รายงานการวิจัย...

รหสโครงการ SUT3-305-51-24-05

รายงานการวจย

การใชวสดเหลอทงจากอตสาหกรรมประมง เพอผลตสารเสรมคณภาพเจลและเพปไทดทยบยง ACE และตานออกซเดชน

(Utilization of fishery byproducts for gel-enhancing agent and ACE inhibitory and antioxidant peptides)

ไดรบทนอดหนนการวจยจาก

มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว





คณะผวจย

หวหนาโครงการ

รศดร จรวฒน ยงสวสดกล สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร

ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ พศ 2551-2552 ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

สงหาคม 2556

ก

กตตกรรมประกาศ โครงการวจยนไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ 2551-2552 ผวจยขอขอบคณ คณศรพร ศรองคณากล คณพรพมล สงขเพม และคณชมภนช วรยะพนธ ทไดปฏบตงานวจยจนส าเรจลลวง ขอขอบคณ คณสรญญา ปองจนลา และคณศศธร แกวเผอก ทชวยจดท ารปเลมของรายงาน ขอขอบคณ คณศภกาญจน บญอย ทชวยจดท าเอกสารการเบกจายและจดท าบญชดวยความเรยบรอย

ข

บทคดยอ วตถประสงคของงานวจยคอการเพมมลคาวสดเหลอทงจากอตสาหกรรมประมง โดยศกษา

การใชประโยชนโปรตนจากน าลางเนอปลา การผลตเพปไทดทมคณสมบตยบย งเอนไซมทยอยสลายเอนจโอเทนซน (Angiotensin converting enzyme ACE) และโปรตนไฮโดรไลเสททมคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระจากวสดเหลอทงของกระบวนการผลตซรมรวมถงกาง กระดก และ เศษหนง และวสดเหลอทงจากกระบวนการก าจดเนอเยอเกยวพน โดยใชโปรตเนสแหลงใหมทผลตจากแบคทเรยสายพนธ Virgibacillus sp และโปรตเนสทางการคาคอ เพปซน ทรปซน และ อลคาเลส จากการศกษาพบวาโปรตนทเกบเกยวไดจากน าลางเนอปลาไนมคณสมบตยบย งเอนไซมทรปซนและสามารถเพมคาเจลของซรมปลาทรายแดงเมอเตมในระดบ 018 และบมท 40 องศาเซลเซยส กอนการใหความรอน และยงสามารถลดการเสอมสลายของกลามเนอเนองจากโปรตเนส จากการท าบรสทธพบวามสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 ซงเปนไกลโคโปรตน มขนาดโมเลกล 40 และ 55 กโลดาลตน โดยสารยบย งบรสทธมความจ าเพาะตอทรปซนและสามารถลดการยอยสลายของมยโอซนสายหลกของซรมปลาตาหวานไดอยางมประสทธภาพ

โปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดก และเศษหนงทผานการยอยโดยโปรตเนส จากแบคทเรยสายพนธ Virgibacillus sp SK33แสดงคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระสงกวาโปรตนไฮโดรไลเสทจากเนอเยอเกยวพนจงน ามาแยกสวนดวยเทคนคโครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจลบ(anion exchange chromatography) และแยกตามขนาด (size exclusion chromatography) หลงจากแยกดวยเทคนคโครมาโทกราฟตามขนาดไดเพปไทด 3 สวนคอ B1 B2 และ B3โดยเพปไทด B3 มความสามารถในการจบกบอนมล ABTS และมคณสมบตรดวซเหลกสงสด ในขณะทสวน B2 และ B3 มความสามารถเดนในการจบกบเหลกและอนมลไฮดรอกซล นอกจากน สวนเพปไทดในสวน B1 และ เพปไทดสงเคราะห (FLGSFLYEYSR) ทไดมาจากการวเคราะหล าดบเพปไทดจากสวน B3 มความสามารถในการจบอนมลอสระทเกดจากไฮโดรเจนเปอรออกไซดภายในเซลล HepG2

การเปรยบเทยบไฮโดรไลเสทของคอลลาเจนหนงปลานลและหนงปลาดกบกอยจากการยอยดวยเพปซน อลคาเลส ทรปซนและโปรตเนสจาก Vigibacillus sp SK39 พบวาไฮโดรไลเสทจากเพปซนมความสามารถยบย งกจกรรมของ ACE ไดสงสดทระดบการยอย (Degree of hydrolysate) 30 ผลจากการแยกไฮโดรไลเสทดวยการกรองผานเยอกรอง สามารถจ าแนกไดสามสวนคอ สวนทมขนาดมากกวา 30 กโลดาลตน ขนาดระหวาง 5-30 กโลดาลตน และ ขนาดนอยกวา 5 กโลดาลตน ไฮโดรไลเสททมขนาดนอยกวา 5 กโลดาลตน แสดงกจกรรมยบย ง ACE สงทสด และความเขมขนทยบย งกจกรรมของ ACE 50 (IC50) มคาเทากบ 901plusmn004 ไมโครกรม (สมมลไกลซน) ตอมลลลตร เพปไทดหลงผานการแยกตามขนาดโมเลกลสามารถยบย งกจกรรมของ ACE ได 7206 ทระดบความเขมขน 02 ไมโครกรม สมมลไกลซน ผลการวเคราะหดวย LC-Tandem mass spectrometry

ค

ของเพปไทดทมกจกรรมยบย ง ACE สงสดประกอบดวยกรดอะมโนอารจนนและไกลซนทปลายสายคารบอกซลของเพปไทด (C-terminus) และกรดอะมโนดานปลายสายอะมโน (N-terminus) สวนมากประกอบดวยกรดอะมโนทมโซขางเปนคารบอนสายตรง (Aliphatic amino acid)

การศกษานแสดงใหเหนวาวสดเหลอทงจากอตสาหกรรมประมงสามารถน ากลบมาใชประโยชนไดโดยอาศยเทคโนโลยการเกบเกยวและเอนไซมทเหมาะสมเพอใชผลตสารยบย งโปรตเนส หรอเพปไทดทมสมบตยบย งกจกรรมของ ACE และสารตานอนมลอสระ ซงอาจสามารถน าไปพฒนาเปนผลตภณฑอาหารเสรมหรอผลตภณฑโภชนเภสชไดตอไป

ง

Abstract Objectives of this study were to various approaches to fully utilize byproducts from fishery

industry with emphasis on wash water of fish mince collagen hydrolysates with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity and protein hydrolysates with antioxidant properties from surimi wastes including frame bone and skin (FBS) and refiner discharge (RD) using proteinases from a novel source Virgibacillus sp and commercial proteinases pepsin trypsin and Alcalase It was found that crude sarcoplasmic proteins obtained from common carp mice wash water showed inhibitory activity toward trypsin and increased textural properties of threadfin bream surimi particularly those set at 40oC when added at 018 In addition it reduced proteolysis caused by endogenous proteinases of threadfin bream surimi Based on protein purification scheme the protein exhibiting inhibitory activity was identified to be the carp α-1 proteinase inhibitor which was glycoprotein with molecular weight of 40 and 55 kDa The purified inhibitor exhibited inhibitory activity toward trypsin and reduced proteolysis of myosin heavy chain of bigeye snapper surimi

FBS protein hydrolysates prepared from Virgibacillus sp SK33 proteinase showed higher antioxidant than RD and was therefore fractionated using anion exchange and size exclusion chromatography (SEC) Three fractions mamely B1 B2 and B3 were obtained after SEC Fraction B3 exhibited the highest antioxidant activity base on 22rsquo-azinobis (3-wthyl-benzothiazoline-6-sulfonate (ABTS) scavenging activity and ferric reducing antioxidant power (FRAP) value while metal chelation and hydroxyl radical scavenging ability were distinctive in fraction B2 and B3 Fraction B1 and a synthetic peptide selected from the pooled de novo peptides of fraction B3 FLGSFLYEYSR had a cellular radical scavenging effect when HepG2 cells were treated with hydrogen peroxide (H2O2)

Collagen hydrolysates from skin of tilapia (Oreochromis niloticus) and hybrid catfish (C macrocephalus x C gariepinus) were obtained using pepsin Alcalase trypsin and proteinase from Virgibacillus sp SK39 Pepsin produced peptides exhibiting the highest ACE inhibitrory activity with a degree of hydrolysis (DH) of 30 The hydrolysate of hybrid catfish skin was fractionated into 3 fractions MWgt30 kDa 5-30 kDa and lt5 kDa using cross-flow ultrafiltration The fraction with MW lt5 kDa showed the highest ACE inhibitory activity with IC50 of 901plusmn004 μg (glycine equivalent)ml The pooled fraction after gel filtration showed ACE inhibitory activity at 7206 at 02 μg glycine equivalent LC-Tandem mass spectrometry of the pooled fraction revealed that

จ

peptides exhibiting ACE inhibitory activity were composed of arginine and lysine at C-termini while N-termini contrined aliphatic amino acids

This study revealed that byproducts from fishery industry could be fully utilized using proper recovery and enzyme technology to obtain proteinase inhibitor or bioactive peptides with ACE inhibitory and antioxidant activity which could be developed to be functional ingredients or nutraceutical products

ฉ

สารบญเรอง หนา กตตกรรมประกาศhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ก บทคดยอภาษาไทยhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ข บทคดยอภาษาองกฤษhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ง สารบญเรองhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ฉ สารบญตารางhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ช สารบญภาพhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip ซ บทท 1 บทน าhelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ความส าคญและทมาของปญหาการวจยhelliphelliphelliphellip 2 การทบทวนเอกสารทเกยวของhelliphelliphelliphellip 4 วตถประสงคของโครงการวจยhelliphelliphelliphellip 27 ขอบเขตของการวจยhelliphelliphelliphellip 27 ประโยชนทไดรบจากการวจยhelliphelliphelliphellip 27

บทท 2 วธด าเนนการวจยhelliphelliphelliphellip 28 21 สารยบย งเอนไซมโปรตเนสจากปลา 29 22 สมบตการยบย งกจกรรม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสท 34 23 เพปไทดตานออกซเดชนจากวสดเหลอทงจากโรงงานซรม 37

บทท 3 ผลการวจยhelliphelliphelliphellip 43 31 สารยบย งเอนไซมโปรตเนสจากปลา 44 32 สมบตการยบย งกจกรรม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสท 53 33 เพปไทดตานออกซเดชนจากวสดเหลอทงจากโรงงานซรม 62

บทท 4 สรปและขอเสนอแนะhelliphelliphelliphellip 69 บรรณานกรมhelliphelliphelliphellip 71 ประวตนกวจยhelliphelliphelliphellip 86

ช

สารบญตาราง หนา ตารางท 11 เพปไทดทมสมบตยบย งเอนไซม ACE ทผลตจากพช 14 ตารางท 12 เพปไทดทผานการท าบรสทธและมคณสมบตในการตานสารอนมลอสระจาก

แหลงตางๆ

20 ตารางท 31 การท าบรสทธของสารยบย งเอนไซมทรปซนจากโปรตนซารโคพลาสมกของปลาไน 48 ตารางท 32 ผลการระบชนดของโปรตนโดย LC-MSMS 40 ตารางท 33 ผลการยบย งโปรตเนสชนดตางๆ โดยสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไน 52 ตารางท 34 ความสามารถในการยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE ของเพปไทดคอลลาเจนจากหนง

ปลานลและหนงปลาดกบกอย

54 ตารางท 35 ความสามารถในการยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจาก

หนงปลาดกบกอยทผานการแยกขนาดดวยอลตราฟลเตรชน

56 ตารางท 36 ล าดบกรดอะมโนของเพปไทดทยบย ง ACE จากการวเคราะหแบบ de novo peptide

sequencing

61 ตารางท 37 ความสามารถในการตานอนมลอสระและผลผลตของโปรตนไฮโดรไลเสทจากกระดก

กาง และเศษหนงปลาทรายแดงและตวอยางหลงแยกดวยคอลมน DEAE-Sephacel

64 ตารางท 38 ความสามารถในการตานอนมลอสระของโปรตนไฮโดรไลเสทจากกระดก กาง

และเศษหนงปลาทรายแดงทผานการแยกดวยคอลมน Superdex 30 prep size exclusion และผลผลตทได

64 ตารางท 39 ล าดบกรดอะมโนของโปรตนไฮโดรไลเสททผานการแยกดวยเทคนค Size exclusion

chromatography จากการวเคราะหดวยเทคนค LC-MSMS

66 ตารางท 310 ความสามารถในการจบกบอนมล ABTS (mM Trolox) ของเพปไทดสงเคราะหแตละชน

และเพปไทดผสมทไดมาจากการวเคราะหล าดบเพปไทดจากสวน B3 ทความเขมขนสดทาย 5 มลลกรมมลลลตร

67

ซ

สารบญรปภาพ หนา รปท 11 Hypertensive mechanism of angiotensin 9 รปท 12 Activity of ACE on (A) angiotensin I and (B) hippuryl-L-histidyl-L-leucine 11 รปท 13 Chemical structures of the ACE-inhibitors enalaprilat enalapril and lisinopril 12 รปท 31 ความสามารถยบย งกจกรรมเอนไซมทรปซน วเคราะหทอณหภม 40 และ 65 องศา-

เซลเซยส EW egg white power (โปรตนไขขาว) WPC whey protein concentrate (โปรตนเวย) SPI soy protein isolate (โปรตนถวเหลอง) SP crude sarcoplasmic protein (โปรตนซารโค-พลาสมก)

44 รปท 32 ผลของโปรตนซารโคพลาสมกสกดจากปลาไนและอณหภมในการบมตอคาแรง (a)

และระยะทาง (b) ณจดแตกหกของเจลจากซรมปลาทรายแดงทความเขมขนของ แคลเซยม 0 01 03 และ 05 SP ตวอยางทเตมโปรตนซารโคพลาสมกสกด

46 รปท 33 ผลของการเตมโปรตนซารโคพลาสมกและอณหภมในการบมทระดบตางๆตอการเสอม

สลายของโปรตนกลามเนอปลาทรายแดง เมอเตมแคลเซยมคลอไรดในระดบ 0 01 03 และ 05 SP ตวอยางทเตมโปรตนซารโคพลาสมกสกด

47 รปท 34 โครมาโตแกรมการท าบรสทธของสารยบย งเอนไซมทรปซนจากโปรตนซารโคพลาสมก

ปลาไน การแยกดวยวธการแลกเปลยนประจลบ (a) การจบจ าเพาะดวยลแกนด concanavalin A (b) และการแยกตามขนาดโมเลกล (c)

48 รปท 35 รปแบบโปรตนซารโคพลาสมกจากปลาไนภายใตสภาวะนอนรดวซง 49 รปท 36 รปแบบโปรตนในสภาวะกอนและหลงเตมเอนไซม PNGase F Std standard molecular

weight 1 โปรตนในสภาวะกอนเตมเอนไซม PNGase F 2 โปรตนในสภาวะหลงเตมเอนไซม PNGase F

51 รปท 37 เสถยรภาพตออณหภมของโปรตนยบย งทรปซนแอลฟา-1 52 รปท 38 รปแบบโปรตนของซรมปลาตาหวานบมทอณหภม 40 (เลนท 2-5) และ 65 (เลนท 6-9)

องศาเซลเซยส ทการเตมสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 บรสทธจากปลาไนทระดบความเขมขนตางๆ MHC มยโอซนสายหนก AC แอคตน TM โทรโปมยโอซน

53 รปท 39 ระดบการยอยคอลลาเจนจากหนงปลานลและปลาดกบกอยโดยเพปซนทระยะเวลาบม

ตางๆ

55 รปท 310 ความสามารถในการยบย ง ACE ของคอลลาเจนจากหนงปลานลและปลาดกบกอยทยอย

โดยเพปซนทระดบการยอยตางๆ

55

ฌ

สารบญรปภาพ (ตอ) หนา รปท 311 การแยกเพปไทดยย ง ACE ทมขนาดต ากวา 5 กโลดาลตน โดย carboxymethyl (CM)-

Sepharose cation exchange column (A) เพปไทดทจบกบคอลมน ชะโดยความเขมขนของสารละลายเกลอตงแต (0-10 โมลาร) ในสารละลายบฟเฟอรโซเดยมอะซเตต 10 มลลโมลาร (pH 40) ดวยอตราการชะเทากบ 10 มลลลตรนาท เกบสารละลายทกๆ 1 มลลลตร จากนนน าๆเพปไทด fraction I และ II ไปวเคราะหหาความสามารถในการยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE โดยใชความเขมขนของเพปไทด 05 ไมโครกรม (glycine equivalent)มลลลตร (B)

58 รปท 312 รปแบบการแยกของเพปไทด fraction II โดยการแยกผานคอลมน Superdex 30 prep

grade (A) โดยการชะดวยน ากลนทอตราการชะเทากบ 03 มลลลตรนาท ตดตามปรมาณเพปไทดของแตละสวนทแยกออกมาโดยวดคาการดดกลนแสงท 215 นาโนเมตร และเกบสารละลายทความถทกๆ 05 มลลลตร ความสามารถในการยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE แสดงดงกราฟ B ทระบเปน I และ II คอตวอยาง G-I และ G-II ตามล าดบ โดยใชความเขมขนของเพปไทด 02 ไมโครกรม (glycine equivalent)มลลลตร (B)

59 รปท 313 รปแบบการแยกของเพปไทดโดยใชคอลมน Superdex peptide 10300 GL ซงชะดวยน า

กลนทอตราการชะเทากบ 03 มลลลตรนาท และตดตามปรมาณเพปไทดท 215 นาโนเมตร

60 รปท 314 การท าบรสทธโดยใชเทคนค Anion exchange chromatography (a) ของโปรตนไฮโดรไล-

เสททผลตจากโครงกระดก กางและหนงปลาทรายแดง ทยอยดวยโปรตเนสจาก Virgibacillus sp SK33 นาน 8 ชวโมง และ การท าบรสทธโดยใชเทคนค Size exclusion chromatography (b) ของตวอยางหลงจากผานการท าบรสทธดวยเทคนค Anion exchange chromatography

63 รปท 315 ความสามารถในการจบอนมลอสระภายในเซลล HepG2 ของตวอยาง fraction B1

และเพปไทดสงเคราะห FLGSFLYEYSR ทความเขมขนของเพปไทด 10 และ 20 ไมโครลตรมลลกรม

68

1

บทท 1 บทน ำ

2

ควำมส ำคญและทมำของปญหำทท ำกำรวจย ซรมคอผลตภณฑเนอปลาทผานการลางน าและแชแขง ซงใชเปนวตถดบในการผลตปอด

ลกชน เตาหปลา และผลตภณฑอาหารทะเลส าเรจรปอนๆ ในชวง 15 ปทผานมาอตสาหกรรมการสงออกเนอปลาแชแขงและผลตภณฑซรมมการเตบโตอยางตอเนอง ประเทศไทยเปนผสงออกซรมทใหญเปนอนดบสองของโลกรองจากสหรฐอเมรกา (wwwglobefishorg) ในป 2555 ปรมาณการสงออกซรมของไทยไปประเทศหลกทส าคญไดแก ญปน รองลงมาคอ ยโรปและรสเซย เกาหล สงคโปรและไตหวน ปรมาณการสงออกซรมไปประเทศดงกลาวรวมทงหมด 57200 เมตรกตน (wwwsurimischoolorg) จากสถตในป พศ 2548-2555 ผลผลตซรมเฉลยของประเทศไทยประมาณ 102250 เมตรกตนตอป (wwwgroundfishforumcom)

ในขนตอนการผลตซรมมการใชน าจ านวนมากเพอก าจดซารโคพลาสมกโปรตน การผลตซรมทกๆ 1 กโลกรม จ าเปนตองใชน าในกระบวนการลางเนอปลาประมาณ 10 ลตร ดงนนในการผลตซรม 102250 เมตรกตน จงมการใชน าไมต ากวา 1022 ลานลตรตอป ซงเปนภาระตอการบ าบดและเปนตนทนในการผลตอยางหลกเลยงไมได

Lin et al (1995) รายงานวาในน าลางซรมประกอบดวยโปรตนทละลายน าได (water soluble protein) ทสญเสยระหวางขนตอนการลาง ซงมปรมาณโปรตนคดเปนรอยละ 14 ของน าลางทไดและยงไมมการรายงานอยางเปนทางการวาการสญเสยโปรตนในระหวางกระบวนการผลตซรมในประเทศไทยเปนเทาใด แตหากใชขอมลดงกลาวของ Lin et al (1995) เปนฐานในการค านวณ อาจประมาณไดวาในการผลตซรม 102250 เมตรกตน จะมโปรตนสญเสยในน าลางประมาณ 14315 เมตรกตน ซงนบเปนปรมาณทมาก

โปรตนทสญเสยในระหวางกระบวนการลางคอซารโคพลาสมกโปรตน ซงประกอบดวยเอนไซมและโปรตนชนดตางๆ เปนทเขาใจมาตลอดวาโปรตนทละลายน าไดเหลานรบกวนการเกด เจลของมยโอฟบรลลาร ซงเปนโปรตนทมบทบาทส าคญในการเกดเจล อยางไรกตามในระยะหลง มรายงานการวจยวาซารโคพลาสมกโปรตน มผลชวยเสรมความแขงแรงของเจลจากโปรตนมยโอฟบรลลาร (Okazaki et al 1986 Morioka and Shimizu 1990 Morioka and Shimizu 1993) นอกจากนเอนไซมทถกชะลางออกจากกระบวนการลางบางชนดมประโยชนในการชวยเสรมความแขงแรงของเจล เชนกน Worratao and Yongsawatdigul (2003) พบวาซารโคพลาสมกทสกดไดจากปลานลมคณสมบตในการเหนยวน าการเกด cross-linking โปรตนกลามเนอได นอกจากนจรวฒน (2546) พบวาเมอน าน าลางจากเนอปลานล เตมลงในซรมปลาปากคม คาความแขงของเจลเพมขน และยงเกดการเชอมขามสายโปรตน (cross-link) ของปลาปากคมอกดวย ผลดงกลาวเกดจากเอนไซมทรานสกลทามเนสในน าลาง จากการท าวจยอยางตอเนอง ผวจยยงพบวาน าลางเนอปลาทรายแดงยงมสารยบย งเอนไซมโปรตเนส (proteinase inhibitor) ซงมคณสมบตยบย งกจกรรม

3

เอนไซมทรปซนและโปรตเนสในปลาปากคม (lizardfish) ไดด สงผลใหคณภาพของเจลซรมปลาปากคมดขน จะเหนไดวาโปรตนซารโคพลาสมกมประโยชนหากสามารถเกบเกยวและน ากลบมาใชเพอเพมมลคาผลผลต แทนทจะปลอยทงในรปของน าเสยหรอน าทงจากโรงงาน นอกจากปลาทรายแดงแลว ปลาตาหวาน (bigeye snapper) ปลาจวด (croaker) และปลาหนวดฤาษ (goat fish) เปนวตถดบส าคญส าหรบการผลตซรม นอกจากนปลาไน (carp) กเปนปลาน าจดเศรษฐกจทมศกยภาพส าหรบใชเปนวตถดบของการผลตซรม การเพาะเลยงปลาไนจากทวโลกในชวงป 2011 มสงถง 37 ลานเมตรกตน (FAO 2013) นอกจากนปลาไนยงเปนปลาทไมมปญหาในเรองของเอนไซมโปรตเนส จากการศกษาเบองตนทางผวจยพบวาการเตมโปรตนซารโคพลาสมกจากปลาไนชวยสงเสรมใหเนอสมผสของซรมเพมสงขน ซงอาจเนองมาจากสารยบย งเอนไซมโปรตเนสในปลาไนมศกยภาพในการยบย งเอนไซมโปรตเนสในซรมไดด ดงนนการใชสารยบย งเอนไซมโปรตเนสจากปลาไนอาจเปนทางเลอกในการยบย งกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสในซรม ยงไมมการศกษาคณสมบตของซารโคพลาสมกโปรตนเหลานอยางเปนระบบ การไดมาซงขอมลเกยวกบคณสมบตของซารโคพลาสมกโปรตนของปลาสายพนธตางๆนจะเปนประโยชนตอการเกบเกยวโปรตนเหลานมาใชประโยชน

ปรมาณวสดเหลอทงจากอตสาหกรรมซรมและปลาแลแชแขง (frozen fillet) ทเปนของแขง เชน เศษกระดก หวปลา ไสปลา และอนๆ ทเกดขนยงคดเปนปรมาณรอยละ 55 ของปลาทงตว (Morrissey et al 2005) ในการผลตซรมทกๆ 1 กโลกรมจะท าใหไดวสดเหลอทงประมาณ 18 กโลกรม และจากขอมลการผลตในป พศ 2545-2546 พบวาปรมาณวสดเหลอทงทเปนของแขงในประเทศไทยคดเปน 252000 เมตรกตน โดยทวไปวสดเหลอทงเหลานจะถกสงตอไปขายในโรงงานปลาปน หรอโรงงานอาหารสตวซงมลคาต า ไดมรายงานการวจยการน าวสดเหลอทงทเปนของแขงจากปลาไปใชประโยชน โดยผลตโปรตนไฮโดรไลเสท เชน วสดเหลอทงทเปนของแขงจากปลาแซลมอน (salmon) มคณคาสารอาหาร เชน กรดอะมโน กรดไขมน eicosapentaenoic acid (EPA) และ docosahexaenoic acid ในปรมาณสง (Liaset et al 2003) นอกจากนยงมการผลตโปรตนไฮโดรไลเสทใชเปนอมลซไฟเออร (emulsifier) ในระยะหลงมการรายงานถงคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซมเปลยนรปแอนจโอเทนซน (angiotensin converting enzyme ACE) ซงมผลในการลดความดนโลหต คณสมบตในการเปนสารตานออกซเดชน (antioxidant) และสารยบย งจลนทรยกอโรคของเพปไทดทไดจากโปรตนไฮโดรไลเสท มงานในตางประเทศมากมายซงแสดงถงคณสมบตในการเปนสารยบย งกจกรรมของ ACE ของโปรตนไฮโดรไลเสทจากวสดเหลอทงในอตสาหกรรมประมง แตยงไมพบวามการศกษาในประเทศไทย การวจยเพอผลตเพปไทดทมคณสมบตเปนสารยบย งกจกรรมของ ACE อาจท าใหเกดแนวทางการพฒนาผลตภณฑอาหารเสรมสขภาพซงเปนผลตภณฑทมมลคาสงและยงเปนการเพมมลคาของวสดเหลอทงจ านวนมากจากอตสาหกรรมซรมอกดวย

4

อตสาหกรรมซรมเปนอตสาหกรรมอาหารทะเลทส าคญของประเทศ ในอดตขอไดเปรยบของประเทศไทยเมอเปรยบเทยบกบประเทศคแขงคอการมแหลงวตถดบทอดมสมบรณและแรงงานราคาถก จงท าใหอตสาหกรรมดงกลาวเตบโตขนอยางตอเนอง จนท าใหประเทศไทยเปนประเทศผผลตซรมรายใหญของโลก แตดวยปรมาณวตถดบทลดลงในปจจบน แหลงวตถดบหลกจงไดจากการท าประมงในประเทศเพอนบาน ดวยระยะทางทหางไกล การขนสงวตถดบจงใชเวลานาน ตนทนในการผลตจงเพมขนพรอมกบความสดของวตถดบทลดลง สงผลกระทบถงคณภาพของซรมในทสด ดงน นหากไมมการวจยและพฒนาเทคโนโลยการผลต ศกยภาพในการแขงขนของอตสาหกรรมซรมไทยในเวทโลกยอมลดลง การเกบเกยวโปรตนจากน าลางเนอปลาเปนแนวทางหนงในการใชประโยชนจากวตถดบใหคมคา เปนการลดปญหาในการก าจดน าทง และเพมผลผลต และหากโปรตนทเกบเกยวไดสามารถเพมความแขงแรง (gel strength) ของเจล ยอมเปนการปรบปรงคณภาพของซรมอกทางหนง โดยไมจ าเปนตองพงพาสารเตมแตงทผลตจากตางประเทศ เชน ไขขาวผง หรอเอนไซมทรานสกลทามเนสจากเชอจลนทรย (Microbial transglutaminase MTGase) นอกจากนการผลตเพปไทดทมคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซม ACE และสารตานออกซเดชน จากวสดเหลอทงทเปนของแขงยอมเปนการเพมมลคาของวสดเหลอทงเหลานนแทนการใชเปนเพยงวตถดบราคาถกในการผลตปลาปน ในการวจยนมงศกษาวสดเหลอทงและน าลางจากกระบวนการผลตซรม และปลานลซงเปนปลาน าจดทมการสงออกในรปปลาแชแขงในปรมาณสง ผลงานวจยนจะสามารถน าไปสการพฒนากระบวนการเกบเกยวโปรตนซารโคพลาสมก และการผลตไบโอแอคทฟเพปไทด (bioactive peptide) จากวสดเหลอทงเพอใชเปนผลตภณฑเสรมสขภาพ ซงหากประสบผลส าเรจ ศกยภาพในการแขงขนของอตสาหกรรมซรม และอตสาหกรรมอาหารทะเลของประเทศในตลาดโลกยอมสงขน เกดการพฒนาอยางย งยน สงผลใหภาคแรงงาน และอตสาหกรรมตอเนอง เชน อตสาหกรรมประมง พฒนาตามไปดวย

กำรทบทวนเอกสำรทเกยวของ 1 สารยบย งโปรตนเนสจากปลา

ปลาบางชนดมเอนไซมโปรตเนสอยในกลามเนอในปรมาณทคอนขางสง ซงเอนไซมเหลานสงผลใหคณภาพของปลาลดต าลง เนองจากเอนไซมโปรตเนสยอยสลายโปรตนกลามเนอท าใหเนอปลานมและยย ดงนนในรางกายของปลาจงจ าเปนตองมสารยบย งเอนไซมเพอควบคมกจกรรมของเอนไซมโปรตเนส สารยบย งเอนไซมโปรตเนสพบไดจากสวนตางๆของปลา

Cao et al (2000) รายงานวาเอนไซมฟอสโฟกลโคส ไอโซเมอเรส (phosphoglucose isomerase) เปนองคประกอบทอยในกลามเนอลาย (skeletal muscle) ของปลาจวดขาว (white croaker) สามารถยบย งเอนไซมโปรตเนสชนดซรนซงจบตวกบมยโอไฟบรลจากกลามเนอปลา

5

ปากคม (lizard fish) ไดเปนอยางด แตไมสามารถยบย งเอนไซมทรปซนจากวว (bovine trypsin) ไคโมทรปซนจากวว (bovine chymotrypsin) และเอนไซมโปรตเนสชนดซรนซงจบตวกบมยโอไฟบรลจากกลามเนอปลาไน (common carp)ได นอกจากน Sun et al (2009) ยงพบวาเอนไซมฟอสโฟกลโคส ไอโซเมอรเรสจากกลามเนอลาย (skeletal muscle) ของปลาคารพ (crucian carp) สามารถยบย งเอนไซมโปรตเนสชนดซรนซงจบตวกบมยโอไฟบรลจากกลามเนอปลาคารพได แตไมสามารถยบย งเอนไซมทรปซนจากครเชยนคารพ (crucian carp trypsin) ไคโมทรปซนจากครเชยนคารพ (crucian carp chymotrypsin) เอนไซมทรปซนจากปลาแมนดารน (mandarin fish trypsin) เอนไซมทรปซนจากวว (bovine trypsin) และเอนไซมโปรตเนสชนดซรนซงจบตวกบมยโอไฟบรลจากกลามเนอปลาจวดขาวได เอนไซมฟอสโฟกลโคส ไอโซเมอรเรสมขนาดโมเลกล 120 กโลดาลตน เมอวเคราะหดวยเทคนค gel filtration และมขนาดโมเลกลเทากบ 55 และ 65 กโลดาลตน เมอวเคราะหดวยเทคนค SDS-PAGE ดงนนเอนไซมนจะมโครงสรางเปนหนวยยอย (sub unit) 2 หนวย นอกจากนฟอสโฟกลโคส ไอโซเมอรเรสสามารถยบย งเอนไซมโปรตเนสชนดซรนซงจบตวกบมยโอไฟบรลจากกลามเนอปลาคารพแบบแขงขน (competitive inhibitor) Sangorriacuten et al (2001) รายงานวา สารยบย งเอนไซมจากกลามเนอปลาจวดขาวมขนาดโมเลกลเทากบ 65 กโลดาลตน สามารถยบย งเอนไซมทรปซน ไคโมทรปซน อลาสเตสและซบทลซนได แตไมสามารถยบย งเอนไซมในกลมของซสเตอน (โบรมเลนและปาเปน) และเมททาโลโปรตเนส (เทอรโมไลซน)ไดและมคณสมบตเปนไกลโคโปรตน Nurhayati Rusyadi Suwandi and Nugraha (2013) ไดท าบรสทธสารยบย งเอนไซมคาทปซนจากกลามเนอปลาแคทฟช (catfish) โดยพบวาสารยบย งมขนาดโมเลกลเทากบ 1665 กโลดาลตน ท างานไดดทสดทอณหภม 40 องศาเซลเซยส พเอช 8 นอกจากนกจกรรมของสารยบย งถกกระตนเมอเตม Mn2+ อยางไรกตามการเตม Ca2+ and Co2+ สงผลใหประสทธภาพการท างานของสารยบย งลดลง Toyohara Makinodan Tanaka and Ikeda (1983) พบสารยบย งเอนไซมทรปซนและคาลเปนจากกลามเนอปลาไน Yamada et al(1985) รายงานวาคาลปาสแตนตน (calpastatin) ซงเปนสารยบย งเอนไซมคาลเปนจากกลามเนอปลาไนมขนาดโมเลกลเทากบ 37 และ 78 กโลดาลตนเมอทดสอบดวยเทคนค SDS-PAGE และขนาดโมเลกลของสารยบย งทงสองยงคงเทาเดมเมอทดสอบดวยเทคนค gel filtration แสดงวาสารยบย งแตละตวเปนพอลเปปไทดสายเดยว Hara and Ishihara (1987) ไดท าบรสทธสารยบย งเอนไซมโปรตเนสจากโปรตนกลามเนอปลาไน ซงสารยบย งนมคณสมบตคลายกบแอลฟา-1 (alpha-1 proteinase inhibitor) จากซรมของมนษย มจดไอโซอเลกทรก (isoelectric point) ทพเอช 53 และพเอชทแสดงกจกรรมการยบย งไดดคอพเอชชวง 70-95 สารยบย งนสามารถยบย งเอนไซมทรปซน ไคโมทรปซนและอลาสเตสได ขนาดโมเลกลของสารยบย งประมาณ 100 กโลดาลตนเมอวเคราะหดวยเทคนค gel filtration แตเมอวเคราะหดวยเทคนค SDS-PAGE พบวามขนาดโมเลกลเทากบ 56 กโลดาลตน นนแสดงวาโปรตนชนดนประกอบดวย 2 หนวยยอย (sub unit)

6

อยางไรกตามสารยบย งแอลฟา-1 จากสวนตางๆของปลาไนเชน perimeningeal fluid ซรม (serum) น าอสจ (seminal plasma) และน าเลอด (blood plasma) เปนพอลเปปไทดสายเดยวโดยมขนาดโมเลกลอยในชวง 54-62 กโลดาลตน (Huang et al 1995 Aranishi 1999 Wojtczak et al 2007 Mickowska 2009) Ylonen et al (1999) รายงานวาทผวหนงของปลาแอตแลนตก แซลมอน (Atlantic salmon) มสารยบย งเอนไซมซสเตอนอย 2 ชนดคอคนโนเจน (kininogen) มขนาดโมเลกลเทากบ 52 กโลดาลตน และซาลารน (salarin) มขนาดโมเลกล 43 กโลดาลตน สารย บย งเอนไซมทงสองชนดนสามารถยบย งเอนไซมปาเปนและฟซนได อยางไรกตามไมสามารถยบย งเอนไซมทรปซนได นอกจากยงพบวาทงคนโนเจนและซาลารนยงเปนไกลโคโปรตนโดยมน าตาลมาเกาะ ในขณะท Patterson (1991) รายงานวาสวนใหญแลวสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 มน าตาลมาเกาะทต าแหนง N-linked เทานน Huang et al (1995) ไดพสจนวาสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 ในสวนของ perimeningeal fluid จากปลาจน (bighead carp) ม N-linked เกาะอย 2 ต าแหนง แตไมพบ O-linked ผลการศกษานคลายกบ Mak et al (2004) ทพบวาสารยบย งเอนไซมโปรตเนสในกลมซรนหรอเซอรปน (serpin) จากน าอสจของปลาเรนโบวเทราต (rainbow trout) ม N-linked มาเกาะ 2 ต าแหนง โดยยงคงไมพบการเกาะของ O-linked ปรมาณน าตาลของ perimeningeal fluid จากปลาจน และน าอสจจากปลาเรนโบวเทราตมอยรอยละ 15 และ 16 ตามล าดบ Carrell et at (1982) รายงานวาปรมาณน าตาลของสารยบย งในกลมเซอรปนจะอยในชวงรอยละ 10-20

Wojtczak et al (2007) พบสองไอโซฟอรมของสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 จากน าอสจ (seminal plasma) ของปลาไน ท งสองไอโซฟอรมเปนไกลโคโปรตน เมอศกษาปฏกรยา deglycosylation ดวยเอนไซม Peptide -N-Glycosidase F (PNGase F) เอนไซมนจะไปตดพนธะระหวางโปรตนและน าตาลทบรเวณ N-linked (Asn-Xxx-SerThr ซง Xxx เปนกรดอะมโนชนดใดๆยกเวน Pro) ท าใหน าตาลทเกาะกบโปรตนทบรเวณ N-linked หลดออกไปสงผลใหขนาดโมเลกลลดลง จากผลการศกษาพบวาไอโซฟอรม A มขนาดโมเลกลลดลงจาก 555 กโลดาลตนเปน 485 กโลดาลตน และไอโซฟอรม B มขนาดโมเลกลลดลงจาก 54 กโลดาลตนเปน 475 กโลดาลตนหลงจากเตมเอนไซม PNGase F ดงนนปรมาณคารโบไฮเดรตของไอโซฟอรม A และ B อยทรอยละ 126 และ 121 ตามล าดบ Guzdek et al (1990) พบวาคารโบไฮเดรตไมมผลตอกจกรรมของสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 อยางไรกตามน าตาลชวยเพมความสามารถในการคงตวตอความรอนโดยขนอยกบความยาวของสายน าตาล (Nakamura et al 1998 Nakamura et al 1993) โครงสรางของสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 จะมสวนทเรยกวา reactive center loop ซงบรเวณนมต าแหนง P1-P1 อยทต าแหนงกรดอะมโนท 30-40 จากปลายสายดานคารบอกซล โดยมกรดอะมโน Met ทต าแหนง P1 และมกรดอะมโน Ser ทต าแหนง P1 ต าแหนง P1-P1 จะใชเปนขอมลเพอระบชนดของเอนไซมโปรตเนสสามารถยบย งได Mickowska (2009) ไดศกษาการจบตวกน

7

ระหวางสารยบย งโปรตเนสแอลฟา-1 จากน าเลอด (blood plasma) ของปลาไนและเอนไซมทรปซน พบวาเมอเอนไซมและสารยบย งตวจบกนจะสงผลใหมขนาดโมเลกลรวมนอยกวาผลรวมของขนาดโมเลกลระหวางเอนไซมและสารยบย ง เนองจากเอนไซมจะตดพนธะระหวาง P1-P1 ของสารยบย ง สงผลให P1 จบกบเอนไซมดวยพนธะโควาเลนต ขณะทพอลเพปไทดทางดานปลายสายคารบอกซลซงเปนดาน P1 ไดหลดออก จงท าใหขนาดโมเลกลรวมของสารเชงซอนระหวางสารยบย งและเอนไซมนอยกวาผลรวมของสารยบย งและเอนไซมประมาณ 3-4 กโลดาลตน นอกจากนสารยบย งเอนไซมทรปซนยงพบในโปรตนกลามเนอของปลาจวดขาวและปลาเฮก (hake) (Busconi et al 1984 Martone et al 1991) Piyadhammaviboon and Yongsawatdigul (2010) พบวาโปรตนทมขนาดโมเลกล 95 41 และ 37 กโลดาลตนจากกลามเนอปลาทรายแดง (threadfin bream) สามารถยบย งเอนไซมทรปซนได และความสามารถในการทนตอความรอนลดลงอยางมากทอณหภม 60 องศาเซลเซยส Siriangkanakun and Yongsawatdigul (2012) รายงานวาโปรตนทมขนาดโมเลกล 35 41 44 50 และ 69 กโลดาลตนจากโปรตนกลามเนอปลาไนมคณสมบตยบย งเอนไซมทรปซน นอกจากนยงพบวาโปรตนเหลานยงสามารถยบย งโปรตเนสในซรมได สงผลใหคาเนอสมผสของซรมเพมขน โดยพบวาการเตมโปรตนสกดจากกลามเนอของปลาไนลงในซรมปลาทรายแดงรวมกบการใหความรอนทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท กอนทจะใหความรอนทอณหภม 90 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท สงผลใหคาแรงและระยะทาง ณ จดแตกหกเพมขนรอยละ 588 และ 186 ส าหรบการใหความรอนท 40 องศาเซลเซยสและเพมขนรอยละ 1049 และ 362 ส าหรบการใหความรอนท 65 องศาเซลเซยส นอกจากนยงพบวาของเหลวทอยในสวนของรงไข (ovarian fluid) จากปลาไนและเยอหมตวออน (chorion) จากปลาไนมซสเตตน (cystatin) ซงเปนโปรตนทมความสามารถยบย งเอนไซมในกลมของซสเตอนได (Tsai et al 1996 Chang et al 1998) Yamashita and Konagaya (1991) รายงานวาโปรตนทมขนาดโมเลกล 16 กโลดาลตนจากไขของปลา chum salmon มคณสมบตในการยบย งเอนไซมซสเตอน นอกจากนสารยบย งเอนไซมซสเตอนยงพบในไขของปลาแปซฟก เฮอรง (Pacific herring) ชมแซลมอน (chum salmon) พอนด สเมล (pond smelt) กลาสฟช (glassfish) และอลาสกา พอลลอค (Alaska pollock) ซงมขนาดโมเลกลเทากบ 120 89 845 17 and 168 กโลดาลตน ตามล าดบ เมอทดสอบดวยเทคนค SDS-PAGE (Ustadi et al 2005) Li et al (2008) รายงานวาเลอดปลาชมแซลมอน (chum salmon) มสารยบย งเอนไซมซสเตอนซงมขนาดโมเลกล 70 กโลดาลตน เมอทดสอบดวยเทคนค SDS-PAGE และ gel filtration แสดงวาโปรตนนเปนพอลเพปไทดสายเดยว และพบวาเปนไกลโคโปรตน Nagashima et al (2004) พบสารยบย งเอนไซมทรปซนมขนาดโมเลกล 47 และ 57 กโลดาลตน จากเมอกผวหนง (skin mucus) ของปลาพฟเฟอร (puffer fish) นอกจากนยงพบวาสารยบย งทงคมคณสมบตเปนไกลโคโปรตน

8

แอลฟา 2 แมคโครกลโบลน (α2-macroglobulin ) สามารถยบย งเอนไซมโปรตเนสไดทง 4 ประเภท ไดแกโปรตเนสประเภทซรน ซสเตอน แอสพาตก และเมทาโลโปรตเนส โดยแอลฟา 2 แมคโครกลโบลนแตละโมเลกลสามารถท าปฏกรยากบโปรตเนสไดเพยง 1 โมเลกล ในสตวเลยงลกดวยนม แอลฟา 2 แมคโครกลโบลน ประกอบดวย 4 หนวยยอย (sub unit) ในขณะท สารยบย งประเภทนทพบในปลาสวนมากม 2 หนวยยอย เชน แอลฟา 2 แมคโครกลโบลนจากน าเลอด (plasma) ของปลาเพลซ (plaice) ซรมของปลาเรนโบวเทราต (rainbow trout) และน าเลอดของปลากลเฮด ซบรม (gilthead seabream) (Starkey and Barrett 1982 Ellis 1987 Funkenstein et al 2005) Li and Lu (2006) รายงานวาแอลฟา 2 แมคโครกลโบลนจากน าเลอดปลาเฉา (grass carp) ม 2 หนวยยอยทตางกนคอมขนาดโมเลกล 95 และ 80 กโลดาลตน Freedman (1991) พบแอลฟา 2 แมคโครกลโบลนจากซรมของปลาเรนโบวเทราต (rainbow trout) และบรคเทราต (brook trout) Chuang ei al (2008) พบแอลฟา 2 แมคโครกลโบลนในน าเลอดของปลาเกา (grouper) สารยบย งนเปนไกลโคโปรตน ความสามารถในการยบย งโปรตเนสลดลงอยางมากทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ท างานไดดทพเอช 10 และประสทธภาพการท างานต าทพเอช 2-6

เอนไซมโปรตเนสมบทบาทส าคญอยางมากตอความสามารถในการฟอรมเจลของซรม โดยเอนไซมนจะยอยสลายโปรตนมยโอฟบรลลารสงผลใหโครงขายของเจลและผลตภณฑซรมทไดมลกษณะออนตวลงพรอมกนนยงท าใหคณภาพของซรมลดลงไปดวย เอนไซมโปรตเนสทนบวาเปนปญหาใหญตอคณภาพของเจลคอเอนไซมทรปซน ซงเอนไซมนกอใหเกดปญหาการยอยสลายโปรตนในปลาหลายชนด เชน ปลาปากคม ปลาแอตแลนตก แมนฮาเดน เปนตน ดงนนการเตมสารยบย งกจกรรมของเอนไซมเพอลดการออนตวของซรมเจลจงเปนแนวทางในการแกปญหา

โปรตนซารโคพลาสมกเปนโปรตนทอยในกลามเนอซงสามารถละลายไดทงในน าและสารละลายเกลอเจอจาง โปรตนชนดนถกเชอวามนมผลในการยบย งความสามารถในการฟอรมเจลของโปรตนมยโอฟบรลลาร ดงนนจงไดมการก าจดโปรตนซารโคพลาสมกออกในขนตอนการผลตซรม อยางไรกตามมหลายการศกษารายงานวาโปรตนซารโคพลาสมกชวยเพมคณสมบตทางดานเนอสมผสของซรม ซงเปนผลมาจากกจกรรมของเอนไซมทรานสกลตามเนสทอยในโปรตนซารโคพลาสมกชวยท าใหเกดการเชอมโยงของสายโปรตนมากขนจงสงผลใหเนอสมผสของซรมเพมมากขนดวย นอกจากนทางคณะวจยยงพบวาโปรตนซารโคพลาสมกมคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซมทรปซน ดงนนการเตมโปรตนซารโคพลาสมกลงไปในซรมนาจะชวยลดปญหาการออนตวของซรมเจลและสงผลใหเนอสมผสของซรมดขน นอกจากนการศกษาเพมเตมถงโปรตนทมคณสมบตในการยบย งเอนไซมโดยการท าบรสทธและศกษาคณลกษณะของสารยบย งเอนไซมทรปซนทอยในโปรตนซารโคพลาสมกเปนสงทส าคญอยางยงเพราะจะน ามาซงองคความรพรอมทงยงสามารถประยกตใชสารยบย งทมอยในธรรมชาตชนดนไดอยางมประสทธภาพ

9

2 Anigotensin I-converting enzyme (ACE) 21 Renin Angiotensin System

Renin Angiotensin System (RAS) เปนระบบหลกทมบทบาทส าคญตอการเกดภาวะความดนโลหตสงในรางกาย (Eriksson et al 2002) RAS จะถกกระตนหลงจากทความดนโลหตลดต าลง โดยเรนนนซงเปนไกลโคโปรตน ถกสงเคราะหจาก juxtaglomerular cells ทไตและปลดปลอยเขาสระบบไหลเวยนโลหตของรางกายในทสด เรนนนมคณสมบตเปนเอนไซม ท าหนาทในการตดพนธะ เพปไทดของโมเลกล angiotensinogen เปลยนเปน angiotensin I ซงอยในสภาพทยงไมท างาน จากนน angiotensin converting enzyme (ACE) จะท าหนาทตดกรดอะมโนสองตวคอ His-Leu จากปลายดานคารบอกซล ของ angiotensin I ไดผลตภณฑ angiotensin II ซงมผลท าใหความดนเลอดสงขน (รปท 11) นอกจากนนยงมผลตอ Bradykinin ซงเปนเพปไทดทรางกายหลงออกเมอเกดบาดแผลหรอการกระทบกระเทอน โดย bradykinin มผลใหความดนเลอดต าลง แต ACE จะยอย เพปไทดทปลายสายคารบอกซลของ bradykinin เปน kinin ซงไมมผลตอการลดความดนเลอด ดงนนเอนไซม ACE จงมผลตอการเพมของ angiotensin II ซงมผลเพมความดนโลหต และลดปรมาณ bradykinin ซงเปนเพปไทดทมผลลดความดนโลหต

รปท 11 Hypertensive mechanism of angiotensin (Barbosa-Filho 2006)

10

Angiotensin II ทเกดขนจะมผลตอการท างานของไต โดย angiotensin II จะไปกระตน adrenal cortex ใหหลง aldosterone เพมขนท าใหเกดการดดกลบของโซเดยม (Na+) ลดการขบน าออก มผลใหความดนเพมสงขน และยงสามารถไปกระตน AT1 receptor ทอยบรเวณกลามเนอเรยบของหลอดเลอดท าใหหลอดเลอดหดตวสงผลใหความดนโลหตสงขนอยางรวดเรว (Kovacs et al 2002) การยบย งระบบ rennin angiotensin เพอลดภาวะความดนโลหตสงท าไดโดยการใชสารยบย งการท างานของ RAS ซงประกอบดวยยาสงเคราะห 2 กลม คอ 1) angiotensin receptor blockers (ARBs) จะแยงจบแบบแขงขน (competitive binding) ตรงต าแหนง AT1 receptor กบ angiotensin II และ 2) angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEIs) มฤทธยบย งการท างานของ ACE ทจะท าใหเกด angiotensin II และลด bradykinin

22 โครงสรางของเอนไซม angiotensin-I converting enzyme Angiotensin converting enzyme (ACE EC 34151) หรอ kininase II หรอ dipeptidyl

carboxypeptidase เปนไกลโคโปรตน มกรดอะมโนเปนองคประกอบประมาณ 642-1306 ตว เปน tran-membrane dipeptidyl peptidase ทม 2 ไอโซฟอรม คอ somaticACE (sACE) และ testicular ACE (tACE) ทถกถอดรหสจากยนเดยวทมจดเรมตนการสงเคราะห (initiation sites) ทตางกน (Oscar 2005) เปน metalloenzyme มกรดอะมโน His-Glu-Met-Gly-His จบกบสงกะส (Zn2+) ซงเปนองคประกอบทบรเวณเรงของเอนไซม (Sturrock et al 2004) สามารถถกกระตนไดดวยคลอไรด จดเปน non specific enzyme ทสามารถตดสารตงตนไดหลากหลายในการทดสอบแบบ in vitro เอนไซมนแบงได 2 กลมใหญตามบรเวณเรงปฏกรยา (active sites) ไดแก เอนไซมทมบรเวณเรงปฏกรยาอยปลายดานคารบอกซลหรอทเรยกวา C-domain (612 amino acids) และเอนไซมทมบรเวณเรงอยบรเวณปลายสายดานอะมโน N-domain (650 amino acids) แตเอนไซมในกลม C-domain มบรเวณเรงยอย (subsites) แบงเปน S1 S1rsquo และ S2rsquo บรเวณเรงยอยทง 3 ต าแหนงจะจบกรดอะมโนชนดทแตกตางกนในสายเพปไทด โดยสามารถจบกบเพปไทดสายสนทมกรดอะมโนชนดทไมมขวทอยต าแหนง C-terminalไดด (Brew 2003) อยางไรกตาม ACE ไมสามารถตดกรดอะมโนโพรลน ทตดกบกรดอะมโนชนดอนได ดงนน ACE ไมมผลในการท าลาย angiotensin II ซงเปนสารเพมความดน (Chi et al 2008)

23 In vitro assay for ACE inhibitory activity การวดกจกรรมของสารยบย งการท างานของ ACE ท าไดโดยการวดกจกรรมของ ACE ดวย

สารตงตนสงเคราะห hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL) ท าใหเกดการปลดปลอย hippuric acid (HA) และ His-Leu ปรมาณของ hippuric acid จะสะทอนถงกจกรรมของ ACE ซงสามารถตดตามไดดวยการวดคาการดดกลนแสง (รปท 12) (Cushman and Cheung 1971) วธการนใชกนอยางแพรหลายในอตสาหกรรมยาและอาหาร มการปรบวธการบางสวนจากการวจยโดยการเปลยนความ

11

เขมขนของ ACE ชนดของสารตงตนและความเขมขนของสารตงตน จากนนไดมการพฒนามาใชการตรวจวดดวยเครองโครมาโทกราฟของเหลวทมสมรรถนะสง (HPLC) (Wu and Ding 2002) และใชคอลมนในการแยก HHL และ HA

รปท 12 Activity of ACE on (A) angiotensin I and (B) hippuryl-L-histidyl-L-leucine (Cushman and

Cheung 1971)

24 เพปไทดทยบย ง Angiotensin I-converting enzyme 241 สารยบย ง ACE ทางการคา

การใชยาทเปนสารยบย ง ACE เปนแนวทางหนงในการรกษาความดนโลหตสง ยาในกลมนสวนใหญไดมาจากการสงเคราะห โดยยาชนดแรกทถกพฒนาขนคอ captropril ซงเปนยาในรปแบบยารบประทาน รปท 13 แสดงโครงสรางของสารยบย ง ACE ทางการคา 3 ชนดคอ enalaprilat enalapril และlisinopril โดย enalapril เปนยาทอยในรป prodrug คอตวมนเองไมมฤทธ แตจะสามารถออกฤทธไดเมอยาผานกระบวนการยอยโดยรางกาย (metabolize) โดยตวยาจะถกเปลยนโดยกระบวนการ deesterification เปนสารทเปนกรดไดคารบอกซล (dicarboxylic acid) คอ enalaprilat ซงมฤทธทางเภสชวทยาเหมอน enalapril และมคาครงชวตทยาวนานกวา โดย enalapril มคาครงชวตประมาณ 13 ชวโมง แต enalaprilat มคาครงชวต 11 ชวโมง ทง enalapril และ enalaprilat สามารถขบออกทางไตได

Lisinopril มโครงสรางคลายคลงกบ enalaprilat เปนยาทสามารถออกฤทธไดโดยตรงเนองจากสามารถละลายน าไดด แตการดดซมของยาจากระบบทางเดนอาหารเกดขนไดไมสมบรณ เมอยาเขาสรางกายจะถกขบออกทางไต โดยไมถกเปลยนแปลงทตบ ยามครงชวตประมาณ 7-12

12

ชวโมง เมอรบประทานเขาสรางกายมคา bioavailability ประมาณ 25-30 แตมชวงเวลาการออกฤทธทนานกวา enapril (Swaan et al1995) Captopril เปนยาทมโครงสรางทประกอบดวยกลมซลฟไฮดรล (sulhydryl SH) จดเปนยาตานแบบสามารถถกดดซมไดรวดเรว ม bioavailability ประมาณ 70 อาหารมผลลดการดดซมประมาณ 30-40 ยาถกเปลยนแปลงทตบไดสาร disulfide และถกขบออกทางไต ยามคาครงชวตประมาณ 3 ชวโมง โดย captopril จะจบกบ ACE ไดดทบรเวณเรงและเปนการจบแบบแขงขนกบ angiotensin I (Cushman et al 1987) ถงแมวายาทงสามชนดนจะมความสามารถในการยบย งการท างานของ ACE ทสงแตกมผลเสยขางเคยงเชน ไอแหง เปนผนทผวหนง สญเสยการรบรส ลมพษ เกดภาวะ hyperkalemia คอมระดบ K+ ในเลอดสง(Atkinson and Robertson 1979 Sica 2003)

รปท 13 Chemical structures of the ACE-inhibitors enalaprilat enalapril and lisinopril (Swaan et

al 1995)

242 อาหารทมสมบตยบย ง ACE เรมมการศกษาสารทมฤทธในการยบย ง ACE จากธรรมชาต โดยพบวาเพปไทดของ

อาหารหลายชนดเปนแหลงของสารยบย งการท างานของ ACE (FitzGerald et al 2004) โดยทวไปเพปไทดจะอยในสภาพทยงไมท างาน โดยอยในรปของโปรตนในอาหาร แตสามารถถกยอยไดดวยเอนไซมโปรตเอสจากระบบทางเดนอาหารหรอจากกระบวนการแปรรปอาหารได (Meisel 1997) จากนนจงถกดดซมเขาสรางกาย และแสดงสมบตยบย ง ACE (Vercruysse Camp and Amagghe

13

2005) มการศกษาถงเพปไทดทมสมบตในการลดความดนจากอาหารอยางกวางขวาง แหลงอาหารทพบ bioactive peptide ทมคณสมบตในการยงย ง ACE คอ ผลตภณฑนม โปรตนจากปลา เนอสตวและโปรตนจากพช

2421 เพปไทดยบย ง ACE ทผลตจากพช โปรตนจากพชทสามารถลดความดนโลหตได เชน ถวเขยว โปรตนจาก

ขาวโพด งา ผกโขม ถวเหลอง เปนตน (Hong et al 2008) Mallikarjan et al (2007) พบวาสมบตในการยบย ง ACE ของเพปไทดขนอยกบเอนไซมทใชและต าแหนงในการตดพนธะเพปไทด Motoi et al (2004) รายงานวาโปรตนไฮโดรไลเสทจากขาวสาล (wheat gliadin) สามารถแสดงกจกรรมในการลดความดนโลหตได Shin et al (2001) รายงานวาเพปไทดทไดจากถวเหลองหมกของประเทศเกาหลทมล าดบเพปไทด His-His-Leu (HHL) สามารถยบย ง ACE จากการทดลองใน in vitro ไดเปนอยางด และสามารถลดความดนโลหตในหนลงไดเมอฉดเขาไปในปรมาณ 5 มลลกรมกโลกรมน าหนกตว (Shin et al 2001) ตารางท 11 แสดงแหลงของสารยบย ง ACE ทไดจากพช

2422 เพปไทดยบย ง ACE ทผลตจากโปรตนนม เพปไทดยบย ง ACE ในนมสวนใหญอยในสภาพทยงไมแสดงกจกรรม ตอง

อาศยการยอยดวยเอนไซมโปรตเอส Meisal et al (1997) รายงานวากระบวนการหมกสามารถชวยปลดปลอยเพปไทดยบย ง ACE ได รวมไปถงเอนไซมทอยในระบบทางเดนอาหาร ท าใหนมเปนแหลงเพปไทดย บย ง ACE ท ดอกแหลงหนง มการรายงานวามแบคทเรยหลายชนดทพบในกระบวนการหมกผลตภณฑนมสามารถสรางเอนไซมโปรตเอส เพอปลดปลอยเพปไทดยบย ง ACE ท าใหผลตภณฑ นมเปรยว โยเกรต เนยแขง มเพปไทดยบย ง ACE เปนสวนประกอบ (Gobbetti et al 2000 Meisel et al 1997) Meihel (2005) รายงานวาเพปไทดจากนมทมความสามารถในการยบย ง ACE คาความเขมขนของไฮโดรไลเสททใชยบย งการท างานของ ACE ลง 50 (IC50) อยในชวง 100-500 ไมโครโมลลตร ตวอยางเชน β-lactoglobulin ซงสามารถแบงออกเปนเพปไทด 2 ทอนคอ Ile-Pro-Ala (IPA) และ Ala-Leu-Pro-Met (ALPM) ทมคา IC50 เทากบ 141 และ 928 ไมโครโมลลตร ตามล าดบ

2423 เพปไทดยบย ง ACE ทผลตจากโปรตนสตว มรายงานการพบเพปไทดยบย ง ACE จากเนอสตวเชน ปลา ไก วว กระบอ

Saiga et al (2006 2008) พบวาเพปไทดทมล าดบกรดอะมโน Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Phe ซงแยกไดจากเนออกไกสามารถยบย งการท างานของ ACE ได รวมถงโปรตนกระดกสวนขาของไกทถกยอยดวยเอนไซม Alcalase ดวยเชนกน Lee et al (2011) ศกษาการยอยหนงปลา skate ดวยเอนไซม Alcalase α-chymotrypsin neutrase pepsin papain and trypsin พบวา เพปไทดทไดจากการยอยดวย α-chymotrypsin แสดงกจกรรมยบย ง ACE ไดสงสด Byun and Kim (2001) แยกเพปไทดจาก

14

หนงของปลา Alaska Pollock ล าดบกรดอะมโน Gly-Pro-Leu และ Gly-Pro-Met ซงพบวาสามารถยบย ง ACE ได โดยมคาการยบย ง IC50 เทากบ 26 และ 1713 ไมโครโมลาร ตามล าดบ

ตำรำงท 11 เพปไทดทมสมบตยบย งเอนไซม ACE ทผลตจากพช (Li et al 2008)

Amino acid sequence IC50 (microM) Origin VLIVP 169 Glycinin LVY 180 Seasame LSA 781 Seasame LKY 078 Seasame LQP 104 Seasame

IVVA 3153 Cholorella vulgaris Spirulina platenis AEL 638 Cholorella vulgaris Spirulina platenis FAL 263 Cholorella vulgaris Spirulina platenis IAPG 114 Cholorella vulgaris Spirulina platenis

KDYRL 265 Mung bean LRY 015023 Pea

MRWRD 21 Spinach Rubisco MRW 06 Spinach Rubisco VW 14 Sake lees LRP 027 α-Zein LSP 17 α-Zein

TQVY 18200 Rice RDHP - Rice

25 โครงสรางของเพปไทดยบย งเอนไซม ACE

ประสทธภาพในการยบย งกจกรรมของ ACE ดวยเพปไทดขนอยกบชนดของกรดอะมโนทปลายสายดานคารบอกซล และความยาวของสายเพปไทด รวมทงขนอยกบแหลงและวธการผลต เพปไทด เพปไทดปลายสายดานคารบอลซล (C-terminal) ประกอบดวยกรดอะมโนทไมมขวสามารถยบย ง ACE ไดดกวากรดอะมโนทมขว (Imayasu et al 1994) และถาต าแหนงปลายสายเปนกรดอะมโนโพรลน พบวามประสทธภาพในการยบย ง ACE ไดด นอกจากนมวลโมเลกลของเพปไทดทม

15

ขนาดเลกจะมประสทธภาพในการยบย ง ACE ไดดกวาเพปไทดทมมวลโมเลกลขนาดใหญกวา Kang et al (2009) ศกษาประสทธภาพการยบย ง ACE ดวยเจลาตนไฮโดรไลเซทจากผลผลตพลอยไดจากการผลตซรมปลา Alaska Pollock และแยกเพปไทดตามขนาดโมเลกลดวยเทคนคอลตราฟวเตรชน (Ultrafiltration) ท 3 5 10 และ 30 กโลดาลตน พบวา เพปไทดทมขนาดมวลโมเลกลนอยกวา 3 กโลดาลตน สามารถยบย งการท างานของ ACE ไดมากทสด โดยมคา IC50 เทากบ 021 มลลกรมมลลลตร 3 โปรตนไฮโดรไลเสทและเพปไทดทมสมบตตานออกซเดชน

31 การผลตโปรตนไฮโดรไลเสท โปรตนไฮโดรไลเสทคอสวนผสมทประกอบไปดวยเพปไทดและกรดอะมโนทเปนผลผลต

จากการยอยโปรตนดวยเอนไซม ทงจากเอนไซมทตดปลายสายโปรตนและทตดพนธะเพปไทดภายในสายโปรตน หรอโปรตนทไดจากการยอยดวยกรดหรอดาง หรอจากกจกรรมของจลนทรย (Samaranayaka et al 2010 Sarmadi and Ismail 2010) การใชเอนไซมทตดพนธะเพปไทดภายในสายโปรตนเปนวธทนยมใชในการผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชน เนองจากใชระยะเวลาส น ไดระดบการยอยสงและมวลโมเลกลของเพปไทดทไดมขนาดตามทตองการ (Samaranayaka and Li-chan 2011) เอนไซมโปรตเนสทนยมใชในการยอยโปรตนมกมาจากเครองในของสตว พช และจลนทรย เอนไซมโปรตเนสทางการคาทน ามาใชเพอผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนคอ Alcalase Flavourzyme Neutrase pepsin trypsin chymotrypsin pancreatin papain และ bromelain (Je et al 2007)

เอนไซม Alcalase เปนเอนไซมทางการคาทผลตจากแบคทเรย Bacillus licheniformis ซงเปนเอนไซมทมประสทธภาพในการยอยโปรตนทสงสด (Gueacuterard et al 2001) และเมอเปรยบเทยบกบเอนไซมโปรตเนสอนๆยงพบวา Alcalase ใหผลผลตของเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนและเพปไทดสายสนทไดมความตานทานการยอยในระบบทางเดนอาหารไดสง (Park et al 2001 Kim et al 2001) Alcalase เปนเอนไซมทตดพนธะเพปไทดภายในสายโปรตน (endoproteinase) ท าใหไดเพปไทดทมขนาดสนและขนาดกลาง (Klompong et al 2008) Alcalase มความจ าเพาะทกวาง โดยมความจ าเพาะสงตอกรดอะมโนทเปนวง (Phe Try Tyr) กรดอะมโนทเปนกรด (Glu) กรดอะมโนทมซลเฟอรเปนองคประกอบ (Met) กรดอะมโนทเปนโซตรง (Leu Ala) กรดอะมโนทมหม ndashOH (Ser) และกรดอะมโนทเปนเบส (Lys) (Doucet et al 2003) เพปไทดทไดจากการยอยปลา silver carp ดวยเอนไซม Alcalase แสดงกจกรรมในการจบอนมลอสระไดดกวาการยอยดวยเอนไซม Flavourzyme (Dong et al 2008) Flavourzyme เปนเอนไซมทสามารถตดพนธะเพปไทดภายในโครงสรางโปรตนและตดจากปลายสายโปรตน มความจ าเพาะทกวาง ผลผลตทไดจะเปนเพปไทดสายสนๆและกรดอะมโนอสระ

16

(van der Ven et al 2002) มการน าเอนไซม Flavourzyme มาใชผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนจากโปรตนปลา เชน ปลาทแขก ปลานล เปนตน Neutrase ผลตจาก Bacillus amyloliquefaciens ซงเปนเอนไซมทมโลหะอยในโครงสราง (metalloendoproteinase) มหมอะมโนทไมชอบน า (hydrophobic amino acids) เปนตวเรงปฏกรยา โดยเอนไซมชนดนสามารถตดพนธะเพปไทดบนสายโปรตนหลายต าแหนง (Zhao and Hou 2009) และมประสทธภาพสงในการผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนดวยโปรตนจากขาวในสวนทเปนเอนโดสเปรม (Zhang et al 2010) เอนไซมทอยในระบบทางเดนอาหาร (pepsin trypsin chymotrypsin และ pancreatin) สามารถผลตเพปไทดทสามารถจบกบอนมลทมหม-OH ได (Byun et al 2009 You et al 2010) เอนไซมเพปซนมความจ าเพาะกบกรดอะมโนทมโครงสรางเปนวง เชน Phe Trp Tyr และกรด อะมโน Leu และ Glu ทอยดานหมคารบอกซลของพนธะเพปไทด (Simpson 2000 You et al 2010) ดงนนการตดดวยเอนไซมเพปซนจะท าใหไดเพปไทดทม Tyr Phe หรอ Leu ทปลายดานอะมโน (N-terminal) (Savoie et al 2005) เอนไซมทรปซนมความจ าเพาะตอ Lys หรอ Arg ทดานคารบอกซลของพนธะเพปไทดสวนเอนไซม α-chymotrypsin จะตดพนธะเพปไทดทดานคารบอกซลเปนกรดอะมโนของ Leu Tyr Phe Try และ Met (Robyt and White 1987)

ผลผลตทไดจากการยอยดวยสารสกดซงไดจากตบออนของหม (Pancreatin) ซงมเอนไซมหลายชนดเปนองคประกอบ สามารถยอยโปรตนใหไดกรดอะมโน Val Leu และ Phe (Mullally et al1994) และมการใช Pancreatin ในการผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนจากโปรตนในมนฝรง (Kudo et al 2009) การใชเอนไซมจากระบบทางเดนอาหารผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนจะท าใหไดเพปไทดททนตอการยอยอาหารของรางกาย (Qian et al 2008a)

นอกจากโปรตเนสทางการคาแลวการใชโปรตเนสจากแหลงอนเพอผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนยงมการศกษาไมมากนก เคยมการศกษาการใชเอนไซมจากปลาชนดตางๆเพอน ามาผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชน เชนเอนไซมทสกดจากล าไสของปลาท จากกางของปลาทนาครบเหลอง (yellowfin sole frame) และจากโปรตนจากกางของปลา Alaska Pollock (Jun et al 2004 Je et al 2005) นอกจากนยงพบวาสามารถผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชนจากวสดเหลอทงของปลาซารดนไดดวยเอนไซมทสกดจากเครองในของปลาซารดน (Bougatef et a l 2010) การใชเอนไซมทแตกตางกนในการยอยโปรตนท าใหไดรปแบบของเพปไทด ขนาด และล าดบกรดอะมโนทแตกตางกน (Chen et al 1995 Jeon et al 1999 Wu et al 2003)

Sinsuwan et al (2008) ไดรายงานถงสภาวะทเหมาะสมในการท างานของเอนไซมโปรตเนสทสรางจาก Virgibacillus sp SK33 ซงคดแยกมาจากน าปลาทหมกเปนระยะเวลา 1 เดอน ท pH 8-11 ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส แบคทเรยชนดนสามารถผลตเอนไซมไดหลายชนด ซงมขนาด 56 46

17

42 32 25 และ 19 กโลดาลตน โดยเอนไซมโปรตเนสจาก Virgibacillus sp SK33 ยงแสดงกจกรรมคลายกบ subtilisin-like alkaline serine proteinase นอกจากนยงสามารถยอยโปรตนของปลากะตกไดดกวาเอนไซม Alcalase ทางการคาอกดวย นอกจากนเอนไซมโปรตเนสจาก Virgibacillus sp SK33 ทผานการท าบรสทธมความจ าเพาะทหลากหลาย โดยสามารถตดพนธะของ insulin B ทหลากหลายรวมไปถง Gln4 Cys7 Glu13 Ala14 Leu1517 Tyr1626 Arg22 Phe2425 and Lys29 (Sinsuwan et al 2010) ท าใหเอนไซมโปรตเนสทผลตจาก Virgibacillus sp SK33 มแนวโนมทจะมศกยภาพส าหรบกระบวนการผลตเพปไทดทมสมบตในการตานออกซเดชน

32 แหลงของโปรตนไฮโดรไลเสทและเพปไทดทมสมบตตานอนมลอสระ ปจจบนนนกวจยเรมใหความสนใจกบคณสมบตในการน ามาใชทางยา (Nutraceutical) จาก

โปรตนไฮโดรไลเสททไดจากสตวและพช เพปไทดทมสมบตตานอนมลอสระทมาจากผลตภณฑอาหารไดรบการยอมรบวาปลอดภย และเปนสารเพอสขภาพ (Healthy compound) ราคาถก มกจกรรมสง และงายตอการดดซม (Sarmadi and Ismali 2010) โปรตนไฮโดรไลเสททมสมบตตานอนมลอสระทไดมาจากการยอยโดยเอนไซมจากพช เชน ถวเหลอง (Moure et al 2006) จมกขาวสาล (Zhu et al 2006) เมลดขาวโพด (Zein) (Kong and Xiong 2006) โปรตนจากน ามนคาโนลา (Chumby et al 2008) บควท (Buckwheat) (Tang et al 2009) cotton leafwarm (Vercruysse et al 2009) ถวลสง (Jamdar et al 2010) Amaranth (Tironi and Anoacuten 2010) และ ขาวบารเลย (Bamdad et al 2011) นอกจากนโปรตนไฮโดรไลเสททมสมบตตานอนมลอสระทไดมาจากการยอยโดยเอนไซมจากสตวและผลตภณฑจากสตวไดแก ไขแดง (Sakanaka et al 2004 Sakanaka and Tachibana 2006) นม (Rival et al 2001 Hogan et al 2009) โปรตนเวย (Pentildea-Ramos and Xiong 2001 Peng et al 2009) ฮโมโกลบนของหม (Chang et al 2007) พลาสมาของหม (Liu et al 2009) และไก (Liu et al 2011) ผลตภณฑจากสตวน าและผลพลอยไดกมการรายงานวาเปนแหลงทดของเพปไทดทมคณสมบตในการตานสารอนมลอสระ เชน ปลาท (Wu et al 2003) หมก (Jumbo flying squid) (Lin and Li 2006) ปลาทแขก (Round scad) (Thiansilakul et al 2007) ปลาขางเหลอง (Yellow stripe trevally) (Klompong et al 2008) ปลากะพงแดงขางแถว (Brownstripe red snapper) (Khantaphant and Benjakul 2008) ปลานล (Tilapia) (Raghavan et al 2008) ตบปลาทนา (Tuna liver) (Je Lee Lee and Ahn 2009) ปลาหม (Loach) (You et al 2010) ปลาดาบเงน (Black scabbardfish) (Batista et al 2010) และหอยเปาฮอ (Pacific abalone) (Zhou et al 2012)

33 การท าบรสทธโปรตนไฮโดรไลเสท การหาล าดบกรดอะมโนและคณลกษณะของเพปไทดมความส าคญส าหรบการศกษากลไก

ในการตานอนมลอสระและอาจใหขอมลเกยวกบคณลกษณะของเพปไทดทมสมบตในการตานอนมลอสระ (Raghavan et al 2008) นอกจากนนการหาล าดบของกรดอะมโนยงมประโยชนตอการ

18

สงเคราะหเพปไทดส าหรบอตสาหกรรมอาหารและยา มหลายงานวจยทศกษาเกยวกบการแยกและระบสารประกอบทคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระโดยใชการแยกผานเยอกรอง (Membrane fitration) โครมาโตรกราฟฟ และแมสสเปกโตรเมทร (Chen et al 2012) ซงสารประกอบเหลานจะถกทดสอบการยบย ง ปฏกรยาออกซเดชนของลพด (Lipid oxidation) การดกจบอนมลอสระ (Radicals scavenging) และความสามารถในการจบกบโลหะ (Metal chelating ability) ตารางท 12 แสดงเพปไทดทผานการท าบรสทธและมคณสมบตในการตานสารอนมลอสระจากแหลงตางๆ Kim et al (2001) พบวาเพปไทดทไดจากหนงปลา Alaska Pollock แสดงความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระอกทงยงมสนบสนนใหสารตานอนมลอสระอยาง α-tocopherol ท างานไดดขน และล าดบกรดอะมโนของเพปไทดจากหนงปลา Alaska Pollock ทประกอบไปดวย GPOGPOGPOGPOG แสดงฤทธตานอนมลอสระมากกวาเพปไทดทมล าดบกรดอะมโนเปน GEOGPOGPOGPOGPOG และไดสรปวาฤทธในตานอนมลอสระของเพปไทดจากหนง Alaska Pollock ขนอยกบล าดบกรดอะมโน Mendis et al (2005a) พบวาเพปไทดจากเจลาตนของหนงหมก (Jumbo squid skin gelatin) มศกยภาพในการยบย งปฏกรยาออกซเดชนของไขมนทสงและมากกวาสารตานอนมลอสระทไดจากธรรมชาตอยาง α-tocopherol นอกจากนนยงมความสามารถในการดกจบอนมลอสระในปฏกรยาการเกดออกซเดชน (OH˚ R˚ RO˚ และ ROO˚) ไดอยางมประสทธภาพ และล าดบกรดอะมโนของเพปไทดทผานการท าบรสทธและมฤทธในการตานอนมลอสระสงในปลาหมกจมโบ คอ FDSGPAGVL (88018 ดาลตน) และ NGPLQAGQPGER (124159 ดาลตน) ยงไปกวานน Rajapakse (2005a) พบวาเพปไทดทมาจากกลามเนอของหมกยกษ (Giant squid muscle) ประกอบไปดวย กรดอะมโน 7 และ 13 ตว ซงมศกยภาพในการเปนสารตานอนมลอสระโดยการยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชนของกรดลโนเลอก (Linoleic acid) และมฤทธมากกวา 35-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene (BHT) ซงเปนสารตานอนมลอสระทสงเคราะหขน Je et al (2005) ศกษาโปรตนไฮโดรไลเสทจากกระดกปลาอลาสกาพอลลอค (Alaska Pollock frame) ทมขนาดต ากวา 1 กโลดาลตน มฤทธในการตานอนมลอสระทสง นอกจากน นเพปไทดทผานการท าบรสทธ (LPHSGY 672 ดาลตน) มบทบาทในการดกจบอนมลไฮดรอกซล (OH˚) โดยคณะผวจยรายงานวาฤทธในการตานอนมลอสระมาจากการทเพปไทดนมกรดอะมโนทมวงแหวน imidazole ทท าหนาทในการจบกบโลหะนอกจากนยงมมกรดอะมโนไทโรซนซงเปนตวใหไฮโดรเจน (Hydrogen donor) กบอนมลอสระ Kim et al (2007) ศกษาเพปไทดทผานการท าบรสทธจากโปรตนไฮโดรไลเสททมาจากกางปลาโฮก (Hoki frame) พบวาเพปไทดทไดมขนาด 1801 ดาลตน และล าดบกรดอะมโนคอ ESTVPERTHPACPDFN โดยเพปไทดนสามารถยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชนของไขมนไดสงกวา α-tocopherol และมประสทธภาพในการดกจบสารอนมลอสระพวก DPPH OH˚ O2 R˚ RO˚

19

และ ROO˚ เนองจากเพปไทดนประกอบไปดวยกรดอะมโนทไมมขวอย 44 ท าใหเกดอนตรกรยาระหวางโมเลกลของกรดไขมนกบเพปไทดและใหโปรตอนกบอนมลอสระของไขมนได

20

ตำรำงท 12 เพปไทดทผานการท าบรสทธและมคณสมบตในการตานสารอนมลอสระจากแหลงตางๆ แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง

1 ปลำ เจลาตนของหนงปลาอลาสกาโพลอค (Alaska pollack skin gelatin)

GEOGPOGPOGPOGPOG และ GPOGPOGPOGPOG

ยอยโดยใชเอนไซมแอลคาเลส และโปรเนสอ (Pronase E)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และปองกนเซลลตบของหนจากการออกซเดชนโดย TBHP

Kim et al (2001)

ปลาทนาครบเหลอง Yellowfin sole ( Limanda aspera) frame

RPDFDLEPPY เอนไซมเพปซนตามดวยเอนไซมจากล าไสปลาแมกเคอเรล (Mackerel intestines crude enzyme (MICE))

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก Jun et al (2004)

กางปลาอลาสกาพอลลอค (Alaska Pollack frame)

LPHSGY เอนไซมจากล าไสปลาแมกเคอเรล (MICE)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล

Je et al (2005)

กลามเนอปลาไหลทะเล(Conger eel muscle)

LGLNGDDVN ทรปซน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล

Ranathunga et al (2006)

กระดกสนหลงปลาทนา (Tuna backbone)

VKAGFAWTANQQLS เพปซน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH

Je et al (2007)

20

21

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง กางปลาโฮก (Johnius belengerii) ESTVPERTHPACPDFN เพปซน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก

ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล MRC-5 จากการถกท าลายโดย TBHP และสามารถปองกนผลจากการท DNA ถกท าลาย

Kim et al (2007)

ผลพลอยไดจากกลามเนอปลาโอตาโต (Bigeye tuna dark muscle by-products)

LNLPTAVYMVT เพปซน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH

Je et al (2008)

กลามเนอปลาเฉา (Grass carp muscle)

PSKYEPFV แอลคาเลส 24 ลตร ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล

Ren et al (2008)

กลามเนอด าจากปลาทนา (Tuna dark muscle by-products)

LPTSEAAKY from OR และ PMDYMVT from PR

Orientase (OR) and protease XXIII (PR)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมล DPPH

Hsu (2010)

เจลาตนจากเกลดปลานล (Nile tilapia (Oreochromis niloticus))

DPALATEPDPMPF

แอลคาเลส ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล และสามารถปองกนผลจากการท DNA ถกท าลาย

Ngo et al (2010)

21

22

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง ปลาหม (Loach) PSYV ปาเปน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก

ดกจบอนมลไฮดรอกซลและ DPPH สามารถจบกบทองแดง

You et al (2010)

ผลพลอยไดจากปลาซารคน (Sardinella aurita)

LHY LARL GGE GAH GAWA PHYL และ GALAAH และ LHY

เอนไซมจากเครองในปลาซารดน (CESV)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมล DPPH

Bougatef et al (2010)

เครองในปลาท (Horse mackerel(Magalaspis cordyla) )

ACFL เพปซนแลวตามดวยทรปซน กบ แอลฟาไครโมทรปซน

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซลและ DPPH

Sampath Kumar et al (2011)

เจลาตนจากหนงปลานล (Tilapia (Oreochromis niloticus))

EGL และYGDEY Multifect neutral and followed by pronase E

ดกจบอนมลไฮดรอกซล DPPH และซปเปอรออกไซด

Zhang et al (2012)

Marine rotifer Brachionus rotundiformis

LLGPGLTNHA และ DLGLGLPGAH

เพปซน ดกจบอนมล DPPH Byun et al (2009)

22

23

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง

2 สตวน ำอนๆ กลามเนอหมกยกษ (Giant squid (Dosidicus gigas) )

NADFGLNGLEGLA and NGLEGLK

ทรปซน ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล MRC-5 จากการถกท าลายโดย TBHP

Rajapakse et al (2005a)

ซอสหอยแมลงภดอง (Fermented marine blue mussel (Mytilus edulis) sauce)

HFGBPFH การยอยสลายตวเอง ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล MRC-5 จากการถกท าลายโดย TBHP

Rajapakse et al (2005b)


FGHPY การยอยสลายตวเอง ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ดกจบอนมลไฮดรอกซล

Jung et al (2005)

หนงกบยกษแอฟรกา (Rana catesbeiana Shaw)

LEELEEELEGCE แอลคาเลส ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล DPPH และซปเปอรออกไซด

Qian et al (2008b)

23

24

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง หอยนางรม (Crassostrea gigas) LKQELEDLLEKQE เพปซนแลวตามดวยทร

ปซน กบ แอลฟาไครโมทรปซน

ยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชน ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล และสามารถปองกนผลจากการท DNA ถกท าลาย

Qian et al (2008a)

หอยแมลงภ (Mytilus edulis) YPPAK นวเทส (Neutrase) ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล DPPH และซปเปอรออกไซด

Wang et al (2013)

3 สตวและผลตภณฑจำกสตว ไลโซไซมจากไขขาว (Hen egg white lysozyme)

NTDGSTDYGILQINSR เอนไซมผสม (ทรปซนและปาเปน)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก และดกจบอนมลไฮดรอกซล DPPH และสามารถจบโลหะ Fe2

Memarpoor-Yazdi et al (2012)

24

25

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง ซารโคพาสมกจากตบวว (Bovine liver sarcoplasmic)

FGKEFTPVLQADFQK FGDLSTADAVMNNPK LHVDPENFKL VLSAADKGNVKA FSDVHPEYGSR AQKPDVLTTGGGNPVGDKLNS AAQKPDVLTTGGGNPVGDKLNS LVQDVVFTDEMAH VGMPDDIIQKGKD

เทอรโมไลซน และดกจบอนมล DPPH และสามารถจบโลหะ Fe2

Di Bernardini et al (2011)

4พช เบตา-คอนไกลซน (β-conglycinin (7s protein))

VNPHDHQN LVNPHDHQN LLPHH LLPHHADADY VIPAGYP LQSGDALRVPSGTTYY

โปรตเนสเอส ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก Chen et al (1995)

25

26

ตำรำงท 12 (ตอ) แหลงของเพปไทด ล ำดบกรดอะมโน กำรเตรยม กจกรรม อำงอง ถวเหลอง เพปไทดทประกอบไป

ดวยฮสตดน เพปไทดสงเคราะห (LLPHH) ทไดขอมลมาจากการยอยโปรตนถวเหลองดวยโปรตเอสเอส

มความสารมารถในการจบกบโลหะ และดกจบอนมลไฮดรอกซล

Chen et al (1998)

กลเตนจากขาวโพด FPLEMMPF แอลคาเลส ยบย บการเกดออกซเดชนของpyrogallol Zheng et al (2006) โปรตนเหลอทงจากสาหราย (Algae protein waste)

VECYGPNRPQF เพปซน ยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชน ดกจบอนมลไฮ ดรอกซลเปอรออกไซด และ DPPH ปองกนเซลล และสามารถปองกนผลจากการท DNA ถกท าลาย

Sheih et al (2009a)

โปรตนจากมนฝรง FGER FDRR and FGERR

เอนไซมผสม (Pancreatin และ Amano-P)

ยบย บการเกดออกซเดชนของกรดลโนเลอก ยบย งการเกดออกซเดชนของไขมนใน erythrocyte membrane

Kudo et al (2009)

โปรตนจากเอนโดรสเปรมของขาว (Rice endosperm protein)

FRDEHKK and KHDRGDEF

นวเทรส ยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชน ดกจบอนมลไฮดรอกซล เปอรออกไซด และ DPPH และ ปองกนเซลล MRC-5 กบ RAW2647 เสยหายจาก TBHP และปองกนเซลลโดนท าลาย

Zhang et al (2010)

26

27

วตถประสงคของโครงกำรวจย 1 ศกษาคณสมบตในการเสรมคณภาพเจลของซารโคพลาสมกโปรตนจากปลาเศรษฐกจ 2 ศกษาคณสมบตในการเปนสารยบย งโปรตเนสของซารโคพลาสมกจากปลา 3 ผลตโปรตนไฮโดรไลเสท (protein hydrolysate) จากวสดเหลอทงจากโรงงานซรม และ

หรอ อตสาหกรรมแปรรปปลา เพอใหไดผลตภณฑทมคณสมบตย บย งเอนไซม Angiotensin Converting Enzyme (ACE) และคณสมบตยบย งการเกดออกซเดชน

ขอบเขตของการวจย

ขอบเขตของโครงการวจยคอมงเกบเกยวซารโคพลาสมกโปรตน และใชประโยชนวสดเหลอทงจากโรงงานซรมและหรอ อตสาหกรรมแปรรปปลาใหเกดประโยชนและมลคาเพม โดยมงเนนเกบเกยวซารโคพลาสมกโปรตนเพอศกษาคณสมบตในการเกดเจล และคณสมบตในการยบย ง โปรตเนส และน ามาใชปรบปรงคณภาพของเจลซรม ซงเปนซรมทมความสามารถในการเกดเจลต า นอกจากนมงการผลตเพปไทดจากวสดเหลอทง เพอใหไดเพปไทดทมคณสมบตเปนสารยบย ง ACE และเปนสารตานออกซเดชน ประโยชนทคาดวาจะไดรบ และหนวยงานทน าผลการวจยไปใชประโยชน

โครงการวจยนจะเปนประโยชนตออตสาหกรรมซรมและอตสาหกรรมอาหารประมง ท าใหเกดแนวทางการใชประโยชนจากวสดเหลอทง (น าลางซรม เศษกาง กระดก หนง) ใหเกดประโยชนสงสดในรปของสารเพมคณภาพเจลซงปจจบนตองน าเขาจากตางประเทศ หรอเพปไทดทมฤทธยบย ง ACE และตานออกซเดชนในระดบเซลลซงมศกยภาพทจะพฒนาเปนผลตภณฑเพอสขภาพตอไป การใชประโยชนจากวสดเหลอทง เปนแนวทางหนงของการใชวตถดบประมงใหเกดประโยชนสงสด ซงเปนการเพมศกยภาพในการแขงขนของอตสาหกรรมประมง หนวยงานของรฐทจะไดประโยชนคอ กรมประมงและนกวจยทศกษาคนควาเกยวกบผลตภณฑประมง องคความรทเกดจากงานวจยในเรองทเกยวของกบสารยบย งโปรตเนสจากซารโคพลาสมกโปรตนและการผลตเพปไทดทมฤทธยบย ง ACE และตานออกซเดชนในระดบเซลลจะสามารถการเผยแพรในวารสารวชาการระดบนานาชาต

28

บทท 2 วธด ำเนนกำรวจย

29

วธกำรทดลอง 21 สำรยบยงเอนไซมโปรตเนสจำกปลำ

211ความสามารถของโปรตนซารโคพลาสมกสกดตอการการยบย งกจกรรมของเอนไซม

2111 การเตรยมตวอยางโปรตนซารโคพลาสมกสกด ขนสงปลาไน (Cyprinus carpio) จากตลาดยาโม อเมอง จนครราชสมา

มายงหองปฏบตการสาขาวชาเทคโนโลยอาหาร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร โดยบรรจใสกลองโฟมทมน าแขง ท าความสะอาดและตดหว ควกไส ขอดเกลด บดเนอปลา จากนนน าเนอปลาบดทไดมาปนผสมดวยน ากลนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ในอตราสวนเนอปลาบดตอน า 1 ตอ 3 กวนตอเนองเปนเวลา 5 นาท จากนนน าสวนผสมไปปนเหวยงท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท น าสวนของเหลวทไดมากรองผานผาขาวบาง 3 ชน จากนนน าของเหลวทไดไปเกบท 4 องศาเซลเซยส ขามคนเพอใหไขมนกลายเปนไขลอยตวอยดานบน ตวอยางทไดนคอโปรตนซารโค-พลาสมกสกด (crude sarcoplasmic protein) ส าหรบซรมปลาทรายแดง (Nemipterus spp) ซอจากโรงงานอนดามนซรม และขนสงมายงหองปฏบตการ สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร แบงบรรจใสถงพลาสตกถงละ 1 กโลกรม ปดผนกสญญากาศและเกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

2112 ความสามารถในการยบย งเอนไซมทรปซน วเคราะหผลของสารยบย งเอนไซมโปรตเนสโดยใชโปรตนซารโค-

พลาสมกสกดเปรยบเทยบกบสารยบย งทางการคาไดแกโปรตนไขขาว (egg white power) โปรตนเวย(whey protein concentrate) โปรตนถวเหลอง (soy protein isolate) ตามวธของ Piyadhammaviboon and Yongsawatdigul (2010) บมสารละลายผสมซงประกอบดวยสารยบย งปรมาตร 200 ไมโครลตร โดยควบคมปรมาณโปรตนของสารยบย งทงสชนดใหเทากน สารละลายบฟเฟอรทรสไฮโดรคลอไรด (Tris-HCl) เขมขน 100 มลลโมลาร (pH 8) ปรมาตร 500 มลลลตร เอนไซมทรปซนเขมขน 04 มลลกรมมลลลตร ปรมาตร 100 ไมโครลตร ทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท จากนนเตมสารละลายเคซนเขมขน 1 บมสารผสมตอทอณหภมทงสองเปนเวลา 1 ชวโมง หยดปฏกรยาดวยสารละลายกรดไตรคลอโรอะซตก (trichloroacetic acid) เขมขน 50 (ทควบคมอณหภม 4 องศา-เซลเซยส) ปรมาตร 400 มลลลตร น าไปปนเหวยงท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ส าหรบตวอยางควบคมเตรยมตวอยางเหมอนขางตนแตเตมสารละลายกรดไตรคลอโรอะซตก กอนสารละลายเคซน โดยไมบม วเคราะหปรมาณโอลโกเปปไทดในสารละลายสวนใสดวยวธ Lowry (Lowy et al 1951) โดยใชสารละลายไทโรซนเปนมาตรฐาน

30

2113 ผลของโปรตนซารโคพลาสมกสกดตอการเกดเจลของซรมจาก ปลาทรายแดง

เตรยมเจลโดยผสมซรมกบเกลอโซเดยมคลอไรดเขมขน 2 ของน าหนกทงหมด แคลเซยมคลอไรดทความเขมขน 0 01 02 03 และ 05 ซารโคพลาสมกโปรตนทความเขมขน 018 และปรบความชนใหเปน 80 บรรจเจลในไมโครเพลท จากนนบมตวอยางทสภาวะตางๆ คอ (1) บมท 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง (2) บมท 40 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท (3) บมท 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนน าไปใหความรอนท 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท (4) ตวอยางทไมมการบมจะน าไปใหความรอนทอณหภม 90 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท เมอครบเวลาใหแชตวอยางในน าผสมน าแขงทนท เกบตวอยางขามคนท 4 องศาเซลเซยส วเคราะหลกษณะเนอสมผสของเจลดวยเครอง Texture Analyzer และใชหววด cylindrical probe ขนาด 2 มลลเมตร โดยตงคาอตราการเคลอนทของหววดท 1 มลลเมตรตอวนาท บนทกคาแรง ณจดแตกหก (breaking force) และระยะทาง ณ จดแตกหก (deformation)

เตมสารละลายกรดไตรคลอโรอะซตกทแชเยนเขมขน 5 (wv) ปรมาตร 18 มลลลตร ลงในซรมเจล (2 กรม) บดผสมและปนเหวยงท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท วเคราะหปรมาณโอลโกเปปไทดในสารละลายสวนใสดวยวธ Lowry (Lowy et al 1951) โดยใช ไทโรซนเปนสารละลายมาตรฐาน แสดงคากจกรรมการยอยสลายตวเองในหนวยไมโครโมลของ ไทโรซนตอกรมตวอยาง

212 การท าบรสทธและสมบตชวเคมของสารยบย งเอนไซมทรปซน 2121 การท าบรสทธสารยบย งเอนไซมทรปซน

เตรยมโปรตนซารโคพลาสมกตามขอ 2111 แตน าเนอปลาบดมาปนผสมในสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) ท 4 องศาเซลเซยสแทนการใชน ากลน จากนนน าตวอยางทเตรยมไดมาใหความรอนทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท น าไปแชไวในน าแขงเปนเวลา 10 นาท น าตวอยางไปปนเหวยงท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท จากนนเตมแอมโมเนยมซลเฟตในในสารละลายสวนใสเกบตะกอนโปรตนชวงของความเขมขนแอมโมเนยมซลเฟต 50-70 โดยควบคมอณหภมระหวางด าเนนการใหอยทประมาณ 4 องศา-เซลเซยส แยกเกบสวนตะกอนโดยน าตวอยางไปปนเหวยงตอท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ละลายสวนตะกอนดวยสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) จากนนก าจดเกลอแอมโมเนยมซลเฟตออกดวยวธ dialysis โดยใช dialysis tubing ทมคา molecular weight cut-off เทากบ10 kDa ละลายในสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) ท 4 องศา-เซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง จากนนน าตวอยางทไดมาแยกตอดวยวธการแยกโดยการแลกเปลยนประจลบ (anion exchange chromatography) โดยใช DEAE-Sephacel เปนตวกลาง ท า คอลมนให

31

สมดลดวยสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) จากนนโปรตนทจบกบเรซน DEAE-Sephacel ถกชะออกโดยการเพมความเขมขนของไอออนในอตราคงทเชงเสนตรงโดยใชโซเดยม คลอไรดเขมขน 0-1 โมลาร ในสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) ทดสอบกจกรรมการยบย งเอนไซมทรปซนของสารละลายในแตละหลอดทดลองและเลอกสารละลายในหลอดทดลองทแสดงคาการยบย งเอนไซมทรปซนสงไปท าเขมขนตอโดยใช ultrafiltration membrane ทมคา molecular weight cut-off เทากบ10 กโลดาลตน จากนนน าสารละลายทผานการท าเขมขนแลวมาก าจดเกลอโซเดยมคลอไรดออกโดยการใชวธ dialysis ตามทระบไวขางบน น าตวอยางมาแยกตอดวยวธการจบจ าเพาะ (affinity chromatography) โดยใช concanavalin A (Con A) เปนลแกนด เพอจบไกลโคโปรตน ปรบคอลมนใหสมดลดวยสารละลาย Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) และโปรตนถกชะออกดวย methyl-α-D-glycoparanoside เขมขน 0-05 โมลาร ในสารละลาย 50 มลล- โมลาร TrisndashHCl pH 75 น าสารละลายในหลอดทดลองทแสดงคาการยบย งเอนไซมทรปซนสงไปท าเขมขนตอโดยใช ultrafiltration membrane ทมคา molecular weight cut-off เทากบ 10 กโลดาลตน น าตวอยางทผานการท าเขมขนแลวไปแยกโปรตนตอโดยอาศยหลกการแยกตามขนาดโมเลกลดวยวธเจลฟวเทรชน (gel filtration) วเคราะหปรมาณโปรตนดวยวธ Lowry โดยใช BSA (Bovine serum Albumin) เปนสารละลายมาตรฐาน แสดงคาปรมาณโปรตนในหนวยมลลกรมมลลลตร

2122 การวเคราะหน าหนกโมเลกลของสารยบย งเอนไซมทรปซน วเคราะหน าหนกโมเลกลของสารยบย งเอนไซมโดยดดแปลงจาก Garcia-

Carreno Dimes and Haard (1993) น าสารละลายโปรตนทไดจากขนตอนการท าบรสทธของแตละวธมาผสมกบ treatment buffer (Tris-HCl เขมขน 125 มลลโมลาร ท pH 68 SDS เขมขน 4 กลเซอรอลเขมขน 20) ดวยอตราสวน 11 เตรยมเจล acrylamide เขมขน 10 โดยมเคซนเขมขน 012 (wv) เปนองคประกอบอยดวย ใชกระแสไฟฟา 120 โวลต เพอแยกโปรตน ควบคมอณหภมใหเยนตลอดการแยกโดยวางอปกรณแยกในอางน าแขง จากนนเตมเอนไซมทรปซนทความเขนขน 04 มลลกรมมลลลตร ปรมาตร 50 มลลลตรลงไปในเจล บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง ยอมสเจลดวย Coomassie blue (Coomassie brilliant blue R-250 เขมขน 01 เมธานอล เขมขน 40 และกรดอะซตก เขมขน 10) เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนลางสออกดวยสารผสมของเอธานอลเขมขน 25 และกรดอะซตกขมขน 10 สารยบย งทมความสามารถในการยบย งกจกรรมของเอนไซมทรปซนจะปรากฏเปนแถบสน าเงน

2123 การศกษากจกรรมการยบย งเอนไซมทรปซน วเคราะหกจกรรมการยบย งเอนไซมทรปซนโดยดดแปลงจาก Barrett and

Kirschke (1981) และ Ishida Sugiyama Sato and Nagayama (1995) บมสารละลายผสมซงประกอบดวยสารละลายบฟเฟอรTris-HCl เขมขน 100 มลลโมลาร (pH 8) ปรมาตร 700 ไมโครลตร

32

เอนไซมทรปซนเขมขน 001 มลลกรมมลลลตร ปรมาตร 100 ไมโครลตร สารยบย งเอนไซมปรมาตร 100 ไมโครลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 นาท จากนนเตม Boc-Asp(oBzl)-Pro-Arg-AMC เขมขน 10 microM ปรมาตร 100 มลลลตร บมสารผสมตอทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท หยดปฏกรยาโดยการเตมสารผสมเมธานอล-บวธานอล-น ากลน (methanoln-butanol deionized water) ในอตราสวน 353035 (vvv) ปรมาตร 15 มลลลตร วดคาความเขมของการเรองแสง (Fluorescence intensity) ดวยเครอง spectrofluorophotometer ทความยาวคลนกระตน (excitation) 380 นาโนเมตร และความยาวคลนของการคายพลงงาน (emission) 460 นาโนเมตร

2124 การระบชนดของโปรตน น าสารละลายโปรตนทไดหลงจากการท าบรสทธมาผสมกบ treatment

buffer (Tris-HCl เขมขน 125 มลลโมลาร ท pH 68 SDS เขมขน 4 glycerol เขมขน 20 szlig-mercaptoethanol เขมขน 10 ใน bromophenol blue เขมขน 01) ดวยอตราสวน 11 ตมในน าเดอด 3 นาท ถายตวอยางลงในเจล acrylamide เขมขน 10 ท าการแยกโปรตนโดยใชความตางศกยท 120 โวลต ยอมสเจลดวย Coomassie brilliant blue G-250 จากนนตดแถบโปรตนทงสองแถบ (44 และ 50 กโลดาลตน) แลวลางดวยสารละลายผสมระหวาง ammonium bicarbonateacetonitrile ในอตราสวน 11 ทความเขมขนของ ammonium bicarbonate 100 มลลโมลาร เตมเอธานอลและตงทงไวเปนเวลา 15 นาท เมอครบเวลาถายเอธานอลออก แลวเตมสารละลาย ammonium bicarbonate เขมขน 50 มลลโมลาร ทม dithiothreitol (DTT) เขมขน 10 มลลโมลาร ตงทงไวทอณหภม 56 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง จากนนดดของเหลว ammonium bicarbonate และ DTT ออก เตมสารละลาย ammonium bicarbonate เขมขน 50 มลลโมลาร ทม iodoacetamide เขมขน 55 มลลโมลาร ตงทงไวในทมดทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท จากนนดดสารละลายผสมออกไปและลางเจลดวย ammonium bicarbonate เขมขน 50 มลลโมลาร จ านวน 2 ครง เตม acetronitrile เขมขน 100 เขยาทอณหภมหอง ถายชน acetronitrile ออก เตมเอนไซมทรปซนทม ammonium bicarbonate เขมขน 50 มลลโมลาร และบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 16 ชวโมง สกดเพปไทดทไดหลงจากยอยดวยเอนไซมทรปซนโดยการสกดสองครง โดยครงแรกเตมสารละลาย acetronitrile เขมขน 50 ทม TFA เขมขน 01 เกบเพปไทดทสกดได จากนนสกดครงทสองดวยสารละลาย acetronitrile เขมขน 80 ทม TFA เขมขน 01 เกบตวอยางทไดแลวรวมกบตวอยางทสกดไดในครงแรก ท าตวอยางใหแหงและเกบไวท -80 องศาเซลเซยสเพอรอน าไปวเคราะหดวย LCMSMS โดยใช electrospray ionization ในการท าใหเกดไอออน (ion source) และใช quadrupoletime-of-flight mass spectrometer เปนสวนของการวเคราะหมวลสาร เพอท าการวเคราะหการแตกตวของเพปไทด น าผล LCMSMS มาวเคราะหชนดของโปรตนโดยใช ฐานขอมลจาก NCBI

33

2125 วเคราะหสมบตไกลโคโปรตนของสารยบย งเอนไซมทรปซน ทดสอบความเปนไกลโคโปรตนท าตามวธของบรษท New England

Biolabs โดยการเตม glycoprotein denaturing buffer (05 SDS DTT เขมขน 40 มลลโมลาร) ลงไปในสารยบย งเอนไซมทรปซนแลวน าไปใหความรอนทอณหภม 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 10 Nonidet P-40 10x reaction beffer (Sodium Phosphate เขมขน 05 มลลโมลาร pH 75) และเอนไซม Peptide -N-Glycosidase F (PNGase F) บมสารละลายผสมนทอณหภม 37 องศา-เซลเซยสเปนเวลา 60 นาท จากนนน าตวอยางมาแยกดวยเจล acrylamide เขมขน 10 และยอมสโปรตนดวยซลเวอร

2126 ความจ าเพาะของสารยบย งโปรตเนส ทดสอบความสามารถของสารยบย งเอนไซมทรปซน ไคโมทรปซน เทอร

โมไลซน ปาเปน และเปปซนโดยใชเอโซเคซน (azocasein) เปนสารตงตนส าหรบเอนไซมทรปซน ไคโมทรปซน เทอรโมไลซนและปาเปน และใชฮโมโกลบน (hemoglobin) เปนสารตงตนส าหรบเอนไซมเปปซน บมสารละลายผสมซงประกอบดวยสารย บย ง ทไดจากการท าบรสทธ (100 ไมโครกรมมลลลตร) สารละลายบฟเฟอร Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) ปรมาตร 600 ไมโครลตร ส าหรบเอนไซมทรปซน ไคโมทรปซน เทอรโมไลซน และใชสารละลายบฟเฟอร DTT เขมขน 2 มลลโมลารใน Tris-HCl เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 75) ส าหรบเอนไซมปาเปน และสารละลายบพเฟอรไกซนไฮโดรคลอไรด (glycinendashHCl) เขมขน 50 มลลโมลาร (pH 20) ส าหรบเอนไซมเปปซน บมทกตวอยางทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 นาท จากนนเตมสารตงตน เอโซเคซนหรอ ฮโมโกลบนเขมขน 1 ปรมาตร 200 ไมโครลตร บมตวอยางทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง พอครบเวลาเตมสารละลายไตรคลอโรอะซตกเขมขน 50 ปรมาตร 500 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 10000xg ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท น าสวนใสทไดจากการใชเอโซเคซนเปนสารตงตนมา 1000 ไมโครลตร จากนนเตมโซเดยมไฮดรอกไซดทความเขมขน 10 นอรมอล ปรมาตร 100 ไมโครลตร น าไปวดคาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร ใชฮโมโกลบนเปนสารตงตนไปวเคราะหปรมาณโอลโกเปปไทดดวยวธ Lowry โดยใชไทโรซนเปนสารมาตรฐาน และวดคาการดดกลนแสงท 750 นาโนเมตร

2127 ความคงตวตอความรอน บมสารยบย งเอนไซมทรปซนทไดจากการท าบรสทธทอณหภม 30 40

50 60 70 80 และ 90 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท ทดสอบกจกรรมคงเหลอดวย เอนไซม ทรปซนและสารตงตน Boc-Asp(oBzl)-Pro-Arg-AMC บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสตามขอ 2124

34

2128 ความสามารถในการยบย งการยอยสลายตวเองของสารยบย งทรปซนแอลฟา-1

เตมสารยบย งเอนไซมทรปซนทผานการท าบรสทธทความเขมขน 0 025 05 และ 1 มลลกรม โปรตน100 กรมของน าหนกทงหมด ลงไปในซรมจากปลาตาหวาน (2 กรม) จากนนบมทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบเวลาจงเตมสารละลายโซเดยมโดเดซลซลเฟต (sodium dedocylsulfate) เขมขน 5 ปรมาตร 18 มลลลตร จากนนบดผสมและบมตวอยางทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท น าสวนผสมไปปนเหวยงท 10000xg ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท วเคราะหปรมาณโปรตนของสารละลายสวนใสดวยวธ Lowry โดยใช Bovine serum Albumin (BSA) เปนสารละลายมาตรฐาน แสดงคาปรมาณโปรตนในหนวยมลลกรมมลลลตร และวเคราะหรปแบบของโปรตนโดยใชเจล acrylamide เขมขน 10 ตามวธของ Laemmli (1970) โดยน าสารละสายโปรตนผสมกบ treatment buffer (Tris-HCl เขมขน 125 มลลโมลาร ท pH 68 SDS เขมขน 4 glycerol เขมขน 20 szlig-mercaptoethanol เขมขน 10 และ bromophenol blue เขมขน 01) ดวยอตราสวน 11 ตมในน าเดอด 3 นาท แยกโปรตนดวยคาความตางศกย 120 โวลต ยอมสดวย Coomassie brilliant blue R-250 และลางสออกดวยสารผสมระหวางเอธานอลเขมขน 25 และกรดอะซตกเขมขน 10

22 สมบตกำรยบยงกจกรรม ACE ของคอลลำเจนไฮโดรไลเสท

221 การเตรยมคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลา น าคอลลาเจนทสกดจากหนงปลานลและหนงปลาดกบกอย มายอยดวยเอนไซม

ทางการคา 3 ชนด คอ ทรปซน เพปซน และ อลคาเลส และเอนไซมจาก Virgibacillus sp SK39 โดยเตรยมสารละลายคอลลาเจนจากปลานลและปลาดกบกอยทความเขมขน 275 มลลกรมมลลลตร ในสารละลายบฟเฟอร McIlvain เขมขน 02 โมลาร ภายใตสภาวะทเหมาะสมตอการท างานของเอนไซมแตละชนด ส าหรบเอนไซมอลคาเลสและทรปซนยอยท pH 8 อณหภม 50 องศาเซลเซยส เอนไซมเพปซนยอยท pH 2 อณหภม 37 องศาเซลเซยส และเอนไซมจาก Vigibacillus sp SK39 คมสภาวะการยอยท pH 6 อณหภม 55 องศาเซลเซยส โดยก าหนดปรมาณเอนไซมทกชนดเทากบ 36 มลลยนต (1 ยนต หมายถงปรมาณเอนไซมทสามารถยอยคอลลาเจนไดผลผลตหนวยมลลโมล (สมมลไกลซน)นาท) ควบคมอณหภมโดยใชอางน ารอนแบบเขยา (Memmert model WNB22 Schwabach Germany) เกบตวอยางทไดจากการยอยทก 1 2 3 4 และ 6 ชวโมง จากนนน าตวอยางไปใหความรอนในน าเดอด 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เพอหยดปฏกรยา ปนเหวยงท 10000 g อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ปรบ pH ของไฮโดรไลเสทใหมคาเทากบ 7 ดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 1 โมลาร หรอสารละลายไฮโดรคลอรกเขมขน 1 โมลาร

35

น าไปปนเหวยงท 10000 g อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เกบสารละลายสวนบนเพอน าไปวเคราะหหาคณสมบตในการยบย งกจกรรมของ ACE ตอไป คอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอยทไดจากการยอยดวยเพปซน แสดงสมบตในการยบย งกจกรรมของ ACE สงทสด ดงนนจงเลอกคอลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอยทยอยดวยเอนไซมเพปซนเพอศกษาตอไป ศกษาผลของ degree of hydrolysis (DH) ทมตอความสามารถในการยบย งการท างานของเอนไซม ACE ของคอลาเจนไฮโดรไลเสททระดบการยอยตางๆกนท 1 2 3 4 6 และ 8 ชวโมง

น าคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอยทมความสามารถในการยบย งการท างานของเอนไซม ACE (Angiotensin I converting enzyme) ทยอยดวยเอนไซมเพปซนมาแยกขนาดดวยกระบวนการอลตราฟวเตชน (Ultrafiltration) โดยใชเครองอลตราฟวเตชน (Pall corporation City state USA) ทมขนาดเยอกรองตางกน 2 ขนาด เรมตนจากการน าสารละลายไฮโดรไลเสทดงกลาวผานเยอกรองทมขนาด 30 กโลดาลตน เกบสวนทคางอย (Retentate) เรยกวาสวนทมขนาดมากกวา 30 กโลดาลตน สวนทผานเยอกรองน าไปผานเยอกรองทมขนาด 5 กโลดาลตน จากนนเกบสวนทคางอยซงจดเปนไฮโดรไลเสททมขนาด 5-30 กโลดาลตน ส าหรบสวนทผานเยอกรองเรยกวาสวนทมขนาดนอยกวา 5 กโลดาลตน เกบไฮโดรไลเสทแตละสวนทอณหภม -80 องศาเซลเซยส จนกวาจะน ามาศกษา

222 การวเคราะหหาความสามารถในการยบย งกจกรรมของ ACE วเคราะหความสามารถในการยบย งกจกรรมของ ACE ตามวธของ Cushman and

Cheung (1971) โดยการเตมคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจ านวน 25 ไมโครลตร จากนนเตม เอนไซม ACE ทเขมขน 25 mU จ านวน 50 ไมโครลตร และน ากลน 25 ไมโครลตร น าไปใหความรอนท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท จากนนเตมสารตงตนจ านวน 150 ไมโครลตร (สวนประกอบของสารตงตน คอ HHL เขมขน 83 มลลโมลาร ในสารละลายบอเรทบฟเฟอร 50 มลลโมลาร ทมเกลอโซเดยมคลอไรด 500 มลลโมลาร ท pH 83) และน าไปบมตอท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 60 นาท หยดปฏกรยาโดยการเตมสารละลายไฮโดรคลอรกเขมขน 1 โมลาร จ านวน 250 ไมโครลตร จากนนสกดกรดฮปพรค (hippuric acid) โดยเตมสารละลายเอทลอะซเตต (ethyl acetate) จ านวน 15 มลลลตร ลงไปในสารละลาย น าไปปนเหวยงท 800timesg เปนเวลา 15 นาท เกบสารละลายชนบนซงมกรดฮปพรค ละลายอย ใสในหลอดทดลองและน าไประเหยโดยใชกระบะทราย ควบคมความรอนของทรายท 80 องศาเซลเซยส จากนนเตมน ากลนจ านวน 1 มลลลตร เพอละลายกรดฮปพรคและกรองผานแผนกรองขนาด 045 ไมโครเมตร กอนทจะน าไปวเคราะหปรมาณกรดฮปพรคดวยเครอง HPLC โดยใช photodiode array detector (DAD (Agilent Technologies Santa Clara CA USA) ฉดตวอยางจ านวน 20 ไมโครลตร เขาคอลมน Zorbax Eclipse XDB-C18 column (46150 mm

36

Agilent Technologies Santa Clara CA USA) จากนนชะโดยใชสารละลาย mobile phase (A) ซงประกอบไปดวย 005 TFA ในน า และ (B) 005 TFA ในอะซโตไนไตรลดวยอตรา 05 มลลลตรนาท ชวงของการแยกท าโดยการเพมสดสวนของ mobile phase B ท 20ndash60 ทชวงเวลา 13 นาทแรก จากนนคงความเขมขนของ mobile phase B ท 60 เปนเวลา 2 นาท จากนนเปลยนความเขมขนของ mobile phase B เปน 20 เปนเวลา 2 นาท และวดคาการดดกลนแสงท 228 นาโนเมตร ตวอยางทใชเปน Blank เตรยมโดยการเตมสารละลายกรดไฮโดรคลอรกกอนทจะเตมเอนไซม ACE ความสามารถในการยบย งเอนไซม () ค านวณไดจากสมการดานลาง

การยบย งเอนไซม ACE =

1000

00

B

BB

CC

IICC

เมอ C0 คอปรมาณกรดฮปพรคของตวอยางทไมไดเตมคอลลาเจนและน าไปบมท 37 องศา

เซลเซยส 60 นาท (control) CB คอปรมาณ กรดฮปพรคของตวอยางทไมไดเตมคอลลาเจนและไมบมท 37 องศาเซลเซยส 60 นาท I0 คอปรมาณกรดฮปพรคของตวอยางทเตมคอลลาเจนไฮโดรไลเสทและน าไปบมท 37 องศาเซลเซยส 60 นาท และ IB คอปรมาณกรดฮปพรคของของตวอยางทเตมคอลลาเจนไฮโดรไลเสทและไมบมท 37 องศาเซลเซยส 60 นาท IC50 คอ ความเขมขนของไฮโดรไลเสททตองการใชเพอยบย งการท างานของ ACE ลง 50

223 การท าบรสทธคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอย คอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอย ทมขนาดนอยกวา 5 กโลดาลตน

แสดงความสามารถในการยบย งกจกรรมของ ACE สงทสด ดงนนจงน ามาท าบรสทธโดยใชเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC AKTA Amersham Bioscience Co Uppsala Sweden) คอลลาเจนไฮโดรไลเสททผานการระเหดแหงน ามาละลายในโซเดยมอะซเตตบฟเฟอรเขมขน 10 มลลโมลาร และน ามาแยกดวยคอลมน carboxymethyl (CM)-Sepharose cation exchange column โดยเรมตนปรบคอลมนใหสมดลดวยสารละลายอะซเตตบฟเฟอรเขมขน 10 มลลโมลาร (pH 40) และชะดวย linear gradient ของโซเดยมคลอไรด (0-10 โมลาร) โดยใชบฟเฟอรชนดเดยวกนท 10 มลลลตรนาท ตดตามปรมาณเพปไทดโดยวดคาการดดกลนแสงท 215 นาโนเมตร และเกบสวนทแยกไดทก 1 มลลลตร จากนนรวม fraction ทแสดงความสามารถในการยบย ง ACE ทสงทสด และน าไประเหดแหงและละลายอกครงดวยน ากลน เพอน ามาแยกดวยคอลมน Superdex peptide 10300 GL column (10 mmtimes300 mm Amersham Biosciences Co Uppsala Sweden) โดยเรมตนปรบคอลมนใหสมดลดวยน ากลนและชะดวยอตราคงทท 03 มลลลตรนาท ตดตามคาการดดกลนแสงของแตละ fraction ท 215 นาโนเมตร จากนนรวม fractionทแสดงความสามารถในการยบย ง ACE ท

37

สงทสดน าไปท าการระเหดแหง และละลายอกครงดวยน ากลนแลวน ามาแยกดวยคอลมน Superdex 30 prep grade column (26times100 cm) โดยเรมตนปรบคอลมนใหสมดลดวยน ากลน และชะดวยน ากลนทอตราคงท 03 มลลลตรนาท จากนนรวม fraction ทมความสามารถในการยบย ง ACE สงทสด เพอน าไปวเคราะหหาล าดบกรดอะมโนดวย LC-MSMS

224 LC-MSMS หาล าดบกรดอะมโนของโปรตนไฮโดรไลเสททผานการแยกดวยเทคนค Size

exclusion chromatography โดยใชเทคนคลควดโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรมทร-แมสสเปกโทรมทร (LC-MSMS) แยกเพปไทดดวยนาโนคอลมน (Acclaim PepMap 100 C18 3 mm 100A 75 mm idtimes150 mm) จากนนชะเพปไทดดวยการเพมความเขมขนของอะซโตไนไตรลเขมขน 80 ในกรดฟอรมคเขมขน 01 (0-70) ว เคราะหล าดบเพปไทดโดยใชซอฟแวร Pepnovo (httpproteomicsucsdeduLiveSearch)

23 เพปไทดตำนออกซเดชนจำกวสดเหลอทงจำกโรงงำนซรม 231 การผลตโปรตเนสจาก Virgibacillus sp SK33

เตรยมกลาเชอ (Inoculum) โดยเขยโคโลนเดยวลงในอาหารเลยงเชอ Y-broth (5 NaCl 1 yeast extract 03 trisodium citrate 02 KCl and 25 MgSO4

7H2O pH 70) บมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส จนกระทงคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 นาโนเมตร เทากบ 0300 ซงมเชอประมาณ 107 CFUมลลลตร จากนนปเปตกลาเชอปรมาตร 50 มลลลตร ลงในอาหารเลยงเชอสตรดดแปร ซงเตมกากยสตจากโรงงานผลตเบยรเปนแหลงไนโตรเจนราคาถกในสดสวนเทากบ yeast extract ปรมาตร 450 มลลลตร บมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส ความเรวรอบ 100 รอบตอนาทเปนเวลา 3 วน น า extracellular proteinase ทผลตไดไปท าแหงดวยวธการระเหดแหง เกบเอนไซมทไดทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอใชในการวเคราะหตอไป

232 การผลตโปรตนไฮโดรไลเสทและคณสมบตในการตานอนมลอสระ น าตวอยางของเหลอทงซงประกอบดวยกาง กระดกและเศษหนง และเนอเยอ

เกยวพนจากปลาทรายแดง จากโรงงานซรมในจงหวดสมทรสาคร มาอบแหงในตอบแบบถาดทอณหภม 75 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 ชวโมง จากนนบดละเอยดและผานเครองรอน และสกดไขมนโดยผสมตวอยางแหงกบ Isopropanol ในอตราสวน 13 ท 40 องศาเซลเซยส สกดซ า 3 รอบๆ ละ 20 นาท จากนนทงตวอยางทสกดไขมนออก ทงไวในตดดควนขามคนเพอก าจด Isopropanol ชงตวอยางแหงทผานการสกดไขมนออกแลว 10 กรม เตมฟอสเฟตบฟเฟอรปรมาตร 90 มลลลตร และเตม โปรตเนสทผลตจากแบคทเรยสายพนธ Virgibacillus sp SK33 และโปรตเนสทางการคาคอ เพปซน ทรปซน และ อลคาเลส จากนนยอยตวอยางทสภาวะทเหมาะสมของแตละเอนไซม คอ อณหภม 65

38

องศาเซลเซยส และ pH 80 37 องศาเซลเซยส และ pH 20 37 องศาเซลเซยส และ pH 80 และ 60 องศาเซลเซยส และ pH 80 ตามล าดบ เปนเวลา 8 ชวโมง น าตวอยางไปใหความรอนในน าเดอดเปนเวลา 10 นาท เพอหยดปฏกรยา และปนเหวยงท 10000 g อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท น าสวนใสมาวเคราะหปรมาณเพปไทดโดยวธ TNBS โดยใชลซนเปนสารมาตรฐาน วดคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระทางเคมโดยทดสอบความสามารถในการจบกบอนมลอนมลอสระ ABTS (2 2rsquo-azinobis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate (ABTS) radical scavenging activity assay) ความสามารถในการรดวซเหลกเฟอรค (Ferric reducing antioxidant power) ความสามารถในการยบย งการฟอกสของเบตาแคโรทน (Inhibition of szlig-carotene bleaching assay) และคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระโดยวดความสามารถปองกนเซลล HepG2 จากออกซเดชนทเหนยวน าโดยเทอร-บวทลไฮโดรเพอรออกไซด (tert-butyl hydroperoxide TBHP) โดยพบวาโปรตนไฮโดร-ไลเสทจากกาง กระดก และ เศษหนงมฤทธในการตานอนมลอสระทสงกวาโปรตนไฮโดรไลเสทจากของเหลอทงจากเนอเยอเกยวพน อยางไรกตาม โปรตนไฮโดรไลเสทจากวตถดบทงสองแหลง สามารถปองกนเซลล HepG2 จากออกซเดชนทเหนยวน าโดย TBHP โปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดก และ เศษหนงทยอยดวยเพปซนมฤทธในการตานอนมลอสระสงสด ตามดวย Virgibacillus sp SK33 ทรปซนและอลคาเลส ตามล าดบ ดงนนจากการทดลองนจงเลอกของเหลอทงจากกาง กระดก และ เศษหนง เพอเปนวตถดบในการผลตโปรตนไฮโดรไลเสท และเพอเปนการใชประโยชนของเอนไซมจากแหลงใหม จงเลอกโปรตเนสทผลตจากแบคทเรยสายพนธ Virgibacillus sp SK33 ในการผลตโปรตนไฮโดรไลเสททมคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระและน าตวอยางโปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดก และ เศษหนงทยอยดวยเอนไซมจาก Virgibacillus sp SK33 ไปท าบรสทธโดยเทคนค Anion exchange chromatography โดยใชคอลมน DEAEndashSephacel และ Size exclusion chromatography

233 การท าบรสทธบางสวนโปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดกและเศษหนง 2331 การท าบรสทธโดยใชเทคนค Anion exchange chromatography

น าตวอยางโปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดก และ เศษหนงทยอยดวยเอนไซมจาก Virgibacillus sp SK33 เวลา 8 ชวโมง มาท าบรสทธโดยเทคนค Anion exchange chromatography ดวยเครอง FPLC ฉดตวอยางปรมาตร 1 มลลลตร ผานคอลมน DEAE-Sephacel (26 เซนตเมตรtimes5 เซนตเมตร GE Healthcare Bio-Sciences AB Uppsala Sweden) ชะเพปไทดทไมเกาะกบคอลมน (Unbound fraction) ดวยสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl (pH 80) เขมขน 50 มลลโมลาร และชะเพปไทดทเกาะกบคอลมน (Bound fraction) ดวยการเพมความเขมขนของสารละลายโซเดยม-คลอไรดในบฟเฟอรเดมจาก 0 เปน 1 โมลาร เกบตวอยาง (Fraction) ละ 5 มลลลตร วดปรมาณ เพปไทดดวยวธ Lowry โดยใช Tyrosine เปนสารมาตรฐานและวดคณสมบตในการเปนสารตาน

39

อนมลอสระดวยวธวดความสามารถในการจบกบอนมล ABTS (ABTS radical scavenging activity assay) และความสามารถในการใหรดวซเหลกเฟอรค (Ferric reducing antioxidant power) ทเพปไทดเขมขน 01 มลลกรม (tyrosine equivalent)มลลลตร เกบตวอยางทมคาความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระสงสดเพอท าบรสทธในขนตอนตอไป

2332 การท าบรสทธโดยใชเทคนค Size exclusion chromatography น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Anion exchange

chromatography ซงมคาความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระสงทสดไปท าบรสทธตอดวยเทคนค Size exclusion chromatography ฉดตวอยางปรมาตร 3 มลลลตร ผานคอลมน Superdex 30 prep grade (150 CV) ชะตวอยางดวยน าก าจดไอออน (Deionized water) เกบตวอยาง (Fraction) ละ 3 มลลลตร วดปรมาณเพปไทดดวยวธ Lowry โดยใช Tyrosine เปนสารมาตรฐานและวดคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระทางเคมดวยวดความสามารถในการจบกบอนมล ABTS ความสามารถในการรดวซเหลกเฟอรค ความสามารถในการจบกบโลหะ (Metal chelating assay) และความสามารถในการจบกบอนมล ไฮดรอกซล (Hydroxyl radical scavenging assay) ทเพปไทดเขมขน 005 มลลกรม (tyrosine equivalent)มลลลตร และคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระทางชวภาพโดยทดสอบความ สามารถในการตานสารอนมลอสระในระบบเซลล (Cellular radical scavenging assay)

234 การวดคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระทางเคม 2341 ความสามารถในการจบอนมลอสระ ABTS

น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Anion exchange และ Size exclusion chromatography มาวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระ โดยปเปตตวอยาง เพปไทด ปรมาตร 20 ไมโครลตร และสารละลาย ABTS เขมขน 7 มลลโมลาร ปรมาตร 1980 ไมโครลตร ผสมใหเขากน ทงไวในทมด 5 นาท จากนนวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 734 นาโนเมตร เทยบกบสารมาตรฐาน Trolox ทความเขมขน 0 05 10 15 20 และ 25 มลลโมลาร ความสามารถในการตานสารอนมลอสระของตวอยางแสดงในหนวยความเขมขนของสารมาตรฐาน Trolox

2342 ความสามารถในการรดวซเหลกเฟอรค น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Anion exchange และ Size

exclusion chromatography มาวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระโดยวดความสามารถในการรดวซเฟอรคไอออนเปนเฟอรสไอออน โดยปเปตตวอยางเพปไทด ปรมาตร 100 ไมโครลตร และสารละลาย FRAP 1000 ไมโครลตร ซงประกอบดวยสารละลาย 2 4 6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) เขมขน 10 มลลโมลาร ในกรดไฮโดรคลอรก 40 มลลโมลาร ปรมาตร 25 มลลลตร FeCl36H2O

40

เขมขน 20 มลลโมลาร ปรมาตร 25 มลลลตร และ อะซเตตบฟเฟอร เขมขน 300 มลลโมลาร ปรมาตร 25 มลลลตร pH 36 ผสมใหเขากน บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท จากนนวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 593 นาโนเมตร เทยบกบสารมาตรฐาน Trolox ทความเขมขน 0 0025 005 0075 0125 02 และ 025 มลลโมลาร ความสามารถในการตานสารอนมลอสระของตวอยางแสดงในหนวยความเขมขนของสารมาตรฐาน Trolox

2343 ความสามารถในการจบกบโลหะ น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Size exclusion

chromatography มาวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระโดยวดความสามารถในการจบกบโลหะเฟอรสไอออน ปเปตตวอยางเพปไทด ปรมาตร 100 ไมโครลตร จากนนเตมน าปราศจากไอออน ปรมาตร 2000 ไมโครลตร FeCl2 เขมขน 2 มลลโมลาร ปรมาตร 50 ไมโครลตร และ ferrozine เขมขน 5 มลลโมลาร ปรมาตร 100 ไมโครลตร บมทอณหภมหอง นาน 20 นาท จากนนวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 562 นาโนเมตร เทยบกบสารมาตรฐาน EDTA ทความเขมขน 0 01 02 03 05 07 และ 10 มลลโมลาร ความสามารถในการตานสารอนมลอสระของตวอยางแสดงในหนวยความเขมขนของสารมาตรฐาน Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

2344 ความสามารถในการจบกบอนมลไฮดรอกซล น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Size exclusion

chromatography มาวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระวดความสามารถในการจบอนมลไฮดรอกซล โดยปเปตตวอยางเพปไทด ปรมาตร100 ไมโครลตร จากนนเตมน าปราศจากไอออน ปรมาตร 500 ไมโครลตร โซเดยมฟอสเฟตบพเฟอร (pH 74) เขมขน 02 โมลาร ปรมาตร 450 ไมโครลตร 2-deoxyribose เขมขน 10 มลลโมลาร ปรมาตร 150 ไมโครลตร FeSO4ndashEDTA เขมขน 10 มลลโมลาร ปรมาตร 150 ไมโครลตร ไฮโดรเจนเปอรออกไซดเขมขน 10 มลลโมลาร ปรมาตร 150 ไมโครลตร ผสมใหเขากน บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 4 ชวโมง หลงจากนนเตมกรดไตรคลอโรอะซตก (trichloroacetic acid) เขมขน 28 ปรมาตร 750 ไมโครลตร และกรด ไทโอบารบทรค (thiobarbituric acid) เขมขน 10 ปรมาตร 750 ไมโครลตร ผสมใหเขากน ตมในน าเดอดนาน 10 นาท จากนนแชในน าแขง และวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 520 นาโนเมตร (A520) เทยบความสามารถในการตานสารอนมลอสระของตวอยางแสดงในหนวยเปอรเซนตการยบย งดงสมการ Control ใชน าปราศจากไอออน ปรมาตร 100 ไมโครลตร แทนเพปไทด

Inhibition = (1-A520 of sample) x 100

A520 of control

41

235 คณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระทางชวภาพ น าตวอยางทผานการท าบรสทธดวยเทคนค Size exclusion chromatography และ

เพปไทดสงเคราะห มาวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระในเซลล โดยใชเซลลมะเรงตบ (HepG2 cell) ซงทดสอบโดยการบมตวอยางเพปไทดทไดจากการท าบรสทธดวยเทคนค Size exclusion chromatography และเพปไทดสงเคราะหทความเขมขน 10 และ 20 ไมโครกรมมลลลตร กบ HepG2 cell ในอาหารเลยงเซลล Dulbeccorsquos Modified Eagle Media Nutrient Mixture F-12 (DMEM-F12) เปนเวลานาน 1 ชวโมง จากนนเตมสาร 2rsquo 7rsquo-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA) ทความเขมขนสดทาย 10 ไมโครโมลาร ซงเมอ DCFH-DA ผานเขาไปในเซลลแลวจะถกยอยดวยเอนไซมเอสเทอเรสทอยภายในเซลลกลายเปน DCFH ซงเปนสารไมเรองแสง แตถาภายในเซลลมอนมลอสระ ซงในการทดลองนใชไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) เขมขน 03 มลลโมลาร ในการเหนยวน าใหเกดอนมลอสระภายในเซลล DCFH จะถกออกซไดซเปน DCF ซงสามารถเรองแสงได (Fluorescence) ถาเพปไทดทท าการทดสอบมความสามารถในการจบกบอนมลอสระกจะท าใหการเรองแสงของ DCF ลดลงซงวดโดยใชเครอง Spectramax Gemini EM fluorescence microplate reader ทความยาวคลนกระตน (Excitation wavelength) 485 นาโนเมตร และความยาวคลนคายแสง (Emission wavelength) 530 นาโนเมตร ความสามารถในการตานสารอนมลอสระในเซลลของตวอยางแสดงในหนวยความเขมขนของการเรองแสงสมพทธ ( Relative fluorescence intensity) เทยบกบตวอยางทเตมไฮโดรเจนเปอรออกไซดทไมไดเตมเพปไทด

236 การหาล าดบกรดอะมโนดวยวธ LC-MSMS หาล าดบกรดอะมโนของโปรตนไฮโดรไลเสทจากกาง กระดก และเศษหนงปลา

ทรายแดงทผานการแยกดวยเทคนค Size exclusion chromatography โดยใชเทคนคลควดโครมาโท-กราฟแมสสเปกโทรมทร-แมสสเปกโทรมทร (LC-MSMS) เชนเดยวกบวธการในขอ 224

237 การสงเคราะหเพปไทด เนองจากเพปไทด B3 ทไดมาจากการแยกโดยเทคนค size exclusion

chromatography มฤทธในการตานอนมลอสระสงในหลายกลไกลและมปรมาณผลผลตสง ดงนนจงสงเคราะหเพปไทดทไดจากการวเคราะหล าดบเพปไทดของ fraction B3 ทไดจากเทคนค LC-MSMS ดวยวธ solid phase peptide synthesis โดยเพปไทดสงเคราะหไดแก VELLVPK LGTGTDL และ NTFLFFK ซงท าบรสทธดวยเทคนค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) โดยใชคอลมน Amethyst C18-H (46times250 mm) เพปไทดสงเคราะห AGNQVLNLQADLPK และ FLGSFLYEYSR ท าบรสทธโดยใชคอลมน Crest ODS (46 times 250 mm) และ SinoChrom ODS-BP (46 times 250 mm) ตามล าดบ วเคราะหมวลโมเลกลของเพปไทดสงเคราะหดวยเทคนค LCndashMSESI จากนนทดสอบคณสมบตในการเปนสารตานอนมลอสระของเพปไทดแตละชนทความเขมขน 5

42

มลลกรมมลลลตร โดยวดความสามารถในการจบกบอนมล ABTS และทดสอบการเสรมฤทธของเพปไทดแตละชนในการเปนสารตานอนมลอสระโดยการผสมเพปไทดสงเคราะหแตละชนโดยใหมความเขมขนสดทายเทากบ 5 มลลกรมมลลลตร

43

บทท 3 ผลการวจย

44

31 สารยบยงเอนไซมโปรตเนสจากปลา 311 คณสมบตโปรตนซารโคพลาสมกสกด

3111 ผลตอการยบย งกจกรรมเอนไซมทรปซน เมอเปรยบเทยบกจกรรมของสารยบย งเอนไซมทางการคาไดแก โปรตน

ไขขาว โปรตนเวยและโปรตนถวเหลอง กบสารยบย งจากโปรตนซารโคพลาสมกสกด พบวาโปรตนไขขาวมความสามารถในการยบย งกจกรรมเอนไซมทรปซนสงสดทสภาวะการบมท 40 และ 65 องศาเซลเซยส (plt005) (รปท 31) ความสามารถในการยบย งของโปรตนเวยและโปรตนถวเหลองไมแตกตางจากโปรตนซารโคพลาสมกจากปลาไน (plt005) โปรตนไขขาว โปรตนเวย โปรตนถวเหลอง และโปรตนซารโคพลาสมกมระดบการยบย งเทากบ 942 905 888 และ 886 ตามล าดบ ท 40 องศาเซลเซยส และเมอวเคราะหทอณหภม 65 องศาเซลเซยสพบวามระดบการยบย งเทากบ 785 651 608 และ 537 ตามล าดบ จะเหนไดวาทอณหภม 40 องศาเซลเซยสมระดบการยบย งสงกวาทอณหภม 65 องศาเซลเซยส ซงอาจบงชไดวาทอณหภม 65 องศาเซลเซยสสารยบย งบางสวนเกดการสญเสยสภาพธรรมชาตสงผลใหความสามารถในการยบย งการท างานของเอนไซมลดลง จากผลดงกลาวยนยนไดวาโปรตนซารโคพลาสมกสกดจากปลาไนมสารยบย งเอนไซมทรปซนเปนองคประกอบ

รปท 31 ความสามารถยบย งกจกรรมเอนไซมทรปซน วเคราะหทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยส

EW egg white power (โปรตนไขขาว) WPC whey protein concentrate (โปรตนเวย) SPI soy protein isolate (โปรตนถวเหลอง) SP crude sarcoplasmic protein (โปรตนซารโค-พลาสมก)

45

3112 ผลตอการเกดเจลของซรมจากปลาทรายแดง อณหภมในการบมและโปรตนซารโคพลาสมกมผลตอคาแรงและ

ระยะทาง ณ จดแตกหก การบมทอณหภม 40 องศาเซลเซยสสงผลใหไดคาแรง ณ จดแตกหกสงกวาทอณหภมอน (plt005 รปท 32ab) เนองจากทอณหภมนจะเกดเซทตง (setting) ซงโดยทวไปปลาทอาศยอยในเขตรอนจะเกดการปรากฏการณนทอณหภมสง และทอณหภมนยงเปนสภาวะทเหมาะสมตอการท างานของเอนไซมทรานสกลตามเนส โดยเอนไซมนจะท าใหเกดการเชอมโยงของสายโปรตนมากขนสงผลใหคาแรงของเจลเพมมากขนดวย ส าหรบการบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยสพบวาคาแรงและระยะทาง ณ จดแตกหกต าทสดท งนอาจเนองมาจากทสภาวะนเปนสภาวะทเหมาะสมตอการกระตนการท างานของเอนไซมโปรตเนส ในเจลทบมทอณหภม 25 องศาเซลเซยสและในสภาวะทไมไดบม (อณหภม 90 องศาเซลเซยส) พบวามคาแรงและระยะทาง ณ จดแตกหกสงกวาการบมท 65 องศาเซลเซยสแตต ากวาทอณหภม 40 องศาเซลเซยส เนองมาจากทสภาวะนไมไดสงเสรมกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสและเอนไซมทรานกลตามเนส

เมอเตมโปรตนซารโคพลาสมกพบวาคาแรงและระยะทาง ณ จดแตกหกมคาสงกวาเจลในสภาวะทไมเตมโปรตนซารโคพลาสมก ซงเหตการณนพบทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยส และเมอทดสอบการเสอมสลายของซรมจากปลาทรายแดงโดยวดคาโอลโกเพปไทด พบวาในตวอยางทไมเตมโปรตนซารโคพลาสมก ระดบการยอยของเอนไซมโปรตเนสสงสดทอณหภม 65 องศาเซลเซยสและเอนไซมโปรตเนสยงคงแสดงกจกรรมไดดทอณหภม 40 องศาเซลเซยส (รปท 33) แตเมอเตมโปรตนซารโคพลาสมกสงผลใหคาโอลโกเพปไทดลดลงทงการบมทอณหภม 40 และ 65 องศาเซลเซยส ซงบงชวาการเตมโปรตนซารโคพลาสมกชวยใหคาเนอสมผสของซรมเพมมากขนซงเปนผลมาจากการยบย งกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสในซรมของปลาทรายแดง ดงนนเพอทจะทราบชนดของโปรตนทมคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซมทรปซน จงท าบรสทธสารยบย งเอนไซมทรปซนจากโปรตนซารโคพลาสมก

46

รปท 32 ผลของโปรตนซารโคพลาสมกสกดจากปลาไนและอณหภมในการบมตอคาแรง (a) และ

ระยะทาง (b) ณจดแตกหกของเจลจากซรมปลาทรายแดงทความเขมขนของแคลเซยม 0 01 03 และ 05 SP ตวอยางทเตมโปรตนซารโคพลาสมกสกด 018

(a)

(b)

47

รปท 33 ผลของการเตมโปรตนซารโคพลาสมกและอณหภมในการบมทระดบตางๆตอการเสอม

สลายของโปรตนกลามเนอปลาทรายแดง เมอเตมแคลเซยมคลอไรดในระดบ 0 01 03 และ 05 SP ตวอยางทเตมโปรตนซารโคพลาสมกสกด 018

312 การท าบรสทธสารยบย งเอนไซมทรปซนจาก crude โปรตนซารโคพลาสมก

3121 การท าบรสทธสารยบย งเอนไซมทรปซน ขนตอนการท าบรสทธของสารยบย งเอนไซมทรปซนจากปลาไนได

แสดงในตารางท 31 หลงจากการใหความรอนและตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต พบวาคาความบรสทธ (purification fold) เพมขน 7 เทา จากนนสารยบย งเอนไซมทรปซนถกแยกตอดวยวธการแลกเปลยนประจลบ โปรตนทมคณสมบตในการเปนสารยบย งสามารถจบยดกบสารตวกลาง ในขณะทโปรตนทมประจเหมอนกบสารตวกลางซงเปนโปรตนทไมมความสามารถในการเปนสารยบย งถกก าจดออกในปรมาณมาก (รปท 34a) สงผลใหคาความบรสทธเพมเปน 23 เทา จากนนใชวธการจบแบบจ าเพาะโดยม concanavalin A เปนลแกนด สารยบย งเอนไซมทรปซนสามารถจบกบลแกนดได (รปท 34b) ดงนนสารยบย งนเปนไกลโคโปรตน จากนนแยกตอดวยวธการแยกตามขนาดโมเลกล (รปท 34c) หลงจากการท าบรสทธ โปรตนทไดมคาความบรสทธเทากบ 129 เทา และปรมาณผลผลตเทากบ 28

48

ตารางท 31 การท าบรสทธของสารยบย งเอนไซมทรปซนจากโปรตนซารโคพลาสมกของปลาไน Step Total protein

(mg) Total activity

(unit) Specific activity

(unitmg) Purity (fold)

Yield ()

Crude extract 205641 138021 067 1 100 Heat treatment 91685 103726 113 169 7515 (NH4)2SO4 precipitation 18236 85829 471 701 6219 DEAE-Sephacel 1037 15925 1536 2289 1154 Con A-Sepharose 129 9269 7208 10739 672 Sephacryl S-300 045 3903 8673 12923 283

รปท 34 โครมาโตแกรมการท าบรสทธของสารยบย งเอนไซมทรปซนจากโปรตนซารโคพลาสมก ปลาไน การแยกดวยวธการแลกเปลยนประจลบ (a) การจบจ าเพาะดวยลแกนด concanavalin A (b) และการแยกตามขนาดโมเลกล (c)

(c)

(b) (a) (a)

49

3122 ขนาดโมเลกล โปรตนซารโคพลาสมกประกอบดวยโปรตนทเปนองคประกอบอย

หลายชนดโดยมขนาดโมเลกลตงแต 23 ถง 150 กโลดาลตน (รปท 35a เลนท 1) หลงจากผานการท าบรสทธดวยวธการแยกตามขนาดแลว พบโปรตนทมขนาดโมเลกลประมาณ 44 และ 50 กโลดาลตน (รปท 35a เลนท 6) จากการทดสอบการยบย งกจกรรมของเอนไซมทรปซนโดยใชเทคนค inhibitory activity staining พบวาแถบโปรตนทงสองยงคงปรากฏบนแผนเจลภายหลงการยอยสลายดวยเอนไซมทรปซน (รปท 35b เลนท 6) ดงนนโปรตนทมขนาดโมเลกล 44 (Inhibitor I) และ 50 (Inhibitor II) กโลดาลตนทไดจากการท าบรสทธซงมคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซมทรปซน

รปท 35 รปแบบโปรตนซารโคพลาสมกจากปลาไนภายใตสภาวะนอนรดวซง (a) การตรวจสอบ

การยบย งเอนไซมทรปซนบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสภายใตสภาวะนอนรดวซง (b) Std standard molecular weight 1 โปรตนซารโคพลาสมก 2 โปรตนทผานการใหความรอนทอณหภม 60 องศาเซลเซยส 3 โปรตนทผานการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตทชวงความเขมขน 50-70 4 โปรตนทผานการแยกดวยการแลกเปลยนประจลบ 5 โปรตนทผานการแยกดวยวธการจบจ าเพาะ 6 โปรตนทผานการแยกตามขนาดโมเลกล

3123 การระบชนดของโปรตน

โปรตนทงสองแถบทไดจากการท าบรสทธถกตดและยอยใหเปนเพปไทดสายสนๆโดยเอนไซมทรปซน เอนไซมจะตดตรงต าแหนงกรดอะมโนทจ าเพาะตอเอนไซมของโปรตนแตละชนด น ามาวเคราะหตอดวย LCMSMS เพอหาล าดบกรดอะมโนทมอยในโปรตนชนด

31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50

นนๆ แลวน าขอมลของล าดบกรดอะมโนทไดมาเทยบกบฐานขอมลโปรตน จากการศกษาพบวาโปรตนทมขนาดโมเลกล 44 กโลดาลตน (Inhibitor I) และ 50 กโลดาลตน (Inhibitor II) มล าดบกรดอะมโนใกลเคยงกบโปรตนยบย งทรปซนชนดแอลฟา-1 (alpha-1-antitrypsin) (ตารางท 32) ตารางท 32 ผลการระบชนดของโปรตนโดย LC-MSMS

Sample Accession number

Protein Species Mascot score

Inhibitor I (44 kDa)

gi 416561 Alpha-1-antitrypsin homolog

Cyprinus carpio (common carp)

143

Inhibitor II (50 kDa)



399

3124 การพสจนความเปนไกลโคโปรตน

ระหวางการท าบรสทธพบวาโปรตนทมคณสมบตในการเปนสารยบย งเอนไซมทรปซนสามารถจบกบลแกนด concanavalin A ไดด ดงนนโปรตนชนดนอาจเปนไกลโค-โปรตน เพอทดสอบสมมตฐานนจงไดใชเอนไซม PNGase F เพอทจะตดพนธะระหวางโปรตนและน าตาลทต าแหนง N-linked จากรปท 36 จะเหนไดวาโปรตนทงสองมขนาดโมเลกลลดลงหลงจากการเตมเอนไซม PNGase F โดย Inhibitor I มขนาดโมเลกลลดลงจาก 44 กโลดาลตนเปน 36 กโล-ดาลตนขณะท Inhibitor II มขนาดโมเลกลลดลงจาก 50 กโลดาลตนเปน 45 กโลดาลตน จากผลนจงยนยนไดวา Inhibitor I และ II เปนไกลโคโปรตน

3125 ผลของสารยบย งบรสทธตอความสามารถในการยบย งเอนไซม สารยบย งทรปซนแอลฟา-1ทท าบรสทธไดมความสามารถในการยบย ง

เอนไซมทรปซนไดสงสด (ตารางท 33) และสามารถยบย งเอนไซมไคโมทรปซนและปาเปนไดเลกนอย อยางไรกตามสารยบย งนไมสามารถยบย งเอนไซมเทอรโมไลซนและเปปซน จากผลนพอจะสรปไดวา สารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากโปรตนซารโคพลาสมกของปลาไนมความจ าเพาะสงตอเอนไซมทรปซน

51

รปท 36 รปแบบโปรตนในสภาวะกอนและหลงเตมเอนไซม PNGase F Std standard molecular weight 1 โปรตนในสภาวะกอนเตมเอนไซม PNGase F 2 โปรตนในสภาวะหลงเตมเอนไซม PNGase F

3126 เสถยรภาพตออณหภมของสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไน

กจกรรมการยบย งของโปรตนแอลฟา-1ไมเปลยนแปลงในชวงอณหภม 30-60 องศาเซลเซยส (รปท 37) จากนนเรมลดลงทอณหภมสงกวา 60 องศาเซลเซยส ทอณหภมประมาณ 70 องศาเซลเซยส ยงคงมกจกรรมการยบย งสงถง 80 อยางไรกตาม กจกรรมการยบย งลดลงอยางมากทอณหภมสงกวา 80 องศาเซลเซยสและไมพบการยบย งเอนไซมทอณหภมประมาณ 90 องศาเซลเซยส ดงนนสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไน มแนวโนมทจะยบย งโปรตเนสใน กระบวนการผลตเซตตงของซรมซงใชอณหภมประมาณ 40 องศาเซลเซยสส าหรบซรมทผลตจากปลาเขตศนยสตร (tropical surimi)

3127 ความสามารถในการยบย งการยอยสลายตวเองในซรมปลาตาหวาน เมอพจารณารปแบบโปรตนของซรมปลาตาหวานทบมทอณหภม 65

องศาเซลเซยสในกรณทไมไดเตมสารยบย งทรปซนแบบแอลฟา-1 พบวามยโอซนสายหลก (myosin heavy chain) มการยอยสลายตวเองสง (รปท 38) ทงนยงพบวาความหนาแนนของโปรตนโทโปรมย-โอซน (Tropomyosin) ลดลงดวยเชนกนทอณหภมน ในขณะทแถบมยโอซนสายหนกทอณหภม 40 องศาเซลเซยสลดลงแตนอยกวาตวอยางบมท 65 องศาเซลเซยส จากผลนสรปไดวาการยอยสลายตวเองของปลาตาหวานโดยโปรตเนสเกดรนแรงทอณหภมประมาณ 65 องศาเซลเซยส

150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52

ตารางท 33 ผลการยบย งโปรตเนสชนดตางๆ โดยสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไน Proteinase Inhibition ()

Serine proteinase Trypsin 100 + 189 α-Chymotrypsin 2071 + 152 Metallo proteinase Thermolysin 0 Cysteine proteinase Papain 2698 + 132 Aspartic proteinase Pepsin 0

รปท 37 เสถยรภาพตออณหภมของโปรตนยบย งทรปซนแอลฟา-1

การเสอมสลายของมยโอซนสายหลกและโทรโปมยโอซนลดลงในตวอยางทเตมสารยบย ง

ทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไน ทงสองอณหภมการบม ถงแมวาทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนสภาวะในการใหความรอนทคอนขางสงแกซรม แตกยงคงพบวาสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 สามารถขดขวางการยอยสลายตวเองโดยโปรตเนสของซรมปลาตาหวานไดด ซงอาจเปนเพราะสารยบย งสามารถทนความรอนได (รปท 38) ความหนาแนนของโปรตนเหลานเพมสงขนเมอเพมความเขมขนของสารยบย งบรสทธ จากผลนอาจกลาวไดวาสารยบย งทรปซนแอลฟา-1 จากปลาไนมผลยบย งกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสจากซรมปลาตาหวานไดด

53

รปท 38 รปแบบโปรตนของซรมปลาตาหวานบมทอณหภม 40 (เลนท 2-5) และ 65 (เลนท 6-9)


32 สมบตการยบยงเอนไซม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสท 321 ความสามารถในการยบย ง ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสท

การศกษานท าโดยใชเอนไซม 4 ชนด คอ อลคาเลส เพปซน ทรปซนและเอนไซมจาก Virgibacillus sp SK39 ในการผลตโปรตนไฮโดรไลเสทโดยใชทความเขมขน 36 mU เทากน ใชคอลลาเจนเปนสารตงตนและความเขมขนของคอลลาเจนทใชในปฏกรยาเทากบ 275 มลลกรมโปรตนมลลลตร พบวา ไฮโดรไลเสทจาก เพปซน ทงคอลลาเจนไฮโดรเสทจากปลานลและปลาดกแสดงความสามารถในการยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE ไดสง

เพปไทดทมสมบตยบย งการท างานของเอนไซม ACE ทมรายงานโดยสวนมากแลวมกประกอบไปดวยกรดอะมโนทไมชอบน า (hydrophobic) เชน proline phenylalanine และ tyrosine ต ำแหนงทสำมจำกปลำยสำยดำนคำรบอกซล (Cheung et at 1980) เพปซนมควำมสำมำรถในกำร

Alpha-1-antitrypsin (mg proteing total weight)

MHC

AC

TM

40 ordmC (60 min) 65 ordmC (60 min)

Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54

ตดพนธะเพปไทดระหวำงกรดอะมโนไฮโดรโฟบค และ อะโรมำตก เชน phenylalanine tryptophan and tyrosine (Nelson and Cox 2000)

ตารางท 34 ควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE ของเพปไทดคอลลำเจนจำกหนง

ปลำนลและหนงปลาดกบกอย

Enzyme TS collagen HS collagen

ACE inhibition () DH () ACE inhibition () DH () Virgibacillus sp SK39 4165 plusmn 080b 2825 1467 plusmn 124a 2833 Pepsin 9325 plusmn 050g 3103 9257 plusmn 017g 3219 Trypsin 4662 plusmn 528c 516 5053 plusmn 065d 755 Alcalase 8743 plusmn 054f 3118 7994 plusmn 076e 2443

Different letters indicate significant differences among mean (plt005) Values are expressed as mean plusmn SD (n = 4)

ดงนนเพปไทดทไดจำกกำรยอยโดยเพปซนจะประกอบไปดวยกรดอะมโนอะโรมำตกหรอ

ไฮโดรโฟบคทปลำยสำยดำยคำรบอกซล จำกผลขำงตนแสดงใหเหนวำเพปซนสำมำรถผลตเพปไทดทมควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE สงกวำเอนไซมอนๆ Lee et al (2009) รำยงำนวำไฮโดรไลเสททไดจำกกำงปลำทนำโดยใชเอนไซมเพปซน แสดงควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของ ACE สงทสดเมอเปรยบเทยบกบ 5 เอนไซมอนๆทใชคอ Alcalase α-chymotrypsin papain Neutrase และ trypsin ไฮโดรไลเสทจำกกำงปลำคอดโดยใช เอนไซม papain แสดงควำมสำมำรถสงสดในกำรในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE มำกกวำเพปไทดทเตรยมจำก chymotrypsin trypsin pepsin และ pronase E (Jeon et al 1999) โดยปกตแลวควำมสำมำรถในกำรยอยขนอยกบธรรมชำตของสำรตงตนและชนดของเอนไซมโปรตเอส ดงนนจำกผลกำรทดลองขำงตนแสดงใหเหนวำเพปซนสำมำรถผลตเพปไทดทสำมำรถยบย งกำรท ำงำนของเอนไซม ACE สงทสด จงเลอกตวอยำงนเพอศกษำตอไป

322 ควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE ของคอลลำเจนทยอยดวยเพปซน ระดบกำรยอย (Degree of hydrolysis DH) มคำเพมขนอยำงรวดเรวในชวง 4

ชวโมงแรกของกำรยอย (รปท 39) และอตรำกำรเพมขนคอยๆลดลงหลงจำก 4 ชวโมง คอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยแสดงควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE มำกกวำไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำนลททกระดบของกำรยอย (plt005 รปท 310) ควำมสำมำรถในกำรยบย งกำรท ำงำนของเอนไซม ACE เพมสงขนเมอ DH เพมขน ทงไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำนล

55

และหนงปลำดกบกอย และควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE ไมเพมสงขน เมอ DH มคำประมำณ 30

รปท 39 ระดบการยอยคอลลาเจนจากหนงปลานล (TS collagen) และปลาดกบกอย (HS collagen)โดยเพปซนทระยะเวลาบมตางๆ

รปท 310 ควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE ของคอลลำเจนจำกหนงปลำนลและปลำดกบกอยทยอย

โดยเพปซนทระดบกำรยอยตำงๆ

56

ความสามารถในการยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลาดกบกอยทระดบการยอย 33 มคานอยกวาทระดบการยอย 30 (plt005) สวนความสามารถในการยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากหนงปลานลทระดบการยอย 38 และ 30 มคาไมแตกตางกน (pgt005) แสดงใหเหนวา ความสามารถในการยบย ง ACE ไมไดขนกบระดบการยอยแตเพยงอยางเดยว ความจ าเพาะของกรดอะมโนในสายเพปไทดอาจเปนปจจยทมผลตอกจกรรมการยบย ง ACE เพป-ไทดทมกรดอะมโน proline phenylalanine และ tyrosine ทปลายดานคารบอกซล จะสามารถจบกบเอนไซม ACE ไดด คอลลาเจนจากหนงปลาดกบกอยม proline มำกกวำคอลลำเจนจำกหนงปลำนล (Sungperm 2012) ดงนน ไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยจงมโอกำสทจะม proline ทปลำยสำยคำรบอกซลมำกกวำ จงอำจจบกบเอนไซม ACE ไดมำกกวำ ไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยจงถกเลอกเพอกำรทดลองขนตอไป

323 กำรท ำบรสทธเพปไทดทยบย ง ACE 3231 อลตรำฟลเตรชน (Ultrafiltration)

คอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยผำนกำรแยกดวยวธกำรอลตรำฟลเตรชน โดยใชแผนเยอกรองทมขนำด 30 กโลดำลตน และตำมดวยแผนเยอกรองขนำด 10 กโลดำลตน ตำมล ำดบ เกบตวอยำงเพปไทดสำมสวนคอ สวนทผำนกำรแยกดวยแผนเยอกรองทงสองขนำด เพอศกษำควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ตารางท 35 ควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ของคอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำก

หนงปลำดกบกอยทผำนกำรแยกขนำดดวยอลตรำฟลเตรชน

MW (Dalton) Inhibition () Crude hydrolysate 9257 plusmn 017a gt 30 kDa 5450 plusmn 145c 5-30 kDa 5711 plusmn 145bc lt5 kDa 6141 plusmn 140b

Different letters indicate significant differences (p lt 005) Values are expressed as mean plusmn SD (n = 4)

เมอเปรยบเทยบควำมสำมำรถของเพปไทดทผำนกำรแยกขนำดดวยอลตรำฟลเตรชนกบ

crude peptide พบวำ crude peptide มควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของ ACE มำกกวำ ทงนอำจเนองมำจำกกำรกำรท ำงำนเสรมกนของเพปไทดทมอยในระบบทงหมด หลงจำกแยกดวยอลตรำ- ฟลเตรชนควำมสำมำรถของคอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยขนอยกบขนำดของ

57

โมเลกลทตำงกน ไฮโดรไลเสททมขนำดนอยกวำ 5 กโลดำลตน แสดงควำมสำมำรถสงสดในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE (plt005 ตำรำงท 35) มกำรรำยงำนวำ bioactive peptides ทประกอบดวยกรดอะมโน 3-20 ตว และเพปไทดทมสำยสนมกมควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ไดด (Philanto 2000)

ไดมกำรศกษำถงควำมสมพนธระหวำงควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE กบขนำดโมเลกลของเพปไทด พบวำเพปไทดขนำดเลกมควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ไดดกวำเพปไทดทมขนำดใหญ เพรำะเพปไทดทมสำยยำวจะกดขวำงกำรเขำจบกบบรเวณเรง (active site) ของเอนไซม (Goacutemez-Ruiz Ramos and Recio 2007) เพปไทดขนำดเลกแสดงควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE สงกวำเพปไทดขนำดใหญและมแนวโนมในกำรดดซมเขำสล ำไสเลกไดงำยอกดวย จำกกำรศกษำพบวำคำ IC50 ของเพปไทดขนำดนอยกวำ 5 กโลดำลตน จำกคอลลำ-เจนหนงปลำดกบกอยมคำเทำกบ 901plusmn004 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร แสดงใหเหนวำเพปไทดคอลลำเจนจำกหนงปลำดกบกอยทไดจำกกำรยอยดวยเพปซนแสดงควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE ทสง คอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกแหลงตำงๆทมควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ไดแก ไฮโดรไลเสทจำกกำงปลำคอดและเนอปลำซำรดนทมขนำดโมเลกลนอยกวำ 3 กโลดำลตน แสดงคำ IC50 เทำกบ 83 ไมโครกรมมลลลตร และ 80 ไมโครกรมโปรตนมลลลตร ตำมล ำดบ (Matsu et al 1993 Jeon et al 1999) สวนไฮโดรไลเสทจำกหอยเชลล หอยนำงรม กระดกปลำคอด และหนงปลำคอด แสดงคำ IC50 ทสงกวำ 10 มลลกรมมลลลตร (He et al 2007)

3232 กำรท ำบรสทธเพปไทดทสำมำรถยบย งกจกรรมเอนไซม ACE เนองจำกคอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกหนงปลำดกบกอยทมขนำด

โมเลกลนอยกวำ 5 กโลดำลตน แสดงควำมสำมำรถในกำรยบย งเอนไซมสงทสด จงถกเลอกเพอท ำบรสทธ โดยผำนคอลมน Carboxymethyl (CM)-Sepharose cation exchange จำกผลกำรท ำบรสทธพบวำคอลมนสำมำรถแยกเพปไทดออกมำไดเปน 2 พค (peak) คอสวนทไมจบกบคอลมน (Unbound fraction) ซงก ำหนดใหเปน I และสวนทจบกบคอลมน (Bound fraction) ซงก ำหนดใหเปน II ซง fraction II น ถกชะออกมำทควำมเขมขนของเกลอเทำกบ 06-10 โมลำร และแสดงควำมสำมำรถในกำรยบย งเอนไซม ACE สงกวำ fraction I โดยมคำกำรยบย งสงถง 8698 ทปรมำณเพปไทดในปฏกรยำเทำกบ 05 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร (รปท 311 (B))

เนองจำก Fraction II มควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE สงสด จงน ำมำท ำบรสทธตอโดยกำรใชเทคนคกำรคดแยกตำมขนำด โดยใชคอลมน Superdex 30 prep grade ซงสำมำรถแยกเพปไทดออกมำเปนสองสวนคอ G-I และ G-II (รปท 312(a)) และเมอวเครำะหควำมสำมำรถในกำรยบย งกำรท ำงำนของเอนไซม ACE พบวำ fraction G-I มควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรม ACE สงกวำ G-II

58

โดยมคำกำรยบย งเทำกบ 7034 ทควำมเขมขนเพปไทดเทำกบ 02 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร

เนองจำกเพปไทดในสวน G-I มควำมสำมำรถในกำรยบย ง ACE สงกวำ G-II จงเลอกมำเพอท ำบรสทธในล ำดบถดมำ Superdex peptide 10300 GL และทำยทสดไดเพปไทดทออกมำ ดงรปท 313 ซง fraction ดงกลำวนแสดงกำรยบย งกจกรรมเอนไซม ACE ท 7206 ทควำมเขมขนของ เพปไทดเทำกบ 02 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร

รปท 311 กำรแยกเพปไทดยย ง ACE ทมขนำดต ำกวำ 5 กโลดำลตน โดย carboxymethyl (CM)-

Sepharose cation exchange column (A) เพปไทดทจบกบคอลมน ชะโดยควำมเขมขนของสำรละลำยเกลอตงแต (0-10 โมลำร) ในสำรละลำยบฟเฟอรโซเดยมอะซเตต 10 มลล-

59

โมลำร (pH 40) ดวยอตรำกำรชะเทำกบ 10 มลลลตรนำท เกบสำรละลำยทกๆ 1 มลลลตร จำกนนน ำๆเพปไทด fraction I และ II ไปวเครำะหหำควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE โดยใชควำมเขมขนของเพปไทด 05 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร (B)

รปท 312 รปแบบกำรแยกของเพปไทด fraction II โดยกำรแยกผำนคอลมน Superdex 30 prep grade

(A) โดยกำรชะดวยน ำกลนทอตรำกำรชะเทำกบ 03 มลลลตรนำท ตดตำมปรมำณเพปไทดของแตละสวนทแยกออกมำโดยวดคำกำรดดกลนแสงท 215 นำโนเมตร และเกบสำรละลำยทควำมถทกๆ 05 มลลลตร ควำมสำมำรถในกำรยบย งกจกรรมของเอนไซม ACE แสดงดงกรำฟ B ทระบเปน I และ II คอตวอยำง G-I และ G-II ตำมล ำดบ โดยใชควำมเขมขนของเพปไทด 02 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร (B)

G-I

G-I G-II

(B)

60

รปท 313 รปแบบกำรแยกของเพปไทดโดยใชคอลมน Superdex peptide 10300 GL ซงชะดวยน ำ

กลนทอตรำกำรชะเทำกบ 03 มลลลตรนำท และตดตำมปรมำณเพปไทดท 215 นำโนเมตร

น ำเพปไทดทไดจำกกำรท ำบรสทธมำวเครำะหล ำดบของกรดอะมโนโดยเทคนค LCMS-MS ซงสำมำรถแยกเพปไทดออกมำไดทงหมด 18 ชนสวน ดงแสดงในตำรำงท 36 กรดอะมโนสวนใหญทพบในเพปไทดคอ leucine (Leu) arginine (Arg) phenylalanine (Phe) และ asparagine (Asn) โดยกรดอะมทพบในปรมำณมำกทสดคอ Leu ทปลำยสำยดำนคำรบอกซล (C-terminal) สวนมำกแลวเปนกรดอะมโน Arg ในขณะทปลำยดำนอะมโน (N-terminal) ประกอบไปดวยกรดอะมโนสำยตรง กจกรรมทำงชวภำพของเพปไทดขนอยกบล ำดบของกรดอะมโน Cheng et al (1980) ไดรำยงำนวำปลำยดำนคำรบอกซลของเพปไทดมกรดอะมโนทมโครงสรำงเปนวงและปลำยดำนอะมโนมกงกรดอะมโนทมโซขำงเปนกง (branch chain) อะมโนสำมำรถยบย ง ACE แบบแยงจบแบบแบบแขงขน (competitive inhibitor) Ondetti and Cushman (1977)ไดเสนอแบบจ ำลองกำรจบกนระหวำงสำรตงตนหรอสำรยบย ง ACE ทบรเวณเรงของ ACE โดยแบงเปนบรเวณเรงยอย (subsites) เปน 3 ต าแหนง คอ S1 (anterpenultimate) S1acute (penultimate) และ S2acute (ultimate) ซงบรเวณเรงยอยทง 3 ต าแหนงจะจบกบกรดอะมโนชนดทแตกตางกน โดยสามารถจบกบเพปไทดสายสนทม Pro และ Val อยทต าแหนงปลายดานคารบอกซลไดเปนอยางด ท าใหเพปไทดทมกรดอะมโนในต าแหนงดงกลาวมคณสมบตในการยบย งการท างานของ ACE (Zhao et al 2007)

61

ตารางท 36 ล ำดบกรดอะมโนของเพปไทดทยบย ง ACE จำกกำรวเครำะหแบบ denovo peptide sequencing

Sequence no

PepNovo score

Molecular weight (Da)

Amino acid sequence

1 60708 1018626 Leu-Met-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 2 37147 921638 Glu-Asn-Leu-Ser-Phe-Arg-Arg 3 98852 903664 Glu-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 4 86536 790576 Glu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 5 48014 905657 Pro-Gln-Leu-Leu-Pro-Pro-Leu-Lys 6 4309 79166 Asp-Lys-Leu-Leu-Phe-Arg 7 86861 905671 Met-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 8 50755 1017667 Glu-Asn-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 9 43813 904795 Asn-Glu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg

10 65303 2919462 Asn-Leu-Met-Ala-Gly-Thr-Gln-Gly-Ser-Tyr-Lys 11 6483 2151592 Leu-Gln-Val-Gln-Glu-Leu-Gln-Pro-Leu-Lys 12 93703 1017864 Leu-Asn-Glu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 13 7102 812443 Glu-Leu-Leu-Asn-Pro-Val-Lys 14 62685 923765 Met-Asn-Leu-Asn-Glu-Phe-Arg 15 66785 790412 Glu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 16 70635 904757 Leu-Leu-Leu-Glu-Asn-Phe-Arg 17 35069 905667 Met-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg 18 65145 1016926 Met-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Arg

Nakagomi et al (2000) รำยงำนวำเพปไทดทแยกไดจำกอลบมนในเลอดของมนษยและใน

น ำเลอดจะมกรดอะมโน arginine ทปลำยดำนคำรบอกซล (Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg และ Tyr-Leu-Tyr-Glu-Ile-Ala-Arg-Arg) สำมำรถแสดงกจกรรมในกำรยบย ง ACE ทสง ประจบวกของกลม guanidine หรอหมแอลฟำอะมโนอำจมผลตอควำมสำมำรถในกำรยบย งเอนไซม คอลลำเจนไฮโดรไลเสทจำกหนงของปลำ skate มกรดอะมโน arginine ทปลำยดำยคำรบอกซล (Gln-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Arg) สำมำรถแสดงกจกรรมกำรยบย ง ACE ทสง โดยมคำ IC50 เทำกบ 148 ไมโครโมลำร (Lee et al 2011) มกำรศกษำล ำดบกรดอะมโนจำกอลบมนในเลอดของมนษยทถกยอยดวยเอนไซมทรปซน โดยล ำดบกรดอะมโนทไดคอ Ala-Trp และ Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-

62

Arg เพปไทด Ala-Trp เปนสำรยบย งทจะเขำจบแบบแขงขน ในขณะท Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg จะเปนสำรยบย งทเขำจบแบบไมแขงขน (noncompetitive inhibitor) กบ ACE (Tauzin et al 2002 Fujita et al 2000 Nakagomi et al 2000 Nakagomi et al 1998 Cheng et al 1980)

33 เพปไทดตานออกซเดชนจากวสดเหลอทงจากโรงงานซรม

331 ศกษำลกษณะเพปไทดทมสมบตในกำรตำนออกซเดชนจำกวสดเหลอทงจำกโรงงำนซรมโดยใชเอนไซม

3311 กำรท ำบรสทธไฮโดรไลเสทจำกกำง กระดกและเศษหนงและคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระ

น ำตวอยำงโปรตนไฮโดรไลเสทจำกกำง กระดกและเศษหนงปลำทรำยแดง ทผำนกำรยอยดวยโปรตเนสจำก Virgibacillus sp SK33 นำน 8 ชวโมง มำท ำบรสทธดวยคอลมน DEAE-Sephacel พบวำ สำมำรถแยกเพปไทดได 2 กลม คอ เพปไทดทไมเกำะกบคอลมน (fraction A) และเพปไทดทเกำะกบคอลมน (fraction B) (รปท 314a) และวดคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระโดยทดสอบควำมสำมำรถในกำรจบอนมล ABTS และควำมสำมำรถในกำรรดวซเหลกเฟอรค โดยพบวำ fraction B มควำมสำมำรถในกำรจบกบอนมล ABTS (0617plusmn0008

มลลโมลำร Trolox) และควำมสำมำรถในกำรใหอเลกตรอนกบเหลกเฟอรค (0329plusmn0002 ไมโคร โมลำร Trolox) สงกวำ fraction A (ตำรำงท 37) ดงนนจงเกบตวอยำงจำก fraction B ไปท ำบรสทธตอดวยเทคนค Size exclusion chromatography พบวำ สำมำรถแยกเพปไทดตำมขนำดได 3 กลม คอ fraction B1 B2 และ B3 (รปท 314b) ซง fraction B3 มควำมสำมำรถในกำรจบกบอนมล ABTS (0487plusmn0061 มลลโมลำร Trolox) และใหอเลกตรอนกบเหลกเฟอรค (113398plusmn7051 ไมโครโมลำร Trolox) สงทสด ในขณะท fraction B2 มควำมสำมำรถในกำรจบกบเหลกเฟอรส (0687plusmn0032 มลลโมลำร EDTA) และอนมลไฮดรอกซล (772plusmn08) สงทสด (ตำรำงท 38) เนองจำก fraction B3 ประกอบดวยเพปไทดทมกรดอะมโนไทโรซน (Y) ซงมควำมสำมำรถในกำรใหโปรตอนหรออเลกตรอนกบอนมลอสระได สวน fraction B2 ประกอบดวยเพปไทดทมกรดอะมโนกลตำมค (E) ซงมควำมสำมำรถในกำรจบกบโลหะ (ตำรำงท 39)

63

รปท 314 กำรท ำบรสทธโดยใชเทคนค Anion exchange chromatography (a) ของโปรตนไฮโดรไล-เสททผลตจำกโครงกระดก กำงและหนงปลำทรำยแดง ทยอยดวยโปรตเนสจำก Virgibacillus sp SK33 นำน 8 ชวโมง และ กำรท ำบรสทธโดยใชเทคนค Size exclusion chromatography (b) ของตวอยำงหลงจำกผำนกำรท ำบรสทธดวยเทคนค Anion exchange chromatography

A

B1

B

64

ตารางท 37 ควำมสำมำรถในกำรตำนอนมลอสระและผลผลตของโปรตนไฮโดรไลเสทจำกกระดก กำง และเศษหนงปลำทรำยแดงและตวอยำงหลงแยกดวยคอลมน DEAE-Sephacel

ตวอยาง ความสามารถในการจบกบอนมล ABTS (mM Trolox)

ความสามารถในการใหอเลกตรอนกบเหลกเฟอรค (microM Trolox)

ผลผลต()

โปรตนไฮโดรไลเสท 0214plusmn0002a 14993plusmn0324b 100 เพปไทดทไมเกำะกบคอลมน (Fraction A) 0329plusmn0002b 5926plusmn006 a 30 เพปไทดทเกำะกบคอลมน (Fraction B) 0617plusmn0008c 37447plusmn4377c 31

Different letters indicate significant differences (p lt 005) Values are expressed as mean plusmn SD

ตารางท 38 ควำมสำมำรถในกำรตำนอนมลอสระของโปรตนไฮโดรไลเสทจำกกระดก กำง และเศษหนงปลำทรำยแดงทผำนกำรแยกดวยคอลมน Superdex 30

prep size exclusion และผลผลตทได ตวอยาง ความสามารถในการจบกบ

อนมล ABTS (mM Trolox)

ความสามารถในการใหอเลกตรอนกบเหลกเฟอรค

(microM Trolox)

ความสามารถในการจบกบเหลกเฟอรส

(mM EDTA)

ความสามารถในการจบกบอนมลไฮดรอกซล ()

ผลผลต ()

เพปไทด B1 0090plusmn0006a 9255plusmn0113a 0185plusmn0007a 0a 6 เพปไทด B2 0154plusmn0004a 7536plusmn1897a 0687plusmn0032c 772plusmn08c 13 เพปไทด B3 0487plusmn0061b 113398plusmn7051b 0307plusmn0051b 553plusmn52b 50 ผลผลตเทยบกบปรมำณเพปไทดกอนฉดเขำคอลมน Superdex 30 prep size exclusion Different letters indicate significant differences (p lt 005) Values are expressed as mean plusmn SD

64

65

3312 ล าดบกรดอะมโนวเคราะหดวยเทคนค LC-MSMS น ำตวอยำงโปรตนไฮโดรไลเสทจำกกำง กระดกและเศษหนงปลำทรำย

แดงทผำนกำรแยกดวยเทคนค Size exclusion chromatography ไปหำล ำดบกรดอะมโนโดยเทคนค Tandem mass spectrometry (LC-MSMS) เพอทจะอธบำย mode of action ของเพปไทด ซงพบวำกรดอะมโนลซน (L) ไลซน (K) และอำรจนน (R) เปนองคประกอบหลกของทง 3 fractions กรดอะมโนกลตำมก (E) เปนกรดอะมโนทเดนใน fractions B1 และ B2 กรดอะมโนไทโรซน (Y) และ ทรปโตแฟน (W) พบในทง fractions B1 และ B2 ในขณะท fraction B3 ประกอบดวยกรดอะมโนกลตำมก (E) ต ำ แตมปรมำณกรดอะมโนไทโรซน (Y) สงกวำ fractions B1 และ B2 (ตำรำงท 39) ซงกรดอะมโนทรปโตแฟน (W) และไทโรซน (Y) มควำมสำมำรถใหโปรตอนหรออเลกตรอนกบอนมลอสระได (Hernaacutendez-Ledesma Davalos Bartolome and Amigo 2005) กรดอะมโนอำรจนน (D) กลตำมก (E) และไลซน (K) มควำมสำมำรถในกำรจบกบโลหะได (Saiga et al 2003)

3313 สมบตเพปไทดสงเครำะหจำก fraction B3 เนองจำก fraction B3 มคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระและม

ปรมำณผลผลตสงสด ดงนนจงสงเครำะหล ำดบกรดอะมโนของ fraction B3 และทดสอบคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระโดยวดควำมสำมำรถในกำรจบกบอนมล ABTS โดยพบวำมเพยง เพปไทด P4 (FLGSFLYEYSR) ทมฤทธเปนสำรตำนอนมลอสระ และเมอผสมเพปไทดแตละชนทควำมเขมขนของเพปไทดสดทำย 5 มลลกรมมลลลตร เพอทดสอบกำรเสรมฤทธในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระ พบวำเพปไทดแตละชนไมมกำรเสรมฤทธกน (ตำรำงท 310) ฤทธในกำรตำนอนมลอสระของเพปไทด P4 (FLGSFLYEYSR) เนองจำกกรดอะมโนไทโรซน (Y) ในล ำดบเพปไทด ซงสำมำรถใหโปรตอนหรออเลกตรอนกบอนมล ABTS ได ดงน นจงสรปไดวำ เพปไทด FLGSFLYEYSR เปนเพปไทดส ำคญซงมคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระใน fraction B3

66

Fraction No Amino acid sequence Fraction No Amino acid sequence Fraction No Amino acid sequence

B1 1 LDDEFPDLSLH B2

1 ALGDQRTFFLNSMVLEEHC B3

1 VELLVPK

2 VEDEFPDLSLH 2 LAGDQRTFFLSNMVLEEHC 2 AGNQVLNLQADLPK

3 FSLDDEFPDLSLH 3 LEDEEHPSGAELT 3 LGTGTDL

4 LDEESTLAGAHE 4 ELEELAQGPVYQA 4 FLGSFLYEYSR

5 VEEESTLAGAHE 5 PTRRYYTLFVFLKRLLLGLFRLLLFYAYKGMP 5 NTFLFFK

6 HELFAASRTLFLNRLDDLGH 6 AVLWCQRGFLEEDELKLF

7 LRFSLEHCLR 7 ELELEEELEAQLW

8 FGLEFHCLKLF 8 GNMNMEKLW

9 GFLEFCHLKLF 9 LEELEEELEGWL

10 LQLVEEWHKNWVF 10 LEELEEELEGLW

11 ASLEEAEGTLEHEEAKLLR 11 NCAQMEKLW

12 TLDDVLQTRDALCPHQ 12 WNDDMTRLW

13 TGANPDLTEQLWTGKSLELHE 13 ASLEEAELLDQFFCLQL

14 ELFNLGEAEDLGGRYLA 14 GLLDELFCLGLEEEELKLF

15 FSGDQLEDYTTTTV 15 LGLDELFCLGLEEEELKLF

16 FSGDQLEDYVAWF 16 VALDELFCLGLEEEELKLF

17 KTRWNEDELYALQKK 17 FGLEEEELFLK

18 LEQVWYLFNQSRYLE 18 ALGDQRTFFLNSMVLEEHC

19 LTYNQDLAEPRCFTM 19 LAGDQRTFFLSNMVLEEHC

20 LEDSLRTDELYAQ 20 LEDEEHPSGAELT

21 LTRSDLEDELYAQLK 21 ELEELAQGPVYQA

22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY

26 QVQQELYQWRFELEMLRQGMV

27 SALEEAEGTLVGLFRYQEL

28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL

31 ERDLLDRWLFLEVWMELE

32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ

35 RWNWRELRFLEEVWMLE

36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF

38 GAEQLDMTTSDLELPPGT

39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE

ตารางท 39 ล ำดบกรดอะมโนของโปรตนไฮโดรไลเสททผำนกำรแยกดวยเทคนค Size exclusion chromatography จำกกำรวเครำะหดวยเทคนค LC-MSMS 66

67

ตาราง 310 ควำมสำมำรถในกำรจบกบอนมล ABTS (mM Trolox) ของเพปไทดสงเครำะหแตละชนและเพปไทดผสมทไดมำจำกกำรวเครำะหล ำดบเพปไทดจำกสวน B3 ทควำมเขมขนสดทำย 5 มลลกรมมลลลตร

Peptide

ABTS radical scavenging activity

(mM Trolox) P1 0a

P1+P2 0a P1+P3 0015plusmn0015a

P1+P2+P3 0005plusmn0000a P1+P2+P4 2140plusmn0024c

P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a

P2+P3 0a P2+P4 2287plusmn0029d

P2+P3+P4 2146plusmn0005c P3 0a

P3+P4 2281plusmn0011d P1+P4 2290plusmn0003d

P1+P3+P4 2125plusmn0019c P4 2448plusmn0003e P5 0a

หมายเหต P1 คอ VELLVPK P2 คอ AGNQVLNLQADLPK P3 คอ LGTGTDL P4 คอ FLGSFLYEYSR และ P5 คอ NTFLFFK ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางทางสถต (plt005)

3314 สมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระทำงชวภำพ

เนองจำก fraction B2 และ B3 มกำรปนเปอนของเกลอโซเดยมคลอไรดจำก anion exchange chromatography อยในปรมำณมำก ซงเกลออำจจะมผลรบกวนตอกำรศกษำกำรเปนสำรตำนอนมลอสระทำงชวภำพ ดงนนในกำรทดลองนจงเลอก fraction B1 และเพปไทดสงเครำะห FLGSFLYEYSR ทไดจำกกำรวเครำะหล ำดบเพปไทดจำก fraction B3 เพอศกษำคณสมบตในกำรเปนสำรตำนอนมลอสระในระดบเซลล จำกกำรทดลองพบวำเมอเตมเฉพำะ

68

ไฮโดรเจนไฮดรอกไซดลงในเซลล HepG2 ท ำให DCF fluorescence intensity เพมขนประมำณ 12 เทำ เทยบกบตวอยำงเซลล HepG2 ทไมเตมไฮโดรเจนไฮดรอกไซด (control) เมอเตม fraction B1 และเพปไทดสงเครำะห FLGSFLYEYSR ทควำมเขมขน 10 และ 20 ไมโครกรมมลลลตร แลวบมเปนเวลำ 1 ชวโมง กอนกำรเตมไฮโดรเจนไฮดรอกไซด พบวำคำ DCF fluorescence intensity ลดลง อยำงไรกตำม คำ DCF fluorescence intensity ไมมควำมแตกตำงระหวำงตวอยำง fraction B1 และเพปไทดสงเครำะห FLGSFLYEYSR ทควำมเขมขน 10 และ 20 ไมโครกรมมลลลตรจำกกำรทดลองนบงชวำ ตวอยำง fraction B1 และ เพปไทดสงเครำะห FLGSFLYEYSR ทไดมำจำกกำรวเครำะหล ำดบเพปไทดจำกสวน B3 มควำมสำมำรถในกำรลดอนมลอสระทเกดจำกไฮโดรเจนเปอรออกไซดภำยในเซลล HepG2

รปท 315 ความสามารถในการจบอนมลอสระภายในเซลล HepG2 ของตวอยาง fraction B1 และ

เพปไทดสงเคราะห FLGSFLYEYSR ทความเขมขนของเพปไทด 10 และ 20 ไมโครกรมมลลลตร ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางทางสถต (plt005)

a a a a a

b

70

บทท 4 สรปและขอเสนอแนะ

70

สรปและขอเสนอแนะ

วสดเหลอทงจากอตสาหกรรมอาหารทะเลไดแก น าลางจากกระบวนการผลตซรม กาง และเศษกระดก รวมถงหนงปลาจากปลาน าจด เปนแหลงของโปรตนและเพปไทดทมประโยชน โดยน าลางเนอปลาไนมโปรตเนสแอลฟา-1 ทมคณสมบตยบย งเอนไซมทรปซนไดสง เปนไกลโคโปรตนทมขนาด 44 และ 50 กโลดาลตน มความสามารถยบย งการเสอมสลายโดยโปรตเนสของเจลของซรมปลาตาหวาน ดงนนจงอาจใชเปนสารยบย งโปรตเนสในซรมเพอปรบปรงคณสมบตของเจลได นอกจากนคอลลาเจนไฮโดรไลเสทของหนงปลานลและปลาดกบกอยมสมบตยบย งเอนไซม Angiotensin converting enzyme (ACE) ซงเปนเอนไซมทกอใหเกดความดนโลหตสง โดยคอลลาเจนไฮโดรไลเสททผลตจากเอนไซมเพปซนมความสามารถในการยบย ง ACE สงสด โดยไฮโดรไลเสทของคอลลาเจนจากปลาดกบกอยแสดงความสามารถในการยบย งสงกวาปลานล กจกรรมการยบย ง ACE ของคอลลาเจนไฮโดรไลเสทจากปลาดกบกอยทยอยดวยเพปซนเพมขนอยางรวดเรวท 4 ชวโมงแรกของการยอย เพปไทดทผานเยอกรองขนาด 5 กโลดาลตน สามารถยบยง ACE ไดสงสด โดยมคาการยบย ง (IC50) 901plusmn004 ไมโครกรม (สมมลไกลซน)มลลลตร และเมอน ามาผานการท าบรสทธและหาล าดบกรดอะมโนพบวา กรดอะมโนสวนใหญทพบในเพปไทดคอ Leu Arg Phe และ Asn บรเวณปลายสายดานคารบอกซล (C-terminal) สวนมากเปนกรดอะมโน Arg ในขณะทปลายสายดานอะมโน (N-terminal) ประกอบไปดวยกรดอะมโนสายตรง แสดงถงแนวโนมของการใชเปนอาหารเสรมสขภาพทชวยควบคมความดนโลหต

ส าหรบเพปไทดจาก กระดก กางและเศษหนงปลาทรายแดงทผานการยอยดวยเอนไซมจาก Virgibacillus sp SK33 ทผานการท าบรสทธบางสวน fraction B3 มความสามารถในการจบกบอนมล ABTS และความสามารถในการใหอเลกตรอนกบเหลกเฟอรคสงทสด ในขณะท fraction B2 มความสามารถในการจบกบเหลกเฟอรสและอนมลไฮดรอกซลสงทสด ถงแม fraction B1 จะมฤทธในการเปนสารตานอนมลอสระซงทดสอบดวยวธทางเคมต า แต fraction B1 และ เพปไทดสงเคราะห (FLGSFLYEYSR) ทไดจากการวเคราะหล าดบเพปไทดจาก fraction B3 มความสามารถในการจบอนมลอสระทเกดจากไฮโดรเจนเปอรออกไซดภายในเซลล HepG2 ผลการศกษานแสดงใหเหนวากาง กระดก และเศษหนงมศกยภาพเปนแหลงโปรตนส าหรบผลตเพปไทดทมคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระ และอาจใชเปนผลตภณฑโภชนเภสช (Nutraceutical) ได

71

บรรณานกรม

จรวฒน ยงสวสดกล (2546) การท าบรสทธและคณลกษณะทางชวเคมของทรานสกลทามเนสจากปลานล รายงานการวจย ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต

Aranishi F (1999) Purification and Characterization of α1-proteinase inhibitor from carp (Cyprinus carpio) serum Marine Biotechnology 1 33ndash43

Atkinson A B and Rovertson J (1979) Captopril in the treatment of clinical hypertension and cardiac failure Lancet 2 836-839

Bamdad F Wu J and Chen L (2011) Effects of enzymatic hydrolysis on molecular structure and antioxidant activity of barley hordein Journal of Cereal Science 54 20-28

Barbosa-Filho J M Valeska K M and Rabelo L A (2006) Natural products inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) A review between 1980ndash2000 Brazilian

Journal of Pharmacognsosy 16 421ndash446 Batista I Ramos C Coutinho J Bandarra N M and Nunes M L (2010) Characterization of

protein hydrolysates and lipids obtained from black scabbardfish (Aphanopus carbo) by-products and antioxidative activity of the hydrolysates produced Process Biochemistry 45 18-24

Bougatef A Nedjar-Arroume N Manni L Ravallec R Barkia A and Guillochon D (2010) Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinellaaurita) by-products proteins Food Chemistry 118 559-565

Brew K (2003) Structural of human ACE gives new insights into inhibitor bining and design Trends in Pharmacological Sciences 24 391-394

Busconi L Fob E J Martone C Trucco R E and Sgnchez J J (1984) Identification of two alkaline proteases and a trypsin inhibitor from muscle of white croaker (Micropogon opercularis) FEBS Letters 176 211-214

Byun H G Lee J K Park H G Jeon J K and Kim S K (2009) Antioxidant peptides isolated from the marine rotifer Brachionus rotundiformis Process Biochemistry 44 842-846

Cao M J Osatomi K Matsuda R Ohkubo M Hara K and Ishihara T (2000) Purification

of a novel serine proteinase inhibitor from the skeletal muscle of white croaker

72

(Argyrosomus argentatus) Biochemical and Biophysical Research Communications 272 485-489

Carrell R W Jeppsson J O Laurell C B Brennan S O Owen M C Vaughan L and Boswell D R (1982) Structure and variation of human alpha 1-antitrypsin Nature 298 329-334

Chang Y S Weng J W Li C C and Huang F L (1998) Identification of cystatin as a component of carp chorion Molecular Reproduction and Development 51 430-435

Chen H M Muramoto K and Yamauchi F (1995) Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-Conglycinin Journal of the Science of Food and Agriculture 43 574-578

Chen H M Muramoto K Yamauchi F Fujimoto K and Nokihara K (1998) Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein Journal of Agricultural and Food Chemistry 46 49-53

Chen N Yang H Sun Y Niu J and Liu S (2012) Purification and identification of antioxidant peptides from walnut (Juglans regia L) protein hydrolysates Peptides 38 344-349

Cheung H S Wang F L Ondetti M A Sabo E F and Cushman D W (1980) Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence The Journal of Biological Chemistry 255 401-407

Hong F Ming L Yi S Zhanxia L Yongquan W and Chi L (2008) The antihypertensive effect of peptides A novel alternative to drugs Peptides 29 1062-1071

Chuang W H Liu P C and Lee K K (2008) Purification and characterization of an alpha-2 macroglobulin protease inhibitor from plasma of the grouper Epinephelus coioides Aquaculture 284 239-245

Cushman D W and Cheung H S (1971) Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin I-converting enzyme of rabbit lung Biochemical Pharmacology 20 1637-1648

Cumby N Zhong Y Naczk M and Shahidi F (2008) Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates Food Chemistry 109 144-148

73

Di Bernardini R Rai D K Bolton D Kerry J OrsquoNeill E and Mullen A M (2011) Isolation purification and characterization of antioxidant peptidic fractions from a bovine liver sarcoplasmic protein thermolysin hydrolyzate Peptides 32 388-400

Dong S Zeng M Wang D Liu Z Zhao Y and Yang H (2008) Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) Food Chemistry 107 1485-1493

Doucet D Otter D E Gauthier S F and Foegeding E A (2003) Enzyme-induced gelation of extensively hydrolyzed whey proteins by Alcalase Peptide identification and determination of enzyme specificity Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 6300-6308

Ellis A E (1987) Inhibition of the Aeromonas salmonicida extracellular proteases by α2- macroglobulin in the serum of rainbow trout Microbial Pathogenesis 3 167-177

Eriksson U Danilczyk U and Penninger J M (2002) Just the beginning Novel functions for Angiotensin-converting enzymes Current Biology 12 745ndash752

FAO Global Production StatisticsFood and Agriculture Organization of the United Nations (2013) [Online] Available httpwwwfaoorgfisheryspecies2957en FitzGerald R J Murray B A and Walsh D J (2004) The emerging role of dairy proteins and

bioactive peptides in nutrition and health American Society for Nutritional Sciences 134 980-988

Freedman S J (1991) The role of alpha 2-macroglobulin in furunculosis a comparison of rainbow trout and brook trout Comparative Biochemistry and Physiology B 98 549-553

Funkenstein B Rebhan Y Dyman A and Radaelli G (2005) Alpha2-macroglobulin in the marine fish Sparus aurata Comparative Biochemistry and Physiology A 141 440-449

Goacutemez-Ruiz J Aacute Loacutepez-Expoacutesito I Pihlanto A Ramos M and Recio I (2008) Antioxidant activity of ovine casein hydrolysates identification of active peptides by HPLCndashMSMS European Food Research and Technology 227 1061-1067

Guenneuges P (2004) Surimi market world resource-supply and demand Presented at the 4th surimi industry forum April 11-15 2004 Astoria OR

74

Guerard F Dufosse L De La Broise D and Binet A (2001) Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna Thunnus albacores wastes using Alcalase Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic 11 1051-1059

Guzdek A Potempa J Dubin A and Travis J (1990) Comparative properties of human alpha-1-proteinase inhibitor glycosylation veriants FEBS Letters 272 125-127

Hara K and Ishihara T (1987) Purification and characterization of serine proteinase inhibitor from carp Cyprinus carpio ordinary muscle Agricultural Biology and Chemistry 51 153-159

Hernaacutendez-Ledesma B Davalos A Bartolome B and Amigo L (2005) Preparation of antioxidant ensymatichydrolysates from α-lactalbumin and β-lactoglobulinIdentification of active peptides by HPLC-MSMS Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 588-593

Hogan S Zhang L Li J Wang H and Zhou K (2009) Development of antioxidant rich peptides from milk protein by microbial proteases and analysis of their effects on lipid peroxidation in cooked beef Food Chemistry 117 438-443


Hsu K C (2010) Purification of antioxidative peptides prepared from enzymatic hydrolysates of tuna dark muscle by-product Food Chemistry 122 42-48

Huang C J Chen C C Chen H J Huang F L and Chang G D (1995) A protease inhibitor of the serpin family is a major protein in carp perimeningeal fluid I Protein purification and characterization Journal of Neuroendocrinology 64 1715-1720

Jamdar S N Rajalakshmi V Pednekar M D Juan F Yardi V and Sharma A (2010) Influence of degree of hydrolysis on functional properties antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate Food Chemistry 121 178-184

Je J Y Lee K H Lee M H and Ahn C B (2009) Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis Food Research International 42 1266-1272

Je J Y Park P J and Kim S K (2005) Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate Food Research International 38 45-50

75

Je J Y Qian Z J Byun H G and Kim S K (2007) Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis Process Biochemistry 42 840-846

Je J Y Qian Z J Lee S H Byun H G and Kim S K (2008) Purification and antioxidant properties of bigeye tuna (Thunnus obesus) dark muscle peptide on free radical-mediated oxidative systems Journal of Medicinal Food 11 629-637

Jeon Y J Byun H G and Kim S K (1999) Improvement of functional properties of codframe protein hydrolysates using ultrafiltration membranes Process Biochemistry 35 471-478

Jun S Y Park P J Jung W K and Kim S K (2004) Purification and characterization of an antioxidative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein European Food Research and Technology 219 20-26

Jung W K Rajapakse N and Kim SK (2005) Antioxidative activity of a low molecular weight peptide derived from the sauce of fermented blue mussel Mytilus edulis European Food Research and Technology 220 535-539

Imayasu S Kawato A Saito Y and Nakamura KW (1994) Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from sake and sake lees Bioscience biotechnology and biochemistry 10 1767-1771

Kang K T Kim H J Kim J S Park C H and Park J W (2009) Fractionation and angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of gelatin hydrolysates from by-products of Alaska pollock surimi Fisheries and Aquatic Sciences 12 79-85

Khantaphant S and Benjakul S (2008) Comparative study on the proteases from fish pyloric caeca and the use for production of gelatin hydrolysate with antioxidative activity Comparative Biochemistry and Physiology Part B 151 410-419

Kim S Y Je J Y and Kim S K (2007) Purification and characterization of antioxidant peptide from hoki (Johnius belengerii) frame protein by gastrointestinal digestion Journal of Nutritional Biochemistry 18 31-38

Kim S K Kim Y T Byun H G Nam K S Joo D S and Shahidi F (2001) Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin Journal of Agricultural and Food Chemistry 49 1984-1989

Klompong V Benjakul S Kantachote D Hayes K D and Shahidi F (2008) Comparative study on antioxidative activity of yellow stripe trevally protein hydrolysate produced from

76

Alcalase and Flavourzyme International Journal of Food Science and Technology 43 1019-1026

Kong B H and Xiong Y L L (2006) Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 6059-6068

Kovaacutecs G Peti-Peterdi J Rosivall L and Darwin Bell P (2002) Angiotensin II directly stimulates macula densa Na-2Cl-K cotransport via apical AT1 receptors American Journal of Physiology-Renal Physiology 282 301-306

Kudo K Onodera S Takeda Y Benkeblia N and Shiomi N (2009) Antioxidative activities of some peptides isolated from hydrolyzed potato protein extract Journal of Functional Foods 1 170-176

Lee S H Qian Z J and Kim S K (2009) A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats Food Chemistry 118 96-102

Lee J K Jeon J K and Byun H G (2011) Effect of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide purified from skate skin hydrolysate Food Chemistry 125 495-499

Li C M Zhong Z H Wan Q H Zhao H Gu H F and Xiong S B (2008) Preparation and thermal stability of collagen from scales of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) European Food Research and Technology 227 1467-1473

Li D K Lin H and Kim S M (2008) Purification and characterization of a cysteine protease inhibitor from chum salmon (Oncorhynchus keta) plasma Journal of Agricultural and Food Chemistry 56 106-111

Li F L and Lu C P (2006) Purification and characterization of α2-macroglobulin from grass carp Ctenopharyngodon idellus Cloning a segment of the corresponding gene Fish amp Shellfish Immunology 20 474-481

Liaset B Julshamn K and Espe M (2003) Chemical composition and theoretical nutritional of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salman frames with ProtamexTM Process Biochemistry 38 1747-1759

Lin L and Li B F (2006) Radical scavenging properties of protein hydrolysates from jumbo flying squid (Dosidicus eschrichitii Steenstrup) skin gelatin Journal of the Science of Food and Agriculture 86 2290-2295

77

Lin T M Park J W and Morrissey M T (1995) Recovered protein and reconditioned water from surimi processing waste Journal of Food Science 50 4-9

Liu Q Kong B Jiang L Cui X and Liu J (2009) Free radical scavenging activity of porcine plasma protein hydrolysates determined by electron spin resonance spectrometer LWT - Food Science and Technology 42 956-962

Liu J H Tian Y G Wang Y Nie S P Xie M Y and Zhu S (2011) Characterization and in vitro antioxidation of papain hydrolysate from black-bone silky fowl (Gallus gallus domesticus Brisson) muscle and its fractions Food Research International 44 133-138

Mak M Mak P Olczak M Szalewicz A Glogowski J Dubin A Watorek W and Ciereszko A (2004) Isolation characterization and cDNA sequencing of alpha-1-antiproteinase-like protein from rainbow trout seminal plasma Biochimica et Biophysica Acta 1671 93-105

Mallikarjun Gouda K G Gowda L R Rao A G A and Prakash V (2006) Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from glycinin the 11S globulin of soybean (Glycine max) Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 4568-4573

Martone C B Busconi L Folco E and Saacutenchez J J (1991) Detection of a trypsin-like serine protease and its endogenous inhibitor in hake skeletal muscle Archives of Biochemistry and Biophystry 289 1-5

Matsu T Matsufuji H Seki E Osajima K Nakashima M and Osajima Y (1993) Inhibition of angiotensin I-convering enzyme by Bacillus lichenformis alkaline protease hydrolyzates derived from sadine muscle Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57 922-925

Meisel H (2005) Biochemical properties of peptides encrypted in bovine proteins Current Topics in Medicinal Chemistry 12 1905-1919

Meisel H Goepfert A and Gunther S (1997) ACE-inhibitory activities in milk products Milchwis 52 307ndash311

Memarpoor-Yazdi M Asoodeh A and Chamani J (2012) A novel antioxidant and antimicrobial peptide from hen egg white lysozyme hydrolysates The Journal of Functional Foods 4 278-286

Mendis E Rajapakse N Byun H G and Kim S K (2005a) Investigation of jumbo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects Life Sciences 77 2166-2178

78

Mickowska B (2009) Purification and characterization of alpha (1)-proteinase inhibitor and antithrombin III major serpins of rainbow trout (Oncorhynchuss mykiss) and carp (Cyprinus carpio) blood plasma Fish Physiology and Biochemistry 35 231-240

Morioka K and Shimizu Y (1990) Contribution of sarcoplasmic proteins to gel formation of fish meat Nippon Suisan Gakkaishi 56 929-933

Morioka K and Shimizu Y (1993) Relationship between the heat-gelling property and composition of fish sarcoplasmic proteins Nippon Suisan Gakkaishi 56 929-933

Morrissey M T Lin J and Ismond A (2005) Waste management and by-product utilization In J W Park Surimi and surimi seafood (pp 281-316) Florida CRC Press

Motoi H and Kodama T (2003) Isolation and characterization of angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides from wheat gliadin hydrolysate FoodNahrung 47 354-358

Moure A Domiacutenguez H and Parajoacute J C (2006) Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates Process Biochemistry 41 447-456

Mullally M M OCallaghan D M FitzGerald R J Donnelly W J and Dalton J P (1994) Proteolytic and peptidolytic activities in commercial pancreatic protease preparations and their relationship to some whey protein hydrolysate characteristics Journal of Agricultural and Food Chemistry 42 2973-2981

Nagashima Y Takeda M Ohta I Shimakura K and Shiomi K (2004) Purification and properties of proteinaceous trypsin inhibitors in the skin mucus of pufferfish Takifugu pardalis Comparative Biochemistry and Physiology Part B 138103-110

Nakamura S Ogawa M and Nakai S 1998 Effects of polymannosylation of recombinant cystatin C in yeast on its stability and activity Journal of Agricultural and Food Chemistry 46 2882-2887

Nakamura S Takasaki H Kobayashi K and Kato A (1993) Hyperglycosylation of hen egg white lysozyme in yeast Journal of Biological Chemistry 268 12706-12712

Nelson D L and Cox M M (2000) Amino acids peptides and proteins D L Nelson and M M Cox (Eds) Lehninger principles of Biochemistry Worth Publishers New York (2000) pp 115-120

79

Ngo D H Qian Z J Ryu B Park J W and Kim S K (2010) In vitro antioxidant activity of a peptide isolated from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) scale gelatin in free radical-mediated oxidative systems Journal of Functional Foods 2 107-117

Nurhayati T Rusyadi S Suwandi R and Nugraha R (2013) Purification and characterization of a cathepsin inhibitor from catfish (Pangasius sp) of Indonesian water International Food Research Journal 20 941-946

Park P J Jung W K Nam K S Shahidi F and Kim S K (2001) Purification and characterization of antioxidative peptides from protein hydrolysate of lecithin-free egg yolk Journal of the American Oil Chemists Society 78 651-656

Patterson S D (1991) Mammalian alpha 1-antitrypsins comparative biochemistry and genetics of the major plasma serpin Comparative Biochemistry and Physiology Part B 100 439-454

Pentildea-Ramos E A and Xiong Y (2001) Antioxidative activity of whey protein hydrolysates in a liposomal system Journal of dairy science 842577-2583

Piyadhammaviboon P and Yongsawatdigul J (2010) Proteinase inhibitory activity of sarcoplasmic proteins from threadfin bream (Nemipterus spp) Journal of the Science of Food and Agriculture 90 291-298

Qian Z J Jung WK Byun H G and Kim S K (2008a) Protective effect of an antioxidative peptide purified from gastrointestinal digests of oyster Crassostrea gigas against free radical induced DNA damage Bioresource Technology 99 3365-3371

Qian Z L Jung W K and Kim S K (2008b) Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin Rana catesbeiana Shaw Bioresource Technology 99 1690-1698

Okazaki E Kanna K and Suzuki T (1986) Effect of sarcoplasmic protein on rheological properties of fish meat gel formed by retort heating Nippon Suisan Gakkaishi 52 1821-1827

Ondetti M A Rubin B and Cushman D W (1977) Design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme new class of orally active antihypertensive agents Science 196 441-444

Osca A C (2005) Novel mechanism of action of ACE and its inhibitors Americn Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 289 1798-1797

80

Philanto L (2000) Bioactive peptides derived from bovine whey proteins Opioid and ace-inhibitory Trends in Food Science and Technology 11 347-356

Raghavan S Kristinsson H G and Leeuwenburgh C (2008) Radical Scavenging and Reducing Ability of Tilapia (Oreochromis niloticus) Protein Hydrolysates Journal of Agricultural and Food Chemistry 56 10359-10367

Rajapakse N Mendis E Byun H G and Kim S K (2005a) Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems The Journal of Nutritional Biochemistry 16 562-569

Rajapakse N Mendis E Jung W K Je J Y and Kim S K (2005b) Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties Food Research International 38 175-182

Ranathunga S Rajapakse N and Kim SK (2006) Purification and characterization of antioxidative peptide derived from muscle of conger eel (Conger myriaster) European Food Research and Technology 222 310-315

Ren J Zhao M Shi J Wang J Jiang Y and Cui C (2008) Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry Food Chemistry 108 727-736

Robyt J F and B J White (1987) Biochemical Techniques Theory and Practics BrooksCole Publishing Co CA USA pp 120

Rival S G Boeriu C G and Wichers H J (2001) Caseins and casein hydrolysates 2 Antioxidative properties and relevance to lipoxygenase inhibition Journal of Agricultural and Food Chemistry 49 295-302

Saiga A Okumura T Makihara T Katsuda S Morimatsu F and Nishimura T (2006) Action mechanism of an angiotensin I-converting inhibitory peptide derived from chicken breast muscle Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 942-945

Saiga A Iwai K Hayakawa T Takahata Y Kitamura S Nishimura T and Morimatsu F (2008) Angiotensin I-converitng enzyme ndashinhibitory peptides obtained from chicken collagen hydrolysate Agricultural Food Chemistry 56 9568-9591

Saiga A Tanabe S and Nishimura T (2003) Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 3661ndash3667

81

Sakanaka S and Tachibana Y (2006) Active oxygen scavenging activity of egg-yolk protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates Food Chemistry 95 243-249

Sakanaka S Tachibana Y Ishihara N and Juneja L R (2004) Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system Food Chemistry 86 99-103

Sangorriacuten M P Folco E J Martone C M and Saacutenchez J J (2001) Purification and characterization of a proteinase inhibitor from white croaker skeletal muscle (Micropogon opercularis) International Journal of Biochemistry amp Cell Biology 33 691-699

Samaranayaka A G P Kitts D D and Li-Chan E C Y (2010) Antioxidative and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory potential of a Pacific Hake (Merluccius productus) fish protein hydrolysate subjected to simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 Cell permeation Journal of Agricultural and Food Chemistry 58 1535-1542

Samaranayaka A G P and Li-Chan E C Y (2011) Food-derived peptidic antioxidants A review of their production assessment and potential applications Journal of Functional Foods 3 229-254

Sampath Kumar N S Nazeer R A and Jaiganesh R (2011) Purification and biochemical characterization of antioxidant peptide from horse mackerel (Magalaspis cordyla) viscera protein Peptides 32 1496-1501

Sarmadi B H and Ismail A (2010) Antioxidative peptides from food proteins A review Peptides 31 1949-1956

Savoie L Gauthier S F Marin J and Pouliot Y (2005) In vitro determination of the release kinetics of peptides and free amino acids during the digestion of food proteins Journal of AOAC International 88 935-948

Sheih I C Wu T K and Fang T J (2009a) Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems Bioresource Technology 100 3419-3425

Sica M D and Domenic A (2003) Combination angiotensin-converting enzyme inhibitor and angiotensin receptor blocker therapy its role in clinical practice Journal of Clinical Hyperttension 5 414-420

82

Simpson B K (2000) Digestive proteinases from marine animals In N M Haard and B K Simpson (Eds) Seafood enzymes Utilization and influence on postharvest seafood quality (pp 531ndash540) New York Marcel Dekker

Sinsuwan S Rodtong S and Yongsawatdigul J (2008) Production and characterization of NaCl-activated proteinases from Virgibacillus sp SK33 isolated from fish sauce fermentation Process Biochemistry 43185-192

Sinsuwan S Rodtong S and Yongsawatdigul J (2010) A NaCl-stable serine proteinase from Virgibacillus sp SK33 isolated from Thai fish sauce Food Chemistry 119 573-579

Siriangkanakun S and Yongsawatdigul J (2012) Trypsin inhibitory activity and gel-enhancing effect of sarcoplasmic proteins from common carp The Journal of Food Science 77 C1124-C1130

Starkey P M and Barrett A J (1982) Evolution of α2-macroglobulin The structure of a protein homologous with human α2-macroglobulin from plaice (Pleuronectes platessa L) plasma Biochemical Journal 205 105-115

Sturrock E D Natesh R Van Rooyen J M and Acharya K R (2004) Structure of Angiotensin I-converting enzyme Cellular and Molecular Life Sciences 61 2677-2686

Sun L C Zhou L G Du C H Cai Q F Hara K Su W J and Cao M J (2009) Glucose-6-phosphate isomerase is an endogenous inhibitor to myofibril-bound serine proteinase of crucian carp (Carassius auratus) Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 5549-5555

Sungperm P 2012 Physico-chemical properties and angiotensin I converting enzyme

inhibitory peptides of collagen prepared from Tilapia (Oreochromis niloticus) and

hybrid catfish (Clarias macrocephalustimesC gariepinus) skin M S Thesis Suranaree

University of Technology Thailand Swaan P W Stehouwer M C and Tukker J J (1995) Molecular mechanism for the relative

binding affinity to the intestinal peptide carrier Comparison of three ACE inhibitors enalapril enalaprilat and lisinopril Biochimica et Biophysica Acta 1236 31-38

Tang C H Peng J Zhen D W and Chen Z (2009) Physicochemical and antioxidant properties of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) protein hydrolysates Food Chemistry 115 672-678

83

Thiansilakul Y Benjakul S and Shahidi F (2007) Antioxidative activity of proteinhydrolysate from round scad muscle using Alcalase and Flavourzyme Journal of Food Biochemistry 31 266-287

Tironi V A and Anoacuten M C (2010) Amaranth proteins as a source of antioxidant peptides Effect of proteolysis Food Research International 43 315-322

Toyohara H Makinodan Y Tanaka K and Ikeda S (1983) Detection of calpastatin and a trypsin inhibitor in carp muscle Agricultural Biology and Chemistry 471151-1154

Tsai Y J Chang G D Huang C J Chang Y S Huang F L (1996) Purification and molecular cloning of carp ovarian cystatin Comparative Biochemistry and Physiology Part B 113 573-580

Ustadi Kim K Y and Kim S M (2005) Comparative study on the protease inhibitors from fish eggs Journal of Ocean University of China 4 198-204

van der Ven C Gruppen H de Bont D B A and Voragen AG J (2002) Correlations between biochemical characteristics and foam-forming and-stabilizing ability of whey and casein hydrolysates Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 2938-2946

Vermeirssen V Van Camp J and Verstraete W (2005) Fractionation of angiotensin I converting enzyme inhibitory activity from pea and whey protein in vitro gastrointestinal digests Journal of the Science of Food and Agriculture 85 399-405

Wang B Li L Chi C F Ma J H Luo H Y and Xu Y f (2013) Purification and characterisation of a novel antioxidant peptide derived from blue mussel (Mytilus edulis) protein hydrolysate Food Chemistry 138 1713-1719

Wojtczak M Całka J Glogowski J and Ciereszko A (2007) Isolation and characterization of alpha1-proteinase inhibitor from common carp (Cyprinus carpio) seminal plasma Comparative Biochemistry and Physiology Part B Biochemistry and Molecular Biology 148 264-276

Worratao A and Yongsawatdigul J (2003) Cross-linking of actomyosin by crude tilapia (Oreochromis niloticus) transglutaminase Journal of Food Biochemistry 27 35-51

Wu H C Chen H M and Shiau C Y (2003) Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Research International 36 949-957

84

Wu J and Ding X (2002) Characterization of inhibition and stability of soy-proteinderived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides Food Research International 35 367ndash375

Yamada Y Sakamoto S I and Seki N (1985) Two calpain inhibiting proteins (calpastatin) in carp skeletal muscle Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 51 1021-1028

Yamashita M and Konagaya S (1991) Cysteine protease inhibitor in egg of chum salmon Journal of Biochemistry 110 762-766

Ylonen A Rinne A Herttuainen J Bogwald J Jarvinen M and Kalkkinen N (1999) Atlantic salmon (Salmo salar L) skin contains a novel kininogen and another cysteine proteinase inhibitor European Journal of Biochemistry 266 1066-1072

You L Zhao M Regenstein J M and Ren J (2010) Changes in the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates during a simulated gastrointestinal digestion Food Chemistry 120 810-816

Zhang Y Duan X and Zhuang Y (2012) Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia (Oreochromis niloticus) skin gelatin Peptides 38 13-21

Zhang J H Zhang H Wang L Guo X N Wang X G and Yao H Y (2010) Isolation and identification of antioxidative peptides from rice endosperm protein enzymatic hydrolysate by consecutive chromatography and MALDI-TOFTOF MSMS Food Chemistry 119 226-234

Zhao X and Hou Y (2009) Limited hydrolysis of soybean protein concentrate and isolate with two proteases and the impact on emulsifying activity index of hydrolysates African Journal of Biotechnology 8 3314-3319

Zheng X Q Li L T Liu X L Wang X J Lin J and Li D (2006) Production of hydrolysate with antioxidative activity by enzymatic hydrolysis of extruded corn gluten Applied Microbiology and Biotechnology 73 763-770

Zhou D Y Zhu B W Qiao L Wu H T Li D M Yang J F and Murata Y (2012) In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone (Haliotis discushannai Ino) viscera Food and Bioproducts Processing 90 148-154

85

Zhu K Zhou H and Qian H (2006) Antioxidant and free radical-scavenging activities of wheat germ protein hydrolysates (WGPH) prepared with alcalase Process Biochemistry 41 1296-1302

86

ประวตนกวจย 1 ชอ (ภาษาไทย) นาย จรวฒน นามสกล ยงสวสดกล (ภาษาองกฤษ) Mr Jirawat Yongsawatdigul 2 เลขหมายประจ าตวประชาชน 3101200691826 3 ต าแหนงปจจบน รองศาสตราจารย 4 หนวยงานทอยทตดตอไดพรอมโทรศพท โทรสาร และ E-mail สาขาเทคโนโลยอาหาร ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร อ เมอง จ นครราชสมา 30000 โทร 044-22-4359 โทรสาร 044-224-387 E-mail jirawatccssutacth 5 ประวตการศกษา ปทจบ ระดบ

ปรญญา อกษรยอ สาขาวชา วชาเอก ชอสถาบนศกษา ประเทศ

2532 2535 2539

ปรญญาตร ปรญญาโท ปรญญาเอก

วทบ (วทยาศาสตรบณฑต) เกยรตนยมอนดบ 2 MS (Master of Science) PhD (Doctor of Philosophy)

เทคโนโลยอาหาร Food Science Food Science and Technology

เทคโนโลยอาหาร Food processing Seafood chemistry

จฬาลงกรณมหาวทยาลย University of Wisconsin-Madison Oregon State University

ไทย

สหรฐอเมรกา สหรฐอเมรกา

6 สาขาวชาการทมความช านาญพเศษ (แตกตางจากวฒการศกษา) ระบสาขาวชาการ -Food proteins Food enzymes 7 ประสบการณทเกยวของกบการบรหารงานวจยทงภายในและภายนอกประเทศ ระบสถานภาพ

ในการท าการวจยวาเปนผอ านวยการแผนงานวจย หวหนาโครงการวจย หรอผรวมวจยในแตละขอเสนอโครงการวจย เปนตน 71 ผอ านวยการแผนงานวจย ชอแผนงานวจย - 72 หวหนาโครงการวจย

87

1 Factors affecting histamine in fish sauce fermentation 2 Proteinases and transglutaminase activity in freshwater fish species 3 Reduction of biogenic amines content during fish sauce fermentation 4 Influence of freshness quality and actomyosin denaturation on gel-forming ability of threadfin

bream (Nemipterus spp) muscle proteins 5 Purification and characterization of transglutaminase from Tilapia (Oreochromis niloticus) 6 Covalent cross-linking of threadfin bream muscle proteins by transglutaminase(s) 7 Inhibition of proteolysis and application of microbial transglutaminase in lizardfish surimi 8 Process development of fishball and fish sausage from freshwater fish species 9 Biogenic amine formation in anchovies and fermented fish products 10 Acceleration of fish sauce production using starter cultures and proteinases 11 Study in catalytic reaction of transglutaminase in threadfin bream surimi using MALDI-TOF 12 Conformation changes of muscle proteins from tropical fish species

72 ผลงานวจยทท าเสรจแลว Wiriyaphan C Chitsomboon B Roytrakul S Yongsawadigul J 2013 Isolation and

identification of antioxidtive peptides from hydrolysate of threadfin bream surimi processing byproduct J Functional Food In press

Lapsongphon N Cadwallader KR Rodtong S Yongsawatdigul J 2013 Characterization of protein hydrolysis and odor-active compounds of fish sauce inoculated with Virgibacillus sp SK37 under reduced salt content J Agric Food Chem DOI 101021jf4014923

Lapsongphon N and Yongsawatdigul J 2013 Production and purification of antioxidant peptides from a mungbean meal hydrolysate by Virgibacillus sp SK37 proteinase Food Chem 992-999

Lapsongphon N Rodtong S and Yongsawatdigul J 2013 Spent Brewery Yeast Sludge as a Single Nitrogen Source for Fibrinolytic Enzyme Production of Virgibacillus sp SK37 Food Science and Biotechnology Food Sci Biotechnol 22(1) 71-78

Montriwong A Kaewphuak S Rodtong S Roytrakul S Yongsawatdigul J 2012 Novel fibrinolytic enzymes from Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 isolated from fish sauce fermentation Process Biochem 47 2379ndash2387

Siriangkanakun S and Yongsawatdigul J 2012 Trypsin inhibitory activity and gel-enhancing effect of sarcoplasmic proteins from common carp J Food Sci 77(10) 1124-1130

88

Hemung B Benjakul S Yongsawatdigul J 2013 pH-dependent characteristics of gel-like emulsion stabilized by threadfin bream sarcoplasmic proteins Food Hydrocolloids 30 315-322

Sinsuwan J Rodtong S Yongsawatdigul J 2012 Hydrolytic activity of Virgibacillus sp SK37 a starter culture of fish sauce fermentation and its cell-bound proteinases World Journal of Microbiology and Biotechnology 28 2651-2659

Yongsawatdigul J Pivisan S Wongngam W Benjakul S 2012 Gelation characteristics of mince and washed mince from small scale mud carp and common carp Journal Aquatic Food Product Technology DOI101080104988502012664251

Wiriyapan A Chitsomboon B Yongsawadigul J 2012 Antioxidant activity of protein hydrolysates derived from threadfin bream surimi byproducts Food Chem 132 104ndash111

Udomsil N RodtongS Choi YJ Hua Y Yongsawatdigul J 2011 The use of Tetragenococcus halophilus as a starter culture for flavor improvement in fish sauce fermentation J Agric Food Chem 59(15) 8401-08

Piyadhammaviboon P Wongngam W Benjakul S Yongsawatdigul J 2011 Antioxidant and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitory Activities of Protein Hydrolysates Prepared from Threadfin bream (Nemipterus spp) Surimi By-products J Aquat Food Prod In press

Phrommao E Yongsawatdigul J Rodtong S Yamabhai M 2011 A novel subtilase with NaCl-activated and oxidant-stable activity from Virgibacillus sp SK37 BMC Biotechnology 1165

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2011 Evidence of cell-associated proteinases from Virgibacillus sp SK33 isolated from fish sauce fermentation J Food Sci 76C413-419

Phrommao E Rodtong S Yongsawatdigul J 2011 Identification of novel halotolerant bacillopeptidase-like proteinases from a moderately halophilic bacterium Virgibacillus sp SK37 J Appl Micro 1191-201

Udomsil N Rodtong S Tanasupawat S Yongsawatdigul J 2010 Proteinase-producing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile compounds International Journal of Food Microbiology 141 186ndash194

89

Tadpitchayangkoon P Park J Mayer S Yongsawatdigul J 2010 Structural Changes and Dynamic Rheological Properties of Sarcoplasmic Proteins Subjected to pH-Shift Method J Agric Food Chem 584241-4249

Tadpitchayangkoon P Park JW and Yongsawatdigul J 2010 Physicochemical and dynamic rheological properties of fish sarcoplasmic proteins treated at various pHs Food Chem 121 1046-1052

Yongsawatdigul J and Hemung B 2010 Structural changes and functional properties of threadfin bream sarcoplasmic proteins subjected to pH-shifting treatments and lyophilization J Food Sci 75(3) C251-257

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2010 Purification and Characterization of a Salt-Activated and Organic Solvent-Stable Heterotrimer Proteinase from Virgibacillus sp SK33 Isolated from Thai Fish Sauce J Agric Food Chem 58 248-256

Piyadhammaviboon P Yongsawatdigul J 2010 Proteinase inhibitory activity of sarcoplasmic proteins from threadfin bream (Nemipterus spp) J Sci Food Agric 90(2) 291-298

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2010 A NaCl-stable serine proteinase from Virgibacillus sp SK33 isolated from Thai fish sauce Food Chem 119573-579

Tadpitchayangkoon P and Yongsawatdigul J 2009 Comparative study of washing treatments and alkali extraction on gelation characteristics of striped catfish (Pangasius hypophthalmus) muscle protein J Food Sci 74(3) C284-C291

Hemung B Li-Chan ECY and Yongsawatdigul J 2009 Identification of glutaminyl sites on β-lactoglobulin for threadfin bream liver and microbial transglutaminase activity by MALDI-TOF mass spectrometry Food Chem 115 149-154

Piyadhammaviboon P and Yongsawatdigul J 2009 Protein cross-linking ability of sarcoplasmic proteins extracted from threadfin bream LWT-Food Science and Technology 42(1) 37-43

Hemung B Li-Chan ECY and Yongsawatdigul J 2008 Reactivity of fish and microbial transglutaminases on glutaminyl sites of peptides derived from threadfin bream myosin J Agric Food Chem 56(16) 7510-7516

Hemung B Li-Chan ECY and Yongsawatdigul J 2008 Thermal stability of fish natural actomyosin affects reactivity to cross-linking by microbial and fish transglutaminases Food Chem 111(2) 439-446

90

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2008 Characterization of Ca2+-activated cell-bound proteinase from Virgibacillus sp SK37 isolated from fish sauce fermentation LWT-Food Sci Tech 41 2166-2174

Hemung B and Yongsawatdigul J 2008 Partial purification and characterization of transglutaminase from threadfin bream (Nemipterus sp) liver J Food Biochem 32182-200

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2008 Production and characterization of NaCl-activated proteinases from Virgibacillus sp SK33 isolated from fish sauce fermentation Process Biochem 43185-192

Park JD Yongsawatdigul J Choi YJ Park JW 2008 Biochemical and conformational changes of myosin purified from Pacific sardine at various pHs J Food Sci 73C191-197

Yongsawatdigul J Rodtong S Raksakulthai N 2007 Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter culture J Food Sci 72 M382-M390

Panpipat V Yongsawatdigul J 2008 Stability of potassium iodide and omega-3 fatty acids in fortified freshwater fish emulsion sausage LWT-Food Sci Tech 41483-492

Sinsuwan S Rodtong S Yongsawatdigul J 2007 NaCl-activated extracellular proteinase from Virgibacillus sp SK37 isolated from fish sauce fermentation J Food Sci 72C264-C269

Yongsawatdigul J and Piyadhammaviboon P 2007 Gel enhancing effect and protein cross-linking ability of tilapia sarcoplasmic proteins J Sci Food Agric 872810-2816

Yongsawatdigul J Sinsuwan S 2007 Aggregation and conformational changes of tilapia actomyosin as affected by calcium ion during setting Food Hydrocolloids 21 359-367

Sirighan P Raksakulthai N Yongsawatdigul J 2007 Partial purification and characterization of trypsin-like proteinases in Indian anchovy (Stolephorus indicus) Food Chem 101 82-89

Sirighan P Raksakulthai N Yongsawatdigul J 2006 Source and changes of proteinase activities of Indian anchovy (Stolephorus indicus) during fish sauce fermentation J Sci Food Agric 86(12) 1970-1976

Yongsawatdigul J Piyadhammaviboon P Singchan K 2006 Gel-forming ability of small scale mud carp unwashed and washed mince as related to endogenous proteinases and transglutaminase activities Eur Food Res Technol 223(6) 769-774

91

Sirighan P Raksakulthai N Yongsawatdigul J 2006 Autolytic activity and biochemical characteristics of endogenous proteinases in Indian anchovy (Stolephorus indicus) Food Chem 98(4) 678-684

Young K Yongsawatdigul J Park J Thawornchinsombat S 2005 Characterisitcs of sarcoplasmic proteins and their interaction with myofibrillar proteins 29 517-532

Hemung B and Yongsawatdigul J 2005 Ca2+ affects physicochemical and conformational changes of threadfin bream myosin and actin in a setting model Food Sci 70C455-460

Yongsawatdigul J and Piyadhammaviboon P 2005 Effect of microbial transglutaminase on autolysis and gelation of lizardfish surimi J Sci Food Agric 85(9) 1453-1460

Worratao A and Yongsawatdigul J 2005 Purification and characterization of transglutaminase from tropical tilapia (Oreochromis niloticus) Food Chem 93651-658

Rodtong S Nawong S Yongsawatdigul J 2005 Histamine accumulation and histamine-forming bacteria in Indain anchovy (Stolephorus indicus) Food Microbiol 22(5)475-482

Yongsawatdigul J and Park JW 2004 Effect of alkaline and acid solubilization on gelation characteristics of rockfish proteins J Food Sci 69(7)C499-505

Yongsawatdigul J Choi YS Udomporn S 2004 Biogenic amines formation in fish sauce prepared from fresh and temperature-abused Indian anchovy (Stolephorus indicus) J Food Sci 69(4)FCT312-319

Yongsawatdigul J and Piyadhammaviboon P 2004 Inhibition of autolytic activity of lizardfish surimi by proteinase inhibitors Food Chem 87 447-455

Yongsawatdigul J and Park JW 2003 Thermal denaturation and aggregation of threadfin bream actomyosin Food Chem 83(3) 406-416

Worratao A and Yongsawatdigul J 2003 Cross-linking of actomyosin by crude tilapia (Oreochromis niloticus) transglutaminase J Food Biochem 27 35-51

Yongsawatdigul J Worratao A and Park J 2002 Effect of endogenous transglutaminase on gelation of threadfin bream surimi J Food Sci 67(9) 3258-3263

Yongsawatdigul J and Park JW 2002 Biochemical and conformation changes of actomyosin from threadfin bream stored in ice J Food Sci 67(3) 985-990

ACE_Cover_0827

ACE_บทท 0 กตตกรรมประกาศ บทคดยอ สารบญ_21-11-56_New

ACE_บทท 1 บทนำ ทมา review วตถประสงค ขอบเขต 211156

ACE_บทท 2 วธดำเนนการวจย_edit

ACE_บทท 3 ผลการวจย_edit

ACE_บทท 4 สรปและขอเสนอแนะ

ACE_บทท 5 บรรณานกรม_edit

ACE_ประวตนกวจย





คณะผวจย

หวหนาโครงการ

รศดร จรวฒน ยงสวสดกล สาขาวชาเทคโนโลยอาหาร

ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ พศ 2551-2552 ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

สงหาคม 2556

ก


ข





ค



ง





จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








ก


ข





ค



ง





จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








ข





ค



ง





จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








ค



ง





จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








ง





จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








จ



ฉ






ช








sequencing









67

ซ














ตางๆ



55

ฌ











68

1


2






3



4





5


6



7


8




9




10






11



Cheung 1971)




12



al 1995)



13








14










15





16





17






18


19


20






Kim et al (2001)







Je et al (2005)






Je et al (2007)

20

21



Kim et al (2007)



Je et al (2008)



Ren et al (2008)





Hsu (2010)


DPALATEPDPMPF


Ngo et al (2010)

21

22



You et al (2010)













Zhang et al (2012)




22

23











Jung et al (2005)



Qian et al (2008b)

23

24




Qian et al (2008a)


Wang et al (2013)





24

25








25

26




Chen et al (1998)



Sheih et al (2009a)




Kudo et al (2009)




Zhang et al (2010)

26

27






28


29







30






31






32




33







34






35





36



1000

00

B

BB

CC

IICC





37









38




39








40







A520 of control

41







42


43


44






45




46



(a)

(b)

47






48


(mg) Total activity



Yield ()



(c)

(b) (a) (a)

49







31

21

45

66

97

200 kDa

116

a b

Std 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

50







143




399





51






150 120

100 100

70

60

50

40

30

85 100

Inhibitor II

PNGase F

Inhibitor I

Inhibitor II

Inhibitor I

2 1 Std

52






53







MHC

AC

TM


Paste 0 025 05 1 0 025 05 1

54











55





56









57






58





59




G-I

G-I G-II

(B)

60




61


Sequence no

PepNovo score


Amino acid sequence





62







63


A

B1

B

64




ผลผลต()







(microM Trolox)


(mM EDTA)


ผลผลต ()


64

65





66


B1 1 LDDEFPDLSLH B2


1 VELLVPK





















22 NPELEELSFLYAQ

23 NPELEELSFLYAAG

24 NPYVMEFNLDKYFE

25 PNYVMEFNLDQLYY



28 TLNYQDLAEPRCFTM

29 TLRDSLEDELYAQ

30 EELRALEEELEAWQL


32 EELARLEEELEAWQL

33 GVDNLVFLEWMDLLE

34 LEELEEELEALWQ


36 AERAAFLEEELEKMRF

37 FSGDQLEDLAGMFF


39 KLEDMQLEAEGGCKLE

40 LVEEELDVGAQKLMP

41 ARLEELEEELEACKPV

42 ELEEELEAKPVC

43 LEELEEELAKCPVE


67


Peptide


(mM Trolox) P1 0a



P1+P2+P3+P4 1962plusmn0021b P2 0a








68




a a a a a

b

70


70




71















72












73












74












75












76












77












78












79












80












81











82














83












84











85


86



2532 2535 2539






ไทย




87










88











89












90













91














ACE_Cover_0827








รายงานการวิจัย...

Documents