4. procesamiento de las muestras para ihq

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA

ESTUDIO INMUNOHISTOQUIMICO

Prof. T.M. Laura Ochoa M.

Objetivos.

• Conservar la inmunoreactividad de células y tejidos.

• Conservar la estructura secundaria y terciaria de las proteínas.

• Conservar la localización de los antígenos.

• Preservar la morfología.

• No provocar interferencia con los inmunoreactivos.

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La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) se deben a la formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces H, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e

hidrófobas)Se establecen múltiples interacciones

Determinantes antigénicos.

• Corresponde al área específica dentro del antígenos que se une al paratopo.

• Pueden ser LINEALES en cuyo caso su formación esta dada por una secuencia aminoacídica o CONFORMACIONALESdada por la estructura secundaria o terciaria de la proteína.

DETERMINANTES ANTIGÉNICOS

Tipos de Muestras para estudioIHQ.

• Células de cultivo.

• Células en suspensión.

• Frotis citológicos

• Frotis sanguíneos.

• Cortes de criostato.

• Cortes en parafina

• Cortes de ultramicrótomo.

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Procesamiento de los líquidos.

• Procesar inmediatamente

• Centrifugar durante 5 minutos a 2.500 rpm

• Con el pellet confeccionar varios frotis ( 3-5), secar parcialmente

• Fijadores: etanol 95°, acetona al 80% en PBS mas formalina 1%, Cytospray.

• Lavar en PBS

• ICQ

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CITOLOGÍAS

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Frotis previamente teñidos.

• Marcar con lápiz diamante al dorso del portaobjeto las zonas sospechosas de mejor celularidad.

• Despegar el cubreobjeto.

• Retirar todo el medio de montaje en xilol

• Decolorar con alcohol ácido

• Hidratar hasta el agua destilada

• ICQ

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Cortes por congelación.

• Transporte al laboratorio

– Suero fisiológico (transporte inmediato)

– Hielo / Medio de transporte (horas)

– Congelado en tanque de nitrógeno líquido (días)

• Mejor preservación antigénicas que cortes en parafina.

• Morfología deficiente.

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Cortes por congelación.

• Congelación: debe ser realizada rápidamente para evitar la formación de cristales de hielo.

• Fijación: Cualquier fijador. Acetona: buena conservación de antígenos de membrana.

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Cortes en Criostato.

• CORTE

– De 6 – 10 micrones o lo más delgado que sea posible

– Montaje sobre portaobjetos pretratados.

– Evitar melladuras e irregularidades.

– Fijar en acetona fría por 15 minutos y secar.

• IHQ ó guardar cortes congelados a -70°C

Cortes por congelación.

VENTAJAS

• Excelente conservación de reactividad antigénica.

DESVENTAJAS

• Morfología deficiente

• Difícil almacenamiento de tejidos y de inmunotinciones

• Dificultades con enzimas endógenas

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Procesamiento de cortes en parafina para IHQ.

• FIJACIÓN

• IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN

• CORTE Y MONTAJE

ETAPAS A CONSIDERAR

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Objetivos de la fijación.

• Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y nucleasas

• Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.

• Preparar al tejido para los procedimientos posteriores

• Anti-microbiano

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Obtención de la muestra.

• Muestras frescas deben ser cortadas en

un tamaño aproximado de 2cm2 x 4 mm

de grosor.

• Fijadas a la brevedad

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Fijador ideal para IHQ.

• No induzca cambios conformacionales en el antígeno (epitopo)

• No enmascare determinantes antigénicos

• No provoque difusión, extracción o desplazamiento de antígenos.

• Permita la penetración de los inmunoreactivos

• Buena morfología

• Baja toxicidad, estabilidad en su almacenamiento, barato.

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Fijación con Formaldehido.

• Más popular de los fijadores

• Es un gas y su presentación comercial es en solución acuosa 37 - 40%

• La fijación involucra una interacción con proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.

• En algunos casos se produce un fenómeno de “enmascaramiento” progresivo de epitopos.

• Frecuentemente requiere el uso técnicas de recuperación de inmunoreactividad.

FORMALDEHÍDO HIDRATO DE METILENO

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FORMALDEHÍDO

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Especies presentes en el

Formaldehido.

• Rompimiento de polímeros a unidades de

hidrato de metileno.

• Proceso dura un par de días si se prepara

en agua. Y es instantáneo cuando se

prepara en buffer a pH fisiológico.

Componentes de la solución de

formaldehido.

• METANOL 10% :

Disminuye la velocidad de la

polimerización del hidrato de metileno.

Promueve la precipitación del para

formaldehído.

En la reacción entre dos moléculas de

formaldehído, una se reduce a metanol y

la otra se oxida a ácido fórmico.

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FORMALINA al 4%

COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)

• Hidrato de metileno Compuesto activo

• Metanol 1%

• Ácido fórmico Compuestos

• Paraformaldehído no deseados

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FORMALINA

Equilibrio de la solución

Tiempo/ pH

Compuesto Compuestos

activo no deseados

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FIJACIÓN CON FORMALDEHIDOPenetración

Hidrato de Reacción

Metileno con grupos

NH2

Formación de

Puentes Reacción

metilénicos entre NH2

metilados

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PROTEÍNA NATIVA

EPITOPOS

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PROTEINA FIJADA CON

FORMALDEHIDO

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Fijación con Formaldehido.• Solución de fijación: Se debe utilizar en

sus condiciones mas estables

– Neutralizada con carbonato de calcio

– Tamponada en PBS pH 7,2 – 7,4

• Tiempo de fijación

– Desde que la muestra es extraída hasta que es fijada.

– Muestra en el fijador.

• Ojo con los congelamientos previos.

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Condiciones de fijación con Formaldehido

• Temperatura / Tiempo de fijación:

– T. A. 6 – 24 hrs

– 4° C 24 – 72 hrs

• Tamaño de la muestra:

– 10 x 10 x 4 mm

• Volumen de fijador:

– 20 – 30 veces el volumen de la muestra

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Fijación con Formaldehido.

EN MUESTRAS FIJADAS EN FORMALDEHIDO EN

CONDICIONES ÓPTIMAS SE PUEDEN OBTENER EXCELENTES

RESULTADOS DE INMUNOTINCIÓN PARA LA

MAYORÍA DE LOS ANTÍGENOS

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Fijación con Ac. Pícrico.

• Fijador de tipo coagulante, poco

penetrante.

• Se emplea en mezclas fijadoras. La más

usada es la mezcla de Bouin.

• Provee buena morfología.

• Su uso se recomienda para estudio de

inmunoglobulinas, filamentos intermedio y

hormonas.

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Fijación con Bicloruro de Mercurio.

• Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc.

• Aditivo y coagulante

• Excelente morfología

• B5 recomendado especialmente para la fijación de ganglios linfáticos.

• Buena conservación de antígenos intracitoplasmático, pero no de membrana.

• Provee al tejido buena permeabilidad para los inmunoreactivos.

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Fijación con etanol.

• Poco penetrante

• Fijador coagulante

• Buena penetración de inmunoreactivos

• Puede inducir a cambios conformacionales

• Endurece los tejidos

• Morfología regular

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FIJACIÓN CON ACETONA

• Poco penetrante

• Fijador coagulante

• Principalmente indicado para

frotis sanguíneos y cortes en

congelación.

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Deshidratación, aclaramiento e

impregnación. • Agente aclarante en

buen estado

(sin agua)

• Temperatura de las

parafinas de

impregnación entre

56 - 62° C.

• Tiempo de

impregnación entre

30 – 45 minutos en

cada parafina.Prof. T.M. Laura Ochoa M.

PROCESADOR

DE TEJIDOS

AL VACIO

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Corte y Montaje.

• Grosor recomendado:4 –5

• Montaje en portaobjetos o cubreobjetos

• Evitar cortes con melladuras, irregularidades, gruesos o desgarrados

• Evitar tocar el agua del baño con las manos con crema

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Corte y Montaje

• Medios adhesivos:

– ALBUMINA DE MAYER

– COLA FRÍA 1%

– POLI-L-LISINA ACUOSA

– 3,AMINOPROPYLTRIETHOXI-SYLANE.

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Corte y Montaje.

• Realizar los cortes la misma semana que

se realizará técnica IHQ.

• Mantener guardados en oscuridad y en

refrigerador. Libres del polvo.

• Mantener bloques de parafina

almacenados en lugares frescos.

• La limpieza de los portaobjetos previa a la

silanización, deber ser sin detergentes.

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Montaje.

• Medios hidrófobos.

• Medios hidrófilos.

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Desparafinación e Hidratación.

• Asegurar remover

total de la parafina,

con agentes de

desparafinación de

buena calidad.

• Cambiar con

regularidad los

reactivos

• Hidratación gradual.

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LA ELECCIÓN DEL MÉTODO DE

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DEPENDE DEL

PROPÓSITO DEL ESTUDIO

INMUNOHISTOQUÍMICO.

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