คูมือปฏิบัติการ

การทดสอบคุณภาพนํ้ านม

วิโรจน ภัทรจินดาวชิระ ศรีค ํามี

ภาควิชาสัตวศาสตรคณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน

2539

KKUFRESH

1

คํ านํ า

การเรียนการสอนในวิชา การผลิตโคนมน้ัน นักศึกษาจํ าเปนที่จะตองมีความรู เก่ียวกับการตรวจสอบคุณภาพน้ํ านมในเบื้องตน และรูถึงวิธีการวิเคราะหสวนประกอบน้ํ านม เพ่ือจะไดนํ าความรูเหลาน้ีไปประยุกตใชในการผลิตโคนมตอไป คูมือปฏิบัติการการทดสอบคุณภาพน้ํ านม ไดเรียบเรียงขึ้นมาเพื่อใหนักศึกษาไดศึกษาลวงหนาในการท่ีจะทํ าการทดสอบคุณภาพน้ํ านม โดยมีเนื้อหาที่ครบถวนสมบูรณในตัวเอง เปาหมายที่สํ าคัญของหนังสือคูมอืเลมน้ีคือ เมื่อนักศึกษาเรียนจบภาคปฏิบัติตามเนื้อหาแลว นักศึกษาสามารถปฎิบัติงานในระดับเจาหนาที่ศูนยรับน้ํ านมดิบหรือปฎิบัติงานเปนเจาหนาที่ตรวจคุณภาพนํ้ านมในโรงงานแปรรูปน้ํ านมไดทันที เน้ือหาในแตละบทเรียนผูเขียนไดพยายามนํ าการทดสอบที่มีการใชกันอยางแพรหลาย เขียนเปนคูมือในการทดสอบคุณภาพน้ํ านมและบางบทปฏิบัติการอาจไมไดสอนในหองเรียน อันเนื่องมาจากขอจํ ากัดของเวลาเรียน แตผูเขียนก็ไดนํ ามาใสไว เพื่อเปนแนวทางใหนักศึกษาไดศึกษาเองเบื้องตน ขอขอบคุณ ผศ.ดร.ณฐพล อ่ํ ารอด อยางสูงที่ไดใหคํ าแนะนํ าในการจัดทํ าคูมือเลมน้ี, คุณสุรเชษฐชยัคํ าเพ็ญ ที่ไดจัดพิมพและคุณวชิระ ศรีคํ ามี เจาหนาที่ประจ ําหองปฏิบัติการนม ที่ชวยในการปรับปรุงขั้นตอนใหสอดคลองกับการปฏิบัติ ในการพิมพครั้งนี้อาจมีขอบกพรองอยูบาง ซึ่งผูเขียนคาดวาจะไดปรับปรุงในโอกาสตอไป

วิโรจน ภัทรจินดา

2

สารบัญ

บทปฏิบัติการ หนา

1. การทดสอบคุณภาพน้ํ านมเบื้องตน 3 1.1 การทดสอบคุณภาพนมโดยประสาทสัมผัส 4 1.2 การทดสอบคุณภาพนมโดยแอลกอฮอล 6 1.3 การทดสอบคุณภาพนมโดยการตมในน้ํ าเดือด 8 1.4 การทดสอบคุณภาพนมโดยวัดความเปนกรด 9

2. การทดสอบจุลินทรียในน้ํ านม 12 2.1 การทดสอบโดยการเปล่ียนสีของเมทธิลีน บลู 13 2.2 การทดสอบริซาชูรีน 1 ชั่วโมง 15 2.3 การนับจุลินทรียโดยกลองจุลทรรศน 17 2.4 การนับจุลินทรียบนจานเล้ียงเช้ือ 20 2.5 การทดสอบแบคทีเรียโคลิฟอรม 23

3. การวิเคราะหสวนประกอบของน้ํ านม 24 3.1 การเก็บตัวอยางน้ํ านม 24 3.2 การวิเคราะหหาไขมัน 26 3.3 การวิเคราะหหาโปรตีน 28 3.4 การวิเคราะหหาแลคโตส 31 3.5 การวิเคราะหหาปริมาณของแข็งทั้งหมดในนํ้ านม 33

4. การตรวจการปลอมปนในน้ํ านม 35 4.1 การวัดความถวงจํ าเพาะของน้ํ านม 35 4.2 การตรวจสอบการปลอมปนน้ํ าในน้ํ านม 37 ภาคผนวก 39 เอกสารอางอิง 40

3

บทปฏิบัติการท่ี 1การทดสอบคุณภาพนํ ้านมเบ้ืองตน

บทนํ า การทดสอบคุณภาพน้ํ านม เปนการตรวจสอบโดยเฉพาะของโรงงานนมหรือ ศูนยรับนม โรงงานรับซ้ือ เพ่ือท่ีจะไดรูวาน้ํ านมที่ผูเลี้ยงโคนมนํ ามาขายใหโรงงานนั้นมีคุณภาพดี สะอาดหรือไม ขั้นตอนในการทดสอบคุณภาพน้ํ านมเบื้องตน กอนรับซ้ือน้ัน จะตองตองเปนวิธีการที่รวดเร็วและใหผลที่นาเชื่อถือไดมีวิธีคือ (1) การทดสอบโดยประสาทสัมผัส (organoleptic test) (2) การทดสอบโดยใชแอลกอฮอล (algohol test) (3) การทดสอบโดยใชการตมในนํ้ าเดือด (clot-on-boiling test) (4) การทดสอบโดยวัดความเปนกรด (acidity test)

วัตถุประสงค 1. ใหนักศึกษามีความสามารถตรวจสอบคุณสมบัตินํ้ านมทางกายภาพอยางงาย โดยวิธีใชประสาทสัมผัสทั้ง 5 2. ใหนักศึกษาสามารถจํ าแนกชนิดและคุณภาพของน้ํ านมในเบื้องตนได

4

บทปฏิบัติที่ 1.1การทดสอบโดยประสาทสัมผัส (Organoleptic Test)

หลักการ ในการตรวจน้ํ านมขั้นแรกในการตรวจสอบนมดิบกอนรับเขาโรงงาน เพ่ือแปรรูปตอไปน้ัน การใชประสาทสัมผัสตาง ๆ ก็สามารถท่ีจะแบงแยกนมดิบไดในระดับหน่ึง โดยเฉพาะสี รส และกล่ิน ของนมดิบถาผดิปกติจากคุณสมบัติของนมดิบท่ัว ๆ ไป ก็สามารถลงความเห็นไมรับซื้อได อยางไรก็ตามการตรวจโดยใชประสาทสัมผสั เปนวิธีการหนึ่งที่นํ ามาใชรวมในการทดสอบและลงความเห็นตอคุณภาพของผลิตภัณฑน้ํ านมวัตถุประสงค - นักศึกษาใชประสาทสัมผัสตาง ๆ เชน ตา จมูก ล้ิน และกาย ทดสอบ คุณภาพนมและสามารถแยกแยะชนิดของนมและลงความเห็น (identify) ไดวานมนั้นมีคุณภาพพอที่จะรับซื้อหรือไม

อุปกรณ : - ถวยใสนม (Beaker) - ถวยตักนม (sample dipper) - ชอนชิมนมวิธีการ : 1. ตรวจดูสภาพทั่วไปของนม เชน สี เศษส่ิงสกปรก ไขมันลอยตัว ตลอดจน ภาชนะบรรจนุม เชนถงันม ฝาถงันมซ่ึงอาจจะมีตะกอนนม (milk stone) เกาะติดอยูตามซอกของรอยตะเข็บถัง 2. ใชชอนตักตัวอยางนมประมาณครึ่งชอน ใสเขาไปในปากละเลงใหทั่วลิ้น ผานลมหายใจเขาไปทางโพรงจมูก ก็จะสัมผัสไดท้ังรสและกล่ินของนมไป พรอม ๆ กัน และเม่ือทดสอบเสร็จแลว จึงบวนทิ้งลงอาง หามกลืนกิน ลางปากและชอนใหสะอาดเพื่อชิมตัวอยางนมตอไปการวิเคราะหผล : (1) การดูสีของนม ก. นมสีขาว (white) ไดแก นมกระบือ หรือนมโคที่มีไขมันเนยตํ่ า หรือนมปนน้ํ า (<3.5%) เชนนมโคพนัธุโฮลสไตน สํ าหรับสีของนม สีขาวนี้อาจจะขาวทึบ หรือขาวโปรง ขาวทึบมักเปนสีของนมที่ผานความรอนไมสูงนัก สีขาวน้ีคือสีของเคซิน ข. นมสีขาวอมเหลือง (yellowish-white) คือ สีพ้ืนเปนสีขาวและ มีสีเหลืองของคาโรตีน(carotene) ปนมาบาง ซ่ึงเปนสีของนม โคโดยทั่ว ๆ ไป ซึ่งมีมันเนยระหวาง 3.5-4.0% ค. นมสีเหลืองอมขาว (whitish-yellow) สีนมคอนขางเหลือง ทั้งนี้มักเปนนมโคที่มีมันเนยมากเชน นมโคพันธุเจอรซ่ี (ไขมัน 4-5%) หรืออาจจะเปนสีของนมน้ํ าเหลือง (colostrum) ก็ได ง. นมสีน้ํ าตาล (brown) มักจะเปนสีของนมที่ผานความรอนสูง มีการไหมของโปรตีนนม เชนนมสเตอริไลส จ. นมสีอ่ืน ๆ (abnormal color)อาจเปนสีแดง เหลืองฯลฯ ทั้งนี้แลวแตความผิดปกติของโคเหลาน้ัน

5

(2) การดมกล่ินและชิมรส การทดสอบโดยการดมกล่ินและชิมรสควรท่ีจะนํ าไปพรอม ๆ กัน จึงจะใหผลดี หามใชวิธีการด่ืมหรือชมิทลีะมาก ๆ แลวกลืนลงไป จะทํ าใหนักศึกษาไมสามารถแยกกลิ่นและชิมรสของนมตัวอยางถัด ๆไปได ส ําหรับรสของนมอาจมีไดหลายรส เชน ก. รสหวานปะแหลม คือรสหวานนิด ๆ ของแลคโตส ถือวาเปนรสของนมปกติ ข. รสเปร้ียว คือ รสของนมเสียหรือจวนเสียซ่ึงเปนรสของกรดแลคติค ค. รสขม ตามธรรมดามักไมคอยพบ นอกจากเปนกรณีพิเศษท่ีจุลินทรีย บางชนิดเปล่ียนโปรตีนนมบางสวนไปเปนเปปโตน มักเกิดเปนคร้ังคราวกับนมสเตอริไลส ง. รสเค็ม เน่ืองจากนมมีเกลือคลอไรดสูงไดแก นมผิดปกติตางๆ เชน นมแมสไตตีส (mastitis)นมเหลือง (colostrum) และนมใน ชวงปลายของการใหนม (late lactation milk) จ. รสจืด มักเปนนมใสหรือนมเติมน้ํ า ฉ. รสอ่ืน ๆ ซ่ึงอาจพบในนม เชน ยากันบูด เปนตน ส ําหรับกลิ่นที่อาจพบจากนมมีดังนี้ ก. กล่ินคาว (unclean flavour) เปนกลิ่นของนมโคดิบทั่วไป คือ นมที่รีดมาจากเตานมยังไมผานกรรมวิธีใด ๆ ข. กล่ินนมสุก(cooked flavour) เปนกล่ินนมท่ีผานความรอนซ่ึงผาน ความรอนสูง กล่ินนมสุกยิง่แรง นมสเตอริไลส จะมีกล่ินนมสุกมากกวานมพาสเจอไรสซ่ึงกล่ินของนมสุกจะเกิดพรอมกับสีน้ํ าตาลของนม ค. กล่ินหืน (rancidity) เปนกล่ินของนมเกาหรือนมเสียเกิดข้ึนจาก สวนของมันเนยที่มีอยูในนม ง. กล่ินอ่ืน ๆ อาจพบไดหลายชนิด เชน กล่ินเหม็น ฯลฯ

6

บทปฏิบัติการท่ี 1.2การทดสอบคุณภาพนมโดยแอลกอฮอล (Alcohol Test)

หลักการ การรับซื้อนมเขาโรงงาน นอกจากจะใชวิธีการตรวจโดยใชประสาทสัมผัสแลว ยังมีการทดสอบโดยใชแอลกอฮอล เพ่ือตรวจสอบสภาพความคงทนตอแอลกอฮอล (Alcohol stability) ของนํ้ านมดิบ โดยหลักการแลวถาน้ํ านมดิบใดๆ เกิดตะกอนหรือเกาะตัวดวยสารละลายแอลกอฮอล ซึ่งมีความเขมขน 68-72% แลวจะไมรับเขาโรงงาน เพราะอาจจะมีปญหาในการนํ าน้ํ านมดิบน้ันไปแปรรูป ซึ่งพบวา นมดิบที่มีAlcohol stability ตํ่ า มักจะมี heat stability ตํ่ าดวย แตก็ไมเสมอไป โดยเฉพาะในนมที่มาจากโรคแรกคลอดหรือโคอยูระยะปลายของการใหนม นมกลุมนี้จะมี Alcohol stability ตํ่ า แตมี heat stability ปกต ิและโดยปกตน้ํิ านมโคจะหมดเสถยีรภาพ เมื่อท ําปฏิกิริยากับแอลกอฮอล 95% แตถาใชแอลกอฮอล 68-75% เขาทดสอบน้ํ านมน้ัน ยังไมมีเสถียรภาพอีก แสดงวาเม่ือนํ านมนั้นไปใหความรอน น้ํ านมจะ clot แยกชั้นนมและเสียไดซ่ึงจะไมเหมาะในการนํ าไปท ําผลิตภัณฑตอไป แมวาการตรวจสอบโดยวิธีแอลกอฮอล อาจจะไมถูกตองมากนักแตก็เปนวิธีท่ีงายและสะดวก จึงมักนิยมใชกันอยูโดยทั่วไป

วัตถุประสงค 1. ใหรูถึงวิธีการตรวจสอบนํ้ านมกอนรับเขาโรงงาน 2. ใหสามารถทดสอบนมที่เสียแลวไดแมนย ํา 3. สามารถทดสอบไดวานมใดอยูตัว ทนความรอนไดดี

อุปกรณ - หลอดทดสอบพรอมฝาปดท่ีลางสะอาดและอบใหแหง - ไปเปต ขนาด 10 มิลลิลิตร - สารละลายแอลกอฮอล 70 % เตรียมโดยผสมเอทธิลแอลกอฮอล (ethyl alcohol) 95% จํ านวน 74มลิลิลิตร กับน้ํ ากล่ัน 26 มิลลิลิตร ซ่ึงจะไดสารละลายแอลกอฮอล 70% จํ านวน 100 มิลลิลิตร (68%เตรียมโดย ethyl alcohol 95% จํ านวน 72 ml. กับน้ํ ากล่ัน 28 ml. ซ่ึงรวมเปนแอลกอฮอล 68% จํ านวน100 ml.)

วิธีการ 1. คนตัวอยางนม ในภาชนะที่บรรจุใหเขากันดี 2. ใชไปเปทดูดตัวอยางนม 2 มิลลิลิตรใสในหลอดทดสอบ 3. ใชไปเปทดูดสารละลายแอลกอฮอล 2 มิลลิลิตร ใสลงไปในหลอดทดสอบที่มีตัวอยางนมอยู แลวปดฝา 4. ผสมตัวอยางนมและแอลกอฮอลใหเขากันดี โดยการกระดกหลอดทดสอบ ควํ่ า-หงาย(inverting) 2-3 คร้ัง หามเขยาแรง 5. เอียงหลอดในแนวนอน หรือควํ่ ากนหลอดข้ึน ใหตัดกับแสงสวาง แลวสังเกตการเกิดตะกอนหรือเกล็ด

7

การวิเคราะหผล :-----------------------------------------------------------------ลักษณะของนม คุณภาพนม ความเปนกรด เกรด ของนม +ve Positive-----------------------------------------------------------------1. ไมมีเกล็ด นมปกติ 0.185% - ve2. มเีกล็ดละเอียด (fine flake) นมปกติ 0.19% + 1 ve3. มเีกล็ดขนาดปานกลาง นมจวนจะเสีย 0.23% + 2 ve (medium flake)4. มเีกล็ดขนาดใหญ (large flake) นมเสียแลว 0.25% + 3 ve-----------------------------------------------------------------หมายเหตุ อยางไรก็ดี มีบางสาเหตุที่นํ้ านมใหผลบวก โดยที่นํ้ านมน้ันไมเสียก็ได (False positive) เชน ในกรณีนมสเตอริไลสอาจใหผลบวก เพราะโปรตีนในนมบางสวนถูกทํ าลาย (denature) ไปในระหวางขบวนการฆาเชือ้ ซึง่ใชความรอนสูงมาก แตนมนั้นก็ยังใชบริโภคได ยกเวนมีเกล็ดขนาดใหญและตกตะกอนแยกชัน้ชัดเจน จึงจะเปนนมเสียจริง

8

บทปฏิบัติการท่ี 1.3การทดสอบโดยการตมในน้ํ าเดือด (Clot-on Boiling)

หลักการ การทดสอบโดยการตมในนํ้ าเดือด มีหลักในการตรวจความคงทนตอความรอนของน้ํ านมดิบ (heatstability) เชนเดียวกับการทดสอบโดยแอลกอฮอลซ่ึงจะทํ าควบคูไปกับการทดสอบโดยแอลกอฮอล ในขณะรับนมเขาโรงงานก็ได หรือจะทดสอบซ้ํ าในกรณีไมแนใจในผลของการทดสอบโดยแอลกอฮอล เพราะการเกิดตะกอนดวยแอลกอฮอล อาจจะเกิดจากสาเหตุอื่น ๆ ก็ได น้ํ านมที่ผานขั้นตอนการตรวจทั้งแอลกอฮอลและ/หรือ การตมในน้ํ าเดือดแลวไมเกิดตะกอน สามารถนํ าเขาแปรรูปได หลักการสํ าคัญคือ นมที่มีสภาพเปนกรดสูง0.25% Lactic หรือนมที่โปรตีนมีเสถียรภาพนอย นมนั้นจะหมดเสถียรภาพไป เม่ือนํ ามาตมผานความรอนเดือดประมาณ 5 นาท ีซึ่งจะเห็นการแยกชั้นของนมวัตถุประสงค 1. นักศึกษาสามารถยืนยันผลท่ีเปนบวกในการตรวจดวยแอลกอฮอลวาเปนน้ํ านมเสีย 2. นักศึกษาเขาใจความหมายของเสถียรภาพของนํ้ านมอุปกรณ - หลอดทดสอบ - เตากับหมอตมนํ้ า (hot plate with bot) - ไปเปท ขนาด 10 มิลลิลิตร - ตะแกรงวางหลอดทดสอบ (rack)วิธีการ 1. นํ าหมอใสนํ้ า 1/3 แลวนํ าไปตั้งบนเตาไฟฟาใหนํ้ าเดือดรออยูแลว 2. ใชไปเปทดูดตัวอยางนม 5 มิลลิลิตร ใสลงไปในหลอดทดสอบ แลววางในตะแกรงหลอดทดสอบ 3. นํ าตะแกรงหลอดทดสอบ วางไวในหมอที่นํ้ ากํ าลังเดือดประมาณ 5 นาที 4. สังเกตการเกิดตะกอน และอานผลเชนเดียวกับวิธีแอลกอฮอล

9

บทปฏิบัติการท่ี 1.4การทดสอบหาปริมาณกรดในน้ํ านม

หลักการ ในน้ํ านมปกติจะมีฤทธิ์เปนกรด โดยจะมีคา pH ประมาณ 6.5-6.7 (เฉล่ีย 6.6) การท่ีมีสภาพเปนกรดเล็กนอยน้ี เน่ืองจากในน้ํ านมจะมีอนุมูลกรดหรือกาซคารบอนไดออกไซดละลายปนอยู โดยธรรมชาติแลวในน้ํ านมดิบมีความเปนกรด (natural acidity) ประมาณ 0.13-0.15% (Lactic) หากจุลินทรียเขาสูในน้ํ านมและมีการเจริญเติบโตมีการเปลี่ยนนํ้ าตาลแลคโตสบางสวนในนมไปเปนกรดแลคติค และกรดทีจ่ลิุนทรียสรางขึ้น (developed acidity) ซ่ึงในการวัดความเปนกรดของนมน้ันเปนผลรวมจาก naturalacidity และ developed acidity รวมเรียกวา titrable acidity !"#$%&'()*+,-./ Natural acidity + Developed acidity = Titrable acidity (0.15% acid) (0.03% acid) (กรดรวม 0.18%) นมดิบที่จะนํ ามาทํ าผลิตภัณฑน้ันไมควรมีกรดสูงเกินไป โดยเฉพาะอยางยิ่ง นมดิบที่จะนํ ามาผลิตเปนนมสดผานความรอนสูง เชน นมสเตอริไลส นมดิบควรมีกรดรวมไมเกิน 0.185% (Lactic) ในกรณีท่ีทํ าพาสเจอไรส นมดิบไมควรมกีรดสูงเกิน 0.2% (Lactic) กรดรวมที่สูงมักจะทํ าใหโปรตีนนมเกิด denatureไดงาย และท ําใหตกตะกอนแข็งตัว อน่ึง นมที่มี developed acidity สูงเปนนมรสไมดี หากนํ าไปผลิตเปนนมสดผานความรอน ผูบริโภคอาจปฏิเสธได แตนมดิบที่มีกรดธรรมชาติสูง เชน สูงถงึ 0.19% กลับเปนกรดท่ีทนความรอนไดดีจลิุนทรียไมชอบเจริญในนมประเภทน้ี การศึกษาความเปนกรดมักนิยมการไตเตรท (titrate) กับดางโซเดียม ไฮดรอกไซด (NaOH)มาตรฐาน และค ํานวณออกมาเปนคาของกรดแลคติควัตถุประสงค 1. นักศึกษาทราบธรรมชาติความเปนกรดของนํ้ านม 2. สามารถวัดความเปนกรดของนํ้ านมได 3. นักศึกษาแยกคุณภาพของนํ้ านมจากระดับความเปนกรดไดอุปกรณ - ไปเปทขนาด 17.6 มิลลิลิตร และขนาด 0.5 มิลลิลิตร - ขวดรูปชมพู (Erlenmeyer flask) ขนาด 200 มิลลิลิตร - บิวเรท ขนาด 50 มิลลิลิตร - โซเดียมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 0.1 N - ฟนอฟธาลีน 1% (เตรียมโดยใชฟนอฟธาลีน,phenolpthalein 1 กรัมละลายในเอทธิลแอลกอฮอร(ethyl alcohol) 95% 50 มิลลิลิตร และนํ ้ากล่ัน 100 มิลลิลิตร)

10

การหาเปอรเซ็นตกรดในนมขาดมันเนย, นมผงขาดมันเนยวิธีการ 1. ใชไปเปท ขนาด 17.6 มิลลิลิตร ดูดนมดิบจํ านวน 17.6 มิลลิลิตร (ประมาณ 18 กรัม) ใสลงไปใน flask 2. ใชไปเปท ขนาด 17.6 มิลลิลิตร ดูดน้ํ ากลั่นจ ํานวน 17.6 มิลลิลิตรใสลงไปใน flask นม แลวเขยาใหเขากันดี 3. ใชไปเปทขนาด 0.5 มิลลิลิตร ดูดฟนอพธาลีน 0.5 มิลลิลิตร ใสลงไปใน flask (หรือใช ฟนอพธาลีน 6-8 หยด) แลวนํ ามาไตเตรทกับโซเดียมไฮดรอกไซด จนถึงจุดยุติ (end point) ซึ่งจะมีสีชมพูคงอยูประมาณ 30 นาท ีจดบันทึกปริมาตรของโซเดียมไฮดรอกไซดที่ใชการคํ านวณ % กรดแล็คติก (% titrable acidity) = ml (0.1N NaOH) x 0.009 x 100 gram of sample(18 กรัม)

การหาเปอรเซ็นตกรดในน้ํ านมดิบม,Yogurtsวิธีที่ 1. ใชไปเปทดูดตัวอยางนม 9 มิลลิลิตร ลงใน flask แลวเติม indicator ฟนอพธาลีน 3-4หยด 2. นํ ามาไตเตรทกับสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด จนไดจุดยุติมีสีชมพูออน บันทึกปริมาตร( ml )ของโซเดียมไฮดรอกไซดท่ีใช

การคํ านวณ

% กรดแล็คติก (% titrable acidity) = ml ของ(NaOH) x 0.009 x 10Vol. Sample

= ml x 0.009 x 100 = ml 9 10

= Vol. NaOH 10 Vol. NaOH = ปริมาณซีซีของ NaOH ที่ใช titrate จนถึงจุดยุติ Vol. Sample = ปริมาณน้ํ านมที่ใช = 9 ml.สมการที่ 1 1. เมื่อ NaOH ท ําปฏิกิริยากับ Lactic acid NaOH + CH3CHOHCOOH ---> CH3CHOHCOONa + H2O (40gm) (90gm) 2. การคํ านวณ กํ าหนดให V เปน ml ของคา NaOH ที่ใช titrate X เปน gm ของนม ที่ใช titrate N NaOH, 1 ml มีดางอยู 1 x 40 x 1 gm 10 10 1,000

11

N NaOH, V ml มีเน้ือดาง NaOH = 1 x 40 x 1 x V gm 10 10 1,000

จากสมการ 1 แสดงวา NaOH 40 gm = Lactic 90 gm

NaOH (1 x 40 x 1 x V) gm = Lactic 90 x 1 x 40 x 1 x V gm 10 1,000 40 10 1,000

นม x gm มี Lactic = 90 x 1 x 40 x 1 x V 40 10 1,000 นม 100 gm มี Lactic = 0.9V X *ปกติเราใชนม 9 ml หรือ 9 gm จะไดสูตรสํ าเร็จคือ % Lactic = 0.9 V = V หรือ = ml 9 10 10

12

บทปฏิบัติการท่ี 2การทดสอบจุลินทรียในน้ํ านม

บทนํ า จุลินทรียในน้ํ านม มีอยูดวยกันหลายชนิด ไดแก แบคทีเรีย, ยีสต และเช้ือรา โดยปกติแลว น้ํ านมที่อยูในเตานม ถือไดวาเปนนมท่ีสะอาด แตหลังรีดออกมาแลว น้ํ านมไดสัมผัสฝุนละอองกับส่ิงแวดลอมตางๆ เชน คนรีด อุปกรณ เคร่ืองมือในการรีด อากาศ เปนตน ท ําใหมีการติดเชื้อจากภายนอก และปกติแลวในน้ํ านมก็มีจุลินทรียอยูในระดับหน่ึงอยูแลวเม่ืออยูในสภาพท่ีเหมาะสม จุลินทรียจะมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็ว ในการตรวจสอบคุณภาพนมเพ่ือรับซ้ือนมของโรงงานน้ัน จะตองมีการตรวจสอบคุณภาพนมเสียกอน การตรวจสอบนี้สามารถทํ าไดโดย 1. การตรวจสอบจุลินทรียโดยออม 1.1 เมทธิลีนบลูรีดักช่ันเทสต (methylene blue reduction test, MBRT) 1.2 การทดสอบรีซาซูริน (resazurin test,RRT) 2. การตรวจสอบจุลินทรียโดยตรง 2.1 การนับจุลินทรียโดยกลองจุลทรรศน (direct microscopic count, DMC) 2.2 การนับจุลินทรียบนจานเล้ียงเช้ือ (standard plate count, SPC) หรือ Agar plate court

13

บทปฏิบัติการ 2.1การทดสอบโดยการเปลี่ยนสีของเมทธิลีน บลู

(Methylene Blue Reduction Test, MBRT)

หลักการ 1. สารละลาย Methylene Blue เมื่ออยูในสภาวะที่มี อ็อกซิเจน,O2 จะมีสีน้ํ าเงิน ดังน้ันเม่ือผสมกับน้ํ านมจึงเห็นเปนสีนํ้ าเงิน เพราะในน้ํ านมก็มี O2 แตในนมก็มีแบคทีเรีย และสวนมากก็เปนพวกท่ีตองการอากาศ O2 ซึง่เมื่อแบคทีเรียขยายตัวเพิ่มจ ํานวนมาก O2 ก็หมดไป จึงทํ าใหสีของ Methylene Blue เปล่ียนเปนสีขาวในสภาพที่ไมม ีO2 น่ันเอง 2. ชั่วโมงการเปลี่ยนของ M.B. จะสัมพันธตรงขามกับจ ํานวนแบคทีเรีย 3. ขอดอยของวิธ ี MBRT คือแบคทีเรียบางชนิด เชน 012 34353678392 :12 0;<7858= จะเปล่ียนสีไดชาและ Somatic cell และเม็ดโลหิตขาว leucocytes จะฟอกสี Methylene Blue ไดเชนกัน ปกติแลวนํ้ านมท่ีสะอาดและถูกหลักอนามัย จะมีเวลาของการเปล่ียนสีมากกวา8 ชั่งโมงขึ้นไป ดวยเหตน้ีุระยะเวลาของการรีดิวซ (reduction-time) จึงถือวาเปนดัชนีชี้บงอยางหนึ่งในการตรวจสอบหาปริมาณของจลิุนทรียในน้ํ านม และใชเปนเกณฑกํ าหนดราคาการซ้ือขายนมสดดวย หรืออาจนํ ามาดัดแปลงพยากรณอายุการเก็บรักษาของนมพาสเจอรไรสได

วัตถุประสงค - นักศึกษาทราบวิธีทดสอบการทดสอบความสะอาดของนํ้ านมโดยวิธีการรีดิวซ สีเมธิลีน บลู และการแบงเกรดนํ้ านม

อปุกรณและสารเคมี - หลอดทดสอบท่ีสะอาดพรอมฝาปด (steriled test tube with screwed cap) - ไปเปทท่ีสะอาด (steriled pipet) ขนาด และ 10 มิลลิลิตร - อางน้ํ าพรอมฝาปด (water bath with cover) ท่ีสามารถปรับอุณหภูมิได - สารละลายเมทธิลีน บลู มาตรฐาน (standard methylene blue solution) เตรียมโดยละลายเมทธิลีน บลู ไธโอไซยาเนต (Methylene blue thiocyanate) จํ านวน 1 เมด็ ในน้ํ ากล่ัน 200 มิลลิลิตร ใน flaskชนิดขนาดบรรจุ 250 มิลลิลิตร ปดจุดยางเก็บใวในตูเย็นไว ใชไดนาน 1 สัปดาห - นาฬิกาจับเวลา (interval timer)วิธีการ 1. ใชไปเปทดูดสารละลายของเมธิลีน บลู 1 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดสอบที่แหง และสะอาดผานการฆาเช้ือแลว 2. ใชไปเปทดูดนํ้ านมตัวอยาง 10 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดสอบดังกลาว พรอมทั้งปดฝา ท ําการกลับหลอดไปมา 3 คร้ัง แลวรีบนํ าเขาไปแชในอางนํ้ าที่ปรับอุณหภูมิไวแลว 37+5oC ปดฝาใหมิดชิดเพื่อปองกันแสงจากภายนอก 3. เร่ิมจับเวลาและสังเกตการเปล่ียนแปลงสีของเมธิลีน บลู ทุกๆชวงเวลา 1/2,1,2,3...7,8 และ 9

14

ชัว่โมง บันทกึผลการเปล่ียนแปลงสีหลัง จาก 30 นาทีแรก และครั้งตอ ๆ ไป ทุก 1 ชั่วโมง ใหกลับหลอดท่ียงัไมเปล่ียนสีอยางเบา ๆ 3 คร้ัง แลวตัดหลอดท่ีเปล่ียนสีแลวออก 4. ท ําหลอดควบคุม (control) ทุกครั้งโดยใชนํ้ านม แตไมใสสารละลายสีหมายเหตุ - การเปล่ียนของ Methylene Blue ในนม ไมจํ าเปนตองเปล่ียนสีท้ังหมดในหลอดทดลอง ถาสวนมากเกินคร่ึง ของหลอดทดสอบเปล่ียนสีแลว ก็ถือวาเปนการเปล่ียนสีสมบูรณแลว - การเทียบเวลาเปล่ียนสีใหถือแตกตางกันทีละ 30 นาทีขึ้นไป เชน 1 ชั่วโมง, 1 ชั่วโมงครึ่ง,2 ชั่วโมง

การอานผลตารางแสดงการแบงเกรดน้ํ านมโดยวิธ ีMBRT----------------------------------------------------------------- อันดับ เกรด ระยะเวลาของการรีดิวซ (ชั่วโมง)----------------------------------------------------------------- 1 ดีมาก ไมเปล่ียนสีใน 8 ชม. 2 ดี เปล่ียนสี 8 ชม. แตไมนอยกวา 6 ชม. 3 พอใช เปล่ียนสี 6 ชม. แตไมนอยกวา 2 ชม. 4 เลว เปลี่ยนสีภายใน 2 ชม.-----------------------------------------------------------------

15

บทปฏิบัติการท่ี 2.2การทดสอบรีซาซูรีน

(Resazurin Test)

หลักการ การตรวจสอบปริมาณจุลินทรียในน้ํ านม โดยการใชหลัการเปล่ียนสี เชนเดียวกับการเปล่ียนสีของเมทธลีิน บลู ริซาซูริน คือ oxidation-reduction indication ที่พัฒนาขึ้นมาใชโดย Ramsdell สีชนิดนี้มีความไวมาก ถึงแมวาจะมีการเปล่ียนศักยของ oxidation-reduction เพียงเล็กนอยจาก แบคทีเรีย, เมด็โลหิตขาวและแสง จะทํ าใหเกิดการเปล่ียนสีของรีซาซูรีนได โดยหลักการแลวการทดลองรีซาซูรีน คือ อัตราความเร็วของการเปล่ียนสี สัมพันธกับจํ านวนจุลินทรียในน้ํ านม ในเวลา 1 ชั่วโมง ซึ่งเมื่อเทียบกับการทดสอบโดย เมทธิลีนบลู และ วิธีการจะใชเวลานอยกวาและใหผลที่ดีพอ ๆ กัน ขั้นตอนปฏิกิริยา reversible chage ขั้น 1 Resazurin ----------------> Resorufin (สีน้ํ าเงิน) (สีชมพ)ู reversible chage ขั้น 2 Resorufin ----------------> Hydroresorufin (สีชมพ)ู (ไมมีสี, ขาว)

วัตถุประสงค - ใหนักศึกษาสามารถทดสอบ ปริมาณจุลินทรียทางออมโดยวิธีรีซาซูรีน และสามารถแบงเกรดของน้ํ านมได

อปุกรณและสารเคมี - หลอดทดสอบ พรอมฝาปด - ไปเปท ขนาด 10 มิลลิลิตร - อางน้ํ า (water bath) ที่ปรับอุณหภูมิ ให พรอมฝาปด - น้ํ ายารีซาซูรีน (resazurin stock solution) เตรียมโดยละลาย เมด็สีรีซาซูรีน 1 เมด็ (11 มิลลิกรัม) ในน้ํ ากล่ันตมเดือด 200 มิลลิลิตร ใสใน flask หรือขวดปดฝา น้ํ ายานี้ควรจะเตรียมเฉพาะที่จะใชเทานั้น - เคร่ืองเทียบสี โลวีบอนด (Lovibond comparater)

วิธีการ 1. ใชไปเปทดูด ริซาซูริน 1 มิลลิลิตร ใชในหลอดทดสอบท่ีสะอาด 2. ใชไปเปทดูดตัวอยางนม 10 มิลลิลิตร ใสลงไปในหลอดน้ํ ายารีซาซูรีนแลวปดฝา ท ําการกลับหลอดไปมา 2-3 คร้ัง และน ําไปวางในอางนํ้ าที่ อุณหภูมิ (98.60F) ปดฝาอางน้ํ าใหมิดชิด

16

3. เม่ือครบเวลา 1 ชั่วโมง น้ํ าหลอดทดสอบมาเทียบสีกับจานสี lovibond comparation แลวอานผลจากจานสีของเคร่ือง

การอานผล----------------------------------------------------------------- สีของตัวอยางนํ้ านม คุณภาพของน้ํ านม การตัดสิน----------------------------------------------------------------- สีน้ํ าเงิน (ไมเปล่ียนสี), Blue ดีมาก ดีมาก สีมวงปนชมพู, Lavender ดี ดี สีชมพู, Pink พอใช นมกํ าลังจะเสีย หรือไดจากโคปวย สีขาว, Colourless เลว นมใชไมได-----------------------------------------------------------------หมายเหต ุ นักศกึษาควรหม่ันตรวจการเปล่ียนสี ทุก 15 นาท ีจนครบ 1 ชั่วโมง จึงอานผลเปรียบเทียบ

17

บทปฏิบัติการ 2.3การนับจุลินทรียโดยกลองจุลทรรศน(Direct Microscopic Count, DMC)

หลักการ การประเมินคาของปริมาณแบคทีเรีย โดยวิธีตรวจสอบดวยกลองจุลทรรศนนี้ใหผลรวดเร็วและสิ้นเปลืองนอย แตตองอาศัยเทคนิคที่ชํ านาญพิเศษ ซ่ึงในระบบของการผลิตนม บางแหงใชในการควบคุมคุณภาพและการแบงเกรดนม เชน การตรวจนับจํ านวนแบคทีเรียแตละเซล หรือกลุมเซล การตรวจนับเมด็เลือดขาว (leucocyte) ในน้ํ านมท่ีเปนโรคเตานมอักเสบ (mastitis) เปนตน ผลการวิเคราะหของวิธี DMCมขีดีจ ํากัดเชนเดียวกับวิธีการนับจุลินทรียในจานเลี้ยงเชื้อ (standard plate count, SPC) ทั้งนี้เพราะการใชปริมาณน้ํ านมนอยมาก ความไมสมํ่ าเสมอของพื้นที่ทํ านมบนแผนสไลด จํ านวนจุลินทรียที่นับไดมากกวาของจริง เพราะเซลลตายใหม ๆ ก็ติดสีได ไมเหมาะกับการนับนมที่สะอาดมาก เชน นมพาสเจอรไรส แตวิธีDMC สามารถสังเกตเห็นรูปรางลักษณะของเซลไดชัดเจน ท ําใหรูถึงแหลงที่มาของแบคทีเรีย เชน ถาพบ=7>9?7@66@6;= เปนลูกโซยาว แสดงวาในน้ํ านมน้ันไดมาจากเตานมอักเสบ เปนตน

วัตถุประสงค - นักศึกษาใหรูวิธีการตรวจสอบจํ านวนจุลินทรียโดยการยอมสี และตรวจนับ ดวยกลองจุลทรรศน

อปุกรณและสารเคมี - กลองจุลทรรศน - แผนสไลด - standard loop 0.4 มิลลิลิตร ปริมาตร 0.01 มิลลิลิตร - ตะเกียงแอลกอฮอล - แอลกอฮอล 95% - Xylol หรือ Xylene - สียอม Loeffler's methylene blue solution เตรียมโดย ชั่ง certified methylene bluechloride จํ านวน 0.6 กรัมใสลง ใน flask ขนาด 250 มิลลิลิตร เติม เอทธิลแอลกอฮอล 95 % จํ านวน100 มลิลิลิตร เขยา 5 นาท ี ใหเขากันดีตั้งทิ้งใวในหองเย็นเวลา 24-48 ช.ม เขยาเปนครั้งคราวจนละลายหมด เก็บใสขวดแลวปดจุกให แนน เก็บใวเปน stock solution สํ าหรับการยอมสีตอไป - หรือใชสียอมสูตรของ Newman-Lampert ซ่ึงผสมใชดังน้ี 1. Methylene blue (certi fied) 1 กรัม 2. Ethyl alcohol 95% 54 ml. 3. Tetrachlorethane (Eastman) 40 ml. 4. Acetic acid (glacial) 6 ml. วธิกีารตวง tetrachdorethane 40 ml. ใส flash ขนาด 250 ml. ตั้ง flash ในน้ํ าอุนหรือบน waterbath (70oC) *ใหระวงัเปลวไฟเพราะเปนสารไวไฟ เสร็จแลวชั่ง Methylene blue 1 กรัม ใสลงใน flashเขยาใหละลายใหหมด และหยอด acetic ทีละหยด จนครบ 6 ml. เขยาใหเขากันใหดีและนํ ามากรองผานกระดาษกรองเบอร whatman No.42 เก็บสีที่ไดในขวดแกวสะอาดไวใชตอไป

18

วิธีการ 1. การเตรียมแผนสไลดตัวอยางนม 1.1 ท ําเครื่องหมายรูปสี่เหลี่ยมพื้นที่ 1 ตารางเซนติเมตร ไวใต แผนสไลดอาจจะใชดินสอเขยีนแกว หรือกระดาษติดไว 1.2 ใช loop ที่ฆาเชื้อแลวแตะนํ้ านมตัวอยาง จํ านวน 1 loop เกลี่ยลงบนพื้นที่สี่เหลี่ยมใหเตม็ และท ําใหเรียบอยางสมํ่ าเสมอ ทิ้งไวใหรอยทา (smear) แหงสักครู 1.3 นํ ามาขจัดไขมันนม โดยแชลงในสารละลาย Xylene นาน 1-2 นาทีแลวทิ้งไวใหแหงที่อุณหภูมิหอง 1.4 เสร็จแลวนํ ามาลางแผนสไลด โดยลางดวยนํ้ าเปลา รินผานสักครูอยางรวดเร็ว แลวสลัดน้ํ าออกและปลอยใหแหง 1.5 นํ าแผนสไลดที่แหงแลวมาจุมในแอลกอฮอล 95% นาน 1-2 นาท ี เพ่ือ fix smear ตากใหแหง 1.6 นํ าสไลดมายอมดวยสี Newman-Lanpert Stain หรือ Loeffler's methylene blue โดยแชในน้ํ ายาสี 1-2 นาที 1.7 ลางสีออกจากแผนสไลดท่ียอมดวยน้ํ าเปลาอีกคร้ัง แลวปลอยแหงไวรอการสองจากกลองจุลทรรศนตอไป 2. การใชกลองจลุทรรศน 2.1 ปรับกลองจุลทรรศน โดยเร่ิมสองดูดวยเลนสวัตถุ (objective lens) ที่มีกํ าลังขยายตํ่ าสุดกอน เมือ่ปรับภาพไดชัดเจนแลวถาตองการดูดวยเลนซท่ีมีกํ าลังขยายสูงขึ้น ใหหมุน nosepiece ไปยังกํ าลังขยายทีต่องการโดยไมตองหมุน coarse adjust-ment แตอาจจะหมุน fine adjustment อีกเล็กนอย 2.1 เมื่อตองการดูดวยเลนซวัตถุชนิดหัว oil-immersion จะใช น้ํ ามนัหยดลงบนแผนสไลด ในขณะทีเ่ลนซวัตถุอยูที่กํ าลังขยายตํ่ าแลวคอยเปลี่ยนกลับมาที่หัว oil-immersion ในขณะที่หมุน coarseadjustment เพื่อใหหัวเลนซลงมาจุมนํ้ ามันบน แผนสไลด ควรหมุนชาๆ และมองดูอยูดานนอกจนเลนซสัมผัสแผนสไลด จึงเริ่มปรับหาภาพดวยเลนซตา (eyes-lens) 3. การนับจํ านวนแบคทีเรีย นํ าแผนสไลดที่เตรียมไวมาตรวจสอบหาแบคทีเรีย โดยการสุมจอภาพ (field) หลาย ๆคร้ัง นับจ ํานวนแบคทีเรียหรือเม็ดเลือดขาวในแตละจอภาพมาเฉลี่ยแลวคูณดวยคา conversion factor ของกลองจุลทรรศนและรายงานผลจํ านวนแบคทีเรียตอ หนวยปริมาตร

การคํ านวณคา conversion factor ตัวอยางเชน กลองจุลทรรศนชนิดน้ีมีเสนผาศูนยกลางของหัว oil-immer-sion เทากับ 0.18 ม.ม. จอภาพจะมีพื้นที่เทากับ iir2 = 3.14 x (0.09)2 = 0.00025 ตร.ซม. ในพื้นที่ 1 ตร.ซม. จะมีจอภาพเทากับ 1 = 4,000 จอภาพ 0.00025เน่ืองจากใช standard loop มีเสนผาศูนยกลาง 4 มม. และมีปริมาตร (น้ํ านม) 0.01 มิลลิลิตร ทาลงบนพืน้ที ่1 ตร.ซม. ซึ่งม ี 4,000 จอภาพ จะทํ าใหแตละจอภาพมีปริมาตรนํ้ านมที่ถูกทาเทากับ 0.01 x 1 มลิลิลิตร/จอภาพ ดังนั้นจ ํานวนที่นับไดใน 4,0001 จอภาพจะตองคูณดวยคา factor 400,000 จึงจะเปนจํ านวนของแบคทีเรียตอปริมาตรนม 1 มิลลิลิตร หรือ

19

นักศกึษาอาจดูเทียบจากตารางเปรียบเทียบ-----------------------------------------------------------------เสนผาศูนยกลางหัว คา factor ที่ใชคูณ จํ านวนคร้ังนับ (fields) ท่ีเหมาะสม oil/m.n----------------------------------------------------------------- 0.21 300,000 60 0.18 400,000 50 0.16 500,000 40 0.15 600,000 30-----------------------------------------------------------------

20

บทปฏิบัติการ 2.4การนับจุลินทรียบนจานเล้ียงเช้ือ

(Standard Plate Count, SPC)

หลักการ การตรวจสอบหาปริมาณแบคทีเรียหรือจุลินทรียในนํ้ านมโดยวิธ ี SPC น้ี เปนการเพาะเล้ียงเช้ือในอาหารเล้ียงเช้ือท่ีเตรียมข้ึน ซึ่งจุลินทรียสวนมากสามารถเจริญเติบโตไดแลวนับจํ านวนโคโลนี (colony)หรือกลุมของโคโลนี น้ํ านมที่มีคุณภาพดีควรจะมีปริมาณแบคทีเรียอยูนอย อยางไรก็ตามวิธีนี้ยังเปนการวัดคาโดยประมาณเทาน้ัน เพราะอาหารเล้ียงเช้ือ อุณหภูมิหรือแฟคเตอรอื่น ๆ ยังไมเหมาะสมสํ าหรับแบคทเีรียทกุชนิด จะมีแบคทีเรียบางชนิดที่เจริญเติบโตไมดีเทาที่ควรหรือตายไป ในระหวางการเลี้ยงเชื้อดังน้ันคานับแบคทีเรียน้ีจึงนอยกวาปริมาณ ที่มีอยูจริงในนํ้ านมแตวิธีน้ีนิยมใชกันมากในงานควบคุมคุณภาพนม เพ่ือเปนดัชนีทางสุขศาสตรของน้ํ านมตอผูบริโภค

วัตถุประสงค - นักศึกษาสามารถตรวจหาปริมาณจุลินทรียในน้ํ านมโดยวิธ ีSPC

อปุกรณและสารเคมี - หลอดทดสอบท่ีสะอาดพรอมฝาปด - ไปเปท ขนาด 1 มิลลิลิตร (steriled graduate pipet) - จานเล้ียงเช้ือท่ีสะอาด (steriled preti disc or plate) - ตูอบ (incubator) - อาหารเล้ียงเช้ือ (nutrient agar) - ตูอบฆาเชื้อ (autoclave)

วิธีการ 1. การเตรียมอุปกรณเคร่ืองแกว ท ําการฆาเช้ือ (sterile) หลอดทดสอบ, ไปเปท และจานเลี้ยงเชื้อโดยนํ าเขาเคร่ือง autoclaveปรับอุณหภูมิ 1200C นาน 1 ชั่วโมงหรือตูอบแหงที่อุณหภูมิ 1800C นาน 4 ชั่วโมง 2. การเตรียมนํ้ าเจือจาง (dilution solution) ตามปกติแลวจะไมใชนํ้ ากลั่นมาใชในการเจือจาง,เพราะจะทํ าใหเซลลแบคทีเรียแตกตายไป ยกเวนกรณีท่ีทํ าอยางรวดเร็ว และรีบเทเพลท แตถาท ํานานควรท ําน้ํ ายาเจือจางเฉพาะ คือ Phosphate buffer การทํ ายาเจือจาง ใหละลาย Potassium Dihydrogen phoshate (KH2PO4) จํ านวน 34 กรัมในน้ํ ากล่ัน 500 ml. และปรับ pH ใหได 7.2 ดวย 0.1 N ของ NaOH และเติมนํ ้ากล่ันอีกใหครบ 1 ลิตร จากนั้นนํ าไปฆาเชื้อที่ 121oC 15 นาท ีและเก็บรักษาไวที่ตูเย็น 3. การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (nutrient agar) ช่ังอาหารเล้ียงเช้ือละลายในน้ํ ากล่ันท่ีผานการฆาเช้ือแลว 1 ลิตร ดังน้ี Pancreatia digest of casein หรือ Casitone หรือ Trypticase, B123 5 กรัม Yeast extract, B127 2.5 กรัม

21

Dextrose (glucose) 1 กรัม Agar, bacteriological grade 15 กรัม น้ํ ากล่ัน 1,000 ซีซี. pH 7.0 นํ าสวนผสมของอาหารเล้ียงเช้ือน้ี มาละลายในการตมใหรอนหรือนํ าเขาเคร่ือง autoclave เพ่ือฆาเชือ้ทีอ่าจปะปนอยูในอาหารเหลานี้แลวเก็บไวใชในตูเย็น เมือ่ตองการใชสามารถนํ ามาหลอมเหลวใหมที่อุณหภูมิ 450C กอนเทลงในจานเล้ียงเชื้อ การผสมสารลายแตละครั้งควรใชใหหมดภายใน 1 สัปดาหปจจุบนัสามารถซ้ืออาหารวุนสํ าเร็จรูปของบริษัทฯ มาละลายแลวใชไดเลย โดยไมตองยุงยากการเตรียมก็ได 4. การเพาะเช้ือตัวอยางนม (inoculation) 4.1 ท ํา Blank โดยการดูดน้ํ าเจือจาง 1 มิลลิลิตร ลงใน จานเลี้ยงเชื้อ เติม agar ทับลงแลวปดฝาเอียงจานเล้ียงเช้ือไปรอบ ๆ ทุกทิศทางให agar ผสมเขากันดี 4.2 ท ําการเจือจางน้ํ านมตัวอยาง (dilution technique) โดยการไปเปทน้ํ านมท่ีผสมกันดีแลว 1มลิลิลิตร ลงในหลอดน้ํ าเจือจาง 9 มิลลิลิตร เขยาใหผสมเขากัน เขียนเครื่องหมายหลอดA 1:10 หรือ 10-1เทา) และใชไปเปทอันใหมดูดน้ํ านมจากหลอดA 1 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดน้ํ าเจือจาง 9 มิลลิลิตร เขยาใหผสมเขากัน เขียนเครื่องหมายหลอดB (1:100หรือ10-2 เทา) ในทํ านองเดียวกันจะไดความเขมขน 10-3, 10-4หรือ 10-5 เทา ตามลํ าดับ แลวแตความตองการโดยคาดวานํ้ านมมีแบคทีเรียมากหรือนอยเทาใดและควรใหคานับโคโลนีท่ีเกิดข้ึนใน plate แตละอันอยูในชวง 30-300 โคโลนี----------------------------------------------------------------- อัตราเจือจางที่ใชชนิดนม ------------------------------------------------ วิธีหาแบคทีเรียทั่วไป หา coliform-----------------------------------------------------------------นมดิบ 1:100 , 1:1,000 , 1:10,000 1:10, 1:100, 1:1,000 (10-2) (10-3) (10-4)นมพาสเจอรไรส 1:10 , 1:100 , 1:1,000 1:1, 1:10, 1,100-----------------------------------------------------------------หมายเหต ุ: ในทางกฎหมายนมที่ผานการฆาเชื้อแลวไมควรมีจํ านวนแบคทีเรียเกิน 50,000 colony/ ml. 4.3 การเพาะเช้ือลง จานเพาะเชื้อ จะใช ไปเปท ดูดน้ํ านมจาก dilution ตางๆ ที่ท ําไว จํ านวน 1มลิลิลิตร ลงในจานเลี้ยงเชื้อ โดยวิธีการปลอดเชื้อ คือ คอย ๆ เปดฝาข้ึนเล็กนอยแลวสอดปลายไปเปทเขาไดและเท agar ประมาณ 12-15 ml. ทับลงทันทีแลวปดฝาเอียงจานเลี้ยงเชื้อไปรอบๆ ใหผสมเขากัน นํ าเขาอบชื้นที่อุณหภูมิ 320C นาน 48 ชั่วโมง ควรกลับจานเล้ียงเช้ือลงใหสวนบนของน้ํ านมอยูบน agar 4.4 เม่ือครบ 48 ชั่วโมง แลวนํ าออกมานับจ ํานวนโคโลนีโดยใชเครื่อง (colony counter) และรายงานผลในหนวยของโคโลนีตอมิลลิลิตรของน้ํ านม (colony/ml.)

22

ตารางแสดง คุณภาพของนมดิบโดยการนับจุลินทรียโดยกลองจุลทรรศนและบนจานเลี้ยงเชื้อ-----------------------------------------------------------------คุณภาพนม DMC/มิลลิลิตร SPC/มิลลิลิตร-----------------------------------------------------------------ดีมาก - <200,000ดี <500,000 200,000- 1,000,000พอใช 500,000- 4,000,000 1,000,000-5,000,000ไมดี 4,000,000-21,000,000 >5,000,000เลว >20,000,000-----------------------------------------------------------------DMC = direct microscopic countSPC = standard plate count(Warner, 1976)