aula7-proteinas2
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ANÁLISES BROMATOLÓGICAS
Profa. Ionara F. R. Vieira
PROTEÍNAS PROTEÍNAS
EM ALIMENTOSEM ALIMENTOS
PROTEÍNAS
DEFINIÇÃO
Substâncias orgânicas complexas (C,
H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn).
Polímero de alto peso molecular
Unidade básica: aminoácidos
IMPORTÂNCIA• nutricional• propriedades
sensoriais2
Unidades estruturais básicas das proteínas
PROTEÍNASAMINOÁCIDOS (aa)
3
Cada aminoácido tem uma cadeia
lateral (R) característica, que
influencia suas propriedades físico-
químicas.
Diferenças: tamanho, estrutura e
carga elétrica.
Arranjo tetraédrico atividade ótica
isômero L e D
Só os aminoácidos L são constituintes
de proteínas naturais.
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
4
alanina
valina
leucina
triptofano
fenilalanina
metionina
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:
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ácido aspártico
histidinaasparagina glicina
serina ácido glutâmico
tirosina
AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)
Polares ou hidrofílicos, Polares ou hidrofílicos, exemplos:exemplos:
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PROTEÍNASPROTEÍNAS
7
PROTEÍNASPROTEÍNAS
São polímeros de aminoácidos.
Vinte tipos de aminoácidos ocorrem
naturalmente nas proteínas.
Diferem com o tipo, número e seqüência
de aminoácidos na cadeia polimérica,
conformação molecular tridimensional.
Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de
O, 14-18 % de N14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de
S.
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ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
ESTRUTURA PRIMÁRIASeqüência linear de aminoácidos
Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula
Varia em 3 aspectos: número, seqüência e natureza dos AA
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA SECUNDÁRIA
Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica
Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares
Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA TERCIÁRIA
Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas
Estabilização: Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da
molécula
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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ESTRUTURA QUATERNÁRIA
Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes
Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.
Aminoácidos essências (lisina, triptofano,
metionina, leucina, isoleucina e valina) não
podem ser sintetizados pelo organismo humano.
Proteínas alimentares são digeríveis, não
tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas
moleculares, atributos nutricionais e
propriedades físico-químicas.
PROTEÍNAS NO ALIMENTOPROTEÍNAS NO ALIMENTO
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Responsáveis por compostos aromáticos
e substâncias coloridas formadas por
reações térmicas ou enzimáticas
ocorridas durante obtenção, preparação e
armazenamento dos alimentos.
Componentes estruturais de muitos
alimentos naturais, freqüentemente
determinam sua textura, por exemplo,
tenderness de produtos de carne e peixe.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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Isoladas são usadas nos alimentos como
ingredientes devidos a suas propriedades
funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir
aparência, textura ou estabilidade
desejáveis ao produto: agentes gelificantes,
emulsionantes, espumantes e espessantes.
Alergias e intolerâncias – proteínas de leite,
ovos, castanhas, etc.; celíacos,
fenilcetunúricos.
PROTEÍNASPROTEÍNAS
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IMPORTÂNCIA
Conhecer o valor nutritivoDeterminação da composição centesimal
de um alimento e análise para rotulagemEstimar rendimento industrialAvaliar a qualidade (ex.: glúten
qualidade da farinha)Avaliar a influência nas propriedades
sensoriais
MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
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MÉTODOS DE DETERMINAÇÃOMÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por
nêutrons; ativação por prótons
B. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol
reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia
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É a determinação mais utilizada.
Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio.
Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%.
%Proteinas = F x %N%Proteinas = F x %N
Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
Análise de nitrogênio
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Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.
Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento.
Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas.
F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão.
Proteínas - KjeldahlProteínas - Kjeldahl
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KJELDAHLKJELDAHL
É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado.
Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.
O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.digestão, destilação e titulação.
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL1a etapa: Digestão
O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio).
A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4
+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim
permanece na solução:
CHON CHON (alimento)(alimento) (NH (NH44))22SOSO44 + C0 + C02(g)2(g) + H + H220 0 (g)(g) (1)(1)
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO
Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia:
(NH(NH44))22SOSO44 + 2 NaOH + 2 NaOH 2NH 2NH33 + 2H + 2H22O + NaO + Na22SOSO44
(2)
A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão
para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso.
NHNH33 + H + H33BOBO33 NH NH44++ + H + H22BOBO33
-- (íon borato)(íon borato) (3) 23
DIGESTOR
DESTILADOR
Água de arraste
Amostra
NaOH
Erlenmeyer com solução de H3BO3
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MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL
3a etapa: Titulação
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico.
HH22BOBO33-- + H + H++ H H33BOBO33 (4)
A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio.
O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado:
%Protein = F x %N%Protein = F x %N 25
Falhas do processo (Kjeldahl):
1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.).
Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.
3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos
5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes
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DESTILAÇÃO DIRETADESTILAÇÃO DIRETA
Modificação do método de kjeldahl.
Sem digestão.
Amostra + NaOH/Na2SO4 NH3
Mistura-se com H3BO3 e titula-se com
ácido.
Necessita de curva de calibração.
É usado como rotina em alguns alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).
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MÉTODO DUMAS MÉTODO DUMAS (1831)(1831)
Também determina N total.
Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2.
O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental.
N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final.
Combustão da amostra (700º-800ºC)
Medição do N
gasoso
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MÉTODO DUMASMÉTODO DUMASNecessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F.
Problemas: sujeita à erros pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa.
Equipamento - melhora precisão;
- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;
-- não necessita de reagentes ou catalisador.
TURBIMÉTRICOTURBIMÉTRICO Fundamento: medida da turbidez
causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico.
Precipitante + proteína turbidez
Mede-se o grau de turbidez.
Rápido, simples (proteínas líquidas).
Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.
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MÉTODOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOSESPECTROFOTOMÉTRICOS
As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas.
A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração.
As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida.
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E VISÍVELVISÍVEL
Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas.
Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho.
Absorbância depende do tipo de proteína. 32
Princípio - Sais de Cu+2 em soluções
alcalinas produzem cor violeta ou roxavioleta ou roxa
quando interagem com ligações
peptídicas.
Medida feita em um Colorímetro ou
espectrofotômetro.
Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos
lê-se a absorbância a 540 nm.
Determina proteínas.
Teste do Biureto (Teste do Biureto (Riegler, 1914)
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Cor formada depende de cada proteína e a
intensidade é proporcional à quantidade.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)
Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas).
Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul.
Cor azul colorímetro (500 a 750 nm) curva padrão. 35
B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)
Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de
incubação Necessita de uma curva padrão com proteína
conhecida
Intensidade da cor depende de cada proteína.
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C. Métodos Espectofotométricos UVC. Métodos Espectofotométricos UV
Princípio - proteínas possuem absorção UV em 280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina.
Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo.
Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos.
Ácidos nucléicos podem interferir.
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Método Dye-bindingMétodo Dye-binding Corantes que reagem quantitativamente
com proteínas. Lisina, histidina e arginina reagem com -
SO3H. Corante + proteína complexo insolúvel. Mede-se o excesso de corante
colorimetricamente. A quantidade de proteína :
Corante ligado = corante inicial – corante livre.
Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.
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DYE-BINDINGDYE-BINDING
Fundamento:
Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico.
Desvantagens: Aquisição do equipamento
Amostra +
corante (exc.)
Formação de um complexo
insolúvel
Separação (centrifugaçã
o ou filtração)
Mede o excesso de corante que não reagiu
Por diferença obtém-se a
quantidade de proteína
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SEPARAÇÃO DE PROTEÍNASSEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
Solubilidade
Cromatografia: - tamanho,
- carga, - adsorção.
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ANÁLISE DE AMINOÁCIDOSANÁLISE DE AMINOÁCIDOS
Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas.
A proteína é hidrolisada usando um ácido forte ou enzimas libera aminoácidos.
Cromatografias separam os aminoácidos troca iônica, afinidade ou por absorção.
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