nukleové kyseliny organizace genomu

Nukleové kyselinyOrganizace genomu

David Kaftan, 2014

Nukleové kyseliny

• DNA, RNA, centrální dogma

• DNA– struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962

• báze, nukleosidy, nukleotidy• primární- komplementarita bazí • sekundární- dvoušroubovice• terciární

– replikace– reparace– mutace

• RNA– struktura

• jednošroubovicová• mRNA a hnRNA• tRNA• rRNA• snRNA

– transkripce a úpravy RNA– translace-proteiny

DNA a RNA jsou polymerypurinových a pyrimidinových nukleotidů

• dlouhé, nerozvětvené polymery

• monomer – nukleotid– purinová nebo pyrimidinová báze– pentosový cukr– fosfátová skupina

• DNA– 2-deoxyribóza– purin: adenine, guanine– pyrimidin: cytosin, thymin

• RNA– ribóza

• přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní

– purin: adenine, guanine– pyrimidin: cytosine, uracyl

De-novo syntéza pyrimidinů

• CO2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu

• kyselina orotová + fosforibosyl pyrofosfát (PRPP)• uridine TP• cytidin TP

• syntéza v plastidech

• UMP– udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do

DNA

• dTMP– dUMP + methenylhydrofolate– metylace, deaminace dCDP (Lemna major)

De-novo syntéza purinů

• syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním– uhlíků

• glycin• CO2

• formyl a methenyl tetrahydrofolát (THF)

– amidové skupiny• kyselina asparagová• glutamin

• syntéza v cytosolu

Katabolismus a recyklace nukleotidů

• hydrolýza DNA, RNA– oligonukleotidy– mononukleotidy– nukleosidy, báze

• syntéza– jednostupňová

• reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy

– dvoustupňová• nereverzibilní

• báze + PRPP ribonukleotid + PPi

• báze + (deoxy)ribóza 1-P (deoxy)nukleosid + Pi

• (deoxy)nukleosid + ATP (deoxy)nukleotid + ATP

Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů

• kovalentní fosfodiesterová vazba– fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů

• dva funkční konce– 3‘

• volná hydroxylová skupina

– 5‘• volná fosfátová skupina

Párování bazí v DNA

• převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice– jedna otočka za 3.4 nm– 10.1 párů bazí na otočku– flexibilní

• vodíkové vazby mezi vlákny• chybí vazby mezi „patry“

• A – T– dvě vodíkové vazby

• G – C– tři vodíkové vazby

• párování hnáno zvýšením entropie– vznik dvouvlákna snižuje entropii– hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie

Alternativní struktury DNA

• B forma– nejčastější

• A DNA– dehydratovaná forma– RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice– in vitro, ale i v buňkách

• Z DNA– levotočivá šroubovice– střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C

DNA v jádře je organizována v chromozómech

• DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny– histony

• malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu

• vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA– nehistonové proteiny

• chromatin– nukleosom

• dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů• H2A, H2B, H3, H4

– solenoid• stabilizován histonem H1

replikace DNA je semikonzervativní

Replikace jaderné DNA

• iniciace, elongace, terminace

• S fáze buněčného cyklu

• iniciace zahájena na několika místech současně– v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby)

• replikon– celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku– 50-70 kb

• rychlost replikace– baktérie 1000 nukleotidů za sekundu– eukaryota 100 nukleotidů za sekundu

• ukončení replikace při setkání vidliček

• počátek obsahuje charakteristickou sekvenci• kvasinky – 200 bp• savci – počátky i 10 kbp od sebe• rostliny – není známo

Replikace DNA: replikační počátky

Replikace jaderné DNA

• oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T

• vazba proteinů specifických pro replikaci– DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání

dvoušroubovice– replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA– DNA topoizomeráza rozplétá smyčky

• Primáza– syntéza krátkých segmentů RNAkomplementární s DNA

• DNA polymeráza– připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového

nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

DNA polymeráza

• připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

• kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP

• nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce

• podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě– Okazakiho fragmenty– každý má svůj primer (asi 10 bazí)– dodatečně pospojovány ligázou

• leading strand - kontinuálně rostoucí řetězec– 1 primer

• lagging strand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec

DNA polymeráza

• připojování nukleotidů jen za primerem– 3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA

• α– nesyntetizuje dlouhé fragmenty– 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu– postrádá exonukleázovou aktivitu

• , ε– spojeno s PCNA– dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů

• RNAza H– odstraňuje RNA primer záměnou za DNA

• ligáza– spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu

RPA, PCNA

• replikační protein A (RPA)– heterotrimerní struktura– stabilizace jednovláknové DNA– uvolněny Polα a Pol

• proliferating cell nuclear antigen (PCNA)– homotrimerní struktura– spojen s Pol a replikačním faktorem (Rfc)

DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci

• připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování

• frekvence chyb 1:107 bp

• polymeráza ve směru 5‘-3‘• nukleáza ve směru 3‘-5‘

– proofreading

• nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru

DNA mismatch repair

• snižuje chybovost 1:107 zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:109)

• rozeznání chyby• vyštěpení chybné oblasti

– jedna baze– celý úsek nemetylované DNA

• DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec• ligáza napojí fragmenty

Změny ve struktuře DNA

• spontánní depurinace

• deaminace cytosinu– 100 bazí za den a genom

• thymidinový dimer - UV záření

• alkylace guaninu

• stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů

• většina změn v nekódujících sekvencích

Oprava pyrimidinových dimerů

• dimer indukováno UV světlem

• oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem

• fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer

• excision repair

Post-replikační oprava

• DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem

• pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bp downstream)

• homologní rekombinace s komplementárním vláknem

• vyplnění chybějících částí DNA polymerázami

• napojení segmentů ligázami

Homologní rekombince

• opravy – uchování nezměněné DNA

• meióza – zdroj variability– nové kombinace DNA– nové geny, RNA, proteiny– odlišné gamety

• mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů

• poměrně časté

• reciproké vs. genová konverze

Homologní rekombinace: single-strand annealing

• extrachromozomální– plazmidová DNA– T-DNA

• přerušení obou vláken obou duplexů• exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí

jednovláknový homologní úsek• komplementární úseky jsou přiloženy (annealing)• odstranění nehomologních částí• oprava mezer

• nekonzervativní – jen jeden duplex přežije

Homologní rekombinace: double-strand break repair

• meióza

• přerušení dvou vláken jednoho z duplexů

• přerušení rozšířeno endonukleázami

• 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexu kde slouží jako primery

• ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy

Homologní rekombinace: přenos vlákna

• LIM15 (homolog RecA)• synaptonemální komplex

Homologní rekombinace: one-sided invasion

• krátké (žádné) homologní sekvence

• u rostlin častější než ostatní typy rekombinace

• traspozonní elementy• vmezeření T-DNA

• přerušení obou vláken akceptorového duplexu• přerušení rozšířeno exonukleázami• jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního

duplexu• prodloužení invadujícího vlákna

Telomery

• koncové sekvence chromozómů

• konzervované repetitivní sekvence

• telomeráza– obsahuje RNA– rozeznává terminální sekvenci bohatou na G– opakovaně přidává repetitivní sekvence na

konec telomery

Plastidy jsou endosymbionty

• DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích

Plastidová DNA

• kruhový chromozóm– velký segment– malý segment– invertovaný opakující se segment

• chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas– tandemové opakování rRNA

• Euglena gracilis

• rozdílné délky– Codium - 89 kb– Acetabularia - 400 kb– vyšší rostliny obvykle 120-160 kb– invertovaný segment: 0.5-76 kb

Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny

• kolem 100 genů– většinou všechny rRNA, tRNA– klíčové geny pro enzymy fotosyntézy

• nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů– 50-73 kb, cca 40 genů

• řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře

enzym rostliny řasyfotosyntetizující Epifagus Euglena Porphyra

počet 101-150 40 82 182

Genetický systém

rRNA rrn 4 4 3 3tRNA trn 30-32 17 27 35

ribozomální protein

rpsrpl

20-215-6

152

214

4618

FotosyntézaRubisco a další rbcL

psa psb pet atp

29-30 0 26 40

NADH dehydrogenáza

nhd 11 0 0 0

Biosyntéza 1-5 2 1 40

počet intronů 18-21 6 155 0

Mechanismus replikace plastidové DNA

• mnoho kopií– až 150– počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu

• frekvence replikace– nezávislá na buněčném dělení u diferencujících

se buněk– synchronní u rychle dělících se buněk

• replikační počátky poblíž rRNA genů– v invertovaných oblastech u tabáku

• pravděpodobně i další replikační počátky

• všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře– helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy,

primázy

Mitochondriální DNA

• velká variabilita velikostí– Oenothera, Brassica: 200 kb– Cucumis melo: 2600 kb

• rozsáhlé nekódující sekvence– Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb– neobsahují opakující se sekvence– živočišné mitochondrie mají malý kompaktní

genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí

• lineární– Chlamydomonas

• cirkulární– jeden kruhový chromozom

• Marchantia, Brassica– mnoho subgenomických kruhových

chromozómů

Homologní rekombinace subgenomických chromozómů

• dynamika master cycle – subgenomic cycle• rekombinace opakujících se sekvencích

– 2 isoformy– 2 subgenomické cykly– 3 kombinace subgenomických cyklů

Mitochondriální genom

• malý počet genů

• oxidativní respirace• syntéza ATP• translace

Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií

• promiskuitní DNA– obsažena ve více kopiích

• jádro, mitochondrie, chloroplasty– rostliny, živočichové, houby– není jen jednosměrný transfer– plastidy-jádro, jádro-plastidy

• plastidový ribozomální protein rpl23– nahrazen jaderným po inaktivaci původního

plastidového– chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23

• přenos z chloroplastu do mitochondrií– jednosměrný– mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA

Transkripce DNA - geny

• gen– kódován DNA– kóduje protein

• protein– DNA - aminokyselina– sekvence aminokyselin -protein– trojrozměrná struktura určuje funkci

• DNA kód– 4-písmenná abeceda (A,G,C,T)– kódující část genu

• menší část– nekódující část

• kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat

• genom– kompletní genetická informace DNA organismu

Organizace plastidového genomu

• operon– sekvence bakteriálních genů podobného typu

transkribovaných najednou

• polycistronní transktipt– klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné

• monocistronní transkript– jeden transkript a jeden gen

• introny– nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci

• exony– kódující sekvence

Organizace jaderného genomu

• asi jen 1 % DNA je transkribováno

• počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná

• gen– promotor– transkribovaná oblast– exony– introny– 3‘ konec nesoucí regulační funkce

Organizace jaderného genomu

• příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně

• umístění na chromozómu– odděleně

– v klastrech, často opakujících se• histony: 10-600x

• rRNA:

Transposable elements

• mobilní DNA sekvence– mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu

• transposony retrotransposony

Bakteriální transposable elements

• vložené sekvence (insertion sequence elements)– inverted repeat

• 5‘ GAGC-----GCTC 3‘• 3‘ CTCG-----CGAG 5‘

– 1-2 kb– mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu

• přesun více méně náhodný

• přesun jen DNA

• poměrně vzácně– 1:105-107 buněk

RNA: primární struktura

• lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů– adenin, guanin, citosin, uracyl– fosforylovaná ribóza

• párování s DNA– A-U, T-A, G-C, ale také G-U

• méně stabilní než DNA– volný 2‘ hydroxyl ribózy

• heteropolární řetězec– 5‘ začátek– 3‘ konec

• častá katalytická aktivita• váha – S

– sedimentační koeficient– Svedberg

Sekundární struktura RNA

• většina tvořena jednotlivými vlákny

• lokální sekundární struktura– smyčky, vlásenky– výduť– standardní párování

• G – C, A – U– nestandardní párování

• G – U, U – U, G – A– volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje

vodíkovou vazbu k interakcím

• interakce domén vytváří terciální struktury

RNA je méně stabilní než DNA

• 2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní• RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu

– při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu

Prekurzorová a mediátorová RNA

• mRNA – messenger (mediátorová, informační)– kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů– (1-2% celkové buněčné RNA)– nejméně stabilní

• hnRNA - heterogenní nukleová– pre-mRNA - prekurzorová mRNA vzniklá v jádře, tzv.

primární transkript – delší než samotný strukturní gen– různé oblasti DNA

• exony (kódujicí)• introny (nekódujicí)

– působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA

Transferová RNA

• tRNA – transferová (přenosová)– přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na

ribosom– většina 4S RNA

• mitochondrie– chybí většina celého setu– import s cytoplazmy

• chloroplasty– obvykle soběstačné– paraziti importují z cytoplazmy

• cytoplazma

Ribosomální RNA

• rRNA – ribosomální– součást ribozomu

• malá podjednotka• velká podjednotka

– 3 typy ribozomů• cytoplasmatické• plastidové• mitochondriální

malé RNA

• malé RNA– účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER

• snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA– RNA splicing: U1, U2 ,U4-9, U11, U12– úprava 3‘ histonové mRNA: U7

• snoRNA – malé jadérkové RNA– pre rRNA processing

• scRNA – malé cytoplasmatické RNA

• cRNA – chromosomová RNA

• miRNA – mikro RNA– regulace a stabilita translace mRNA

• telomerázová RNA– templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů

• 7SL RNA– import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula

Genetická informace kódovaná v RNA

• virus tabákové mozaiky– jednovláknová RNA– proteinový kabátek kódován RNA

• Gierer a Schramm 1956– samotná RNA způsobuje infekci

• Fraenkel-Conrat, Singer 1957– hybridní virové částice– RNA a cizí protein– nové virové částice obsaohvaly vlastní protein

Transkripce DNA na RNA

• syntéza od 5‘ směrem k 3‘

• templátové vlákno DNA přepsáno do komplementárního vlákna RNA– identické s komplementární DNA– uracil místo thyminu

• RNA polymeráza se pohybuje po DNA ve směru od 3‘ k 5‘

RNA polymerázy

• RNA polymeráza se váže slabě k DNA

• podobná struktura bakteriálních a eukaryotních polymeráz

jaderná RNA polymeráza

• RNA polymeráza I– jadérko– 25S, 17S a 5.8S rRNA

• RNA polymeráza, II– nukleoplasma– mRNA, U1, U2, U4, U5

• RNA polymeráza III– nukleoplazma– třída 1

• 5S rRNA– třída 2

• tRNA– třída 3

• U3, U6, další malé stabilní RNA

jaderná RNA polymeráza

• struktura– dvě velké podjednotky (125 a 220 kDa)– několik dalších malých podjednotek

• 5 z nich společné všem polymerázám

• 220 kDa podjednotka RNA polymerázy II– C terminální doména YSPTSPS

• transkripční faktor II H (TFIIH)– kináza fosforylující Ser, Thr– uvolnění RNA polymerázy II s promotoru

• iniciace transkripce

chloroplastová RNA polymeráza

• kódovaná v jádře– jeden protein– bakteriofágový typ

• plastidová– , , ‘ podjednotky kódovány v chloroplastu– v jádře

• spolupráce jaderného a chloroplastového genomu– vazba na -10 a -35 consenzuální motiv promotoru

Iniciace transkripce

• promotor– místa na chromozómu pro vazbu RNA polymerázy– TATA box

• terminační sekvence

• jádro– pro vazbu třeba transkripční faktory– obvykle jeden promotor pro jeden gen

• plastidy– vazba RNA polymerázy obvykle bez transkripčních faktorů– geny a operony mohou mít mnoho promotorů

– podobně snad i u mitochondrií

DNA transkripce

• Proces podobný replikaci DNA– transkript nezůstává spojen s DNA– DNA dvojšroubovice se ihned obnovuje

• RNA transkript je krátký– tisíce nukleotidů

• RNA-polymerázy mohou jít za sebou– syntéza další RNA před dokončením prvního transkriptu– rychlá tvorba mnoha transkriptů

• RNA-polymeráza nemá opravnou schopnost

Cytoplazmatická mRNA

• méně stabilní než tRNA a rRNA• posttranskripční úpravy

• m7G čepička– 5‘ konec mRNA– připojení guanosinu– N-7 metylace– nezbytné pro iniciaci translace– ochrana před degradací

• poly A 3‘– polyA polymeráza dosyntetizuje poly adeninový konec– 20-250 A– umožňuje export z jádra– stabilizuje mRNA proti degradaci– nezbytný pro iniciaci translace

Plastidová a mitochondriální mRNA

• jedna mRNA může nést několik kódujících sekvencí• chybí 5‘ čepička i 3‘ poly A

• mitochondrie– 5‘ TP

• plastidy– 5‘ MP– některé mají krátký polyA 3‘ konec

• podporuje degradaci

• 3‘ i 5‘ konce mohou tvořit smyčky– regulační funkce

• úprava, translace, degradace

RNA processing

• exony– kódující sekvence

• introny– nekódující sekvence– jaderná i plastidová, mitochondriální RNA– žádné introny u 5.8S, 5S rRNA, snRNA– délka– jaderné savčí 100b-100kb– obvykle 80-140 nukleotidů u rostlin, bohaté na A-U( 60-70%)– v plastidech někdy chybí zcela

• RNA splicing– před opuštěním jádra po přidání čepičky a poly(A)– vystřihnutí intronů

• speciální sekvence několika nukleotidů určuje pozici 5´GU- AG 3– spojení exonů

Introny

délka místa střihu výskyt

• jaderné pre-mRNA <70 G:GU….AG:N jaderná mRNA• jaderné pre-tRNA11-13 nekonzervované jaderná tRNA• skupina I >200 U:N….G:N plastidová tRNA, rRNA,

mRNA• skupina II <200 až >400 plastidy a mitochondrie• skupina III Euglena

• obvykle nejsou kratší než 70 bazí

• bohaté na A-U páry– dvouděložné 70%– jednoděložné 60%, někdy ale jen 30%

Splicing intronů

• spliceosome– malé jaderné nukleoproteinové částice snRNP– snRNA– U1, U2, U4/U6 komplex, U5– non snRNP factors

• lariat– guanosin na rozhraní intronu a exonu na 5‘ konci pre-mRNA

vytvoří fosfodiesterovou vazbu s 2‘ hydroxylovou skupinu adenosinu

• uvolněný intron se odbourá

• introny zvyšují pravděpodobnost rekombinace exonů a tvorby nových proteinů.

• alternativní sestřih– jeden gen dá vznik několika mRNA a různým proteinům

Splicing pre-tRNA

• introny krátké– jen 11-60 bazí– není konzervovaná sekvence střihu– obsahují sekvenci komplementární k antikodonu

• endonukleáza odštěpí intron v blízkosti antikodónu

• cyklická fosfátová skupina rozštěpena na 2‘ fosfát

• 5‘ hydroxyl fosforylován

• RNA ligáza spojí oba konce

• fosfatáza odstraní 2‘ fosfát

Selfsplicing

• ribozym– RNA s katalytickou aktivitou

• skupina I– guanosin jako kofaktor

• skupina II– podobný mechanizmus jako pre-tRNA– adenosin intronu atakuje OH na 3‘

prvního exonu– lariat– nejsou přítomny u rostlinných

mitochondrií a chloroplastů

Selfsplicing

• ribozym– RNA s katalytickou aktivitou

• skupina I– guanosin jako kofaktor

• skupina II– podobný mechanizmus jako pre-tRNA– adenosin intronu atakuje OH na 3‘

prvního exonu– lariat– nejsou přítomny u rostlinných

mitochondrií a chloroplastů

Úprava rRNA

• většina genů transkribována jako prekurzorové RNA a poté upravována

• pouze některé malé RNA transkribované RNA polymerázou III nejsou upravovány– 5S rRNA

• plastidové rRNA kódované v polycistronické transkripční jednotce obsahující dva geny tRNA s neobvykle dlouhým intronem

Úprava tRNA

• transkribovány RNA polymerázou III

• pre-tRNA obsahují nadbytečné sekvence na 3‘ i 5‘ konci– odstraňovány nukleázami– přidání CCA na 3‘

• odstranění intronu

Úprava plastidové pre-mRNA

• chloroplastový genom obsahuje cca. 150 genů ale jen 60 transkripčních jednotek

• pre-mRNA polycistronický transkript

• štěpení na monocistronické mRNA– nezbytné pro translaci

• bakteriální translace polycistronické mRNA

• mitochondrie transkribují monocistronické pre-mRNA– kromě několika vyjímek

RNA editting

• změna sekvence kódující protein

• objeveno u mitochondrií trypanozomy

• změny nukleotidů– přidání, odstranění

• poly U předány z 3‘ guide RNA– mitochondrie

» Trypanozoma, Physarium

– modifikace, substituce• C – U, méně často U – C• plastidy, mitochondrie rostlin

– 1200x na genom v mitochondrii– 30x na genom chloroplastu

Doba života RNA

• mRNA se může překládat několikrát• podle množství potřebného proteinu se řídí doba života mRNA. • prokaryota

– 3 min

• eukaryota – 30min až 10 hodin.