capillary zone electrophoresis
Post on 26-Sep-2015
127 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
-
CAPILLARY ZONE
ELECTROPHORESISKelompok 1:
Mochamad Fathurohman (20714035)
Nadia Nanda Kalista (20714501)
Triyadi Hendra Wijaya (20714007)
Yeni (20714032)
-
Elektroforesis?????
Elektroforesis: teknik pemisahan komponen bermuatanberdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik (yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan).
Elektrokinetik: pergerakan komponen bermuatan positif (+) ke kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) ke
kutub positif (+).
Hasil: elektroforegram yang memberikan informasi mengenai kecepatan migrasi.
-
Simple Electrophoresis
-
Electropherogram
Y-axis = detector response (Abs)
X-axis = waktu migrasi
Puncak electropherogram menyerupai kromatogram akan tetapi puncaknya lebih
sempit.
Data kualitatif: lokasi puncak dan resolusi puncak.
Data kuantitatif: tinggi puncak dan area di bawah puncak.
-
Jenis Elektroforesis
Planar Kapiler (CE)
-
Hal yang mempengaruhi
kecepatan migrasi......
Hidrofobisitas
Massa
Muatan
-
CE
Capillary Zone Electrophoresis (CZE)
Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
Capillary Isoelectric Focusing (cIEF)
Capillary Isotachophoresis (cITP)
Micellar Electrophoresis
Chiral Electrophoresis
Nonaqueous Electrophoresis
Capillary Electrochromatography
-
Elektroforesis zona
kapiler (CZE) ????
Mekanisme separasinya berdasarkan pada perbedaan rasiomuatan-massa.
Dasar-dasar CZE adalah keseragaman larutan buffer danbesarnya medan listrik yang tetap pada sepanjang kolom
(pipa) kapiler. CZE menggunakan kapiler terbuka.
Komponen-komponen sampel terpisah menjadi zona-zonakhusus.
Mobilitas elektroforesis ditentukan dengan menggunakan persamaan dari teori Debeye-Huckel-Henry (q=muatan netto,
R=jari-jari Stokes, =viskositas).
-
Komponen-komponen sampel terpisah
menjadi zona-zona khusus.
-
Aplikasi CZE
Sodium ions
Drugs Protein
-
Instrumentasi
-
Alat-alat yang digunakan
Kolom kapiler (Capillaries are normally made of silica with a length of 20100 cm, an outer
diameter of 300400 m, and an inner diameter
of 20200 m).
Dua buah elektroda (Anode + dan katode -)
Power supply (bisa diatur untuk bertegangantinggi)
Detector (sinar UV)
Larutan buffer beserta dua buah tempatpenyimpanannya.
-
Kolom kapiler Biasanya digunakan fused silika. Permukaan bermuatan negatif (Si2O
- atau silanol)
Pada CE diameter kolom kecil, luas area kecil, sehinggaresistensi listrik tinggi. Pada kondisi ini pelebaran kurvakarena termal minimum.
Na NaNa
Na Na Na Na
OSi
OH
OSi
OSi
OH O
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
OSi
OH
OSi
O
OSi
OH
O
ClCl
Na
Na
ClNa
-
ElektrodaPlatinum foil
PotensialDC supply 20-30 kV (high voltage)
Detektor: Pada dasarnya detektor yang semua detektor yang digunakan padaHPLC dapat juga diaplikasikan pada CE.Detektor tersebut meliputi: UV, diodaarray, fluorescence, refraktif indeks, elektrokimia dan lainnya.
-
Sistem injeksi sampel
Digunakanbantuantekanan saatmenginjeksikansampel padakolom kapiler.
Injeksihidrodinamik
Digunakanbantuan aruslistrik saatsampeldiinjeksikanpada kolomkapiler.
Injeksielektrokinetik
-
Volume sampel yang diinjeksikan pada sistem injeksi
hidrodinamik dihitung dengan persamaan
P adalah perbedaan tekanan (Pa)
d adalah diameter kapiler bagian dalam (m)
t adalah waktu menggunakan (det)
adalah viskositas buffer (kg m1s1),
L panjang tabung kapiler. The fact (m)
103 merupakan faktor konfersi m3 ke liter.
-
Mol solut yang diinjeksikan pada sistem injeksi elektrokinetik
dihitung dengan persamaan
C adalah konsentrasi solut
t adalah waktu medan listrik diaplikasikan
r adalah jari-jari kapiler
ep adalah mobilitas elektroforetik solut eof adalah mobilitas
elektroosmotik
E adalah medan listrk yang digunakan
Kbuf adalah konduktivitas buffer
.
-
Migration time & MIGRATION RATE
Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktuyang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom
kapiler menuju jendela detektor.
Kecepatan merupakan hasil kalkulasi dari membagiperpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari
detektor. ep= mobilitas elektroforesis
vep= kecepatan elektroforesis
E= medan listrik
Ld= panjang kapiler menuju detektor
Lt= panjang kapiler total
V= tegangan listrik
tm= waktu migrasi
-
Jika kapiler pada elektroforesis
diberi tegangan
Electroosmotic flow (EOF)
Terjadi perpindahan muatan ke arah kutub negatif (-)/
katode
Elektroforetik Flow (EMF)
Pergerakan elektrolit yang
tidak dipengaruhi oleh EOF
(Berdasarkan gaya gerak
listrik)
-
Terjadi pemisahan anatara muatan positif dengan muatannegatif akibat adanya lapis rangkap listrik.
Lapis rangkap listrik terjadi akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler.
-
eof : mobilitas Elektroosmotik (EOF) yang bertambahsecara vektorial
ep: mobilitas analat atau mobilitas elektroforetik (EMF)
eap: mobilitas aktual = ep + eof
-
Spesi bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat karenaEOF & EMF arahnya sama
Spesi netral bergerak ke katoda dengan kecepatanditentukan oleh aliran elektroosmotik
Spesi bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF & EMF berbeda arah
-
CONTOH APLIKASI CZE DALAM
JURNAL
-
Abstrak
Elektrolit : Hydroxyisobutyric acid (HIBA) , NaOH
Standar Internal : imidazole.
Pemisahan dilakukan dalam fused uncoated silica capillary
Metoda :Sample dan standar diinjeksikan secara hidrodinamik(50mbar,3s) dari ujung outlet kapiler
Sistem elektroforesis dioperasikan dalam polaritas normal dan kondisi tegangan konstan 30kV
validasi dari sample tuna yang berbeda
Hasil kadar penentuan histamin dalam sampel melalui CZE dibandingkan dengan metoda LCMS/MS
-
Pendahuluan
Histamin
senyawa amino biogenik yang terdapat dalam berbagai tingkatan makanan, seperti keju, sayuran, ikan, dan lain-lain.
Terbentuk dalam makanan melalui dekarboksilasi dari asam amino histidinyang dikatalisis oleh L-histidin dekarboksilase
Keracunan
FDA, tingkat histamin di atas 200mg/kg penyakit tipe scombroid.
Gejala penyakit : kesemutan atau terbakar dalam atau di sekitar mulut atautenggorokan, ruam atau gatal-gatal pada tubuh bagian atas, tekanan darah, sakitkepala, pusing, gatal pada kulit, mual, muntah, diare, penyempitan saluranpernapasan seperti asma, palpitasi jantung, dan gangguan pernapasan
KonsentrasiHistamin
Amerika Serikat, FDA : batas maksimum 50mg/kg (histamin untuk ikan segardan kaleng
Brazil :batas maksimal 100mg/kg histamin pada otot ikan beku & segar, danikan kaleng
konsentrasi histamin : kondisi kebersihan, metoda pengolahan suhupenyimpanan dan waktu penyimpanan,
-
Beberapa metoda penentuan
Histamin
HPLC dengan fluoresensi atau UV dan penggunaan derivatisasi ,
kromatografi gas dengan detektor api pengion,
Deteksi UPLC dengan UV,
kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi fluoresensimenggunakan prosedur pra-kolom derivatisasi
HPLC dengan fluoresensi atau UV ,
kromatografi pertukaran ion dengan deteksi konduktivitas,
elektroforesis kapiler dan HPLC dengan fluoresensi atau UV
kromatografi cair- spektrometri massa menggunakan prosedurekstraksi fase padat
-
Tujuan Penelitian
Mengembangkan Metode cepat danselektif untuk penentuan histamin
menggunakan elektroforesis zona kapiler
(CZE) dengan deteksi UV. Metode
diterapkan dalam analisis sampel ikan tuna
dan hasilnya dibandingkan dengan metode
LC-MS / MS.
-
Sampel
Enam sampel tuna yang dibeli dari pasar lokal:
-15oC
-
Kondisi sampel :
Sampel ikan kalengan, ikan segar dianalisis segera setelah ikan dibuka .
Sampel sushi dibeli dan dianalisis segera.
Sampel ikan (fish tuna beku) dianalisis setelah penyimpanan selama tiga bulan
dalam freezer pada 15oC. (semua sampel
dihaluskan)
-
background elektrolit (BGE) : 60mmol/L hydroxyisobutyricacid and 10mmol/L
NaOH pada pH3.3.
Standar internal (IS) : Larutan stok standar histamin (600mg/L) dlm EtOH, Imidazole
(30mg/L) disiapkan dalam air deionisasi.
-
METODE PENELITIAN
-
10g sampel dlm labu (volume 150 mL) + 25
mL EtOH
emulsi
Sentrifugasi pada 10,000rpm 3 menit
diencerkan 1: 1 dengan larutan IS
injeksi
Sample dan standar yang disuntikkan secara
hidrodinamis (50mbar, 3s)
kapiler dibilas selama 30 detik dengan BGE. (HIBA
60mmol/L & NaOH10mmol/L pada pH 3,3 dlm
air deionisasi diencerkan dengan
larutan asamtrifluoroacetat
(Konsentrasi akhir 10mmol/L) dan air
deionisasi.
botol berisi 0.25mL campuran chloroform +
1.0mL sampel. Kemudian disentrifugasi
run
fase gerak : 95% pelarut A (H2O 0,1% formicacid) dan 5% pelarut B (95: 5 asetonitril /
H2O). Aliran air =200 mL/min. Volume injeksi adalah 5.0 mL,
30oC
Pretreat
ment !
Pretreat
ment !
Pretreat
ment 2
-
HASIL & DISKUSI
-
Hasil Pemilihan komponen BGE dan standar
Cincin amida- mampu menyerap radiasiUV, yang memungkinkan deteksi
langsung dari analit dalam instrumen CE
dengan detektor UV.
Histamine yang terdisosiasi asam basamemiliki nilai Pka 6,0 dan 9,8 muatan positif tergantung pHmedium.
Komponen yang dipilih untuk komposisiBGE adalah natrium sebagai co-ion dan
HIBA sebagai counter-ion Keduanyatidak memiliki kelompok kromofor
dalam struktur kimianya tidakmemberikan kontribusi terhadap
penyerapan background di UV
HIBA terpilih BGE max 60 mmol L^-1 Peakmaster Software
Kapasitas buffer 21,5 mmol^-1 jumlahnya cukup untuk metode yang
digunakan
pH sekitar 3,3 histamine memilikimuatan positif max
-
Hasil Karakteristik metode optimasi dalam sampel ikan tuna
Matriks sampel puncak kreatinin (0,65 menit) dan histidin (0,75 menit) Kelompok senyawa nitrogen dari ikan tuna (Kationik pd pH BGE) terdeteksi
absorptivitas pada panjang gelombang deteksi histamin
CZE cepat dan selektif untuk pemisahan dan penentuan analit. Karena tingginya mobilitas histamine dan sebagai metode deteksi langsung dimana
kelompok kromoforik tidak bisa ikut tercampur dalam deteksi analit.
-
Hasil Validasi Metode
metode validasi FDA system suit-ability, repeatability, linearity, limit of
detection, limit of quanti- fication, and
selectivity.
Resolusi antara histidine dan imidazoledapat dipisahkan dengan baik
Instrumental precision and intra-dayprecision pada larutan standar dari histamine
dan sample menunjukan nilai RSD 72,000 linieritas baik
Limits of detection (LOD) = 3 (S/N), Limitsof quantification (LOQ) = 10 (S/N) dengan signal untuk mengetahui noise
ratios.
Slope dari kurva standar adisi(0.036270.0016; R2 0.996) dan kurva
kalibrasi eksternal (0.033270.0015; R2
0.999) T-test menunjukan secara statisticslope yang dihasilkan sama (99%)
-
Hasil penentuan histamin
dalam sampel
Perbedaan besar antara beberapa nilai-nilai
konsentrasi histamin yang
diberikan pada sampel
menunjukkan bahwa selain
jenis pengolahan ikan,
kondisi waktu dan
penyimpanan juga
mempengaruhi.
-
Kesimpulan
Strategi pemilihan kondisi yang sesuai untukpengembangan metode pemisahan yang cepat dan bebasgangguan mungkin dapat digunakan dalampengembangan metode baru untuk determinasi molekullain dalam matriks yang kompleks, seperti ikan.
Peakmasters software menentukan komponen BGEtanpa eksperimen.
Sebuah metode sederhana dan cepat dikembangkan dandapat digunakan dalam penentuan histamin dari sampelikan tuna dan juga jenis-jenis ikan lainnya.
-
TERIMA KASIH
-
Referensi
Camilleri, Petrick. 1997. Capillary Electrophoresis Theory andPractice, 2and edition. London: CRC Press.
Cay, Jianyi dan Jack Henion. 1995. Capillary Electrophoresis MassSpectro, Journal of Chromatograpy A, 173 (1995) 667-692.
Klug, W. S. and M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4thed. Prentice Hall, Englewood cliffs.
Kuhn, R., dan Kuhn Hoffstetter S. 1993. Capillary ElectrophoresisTheory and Practice. Jerman: Spinger-Verlag.
Li, S.F.Y. 1996. Capillary Electrophoresis Principles, Practice, andApplications. Netherlands: Elsevier.
Smith, Martin. 2004. Understanding Mass Spectro. Kanada: John Wileyand Sons, Inc.
Vitali, Luciano at all. 2013. Development of a fast and selectiveseparation method to determine histamine in tuna fish samples usingcapillary zone electrophoresis. Brazil: Department of Science andFood Technology and Department of Chemistry. Federal Universityof Santa Catarina. Florianopolis, SC.
top related