marcadores de celiaquía por...

Marcadores de celiaquía por

quimioluminiscencia Ángel Esteban Rodríguez

Hospital General U. de Alicante

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WORKSHOP WERFEN Actualización en Autoinmunidad: nuevas tecnologías en el laboratorio.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Definición

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La Enfermedad Celíaca es un proceso sistémico

mediado inmunológicamente y originado por la

intolerancia al gluten, en personas genéticamente

predispuestas.

Se caracteriza por la presencia de

manifestaciones clínicas variables

(digestivas o no), anticuerpos

específicos de la enfermedad,

haplotipos HLA-DQ2 o HLA-DQ8 y

enteropatía.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Multifactorial

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Auto-anticuerpos

Linfocitos B

Respuesta inmune celular

y humoral

Inflamación

Linfocitos T

Gluten

Extrínseco

Factores desencadenante y predisponente

Genética

Intrínseco

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Estudio de la EC

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• Anti-endomisio (EMA)

• Anti-transglutaminasa IgA o IgG (tTG)

• Anti-gliadina desamidada IgA o IgG (DGP)

Serología autoinmune

• Asociación con HLA-DQ2 o DQ8

Estudio genético

• Lesión de la mucosa intestinal: Hiperplasia de las criptas y atrofia de las vellosidades

• Linfocitos intraepiteliales

Biopsia

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Ac. Anti-endomisio

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• Dirigidos contra fibras de

reticulina que rodea al músculo

liso en esófago de mono

• Antígeno: transglutaminasa

tisular (tTG)

• Se detectan por IFI en la porción

distal del esófago de mono

• Patrón reticular en la muscularis

mucosae

• Isotipo IgA: sensibilidad ≈95% y

especificidad 100%

Problemas: • Interpretación subjetiva: experiencia • Tejidos de mono son escasos y caros

Fluorescencia en sustancia intercelular de las fibras musculares lisas

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Ac. antitransglutaminasa

• Se encuentran en sangre (IgG e IgA)

• Alta sensibilidad y especificidad

(IgA)

• Diferente comportamiento frente

EMA (más S y menos E), epítopos

menores

• Generalmente: a mayor lesión

histológica, mayor sensibilidad

• Automatizables

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

rh-tTG

(recombinante humana)

h-tTG

(nativa humana)

pg-tTG

(Cobaya)

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Ac. Anti-tTG:

antígenos para su determinación

Marcador serológico único en la práctica clínica: - Cribado de EC - Seguimiento de adherencia a

la dieta sin gluten (DSG)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Ac. Anti-péptidos desamidados de la gliadina (DGP)

• Ac. Antigliadina: desuso

• Antígeno: péptido (sintético)

desamidado de la gliadina

• S y E comparable a tTG (algo menor)

• DGP-IgG mejor que DGP-IgA

• DGP aparecen antes que tTG (?):

útiles en menores 2-3-años.

• DGP + tTG: aumento S

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Grupos de riesgo

• Familiares

• Síndromes genéticos: Down, Turner, Williams

• Enfermedades autoinmunes: Sjogren, Tiroiditis,

Diabetes tipo I, HAI

• Déficit total de IgA (<5 mg/dL)

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Realizar anti-tTG, EMA y/o los anti-DGP del tipo IgG

Buena combinación: tTG IgA + DGP IgG

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Métodos de determinación

• Inmunofluorescencia indirecta (IFI): EMA

• Inmunoensayos:

o ELISA (enzimático)

• Clásicos en microplaca

• Fluroinmunoensayo (FEIA)

o No enzimático: Quimioluminiscencia (CIA)

• Ensayo multiplex: MFI (multiplex flow immunoassay)

• Alta sensibilidad y especificidad

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

CIA

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

CIA: Ventajas (I) • Calibración/

control de calidad

por parámetro

• Curva de

calibración de

trabajo estable

por lote de

reactivo

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Rango de medida tTG-IgA: 1,9 a 4965 CU

Punto de corte: 20 CU

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

CIA: Ventajas (II)

• Tiempo del ensayo: 30 min

• Acceso aleatorio (incluido

cualquier isotipo)

• Rango de medida amplio

• Preciso

• Mayor S y E para todas las

técnicas

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Chemiluminescence and ELISA-based serum assays for diagnosing and monitoring celiac

disease in children: A comparative study

• CIA Quanta-Flash tTG y DGP (IgA e IgG)

• ELISA Quanta-Lite tTG y DGP (IgA e IgG)

• Retrospectivo: 321 niños todos biopsia

• EC: 155 niños

• Objetivo: Estudio del rendimiento clínico y analítico

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207 14

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Imprecisión en el estudio

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Sensibilidad y especificidad

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Conclusiones del estudio

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• Deficiencia de IgA: Se puede usar DGP-IgG

• Elevada S y E: sobre todo tTG-IgA

• Rango analítico de medida muy amplio

Falsos Positivos y Negativos

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

• Falsos negativos:

oDéficit de IgA

oNo reconocimiento de epítopos de

htTG del ensayo

• Falsos positivos:

oCeliaquía latente

oBiopsia correcta?

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Falsos negativos y positivos

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Seguimiento dieta sin gluten (DSG)

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Biomarcadores

decrecen

significativamente

a los 12 meses:

tTG-IgA > cutoff

en 45% casos

DGP > cutoff en

14 % casos

1º disminuyen los ac. que reconocen péptidos

del gluten y después los autoanticuerpos anti-tTG

Relativamente

al momento

del

diagnóstico la

variación más

grande y

temprana es

para tTG-IgA

Aita A, Rossi E, Basso D, et al. Clinica Chimica Acta 421 (2013) 202–207

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Analytical and Clinical Comparison of Two Fully

Automated Immunoassay Systems for the Diagnosis

of Celiac Disease

• Adultos: 74 pacientes con EC y biopsia; 138

controles.

• Técnicas: CIA Q-Flash vs FEIA (EliA, Thermo

Scientific). También EMA-IgA (corte 1/10)

• EMA IgA, S y E 100 % (sin déficit IgA)

Lakos G, Norman GL, Mahler M, Martis P, Bentow C, Santora D, Fasano A.

J Immunol Res. 2014;2014:371263. doi: 10.1155/2014/371263. Epub 2014 Mar 13.

19

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

20

Q-Flash tTG IgA: mayor S y E (si cutoff EliA baja la S y E se igualan) Q-Flash DPG: mayor S y E Mejor combinación: Q-Flash tTG IgA + DGP IgG (S 98,6 %)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

LSN: Límite Superior de Normalidad 21

[tTG-IgA] >10 x LSN en EC:

Q-Flash IgA = 50%

FEIA IgA = 23 %

Aplicando el algoritmo diagnóstico ESPGHAN…

CIA FEIA

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Fully-automated, chemiluminescence IgA and IgG anti-tissue transglutaminase (tTG) antibodies

serum assays for the screening of celiac disease.

• 727 pacientes consecutivos (mediana edad 27 a)

• No encuentran falsos negativos (S 100%)

• 3 falsos positivos (E 99,6 %)

• Útil en diagnóstico: excelente rendimiento analítico

• Útil en el seguimiento: amplio rango de medida

• Más S que EMA sin pérdida E

Daves M, Cemin R, Perkmann V, et al. J Immunol Methods. 2016 Feb;429:57-9. 22

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Estudio tTG-IgA en rango 20-200 CU

• Período Enero 2015 – Junio 2016

• 20 niños (45% ♂) y 25 adultos (28% ♂)

• Parámetros estudiados:

o tTG-IgA y DPG-IgG por CIA (Q-Flash, BIO FLASH, WERFEN)

o EMA-IgA (IFI, esófago de mono, Euroimmun)

o HLA y Biopsia intestinal

• tTG entre 20 y 200 CU como primera

determinación (diagnóstico)

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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Resultados (I)

[tTG-IgA] (CU) [DGP-IgG] (CU)

Media Rango Media Rango*

Niños 82,0 23,7-183,1 25,0 3-93

Adultos 56,0 23,3-177,7 8,56 3-65

(*) Excluidos déficit de IgA 24

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Resultados (II)

tTG-IgA (niños)

Rojo: EC

Amarillo: DQ8DQ7 25

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

EMA

POS NEG 0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

E. CELIACA

SI NO

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Resultados (III)

DGP-IgG (niños)

Rojo: EC

Amarillo: Déficit IgA 26

0

20

40

60

80

100

120

140

DG

P-I

gG

(C

U)

E. CELIACA

SI NO

≈ 400

y = 0,4236x - 4,686 R² = 0,4599

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

DG

P-I

gG

(C

U)

tTG-IgA (CU

Correlación tTG-IgA vs DGP-IgG

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Resultados (V) tTG-IgA (adultos)

Verde: EC

Rojo: Déficit de IgA y EC 27

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

EMA

POS NEG

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

tTG

-Ig

A (

CU

)

CELIAQUIA

POS NEG

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Controles externos UK-NEQAS

• Sample 152-1 was a serum sample from a patient with known

Coeliac disease.

28

• Sample 162-1 was a serum sample from a patient with known

Coeliac disease.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Conclusiones • Marcadores de E.

celíaca: o S y E muy elevadas

o Rango de medida muy

amplio (sobre todo tTG-

IgA), distinguiendo bien

entre positivo y negativo

o Útiles tanto para el

diagnóstico de E. celíaca,

como para el seguimiento

de la DSG.

o Reduce la necesidad de

biopsia para el diagnóstico

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• GENERALES: o Rápido (30 min. ensayo)

o Fácil manejo

o Acceso aleatorio de las

muestras

o Calibración por lote

(y controles) únicos para

cada analito

o Preciso

o Mantenimiento mínimo

o No existe la variabilidad

inter-observador

(comparado con IFI)

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