บทที่ 3

วิธีดําเนินการวิจัย วัสดุ อุปกรณ สารเคม ี 1. วัตถุดิบท่ีใชในการวิจัย

1.1 ผักตบชวา 1.2 กกรังกา 2. อุปกรณท่ีใชในการวิจัย 2.1 กรวยกรอง 2.2 กรวยแยก 2.3 คอลัมน (column)

2.4 ขวดกนกลม (round bottom flask) 2.5 กระจกนาฬิกา (watch glasses) 2.6 ขวดแกวขนาดเลก็ (vial) 2.7 ขวดปรบัปริมาตร (volumetric flask) 2.8 ขวดรูปชมพู(elrenmayer flask) 2.9 แทงแกวคน (stirring rod) 2.10 บีกเกอร (beaker) 2.11 ปเปตต (pipette) 2.12 หลอดทดลอง (test tube) 2.13 หลอดหยด (dropper) 2.14 อุปกรณหั่น เชน มีด กรรไกร 3. สารเคมีท่ีใชในการวิจัย 3.1 ซิลิกาเจล (silica gel)

3.2 ไดคลอโรมีเทน (dichloromethane) 3.3 เมทานอล (methanol) 3.4 เอทานอล (ethanol) 3.5 เฮกเซน (hexane)

26

4. เคร่ืองมือท่ีใช 4.1 เครื่องระเหยสุญญากาศ 4.2 ตูอบชนิดควบคุมอุณหภมูิ

4.3 เครื่อง autoclave 4.4 ชุดเครื่องกลั่นสาร วิธีการทดลอง 1. การสกัดสารสกัดหยาบ 1.1 การสกัดสารสกัดหยาบจากราก และ ใบ ของผักตบชวา

เก็บผักตบชวามาทําการแยกสวนของ ใบ และราก นํามาลางน้ําใหสะอาด แลวนํามาผึ่งลมใหแหง ทําการหัน่ใหเปนชิ้นเลก็ๆ ช่ังน้ําหนักใหไดประมาณ 5 กิโลกรัม จากนั้นนํามาแชในตัวทําละลาย ที่เตรียมไว โดยแช เรียงลําดับความมีขัว้นอยไปหาความมีขั้วมาก ดังนี ้ คือ เฮกเซน ( hexane ) , ไดคลอโรมีเทน (dichloromethane) , เอทานอล (ethanol) และเมทานอล (methanol) โดยมวีิธีการโดยละเอียดดังนี้ คือ เทสารละลาย เฮกเซน จนทวม ปดฝาทิ้งไวเปนเวลา 5 วัน นํามากรองเอาเฉพาะสวนที่เปนสารละลาย นําไประเหยที่เครื่องระเหยสญุญากาศแบบหมุน (rotary vaccuum evaporator) ที่อุณหภูมิ 40-50 องศาเซลเซียส จนกระทั่ง crude ที่ไดแหงสนิท จะไดสารสกัดหยาบ (crude)ในชั้นเฮกเซน จากนั้นเทสารละลายไดคลอโรมีเทน ลงในกากพืชที่เหลือจนทวม ปดฝาทิ้งไวเปนเวลา 5 วนั นาํมากรองเอาเฉพาะสวนทีเ่ปนสารละลาย นําไประเหยที่เครื่องระเหยสญุญากาศแบบหมุน จะไดสารสกัดหยาบในชั้นไดคลอโรมีเทน จากนั้นเทสารละลายเอทานอล ลงในกากพืชที่เหลือจนทวม ปดฝาทิ้งไวเปนเวลา 5 วัน นํามากรองเอาเฉพาะสวนทีเ่ปนสารละลาย นําไประเหยที่เครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน จะไดสารสกัดหยาบในชั้นเอทานอล จากนั้นเทสารละลายเมทานอล ลงในกากพืชที่เหลือจนทวม ปดฝาทิ้งไวเปนเวลา 5 วนั นํามากรองเอาเฉพาะสวนที่เปนสารละลาย นําไประเหยที่เครื่องระเหยสุญญากาศแบบหมุน จะไดสารสกัดหยาบในชั้นเมทานอล นําสารสกัดหยาบที่ไดในแตละสวนซึ่งใสในขวด vial เพือ่นําไปศึกษาหาสารออกฤทธิ์ตอไป ซ่ึงวิธีการสกัดสวนราก และสวนใบของผักตบชวา แสดงดังภาพที่ 3 และ 4 ตามลําดับ

27

สวนรากของผักตบชวา

Hexane Crude Hexane กากสวนรากของผักตบชวา Dichloromethane Crude Dichloromethane กากสวนรากของผักตบชวา Ethanol Crude Ethanol กากสวนรากของผักตบชวา Methanol Crude Methanol กากสวนรากของผักตบชวา

ภาพที่ 3 ขั้นตอนการสกัดสารสกัดหยาบจากสวนรากของผักตบชวา

28

สวนใบของผักตบชวา Hexane Crude Hexane กากสวนใบของผักตบชวา Dichloromethane Crude Dichloromethane กากสวนใบของผักตบชวา Ethanol Crude Ethanol กากสวนใบของผักตบชวา Methanol Crude Methanol กากสวนใบของผักตบชวา

ภาพที่ 4 ขั้นตอนการสกัดสารสกัดหยาบจากสวนใบของผักตบชวา

29

1.2 การสกัดสารสกัดหยาบจาก ลําตน และ ดอกของกกรังกา การสกัดสารสกัดหยาบจาก ลําตน และ ดอกของกกรังกา ทําเชนเดียวกันกับการสกัดสาร

สกัดหยาบจากผักตบชวา ในขอ 1.1 ซ่ึงแสดงวิธีการสกัดดังภาพที่ 5 และ 6 ตามลําดับ ลําตนของกกรังกา Hexane Crude Hexane กากลําตนของกกรังกา Dichloromethane Crude Dichloromethane กากลําตนของกกรังกา Ethanol Crude Ethanol กากลําตนของกกรังกา Methanol Crude Methanol กากลําตนของกกรังกา

ภาพที่ 5 ขั้นตอนการสกัดสารสกดัหยาบจากสวนตนของกกรังกา

30

ดอกของกกรังกา Hexane Crude Hexane กากสวนดอกของกกรังกา Dichloromethane Crude Dichloromethane กากสวนดอกของกกรังกา Ethanol Crude Ethanol กากสวนดอกของกกรังกา Methanol Crude Methanol กากสวนดอกของกกรังกา

ภาพที่ 6 ขั้นตอนการสกัดสารสกัดหยาบจากสวนดอกของกกรังกา

31

2. การศึกษาฤทธิ์ในการยับยัง้การเจริญของจุลินทรียของสารสกัดจากกกรังกา และผักตบชวา 2.1 Disc diffusion techniques

เปนวิธีที่นยิมใชกันมากในหองปฏิบัติการ เนื่องจากเปนวิธีซ่ึงสามารถปฏิบัติงาย สะดวก และรวดเร็ว รวมท้ังสามารถใหผลที่แนนอนและถูกตอง การทดสอบวิธีนี้ใชหลักการแพร โดยสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่เติมลงบนกระดาษกรอง (filter paper disc) ซ่ึงวางบนผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไดเพาะเลี้ยงจุลินทรียที่ใชในการตรวจสอบไว จะแพรจากจุดเริ่มตนไปในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้น เมื่อระยะทางที่สารแพรออกไปเพิ่มขึ้น ความเขมขนของสารนั้นจะลดลงทําใหเกิดความแตกตางของความเขมขนของสาร ณ จุดตางๆกันรอบแผนกระดาษกรอง ในขณะเดยีวกันจุลินทรียบนผิวของอาหารเล้ียงเชื้อที่ไมถูกยับยัง้โดยสารออกฤทธิ์ ณ ความเขมขนของสารที่จุดใดๆ (ไกลกระดาษกรอง) กจ็ะเจริญและเพิ่มจํานวนขึ้นจนเห็นไดชัด แตบริเวณใกลกระดาษกรองซึ่งมีความเขมขนของสารมากพอที่จะยับยั้งเชื้อได จะไมมกีารเจรญิของเชื้อใหเห็นจึงเกิดเปนโซนใส (inhibition zone) ขึ้น อัตราการแพรของสารออกฤทธิ์ผานไปในอาหารเลี้ยงเชื้อมอิีทธิพลตอขนาดเสนผานศูนยกลางของโซนใส ซ่ึงจะบอกถึงความสามารถของสารที่นํามาทดสอบวาสามารถยับยั้งเชือ้ไดมากนอยเพียงใด ผลการยับยั้ง จุลินทรียวัดไดจากขนาดของโซนใสโดยขนาดเสนผานศูนยกลางของโซนใสจะแปรผกผันกับคาความเขมขนต่ําสุดของสารซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย (Minimal Inhibitory Concentration หรือ MIC) 2.1.1 การเตรียมแบคทีเรียที่ใชทดสอบ

ใชแบคทีเรียที่มีอายุไมเกิน 24 ช่ัวโมง และความเขมขนของเชื้อที่ใชตองในปริมาณที่เหมาะสม ซ่ึงโดยทัว่ไปจะนยิมใชเชื้อปริมาณ 105 – 107 เซลลตอมิลลิลิตร วิธีการทํามีดังตอไปนี ้

1) เขี่ยโคโลนีของเชื้อที่ตองการทดสอบที่เพาะเลี้ยงไวในจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอายุประมาณ 24 ช่ัวโมง มาประมาณ 2-3 โคโลนี นํามาใสในอาหารสาํหรับเลี้ยงเชื้อที่เตรียมไวในหลอดทดสอบปริมาตรหลอดละ 2 มิลลิลิตร

2) นําหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อในขอ 1) ไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซียลเซียส เปนเวลา 24 ช่ัวโมง

3) นําเชื้อจากขอ 2) มาเจือจางใหไดจํานวนแบคทีเรีย 105 – 107 เซลลตอมิลลิลิตร โดยเจือจางดวยอาหารเลี้ยงเชื้อ แลวนําไปวัดความขุนใหไดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร เทากับ 5 2.1.2 การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

ในการทดสอบนี้จะใชอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งโดยวธีิ Agar diffusion โดยใชอาหาร Plate count agar (PCA)

32

2.1.3 การศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งจุลินทรยี 1) เขียนทีจ่านอาหารแข็ง เพื่อระบุตําแหนงที่จะวางแผนกระดาษกรองขนาดเสน

ผานศูนยกลาง 6 มิลลิลิตร ทั้งหมด 4 ตําแหนง ดังภาพที่ 7 ภาพที่ 7 ตําแหนงที่จะวางแผนกระดาษกรองขนาดเสนผานศูนยกลาง 6 มิลลิลิตร ทั้งหมด 4 ตําแหนง

2) วิธีเพาะแบคทีเรียลงบนอาหารทดสอบ ใชไมพันสาํลีที่ปราศจากเชื้อชุบ

แบคทีเรียที่ปรับความขุนไวโดยมีปริมาณเชือ้ประมาณ 105 – 107 เซลลตอมิลลิลิตร แลวบิดใหแหงพอหมาด ๆ กับขางหลอดทดลอง จากนั้นทาํการ swab ใหทั่วบนผิวอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยลากเสนผานศูนยกลาง จานเพาะเลี้ยงเชือ้แลวปายเปนเสนตั้งฉากผานเสนที่ลากไวถ่ี ๆ ใหทั่วผิวหนาแลวหมุนจานเพาะเชื้อ ไปประมาณ 60 องศา แลวปายเชนกันทําเชนนี้ 3 คร้ัง เพื่อใหแบคทีเรียกระจายสม่ําเสมอทั่วผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อ ทิ้งไวประมาณ 3 - 5 นาทีเพื่อใหสวนผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อแหง

3) การทดสอบสารสกัด โดยใชกระดาษกรองปราศจากเชื้อขนาดเสนผานศูนยกลาง 6 มลิลิเมตร ใชปากคีบ (forceps) คีบกระดาษวางบนจานเพาะเชื้อที่เตรียมไวขางตนแลวกดเบา ๆ มาวางที่ตําแหนงที่กําหนดไว

4) หยดตัวอยางสารสกัดกก และผักตบชวาจากสวนตางๆ เชน ตน ดอก ใบ และ ราก ที่สกัดดวยตัวทําละลายตางๆ ที่จะทดสอบวางใสลงแผนกระดาษกรอง คนละตาํแหนงตามลําดับ ตําแหนงละ 10 ไมโครลิตร รวมทั้งหยดตวัทําละลายนัน้ๆ เปน control โดยใช automatic pipette ที่ปราศจากเชื้อ เสร็จแลวนําจานเพาะเชื้อที่นีไ้ปเลี้ยงที่ 35 - 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16 – 18 ช่ัวโมง แลวนํามาวัดเสนผานศูนยกลาง ของบริเวณที่ไมมีแบคทีเรียขึ้น (inhibition zone) โดยวดัหนวยเปนมิลลิเมตร

สารสกัด

ตัวทําละลาย

สารสกัด สารสกัด

สารสกัด

33

5) การอานผล เมื่อบมเชื้อจนครบ 16 -18 ช่ัวโมง แลว ใหวัดขนาดของโซนใสที่เกิดขึน้ โดยวัด

จากขอบโซนขางหนึ่งไปยังขอบโซนอีกขางหนึ่ง โดยใหผานจุดศนูยกลางของ paper disc ดวย บนัทึกหนวยเปนมิลลิเมตร (ขอบโซนที่วัดตองเปนโซนที่ชัด ถามีเชื้อขึ้นบางๆ ใหถือวาบริเวณนั้นยังมีปริมาณยาหรือสารสกัดชีวภาพสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได ขนาดของโซนใส (Inhibition zone; มิลลิลิตร) = (ขนาดเสนผานศูนยกลางของ paper disk และ โซนใส

ของเชื้อ) ลบดวย ขนาดเสนผานศูนยกลางของ paper disk ( 6 มิลลิลิตร)

อัตราสวนของ inhibition zone = ขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใสของเชื้อ

ขนาดเสนผานศูนยกลางของ negative control 2.2 Broth Dilution Technique

2.2.1 ความเขมขนต่ําสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ Minimal inhibitory concentration (MIC)

การทดสอบหาความไวของแบคทีเรียตอยาปฏชีิวนะโดยวิธีนี้เปนวิธีที่ละเอียดวิธีหนึ่ง ซ่ึงไดจากการทดสอบวิธีนี้จะทําใหทราบทั้ง MIC และ MLC (Minimal lethal concentration) ของยาปฏิชีวนะนั้นๆ กับแบคทีเรียซ่ึงทําการทดสอบหลักการโดยทัว่ไปของวิธีนี้คือ การเลี้ยงแบคทีเรียที่ตองการทดสอบในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลวซ่ึงมียาปฏิชีวนะในปรมิาณตางๆกันผสมอย ูดวย และสังเกตการเจรญิของแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อซ่ึงมียาปฏิชีวนะในปรมิาณตางๆ กนั การทดสอบหาความไวของแบคทีเรียตอยาปฏิชีวนะโดยวิธี broth dilution technique นี้สามารถทําไดทั้ง macro broth dilution technique และ micro broth dilution technique ในที่นี้ทําการทดสอบโดยวิธี Macro broth dilution technique

1) การเตรียมแบคทีเรียที่ใชทดสอบ แบคทีเรียที่ใชในการทดสอบตองอยูในระยะที่เซลทุกๆ เซลพรอมที่จะ

เจริญเติบโตหรือแบงเซลลได ควรเปนแบคทีเรียที่มีอายไุมมากนกั โดยท่ัวไปใชแบคทีเรียที่มีอายไุมมากกวา 24 ช่ัวโมง วิธีการเตรียมมีดังตอไปนี้

(1) เขี่ยโคโลนีของเชื้อที่ตองการทดสอบที่เพาะเลี้ยงไวในจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอายุประมาณ 24 ช่ัวโมง เขี่ยโคโลนีมาประมาณ 4 - 5 โคโลนี นํามาใสในอาหารเหลวที่เหมาะสม เขยาเพื่อใหเชือ้กระจายตัวออกจากกัน

34

(2) นําหลอดอาหารเลี้ยงเชือ้ในขอ (1) ไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นานประมาณ 3 - 4 ช่ัวโมง โดยเจือจางดวยอาหารเลี้ยงเชื้อ แลวนําไปวัดความขุนใหไดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร เทากับ 5 2) การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

ในการทดสอบนี้จะใชอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเหลว โดยใชอาหารเลีย้งเชื้อ Trypticase soy broth 3) การเตรียมสารสกัดกก และผักตบชวา ที่ใชในการทดสอบ โดยนําสารที่สกัดไดทุกตัวอยางนํามาละลายในตวัทําละลายนัน้ๆใหไดความเขมขน 100 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร

4) การปฏิบัติการทดสอบการศึกษาความไวตอสารสกัดกก และผักตบชวา ดวยวิธี Macro broth dilution technique

(1) นําหลอดทดลองขนาด 13 x 100 มิลลิเมตร ซ่ึงผานการฆาเชื้อและทําใหแหง จํานวน 12 หลอด เขียนหมายเลขกํากบัไวที่หลอด

(2) ใชปเปตดดูอาหารเลี้ยงเชื้อ (broth) ใสลงในหลอดที่ 2 - 12 หลอดละ 1 มิลลิลิตร

(3) ใชปเปตดดูสารสกัดลงในหลอดที่ 1 และ 2 หลอดละ 1 มิลลิลิตร ผสมสารในหลอดที่ 2 ใหเขากนั

(4) ใชไปเปตดูดสารในหลอดที่ 2 หลอด จํานวน 1 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดที่ 3

(5) ทําซ้ําในขอ (4) ไปจนถึงหลอดที่ 11 ดงัแผนภาพที่ 8 (เปลี่ยนไปเปตทุกคร้ังที่เปลี่ยนหลอด) เมื่อผสมสารละลายในหลอดที่ 11 ใหเขากันไดดแีลวใหใชไปเปตดูดสารละลายทิ้ง ไป 1 มิลลิลิตร หลอดที่ 12 จะมีแตอาหารเลี้ยงเชื้อเพียงอยางเดยีวไมมีสารสกัด จึงใชเปน positive control

(6) เติมเชื้อจุลินทรียที่เตรียมไวลงไปในทุกหลอด จํานวนหลอดละ 1 มิลลิลิตร ดังแผนภาพที่ 8

(7) นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 16 - 18 ช่ัวโมง 5) การอานผลการหา Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

เมื่อบมเชื้อจนครบ 16 -18 ช่ัวโมง แลว ใหสังเกตหลอดสดุทายที่ไมม ีจุลินทรียเจริญหรืออาหารเลี้ยงเชื้อในหลอดไมขุน อานปริมาณของสารทดสอบของหลอดนี้เปนคา MIC ของ บันทึกหนวยเปนมิลลิกรัมตอมิลลิเมตร

35

คา MIC คือ คาความเขมขนที่ต่ําที่สุดของยาปฏิชีวนะที่ใชทดสอบที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อทดสอบไดอยางสมบูรณ

ภาพที่ 8 แผนภูมิสรุปขั้นตอนการปฏิบัติสําหรับ Macro broth dilution technique

2.2.2 ความเขมขนต่ําสุดที่สามารถฆาไดเชื้อ Minimal bactericidal concentration

(MBC) (หมวดจุลชีววิทยา, 2547) จากการหาคาความเขมขนต่ําที่สุดที่ทําใหเชื้อไมเจริญในอาหารเหลวนั้น สามารถ

นํามาหาคา MBC ได โดยนําหลอดที่ทําการทดสอบจากการหาคา MIC ที่ไมมีความขุนทุกหลอดไป spread plate บนอาหาร trypticase soy agar ถาความเขมขนของสารสกัดที่สามารถฆาเชื้อไดกจ็ะไมพบการเจริญของเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ แตถาเชื้อไมตายกจ็ะพบการเจริญของเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ดังภาพที่ 9

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml ทิ้ง 1 ml

1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Positive control

ปริมาณอาหารเลี้ยง 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 เชือ้เหลว (มล.) ความเขมขนของ 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.08 0 สารสกัด (มก/ มล.) จํานวนเชือ้ทดสอบ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ที่มีปริมาณเชื้อ 105 – 107เซลลตอมิลลิลิตร

1 ml 1 ml

Working solution ของสารสกัด ความเขมขน 100 มิลลิกรัม/มล.

36

ภาพที่ 9 แผนภูมิสรุปขั้นตอนการปฏิบัติสําหรับ Macro broth dilution technique และการหาคา MBC