tecnologia do dna recombinante-email

Tecnologia do DNA Recombinante

A revolução na Biotecnologia

Rafael Guimarães rafaellg@gmail.com

Início - entre 1970 e 1980

  Como alterar precisamente a constituição genética de organismos vivos.

Revolução Biotecnológica

Engenharia Genética

Revolução Biotecnológica

Desenvolvimento de drogas

Novas terapias

Alimentos mais saudáveis

Tecnologias ambientais

  É possível transferir um gene de um organismo para outro e, este ser expresso?

  É possível combinar dois genes em um?

  É possível regular a expressão de um gene?

  Podemos identificar indivíduos ?

  Podemos determinar mutações que levarão a doença?

  É possível mudar a constituição genética de um organismo para deixá-lo vantajoso para a sociedade?

Ferramentas para manipular o DNA

Tecnologia do dna recombinante

  É possível transferir um gene de um organismo para outro e, este ser expresso?

  É possível combinar dois genes em um?

  É possível regular a expressão de um gene?

  Podemos identificar indivíduos ?

  Podemos determinar mutações que levarão a doença?

  É possível mudar a constituição genética de um organismo para deixá-lo vantajoso para a sociedade?

Ferramentas se encontram naturalmente na natureza !!!!!!!

clonagem gênica

Visão geral Produção de cópias iguais por meio de reprodução assexual

Inserção de um DNA dentro da célula e sua reprodução e conservação

Isolamento e mutiplicação de fragmentos específicos de DNA de interesse

Clonagem na Biologia Molecular

Com objetivo de obter grandes quantidades do DNA de interesse

Componentes básicos

(I) Enzimas que cortem o DNA

(II)  Enzimas de unam o DNA

(III)  Vetores que multipliquem o DNA

Visão geral

Enzima de restrição !

Sistema de Restrição por Modificação!(SRM)!

  A bactéria utiliza um sistema de defesa contra a invasão dos bacteriófagos.!

  Clivam o material genético viral assim que ele entra no citoplasma da bactéria.!

  Enzimas de Restrição!

•  Premio Nobel de 1978 Werner Arber

Nucleases!

  Exonucleases!

  Endonuclease!

Definição!•  São enzimas, endonucleases, que reconhecem sequências no

DNA e quebram as ligações fosfodiéster!

16

  São produzidas naturalmente por bactérias, onde elas são usadas contra vírus.

  Reconhecem sequências específicas de 4 a 8 pb e cortam o DNA em sítios

próximos ou a 25 pb de distância.

•  Enzimas com diferentes sítios de reconhecimento podem gerar as mesmas

extremidades coesivas. Ex . Bam HI (GGATTC), Bgl II (AGATCT) e Sau 3A

(GATC).

•  A função natural das enzimas de restrição é proteger bactérias inativando o DNA do vírus infectante.

•  Os grupos CH3 (metila) protegem o DNA próprio da bactéria de suas enzimas de restrição.

Enzimas de Restrição

FUNÇÃO!•  Reconhecem sequências específicas no DNA e clivam o DNA!

Produzidas naturalmente

pelas Bactérias

Tipos de Enzimas!•  Existem 3 tipos de Enzimas de Restrição!

  Tipo I!

  Tipo II!

  Tipo III!

Enzimas de Restrição Tipo II!•  Reconhecem sequências específicas no DNA e clivam o DNA no

sequência reconhecida!

Sequências que serão reconhecidas no DNA

Sequências Palindrômicas

de 4-6 nucleotídeos

Não necessitam de ATP

Poucos co-fatores em geral Mg++

20

Enzimas de Restrição

Tipos de Cortes!

22

23

ENZIMA ORGANISMO SEQUÊNCIA DE EXTREMIDADE RECONHECIMENTO CEGA OU COESIVA

Eco RI Escherichia coli Bam H1 Bacillus amyloliquefaciens Bgl II Bacillus globigii Pvu I Proteus vulgaris Pvu II Proteus vulgaris Hind III Haemophilus influenzae Rd Hinf I Haemophilus influenzae Rf Sau 3A Staphylococcus aureus Alu I Arthrobacter luteus Taq I Thermus aquaticus Hae III Haemophilus aegyptius Not I Nocardia otitidis-caviarum Sfi I Streptomyces fimbriatus

GAATTC COESIVA GGATTC COESIVA AGATCT COESIVA CGATCG COESIVA CAGCTG CEGA AAGCTT COESIVA GANTC COESIVA GATC COESIVA AGCT CEGA TCGA COESIVA GGCC CEGA GCGGCCGC COESIVA GGCCNNNNNGGCC COESIVA

CORTES NO DNA FEITOS PELAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:

FREQUÊNCIA DE RECONHECIMENTO DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO EM UMA MOLÉCULA DE DNA : 4 n onde, n= número de bases reconhecidas pela enzima de restrição. Ex. Sau 3A (GATC) 43 = 256 nucleotídeos ou seja, 1: 256 nucleotideos existe um sítio de restrição na molécula de DNA.

24

Quais as aplicações das enzimas de restrição?

25

Como analisar cortes feitos por enzimas de restrição?

DNA ligaseAs Enzimas que Ligam

T4 DNA ligase   Catalisa a ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos

  Origem Viral   ligando fragmentos de DNA coesivos ou abruptos

Como ligam

Vetores!

Definição!•  É um veículo genético (DNA) capaz de autoduplicação que carrega/transporta

o DNA para uma célula hospedeira de forma segura.!

Função

Introduzir e garantir a estabilidade do DNA dentro da célula hospedeira

VEÍCULOS DE CLONAGEM GÊNICA

Características:

  Capacidade de Replicação no interior celular

  Relativamente pequeno (<10kb) 31

Conceito:

Estas estruturas levam o DNA das células de uma espécie

para as células de outras espécies.

Tipos de Vetores!

  De acordo com !

  O estado dentro da célula!

  A funcionabilidade!

  O tamanho!

Estado dentro da célula!

  Vetores pequenos que permanecem em replicação passando o vetores para a célula filha!

  Vetores que se inserem genes dentro do genoma da célula hospedeira!

Funcionabilidade!

  Vetores de Clonagem!

  Vetores de Expressão!

  Vetores de Clonagem e expressão!

Tamanho!

  Plasmídeos!

  Bacteriófagos!

  Cosmídeos!

  Cromossomos artificiais de Bactéria (BAC) e Leveduras (YAC) !

Estrutura de um Vetor!

  Dependendo do tipo de vetor existem diferenças na sua estrutura!

Plasmídeos!(I)  Origem de Replicação autónoma !

(II) Gene de resistência à antibiótico!

(III)  Sítio de Policlonagem!

(IV)  Gene de Seleção dos recombinates!

•  Genoma DNA circular dupla fita!

•  Permite a inserção de fragmentos de até 10kb.!

PLASMÍDEOS

SÃO MOLÉCULAS DE DNA CIRCULARES BIFILAMENTARES ENCONTRADAS

NATURALMENTE EM BACTÉRIAS, LEVEDURAS CÉLULAS VEGETAIS E OUTROS

TIPOS DE ORGANISMOS .

  CARACTERÍSTICAS:

  APRESENTAM UM MARCADOR SELECIONÁVEL (CARACTERÍSTICA ÚTIL PARA A

BACETÉRIA HOSPEDEIRA).

  GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. Ex. AMPICILINA E CLORANFENICOL.

  APRESENTAM UMA SEQUÊNCIA DE DNA QUE ATUAM COMO ORIGEM DE

REPLICAÇÃO.

  ALGUNS SE INSEREM NO CROMOSSOMO BACTERIANO (INTEGRATIVOS OU

EPISSOMAIS).

38

PLASMÍDEO

39

GRUPOS: NÃO CONJUNGATIVO E EPISSOMAL (CONJUGATIVO)

40

41

TAMANHO E NÚMERO DE CÓPIAS:

• 1 a 250 Kb

• 1 a 50 cópias por célula.

Ex. pUC8 (E. coli) 2,1 Kb colE1 (E. coli) 6,4 Kb RP4 (Pseudomonas e outros) 54 kb

TOL (Pseudomonas putida) 117 kb

42

PLASMÍDEO pUC18/19

PLASMÍDEO DE LEVEDURA

43

BACTERIÓFAGOS (FAGOS) SÃO VÍRUS QUE INFECTAM ESPECIFICAMENTE BACTÉRIAS.

ESTRUTURA: • CONTÉM DNA OU RNA COMO MATERIAL GENÉTICO

• CONTÉM UMA COBERTURA PROTÉICA OU CAPSÍDEO

PADRÃO GERAL DA INFECÇÃO:

• A PARTÍCULA DO FAGO FIXA-SE NA SUPERFÍCIE EXTERNA DA BACTÉRIA E INJETA O SEU

CROMOSSOMO DE DNA NO INTERIOR DA CÉLULA.

• A MOLÉCULA DE DNA DO FAGO É REPLICADA, GERALMENTE POR ENZIMAS ESPECÍFICAS,

CODIFICADAS POR GENES DO SEU PRÓPRIO CROMOSSOMO.

• OUTROS GENES DO FAGO DIRIGEM A SÍNTESE DOS COMPONENTES PROTÉICOS DO

CAPSÍDEO E NOVAS PARTÍCULAS VIRAIS SÃO MONTADAS E LIBERADAS NA BACTÉRIA.

44

TIPOS DE CICLO DE INFECÇÃO:

• LISOGÊNICO

• LÍTICO: Completa-se em menos de 20 min.

Ciclo lisogênico do bacteriófago

45

Ciclo lítico do bacteriófago

Bacteriófagos Lambda!

Genoma DNA Linear dupla fita!

The λ genome is 48.5 kb, of which some 15 kb or so is ‘optional’ in that it contains genes that are only needed for integration of the phage DNA into the E. coli chromosome!

Bacteriófagos Lambda!•  Genoma DNA Linear dupla fita!

•  Existem dois tipos de vetores baseados em bacteriófagos!

(I)  Aquele em que o fragmento a ser clonado substitui parte da sequência não essencial do vírus!

a)  Comportam fragmentos de 9 a 25kb!

(II) Aquele em que o fragmento a ser clonado é inserido no vetor!

a)  Comportam até 7kb!

Inserção do Fragmento!

Cosmídeos!

Carrega a região cos dos bacteriófagos lambda

Pode ser empacotado nas partículas virais do fago

44 kb do novo DNA pode ser inserido

Cargas negativas do DNA e da Membrana

Transformação por heat-shock

Deixar as células competentes a aceitar o DNA exógeno

53

Eletroporação

53

Inserção

Transformação

Não sabemos se o vetor está dentro do microorganismos, e se ele está de maneira correta

Temos que dar funções ao vetor

Duas Etapas/situações

• os microorganismos que contém o vetor

• os vetores clonados de maneira correta

Selecionar

Regiões do plasmídeo

Duas regiões

Resistência a antibiótico

Estrutura do plasmídeo

Um região

Resistência a antibiótico

Um região

Quebra da lactose

Gene LacZ

LacZ

5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole.

Coloração Azul

Na presença do indutor IPTG

LacZ

5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole.

Coloração Azul

Na presença do indutor IPTG

X

X

X

X

Coloração BRANCA

PRODUÇÃO DE INSULINA RECOMBINANTE

PRODUÇÃO DE INSULINA RECOMBINANTE

Ovelhas transgênicas: Produção de proteínas recombinantes no leite

hGH hGH = hormônio do crescimento humano