1. molekularna osnova procesa apoptoze...1 1. molekularna osnova procesa apoptoze 1.1. apoptoza...
Post on 02-Feb-2021
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
1
1. Molekularna osnova procesa apoptoze
1.1. Apoptoza
Ćelijska smrt, zajedno sa rastom i diferencijacijom, predstavlja suštinski deo
životnog ciklusa ćelije. Dnevno u organizmu čoveka umire do 5% od ukupnog broja
ćelija. Svaka osoba, u toku jedne godine, produkuje i razgradi ćelijsku masu koja je
jednaka težini tela. Homeostatska kontrola broja ćelija ostvaruje se putem dinamičke
ravnoteže između dva suprotna procesa - ćelijske deobe i ćelijske smrti (slika 1).
B R O J Ć E L I J A
Slika 1. Homeostatska kontrola broja ćelija. Tkivna homeostaza je posledica ravnoteže između proliferacije čelija i regulisanog ćelijskog umiranja po tipu apoptoze.
Ulogu ćelijske smrti u razvoju organizma prvi put su opisali pedesetih godina
prošlog veka Glucksmann i Saunders. Prvi dokaz za postojanje dva morfološki različita
tipa ćelijske smrti dao je australijski patolog Džon F. R. Ker (r.1934) 1965. godine (slika
2). Ker i saradnici su histohemijskim metodama ispitivali promene na lizozomima
hepatocita pacova u uslovima ishemije. Tokom tih ispitivanja uočili su postojanje ćelija
koje verovatno umiru, ali se po morfološkim odlikama razlikuju od ćelija koje se nalaze u
procesu nekroze.
Slika 2. Džon F. R. Ker. Australijski patolog koji je sredinom šezdesetih godina prošlog veka prvi opisao ćelije koje umiru procesom apoptoze.
-
2
Ker je novootkrivenu formu ćelijske smrti nazvao apoptoza. Reč apoptoza potiče
iz grčkog jezika (apo + pto) i znači opadanje (lišća sa drveta). Ovim nazivom Ker je želeo
da naglasi da se radi o fiziološkom, odnosno „prirodnom“ načinu umiranja ćelija.
Danas se ćelijska smrt deli na akcedentalnu i regulisanu ćelijsku smrt.
Akcedentalna ćelijska smrt je posledica dejstva ekstremnih fizičkih (visoka
temperatura, pritisak, ...), hemijskih (jaki deterdženti, velike promene pH) i mehaničkih
stimulusa. U tim okolnostima ćelija umire bez “uključenja” specifične molekularne
mašinerije. Regulisana ćelijska smrt je vrsta ćelijskog odgovora na prisustvo
odgovarajućih signala koji dovode do aktiviranja specifičnih molekularnih mašinerija.
Programirana ćelijska smrt je vrsta regulisane ćelijske smrti.
Prema morfološkim karakteristikama razlikuju se tri tipa ćelijske smrti. Ćelijska smrt
tipa I – apoptoza (ćelijsko samoubistvo), ćelijska smrt tipa II – autofagija i ćelijska smrt
tipa III – nekroza (ćelijsko ubistvo).
Apoptoza je aktivan proces genski regulisanog ćelijskog samouništenja i u
većini slučajeva služi homeostatskoj funkciji. To je jedan od najizučavanijih bioloških
fenomena ćelija eukariota. Poslednjih deset godina preko 10.000 naučnih radova
godišnje za temu istraživanja ima proces apoptoze.
Programirana ćelijska smrt po tipu apoptoze opisana je u normalnim fiziološkim
uslovima (tokom procesa embriogeneze, diferencijacije i u procesima razvoja i regulacije
imunskog sistema), kao i u nizu patoloških stanja organizma.
Biološka uloga apoptoze u normalnim fiziološkim uslovima organizma ogleda se u:
1. programiranom smanjenju broja ćelija tokom embriogeneze i metamorfoze - kod
čoveka najpoznatiji primer ćelijskog umiranja po tipu apoptoze je onaj tokom
embrionalnog formiranja prstiju ruku;
2. eliminaciji suvišnih ćelija u održavanju konstantnog broja ćelija - održavanje tkivne
homeostaze;
3. hormon zavisnoj redukciji broja ćelija kod adulta - ćelije endometrijuma tokom
menstrualnog ciklusa;
4. deleciji ćelija u ćelijskim populacijama koje karakteriše visok nivo proliferacije -
epitelne ćelije intestinalnih kripti gastrointestinalnog trakta;
5. u imunskom odgovoru tokom regulisane eliminacije specifičnih ćelijskih populacija,
kao i samih autoreaktivnih ćelija imunskog sistema;
6. uklanjanju transformisanih ili na drugi način oštećenih ćelija.
Rezultati eksperimentalnih istraživanja brojnih laboratorija pokazuju da postoji
čitav niz faktora koji mogu stimulatorno ili inhibitorno uticati na proces apoptoze.
Jonizujuće zračenje, virusna infekcija, toplotni stres i bilo koja druga promena spoljne
sredine koju ćelija prepoznaje kao stres jesu znak da ćelija aktivira program svog
-
3
suicida. Svi prirodni i veštački agensi koji dovode do oštećenja DNK mogu se, takođe,
smatrati induktorima procesa apoptoze (slobodni radikali, npr.). Naravno, postoji i veliki
broj fizioloških aktivatora procesa apoptoze, kao što su faktori rasta, neurotransmiteri,
hormoni, itd. Limfociti T koji su CD8+ imaju sposobnost indukcije procesa apoptoze
drugih ćelija.
Postoji čitav niz bolesti čoveka tokom kojih dolazi do inhibicije procesa apoptoze.
To su, pre svega, maligne bolesti. Inhibicija procesa apoptoze karakteriše i brojna auto-
imunska oboljenja. Istovremeno postoje mnoge bolesti kod kojih dolazi do stimulacije
procesa apoptoze. U prvom redu to su neurološka oboljenja, kao što su Parkinsonova
bolest, Alchajmerova bolest i ALS (amilotrofična lateralna skleroza). Progresivno
umiranje CD4+ limfocita T procesom apoptoze karakteristika je infekcije izazvane
virusom humane imunodeficijencije (HIV).
Na osnovu ovih saznanja, apoptoza je kao genski regulisan proces postala tema
brojnih molekularno-bioloških studija koje za cilj imaju istraživanja patofizioloških
mehanizama nastanka i lečenja bolesti čoveka.
1.1.2. Morfološke karakteristike procesa apoptoze
Apoptoza je asinhrona pojava koja zahvata pojedinačne ćelije tkiva. To je veoma brz
proces koji ćeliju iz jedne ćelijske populacije može „ukloniti“ za manje od 4 sata. U toku
procesa apoptoze dolazi do karakterističnih morfoloških promena koje se ispoljavaju bez
obzira na vrstu tkiva ili okolnosti pod kojim je izazvana. Upravo je ovaj ustaljeni obrazac
morfoloških promena bio presudan za pretpostavku da su u osnovi procesa apoptoze
pre aktivni nego pasivni ćelijski procesi.
Morfološke promene u toku ovog procesa mogu se podeliti na promene rane i
kasne faze procesa apoptoze. Prvi morfološki znak apoptoze predstavlja kondenzacija
hromatina, najčešće u marginalnim oblastima nukleusa. Uporedo sa izmenama
hromatina, u ovoj ranoj „kondenzacijskoj” fazi apoptoze, dolazi i do kondenzacije
citoplazme (slika 3). Kondenzacija nukleusa i citoplazme dovodi do smanjenja
zapremine ćelije, uz povećanje gustine citoplazme, sabijanja intaktnih organela i
razgradnje citoskeleta.
Kasnu fazu apoptoze obeležava segmentacija nukleusa i fragmentacija
citoplazme. Na ćelijskog membrani dolazi do pojave većeg broja citoplazmatskih izvrata.
Ovaj proces Ker je nazvao „pupljenje“ ćelijske membrane (slika 4).
-
4
Slika 3. Elektronsko-mikroskopski snimak limfocita B periferne krvi čoveka. Strelicom obeležena ćelija smanjene zapremine i kondezovanog hromatina koja se nalazi u procesu apoptoze (TEM, 20.000x).
Slika 4. Shematski prikaz morfoloških promena tokom procesa apoptoze. Objašnjenje dato u tekstu.
Završnu fazu procesa apoptoze karakteriše pojava fragmenata apoptotske ćelije
koji su okruženi ćelijskom membranom i nazivaju se apoptotska tela. Apoptotska tela
podležu procesu fagocitoze u kom učestvuju makrofagi, dendritske i druge ćelije
parenhima ili okolne ćelije. To je krajnja faza apoptoze - faza fagocitoze i unutarćelijske
razgradnje (slika 4). Proces fagocitoze apoptotskih tela karakteriše i odsustvo
-
5
zapaljenske reakcije. Apoptotska tela, koja se formiraju u eksperimentalnim uslovima in
vitro, ne bivaju fagocitovana. Ona spontano propadaju, u toku nekoliko sati, procesom
koji se naziva sekundarna nekroza.
Određene morfološke karakteristike procesa nekroze (značajna razgradnja
citoskeleta i „pupljenje“ ćelijske membrane) veoma su slične karakteristikama kasne faze
procesa apoptoze. Identifikacija biohemijskih mehanizama koji prate morfološke
promene apoptoze, pomaže u boljem razlikovanju ove dve vrste ćelijske smrti.
1.1.3. Biohemijske karakteristike procesa apoptoze
Najizučavaniji biohemijski aspekt procesa apoptoze predstavljaju promene na
molekulu DNK. Tokom rane faze procesa apoptoze dolazi do inicijalne fragmentacije
molekula DNK u okviru hromatinskih petlji na fragmente veličine od 50 – 300 kb.
Morfološki uočljivu kondenzaciju hromatina prati fragmentacija molekula DNK na
fragmente od približno 180 bp. Endonukleaza koja je odgovorna za internukleozomalnu
fragmentaciju molekula DNK nije još prečišćena i potpuno opisana. Na agaroznom gelu,
genomska DNK izolovana iz apoptoske ćelije daje karakteristična izgled nalik
merdivinama.
Tokom procesa apoptoze uočena je pojava promene orijentacije molekula
fosfatidilserina (PS) sa unutrašnje na spoljašnju stranu ćelijske membrane. Ova
promena lokacije PS definiše se kao signal „pojedi me“ („eat me“) preko kojeg fagociti i
druge ćelije prepoznaju apoptotsku ćeliju. Detekcija PS na spoljašnjoj strani ćelijske
membrane predstavlja i jednu od metoda detekcije apoptotskih ćelija.
Rezultati eksperimentalnih studija rađenih na nematodi C. elegans dali su dokaze o
ulozi enzima proteaza u procesu apoptoze. Ovo je podstaklo brojne naučnike da svoja
istraživanja usmere u pravcu uloge enzima proteaza i u procesu programirane ćelijske
smrti složenijih organizama, uključujući i čoveka. U skorije vreme učinjen je veliki
napredak u razumevanju molekularnih mehanizama izvršne faze apoptoze u kojoj je
dokazano učešće enzima proteaza, naročito zasebne familije cistein proteaza, kaspaza.
1.1.4. Apoptoza versus Nekroza
Postoje mišljenja da su apoptoza i nekroza „dva lica“ iste vrste ćelijske smrti.
Međutim, i ako obe vrste ćelijske smrti mogu indukovati isti stimulusi, rezultati brojnih
eksperimentalnih istraživanja idu u prilog činjenici da su apoptoza i nekroza dva različita
fenomena. Različiti odgovor ćelija na dejstvo istog stimulusa objašnjava se dužinom i
jačinom stimulusa.
Za razliku od apoptoze, nekroza se definiše kao pasivan proces koji nastaje pod
dejstvom nefizioloških uslova spoljašnje sredine. Ovaj proces je energetski nezavisan,
-
6
dok odvijanje apoptoze zahteva energiju (ATP). Glavna morfološka razlika ova dva
procesa je u tome što kod nekroze dolazi do bubrenja ćelijske membrane i lize ćelije uz
oslobađanje lizozomskih enzima koji indukuju zapaljensku reakciju. Za razliku od
apoptoze, fragmentacija DNK kod nekroze je „nasumična”, pa se na agaroznom gelu
uočavaju fragmenti različite veličine u vidu razmaza. Zbir osnovnih razlika između
apoptoze i nekroze dat je u tabeli 1.
Tabela 1. Apoptoza versus Nekroza
1.2. Molekularna osnova procesa apoptoze
1.2.1. Induktori procesa apoptoze
„Odluka“ ćelije da uđe u proces apoptoze može biti posledica vanćelijskih signala
smrti. To su najčešće specifični ligandi za tzv. receptore smrti (eng. death receptors,
DRs). Receptori smrti pripadaju familiji TNFRs (eng. tumour necrosis factor receptors,
TNFRs).
Vezivanjem odgovarajućih vanćelijskih molekula za receptore smrti, procesom
prenosa signala, moguće je aktiviranje procesa apoptoze. Najpoznatije ligande, koji
vezivanjem za svoje receptore indukuju proces apoptoze, predstavljaju TNF- (ligand za
TNFR 1 receptor) i Fas ligand (za receptor Fas poznat i pod nazivima CD95 i APO-1).
Fas ligand (FasL) je trimer, protein težak 40kDa, koji vezivanjem za receptor Fas
indukuje proces apoptoze. Receptor Fas je transmembranski receptor tipa I težak
45kDa. Prisutan je na ćelijskim membranama različitih tipova ćelija, uključujući i limfocite
T i NK ćelije čoveka. Receptori smrti, kao što je receptor Fas, poseduju citoplazmatske
domene veličine od približno 80 aminokiselinskih ostataka koji se zbog svog značaja u
prenosu signala nazivaju domeni smrti (eng. death domains, DDs) (slika 5).
Vrsta ćelijske smrti Apoptoza Nekroza
Pojava Asinhrona Masivna
Energetski zavisan proces Da Ne
Fragmentacija molekula DNK Uniformna Nasumična
Oštećenja na organelama Ne / Da Da
Apoptotska tela Da Ne
Liza ćelije Ne Da
Zapaljenska reakcija Ne Da
Ožiljak u tkivu Ne Da
-
7
Slika 5. Uloga kompleksa DISC u indukciji procesa apoptoze. Vezivanjem liganda (vanćelijskog signala smrti) za receptor Fas dolazi do konformacione promene koja omogućava interakciju domena smrti receptora sa domenima smrti proteina FADD. Protein FADD interaguje sa kaspazom 8 putem domena DED i na taj način formira se kompleks DISC.
Aktivacija receptora indukuje interakciju receptornih domena smrti sa homolognim
domenima smrti unutarćelijskih proteina koji se nazivaju proteinski adapteri. Tako,
domeni smrti receptora Fas interaguju sa homolognim domenima proteinskog adaptera
koji se naziva protein FADD (eng. Fas-associated death domain, FADD). Proteini
adapteri sadrže i efektorne domene smrti (eng. death effector domains, DEDs).
Domeni DED interaguju sa sebi homolognim efektornim domenima smrti enzima
kaspaze 8.
Kaspaza 8 je prvi enzim koji se tokom prenosa vanćelijskog signala smrti aktivira u
ćeliji i indukuje kaskadnu reakciju aktivacije drugih apoptotskih enzima, kaspaza. Zbog
svoje biološke uloge kaspaza 8 dobila je naziv inicijator kaspaza. Kompleks proteina –
receptor Fas, protein FADD i prokaspaza 8, koji indukuje proces apoptoze, naziva se
kompleks DISC (eng. Death Inducing Signaling Complex, DISC) (slika 5).
-
8
Osim vanćelijskim, proces apoptoze može biti indukovan i unutarćelijskim
signalima smrti. Unutarćelijski signali smrti najčešće se aktiviraju kao odgovor ćelije
na različite oblike stresa. Lekovi i druga toksična jedinjenja, toplotni stres, zračenje,
hipoksija i virusna infekcija najčešći su uzročnici aktivacije unutarćelijskih signala smrti.
Mehanizmi kojima različite vrste stresova aktiviraju biohemijsku mašineriju apoptoze
nisu potpuno poznati. Smatra se da intenzitet i dužina trajanja stresa predstavljaju
ključne faktore u „odluci“ ćelije da aktivira program svog samouništenja.
1.2.1. Efektori procesa apoptoze
Bez obzira na vrstu stimulusa (vanćelijski ili unutarćelijski) koji ga indukuje,
ključni događaj tokom procesa apoptoze predstavlja kaskadna reakcija proteolitičke
aktivacije članova familije enzima cistein proteaza – kaspaza. Kaskadna reakcija
aktivacije kaspaza glavna je karakteristika tzv. egzekutorne ili izvršne faze procesa
apoptoze. Kaspaze su aspartat-specifične cistein proteaze. U ćelijama čoveka otkrivena
je familija enzima kaspaza od 14 članova. Prema svojoj biološkoj ulozi u ćeliji one se deli
u dve potfamilije: potfamilija inflamatornih kaspaza (kaspaze 13, 5, 4, 1) i potfamilija
apoptotskih kaspaza (kaspaze 7, 3, 6, 8, 10, 2, 9).
Sve kaspaze sintetišu se u formi proenzima (zimogena) koji se sastoji od tri
domena: a) prodomena različite dužine na N-kraju proteina; b) velike subjedinice od 20
kDa (p20); i c) male subjedinice od 10 kDa (p10) na C–kraju proteina.
Aktiviraju se proteolitičkim mehanizmom koji razdvaja (na mestu aspartata)
najpre veću (p20) od manje (p10) subjedinice, a potom u formiranom dimeru p20/p10
dolazi do razdvajanja velike subjedinice (p20) od prodomena. Poslednja faza aktivacije
kaspaza predstavlja povezivanje dva heterodimera u aktivni tetramer, koji sa dva aktivna
mesta svoju proteolitičku aktivnost ispoljava na većem broju proteina (slika 6).
Slika 6. Shematski prikaz aktivacije kaspaza. Kaspaze se aktiviraju proteolitičkim raskidanjem velike (p20) od male subjedinice (p10). U formiranom dimeru p20/p10 dolazi do razdvajanja prodomena od velike subjedinice.
Kaspaze svojom enzimskom aktivnošću vrše inaktivaciju inhibitora apoptoze i
razgradnju struktura nukleusnog matriksa, nukleusne lamine i citoskeleta. Istovremeno,
-
9
proteoliza predstavlja jedan od mogućih mehanizama aktivacije endonukleaza tokom
procesa apoptoze. Dezintegracija hromatina, promene na citoskletu i „pupljenje” ćelijske
membrane su morfološki uočljive manifestacije biohemijskih dešavanja nastalih
dejstvom aktiviranih kaspaza.
Aktivacija kaspaza predstavlja sigurni znak da je ćelija krenula putem suicida, i
taj se suicid, odnosno njegova izvršna faza, nikakvim mehanizmima ne može sprečiti.
U ćelijama sisara dokazano je i prisustvo prirodnih inhibitora kaspaza koji se
nazivaju proteini inhibitori apoptoze (eng. inhibitors of apoptosis proteins, IAPs). Do
sada, otkriveno je sedam članova ove familije proteina. U okolnostima kada ne postoji
apoptotski stimulus, inhibitori kaspaza uspešno onemogućavaju njihovu proteolitičku
aktivaciju i konverziju iz forme proenzima u enzim.
Poslednjih godina pokazano je da unutarćelijski signali mogu indukovati proces
apoptoze koji je nezavisan od aktiviranja enzima kaspaza. U nekim ćelijama, proces
apoptoze indukuje se aktivacijom endonukleaze G i faktora AIF (eng. apoptosis-inducing
factor, AIF). Ova dva proteina primarno su lokalizovana u mitohondrijama. Nakon
dejstva unutarćelijskog signala, oni se iz mitohondrija transportuju u nukleus.
Endonukleaza G vrši fragmentaciju molekula DNK.
1.3. Regulacija procesa apoptoze
Brojni vanćelijski i unutarćelijski signali (induktori apoptoze) mogu indukovati
proces apoptoze, u čijoj izvršnoj fazi dolazi do aktivacije kaspaza (efektori apoptoze).
Rezultati eksperimentalnih istraživanja na raznim model sistemima su pokazali da je
proces apoptoze regulisan značajnim brojem unutarćelijskih regulatora (modulatori
apoptoze).
Proteini familije Bcl 2, protein p53, proteinski produkti određenih onkogena i gena
regulatora ćelijskog ciklusa, zatim citohrom C, razni transkripcioni regulatori, određene
klase fosfataza i kinaza predstavljaju samo neke od poznatih modulatora ovog procesa.
1.3.1. Uloga proteina familije Bcl 2 u regulaciji procesa apoptoze
Proteini familije Bcl 2 ključni su unutarćelijski modulatori (regulatori) procesa
apoptoze. Prvootkriveni član familije Bcl 2 bio je protein Bcl 2 (eng. B-cell
leukemia/lymphoma 2, Bcl 2). Gen je lokalizovan na dugom kraku hromozoma 18
(q21.3). Otkriven je 1984. godine tokom ispitivanja akutne B leukemijske ćelijske linije sa
detektovanom hromozomskom translokacijom t(14;18). Istraživanja na uzorcima
periferne krvi bolesnika sa kliničkom dijagnozom folikularnog limfoma pokazala su da se
t(14;18) aktivira proto-onkogen Bcl 2. Ovom translokacijom, gen BCL 2 „prebacuje” se u
-
10
blizinu lokusa teškog lanca imunoglobulina, što dovodi do visokog nivoa njegove
ekspresije.
Bcl 2 je unutarćelijski protein težine 26 kDa, lokalizovan u membranama
mitohondrija, endoplazmatičnog retikuluma i u spoljašnjoj membrani nukleusnog ovoja.
Nakon proteina Bcl 2, otkrivena je čitava familija homolognih proteina od kojih neki imaju
stimulatorni, a drugi inhibitorni efekat na proces apoptoze. Kao ko-imunoprecipitat
proteina Bcl 2, prvo otkriveni pro-apoptotski homolog bio je protein Bax (eng. Bcl 2 -
associated X, Bax). To je unutarćelijski protein težine 21 kDa pretežno lociran u
citoplazmi. U ćelijama čoveka otkriveno je preko 20 članova familije proteina Bcl 2.
Svi članovi familije proteina Bcl 2 sadrže najmanje jedan od četiri visoko
konzervirana Bcl 2 homologa domena (domeni BH). Šest anti-apoptotskih članova
familije Bcl 2 (Bcl 2, Bcl–Xl, Bcl-W, MCL1, A1 i Bcl-B) sadrže sva četiri homologna
domena (BH1-BH4). Na osnovu broja homolognih domena koje sadrže, pro-apoptotski
proteini su podeljeni u dve potfamilije (slika 7).
Slika 7. Proteini familije Bcl 2. Anti-apoptotski članovi familije Bcl 2 imaju sva četiri domena BH. Po broju domena BH, pro-apoptotski članovi ove familije dele se u dve potfamilije. Potfamilju protein Bid čine proteini koji sadrže samo domen BH3.
Proteini potfamilije od tri člana (Bax, Bak i Box) sadrže tri homologna domena i
nazivaju se potfamilija proteina Bax. Ostali pro-apoptotski proteini (potfamilija
proteina Bid) sadrže samo jedan domen BH. To je domen BH3 po kome su i dobili
naziv “BH3 – only proteins”. Većina članova familije proteina Bcl 2 sadrži i domene koji
omogućavaju njihovo vezivanje za različite membrane ćelija (domeni TM). Bcl 2
homologni domeni odgovorni su za procese homodimerizacije i heterodimerizacije
proteina članova familije Bcl 2. Zahvaljujući ovim domenima BH, heterodimere formiraju i
proteini sa suprotnim dejstvom na proces apoptoze.
-
11
Tokom indukcije procesa apoptoze, pod dejstvom apoptotskog stimulusa
aktivirani proteini Bax formiraju dimere. Homodimeri proteina Bax formiraju kanale na
spoljašnjoj membrani mitohondrija. Istu sposobnost ima i još jedan pro-apoptotski
protein familije Bcl 2. To je protein Bak (eng. BCL‑2 antagonist/killer, Bak)(slika 8).
Slika 8. Uloga mitohondrija u procesu apoptoze. Pro-apoptotski članovi familije Bcl 2 (protein Bax i Bak) formiraju kanale na spoljašnjim membranama kroz koje citohrom C napušta mitohondrije. Protein Bcl 2 može formirati heterodimere sa proteinima Bax ili Bak i na taj način blokira formiranje njihovih homodimera, odnosno kanala, na spoljašnjim membranama mitohondrija.
Putem ovih kanala molekuli citohroma C, koji je jedan od ključnih aktivatora
izvršne faze procesa apoptoze, napuštaju mitohondrije. U slučajevima kada je
predominantno prisustvo proteina Bcl 2 u ćeliji, vezivanjem za protein Bax, ovi molekuli
inhibiraju formiranje mitohondrijalnih membranskih kanala i oslobađanje citohroma C. Na
osnovu ovih saznanja većina autora kao glavnu biološku ulogu proteina Bcl 2 u inhibiciji
procesa apoptoze smatra njegovu sposobnost vezivanja za protein Bax i
heterodimerizacionu neutralizaciju njegovog pro-apoptotskog dejstva.
Zbog izuzetnog značaja, odnos pro-apoptotskih i anti-apoptotskih homodimera i
heterodimera smatra se vrstom autonomnog „ćelijskog reostata“ koji opredeljuje vrstu
-
12
ćelijskog odgovora na dejstvo apoptotskog stimulusa. Međutim, postoje i suprotna
mišljenja. Na osnovu rezultata eksperimentalnog rada na transgenim miševima,
Knudson i Korsmeyer zaključuju da proteini Bcl 2 i Bax mogu i na funkcionalno
nezavisan način da regulišu proces apoptoze.
Pojedini autori smatraju da ključnu ulogu u regulaciji procesa apoptoze ćelija
sisara ima protein Bcl-X. Alternativnom obradom primarnog transkripta gena BCL-X
moguće je dobiti 2 različita molekula iRNK, odnosno dva proteina Bcl-X: duži (Bcl-Xl) i
kraći (Bcl-Xs). Protein Bcl-Xl je strukturno i funkcionalno sličan proteinu Bcl 2. Drugi
protein Bcl-Xs u heterodimernoj kombinaciji sa proteinom Bcl 2 funkcioniše kao njegov
dominantni inhibitor.
Oslobađanje citohroma C je posledica aktivacije modulatora apoptoze dejstvom
unutarćelijskih signala smrti. Citohrom C je zbog svog pozitivnog dejstva na aktivaciju
kaspaze 3 dobio naziv Apaf 2 (eng. apoptotic protease activating factor 2, Apaf 2). U
prisustvu adapterskog molekula - proteina Apaf 1, citohroma C i adenozin-trifosfata
(ATP) dolazi do proteolitičke aktivacije prokaspaze 9 (Apaf 3). Protein-protein
interakciju Apaf 1 i Apaf 3 omogućuju njihove homologne sekvence nazvane CARD
(eng. caspase recruitment domains, CARDs) (slika 9). U odsustvu citohroma C ova
interakcija je blokirana zahvaljujući strukturnoj konformaciji molekula Apaf 1.
Slika 9. Apoptozom. Citohorom C vezivanjem za protein Apaf 1 vrši njegovu konformacionu protenu. Ova promena omogućava protein-protein interakciju ovog adapterskog molekula sa enzimom prokaspazom 9. Na ovaj način formira se apoptozom u kome dolazi do proteolitičke aktivacije enzima kaspaze 9.
-
13
Vezivanjem citohroma C za molekul Apaf 1 dolazi do njegove konformacione
promene koja domene CARD čini dostupne za interakciju sa homolognim domenima
prokaspaze 9. Proteinski kompleks koga čine proteini Apaf 1, Apaf 2 i citohrom C naziva
se apoptozom. Rezultat ove interakcije je proteolitička aktivacija prokaspaze 9.
Aktivirana kaspaza 9 u kaskadi apoptotskih događaja aktivira kaspazu 3, što predstavlja
početak ireverzibilne, izvršne faze procesa apoptoze. Kontrolisano oslobađanje
citohroma C iz mitohondrija u citosol je neophodan uslov za otpočinjanje izvršne faze
procesa apoptoze. Upravo zbog toga mitohondrije se nazivaju ćelijskim regulatorom
života i smrti.
Proteini potfamilije proteina Bid koji sadrže samo domen BH3 na dva načina
ostvaruju svoj pro-apoptotski efekat. Proteini Bad (eng. BCL‑2 antagonist of cell death,
Bad) i NOXA inaktiviraju anti-apoptotske članove svoje familije procesom
heterodimerizacije. Drugi članovi ove potfamilije (Bid, Bim i PUMA) direktno aktiviraju
pro-apoptotske proteine Bax i Bak koji imaju sposobnost formiranja kanala na
spoljašnjim membranama mitohondrija (slika 10).
Slika 10. Uloga pro-apoptotskih članova familije proteina Bcl 2 u procesu apoptoze. Proteini Bax i Bak formiraju kanale na membranama mitohondrija. Proteini Bid, Bim i PUMA direktno aktiviraju proteine Bax i Bak dok proteini Bad, Bcl-Xs i NOXA inaktiviraju anti-apoptoske članove familije (Bcl 2, Bcl-Xl i MCL-1).
-
14
1.3.2. Uloga proteina p53 u regulaciji procesa apoptoze
Protein p53 otkriven je 1979. godine. Inicijalno je okarakterisan kao ko-
imunoprecipitat velikog T antigena u SV 40-transformisanim ćelijama. Čitavih deset
godina verovalo se da je gen TP53 onkogen. Godine 1989. Bert Vogelstein i saradnici,
na osnovu istraživanja mutacija gena TP53, zaključuju da je protein p53 tumor-
supresorni protein. Od tada započinju intenzivna izučavanja ovog gena i njegovog
proteinskog produkta. Na osnovu broja naučnih studija, časopis Science 1993. godine
protein p53 proglašava za „Molekul godine” („Molecule of the Year“). Gen TP53
lokalizovan je na 20 kb dugoj sekvenci čovečijeg hromozoma 17 (17p13.1) kod čoveka.
Gen TP53 sastoji se od 11 egzona koji se prepisuju u iRNK dugu 1,8 kb. Prepisuje
se sa tri promotora. Pored uzvodnog promotora, poseduje promotore i u intronu 1 i
intronu 4. Proteinski produkt ovog gena od 375 aminokiselina ima molekulsku masu od
oko 53 kDa. U okviru proteinske sekvence razlikuje se nekoliko bitnih domena (slika
11):
na amino kraju (1-44 ak) nalazi se transaktivacioni domen odgovoran za
aktivaciju transkripcije ciljnih gena;
prolin-bogat domen (58-101ak) sa funkcijom u odgovoru proteina p53 na
oštećenja DNK procesom apoptoze;
DNK-vezujući domen (102-292ak) odgovoran za interakciju ovog proteina sa
molekulom DNK (ovaj domen najčešće je pogođen mutacijama); i
oligodimerizacioni domen (325-356 ak) odgovoran za vezivanje sa drugim
molekulima p53.
Slika 11. Shematski prikaz peptidnog lanca p53. Objašnjenje dato u tekstu.
Poluživot ovog proteina je kratak i iznosi od 5 do 20 minuta, a svoju biološku
ulogu ispoljava kao regulatorni protein transkripcije (slika 12). Metodom hromatin
imunoprecipitacije do sada je identifikovano preko 540 sekvenci u genomu čoveka koje
sadrže potencijalna vezujuća mesta za protein p53.
-
15
Slika 12. Protein p53 je regulatorni protein transkripcije. Protein p53 je transkripcioni represor gena čiji su proteinski produkti odgovorni za normalnu propagaciju ćelije kroz faze ćelijskog ciklusa. Istovremeno, on je i transkripcioni aktivator gena čiji su proteinski produkti uključeni kako u procese zaustavljanja ćelijskog ciklusa u fazi G1, tako i u indukciju procesa apoptoze.
U ćelijama se razgradnja proteina p53 ostvaruje posredstvom ubikvitin ligaze E3
koja je nazvana protein Mdm2 (eng. murine double minute 2, Mdm2). U uslovima
dejstva stresa na ćeliju dolazi do raskidanja heterodimera proteina p53 i Mdm2 i
blokiranja procesa razgradnje. Posttranslaciona modifikacija proteina p53 fosforilacijom
je odgovorna za stabilizaciju molekula i produžetak njegovog poluživota na nekoliko sati.
Kao posledica nagomilavanja proteina p53, u zavisnosti od jačine stresa, dolazi do
zaustavljanja ćelijskog ciklusa ili indukcije procesa apoptoze.
Zaustavljanje ćelijskog ciklusa u fazi G1 (tzv. „G1 zastoj”) za ćeliju predstavlja
„time out“ koji koriste reper mehanizmi da isprave oštećenja u molekulu DNK. U
neizmenjenim ćelijama tkiva, ovo vreme je dovoljno za ispravljanje većeg dela
oštećenja, i posle G1 zastoja ćelija nastavlja svoj ćelijski ciklus. Ukoliko je broj oštećenja
na molekulu DNK veliki, protein p53 indukuje proces apoptoze. Kada je protein p53 na
bilo koji način inaktiviran (najčešće mutacijama), ne dolazi do indukcije procesa
apoptoze zavisnog od proteina p53. To je čest slučaj u neoplastično transformisanim
ćelijama, što za rezultat ima agresivniji tumorski rast.
Uloga proteina p53 u indukciji procesa apoptoze je dvojaka. Kao aktivator
transkripcije učestvuje u regulaciji ekspresije pro-apototskih gena (PUMA, NOXA, BAX,
APAF 1). Pored toga, direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje
dimera proteina Bax (slika 13).
-
16
Slika 13. Uloga proteina p53 u indukciji procesa apoptoze. Kao transkripcioni aktivator indukuje ekspresiju pro-apoptotskih gena, a direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje homodimera proteina Bax.
-
17
Ključni koncepti
Danas se ćelijska smrt deli na akcedentalnu i regulisanu ćelijsku smrt.
Programirana ćelijska smrt je vrsta regulisane ćelijske smrti. Prema morfološkim
karakteristikama razlikuju se tri tipa ćelijske smrti. Ćelijska smrt tipa I – apoptoza
(ćelijsko samoubistvo), ćelijska smrt tipa II – autofagija i ćelijska smrt tipa III –
nekroza (ćelijsko ubistvo).
Apoptoza je aktivan proces genski regulisanog ćelijskog samouništenja i u većini
slučajeva služi homeostatskoj funkciji. Programirana ćelijska smrt po tipu
apoptoze opisana je u normalnim fiziološkim uslovima (tokom procesa
embriogeneze, diferencijacije i u procesima razvoja i regulacije imunskog
sistema), kao i u nizu patoloških stanja organizma.
Morfološke promene u toku ovog procesa mogu se podeliti na promene rane i
kasne faze procesa apoptoze. Kondenzacija nukleusa i citoplazme dovodi do
smanjenja zapremine ćelije, uz povećanje gustine citoplazme, sabijanja intaktnih
organela i razgradnje citoskeleta. Kasnu fazu apoptoze obeležava segmentacija
nukleusa i fragmentacija citoplazme. Završnu fazu procesa apoptoze karakteriše
pojava fragmenata apoptotske ćelije koji su okruženi ćelijskom membranom i
nazivaju se apoptotska tela. Apoptotska tela podležu procesu fagocitoze.
Najizučavaniji biohemijski aspekt procesa apoptoze predstavljaju promene na
molekulu DNK. Tokom rane faze procesa apoptoze dolazi do inicijalne
fragmentacije molekula DNK u okviru hromatinskih petlji na fragmente veličine od
50 – 300 kb. Morfološki uočljivu kondenzaciju hromatina prati fragmentacija
molekula DNK na fragmente od približno 180 bp.
„Odluka“ ćelije da uđe u proces apoptoze može biti posledica vanćelijskih signala
smrti. To su najčešće specifični ligandi za tzv. receptore smrti. Kaspaza 8 je prvi
enzim koji se tokom prenosa vanćelijskog signala smrti aktivira u ćeliji i indukuje
kaskadnu reakciju aktivacije drugih apoptotskih enzima, kaspaza. Zbog svoje
biološke uloge kaspaza 8 dobila je naziv inicijator kaspaza. Kompleks proteina –
receptora, protein adaptera i prokaspaza 8, koji indukuje proces apoptoze,
naziva se kompleks DISC.
Osim vanćelijskim, proces apoptoze može biti indukovan i unutarćelijskim
signalima smrti. Unutarćelijski signali smrti najčešće se aktiviraju kao odgovor
ćelije na različite oblike stresa.
-
18
Bez obzira na vrstu stimulusa (vanćelijski ili unutarćelijski) koji ga indukuje,
ključni događaj tokom procesa apoptoze predstavlja kaskadna reakcija
proteolitičke aktivacije članova familije enzima cistein proteaza – kaspaza.
Kaspaze svojom enzimskom aktivnošću vrše inaktivaciju inhibitora apoptoze i
razgradnju struktura nukleusnog matriksa, nukleusne lamine i citoskeleta.
Brojni vanćelijski i unutarćelijski signali (induktori apoptoze) mogu indukovati
proces apoptoze, u čijoj izvršnoj fazi dolazi do aktivacije kaspaza (efektori
apoptoze). Rezultati eksperimentalnih istraživanja na raznim model sistemima su
pokazali da je proces apoptoze regulisan značajnim brojem unutarćelijskih
regulatora (modulatori apoptoze).
Proteini familije Bcl 2 ključni su unutarćelijski modulatori (regulatori) procesa
apoptoze. Svi članovi familije proteina Bcl 2 sadrže najmanje jedan od četiri
visoko konzervirana Bcl 2 homologa domena (domeni BH). Bcl 2 homologni
domeni odgovorni su za procese homodimerizacije i heterodimerizacije proteina
članova familije Bcl 2. Zahvaljujući ovim domenima BH, heterodimere formiraju i
proteini sa suprotnim dejstvom na proces apoptoze. Pro-apoptotski članovi
familije Bcl 2 (protein Bax i Bak) formiraju kanale na spoljašnjim membranama
kroz koje citohrom C napušta mitohondrije. Protein Bcl 2 može formirati
heterodimere sa proteinima Bax ili Bak i na taj način blokira formiranje njihovih
homodimera, odnosno kanala, na spoljašnjim membranama mitohondrija. Zbog
izuzetnog značaja, odnos pro-apoptotskih i anti-apoptotskih homodimera i
heterodimera smatra se vrstom autonomnog „ćelijskog reostata“ koji opredeljuje
vrstu ćelijskog odgovora na dejstvo apoptotskog stimulusa.
Citohorom C vezivanjem za protein Apaf 1 vrši njegovu konformacionu protenu.
Ova promena omogućava protein-protein interakciju ovog adapterskog molekula
sa enzimom prokaspazom 9. Na ovaj način formira se apoptozom u kome dolazi
do proteolitičke aktivacije enzima kaspaze 9.
Protein p53 je transkripcioni represor gena čiji su proteinski produkti odgovorni
za normalnu propagaciju ćelije kroz faze ćelijskog ciklusa. Istovremeno, on je i
transkripcioni aktivator gena čiji su proteinski produkti uključeni kako u procese
zaustavljanja ćelijskog ciklusa u fazi G1, tako i u indukciju procesa apoptoze.
Kao transkripcioni aktivator indukuje ekspresiju pro-apoptotskih gena, a
direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje homodimera
proteina Bax.
-
19
Pitanja
1. Šta je apoptoza i navedi njenu ulogu u normalnim fiziološkim stanjima organizma?
2. Navedi najznačajnije morfološke karakteristike procesa apoptoze.
3. Navedi najznačajnije biohemijske karakteristike procesa apoptoze.
4. Koje su osnovne razlike između procesa apoptoze i nekroze ?
5. Objasni dešavanja u ćeliji u kojoj je proces apoptoze indukovan vanćelijskim signalima.
6. Objasni dešavanja u ćeliji u kojoj je proces apoptoze indukovan unutarćelijskim
signalima.
7. Koja je uloga Bcl 2 familije proteina u procesu apoptoze ?
8. Koja je uloga proteina p53 u procesu apoptoze ?
9. Šta su kasapaze i koja je njihova uloga u ćeliji ?
10. Objasni ulogu mitohondrija u procesu apoptoze.
top related