complex UPF2 induces phosphorylation of UPF1 by SMG1. Phosphorylated S/TQ residues of

UPF1 are bound by SMG6 (T28), and/or SMG5/SMG7 heterodimer (S1096) or PNRC2 (S1073

and S1078) and then these factors induce degradation of the target mRNA.

Previously our group has shown that introns in the 3'UTR located 28 nt from the stop

codon do not induce NMD while located 99 nt from the stop codon it does, and that the N- and C-

terminal domains of UPF1 act redundantly and that both the N- and C-terminal domains are

phosphorylated.

To assess the NMD-inducing effect of the distance between the stop codon and the intron

we created NMD reporter GFP constructs with introns in their 3'UTR in different distance from

the stop codon. We demonstrated that in plants, like in vertebrates, introns located >50 nt from the

stop can induce NMD. But, unlike in vertebrates, the farther the intron is located from the stop

codon the more effective the NMD. Thus we propose that in plants, unlike in mammals, intron-

based NMD could play a role in fine tuning of gene expression.

To clarify the role of UPF1 phosphorylation in plant NMD, we generated UPF1 mutants

and analyzed their phosphorylation status and the NMD competency of these mutants. We

confirmed that the N- and C- terminal regions of plant UPF1 are heavily phosphorylated, and that

these regions play an essential but redundant role in plant NMD. We show that although several

residues in the N-terminal domain of UPF1 are phosphorylated, only three phosphorylated amino

acids, S3, S13 and T29, play a role in NMD. Moreover, we found that the C-terminal domain

consists of functionally redundant S/TQ-rich segments and that S1076 is involved in NMD. All

NMD-relevant phosphorylation sites were in the S/TQ context. Since co-localization and FRET-

FLIM assays suggest that the N-terminal and probably the C-terminal phosphorylated S/TQ

residues create binding platform for SMG7, our data support the hypothesis that phosphorylation

of UPF1 connects the PTC recognition and the SMG7-mediated target transcript degradation steps

70

of NMD in plants. SMG7 binds the phosphorylated S/TQ sites of the UPF1 component of the

NMD complex and then induces the degradation of the NMD target mRNA.

71

M1. FELHASZNÁLT IRODALOM

ABRAHAM, R. T. 2004. PI 3-kinase related kinases: 'big' players in stress-induced signaling pathways. DNA

Repair (Amst), 3, 883-7.

ALONSO, C. R. 2005. Nonsense-mediated RNA decay: a molecular system micromanaging individual gene

activities and suppressing genomic noise. Bioessays, 27, 463-6.

ALTAMURA, N., GROUDINSKY, O., DUJARDIN, G. & SLONIMSKI, P. P. 1992. NAM7 nuclear gene

encodes a novel member of a family of helicases with a Zn-ligand motif and is involved in mitochondrial

functions in Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol, 224, 575-87.

AMRANI, N., DONG, S., HE, F., GANESAN, R., GHOSH, S., KERVESTIN, S., LI, C., MANGUS, D. A.,

SPATRICK, P. & JACOBSON, A. 2006. Aberrant termination triggers nonsense-mediated mRNA

decay. Biochem Soc Trans, 34, 39-42.

AMRANI, N., GANESAN, R., KERVESTIN, S., MANGUS, D. A., GHOSH, S. & JACOBSON, A. 2004. A

faux 3'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay. Nature, 432,

112-8.

ANDERS, K. R., GRIMSON, A. & ANDERSON, P. 2003. SMG-5, required for C.elegans nonsense-mediated

mRNA decay, associates with SMG-2 and protein phosphatase 2A. EMBO J, 22, 641-50.

ARIAS-PALOMO, E., YAMASHITA, A., FERNANDEZ, I. S., NUNEZ-RAMIREZ, R., BAMBA, Y., IZUMI,

N., OHNO, S. & LLORCA, O. 2011. The nonsense-mediated mRNA decay SMG-1 kinase is regulated

by large-scale conformational changes controlled by SMG-8. Genes Dev, 25, 153-64.

ARRIBAS-LAYTON, M., WU, D., LYKKE-ANDERSEN, J. & SONG, H. 2013. Structural and functional

control of the eukaryotic mRNA decapping machinery. Biochim Biophys Acta, 1829, 580-9.

ATKINSON, G. C., BALDAUF, S. L. & HAURYLIUK, V. 2008. Evolution of nonstop, no-go and nonsense-

mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol Biol, 8, 290.

AVERY, P., VICENTE-CRESPO, M., FRANCIS, D., NASHCHEKINA, O., ALONSO, C. R. & PALACIOS,

I. M. 2011. Drosophila Upf1 and Upf2 loss of function inhibits cell growth and causes animal death in

a Upf3-independent manner. RNA, 17, 624-38.

BAULCOMBE, D. 2005. RNA silencing. Trends Biochem Sci, 30, 290-3.

BAUMBERGER, N. & BAULCOMBE, D. C. 2005. Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that

selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 11928-33.

BEHM-ANSMANT, I., GATFIELD, D., REHWINKEL, J., HILGERS, V. & IZAURRALDE, E. 2007a. A

conserved role for cytoplasmic poly(A)-binding protein 1 (PABPC1) in nonsense-mediated mRNA

decay. EMBO J, 26, 1591-601.

BEHM-ANSMANT, I., KASHIMA, I., REHWINKEL, J., SAULIERE, J., WITTKOPP, N. & IZAURRALDE,

E. 2007b. mRNA quality control: an ancient machinery recognizes and degrades mRNAs with nonsense

codons. FEBS Lett, 581, 2845-53.

BELOSTOTSKY, D. A. & SIEBURTH, L. E. 2009. Kill the messenger: mRNA decay and plant development.

Curr Opin Plant Biol, 12, 96-102.

BENKOVICS, A. H., NYIKO, T., MERAI, Z., SILHAVY, D. & BISZTRAY, G. D. 2011. Functional analysis

of the grapevine paralogs of the SMG7 NMD factor using a heterolog VIGS-based gene depletion-

complementation system. Plant Mol Biol, 75, 277-90.

BHATTACHARYA, A., CZAPLINSKI, K., TRIFILLIS, P., HE, F., JACOBSON, A. & PELTZ, S. W. 2000.

Characterization of the biochemical properties of the human Upf1 gene product that is involved in

nonsense-mediated mRNA decay. RNA, 6, 1226-35.

BOEHM, V., HABERMAN, N., OTTENS, F., ULE, J. & GEHRING, N. H. 2014. 3' UTR length and messenger

ribonucleoprotein composition determine endocleavage efficiencies at termination codons. Cell Rep, 9,

555-68.

BRENGUES, M., TEIXEIRA, D. & PARKER, R. 2005. Movement of eukaryotic mRNAs between polysomes

and cytoplasmic processing bodies. Science, 310, 486-9.

CALI, B. M., KUCHMA, S. L., LATHAM, J. & ANDERSON, P. 1999. smg-7 is required for mRNA

surveillance in Caenorhabditis elegans. Genetics, 151, 605-16.

CAO, D. & PARKER, R. 2003. Computational modeling and experimental analysis of nonsense-mediated decay

in yeast. Cell, 113, 533-45.

CELIK, A., KERVESTIN, S. & JACOBSON, A. 2015. NMD: At the crossroads between translation termination

and ribosome recycling. Biochimie, 114, 2-9. CHAKRABARTI, S., BONNEAU, F., SCHUSSLER, S., EPPINGER, E. & CONTI, E. 2014. Phospho-

dependent and phospho-independent interactions of the helicase UPF1 with the NMD factors SMG5-

SMG7 and SMG6. Nucleic Acids Res, 42, 9447-60.

72

CHAKRABARTI, S., JAYACHANDRAN, U., BONNEAU, F., FIORINI, F., BASQUIN, C., DOMCKE, S.,

LE HIR, H. & CONTI, E. 2011. Molecular mechanisms for the RNA-dependent ATPase activity of

Upf1 and its regulation by Upf2. Mol Cell, 41, 693-703.

CHAMIEH, H., BALLUT, L., BONNEAU, F. & LE HIR, H. 2008. NMD factors UPF2 and UPF3 bridge UPF1

to the exon junction complex and stimulate its RNA helicase activity. Nat Struct Mol Biol, 15, 85-93.

CHAN, W. K., HUANG, L., GUDIKOTE, J. P., CHANG, Y. F., IMAM, J. S., MACLEAN, J. A., 2ND &

WILKINSON, M. F. 2007. An alternative branch of the nonsense-mediated decay pathway. EMBO J,

26, 1820-30.

CHAN, W. K., BHALLA, A. D., LE HIR, H., NGUYEN, L. S., HUANG, L., GECZ, J. & WILKINSON, M. F.

2009. A UPF3-mediated regulatory switch that maintains RNA surveillance. Nat Struct Mol Biol, 16,

747-53.

CHANG, Y. F., IMAM, J. S. & WILKINSON, M. F. 2007. The nonsense-mediated decay RNA surveillance

pathway. Annu Rev Biochem, 76, 51-74.

CHIBA, Y. & GREEN, P. J. 2009. mRNA Degradation Machinery in Plants. J. Plant Biol., 52, 114-124.

CHIU, S. Y., SERIN, G., OHARA, O. & MAQUAT, L. E. 2003. Characterization of human Smg5/7a: a protein

with similarities to Caenorhabditis elegans SMG5 and SMG7 that functions in the dephosphorylation

of Upf1. RNA, 9, 77-87.

CHO, H., HAN, S., CHOE, J., PARK, S. G., CHOI, S. S. & KIM, Y. K. 2013. SMG5-PNRC2 is functionally

dominant compared with SMG5-SMG7 in mammalian nonsense-mediated mRNA decay. Nucleic Acids Res, 41, 1319-28.

CHO, H., KIM, K. M., HAN, S., CHOE, J., PARK, S. G., CHOI, S. S. & KIM, Y. K. 2012. Staufen1-mediated

mRNA decay functions in adipogenesis. Mol Cell, 46, 495-506.

CHO, H., KIM, K. M. & KIM, Y. K. 2009. Human proline-rich nuclear receptor coregulatory protein 2 mediates

an interaction between mRNA surveillance machinery and decapping complex. Mol Cell, 33, 75-86.

CLERICI, M., DENIAUD, A., BOEHM, V., GEHRING, N. H., SCHAFFITZEL, C. & CUSACK, S. 2014.

Structural and functional analysis of the three MIF4G domains of nonsense-mediated decay factor

UPF2. Nucleic Acids Res, 42, 2673-86.

CZAPLINSKI, K., RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., PAUSHKIN, S. V., HAN, X., WENG, Y., PERLICK, H. A.,

DIETZ, H. C., TER-AVANESYAN, M. D. & PELTZ, S. W. 1998. The surveillance complex interacts

with the translation release factors to enhance termination and degrade aberrant mRNAs. Genes Dev,

12, 1665-77.

DECKER, C. J., TEIXEIRA, D. & PARKER, R. 2007. Edc3p and a glutamine/asparagine-rich domain of Lsm4p

function in processing body assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 179, 437-49.

DENNING, G., JAMIESON, L., MAQUAT, L. E., THOMPSON, E. A. & FIELDS, A. P. 2001. Cloning of a

novel phosphatidylinositol kinase-related kinase: characterization of the human SMG-1 RNA

surveillance protein. J Biol Chem, 276, 22709-14.

DOMA, M. K. & PARKER, R. 2006. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation

elongation. Nature, 440, 561-4.

DOSTIE, J. & DREYFUSS, G. 2002. Translation is required to remove Y14 from mRNAs in the cytoplasm.

Curr Biol, 12, 1060-7.

DURAND, S., COUGOT, N., MAHUTEAU-BETZER, F., NGUYEN, C. H., GRIERSON, D. S., BERTRAND,

E., TAZI, J. & LEJEUNE, F. 2007. Inhibition of nonsense-mediated mRNA decay (NMD) by a new

chemical molecule reveals the dynamic of NMD factors in P-bodies. J Cell Biol, 178, 1145-60.

DURAND, S., FRANKS, T. M. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2016. Hyperphosphorylation amplifies UPF1

activity to resolve stalls in nonsense-mediated mRNA decay. Nat Commun, 7, 12434.

DURAND, S. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2011. SnapShot: Nonsense-mediated mRNA decay. Cell, 145, 324-

324 e2.

DZIKIEWICZ-KRAWCZYK, A., PIONTEK, P., SZWEYKOWSKA-KULINSKA, Z. & JARMOLOWSKI, A.

2008. The nuclear cap-binding protein complex is not essential for nonsense-mediated mRNA decay

(NMD) in plants. Acta Biochim Pol, 55, 825-8.

EBERLE, A. B., LYKKE-ANDERSEN, S., MUHLEMANN, O. & JENSEN, T. H. 2009. SMG6 promotes

endonucleolytic cleavage of nonsense mRNA in human cells. Nat Struct Mol Biol, 16, 49-55.

EULALIO, A., BEHM-ANSMANT, I., SCHWEIZER, D. & IZAURRALDE, E. 2007. P-body formation is a

consequence, not the cause, of RNA-mediated gene silencing. Mol Cell Biol, 27, 3970-81.

FAN, J., YANG, X., WANG, W., WOOD, W. H., 3RD, BECKER, K. G. & GOROSPE, M. 2002. Global

analysis of stress-regulated mRNA turnover by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci U S A, 99,

10611-6.

FATSCHER, T., BOEHM, V. & GEHRING, N. H. 2015. Mechanism, factors, and physiological role of

nonsense-mediated mRNA decay. Cell Mol Life Sci, 72, 4523-44.

73

FERNANDEZ, I. S., YAMASHITA, A., ARIAS-PALOMO, E., BAMBA, Y., BARTOLOME, R. A.,

CANALES, M. A., TEIXIDO, J., OHNO, S. & LLORCA, O. 2011. Characterization of SMG-9, an

essential component of the nonsense-mediated mRNA decay SMG1C complex. Nucleic Acids Res, 39,

347-58.

FILICHKIN, S. A., PRIEST, H. D., GIVAN, S. A., SHEN, R., BRYANT, D. W., FOX, S. E., WONG, W. K. &

MOCKLER, T. C. 2010. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana.

Genome Res, 20, 45-58.

FRANKS, T. M., SINGH, G. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2010. Upf1 ATPase-dependent mRNP disassembly

is required for completion of nonsense- mediated mRNA decay. Cell, 143, 938-50.

FRISCHMEYER, P. A., VAN HOOF, A., O'DONNELL, K., GUERRERIO, A. L., PARKER, R. & DIETZ, H.

C. 2002. An mRNA surveillance mechanism that eliminates transcripts lacking termination codons.

Science, 295, 2258-61.

FUKUHARA, N., EBERT, J., UNTERHOLZNER, L., LINDNER, D., IZAURRALDE, E. & CONTI, E. 2005.

SMG7 is a 14-3-3-like adaptor in the nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol Cell, 17, 537-47.

FUNAKOSHI, Y., DOI, Y., HOSODA, N., UCHIDA, N., OSAWA, M., SHIMADA, I., TSUJIMOTO, M.,

SUZUKI, T., KATADA, T. & HOSHINO, S. 2007. Mechanism of mRNA deadenylation: evidence for

a molecular interplay between translation termination factor eRF3 and mRNA deadenylases. Genes

Dev, 21, 3135-48.

GARNEAU, N. L., WILUSZ, J. & WILUSZ, C. J. 2007. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 113-26.

GATFIELD, D., UNTERHOLZNER, L., CICCARELLI, F. D., BORK, P. & IZAURRALDE, E. 2003.

Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian

pathways. EMBO J, 22, 3960-70.

GEHRING, N. H., KUNZ, J. B., NEU-YILIK, G., BREIT, S., VIEGAS, M. H., HENTZE, M. W. & KULOZIK,

A. E. 2005. Exon-junction complex components specify distinct routes of nonsense-mediated mRNA

decay with differential cofactor requirements. Mol Cell, 20, 65-75.

GEHRING, N. H., LAMPRINAKI, S., KULOZIK, A. E. & HENTZE, M. W. 2009. Disassembly of exon

junction complexes by PYM. Cell, 137, 536-48.

GEHRING, N. H., NEU-YILIK, G., SCHELL, T., HENTZE, M. W. & KULOZIK, A. E. 2003. Y14 and hUpf3b

form an NMD-activating complex. Mol Cell, 11, 939-49.

GLAVAN, F., BEHM-ANSMANT, I., IZAURRALDE, E. & CONTI, E. 2006. Structures of the PIN domains

of SMG6 and SMG5 reveal a nuclease within the mRNA surveillance complex. EMBO J, 25, 5117-25.

GOERES, D. C., VAN NORMAN, J. M., ZHANG, W., FAUVER, N. A., SPENCER, M. L. & SIEBURTH, L.

E. 2007. Components of the Arabidopsis mRNA decapping complex are required for early seedling

development. Plant Cell, 19, 1549-64.

GONZALEZ, C. I., RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., VASUDEVAN, S., HENRY, M. F. & PELTZ, S. W. 2000.

The yeast hnRNP-like protein Hrp1/Nab4 marks a transcript for nonsense-mediated mRNA decay. Mol Cell, 5, 489-99.

GRANT, C. M. & HINNEBUSCH, A. G. 1994. Effect of sequence context at stop codons on efficiency of

reinitiation in GCN4 translational control. Mol Cell Biol, 14, 606-18.

GRIMSON, A., O'CONNOR, S., NEWMAN, C. L. & ANDERSON, P. 2004. SMG-1 is a phosphatidylinositol

kinase-related protein kinase required for nonsense-mediated mRNA Decay in Caenorhabditis elegans.

Mol Cell Biol, 24, 7483-90.

GUAN, Q., ZHENG, W., TANG, S., LIU, X., ZINKEL, R. A., TSUI, K. W., YANDELL, B. S. &

CULBERTSON, M. R. 2006. Impact of nonsense-mediated mRNA decay on the global expression

profile of budding yeast. PLoS Genet, 2, e203.

HAYDEN, C. A. & JORGENSEN, R. A. 2007. Identification of novel conserved peptide uORF homology

groups in Arabidopsis and rice reveals ancient eukaryotic origin of select groups and preferential

association with transcription factor-encoding genes. BMC Biol, 5, 32.

HE, F., LI, X., SPATRICK, P., CASILLO, R., DONG, S. & JACOBSON, A. 2003. Genome-wide analysis of

mRNAs regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mRNA decay pathways in yeast. Mol Cell, 12,

1439-52.

HILLMAN, R. T., GREEN, R. E. & BRENNER, S. E. 2004. An unappreciated role for RNA surveillance.

Genome Biol, 5, R8.

HISCOTT, J., PITHA, P., GENIN, P., NGUYEN, H., HEYLBROECK, C., MAMANE, Y., ALGARTE, M. &

LIN, R. 1999. Triggering the interferon response: the role of IRF-3 transcription factor. J Interferon

Cytokine Res, 19, 1-13.

HOGG, J. R. & GOFF, S. P. 2010. Upf1 senses 3'UTR length to potentiate mRNA decay. Cell, 143, 379-89.

HOSODA, N., KIM, Y. K., LEJEUNE, F. & MAQUAT, L. E. 2005. CBP80 promotes interaction of Upf1 with

Upf2 during nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells. Nat Struct Mol Biol, 12, 893-901.

74

HOUSELEY, J. & TOLLERVEY, D. 2009. The many pathways of RNA degradation. Cell, 136, 763-76.

HSU, P. P., KANG, S. A., RAMESEDER, J., ZHANG, Y., OTTINA, K. A., LIM, D., PETERSON, T. R., CHOI,

Y., GRAY, N. S., YAFFE, M. B., MARTO, J. A. & SABATINI, D. M. 2011. The mTOR-regulated

phosphoproteome reveals a mechanism of mTORC1-mediated inhibition of growth factor signaling.

Science, 332, 1317-22.

HU, W., PETZOLD, C., COLLER, J. & BAKER, K. E. 2010. Nonsense-mediated mRNA decapping occurs on

polyribosomes in Saccharomyces cerevisiae. Nat Struct Mol Biol, 17, 244-7.

HU, W., SWEET, T. J., CHAMNONGPOL, S., BAKER, K. E. & COLLER, J. 2009. Co-translational mRNA

decay in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 461, 225-9.

HUG, N. & CACERES, J. F. 2014. The RNA helicase DHX34 activates NMD by promoting a transition from

the surveillance to the decay-inducing complex. Cell Rep, 8, 1845-56.

HUNTZINGER, E., KASHIMA, I., FAUSER, M., SAULIERE, J. & IZAURRALDE, E. 2008. SMG6 is the

catalytic endonuclease that cleaves mRNAs containing nonsense codons in metazoan. RNA, 14, 2609-

17.

HURT, J. A., ROBERTSON, A. D. & BURGE, C. B. 2013. Global analyses of UPF1 binding and function

reveal expanded scope of nonsense-mediated mRNA decay. Genome Res, 23, 1636-50.

HUTVAGNER, G. & SIMARD, M. J. 2008. Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nat Rev Mol

Cell Biol, 9, 22-32.

HWANG, J. & MAQUAT, L. E. 2011. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in animal embryogenesis: to

die or not to die, that is the question. Curr Opin Genet Dev, 21, 422-30.

HWANG, J., SATO, H., TANG, Y., MATSUDA, D. & MAQUAT, L. E. 2010. UPF1 association with the cap-

binding protein, CBP80, promotes nonsense-mediated mRNA decay at two distinct steps. Mol Cell, 39,

396-409.

IACONO, M., MIGNONE, F. & PESOLE, G. 2005. uAUG and uORFs in human and rodent 5'untranslated

mRNAs. Gene, 349, 97-105.

INACIO, A., SILVA, A. L., PINTO, J., JI, X., MORGADO, A., ALMEIDA, F., FAUSTINO, P., LAVINHA,

J., LIEBHABER, S. A. & ROMAO, L. 2004. Nonsense mutations in close proximity to the initiation

codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem, 279, 32170-80.

ISKEN, O., KIM, Y. K., HOSODA, N., MAYEUR, G. L., HERSHEY, J. W. & MAQUAT, L. E. 2008. Upf1

phosphorylation triggers translational repression during nonsense-mediated mRNA decay. Cell, 133,

314-27.

ISKEN, O. & MAQUAT, L. E. 2008. The multiple lives of NMD factors: balancing roles in gene and genome

regulation. Nat Rev Genet, 9, 699-712.

IVANOV, P. V., GEHRING, N. H., KUNZ, J. B., HENTZE, M. W. & KULOZIK, A. E. 2008. Interactions

between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian

NMD pathways. EMBO J, 27, 736-47.

IWAKAWA, H. O., TAJIMA, Y., TANIGUCHI, T., KAIDO, M., MISE, K., TOMARI, Y., TANIGUCHI, H.

& OKUNO, T. 2012. Poly(A)-binding protein facilitates translation of an uncapped/nonpolyadenylated

viral RNA by binding to the 3' untranslated region. J Virol, 86, 7836-49.

JEAN, A., GUTIERREZ-HARTMANN, A. & DUVAL, D. L. 2010. A Pit-1 threonine 220 phosphomimic

reduces binding to monomeric DNA sites to inhibit Ras and estrogen stimulation of the prolactin gene

promoter. Mol Endocrinol, 24, 91-103.

JEONG, H. J., KIM, Y. J., KIM, S. H., KIM, Y. H., LEE, I. J., KIM, Y. K. & SHIN, J. S. 2011. Nonsense-

mediated mRNA decay factors, UPF1 and UPF3, contribute to plant defense. Plant Cell Physiol, 52,

2147-56.

KALMAR, L., ACS, V., SILHAVY, D. & TOMPA, P. 2012. Long-range interactions in nonsense-mediated

mRNA decay are mediated by intrinsically disordered protein regions. J Mol Biol, 424, 125-31.

KASHIMA, I., JONAS, S., JAYACHANDRAN, U., BUCHWALD, G., CONTI, E., LUPAS, A. N. &

IZAURRALDE, E. 2010. SMG6 interacts with the exon junction complex via two conserved EJC-

binding motifs (EBMs) required for nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 24, 2440-50.

KASHIMA, I., YAMASHITA, A., IZUMI, N., KATAOKA, N., MORISHITA, R., HOSHINO, S., OHNO, M.,

DREYFUSS, G. & OHNO, S. 2006. Binding of a novel SMG-1-Upf1-eRF1-eRF3 complex (SURF) to

the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 20, 355-67.

KERENYI, F., WAWER, I., SIKORSKI, P. J., KUFEL, J. & SILHAVY, D. 2013. Phosphorylation of the N-

and C-terminal UPF1 domains plays a critical role in plant nonsense-mediated mRNA decay. Plant J,

76, 836-48.

KERENYI, Z., MERAI, Z., HIRIPI, L., BENKOVICS, A., GYULA, P., LACOMME, C., BARTA, E., NAGY,

F. & SILHAVY, D. 2008. Inter-kingdom conservation of mechanism of nonsense-mediated mRNA

decay. EMBO J, 27, 1585-95.

75

KERTESZ, S., KERENYI, Z., MERAI, Z., BARTOS, I., PALFY, T., BARTA, E. & SILHAVY, D. 2006. Both

introns and long 3'-UTRs operate as cis-acting elements to trigger nonsense-mediated decay in plants.

Nucleic Acids Res, 34, 6147-57.

KERVESTIN, S. & JACOBSON, A. 2012. NMD: a multifaceted response to premature translational

termination. Nat Rev Mol Cell Biol, 13, 700-12.

KOCHETOV, A. V., SYRNIK, O. A., ROGOZIN, I. B., GLAZKO, G. V., KOMAROVA, M. L. & SHUMNYI,

V. K. 2002. [Context organization of mRNA 5'-untranslated regions of higher plants]. Mol Biol (Mosk),

36, 649-56.

KOONIN, E. V., CSUROS, M. & ROGOZIN, I. B. 2013. Whence genes in pieces: reconstruction of the exon-

intron gene structures of the last eukaryotic common ancestor and other ancestral eukaryotes. Wiley

Interdiscip Rev RNA, 4, 93-105.

KOROLEVA, O. A., BROWN, J. W. & SHAW, P. J. 2009a. Localization of eIF4A-III in the nucleolus and

splicing speckles is an indicator of plant stress. Plant Signal Behav, 4, 1148-51.

KOROLEVA, O. A., CALDER, G., PENDLE, A. F., KIM, S. H., LEWANDOWSKA, D., SIMPSON, C. G.,

JONES, I. M., BROWN, J. W. & SHAW, P. J. 2009b. Dynamic behavior of Arabidopsis eIF4A-III,

putative core protein of exon junction complex: fast relocation to nucleolus and splicing speckles under

hypoxia. Plant Cell, 21, 1592-606.

KOZAK, M. 2001. Constraints on reinitiation of translation in mammals. Nucleic Acids Res, 29, 5226-32.

KULKARNI, M., OZGUR, S. & STOECKLIN, G. 2010. On track with P-bodies. Biochem Soc Trans, 38, 242-

51.

KURIHARA, Y., MATSUI, A., HANADA, K., KAWASHIMA, M., ISHIDA, J., MOROSAWA, T., TANAKA,

M., KAMINUMA, E., MOCHIZUKI, Y., MATSUSHIMA, A., TOYODA, T., SHINOZAKI, K. &

SEKI, M. 2009. Genome-wide suppression of aberrant mRNA-like noncoding RNAs by NMD in

Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 2453-8.

KUROSAKI, T. & MAQUAT, L. E. 2013. Rules that govern UPF1 binding to mRNA 3' UTRs. Proc Natl Acad

Sci U S A, 110, 3357-62.

KUZMIAK, H. A. & MAQUAT, L. E. 2006. Applying nonsense-mediated mRNA decay research to the clinic:

progress and challenges. Trends Mol Med, 12, 306-16.

LAI, T., CHO, H., LIU, Z., BOWLER, M. W., PIAO, S., PARKER, R., KIM, Y. K. & SONG, H. 2012. Structural

basis of the PNRC2-mediated link between mrna surveillance and decapping. Structure, 20, 2025-37.

LE HIR, H., IZAURRALDE, E., MAQUAT, L. E. & MOORE, M. J. 2000. The spliceosome deposits multiple

proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions. EMBO J, 19, 6860-9.

LEE, S. R., PRATT, G. A., MARTINEZ, F. J., YEO, G. W. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2015. Target

Discrimination in Nonsense-Mediated mRNA Decay Requires Upf1 ATPase Activity. Mol Cell, 59,

413-25.

LEEDS, P., PELTZ, S. W., JACOBSON, A. & CULBERTSON, M. R. 1991. The product of the yeast UPF1

gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon.

Genes Dev, 5, 2303-14.

LEEDS, P., WOOD, J. M., LEE, B. S. & CULBERTSON, M. R. 1992. Gene products that promote mRNA

turnover in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 12, 2165-77.

LEJEUNE, F., LI, X. & MAQUAT, L. E. 2003. Nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells involves

decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Mol Cell, 12, 675-87.

LEJEUNE, F. & MAQUAT, L. E. 2005. Mechanistic links between nonsense-mediated mRNA decay and pre-

mRNA splicing in mammalian cells. Curr Opin Cell Biol, 17, 309-15.

LEWIS, B. P., GREEN, R. E. & BRENNER, S. E. 2003. Evidence for the widespread coupling of alternative

splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 189-92.

LIU, Q., FENG, Y. & ZHU, Z. 2009. Dicer-like (DCL) proteins in plants. Funct Integr Genomics, 9, 277-86.

LLAVE, C. 2010. Virus-derived small interfering RNAs at the core of plant-virus interactions. Trends Plant Sci,

15, 701-7.

LLOYD, J. P. & DAVIES, B. 2013. SMG1 is an ancient nonsense-mediated mRNA decay effector. Plant J, 76,

800-10.

LOH, B., JONAS, S. & IZAURRALDE, E. 2013. The SMG5-SMG7 heterodimer directly recruits the CCR4-

NOT deadenylase complex to mRNAs containing nonsense codons via interaction with POP2. Genes Dev, 27, 2125-38.

LONGMAN, D., PLASTERK, R. H., JOHNSTONE, I. L. & CACERES, J. F. 2007. Mechanistic insights and

identification of two novel factors in the C. elegans NMD pathway. Genes Dev, 21, 1075-85.

LYNCH, M. & KEWALRAMANI, A. 2003. Messenger RNA surveillance and the evolutionary proliferation of

introns. Mol Biol Evol, 20, 563-71.

MARTIN, K. C. & EPHRUSSI, A. 2009. mRNA localization: gene expression in the spatial dimension. Cell,

136, 719-30.

76

MATSUOKA, S., BALLIF, B. A., SMOGORZEWSKA, A., MCDONALD, E. R., 3RD, HUROV, K. E., LUO,

J., BAKALARSKI, C. E., ZHAO, Z., SOLIMINI, N., LERENTHAL, Y., SHILOH, Y., GYGI, S. P. &

ELLEDGE, S. J. 2007. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive

to DNA damage. Science, 316, 1160-6.

MCILWAIN, D. R., PAN, Q., REILLY, P. T., ELIA, A. J., MCCRACKEN, S., WAKEHAM, A. C., ITIE-

YOUTEN, A., BLENCOWE, B. J. & MAK, T. W. 2010. Smg1 is required for embryogenesis and

regulates diverse genes via alternative splicing coupled to nonsense-mediated mRNA decay. Proc Natl

Acad Sci U S A, 107, 12186-91.

MEAUX, S., VAN HOOF, A. & BAKER, K. E. 2008. Nonsense-mediated mRNA decay in yeast does not

require PAB1 or a poly(A) tail. Mol Cell, 29, 134-40.

MEDGHALCHI, S. M., FRISCHMEYER, P. A., MENDELL, J. T., KELLY, A. G., LAWLER, A. M. & DIETZ,

H. C. 2001. Rent1, a trans-effector of nonsense-mediated mRNA decay, is essential for mammalian

embryonic viability. Hum Mol Genet, 10, 99-105.

MEHTA, A., TROTTA, C. R. & PELTZ, S. W. 2006. Derepression of the Her-2 uORF is mediated by a novel

post-transcriptional control mechanism in cancer cells. Genes Dev, 20, 939-53.

MELERO, R., HUG, N., LOPEZ-PERROTE, A., YAMASHITA, A., CACERES, J. F. & LLORCA, O. 2016.

The RNA helicase DHX34 functions as a scaffold for SMG1-mediated UPF1 phosphorylation. Nat

Commun, 7, 10585.

MELERO, R., UCHIYAMA, A., CASTANO, R., KATAOKA, N., KUROSAWA, H., OHNO, S.,

YAMASHITA, A. & LLORCA, O. 2014. Structures of SMG1-UPFs complexes: SMG1 contributes to

regulate UPF2-dependent activation of UPF1 in NMD. Structure, 22, 1105-19.

MENDELL, J. T., SHARIFI, N. A., MEYERS, J. L., MARTINEZ-MURILLO, F. & DIETZ, H. C. 2004.

Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mutes

genomic noise. Nat Genet, 36, 1073-8.

MERAI, Z., BENKOVICS, A. H., NYIKO, T., DEBRECZENY, M., HIRIPI, L., KERENYI, Z., KONDOROSI,

E. & SILHAVY, D. 2013. The late steps of plant nonsense-mediated mRNA decay. Plant J, 73, 50-62.

MERAI, Z., KERENYI, Z., MOLNAR, A., BARTA, E., VALOCZI, A., BISZTRAY, G., HAVELDA, Z.,

BURGYAN, J. & SILHAVY, D. 2005. Aureusvirus P14 is an efficient RNA silencing suppressor that

binds double-stranded RNAs without size specificity. J Virol, 79, 7217-26.

MILLER, J. N. & PEARCE, D. A. 2014. Nonsense-mediated decay in genetic disease: friend or foe? Mutat Res

Rev Mutat Res, 762, 52-64.

MITCHELL, P. & TOLLERVEY, D. 2003. An NMD pathway in yeast involving accelerated deadenylation and

exosome-mediated 3'-->5' degradation. Mol Cell, 11, 1405-13.

MOORE, M. J. & PROUDFOOT, N. J. 2009. Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to

translation. Cell, 136, 688-700.

MORENO, A. B., MARTINEZ DE ALBA, A. E., BARDOU, F., CRESPI, M. D., VAUCHERET, H., MAIZEL,

A. & MALLORY, A. C. 2013. Cytoplasmic and nuclear quality control and turnover of single-stranded

RNA modulate post-transcriptional gene silencing in plants. Nucleic Acids Res, 41, 4699-708.

MUFARREGE, E. F., GONZALEZ, D. H. & CURI, G. C. 2011. Functional interconnections of Arabidopsis

exon junction complex proteins and genes at multiple steps of gene expression. J Exp Bot, 62, 5025-36.

MUHLEMANN, O. 2008. Recognition of nonsense mRNA: towards a unified model. Biochem Soc Trans, 36,

497-501.

MUHLEMANN, O., EBERLE, A. B., STALDER, L. & ZAMUDIO OROZCO, R. 2008. Recognition and

elimination of nonsense mRNA. Biochim Biophys Acta, 1779, 538-49.

MUHLEMANN, O. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2010. How and where are nonsense mRNAs degraded in

mammalian cells? RNA Biol, 7, 28-32.

MUHLRAD, D. & PARKER, R. 1994. Premature translational termination triggers mRNA decapping. Nature, 370, 578-81.

NAGY, E. & MAQUAT, L. E. 1998. A rule for termination-codon position within intron-containing genes:

when nonsense affects RNA abundance. Trends Biochem Sci, 23, 198-9.

NARSAI, R., HOWELL, K. A., MILLAR, A. H., O'TOOLE, N., SMALL, I. & WHELAN, J. 2007. Genome-

wide analysis of mRNA decay rates and their determinants in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 19, 3418-

36.

NICHOLSON, P., JOSI, C., KUROSAWA, H., YAMASHITA, A. & MUHLEMANN, O. 2014. A novel

phosphorylation-independent interaction between SMG6 and UPF1 is essential for human NMD.

Nucleic Acids Res, 42, 9217-35.

NICHOLSON, P. & MUHLEMANN, O. 2010. Cutting the nonsense: the degradation of PTC-containing

mRNAs. Biochem Soc Trans, 38, 1615-20.

NYIKO, T., KERENYI, F., SZABADKAI, L., BENKOVICS, A. H., MAJOR, P., SONKOLY, B., MERAI, Z.,

BARTA, E., NIEMIEC, E., KUFEL, J. & SILHAVY, D. 2013. Plant nonsense-mediated mRNA decay

77

is controlled by different autoregulatory circuits and can be induced by an EJC-like complex. Nucleic

Acids Res, 41, 6715-28.

NYIKO, T., SONKOLY, B., MERAI, Z., BENKOVICS, A. H. & SILHAVY, D. 2009. Plant upstream ORFs

can trigger nonsense-mediated mRNA decay in a size-dependent manner. Plant Mol Biol, 71, 367-78.

OHNISHI, T., YAMASHITA, A., KASHIMA, I., SCHELL, T., ANDERS, K. R., GRIMSON, A., HACHIYA,

T., HENTZE, M. W., ANDERSON, P. & OHNO, S. 2003. Phosphorylation of hUPF1 induces

formation of mRNA surveillance complexes containing hSMG-5 and hSMG-7. Mol Cell, 12, 1187-200.

OKADA-KATSUHATA, Y., YAMASHITA, A., KUTSUZAWA, K., IZUMI, N., HIRAHARA, F. & OHNO,

S. 2012. N- and C-terminal Upf1 phosphorylations create binding platforms for SMG-6 and SMG-

5:SMG-7 during NMD. Nucleic Acids Res, 40, 1251-66.

PAGE, D. R. & GROSSNIKLAUS, U. 2002. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet, 3, 124-36.

PAGE, M. F., CARR, B., ANDERS, K. R., GRIMSON, A. & ANDERSON, P. 1999. SMG-2 is a phosphorylated

protein required for mRNA surveillance in Caenorhabditis elegans and related to Upf1p of yeast. Mol Cell Biol, 19, 5943-51.

PAILLUSSON, A., HIRSCHI, N., VALLAN, C., AZZALIN, C. M. & MUHLEMANN, O. 2005. A GFP-based

reporter system to monitor nonsense-mediated mRNA decay. Nucleic Acids Res, 33, e54.

PAL, M., ISHIGAKI, Y., NAGY, E. & MAQUAT, L. E. 2001. Evidence that phosphorylation of human Upfl

protein varies with intracellular location and is mediated by a wortmannin-sensitive and rapamycin-

sensitive PI 3-kinase-related kinase signaling pathway. RNA, 7, 5-15.

PALUSA, S. G., ALI, G. S. & REDDY, A. S. 2007. Alternative splicing of pre-mRNAs of Arabidopsis

serine/arginine-rich proteins: regulation by hormones and stresses. Plant J, 49, 1091-107.

PERALES, R. & BENTLEY, D. 2009. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus

for nuclear transactions. Mol Cell, 36, 178-91.

PULAK, R. & ANDERSON, P. 1993. mRNA surveillance by the Caenorhabditis elegans smg genes. Genes

Dev, 7, 1885-97.

RAJKOWITSCH, L., VILELA, C., BERTHELOT, K., RAMIREZ, C. V. & MCCARTHY, J. E. 2004.

Reinitiation and recycling are distinct processes occurring downstream of translation termination in

yeast. J Mol Biol, 335, 71-85.

RATCLIFF, F., MARTIN-HERNANDEZ, A. M. & BAULCOMBE, D. C. 2001. Technical Advance. Tobacco

rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J, 25, 237-45.

RAYSON, S., ARCIGA-REYES, L., WOOTTON, L., DE TORRES ZABALA, M., TRUMAN, W., GRAHAM,

N., GRANT, M. & DAVIES, B. 2012. A role for nonsense-mediated mRNA decay in plants: pathogen

responses are induced in Arabidopsis thaliana NMD mutants. PLoS One, 7, e31917.

REBBAPRAGADA, I. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2009. Execution of nonsense-mediated mRNA decay: what

defines a substrate? Curr Opin Cell Biol, 21, 394-402.

REHWINKEL, J., BEHM-ANSMANT, I., GATFIELD, D. & IZAURRALDE, E. 2005a. A crucial role for

GW182 and the DCP1:DCP2 decapping complex in miRNA-mediated gene silencing. RNA, 11, 1640-

7.

REHWINKEL, J., LETUNIC, I., RAES, J., BORK, P. & IZAURRALDE, E. 2005b. Nonsense-mediated mRNA

decay factors act in concert to regulate common mRNA targets. RNA, 11, 1530-44.

REHWINKEL, J., RAES, J. & IZAURRALDE, E. 2006. Nonsense-mediated mRNA decay: Target genes and

functional diversification of effectors. Trends Biochem Sci, 31, 639-46.

RIEHS-KEARNAN, N., GLOGGNITZER, J., DEKROUT, B., JONAK, C. & RIHA, K. 2012. Aberrant growth

and lethality of Arabidopsis deficient in nonsense-mediated RNA decay factors is caused by

autoimmune-like response. Nucleic Acids Res, 40, 5615-24.

RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., GONZALEZ, C. I. & PELTZ, S. W. 1998. Identifying the right stop: determining

how the surveillance complex recognizes and degrades an aberrant mRNA. EMBO J, 17, 575-89.

SACHS, M. S. & GEBALLE, A. P. 2006. Downstream control of upstream open reading frames. Genes Dev,

20, 915-21.

SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. 2001. Molecular cloning : a laboratory manual, New York, Cold Spring

Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory.

SAUL, H., ELHARRAR, E., GAASH, R., ELIAZ, D., VALENCI, M., AKUA, T., AVRAMOV, M.,

FRANKEL, N., BEREZIN, I., GOTTLIEB, D., ELAZAR, M., DAVID-ASSAEL, O., TCHERKAS, V.,

MIZRACHI, K. & SHAUL, O. 2009. The upstream open reading frame of the Arabidopsis AtMHX

gene has a strong impact on transcript accumulation through the nonsense-mediated mRNA decay

pathway. Plant J, 60, 1031-42.

SAULIERE, J., HAQUE, N., HARMS, S., BARBOSA, I., BLANCHETTE, M. & LE HIR, H. 2010. The exon

junction complex differentially marks spliced junctions. Nat Struct Mol Biol, 17, 1269-71.

78

SCHELL, T., KOCHER, T., WILM, M., SERAPHIN, B., KULOZIK, A. E. & HENTZE, M. W. 2003.

Complexes between the nonsense-mediated mRNA decay pathway factor human upf1 (up-frameshift

protein 1) and essential nonsense-mediated mRNA decay factors in HeLa cells. Biochem J, 373, 775-

83.

SCHWEINGRUBER, C., RUFENER, S. C., ZUND, D., YAMASHITA, A. & MUHLEMANN, O. 2013.

Nonsense-mediated mRNA decay - mechanisms of substrate mRNA recognition and degradation in

mammalian cells. Biochim Biophys Acta, 1829, 612-23.

SHETH, U. & PARKER, R. 2006. Targeting of aberrant mRNAs to cytoplasmic processing bodies. Cell, 125,

1095-109.

SHUM, E. Y., JONES, S. H., SHAO, A., DUMDIE, J., KRAUSE, M. D., CHAN, W. K., LOU, C. H.,

ESPINOZA, J. L., SONG, H. W., PHAN, M. H., RAMAIAH, M., HUANG, L., MCCARREY, J. R.,

PETERSON, K. J., DE ROOIJ, D. G., COOK-ANDERSEN, H. & WILKINSON, M. F. 2016. The

Antagonistic Gene Paralogs Upf3a and Upf3b Govern Nonsense-Mediated RNA Decay. Cell, 165, 382-

95.

SHYU, A. B., WILKINSON, M. F. & VAN HOOF, A. 2008. Messenger RNA regulation: to translate or to

degrade. EMBO J, 27, 471-81.

SILVA, A. L., PEREIRA, F. J., MORGADO, A., KONG, J., MARTINS, R., FAUSTINO, P., LIEBHABER, S.

A. & ROMAO, L. 2006. The canonical UPF1-dependent nonsense-mediated mRNA decay is inhibited

in transcripts carrying a short open reading frame independent of sequence context. RNA, 12, 2160-70.

SILVA, A. L., RIBEIRO, P., INACIO, A., LIEBHABER, S. A. & ROMAO, L. 2008. Proximity of the poly(A)-

binding protein to a premature termination codon inhibits mammalian nonsense-mediated mRNA

decay. RNA, 14, 563-76.

SINGH, G., REBBAPRAGADA, I. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2008. A competition between stimulators and

antagonists of Upf complex recruitment governs human nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Biol, 6, e111.

SIWASZEK, A., UKLEJA, M., & DZIEMBOWSKI, A. 2014. Proteins involved in the degradation of

cytoplasmic mRNA in the major eukaryotic model systems, RNA Biology, 11, 1122-1136.

SLUCHANKO, N. N. & GUSEV, N. B. 2016. Moonlighting chaperone-like activity of the universal regulatory

14-3-3 proteins. FEBS J.

SONENBERG, N. & HINNEBUSCH, A. G. 2009. Regulation of translation initiation in eukaryotes:

mechanisms and biological targets. Cell, 136, 731-45.

SOURET, F. F., KASTENMAYER, J. P. & GREEN, P. J. 2004. AtXRN4 degrades mRNA in Arabidopsis and

its substrates include selected miRNA targets. Mol Cell, 15, 173-83.

SPRIGGS, K. A., BUSHELL, M. & WILLIS, A. E. 2010. Translational regulation of gene expression during

conditions of cell stress. Mol Cell, 40, 228-37.

STALDER, L. & MUHLEMANN, O. 2008. The meaning of nonsense. Trends Cell Biol, 18, 315-21.

STALDER, L. & MUHLEMANN, O. 2009. Processing bodies are not required for mammalian nonsense-

mediated mRNA decay. RNA, 15, 1265-73.

SUN, X., PERLICK, H. A., DIETZ, H. C. & MAQUAT, L. E. 1998. A mutated human homologue to yeast Upf1

protein has a dominant-negative effect on the decay of nonsense-containing mRNAs in mammalian

cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 10009-14.

SUZUKI, Y., ISHIHARA, D., SASAKI, M., NAKAGAWA, H., HATA, H., TSUNODA, T., WATANABE, M.,

KOMATSU, T., OTA, T., ISOGAI, T., SUYAMA, A. & SUGANO, S. 2000. Statistical analysis of the

5' untranslated region of human mRNA using "Oligo-Capped" cDNA libraries. Genomics, 64, 286-97.

SWISHER, K. D. & PARKER, R. 2009. Related mechanisms for mRNA and rRNA quality control. Mol Cell, 34, 401-2.

SZITTYA, G., MOLNAR, A., SILHAVY, D., HORNYIK, C. & BURGYAN, J. 2002. Short defective

interfering RNAs of tombusviruses are not targeted but trigger post-transcriptional gene silencing

against their helper virus. Plant Cell, 14, 359-72.

TABUCHI, T., OKADA, T., AZUMA, T., NANMORI, T. & YASUDA, T. 2006. Posttranscriptional regulation

by the upstream open reading frame of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene. Biosci

Biotechnol Biochem, 70, 2330-4.

TAKAHASHI, S., ARAKI, Y., OHYA, Y., SAKUNO, T., HOSHINO, S., KONTANI, K., NISHINA, H. &

KATADA, T. 2008. Upf1 potentially serves as a RING-related E3 ubiquitin ligase via its association

with Upf3 in yeast. RNA, 14, 1950-8.

THARUN, S. 2009. Roles of eukaryotic Lsm proteins in the regulation of mRNA function. Int Rev Cell Mol

Biol, 272, 149-89.

THEIN, S. L., HESKETH, C., TAYLOR, P., TEMPERLEY, I. J., HUTCHINSON, R. M., OLD, J. M., WOOD,

W. G., CLEGG, J. B. & WEATHERALL, D. J. 1990. Molecular basis for dominantly inherited

inclusion body beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 87, 3924-8.

79

UNTERHOLZNER, L. & IZAURRALDE, E. 2004. SMG7 acts as a molecular link between mRNA surveillance

and mRNA decay. Mol Cell, 16, 587-96.

VALENTINE, T., SHAW, J., BLOK, V. C., PHILLIPS, M. S., OPARKA, K. J. & LACOMME, C. 2004.

Efficient virus-induced gene silencing in roots using a modified tobacco rattle virus vector. Plant

Physiol, 136, 3999-4009.

VELASQUEZ, A. C., CHAKRAVARTHY, S. & MARTIN, G. B. 2009. Virus-induced gene silencing (VIGS)

in Nicotiana benthamiana and tomato. J Vis Exp, (28), e1292.

VOINNET, O. 2008. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci, 13,

317-28.

VOINNET, O. 2009. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell, 136, 669-87.

WANG, W., CZAPLINSKI, K., RAO, Y. & PELTZ, S. W. 2001. The role of Upf proteins in modulating the

translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBO J, 20, 880-90.

WASSENEGGER, M. & KRCZAL, G. 2006. Nomenclature and functions of RNA-directed RNA polymerases.

Trends Plant Sci, 11, 142-51.

WEBER, C., NOVER, L. & FAUTH, M. 2008. Plant stress granules and mRNA processing bodies are distinct

from heat stress granules. Plant J, 56, 517-30.

WELLS, S. E., HILLNER, P. E., VALE, R. D. & SACHS, A. B. 1998. Circularization of mRNA by eukaryotic

translation initiation factors. Mol Cell, 2, 135-40.

WEN, J. & BROGNA, S. 2010. Splicing-dependent NMD does not require the EJC in Schizosaccharomyces

pombe. EMBO J, 29, 1537-51.

WENG, Y., CZAPLINSKI, K. & PELTZ, S. W. 1996a. Genetic and biochemical characterization of mutations

in the ATPase and helicase regions of the Upf1 protein. Mol Cell Biol, 16, 5477-90.

WENG, Y., CZAPLINSKI, K. & PELTZ, S. W. 1996b. Identification and characterization of mutations in the

UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not

mRNA turnover. Mol Cell Biol, 16, 5491-506.

WILKINSON, M. F. 2003. The cycle of nonsense. Mol Cell, 12, 1059-61.

WINKLER, R. G. & FELDMANN, K. A. 1998. PCR-based identification of T-DNA insertion mutants. Methods Mol Biol, 82, 129-36.

WITTKOPP, N., HUNTZINGER, E., WEILER, C., SAULIERE, J., SCHMIDT, S., SONAWANE, M. &

IZAURRALDE, E. 2009. Nonsense-mediated mRNA decay effectors are essential for zebrafish

embryonic development and survival. Mol Cell Biol, 29, 3517-28.

WOLF, J. & PASSMORE, L. A. 2014. mRNA Deadenylation by Pan2/Pan3. Biochem Soc Trans, 42, 184–187.

YAMASHITA, A., OHNISHI, T., KASHIMA, I., TAYA, Y. & OHNO, S. 2001. Human SMG-1, a novel

phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase, associates with components of the mRNA

surveillance complex and is involved in the regulation of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev,

15, 2215-28.

YAMASHITA, A., CHANG, T. C., YAMASHITA, Y., ZHU, W., ZHONG, Z., CHEN, C. Y. & SHYU, A. B.

2005. Concerted action of poly(A) nucleases and decapping enzyme in mammalian mRNA turnover.

Nat Struct Mol Biol, 12, 1054-63.

YAMASHITA, A., IZUMI, N., KASHIMA, I., OHNISHI, T., SAARI, B., KATSUHATA, Y., MURAMATSU,

R., MORITA, T., IWAMATSU, A., HACHIYA, T., KURATA, R., HIRANO, H., ANDERSON, P. &

OHNO, S. 2009. SMG-8 and SMG-9, two novel subunits of the SMG-1 complex, regulate remodeling

of the mRNA surveillance complex during nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 23, 1091-105.

YAMASHITA, A. 2013. Role of SMG-1-mediated Upf1 phosphorylation in mammalian nonsense-mediated

mRNA decay. Genes Cells, 18, 161-75.

YOINE, M., NISHII, T. & NAKAMURA, K. 2006a. Arabidopsis UPF1 RNA helicase for nonsense-mediated

mRNA decay is involved in seed size control and is essential for growth. Plant Cell Physiol, 47, 572-

80.

YOINE, M., OHTO, M. A., ONAI, K., MITA, S. & NAKAMURA, K. 2006b. The lba1 mutation of UPF1 RNA

helicase involved in nonsense-mediated mRNA decay causes pleiotropic phenotypic changes and

altered sugar signalling in Arabidopsis. Plant J, 47, 49-62.

ZHANG, Z., XIN, D., WANG, P., ZHOU, L., HU, L., KONG, X. & HURST, L. D. 2009. Noisy splicing, more

than expression regulation, explains why some exons are subject to nonsense-mediated mRNA decay.

BMC Biol, 7, 23.

ZHENG, D., EZZEDDINE, N., CHEN, C. Y., ZHU, W., HE, X. & SHYU, A. B. 2008. Deadenylation is

prerequisite for P-body formation and mRNA decay in mammalian cells. J Cell Biol, 182, 89-101.

ZUND, D., GRUBER, A. R., ZAVOLAN, M. & MUHLEMANN, O. 2013. Translation-dependent displacement

of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nat Struct Mol Biol, 20, 936-43.

80

M2. Primerek listája

Primer neve szekvencia

Az introntávolság hatását vizsgáló konstrukciók elkészítéséhez használt primerek

30c BI F CATGGATTCATCCTCTAGAAGATCTTATCC

40c BI F CATGGATCCCTCAACCAAATCCTCTAGAAG

50c BI F CATGGATCCGCCACCTTCGCCCTCAACCAA

60c BI F CATGGATCCTTGAATCTCGCCAACTTCGCC

70c BI F CATGGATCCTCTGAAGCTTTGAATCTCGCC

80c BI F CATGGATCCTGGCACCACATCTGAAGCTTTGA

pFF2 rev AATTCCCTTATCTGGGAACTACTCAC

Primer neve szekvencia

Az Arabidopsis UPF1 N-terminális régióját térképező konstrukciók elkészítéséhez

használt primerek

U1N-terF1 for CACAGGATCCATGGATTCTCAACAGAGCGAT

U1N-terF4 rev CACAGGATCCTGCATCAACCTGACTACTACTAC

U1-F3 ala cserelo R GAATCGCCTTGAGCATTGAATTCCA

U1-F3 ala cserelo F TGGAATTCAATGCTCAAGGCGAATC

UPF1 Nterm F1-F2 ala

mut F

CACAGGATCCGATGCTCAACAGAGCGATCTCTTTGAC

ACCGCAGCGCAGCCG

U1N-terF4ala mut rev CACAGGATCCTGCATCAACCTGAGCACTACTACTAAC

ACC

U1N-terF3DS for CACAGGATCCGATTACCAGGATTTTGGATCG

U1 F3 ΔDS rev CACAGGATCCGAACTCTGAATCGCCTTG

U1N-terF3 for CACAGGATCCGAATTCAATACTCAAGGCGATTC

U1N-terF3ala mut for CACAGGATCCGAATTCAATGCTCAAGGCGATTC

U1N-terF3asp mut for CACAGGATCCGAATTCAATGATCAAGGCGATTC

81

Az Arabidopsis UPF1 C-terminális régióját térképező konstrukciók elkészítéséhez

használt primerek

U1 F.F5 CACACCTAGGGGTCCGCTAGCCCAACCTG

U1-R.F8 CACATCTCGAGCTAATGTGCTCCTTGTGTGGCATA

U1 F.F10 CACACCTAGGTTTCCTGGAAACTTTATGAATCAG

U1-R.F12 CACATCTCGAGCTATCCATCATCCTGGGATGA

U1 F.F14 CACACCTAGGAATCCTTATGGTGTGAACAATCC

U1 R.full CACACTCGAGTCAGCCATTGTAAGGATGTTTTG

Upf1 seq3 GCATGGTACAGTTTCAGA

U1 Cter F1 cserelo rev CGTATGGCTGAGCAGGAGGA

U1 Cter F1 cserelo for TCCTCCTGCTCAGCCATACG

U1-R.F4 CACATCTCGAGTCAAGGTTGGGATAGCGGACCACCA

U1 Cter F3-F4 ala mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGCTAGCGGACCACCAGGT

GAAGGTGAAGGCTGGGCATTCGGACT

U1 Cter F2 cserelo rev ACATTATGTTGGGCGGCTTG

U1 Cter F2 cserelo for CAAGCCGCCCAACATAATGT

U1 Cter F3A mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGATAGCGGACCACCAGGT

GAAGGCTGGGCATTCGGACT

U1 Cter F4A mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGCTAGCGGACCACCAGGT

GAAGGCTGGCTATTCGGACT

82

M3. Az Arabidopsis UPF1 N- és C-terminális S/TQ gazdag régióinak

funkcionális térképezéséhez használt konstrukiók és a megépítésükhöz

felhasznált primerek és minták

Konstrukció neve

A PCR-hez használt primerek

Forward primer Reverse primer

PCR-hez használt

minta

Az Arabidopsis UPF1 N-terminális régiójának térképezéséhez használt konstrukciók

U1ΔC U1N-terF1 for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

NP3A

U1N-terF1 for

U1-F3 ala cserelo F

U1-F3 ala cserelo R

U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

NP1-2A4A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1N-terF4ala mut rev Bin Hada-Upf1

NP1-4A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1N-terF4ala mut rev NP3A

NΔNn U1N-terF3DS for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

NΔNc U1N-terF1 for U1 F3 ΔDS rev Bin Hada-Upf1

NΔcP3A U1N-terF1 for U1 F3 ΔDS rev NP3A

NΔcP1-2A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1 F3 ΔDS rev Bin Hada-Upf1

NΔcP1-3A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1 F3 ΔDS rev NP3A

NΔP1-2 U1N-terF3 for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

NΔP1-2P3A U1N-terF3ala mut for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

NΔP1-2P3D U1N-terF3asp mut for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1

Az Arabidopsis UPF1 C-terminális régiójának térképezéséhez használt konstrukciók

ΔNU1C2 U1 F.F5 U1-R.F8 Bin Hada-Upf1

ΔNU1C3 U1 F.F10 U1-R.F12 Bin Hada-Upf1

ΔNU1C4 U1 F.F14 U1 R.full Bin Hada-Upf1

C1P1-2A

Upf1 seq3

U1 Cter F1 cserelo for

U1 Cter F1 cserelo rev

U1-R.F4 C1P2A*

C1P3-4A Upf1 seq3 U1 Cter F3-F4 ala mut rev Bin Hada-Upf1

C1P1-4A Upf1 seq3 U1 Cter F3-F4 ala mut rev C1P1-2A

C1P1-3A Upf1 seq3 U1 Cter F3A mut rev C1P1-2A

C1P1-2AP4A Upf1 seq3 U1 Cter F4A mut rev C1P1-2A

*C1P2A Upf1 seq3

U1 Cter F2 cserelo for

U1 Cter F2 cserelo rev

U1-R.F4

Bin Hada-Upf1

83

M4. Az Arabidopsis, szőlő, rizs és humán UPF1 N- és C-terminális régióinak

összehasonlítása

Az UPF1 N-terminális régiója szekvenciáinak összehasonlítása. Arabidopsis thaliana, szőlő (Vitis

vinifera), rizs (Oryza sativa) és humán UPF1 homológok szekvenciái. A mindegyikben konzervált

aminosavak feketével, amelyek nem mindegyikben konzerváltak, szürkével jelölve. Az összehasonlítás

T-Coffee-val készült, az ábrázolás GenDoc-kal. Piros téglalappal a vizsgálatainkkal azonosított, a

növényi NMD-ben szerept játszó aminosavak vannak bekeretezve. Szürke és fekete nyilak jelölik az

Arabidopsis UPF1 MS-analízissel azonosított foszforilált helyeit. A fekete nyíl a konzervált foszforilált

T29-et jelöli. Emlősökben az ennek megfelelő T28-at az SMG1 foszforilálja és az SMG6 kötődik hozzá.

Az NMD-releváns Nn rész piros vonallal, az NMD-irreleváns Nc rész szürkével jelölve. Az Nn rész

viszonylag erősen konzervált a nyitvatermők között, és sok hasonlóságot mutat a humánnal is, míg az

Nc rész igen változatos még a növények között is.

Az UPF1 C-terminális C1 része szekvenciáinak összehasonlítása. Arabidopsis thaliana, szőlő (Vitis

vinifera), rizs (Oryza sativa) és humán UPF1 homológok szekvenciái. A mindegyikben konzervált

aminosavak feketével, amelyek nem mindegyikben konzerváltak, szürkével jelölve. Az

összehasonlítás T-Coffee-val készült, az ábrázolás GenDoc-kal. Pirossal az S1076 S/TQ hely van

bekeretezve, amelyről kimutattuk, hogy szerepe van az NMD-ben. Zölddel az S1085, aminek lehet

szerepe az NMD-ben. Csillag jelöli az MS-analízissel azonosított foszforilációs helyeket. A C1 rész

növények között erősen konzervált, míg humánban csak a már említett két S/TQ hely és a környező

szekvencia hasonló.

84

M5. A foszforilált szerinek és treoninok azonosítása

tömegspektrometriával.

A tömegspektrometriás mérésekhez az N-terminális mutánsokat vad típusú N. benthamiana leveleiben

expresszáltattuk, a fehérjéket anti-HA ellenanyaggal immunoprecipitáltuk és SDS-PAGE módszerrel

futtattuk. A Coomassie-Blue-val festett fehérjesávokat kivágtuk, a gélben tripszinnel vagy pedig

tripszinnel és pepszinnel emésztettük. A foszfopeptideket titán-oxid gyantán dúsítottuk, majd LC-

MS/MS-sel elemeztük.

A vastaggal szedett aminosavak a potenciális PIKK kináz célpontok. Az Nc régió (36-109 aa) erősen

foszforilált, míg a CH és helikáz domén alig (109-1011 aa). Az Nn régió (1-35 aa) mindhárom S/TQ

helye (S3, S13, T29), melyek fontosak az NMD-hez, foszforilált.

Részletes kísérleti leíráshoz lásd még (Kerenyi F. et al., 2013).

85

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Nagy-nagy köszönettel tartozom Dr. Silhavy Dánielnek a lehetőségért, hogy a csoportjában

dolgozhattam, iránymutatásaiért és tanácsaiért, végtelen türelméért, és a pénteki focikért.

Köszönöm a Növényi RNS Biológia csoport valamennyi munkatársának munkámhoz nyújtott

önzetlen segítségét.

Köszönet illet mindenkit, aki bármilyen mértékben és minőségben hozzájárult a dolgozat

elkészültéhez.

86

A doktori disszertáció alapját képező publikációk

„Peer reviewed” folyóiratokban megjelent cikkek

Kerenyi, F; Wawer, I; Sikorski, PJ; Kufel, J; Silhavy, D: Phosphorylation of the N- and C-

terminal UPF1 domains plays a critical role in plant nonsense-mediated mRNA decay (2013)

PLANT JOURNAL Volume: 76 Issue: 5 Pages: 836-848.

Nyiko, T; Kerenyi, F; Szabadkai, Levente; Benkovics A, Major P, Sonkoly B, MeraiZ, Barta E,

Niemiec E, Kufel J and Silhavy D: Plant nonsense-mediated mRNA decay is controlled by

different autoregulatory circuits and can be induced by an EJC-like complex (2013)

NUCLEIC ACIDS RESEARCH Volume: 41 Issue: 13 Pages: 6715-6728.

Konferencia absztraktok

Kerényi F, Wawer I, Kufel J, Silhavy D: UPF1 phosphorylation is essential for Nonsense

Mediated mRNA Decay (NMD) in plants. „Jövőnk” konferencia, Keszthely, 2013.

Más, a disszertáció témájához nem kapcsolódó publikációk

„Peer reviewed” folyóiratokban megjelent cikkek

Bakó J, Kerényi F, Hrubi E, Varga I, Daróczi L, Dienes B, Csernoch L, Gáll J, and Hegedűs C:

Poly-γ-Glutamic Acid Nanoparticles Based Visible Light-Curable Hydrogel for Biomedical

Application (2016) JOURNAL OF NANOMATERIALS Volume 2016 (2016), Article ID

7350516.

Kerényi, F; Tarapcsák, S; Hrubi, E; Baráthne, SÁ; Hegedüs, V; Balogh, S; Bágyi, K; Varga, G;

Hegedüs, C: Comparison of sorting of fluorescently and magnetically labelled dental pulp

stem cells [Fogbél eredetű őssejtek fluoreszcens és mágneses válogatásának összehasonlító

vizsgálata] (2016) FOGORVOSI SZEMLE Volume 109, Issue 1, Pages 29-33.

Kuttor, A; Szaloki, M; Rente, T; Kerenyi, F; Bako, J; Fabian, I; Jenei, A; Lazar, I; Hegedus, C:

Preparation and application of highly porous aerogel-based bioactive materials in dentistry

(2014) FRONTIERS OF MATERIALS SCIENCE Volume: 8 Issue: 1 Pages: 46-52.

Deák, T; Hoffmann, S; Bodor, P; Kerényi, F; Bisztray, GD; Kozma, P: Marker assisted selection

for Seedlessness in a Multiresistant table grape hybrid family (2014) ACTA

HORTICULTURAE Volume 1046, Pages 485-492.

87

Konferencia absztraktok

Kerényi, F; Tombácz, I; Lázár, I; Hegedűs, C: Silica based aerogel composites as potential bone

regenerating scaffold materials (előadás); European Advanced Materials Congress 2016,

Stockholm, Sweden, 2016

Kerényi, F; Kuttor, A; Tombácz, I; Baráthné, SÁ; Lázár, I; Hegedűs, C: Highly porous silica

aerogel-based bioactive composite materials as potential scaffolds for bone regeneration

(poszter); 27th European Conference on Biomaterials ESB2015, Kraków, Poland, 2015.

Kerényi, F; Kuttor, A; Tombácz, I; Baráthné, SÁ; Tarapcsák, S; Lázár, I; Hegedűs, C: Behaviour

of STRO-1 sorted dental pulp stem cells on a highly porous silica aerogel-based bioactive

composite material (előadás); BIT’s 7th Annual World Congress of Regenerative Medicine

and Stem Cells, Haikou, China, 2014.

Bakó, J; Szepesi, M; Kuttor, A; Kerényi, F; Jenei, A; Hegedűs, C: Drug release from visible-

light curable biodegradable nanocomposite hydrogelsystems (poszter); 6th International

Conference on Drug Discovery and Therapy, Dubai, UAE, 2014.

Kerényi, F; Hrubi, E; Szalóki, G; Jenei, A; Hegedűs, C: Diverse effect of BMP-2 on various cells

able to differentiate to osteoblast (poszter); 3rd Biotechnology World Congress, Dubai, UAE,

2014.