ความหลากหลายทางชีวภาพของ ... · 2017-10-17 · 2...

รายงานการวจยฉบบสมบรณ

เร�อง

ความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนปาดบแลงและ ดนปาสนสองใบ อทยานแหงชาตน! าหนาว

โดย

ผศ.ดร.ธวชชย สมประดษฐ และคณะ ภาควชาจลชววทยาและปรสตวทยา

คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร 2552

2

คานา

การศกษาความหลากหลายทางชวภาพของส�งมชวต ในประเทศไทย มความสาคญมากอยางย�ง จาเปนตองดาเนนการอยางเรงดวน เน�องจากปจจบนทรพยากรปาไม และสภาพแวดลอมภายในประเทศ ไดรบการคกคามท ,งทางตรงและทางออม จากปญหาการเพ�มข,นของประชากรอยางตอเน�อง การพฒนาอยางไรทศทางซ�งขาดการควบคมท�เหมาะสม ตลอดจนการขาดวสยทศนของบคลากรท�รบผดชอบหลายสวน ทาใหขอมลพ,นฐานดงกลาวไมไดรบการศกษาเทาท�ควร โดยเฉพาะทรพยากรชวภาพในกลมจลนทรย ยสตเปนจลนทรยกลมเช,อรา ท�มขอมลการศกษานอยมากในประเทศไทย โดยเฉพาะในพ,นท�ปาไม ในเขตอทยานแหงชาต เขตรกษาพนธสตวปา และพ,นท�สงวนอ�น ท ,งท�ยสตเปน จลนทรยท�มคณประโยชนมากมายตอมนษยชาต ท ,งการใชผลตอาหาร เคร�องด�ม ผลตภณฑเสรมสขภาพ เภสชภณฑหลายชนด ตลอดจนการแกปญหาส�งแวดลอม และประเทศไทยไดรบการคาดหมายวามความหลากหลายทางชวภาพของยสตสงมาก ซ�งสนบสนนจากการวจยของผเขยนในเบ,องตน เร�อง ความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนของปาดบเขา ปาเบญจ-พรรณ ปาเตงรง และปาสนสามใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว อยางไรกตามความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนปาดบแลง และปาสนสองใบ ในเขตอทยานแหงชาตน,าหนาว ยงไมไดรบการศกษา ดงน ,นเพ�อใหขอมลความหลากหลายทางชวภาพในดนปาไมของอทยานแหงชาตน,าหนาว มความสมบรณมากข,น ผวจยจงไดรบทนสนบสนนการวจยจากคณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร เพ�อศกษาวจย ผวจยขอขอบคณมา ณ.โอกาสน,

ขอขอบคณกรมอทยานแหงชาต สตวปา และพนธพช ท�ใหความอนเคราะหพ,นท�และนกวจยรวมการศกษาในคร ,งน, ท�ขาดได ตองขอขอบพระคณ คณวโรจน หนกแนน อดตหวหนาอทยานแหงชาตน,าหนาว พ�บญเพง และคณะท�ชวยเหลอในการเกบตวอยางเพ�อศกษาวจยในคร ,งน,

ผชวยศาสตราจารย ดร.ธวชชย สมประดษฐ หวหนาโครงการวจย

3

บทท� 1 บทนา

ท�มาและความสาคญของการวจย

ประเทศไทยมจดต ,งทางภมศาสตรท�เหมาะสมในระหวางเสนรงท� 5 องศา 40 ลบดา ถง 20 องศา 35 ลบดาเหนอ และเสนแวงท� 93 องศา 30 ลบดา ถง 105 องศา 40 ลบดาตะวนออก ทาใหสภาพภมอากาศของประเทศไทยเกดข,นจากการสรางสภาวะสมดลของพลงงานในเขตรอนกบเขตหนาวในแถบข ,วโลกเหนอ กอปรกบสภาพภมประเทศประกอบดวยเทอกเขาสงสลบ ซบซอนในภาคเหนอ เปนท�ราบในตอนกลางของประเทศ และมแนวสนเขาตอเน�องจากซกตะวนตกลงไปจนสดภาคใต ภาคตะวนออกเฉยงเหนอเปนท�ราบสง และลาดลงสแมน,าโขง ปจจยเหลาน,ทาใหเกดความแปรผนข,นในแตละพ,นท�ทาใหเกดสภาพภมอากาศเฉพาะถ�น (micro-climate) ซ�งเม�อผนวกกบสภาพของดนท�เกดจากวตถตนกาเนด (parent materials) ท�แตกตางกน สงผลใหเกดความหลากหลายของชนดปาไมในแตละภมภาคของประเทศไทย

ระบบนเวศปาไม (Forest Ecosystem) ของประเทศไทยมความซบซอนทางดานกายภาพและชวภาพสง เปนผลจากความผนแปรของปจจยแวดลอมตางๆ เชน ปรมาณน,าฝนท�เกดจากลมมรสมตะวนตกเฉยงใต ลมจากรองความกดอากาศ และลมไตฝน ความช,นในบรรยากาศ อณหภม ฤดกาล สภาพทางธรณวทยา และสภาพของไฟปา ดวยปจจยตางๆเหลาน,ทาใหสงคมส�งมชวตในระบบนเวศปาไมของประเทศไทยถกคาดหมายวามความหลากหลายทางชวภาพสง ท ,งในดานความหลากหลายทางพนธกรรม (genetic diversity) ความหลากหลายของชนดหรอสปชส (species diversity) และความหลากหลายของระบบนเวศ (ecological diversity) จากขอมลพ,นฐานของการศกษาในดานตางๆท�เก�ยวของทาใหนกวชาการดานความหลากหลายทางชวภาพประมาณการวา จากจานวนส�งมชวตท ,งหมดบนโลกท�มประมาณ 5 ลานชนด จานวนประมาณ 350,000 ชนด พบอยในประเทศไทย ดงน ,นประเทศไทยจงนบไดวามความร�ารวยอยางมากในดานความหลากหลายของส�งมชวต ท ,งพช สตว และจลนทรย ในสวนของจลนทรยคาดวาจะมในประเทศไทยถง 200,000 ชนด หรอมากกวา อยางไรกตามประมาณ 1 ใน 10 สวนของจานวนจลนทรยท ,งหมดเทาน ,นท�มการศกษาและรายงานผลการวจยท ,งภายในประเทศและตางประเทศ ทาใหจลนทรยสวนใหญท�คาดวามในประเทศไทย โดยเฉพาะอยางย�งจลนทรยท�อาศยอยในระบบนเวศปาไมของเมองไทยท�มความอดมสมบรณและถกกนเปนพ,นท�อนรกษ ซ�งกระจายอยตามเขตอทยานแหงชาต และเขตรกษาพนธสตวปา ยงไมไดรบการศกษาอยางจรงจง และไมมรายงานการวจยเผยแพรออกมา ซ�งเม�อพจารณาจากการท�ประเทศไทยมการสญเสยพ,นท�ปาไมเปนจานวนมหาศาล ในชวง 30 ปท�ผานมาจนถงปจจบน เน�องมาจากสาเหตสาคญหลายประการดวยกน เชน การเพ�มของประชากรทาใหมการบกรกปาเพ�มข,นเพ�อเปนท�อยอาศยและทาการเกษตรกรรม การใหสมปทานปาไมท�ขาดการควบคมอยาง

4

เพยงพอ การตดถนนเขาสพ,นท�ปา การเกษตรเชงอตสาหกรรม ความกาวหนาของเทคโนโลยท�ใชในการทาลายปา และการครอบครองท�ดนเพ�อเกงกาไร เปนตน จากสาเหตดงกลาวเหลาน, ทาใหอตราการคกคามตอความหลากหลายทางชวภาพของประเทศไทย โดยเฉพาะความหลากหลายทางชวภาพของจลนทรยเพ�มสงมากข,นเร�อยๆ หากขาดการศกษาในดานความหลากหลายทางชวภาพของจลนทรยอยางรวดเรว และเปนระบบตามหลกการทางวทยาศาสตรท�ถกตอง ผลกระทบท�ตามมาคอ ประเทศไทยจะสญเสยชนดและสายพนธของจลนทรยท�มความหลากหลายในดานพนธกรรมไปอยางไมสามารถท�จะประเมนคาได ท ,งท�ชนดและสายพนธของ จลนทรยดงกลาวสามารถนามาศกษาวจยเพ�อประยกตใชใหเกดประโยชนในดานตางๆ เชน ดานการเกษตร อตสาหกรรม การแพทย และส�งแวดลอม อนจะนามาซ�งการยกระดบคณภาพชวตของประชากรในประเทศไทยโดยรวมในท�สด วตถประสงคของโครงการวจย 1. เพ�อศกษาความหลากหลายของยสตในดนปาดบแลงและดนปาสนสองใบของ อทยานแหงชาตน,าหนาว 2. เพ�อศกษาความสมพนธเชงววฒนาการของยสตท�อาศยในดนปาดบแลงและ ดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว

3. เพ�ออนรกษทรพยากรพนธกรรมของยสตในดนปาดบแลงและดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว สายพนธท�สามารถเพาะเล,ยงได โดยใชการศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตดวยเทคนคมาตรฐานทางอนกรมวธานแบบด ,งเดม และอนกรมวธานสมยใหม ผลท�คาดวาจะไดรบ

1. ทราบความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนของปาดบแลงและปาสนสองใบ ในเขตอทยานแหงชาตน,าหนาว โดยเฉพาะสายพนธท�สามารถเพาะเล,ยงได

2. สามารถแยก รวบรวม และเกบรกษาสายพนธบรสทธ [ของยสตสายพนธท�สามารถเพาะเล,ยงไดในหองปฏบตการ เพ�อเปนการอนรกษทรพยากรทางพนธกรรมอยางย �งยน

3. ทราบและเขาใจความสมพนธทางววฒนาการของยสตท�พบในดนของปาดบแลงและปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว 4. ไดขอมลท�เปนประโยชนเพ�อการศกษาวจยในอนาคตเก�ยวกบความหลากหลายทางชวภาพของยสต

5

บทท� 2 การตรวจเอกสาร

อทยานแหงชาตน,าหนาว เปนอทยานแหงชาตท�มขนาดใหญแหงหน�งของประเทศไทย

ไดรบการจดต ,งในป พ.ศ. 2515 อาณาเขตของอทยานครอบคลมพ,นท�ประมาณ 603,750 ไร หรอ 966 ตารางกโลเมตร เปนอทยานแหงชาตท�ต ,งอยบนรอยตอของภาคเหนอ และภาคตะวนออกเฉยงเหนอ พ,นท�เปนภเขาสลบซบซอน ความสงโดยเฉล�ยประมาณ 800 เมตรจากระดบน,าทะเลปานกลาง พ,นท�ประมาณ 95 เปอรเซนตของพ,นท�ท ,งหมดถกปกคลมดวยปาธรรมชาตหลายชนด เชน ปาดบเขา ปาดบแลง ปาเบญจพรรณ ปาเตงรง และ ปาสนเขา ทาใหอทยานแหงชาตน,าหนาวเปนแหลงตนน,าของลาน,าหลายสาย เชน ลาน,าพรม ลาน,าพอง ลาน,าเชญ และลาน,าปาสก องคประกอบทางธรณวทยาประกอบดวยหนวยดนท�ลาดเชงซอนท�เกดจากการสลายตวของหนหลายชนด เชน หนทราย หนดนดาน หนปน และหนกรวดมน ทาใหมลกษณะท�แตกตางกนไปท ,งเน,อดน สดน และปฏกรยาของดนตามแตวตถตนกาเนด สภาพภมอากาศในเขตอทยานแหงชาตน,าหนาวมอากาศคอนขางหนาวเยน อณหภมโดยเฉล�ยประมาณ 20-22 องศาเซลเซยส ปรมาณน,าฝนรายปอยระหวาง 1,000-1,700 มลลเมตร ซ�งปรมาณน,าฝนไดรบอทธพลจากลมมรสมตะวนตกเฉยงใต และลมมรสมตะวนออกเฉยงเหนอ ทาใหเกดฤดกาล 3 ฤดกาล คอ ฤดฝน ฤดหนาว และฤดรอน จากปจจยดงท�กลาวมาขางตน ทาใหระบบนเวศปาไมของอทยานแหงชาตน,าหนาวมความอดมสมบรณ และซบซอนในเชงนเวศวทยา อนกอใหเกดความหลากหลายทางชวภาพท ,งในดานของความหลากหลายทางพนธกรรม ความหลากหลายของสปชส และความหลากหลายของระบบนเวศ ซ�งสอดคลองกบการสารวจพบชนดของพชและสตวมากกวา 400 ชนดท�อาศยอยในระบบนเวศปาไมของอทยานแหงชาตน,าหนาว อยางไรกตามขอมลดานความหลากหลายทางชวภาพของจลนทรยในเขตอทยานแหงชาตน,าหนาวยงมนอยมากเน�องจากขาดการศกษาตามหลกวชาการท�ถกตองและเปนระบบ ดงน ,นการศกษาความหลากหลายทางชวภาพของจลนทรยในระบบนเวศปาไมของอทยานแหงชาตน,าหนาวจงมความจาเปนอยางย�ง โดยอาศยเทคนคมาตรฐานท�ใชในการศกษาอนกรมวธานแบบด ,งเดม (conventional taxonomy) และอนกรมวธานสมยใหม (modern taxonomy) ตลอดจนเทคนคทนสมยทางนเวศวทยาระดบโมเลกล (recent technique in molecular ecology) ท�ใชในการประเมนความหลากหลายทางชวภาพของจลนทรยไดอยางถกตอง และครอบคลมท ,งจลนทรยท�สามารถเพาะเล,ยงได (culturable microorganisms) และ จลนทรยท�ยงไมสามารถเพาะเล,ยงได (unculturable microorganisms) ความหลากหลายทางชวภาพของยสต (yeast biodiversity) หมายถง คณสมบตของกลมหรอชนดของยสตท�มความหลากหลายในระดบพนธกรรมหรอยน (genetic diversity) ความหลากหลายในระดบชนดหรอสปชส (species diversity) จนถงความหลากหลายของแหลงท�อยอาศยในเชงนเวศวทยา (ecological diversity) ยสตเปนเช,อราท�เซลลสวนใหญดารงชวตแบบ

6

เซลลเดยว (unicellular fungi) พบไดท �วไปในแหลงท�อยอาศยตามธรรมชาต เชน ดน อากาศ น,า สตว และพช (do Carmo-Sousa, 1978; Spencer and Spencer, 1997; Luong et al., 2000; Nakase, 2000) ดนเปนแหลงท�อยอาศยของยสตท�นาสนใจ เน�องจากดนอดมไปดวยสารอาหารมากมายหลายชนดท�จาเปนตอการเจรญของยสต ซ�งเปนผลมาจากกระบวนการยอยสลายซากพชซากสตวโดยกจกรรมของแบคทเรยและเช,อราชนดตางๆ ผลของการใชสารอาหารดงกลาวทาใหยสตสามารถผลตสารเมแทบอไลซท�สาคญ เชน แอลกอฮอล กรดอนทรย และกาซหลายชนด ท�มผลในการสงเสรมการเจรญของจลนทรยหลายกลม ท ,งกลมท�ตองการออกซเจนในการเจรญ (aerobes) กลมท�ไมตองการออกซเจนในการเจรญ (anaerobes) และกลมท�สามารถเจรญไดท ,งในสภาพท�มและไมมออกซเจน (facultative anaerobes) (Reith et al., 2002) อยางไรกตามพบวายสตบางชนดในสกล Candida Cerinosterus Cryptococcus Debaryomyces Hormonema Hortaea Pseudozyma Rhodotorula และ Trichosporon มความสามารถในการยอยสลายซากพชซากสตว เน�องจากยสตเหลาน,มกจกรรมของเอนไซมหลายชนด เชน เซลลเลส (cellulase) เฮมเซลลเลส (hemicellulase) เพคตเนส (pectinase) โปรตเอส (protease) และไลเปส (lipase) เปนตน (Middelhoven, 1997; Scorzetti et al., 2000; Middelhoven et al., 2001) นอกจากน,จากการศกษา พบวา ยสตหลายชนด เชนAureobasidium pullulans Citeromyces matritensis Cryptococcus laurentii Rhodotorula

glutinis และ Sporobolomyces roseus มความสามารถในการสรางสารปฏชวนะในการยบย ,งการเจรญของแบคทเรยบางชนด (McCormack et al., 1994) ความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนมความแตกตางกนไปข,นอยกบปจจยทางดานกายภาพ และชวภาพของดน เชน ชนด ความอดมสมบรณ สภาวะความเปนกรด-ดาง อณหภมความช,น และส�งมชวตชนดตางๆในดน (Slavikova and Vadkertiova, 2000) ยสต บางชนด เชน Debaryomyces occidentalis Lipomyces starkeyi L. lipofera L. kononenkoae L. tetrasporus L. anomalus Schizoblastosporion starkeyi-henricii Sporobolomyces salmonicolor และยสตหลายชนดในสกล Cryptococcus และ Rhodotorula เปนยสตท�พบไดท �วไปในดน (Spencer and Spencer, 1997) การศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนในอดตโดยท �วไปมกเปนการศกษายสตท�อาศยอยในดนท�เกบจากแหลงตางๆ ในหลายภมภาคของโลกท�มความแตกตางกนในดานลกษณะของภมอากาศ (Goto et al., 1987; van der Walt et al., 1994; Kurtzman, 2001) ในสวนของการศกษาความหลากหลายของยสตในดนท�ทาการเกบรวบรวมมาจากพ,นท�ปาอนรกษยงมอยนอยมาก เชน Slavikova and Vadkertiova (2000) ศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตท�อาศยอยในดนของปาผลดใบ (deciduous forest) และปาสน (coniferous forest) ในประเทศสโลวาเกย พบวา ยสตสวนใหญท�พบในดนของปาท ,ง 2 ชนดสวนใหญเปนยสตในกลม basidiomycetous yeasts คอ Cryptococcus laurentii C. albidus C. macerans C. terreus Cystofilobasidium capitatum Leucosporidium scottii Rhodotorula

7

aurantiaca R. glutinis R. rubra Sporobolomyces salmonicolor Trichosporon cutaneum และ T. pullulans สาหรบยสตสวนนอยท�พบเปนยสตในกลม ascomycetous yeasts คอ Candida famata Debaryomyces castellii D. polymorphus Kloeckera apis และ Pichia

americana Polyakova et al. (2001) ศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนท�ม

ความช,นสงท�เกบในพ,นท�ปาอนรกษในเขต Western Siberia และ Hummocky Tundra Region ท� Cape Barrow (Alaska) พบวายสตสวนใหญท�พบในดนเปนยสตในกลม basidiomycetous yeasts เชนเดยวกน โดยสปชสท�พบมาก คอ Cryptococcus albidus C. gilvescens และ Rhodotorula mucilaginosa สาหรบยสตในกลม ascomycetous yeasts ท�พบ คอ Candida

paludigena และ Schizoblastosporion starkeyi-henricii ซ�งสอดคลองกบการศกษาความหลากหลายของยสตในดนปาไมของอทยานแหงชาตในประเทศออสเตรยท�พบวา ยสตสวนใหญท�พบในดนเปนยสตในกลม basidiomycetous yeasts โดยเฉพาะอยางย�ง Cryptococcus หลายสปชส (Wuczkowski and Prillinger, 2004) จากขอมลขางตนจะเหนไดวา การศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนของปาอนรกษท�มรายงานการวจยท ,งหมดซ�งไดรบการตพมพในวารสารทางวชาการระดบนานาชาตเปนการศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนของปาธรรมชาตในเขตท�มภมอากาศคอนขางหนาวเยนซ�งลกษณะภมอากาศแตกตางอยางส,นเชงกบปาธรรมชาตในเขตพ,นท�อนรกษในอทยานแหงชาต และเขตรกษาพนธสตวปาของประเทศไทย การศกษาความหลากหลายทางชวภาพของยสตในดนโดยสวนใหญเปนการศกษาโดยใช Culture-dependent method ซ�งอาศยการแยกยสตจากดนตวอยางโดยใชอาหารเล,ยงเช,อท�เหมาะสมซ�งมผลในการเหน�ยวนาใหเกดการเจรญของยสต และมการเตมสารท�ยบย ,งการเจรญของ แบคทเรย และราเสนใยท�มอยจานวนมากในดน อาหารเล,ยงเช,อท�ใชในการแยกยสตโดยท �วไป คอ Yeast Extract Malt Extract (YM) medium หรอ Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) medium ท�ปรบพเอชเปน 3.7 ดวยกรดไฮโดรคลอรก (hydrochloric acid) หรอกรดซลฟรก (sulfuric acid) (Yarrow, 1998) นอกจากน,อาจใชกรดอนทรย (organic acid) บางชนด เชน กรดโพรพโอนก (propionic acid) หรอ กรดแลกตก (lactic acid) เตมลงไปในอาหารเล,ยงเช,อเพ�อยบย ,งการเจรญของราเสนใย และแบคทเรย (Lachance, 1990; Kerrigan et

al., 2004) อยางไรกตามในปจจบนนยมเตมสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอลเขมขน 100-200 มลลกรมตอลตร และกรดโพรพโอนกเขมขน 1 กรมตอลตร ลงไปในอาหารเล,ยงเช,อเพ�อยบย ,งการเจรญของแบคทเรย และราเสนใยตามลาดบ (Kurtzman and Sujiyama, 2001) นอกจากน,อาจใชอาหารท�มแหลงคารบอนและแหลงพลงงานท�จาเพาะในการแยกยสตเฉพาะกลม เชน การใชอาหารเล,ยงเช,อท�มเมธานอล (methanol) เปนแหลงคารบอนและแหลงพลงงานในการแยกยสตท�มความสามารถในการใชเมธานอล (methylotrophic yeasts) (van Dijken and Harder, 1974; Limtong et al., 2004) หลงจากแยกยสตจากดนตวอยางแลว การระบช�อสปชสของยสต

8

ในชวง 1-2 ทศวรรษท�ผานมามกใชการเปรยบเทยบคณลกษณะบางประการของยสตท�แยกไดกบยสตท�มรายงานการศกษาเรยบรอยแลวโดยยดหลกการของอนกรมวธานแบบด ,งเดมเปนเกณฑ คอ การเปรยบเทยบคณลกษณะทางสณฐานวทยา คณลกษณะของการเจรญในอาหารเล,ยงเช,อ คณลกษณะทางสรรวทยาและชวเคม และคณลกษณะทางเคมเปนหลก อยางไรกตามในชวงปลายทศวรรษท�ผานมามการพฒนาเทคนคท�มประสทธภาพสงและแมนยาในการระบช�อสปชสของยสตโดยเปรยบเทยบลาดบของนวคลโอไทดบรเวณ D1/D2 domain ของ 26S rDNA ซ�งยาวประมาณ 600 นวคลโอไทด และมความจาเพาะในยสตแตละสปชส ท ,งน,ยสตตางสปชสกนจะมความแตกตางของลาดบของนวคลโอไทดบรเวณ D1/D2 domain ของ 26S rDNA มากกวา 1 เปอรเซนต (Kurtzman and Robnett, 1997, 1998) ปจจบนเทคนคดงกลาวไดรบการยอมรบอยางสงในการใชระบช�อสปชสของยสตท�แยกจากแหลงท�อยอาศยตามธรรมชาตตางๆ (Fell et al., 2000; Fonseca et al., 2000; Kurtzman, 2001; Shin et al., 2001, Bai et al., 2002; Thanh et al., 2003, Hirai et al., 2004; Limtong et al., 2004)

9

บทท� 3 วธการวจย

การวางแปลงพ7นท�และการเกบดนตวอยาง กาหนดแปลงพ,นท�ในการเกบดนตวอยางในพ,นท�ปาดบแลงและปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว ขนาดกวาง 40 เมตร ยาว 120 เมตร และแบงพ,นท�ออกเปนแปลงยอย 48 แปลง ขนาดกวาง 10 เมตร ยาว 10 เมตร จากน ,นทาการเกบตวอยางจาก 24 แปลงยอย และ นาดนตวอยางท�ไดมารวมกนเปน composite sample และใชในการศกษาตอไป การแยกยสตจากดนตวอยาง แยกยสตจากดนตวอยางทาตามวธท�ดดแปลงจากวธของ Kurtzman and Sugiyama (2001) โดยใสดนตวอยาง 5 กรมลงในอาหาร acidified YM (yeast extract malt extract) broth ท�มสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอลเขมขน 100 มลลกรมตอลตร และกรดโพรพโอนก 0.1 เปอรเซนต ปรบพเอชเปน 3.7 บมท� 160 รอบตอนาท นาน 3-7 วน จากน ,นทาการแยกยสตท�เจรญในอาหารดงกลาวโดยใช acidified YM agar ท�มสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอลเขมขน 100 มลลกรมตอลตร และกรดโพรพโอนก 0.1 เปอรเซนต ปรบพเอชเปน 3.7 บมนาน 3-7 วน เม�อพบโคโลนบนผวหนาอาหารทาการเลอกเกบโคโลนท�มความแตกตางกน และนาไปทาใหบรสทธ [โดยใชเทคนค cross streak บนอาหาร YM agar และเกบเช,อยสตบรสทธ [ไวใชในการศกษาตอไป การระบช�อยสตโดยการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain ของ LSU rDNA (26S rDNA) ทาการแยกดเอนเอของยสตโดยใชวธท�ดดแปลงจากวธของ Lachance และคณะ (1999) จากน ,นทาการขยายปรมาณดเอนเอเปาหมายโดยใชวธของ Kurtzman และ Robnett (1998) และทาการตรวจสอบ amplicon ท�ไดโดยใชเทคนค agarose gel electrophoresis รวมกบการยอมดวย ethidium bromide จากน ,นทาการแยก amplicon ใหบรสทธ [โดยใช QIAquick Purification Kit (Qiagen) และนา amplicon ท�ไดมาทา cycle-sequencing โดยใช BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit version 3.1 (Applied Biosystems) รวมกบการใชเทคนค PCR ตามวธท�แนะนาโดยบรษทผผลต จากน ,นนาเอาผลการทดลองมาวเคราะหหาลาดบเบสของ D1/D2 domain ของ LSU rDNA (26S rDNA) และนาไปใชในการระบช�อสปชสของยสตโดยการเปรยบเทยบกบลาดบเบสของ D1/D2 domain ใน database ของ DDBJ (DNA Data Bank of Japan) โดยใชโปรแกรม BLAST บน homepage ดงกลาว พรอมท ,งวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการโดยใชโปรแกรม CLUSTAL X 1.61

10

บทท� 4 ผลการทดลอง

การแยกยสตจากดนตวอยาง จากผลการทดลองแยกยสตจากดนตวอยางท�เกบรวบรวมจากดนปาดบแลงและ ดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว สามารถรวบรวมสายพนธยสตบรสทธ [ไดท ,งหมด 284 สายพนธ (ตารางท� 1) ตารางท� 1 รายละเอยดของจดเกบตวอยาง ฤดกาลท�เกบตวอยาง และจานวนสายพนธยสตท�แยกได _____________________________________________________________________ จานวนสายพนธยสตท�แยกได จดท� ดนปาดบแลง ดนปาสนสองใบ _______________________________________________________________ R W S R W S ______________________________________________________________________ 1 5 4 4 5 4 4 2 5 4 5 5 5 4 3 6 5 5 4 5 5 4 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 3 3 5 6 3 4 3 3 3 3 7 2 3 2 5 5 5 8 6 5 5 4 4 3 9 3 3 3 4 3 3 10 4 4 3 4 4 3 11 3 3 3 3 4 3 12 3 3 2 3 3 3 _______________________________________________________________________ รวม 50 48 45 48 48 45 _______________________________________________________________________ R คอ ฤดฝน S คอ ฤดรอน W คอ ฤดหนาว

11

การระบช�อยสตโดยการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain ของ LSU rDNA (26S rDNA) จากการพสจนเพ�อระบช�อยสตท�แยกไดจากดนปาดบแลง 143 สายพนธ รายละเอยด ผลการพสจนเพ�อระบช�อยสตสรปในตารางท� 2 ตารางท� 2 รายช�อสปชสยสตท�พบในดนปาดบแลงของอทยานแหงชาตน,าหนาว _______________________________________________________________________ จนส สปชส จานวนสายพนธ _______________________________________________________________________ Asterotremella A. humicola 3

Blastobotrys B. mokoenaii 7 Candida C. albicans 2 C. boidinii 2

C. cylindraces 2 C. diversa 21 C. fructus 2 C. maltosa 3 C. pseudolambica 4 C. zeylanoides 3 Candida sp. 10

Debaryomyces D. hansenii 20 D. vanrijiae 23

Geotrichum G. fragans 2 G. silvicola 5

Hanseniaspora H. uvarum 2 Kazachstania K. humicola 2 Kazachstania K. unisporus 3 Kluyveromyces Kluyveromyces sp. 2

Pichia P. acaciae 4 Pichia P. spartinae 1 Pichia Pichia sp. 3

Tetrapisispora T. namnaonensis 11 Williopsis W. saturnus 6

___________________________________________________________________

12

จากการพสจนเพ�อระบช�อยสตท�แยกไดจากดนปาสนสองใบ 141 สายพนธ รายละเอยด ผลการพสจนเพ�อระบช�อยสตสรปในตารางท� 3 ตารางท� 3 รายช�อสปชสยสตท�พบในดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว _______________________________________________________________________ จนส สปชส จานวนสายพนธ _______________________________________________________________________ Asterotremella A. humicola 3

Blastobotrys B. mokoenaii 3 Candida C. boidinii 3 C. maltosa 5 C. silvae 2 C. tropicalis 3

Candida sp. I 3 Candida sp. II 3

Debaryomyces D. hansenii 3 D. vanrijiae 4 Galactomyces G. reessii 3

Geotrichum G. silvicola 2 Issatchenkia Issatchenkia sp. 17 Lachancea L. fermentati 10 Ogataea O. reessii 7 Pichia P. membranifaciens 20 P. pijperi 3 P. spartinae 7 Pichia sp. 1 Saccharomyces S. cerevisiae 3

Tetrapisispora T. namnaonensis 4 Torulaspora To. delbrueckii 5 Trichosporon Tr. asahii 7 Williopsis W. saturnus 22

__________________________________________________________________

13

การวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการ การวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการของยสตท�พบในดนปาไมดบแลงและดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาตน,าหนาว สรปในภาพท� 1-32

ภาพท� 1 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต C. cylindracea (DR1-1 และ DW1-4)

จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain

(Bar 0.01 nucleotide substitution per nucleotide position)

Saccharomyces cerevisiae (AY048154)

Pichia xylosa (EU011653)

Pichia toletana (EU011652)

Candida chilensis (U45821)

Cephaloascus fragrans (U40091)

Cephaloascus albidus (U39474)

Pichia stipitis (U45741)

Candida anglica (AF245403)

Candida cleridarum (AF251552)

Candida fragi (U71071)

Candida quercitrusa (U45831)

Candida natalensis (U45818)

100

97

96

58

99

72

79

100

51

Pichia inositovora (U45848)

DR1-1, DW1-4

100

Candida piceae (AF153672)

Pichia pilisensis (EU011630)

Candida sonorensis (U70185)79

Candida hungarica (EU011587)

100

68

65

80

40

C. cylindracea (U48523)

0.01

14

ภาพท� 2 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต G. silvicola (DR3-1 และ PS2-4)



Candida albicans (U45776)

Geotrichum fragrans (U40119)

Geotrichum clavatum (U40112)

Geotrichum fermentans (40117)

Geotrichum histeridarum Y-27729 (AY520357)

Geotrichum carabidarum Y-27727 (AY520292)

Dipodascus tetrasporeus (AB300502)

100

Geotrichum klebahnii (U40114)

Dipodascus armillariae (U40093)

Dipodascus macrosporus (U40121)

88

Dipodascus albidus (U40081)

Galactomyces reessii (U40111)

Geotrichum citri-aurantii (U94918)

Galactomyces geotrichum (U40118)

DR3-1, PS2-4

Geotrichum silvicola EM 17 (AB281297) 100

77

65

98

50

82

33

38

81

100

85

0.02

15

ภาพท� 3 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต C. zeylanoides (DR9-1 และ DW12-3)




Candida multigemmis (U45782)

Debaryomyces hansenii var. fabryi (U94927)

Debaryomyces prosopidis (AB054993)

Debaryomyces robertsiae (U45805)

Debaryomyces udenii (U45844)

Debaryomyces coudertii (U45846)

87

Debaryomyces nepalensis (U45839)

Debaryomyces hansenii (U45808)

100

Candida ralunensis (U45786)

Candida laureliae (U45787)

Candida boleticola (U45777)

Candida schatavii (U45795)

Candida railenensis (U45800)

Candida oleophila (U45793)

C. santamariae var. santamariae (U45794)

Candida beechii (U45798)

C. santamariae var. membranifaciens (U45785)

DR9-1, DW12-3

Candida zeylanoides (U45832) 65

84

97

82

99

51

55

80

0.01

Candida krissii (U45853)

16

ภาพท� 4 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต C. diversa (DR1-2 และ DS2-5)




Candida abiesophila (AY923245)

Pichia sp. NRRL Y-11513 (AF017409)

Issatchenkia terricola (U76345)

Torulaspora delbrueckii WQGB52 (DQ869079)

Issatchenkia hanoiensis (AY163900)

Pichia sporocuriosa (EF550232)

Candida pseudolambica (U71063)

100

Pichia cecembensis (AM159112)

37

Candida thaimueangensis (FJ196735)

Issatchenkia occidentalis (U76348)

Candida rugopelliculosa (EF550238)

30

67

100

97

Pichia sp. ST-84 (DQ404448)

Saturnispora mendoncae (AY923242)

Saturnispora sp. NRRLY-11516 (AF017727)

Saturnispora saitoi (U94932)

Saturnispora saitoi (AY923243)

Saturnispora ahearnii (EF550217)

Saturnispora besseyi (EF550216)

99

100

DR1-2, DS2-5

Candida diversa (U71064)

Candida agrestis (U71074)

Saturnispora zaruensis (U94933)

Saturnispora hagleri (AY762363)

Saturnispora dispora (U94937)

100

88

100

100

99

30

100

92

80

64

100

100

100

89

0.02

Candida silvae (U71065)

17

ภาพท� 5 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต C. maltosa (DW4-5 และ PS2-2)




Candida maris (U70181)

Pichia finlandica (U75517)

Candida nemodendra (U70246)

91

Pichia minuta var. nonfermentans (U75518)

Pichia minuta var. minuta (U75515)

Pichia philodendra (U75522)

93

57

44

Williopsis salicorniae (U75966)

58

Candida hyderabadensis (AM159100)

Candida metapsilosis UM6 (FJ515255)

Yarrowia lipolytica SM14 (FJ515252)

Candida orthopsilosis Kw301-97 (FM172988)

Candida parapsilosis Kw113-98 (FM172986)73

68

Candida sojae (U71070)

Candida tropicalis (U45749)

DW4-5, PS2-2

Candida maltosa (U45745)

95

100

72

67

Candida gigantensis (AY520316)

Candida buenavistaensis (EF120595)

Candida africana (AM495238)

Candida dubliniensis (U57685)99

58

70

87

100

100

0.01

18

ภาพท� 6 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต Pichia sp. ST-84 (DS1-3 และ PR4-3)





Pichia sp. NRRL Y-11513 (AF017409)


Torulaspora delbrueckii WQGB52 (DQ869079)




51


Candida rugopelliculosa (EF550238)

35

67


39

100

97


DS1-3, PR4-3

Pichia sp. ST-84 (DQ404448)

Candida sp. BG02-7-15-015A-2-1 (AY520326)

Candida sp. FN7S06 (EF460517)

100

91


Saturnispora sp. NRRL Y-11516 (AF017727)

Candida diversa (EF550213)



Saturnispora hagleri (EF550221)


100


Saturnispora saitoi NRRL Y-7820 (AY923243)


99

100

99

46

100

92

100

88

53

100

100

100

87

0.02

19

ภาพท� 7 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต P. spartinae (DS1-1 และ PR4-2)




Candida palmioleophila SM 49 (AB281308)

Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae (U45842)

Debaryomyces vanrijiae var. yarrowii (U45843)

Debaryomyces pseudopolymorphus (U45845)

99

Debaryomyces castellii (U45841)

Debaryomyces yamadae (U45837)34

Debaryomyces etchellsii (U45809)





Candida psychrophila (U45813)



80

89

49

96

59

Candida shehatae var. lignose (U45772)

Candida shehatae var. shehatae (U45761)

Candida shehatae var. insectosa (U45773)


Pichia segobiensis (U45742)

99

100

Candida coipomoensis (U45747)

Candida lignicola (AY845350)

Candida ergastensis (U45746)

91

88

78

DS1-1, PR4-2

Pichia spartinae (U45764)

Pichia dianae (AF466178)

100

38

76

49

78

0.01

Debaryomyces polymorphus (AB054994)

38

59

20

ภาพท� 8 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต W. saturnus var. mrakii (DW4-2 และ

PR4-1) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Pichia meyerae (U73578)

Pichia euphorbiae (EF550326)

Pichia bimundalis (U73574)

Pichia americana (U73575)

Candida mycetangii (EF550330)

Candida maritima (U69877)

75

80

Pichia mississippiensis (U74597)

Pichia amylophila (U73577)

Pichia fabianii (U73573)

Pichia veronae (U73576)

99

99

Pichia japonica (U73579)

Candida easanensis BCC 11761 (AY634570)

Candida pattaniensis BCC 11799 (AY634569)

85

32

23

47

87

56

Candida vartiovaarae (U69875)

Williopsis saturnus var. subsufficiens (U75960)

Williopsis saturnus var. mrakii (U94929)

DW4-2, PR4-1

Williopsis saturnus var. saturnus (U75958)

Williopsis saturnus var. suaveolens (U94930)

Williopsis saturnus var. sargentensis (U94936)

98

63

96

96

86

0.01

23

21

ภาพท� 9 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ H. uvarum (DR4-4 และ DW4-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Pichia fermentans (U386732)

Hanseniaspora guilliermondii (U84230)

Hanseniaspora lachancei CBS 8818 (AJ512457)

Hanseniaspora opuntiae CBS 8733 (AJ512453)

Hanseniaspora opuntiae CBS 8820 (AJ512451)

96

Rhodotorula mucilaginosa SY3S-1 (U250050)

55

Hanseniaspora clermontiae CBS 8821 (AJ512452)

Hanseniaspora meyeri CBS 8815 (AJ512458)

Hanseniaspora meyeri UWO-PS 87-2361.1 (AJ512461)

78

81

45

DR4-4, DW4-4

Hanseniaspora uvarum G10p1 (AY305681)

95

100

0.01

Hanseniaspora lachancei UWO-PS92-221(AJ512459)

22

ภาพท� 10 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ B. mokoenaii (DS8-4 และ PW9-3) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Lipomyces yamadae (DQ518983)

Pichia koratensis ST-237 (DQ404484)

Pichia acaciae NBRC 1681 (AB354212)

Candida bituminiphila (AF294910)

Candida bertae (U70251)

Stephanoascus smithiae (U76531)

Candida edax (U70245) 100

Blastobotrys proliferans (U40098)

Blastobotrys arbuscula (U40108)

Sympodiomyces parvus (U40096)

Sympodiomyces indianaensis (AY283605)

Trichomonascus petasosporus (AF017247)100

85

61

DS8-4, PW9-3

Arxula adeninivorans (U40094)

Stephanoascus ciferrii (U40138)

Arxula terrestris (U40103)

Candida chiropterorum (U45822) 100

76

Candida santjacobensis (U45811)

Candida ancudensis (U45810)

Candida drimydis (U45815)

Candida petrohuensis (U45819)

Candida antillancae (U45812)

Candida tepae (U45816)

Candida bondarzewiae (U45806)

97

100

78

28

100

38

85

26

100

40

40

100

70

55

0.02

B. mokoenaii CBS 8435 (AY559042)

23

ภาพท� 11 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ T. namnaonensis (DR11-3 และ PW4-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Torulaspora franciscae (U73604)

Torulaspora pretoriensis (U72157)

Saccharomyces dairenensis (AY048168)

100

Kazachstania aquatica (AY881651)


Saccharomyces exiguus CBS8135 (AY007901)

Kazachstania exigua CBS 135 (U982209)

Kazachstania turicensis YM002 (U982208)

Saccharomyces bulderi (AF398486)

Saccharomyces barnettii (AY048164)

93

58

100

54

45

Tetrapisispora arboricola (AF398488)

Tetrapisispora nanseiensis (AF398487)

Tetrapisispora iriomotensis (AF398489)

Tetrapisispora phaffii (AY048166)

Tetrapisispora fleetii CBS 8957 (AY645662)

DR11-3, PW4-4

Tetrapisispora namnaoensis (AB180480)

99

73

84

99

47

96

87

100

0.02

Tetrapisispora namnaoensis SA7S13 (EF460626)

Tetrapisispora namnaoensis SA4S06 (EF460611)

24

ภาพท� 12 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ C. boidinii (DR3-2 และ DW3-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Candida pini (EU011639))

Candida boidinii XM02G (EU293427)

DR3-2, DW3-4

Candida pignaliae (EU011640)

Williopsis salicorniae (EU011637)

Pichia trehalophila (EU011636)

Pichia methanolica (EU011638)

61

Candida piceae (EU011633)

Pichia pilisensis (EU011630)

Candida sonorensis (EU011631)41

77

Candida sithepensis (AB120220)

Candida ovalis (EU011634)

Candida arabinofermentans (EU011635)

65

44

97

21

Ogataea polymorpha (EF550269)

Pichia siamensis EXOC22 (EF063137)

Ogataea siamensis FS96 (AB120216) 94

Pichia finlandica (EU011612)

Ogataea falcaomoraisii (AY561260)

Candida nemodendra (EU011629)

Pichia zsoltii (EU011628)

Pichia henricii (DQ409157)

Pichia glucozyma (DQ409156)91

70

62

49

85

27

Pichia dorogensis (EU011620)

Pichia minuta var. nonfermentans (EU011619)

Pichia minuta var. minuta (EU011618)92

33

75

67

100

60

47

0.01

25

ภาพท� 13 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ C. pseudolambica (DR4-5 และ DS4-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain





Candida californica (EF550230)

Pichia galeiformis (U75738)

Pichia deserticola (U75734)

Candida ethanolica (U71073) 99

Pichia membranifaciens (AB045136)

72


93


99

Issatchenkia hanoiensis (EF550349)

Pichia sporocuriosa RV137 (AB438167)

DR4-5, DS4-4

Candida pseudolambica (AB437385)

100

100

66

44

Issatchenkia scutulata var. exigua (U76349)

Issatchenkia scutulata var. scutulata (AF325358)

Candida rugopelliculosa (U71069)


37

86

90




99





100

82

100


91


98

100

99

97

0.02

26

ภาพท� 14 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ Candida sp. CBS 6394 (PW2-1 และ PS2-1) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain (Bar 0.02 nucleotide substitution per nucleotide position)






100





100

79

82

100


91


98


PW2-1, PS2-1

Candida sp. CBS 6394 (AY551000)

Candida californica (EF550230)

100



Candida ethanolica (U71073)98

89

Pichia membranifaciens (AB045136)


93


100


Issatchenkia hanoiensis (EF550349)

Pichia sporocuriosa (AB438167) 100

62

54





35

87

88

100

100

98

0.02

27

ภาพท� 15 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ D. vanrijiae (DR1-4 และ DW1-3) D. polymorphus (DR2-5 and DS3-3), D. hansenii (DR2-3 and PS1-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Candida palmioleophila (AB281308)

Candida shehatae var. lignose (U45772)

Candida shehatae var. shehatae (U45761)

Candida shehatae var. insectosa (U45773)


Pichia segobiensis (U45742)

99

100

Candida coipomoensis (U45747)

Candida lignicola (AY845350)

Candida ergastensis (U45746)

87

Pichia dianae (AF466178)

84

86

37

DR1-4, DW1-3

Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae (U45842)

Debaryomyces vanrijiae var. yarrowii (U45843)

76

Debaryomyces pseudopolymorphus (U45845)

99

DR2-5, DS3-3

Debaryomyces polymorphus (U45836)

Debaryomyces castellii (U45841)

Debaryomyces yamadae (U45837)

77

Debaryomyces etchellsii (U45809)


DR2-3, PS1-4



Candida psychrophila (U45813)

97

74


59



93

47

89

66

47

82

Pichia spartinae (U45764)

36

79

28

ภาพท� 16 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ G. fragans (DR8-6 และ DW8-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Candida silvae VTT C-04527 (DQ377641)

Issatchenkia occidentalis 5.2-2 (FJ432598)

Geotrichum fermentans (U40117)

Geotrichum cucujoidarum Y-27731 (AY520305)

Candida ghanaensis (AF271083)

100

Candida ubatubensis UNESP-247R (AY695395)

Candida picinguabensis NCYC D3722 (AJ876896)

Metschnikowia corniflorae NRRL Y-27750 (AY611610)

59

Metschnikowia kamakouana UWOPS04-112.5 (AY796024)

Aciculoconidium aculeatum (U40087)

Geotrichum clavatum (U40112)

Dipodascus spicifer (U40115)

Dipodascus capitatus (U40084)

73

DR8-6, DW8-2

Geotrichum fragrans (U40119)

Dipodascus tetrasperma (U40086)

59

Dipodascus magnusii (U400970

68

Dipodascus ovetensis (U40116)

Dipodascus ambrosiae (U40102)

Schizoblastosporion chiloense (U84347)

Dipodascus ingens (U40134)

Dipodascus starmeri (U59391)

74

100

59

99

45

100

86

100

41

96

46

51

76

97

99

0.02

29

ภาพท� 17 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ Kluyveromyces sp. IFO 11072

(DR8-3 และ DS8-3) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain (Bar 0.01 nucleotide substitution per nucleotide position)


Torulaspora delbrueckii CO4 (EU879961)

Torulaspora delbrueckii EXOC3 (EF063124)



Zygosaccharomyces microellipsoides (U72160)

Torulaspora globosa (U72166)

77

Saccharomyces dairenensis (AY048168)

Saccharomyces castellii (AY048167)

95

89

Saccharomyces paradoxus 8MCHS (EU669466)

Saccharomyces cariocanus (AY130342)


100

Saccharomyces bayanus (AY048156)

75

Saccharomyces unisporus (AY048158)

Saccharomyces servazzii (AY048157)

Saccharomyces kunashirensis (AF398483)

99

Kazachstania zonata (AB198187)

Kluyveromyces lodderae (AY048161)

52

43

97

32

Saccharomyces exiguus (AY048163)

DR8-3, DS8-3

Kluyveromyces sp. IFO 11072 (AB087386)

Kluyveromyces yarrowii (AY048170)

100

41

38

0.01

30

ภาพท� 18 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ K. humatica (DW9-2 และ DS9-1) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Kazachstania zonata NBRC 100504 (AB198187)

Kazachstania gamospora NBRC 11056 (AB087388)

Kluyveromyces piceae (U84346)

Saccharomyces rosinii NRRL Y-17919 (AY048160)

Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632 (AY048154)

Torulaspora franciscae (AFU73604)


Torulaspora delbrueckii CBS 133T (AJ508558)


100

Kazachstania servazzii (AB161688)

Kazachstania aerobia AS 2.2384 (AY582127)

Kazachstania unisporus NRRL-Y-1556 (AY007912)

84


Kazachstania kunashirensis NRRL Y-27339 (AF398483)

94

33

Kluyveromyces africanus NRRL Y-8276 (AY048159)

Kazachstania martiniae NRRL Y-409 (AF398481)

49

32

42

Kazachstania jiainicus ATCC MYA-4454 (FJ196732)

Kazachstania yakushimaensis (AB041000)

Kazachstania transvaalensis (U68549)

Kazachstania humatica (AB040999)

DW9-2, DS9-1

74

98

25

100

96

40

74

74

0.02

68

31

ภาพท� 19 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ K. unispora (DW12-2 และ DS12-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain





Saccharomyces dairenensis NRRL Y-12639 (AY048168)

Saccharomyces castellii NRRL Y-12630 (AY048167)



Torulaspora delbrueckii CBS 133T (AJ508558)


41

64

Kluyveromyces yarrowii (AY048170)

99

89

43


Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632(AY048154)

DW12-2, DS12-2

Kazachstania unispora IMAU3Y089 (FJ770561) 93


Kazachstania servazzii NRRL Y-12661 (AY48157) 69

Kazachstania kunashirensis (AF398483)


91

29

Kazachstania africanus NRRL Y-8276 (AY048159)

Kazachstania martiniae NRRL Y-409 (AF398481)

41

43


Kazachstania rosinii NRRL Y-17919 (AY048160)

Kazachstania lodderae NRRL Y-8280 (AY048161)

91

24

64

99

19

39

18

63

65

0.01

Kazachstania unispora IMAU3Y090 (FJ770562)

32

ภาพท� 20 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ I. siamensis (PR2-2 และ PW7-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Candida abiesophila NRRL Y-11514 (AY923245)


Saturnispora mendoncae NRRL Y-11515 (AY923242)



Saturnispora hagleri NRRL Y-27828 (EF550221)


99

51


Saturnispora ahearnii NRRL Y-7555 (EF550217)

Saturnispora saitoi (U94932)99

100

52

95

99


Pichia fermentans NRRL Y-1619 (EF550234)

I. scutulata var. scutulata NRRL Y-7663 (EF550243)



93

Candida pseudolambica NRRL Y-17318 (EF550235)

96

67

Issatchenkia siamensis (AB247501)

PR2-2, PW7-2

Pichia pseudocactophila NRRL Y-17239 (U75732)

Pichia norvegensis NRRL Y-7687 (EF550239)

Pichia cactophila NRRL Y-10963 (EF550241)

Candida inconspicua NRRL Y-2029 (EF550240)

50

99

100

99

37

74

36

77

99

100

98

0.02

Candida thaimueangensis NRRL Y-27416 (EF550231)

33

ภาพท� 21 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ P. membranifaciens (PR7-4 และ PW11-

1) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain


100




Pichia fermentans NRRL Y-1619 (EF550234)

Pichia cactophila NRRL Y-10963 (EF550241)

Candida inconspicua NRRL Y-2029 (EF550240)

Pichia pseudocactophila (U75732)

Pichia norvegensis NRRL Y-7687 (EF550239)

99

51

Issatchenkia siamensis (AB247501)

99

I. scutulata var. scutulata NRRL Y-7663 (EF550243)



85

79

96

PR7-4, PW11-1

Pichia galeiformis C6-3 (EU019217)

Pichia membranifaciens IMAU3Y051 (FJ770524)

Pichia scaptomyzae CECT 11495 (DQ409150)

100

Candida thaimueangensis NRRL Y-27416 (EF550231)

98


Candida pseudolambica NRRL Y-17318 (EF550235)

99

78

32

19

13

52



Candida diversa NRRL Y-5713 (EF550213)

100





100

69

72

100

93


99

100

99

96

0.02

34

ภาพท� 22 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ L. fermentati (PW12-1 และ PS7-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Zygosaccharomyces bisporus (AB375304)

Zygosaccharomyces lentus (AF339888)

Kluyveromyces polysporus NRRL Y-8283 (AY048169)

Kluyveromyces yarrowii NRRL Y-17763 (AY048170)




Kazachstania unispora D3-2 (EU019220)

99

Kazachstania exigua CBS 135 (EU982209)

77

41

Torulaspora globosa (U72166)




Torulaspora delbrueckii (U72156)35

80

29

96

99

31

99

62

PW12-1, PS7-2

Lachancea fermentati (U84239)

Lachancea cidri (U84236)

100

Lachancea waltii (U69582)

Lachancea thermotolerans (U69581)

Lachancea meyersii CBS 8951 (AY645656)

95

98

97

Saccharomyces kluyveri (U68552)

Lachancea kluyveri (EU289340)

62

100

87

89

0.01

35

ภาพท� 23 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ T. asahii (PR3-3 และ PS3-5) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain


Filobasidiella neoformans var. neoformans (AF075484)

Trichosporon lignicola var. simplex (AF363657)

Trichosporon lignicola var. lignicola (AY370685)

Trichosporon lignicola var. undulatum (AF363658)

100

Hyalodendron lignicola KCTC 17082 (AF459698)

87

Trichosporon wieringae CBS 8903 (AY315666)

94

Trichosporon montevideense (AF105397)

Trichosporon domesticum CBS 8111 (AF189874)

Trichosporon brassicae VTT C-04575 (DQ377685)

Trichosporon siamense (AB164370)

99

64

100

92

Trichosporon moniliiforme CBS8400 (AF189873)

Trichosporon middelhovenii (AB180198)

Trichosporon debeurmannianum (AY143554)

Trichosporon cutaneum ESAB19 (AJ749837)

85

65

Trichosporon guehoae (AF105401)

99

Cryptococcus curvatus CBS 570 (AF189834)

39

Trichosporon caseorum HB819 (AJ319757)

Trichosporon lactis HB865 (AJ319756)

Trichosporon ovoides (AB189942)

Trichosporon inkin (AF105396)

66

35

Trichosporon aquatile (AF075520)

Trichosporon insectorum ATCC MYA-4361(FJ196728)

Trichosporon faecale (AF105395)

Trichosporon coremiiforme (AF139983)

76

Trichosporon asahii CBS 8640 (AF189881)

PR3-3, PS3-5

Trichosporon japonicum CBS 8641 (AF308657)

Trichosporon asteroides CBS 2481 (AF075513)

63

67

50

65

52

90

74

56

100

55

67

0.01

36

ภาพท� 24 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ P. silvae (PR5-1 และ PR6-3) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain







69


45

Issatchenkia hanoiensis NRRL Y-27509 (EF550349)


Pichia cecembensis NRRLY-27985T (AM159112)

Candida californica NRRL Y-27254 (EF550230)



Candida ethanolica (U71073)99

Pichia membranifaciens IFO 10731 (AB045136)

78

Candida thaimueangensis ATCC MYA-4468 (FJ196735)

92

100

50

60

91

41


89

PR5-1, PR6-3

Candida silvae NRRL Y-6725 (EF550215)



Candida diversa NRRL Y-5713 (EF550213)

100





100

70

52

100

76

100

98

100

99

95

0.02

Saturnispora mendoncae NRRL Y-11515 (AY923242)

37

ภาพท� 25 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ P. pijperie (PR7-5 และ PR8-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Candida hungarica NRRL Y-27594 (EU011587)

Candida cidri NRRL Y-27078 (EU011588)

Candida boidinii NRRL Y-2332 (EU011598)

Candida arabinofermentans ATCC MYA-4484 (FJ196744)

91

89

Candida quercitrusa JHSb (EF375703)

Candida natalensis EB3 (AB436393)

Candida chilensis (U45821)

100

PR7-5, PR8-4

Pichia pijperi NBRC 102058 (AB449694)

Candida solani (U70179)

100

Pichia amylophila CECT 11439 (DQ409158)

Pichia mississippiensis CECT 11463 (DQ409159)

Pichia meyerae (U73578)

99

Williopsis saturnus WC91-2 (EF532300)

95

Pichia lachancei (AF017412)

Pichia petersonii (U73572)

63

59

Pichia strasburgensis (U74591)

Pichia hampshirensis (EF550334)

Williopsis mucosa (U75961)

Pichia rabaulensis NRRL Y-7945 (EF550303)

Candida odintsovae NRRL Y-17760 (EF550304)

Pichia anomala SYCYS-1 (EU285531)

100

31

98

69

83

75

100

71

79

66

84

22

0.01

38

ภาพท� 26 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ C. tropicalis (PR9-1 และ PW8-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain






91




94

59

46


59

Candida dubliniensis (U57685)

Candida africana UPV-EHU 97135 (AM495238)

99

Candida gigantensis BG02-7-21-004G-1-1 (AY520316)

58

Lodderomyces elongisporus YF12c (EF394940)

Candida hyderabadensis NRRL Y-27953T (AM159100)


FYarrowia lipolytica SM14 (J515252)


86

Candida parapsilosis Kw113-98 (FM172986)

85

75

67

PR9-1, PW8-4

Candida tropicalis (FJ515227)


100


93

70

73

89

71

100

100

0.01

39

ภาพท� 27 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ G. reessii (PW7-4 และ PS7-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Geotrichum histeridarum NRRL Y-27729 (AY520357)

Geotrichum carabidarum NRRL Y-27727 (AY520292)

Geotrichum sp. JCM 5226 (AB271017)

98

Dipodascus armillariae (U40093)

Endomyces decipiens (U40129)

Geotrichum klebahnii (U40114)

100

Dipodascus macrosporus (U40121)

96

Dipodascus tetrasporeus (AB300502)

39

Galactomyces reessii NRRL Y-17566 (U40111)

PW7-4, PS7-4

Galactomyces reessii HIT-BY13 (FJ219595)

63

Galactomyces reessii ED2 (AB436431)

79

Geotrichum citri-aurantii (U94918)

Galactomyces citri-aurantii (U84233)

99

100

Geotrichum sp. HN24-3 (EU651850)

Geotrichum sp. CICC1364 (DQ912840)

Geotrichum sp. HN21-4 (EU651849)

66

62

100

Geotrichum silvicola EM 17 (AB281297)

Geotrichum silvicola EM 6 (AB281296)

Geotrichum sp. 3.4-3 (FJ432593)

Geotrichum sp. DTQ-LP20.11 (EF025925)

Galactomyces geotrichum HN12-2-a (EU753717)

Galactomyces geotrichum HN12-5 (EU708993)

Galactomyces geotrichum HN4-1(EU708992)

Galactomyces geotrichum HN10-2 (EU753714) 51

42

55

50

18

35

47

100

35

100

100

89

0.02

40

ภาพท� 28 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ O. zsoltii (PR3-1 และ PR9-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain



Pichia trehalophila NRRL Y-6781 (EU011636)

Pichia trehalophila (U75723)

Pichia methanolica (U75523)

98


50

Pichia pilisensis NRRL Y-27598 (EU011630)

Candida piceae NRRL YB-2107 (EU011633)

Candida sonorensis (U70185)

23

71

43

Ogataea thermomethanolica N002 (AB200284)


Pichia minuta var. minuta NRRL Y-411(EU011618)

Pichia dorogensis NRRL Y-27599 (EU011620)

92

39


Pichia trehaloabstinens (AF403145)

Ogataea polymorpha NRRL Y-2214 (EF550269)

Pichia angusta (U75524)

Candida thermophila (AF403148)

100

Ogataea siamensis FS96 (AB120216)

92

Ogataea falcaomoraisii UFMG T-264-1 (AY561260)

Candida cf. ortonii UWO(PS)00-186.3 (AF530610)

Candida ortonii (AF313350)

76


Candida krabiensis N051 (AB120219)

PR3-1, PR9-2

Ogataea zsoltii (AF403147)

Pichia pini (U75527)

Ogataea pini (AB440275)

Pichia henricii (U75519)

Ogataea henricii (AB440276)

99

Ogataea neopini (AB440274)

60

Pichia glucozyma (U75520)

Ogataea glucozyma (AB440277)

99

100

94

95

60

24

100

12

89

50

96

29

25

20

92

49

0.01

41

ภาพท� 29 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ C. albicans (DR5-2 และ DS5-4) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain






91




95

58

45


58

DR5-2, DS5-4

Candida albicans TA62 (AF156537)

Candida dubliniensis (U57685)

100

99

Candida gigantensis BG02-7-21-004G-1-1 (AY520316)

64

Candida tropicalis (FJ595932)



93

Lodderomyces elongisporus YF12c (EF394940)

Candida hyderabadensis NRRL Y-27953T (AM159100)

Candida parapsilosis Kw113-98 (FM172986)


Yarrowia lipolytica SM14 (FJ515252)


86

84

76

65

62

65

89

76

100

100

0.01

42

ภาพท� 30 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ A. humicola (DW2-4 และ PS4-3) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain


Filobasidiella neoformans var. neoformans (AF075484)

Bullera cylindrica AS 2.2308 (AY487563)

Bullera huiaensis JCM 8933 (AB118870)

Bullera boninensis AS 2.2413 (AY487568)77

Cryptococcus fragicola (AB126585)

DW2-4, PS4-3

Asterotremella humicola (FJ534906)

Asterotremella pseudolongus (AB126587)

Asterotremella longus (AB126589)

100

99

Asterotremella albida HB82 (AM265554)

Asterotremella albida HB81 (AM265553)

37

99

Asterotremella musci (AB126586)

52

Cryptococcus curvatus (AJ555468)

98

Trichosporon inkin (AF105396)

Trichosporon siamense (AB164370)

Trichosporon loubieri (AF075522)

Trichosporon mycotoxinivorans (AJ601388)

Trichosporon laibachii (AF075514)

Trichosporon akiyoshidainum (AB180200)

Trichosporon multisporum (AF139984)

97

Trichosporon veenhuisii (AF105400)

86

Trichosporon vadense (AY093426)

48

Trichosporon coprophilum (AB180199)

Trichosporon wieringae CBS8903 (AY315666)

42

29

86

69

43

84

97

42

48

35

100

70

0.01

Trichosporon sporotrichoides CBS8246 (AF189885)

43

ภาพท� 31 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ T. delbrueckii (PW10-2 และ PS10-1) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain







Kluyveromyces lodderae NRRL Y-8280 (AY048161)

88

PW10-2, PS10-1

Torulaspora delbrueckii (U72156)


98


52

Torulaspora microellipsoides (U72160)

44


98



43

93



43

99


Saccharomyces kunashirensis NRRL Y-27339 (AF398483)

Saccharomyces servazzii (AB161688)


Saccharomyces unisporus NRRL Y-1556 (AY048158)

75

34

94


Saccharomyces martiniae NRRL Y-409 (AF398481)

49

47

27

23

70

27

68

40

0.01

44

ภาพท� 32 ความสมพนธเชงววฒนาการของยสต◌ S. cerevisiae (PR9-2 และ PW9-2) จากวเคราะหเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของ D1/D2 domain







Kluyveromyces lodderae NRRL Y-8280 (AY048161)

88

PR9-4, PW9-2

Saccharomyces cerevisiae TJY-29 (EU557024)


100

Torulaspora delbrueckii CO4 (EU879961)



51


40


99



42

93

99

44


Saccharomyces kunashirensis NRRL Y-27339 (AF398483)

Saccharomyces servazzii (AB161688)


Saccharomyces unisporus NRRL Y-1556 (AY048158)

73

33

93


Saccharomyces martiniae NRRL Y-409 (AF398481)

50

48

28

23

68

28

69

42

0.01

45

บทท� 5

สรปผลการทดลอง

ความหลากหลายของสปชสของยสตท�พบในดนปาดบแลงของอทยานแหงชาตน,าหนาว จานวน 24 สปชส คอ Asterotremella humicola, Blastobotrys mokoenaii, Candida albicans,

C. boidinii, C. cylindraces, C. diversa, C. fructus, C. maltosa, C. pseudolambica,

C. zeylanoides, Candida sp., Debaryomyces hansenii, D. vanrijiae, Geotrichum fragans,

G. silvicola, Hanseniaspora uvarum, Kazachstania humicola, K. unisporus,

Kluyveromyces sp., Pichia acaciae, P. spartinae, Pichia sp., Tetrapisispora

namnaonensis และ Williopsis saturnus

ความหลากหลายของสปชสของยสตท�พบในดนปาสนสองใบของอทยานแหงชาต น,าหนาว จานวน 24 สปชส คอ Asterotremella humicola , Blastobotrys mokoenaii,

Candida boidinii, C. maltosa, C. silvae, C. tropicalis, Candida sp. I, Candida sp. II, Debaryomyces hansenii, D. vanrijiae, Galactomyces reessii, Geotrichum silvicola,

Issatchenkia siamensis, Lachancea fermentati , Ogataea reessii, Pichia membranifaciens,

P. pijperi, Pichia spartinae, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Tetrapisispora

namnaonensis, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon asahii และ Williopsis saturnus

46

เอกสารอางอง

Bai, F.Y., M. Takashima, J.H. Jia and T. Nakase. 2002. Dioszegia zsoltii sp. nov.,

a new ballistoconidium-formimg yeast species with two varieties. J. Gen. Appl. Microbiol. 48: 17-23.

Bridge, E. and B. Spooner. Soil fungi: diversity and detection. Plant Soil 232: 147-154.

do Carmo-Sousa, L. 1978. Taxonomy and systematics of yeasts, pp. 5-78. In A.H. Rose and J.S. Harrison, eds. The Yeasts Volume1:Biology of Yeasts. Academic Press, New York.

Fell, J.W., T. Boekhout, A. Fonseca, G. Scorzetti and A. Statzell-Tallman. 2000. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

50: 1351-1371. Fonseca, A., J.W. Fell, C.P. Kurtzman and I. Spencer-Martins. 2000. Candida tartarivorans sp. nov., an anamorphic ascomycetous yeast with the capacity to degrade L(+)-and meso-tartaric acid. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 389-394. Goto, S., H. Iwasaki, Y. Okuma, Y. Ito and A. Endo. 1987. New species belonging to the genera Pichia and Candida. J. Gen. Appl. Microbiol. 33: 275-286. Hirai, A., R. Kano, K. Makimura, E.R. Duarte, J.S. Hamdan, M.A. Lachance, H. Yamaguchi and A. Hasegawa. 2004. Malassezia nana sp. nov., a novel lipid- dependent yeast species isolated from animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

54: 623-627. Kimura, M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16: 111-120. Kurtzman, C.P. 2001. Four new Candida species from geographically diverse locations. Antonie van Leeuwenhoek. 79: 353-361. Kurtzman, C.P. and C.J. Robnett. 1997. Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5’ end of the large subunit (26S) ribosomal DNA gene. J. Clin. Microbiol. 35: 1216-1233. Kurtzman, C.P. and C.J. Robnett. 1998. Identification and phylogeny of

47

ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek. 73: 331-371.

Kurtzman, C.P. and J. Sugiyama. 2001. Ascomycetous yeasts and yeastlike taxa, pp. 179-200. In D.J. McLaughlin and P.A. Lemke, eds. The Mycota VII: Systematics and Evolution Part A. Springer-Verlag, Berlin.

Lachance, M.A. 1990. Yeast selection in nature, pp. 21-41. In C.J. Panchal, ed. Yeast Strain Selection. Marcel Dekker, Inc.,New York. Lachance, M.A., J.M. Bowles, W.T. Starmer and S.F. Barker. 1999. Kodamaea kakaduensis and Candida tolerans, two new ascomycetous yeast species from Australian Hibiscus flowers. Can. J. Microbiol. 45: 172-177. Limtong, S., N. Srisuk, W. Yongmanitchai, H. Kawasaki, H. Yurimoto, T. Nakase and N. Kato. 2004. Three new thermotolerant methylotrophic yeasts, Candida krabiensis sp. nov., Candida sithepensis sp. nov., and Pichia siamensis sp. nov., isolated in Thailand. J. Gen. Appl. Microbiol. 50: 119-127. Loung, D.T., M. Takashima, P.V. Ty, N.L. Dung and T. Nakase. 2000. Four new species of Kockovaella isolated from plant leaves collected in Vietnam. J. Gen. Appl. Microbiol. 46: 279-310. McCormack, P.J., H.G. Wildman and P. Jeffries. 1994. Production of antibacterial compounds by phylloplane-inhabiting yeasts and yeastlike fungi. Appl. Environ. Microbiol. 60: 927-931. Middelhoven, W.J. 1997. Identity and biodegradative abilities of yeasts isolated from plants growing in an arid climate. Antonie van Leeuwenhoek. 72: 81-89. Middelhoven, W.J., G. Scorzetti and J.W. Fell. 2001. Trichosporon porosum comb. nov., an anamorphic basidiomycetous yeast inhabiting soil, related to the loubieri/laibachii group of species that assimilate hemicelluloses and phenolic compounds. FEMS Yeast Res. 1: 15-22. Muyzer, G., E.S. de Waal and A.G. Uitterlinden. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-700. Nakase, T. 2000. Expanding world of ballistosporus yeasts: distribution in the phyllosphere, systematics and phylogeny. J. Gen. Appl. Microbiol. 46: 189-216. O’Donnell, K. 1993. Fusarium and its near relatives, pp. 225-233. In D.R. Reynolds and J.W. Taylor, eds. The Fungal Holomorph: Miotic, Meiosis and

48

Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics. CAB International, Wallingford.

Reith, F., H.L. Drake and K. Kusel. 2002. Anaerobic activities of bacteria and fungi in moderately acidic conifer and deciduous leaf litter. FEMS Microbiol. Ecol. 41: 27-35. Scorzetti, G., I. Petrescu, D. Yarrow and J.W. Fell. 2000. Cryptococcus adeliensis sp. nov., a xylanase producing basidiomycetous yeast from Antarctica. Antonie van Leeuwenhoek. 77: 153-157. Shin, K.S., Y.K. Shin, J.H. Yoon and Y.H. Park. 2001. Candida thermophila sp. nov., a novel thermophilic yeast isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 2167-2170. Slavikova, E. and R. Vadkertiova. 2000. The occurrence of yeasts in the forest soils. J. Basic Microbiol. 40: 207-212. Spencer, J.F.T. and D.M. Spencer. 1997. Yeasts in Natuarl and Artificial Habitats. Springer-Verlag, Berlin. Thanh, V.N., D.A. Hai and M.A. Lachance. 2003. Issatchenkia hanoiensis, a new

yeast species isolated from frass of the litchi fruit borer Conopomorpha

cramerella Snellen FEMS Yeast Res. 4: 113-117. Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic

Acid Res. 22: 4673-4680. van der Walt, J.P., T. Nakase, M. Suzuki, M. Takashima and Y. Yamada. 1994. Debaryomyces polymorphus var. africanus, a new variety of ascosporogenous yeast found in South Africa. J. Gen. Appl. Microbiol. 40: 331-337. van Dijken, J.P. and W. Harder. 1974. Optimal conditions for the enrichment and isolation of methanol-assimilating yeasts. J. Gen. Appl. Microbiol. 84: 409-411. Wuczkowski, M. and H. Prillinger. 2004. Molecular identification of yeasts from soils of the alluvial forest national park along the river Danube downstream of Vienna, Austria (“Nationalpark Donauauen”). Microbiol. Res. 159: 263-275. Yarrow, D. 1998. Methods for isolation, maintenance, and identification of yeasts, pp. 77-100. In C.P. Kurtzman and J.W. Fell, eds. The Yeasts: A Taxonomic Study. 4th ed. Elsevier Science, Inc., Amsterdam.

ความหลากหลายทางชีวภาพของ ... · 2017-10-17 · 2...

Documents