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1
NATÁLIA RODRIGUES SILVA
IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS
PERIAPICAIS E CISTOS RADICULARES
NATAL/RN
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
ODONTOLOGIA
NATÁLIA RODRIGUES SILVA
2
NATÁLIA RODRIGUES SILVA
IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS PERIAPICAIS E
CISTOS RADICULARES
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como parte
integrante dos requisitos para obtenção do título
de Cirurgião-Dentista.
Orientadora: Márcia Cristina da Costa Miguel
NATAL/RN
2016
3
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Silva, Natalia Rodrigues.
Imunoexpressão da proteína Bax em granulamas periapicais e cistos radiculares
/ Natalia Rodrigues Silva. – Natal, RN, 2016.
37 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Gran-
de do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.
1. Proteína Bax– Monografia. 2. Imuno-histoquímica – Monografia. 3.
Granuloma periapical – Monografia. 4. Cisto radicular - Monografia. I. Miguel,
Márcia Cristina da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO Black D 6
4
NATÁLIA RODRIGUES SILVA
IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS PERIAPICAIS E
CISTOS RADICULARES
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento
de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de
Cirurgião-Dentista.
Aprovada em: 07/06/2016
_______________________________________
Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Orientadora
_______________________________________
Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Banca Examinadora
_______________________________________
Prof. Dra. Ericka Janine Dantas da Silveira
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Banca Examinadora
5
DEDICATÓRIA
Dedico esse TCC a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para que eu
chegasse até aqui, em especial meus pais.
6
AGRADECIMENTOS
Há tanto o que agradecer que não sei por onde começar. Irei começar pelo criador de
tudo, pai todo poderoso, Deus - o pai de todos - pois foi quem disse o caminho que deveria
seguir, o curso que deveria fazer, e assim fiz, de acordo com Sua vontade. Obrigada, meu pai,
por toda força, por transformar todo obstáculo parecer uma simples pedra no meu caminho,
obrigada por me fazer forte e sempre me ajudar levantar a cabeça quando as dificuldades
apareciam, que não foram poucas, a Ti devo essa conquista.
Agradeço a Deus por ter me dado duas mães maravilhosas - Maria Rodrigues (avó) e
Graça Maria (mãe). Minha avó que, infelizmente, não está mais entre nós em corpo, mas
que sinto sua presença onde quer que eu vá. A ela, que até seus últimos dias dizia que ia
esperar eu me formar pra que eu fosse cuidar dela, mas ainda continua cuidando, vibrando por
mim lá do céu, devo meu muito obrigado. Minha mãe, meu forte, meu tudo, sem ela também
não teria chegado aqui. Cada noite sem dormir, cada desespero, estresse até mesmo nos dias
de provas, serão sempre lembrados. Obrigada por estar comigo cada minuto, agora é minha
vez de retribuir por tudo isso.
Agradeço pelos dois pais que tenho - Raimundo (avó) e José Rilmar (pai). Meu avô
com seu jeitinho bruto de ser, sempre preocupado se eu estou precisando de alguma, se estou
bem, meu muito obrigado. Meu pai que me deu a oportunidade de sair muito nova de casa
para que eu pudesse ter bons estudos e com muito trabalho permitiu que eu chegasse até aqui.
Eu tinha 14 e hoje, com 25, estou me formando. Demorou um pouco, mas consegui.
Agradeço pelas irmãs que tenho, Gracielle e Gilmara. Irmãs que eu brigo e ao mesmo tempo
estamos rindo, brincando e, agora, comemoram essa vitória. Obrigada, minhas irmãs, por todo
apoio.
Agradeço pela família que me deu, pois todos contribuíram grandemente para minha
formação, estando comigo durante todo período em que estava estudando tanto pra o
vestibular como na graduação. Obrigada por me acolherem em suas casas quando precisei,
por me tirarem dos apertos, enfim, por tudo, vocês foram essenciais para minha formação.
Agradeço a Deus também pelos anjos que colocou em minha vida durante todos esses
anos de estudo. Minhas amigas/irmãs Mellyna e Myllena que estiveram comigo em todos os
momentos, vocês foram mais que amigas, foram minha família quando estava sozinha,
cansada, doente, em todas as vezes que precisei de uma mãozinha. Meus amigos, que sempre
estiveram torcendo, me fazendo rir nos momentos de tristeza, de desespero, de ansiedade, me
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dando todo apoio pra chegar até aqui. Os cursinhos que foram minha segunda casa durante
três anos, Lógico Cursos Aliados e Call, em especial os professores Carlão, Rogerio, João
Maria, Lazaro e Rosemberg, pelo excelente trabalho que fizeram, por serem tão atenciosos,
por me ajudarem muito quando mais precisei. Meus anjos da faculdade Rani, Bianca, Ana
Margarida e Thaís com quem compartilho diariamente meus estresses, risos e medos,
momentos que sentirei muita falta quando tudo isso acabar. Luiz Artur, meu anjo do TCC,
sem você estaria perdida nesse trabalho. Obrigada por ter tanta paciência comigo, por sempre
me socorrer quando não sabia para onde ir, por me fazer rir nos momentos de desespero, por
tornar esse trabalho mais leve. Todos os professores que fizeram parte da graduação, obrigada
pelos ensinamentos e pela paciência de mostrar, explicar quando não tinha habilidade em
algum procedimento.
Agradeço a minha orientadora Márcia Cristina Da Costa Miguel pela oportunidade
que me deu. O projeto trata de um assunto nada fácil, pelo menos a meu ver, mas com as
orientações essenciais que tive consegui concluir. Obrigada pela paciência, pelos
ensinamentos, pelo perfeccionismo que me fez aprender muito, enfim, obrigada por tudo.
Agradeço, por fim, a todas as pessoas que contribuíram na minha formação, foram
tantas que não dá pra colocar todas, mas que lembrarei o que cada um fez e ainda faz por
mim. Agradeço novamente e sempre agradecerei a Deus, pois foi Ele que proporcionou que
todas essas pessoas entrassem em minha vida.
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RESUMO
Objetivo: Avaliar a presença da proteína Bax em linfócitos presentes no infiltrado
inflamatório de GPs e CRs.
Metodologia: Vinte e cinco casos de GPs e 25 de CRs foram submetidos à análise imuno-
histoquímica usando o anticorpo primário anti-bax. A imunoexpressão da proteína Bax foi
quantitativamente avaliada nos linfócitos marcados em 5 campos consecutivos de cada caso
de GP e CR. Então, foi contado o número total de linfócitos imunopositivos em cada campo.
Os dados foram avaliados pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Foi considerado um
nível de significância de 5% (p < 0,05).
Resultados: Verificou-se a imunoexpressão da proteína Bax em linfócitos de todos os casos
de GPs e CRs, mas não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas lesões em
relação à quantificação da imunopositividade à proteína Bax (p=0,236). Assim como também
não foi verificado diferença estatisticamente significativa do infiltrado inflamatório entre as
lesões (p=0,347) e (p=0,476) respectivamente, nem entre a espessura do revestimento epitelial
(p=0,186).
Conclusões: Sugere-se que a imunoexpressão da proteína Bax identificada em linfócitos dos
GPS e dos CRs está implicada no processo de apoptose de linfócitos ativados em resposta à
estimulação antigênica frequente nestas lesões periapicais e que este mecanismo acontece
tanto para limitar o dano aos tecidos saudáveis causados por estes linfócitos ativados e suas
citocinas liberadas, quanto para restaurar a homeostase do sistema imunológico local.
9
ABSTRACT
Aim: To evaluate the presence of Bax protein in lymphocytes presented in inflammatory
infiltrate of radicular cysts (RC) and periapical granuloma (PG).
Material and Methods: Twenty-five cases of PG and twenty-five cases of RC were
submitted to immunohistochemistry analysis using a primary antibody anti-bax. The
immunoexpression of Bax protein was quantitatively evaluated on these lymphocytes marking
five fields consecutively in each case of PG and RC. Then, the total number of lymphocytes
immunopositives was counted on each field. All data was evaluated through the non-
parametric Mann-Whitney test. It was observed a significance of 5% (p<0,05).
Results: There were immunoexpression of Bax protein in lymphocytes from all cases of PG
and RC, but it was not observed a statistical significant difference between these lesions and
the number of immunopositivity to Bax protein (p=0,236). There was no statistical significant
in the inflammatory infiltrate from PG (p= 0,347) and PC (p= 0,476), nor between the
thickness of epithelial covering (p= 0,186).
Conclusion: It is suggested that the immunoexpression of Bax protein identified in PG and
PC lymphocytes is related to apoptosis process activated in response to antigens stimulation
on these periapical lesions. This mechanism happens to limit the damage to normal tissue
caused by this activated lymphocytes and its cytokines in order to return the homeostasis to
local immunologic system.
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LISTA DE TABELA E ILUSTRAÇÕES
TABELA 1 Avaliação das diferenças do numero de células Bax+ em granulomas
periapicais e cistos radiculares e suas diferenças em relação ao tipo de
lesão, grau do infiltrado inflamatório e espessura epitelial dos cistos
radiculares..................................................................................................27
FIGURA 1: Imunoexpressão de Bax em lesões periapicais...........................................28
FIGURA 2a: Box plot do número de linfócitos imunopositivos para a proteína Bax no
CR...............................................................................................................29
FIGURA 2b: Box plot da associação do número de linfócitos imunopositivos para
proteína Bax em relação à espessura do epitélio nos CRs.....................30
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 13
2 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 15
2.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA...................................................................................... 15
2.2 MÉTODO IMUNO-HISTOQUÍMICO........................................................................ 15
2.3 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA........................................................................ 16
2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................................................16
3 RESULTADOS .......................................................................................................... 17
3.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA...................................................................................... 17
3.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA........................................................................ 17
4 DISCUSSÃO............................................................................................................... 18
5 CONCLUSÃO............................................................................................................ 22
6 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 23
7 ANEXOS..................................................................................................................... 31
12
Imunoexpressão da proteína Bax em granulomas periapicais e cistos radiculares
NR Silva1, LAB Silva
2, SIM Lourenço
2, ALL Costa
2, EJD Silveira
2, MCC Miguel
2
1 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil.
2 Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil.
Palavras-chave: Cisto radicular, Granuloma periapical, Imuno-histoquímica, Linfócitos
Proteína Bax.
Correspondência: Márcia Cristina da Costa Miguel, Programa de Pós-Graduação em
Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, Natal, RN, Brasil, CEP 59056-000. Tel.: +55
84 3215 4138; fax: +55 84 3215 4138. E-mail: mccmiguel@hotmail.com.
13
INTRODUÇÃO
A exposição da polpa dental aos microrganismos e seus subprodutos, como
consequência da cárie dentária, fraturas ou procedimentos operatórios, desencadeia uma
resposta inflamatória local que irá resultar em necrose e consequente envolvimento dos
tecidos periapicais (Queiroz-Júnior et al. 2010, Shiromany et al. 2015). Os produtos
microbianos e a resposta imunológica que atuam no periápice acabam levando à destruição
do tecido periapical, resultando na formação de lesões, como granulomas periapicais e cistos
radiculares (Graunaite et al. 2011).
Os granulomas periapicais (GPs) são compostos por um tecido de granulação
contendo fibroblastos e vasos recém-formados, com um infiltrado inflamatório variável
(Andrade et al. 2013, Faustino et al. 2016). Os cistos radiculares (CRs) são cistos
odontogênicos inflamatórios cuja origem está associada aos restos epiteliais de Malassez que
são estimulados a proliferar como consequência da resposta imunoinflamatória (Martins et al.
2011, Moosvi & Rekha 2013, Bernardi et al. 2015).
O infiltrado inflamatório presente nessas lesões periapicais consiste em uma mistura
de linfócitos T CD4+/ CD8+ e B, neutrófilos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, células
dendríticas (DC), células NK, eosinófilos, mastócitos, bem como diferentes citocinas (IL-1,
IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17), interferon-γ (IFN- γ), fator de necrose tumoral (TNF-α)
presentes em diferentes proporções de acordo com o estágio de evolução da lesão (Marçal et
al. 2010, Martín-gonzález et al. 2015). À medida que a infecção se estabelece, uma resposta
imune específica é formada, podendo ser encontrados linfócitos CD4+ e CD8+ difusos no
infiltrado dessas lesões (Philippi et al. 2003). Os linfócitos CD4+ modulam a resposta
inflamatória no periápice através da liberação de citocinas pelos seus subgrupos, como a IL-2
liberada pelas células Th1, que são associadas à destruição do tecido ósseo e a progressão da
lesão, enquanto seus antagonistas IL-4, IL-10 e IL-33 liberadas pelas células Th2 limitam os
danos aos tecidos. Além da Th1/ Th2, as células Th17 também produzem outras citocinas
efetoras com propriedades osteoclastogênicas, tais como IL-6 e IL-23, reforçando o potencial
papel destrutivo nas lesões periapicais (Araujo-Pires et al. 2014). Os linfócitos CD8+, além de
induzirem a morte por apoptose de células infectadas, podem produzir citocinas pró-
inflamatórias como IFN- γ, (TNF-α), fator de necrose tumoral- β (TNF-β) e fator estimulador
de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (Morishima et al. 2010, Myoung et al.
2012).
14
Um dos mecanismos da morte celular desencadeada pelos linfócitos é a apoptose,
também conhecido como morte celular programada, que desempenha um papel importante no
desenvolvimento e na manutenção da homeostase dentro de todos os organismos
multicelulares (Tekkeşin et al. 2012). Este é um mecanismo geneticamente programado e
tem um importante papel na homeostase da população de células, podendo ser desencadeado
pela via intrínseca ou pela via extrínseca (Loreto et al. 2013).
Dentre as proteínas envolvidas na apoptose, tem-se as proteínas intracelulares que
regulam diretamente o processo de ativação das caspases que constituem a denominada
família Bcl-2. Os membros dessa família podem ser divididos em moléculas pró-apoptóticas
(BAX, BAK, BCL-xs, BAD, BID, BIKHRK, BIM e BOK) e antiapoptóticas (BCL-2, BCL-x,
BCL-w, BFL-1, BRSAG-1, MCL-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1) (Faria et al.
2006). As proteínas Bcl-2 e Bax são geralmente consideradas como as mais importantes
reguladoras de apoptose e os seus níveis relativos determinam o destino das células. A
proteína Bax é o membro de promoção da morte mais característico da família Bcl-2 (Amaral
et al. 2011). Essa proteína pode produzir heterodímeros com a Bcl-2 (Bax/Bcl-2) ou
homodímeros (Bax/Bax) e desta forma, Bcl-2 suprime a morte celular quando
heterodimerizada com Bax, por outro lado, o homodímero Bax/Bax promove apoptose
(Tekkeşin et al. 2012). O mecanismo de controle da apoptose pelos genes da família Bcl-2
envolve a formação de poros na membrana mitocondrial, permitindo a interação de várias
proteínas envolvidas na regulação da morte celular (Anazzeti & Melo 2007).
Algumas pesquisas analisaram os mecanismos de apoptose associados ao
revestimento epitelial de CRs (Suzuki et al. 2005, Martins et al. 2011, Loreto et al 2013).
Tekkeşin et al (2012), verificaram a forte presença da proteína Bax no revestimento epitelial
de cistos radiculares, sugerindo o aumento da atividade apoptótica no epitélio cístico.
Na revisão de literatura, não foram encontrados estudos que analisem a apoptose
associada aos componentes do infiltrado inflamatório das lesões periapicais. Diante do
exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a presença da proteína Bax em linfócitos
presentes no infiltrado inflamatório de GPs e CRs.
15
MATERIAIS E MÉTODOS
Cinquenta espécimes, incluindo 25 GPs e 25 CRs, obtidos do laboratório de Patologia
Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
foram selecionados de maneira randomizada para o estudo. O diagnóstico patológico das
lesões foi confirmado através da associação entre aspectos clínicos, radiográficos e
histopatológicos. Todos os casos de GPs e CRs foram obtidos a partir de pacientes que não
realizaram tratamento endodôntico prévio nos dentes associados às lesões. O estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Número do
parecer: 398.669).
Análise morfológica
Para o estudo histomorfológico, foram utilizadas lâminas com cortes de 5μm de
espessura do material incluído em blocos de parafina, corados pela técnica da
Hematoxilina/Eosina que posteriormente foram escaneadas com auxílio do equipamento
Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest,
Hungary, H-1121). As imagens foram analisadas através do programa de visualização
Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest,
Hungary, H-1121) em diferentes amplitudes. Foi avaliada a intensidade do infiltrado
inflamatório em todos os espécimes. A partir da porção mais central dos GPs e da região
subepitelial dos CRs, em direção à periferia, foi avaliado 1 campo microscópico, sob aumento
total de 33,33x, o qual foi dividido em três terços. As lesões foram então classificadas da
seguinte forma: grau I (leve), infiltrado inflamatório restrito ao primeiro terço; grau II
(moderado), infiltrado inflamatório até o segundo terço; grau III (intenso), infiltrado
inflamatório até o terceiro terço, adaptado do estudo de Tsai et al. (2004). O revestimento
epitelial dos CRs foi avaliado adaptando-se o critério sugerido por Moreira et al. (2000), onde
CRs que apresentaram em sua maior extensão 2 a 10 camadas de células foram classificados
como atróficos e os que revelaram mais de 10 camadas de células foram classificados como
hiperplásicos.
Método imuno-histoquímico
As amostras selecionadas, fixadas em formol a 10% e incluídas em parafina foram
submetida a cortes de 3μm de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro
devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano,
16
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao
anticorpo primário anti-Bax (A3533, Dako Carpinteria, CA, USA) com uma diluição de
1:1000-overnight. Posteriormente, as amostras foram incubadas no sistema HI DEF (HRP,
Polymer System) de detecção. A diaminobenzidina (3,3-Diaminobenzidina, Sigma Chemical
Co, St. Louis, MO, USA) foi usada como cromógeno para revelação da reação e a contra-
coloração foi feita com hematoxilina de Mayer. Como controle positivo para os anticorpos
primário foram utilizados cortes de linfonodo. O controle negativo consistiu na substituição
do anticorpo primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.
Análise imuno-histoquímica
Para o estudo imuno-histoquímico, as lâminas preparadas foram escaneadas com
auxílio do equipamento Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege
M. str. Budapest, Hungary, H-1121). As imagens foram analisadas através do programa de
visualização Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str.
Budapest, Hungary, H-1121) num aumento de 80x. Foram selecionados 5 campos
consecutivos de cada caso (região subepietelial dos CRs e região central dos GPs). Após esta
etapa, foi contado o número total de linfócitos imunopositivos em cada campo, sendo gerada
uma mediana para cada caso, a qual foi usada para análise estatística. A contagem desses
linfócitos positivos foi realizada por um único examinador. Consideraram-se como os
linfócitos as células pequenas, com citoplasma escasso, agranular, com o núcleo esférico e
intensamente corado (Ross & PAWLINA, 2011). Após esta etapa, foi contado o número total
de linfócitos imunopositivos em cada campo com o auxílio do programa imageJ.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada no programa Statistical Package for the Social
Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago, USA). Ao constatar-se a ausência de normalidade
na distribuição da amostra, foi feita a comparação entre o número de células positivas para a
proteína Bax de acordo com o tipo de lesão (GPs ou CRs), intensidade do infiltrado
inflamatório (grau I/II ou grau III) e tipo de revestimento cístico (atrófico ou hiperplásico)
através do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Na busca por associação significativa
entre intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento cístico utilizou-se
também o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Para todos os testes, foi considerado um
nível de significância de 5% (p < 0,05).
17
RESULTADOS
Análise morfológica
A análise da intensidade do infiltrado inflamatório mostrou que dos 25 casos de GPs
72% (n=18) possuíam infiltrado grau III, enquanto que o grau II foi visto em 20% (n=5) e o
grau I em 8% (n=2) dos casos. Nos CRs, o infiltrado grau III foi visto em 56% (n=14) dos
casos, enquanto o grau II ocorreu em 20% (n=5) e o grau I em 24% (n=6). Em relação à
espessura do revestimento epitelial dos CRs, 52% (n=13) foram do tipo atrófico e 48% (n=12)
do tipo hiperplásico.
A análise da associação entre a intensidade do infiltrado inflamatório (I/II e III) e a
espessura do revestimento epitelial dos CRs (atrófico ou hiperplásico), mostrou ausência de
associação estatisticamente significativa entre essas duas variáveis (p=0,828).
Análise imuno-histoquímica
A análise da expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-Bax mostrou a presença
da proteína Bax em linfócitos de todos os casos de GPs (Fig. 1a) e CRs (Fig. 1b) analisados.
O numero médio de linfócitos Bax positivos foi de 30,06 (±17,4) com mínimo de 6 e máximo
de 97 células. Enquanto que a mediana da marcação para proteína Bax destas células foi 31,0
em GPs e 25,0 em CRs. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas
lesões em relação à quantificação da imunopositividade para a proteína Bax (p=0,236)
(Tabela 1) (Fig. 1c-d) (Fig. 2a).
A comparação entre o número de linfócitos Bax positivos em relação ao grau de
infiltrado inflamatório também mostrou ausência de diferença estatisticamente significativa
(p=0,169) (Tabela 1). A espessura do revestimento epitelial dos CRs também foi relacionada
ao número de linfócitos Bax positivos
(Fig. 1e-f). A mediana para lesões com epitélio atrófico
foi de 22,0 e para lesões com epitélio hiperplásico foi de 32,5, não sendo observada diferença
estatisticamente significativa para os linfócitos Bax
positivos
entre esses dois grupos
(p=0,186) (Tabela 1) (Fig. 2b).
Avaliando o número de linfócitos Bax
positivos e a intensidade do infiltrado
inflamatório dentro do grupo dos CRs não foi observada diferença estatisticamente
significativa (p=0,476) assim como no grupo dos granulomas (p=0,347).
18
DISCUSSÃO
As lesões periapicais se desenvolvem em resposta à infecção microbiana nos canais
radiculares. Após a necrose pulpar, micro-organismos estimulam a migração de células do
sistema imune para a região periapical, onde estas dão inicio a uma série de reações que
envolvem o recrutamento de outras células inflamatórias, liberação de citocinas pró-
inflamatórias e imunorreguladoras, além de quimiocinas (Brito et al. 2012, Aranha et al.
2013).
Tanto os linfócitos T quanto B são programados para responder a antígenos
específicos, mas nas lesões periapicais os linfócitos T se encontram em maior proporção
(Zizzi et al. 2012). Essas células são as principais responsáveis pela regulação da liberação de
citocinas na resposta imunológica. O subgrupo Th1dos linfócitos T CD4+ são os responsáveis
pela produção da IL-2, IFN- γ e indução de macrófagos, podendo participar de todas as etapas
da progressão da lesão periapical. Em contrapartida o subgrupo Th2 secreta IL-4, IL-5 e IL-
13, além de serem excelentes auxiliares para os linfócitos B na produção de anticorpos e
modulação da resposta sintomatológica e são encontrados principalmente em lesões crônicas
(Fraga et al. 2013). Além das células Th1 e Th2, as células Th17 desempenham papéis
críticos no desenvolvimento das lesões periapicais através da liberação de IL-6 e IL-23 que
atuam estimulando o desenvolvimento de osteoclastos participando consequentemente no
processo de reabsorção óssea, enquanto as células Treg suprem a formação dos osteoclastos
através da liberação de citocinas como TGF-β e IL-10 (Andrade et al. 2013, Araujo-Pires et
al. 2014, Yang et al. 2014). A função primária dos linfócitos T CD8+ é a detecção e
eliminação de células transformadas ou infectadas por vírus, esses linfócitos atuam na
atividade lítica por meio de dois mecanismos: através da liberação de grânulos e morte
dependente de um receptor, que é ativado pela interação entre CD95 (Fas), TNF-α ou TRAIL
e os ligantes presentes na superfície dos linfócitos CD8+ (Harari et al. 2009). A razão positiva
CD4/CD8 indica a natureza complexa da interação imunológica em cistos radiculares. Vários
fatores, como o tempo de duração da lesão podem influenciar na interação, o que permite uma
inversão desta razão (Zizzi et al. 2013).
Para limitar o dano aos tecidos saudáveis, vários mecanismos têm evoluído para
controlar a resposta imunológica, incluindo inativação celular e morte celular (Häcker et al.
2006), por exemplo após eliminação do antígeno em uma infecção, a maioria dos linfócitos T
morre por apoptose, enquanto alguns sobrevivem e se tornam células de memória (Suzuki et
19
al. 2005). Nas infecções periapicais, como as aqui estudadas, grande quantidade de células
inflamatórias são geradas em resposta aos antígenos microbianos, dentre estas células,
destacam-se os linfócitos T, então é de se esperar que o sistema imune utilize a apoptose
destas células imunes ativadas como forma de restaurar a homeostase de células T, prevenir
autoimunidade e imunopatologias, desempenhando um mecanismo importante no controle
numérico de linfócitos T específicos que são ativados massivamente em resposta a infecções
microbianas (Häcker et al. 2006, Tripath et al. 2013). Em relação a isto, estudos têm
demonstrado que a morte de linfócitos T ativados por antígenos durante o término da resposta
imune é iniciado pela proteína Bim, membro da família BCL-2 e também necessitam das
proteínas Bax e Bak, onde estas têm um papel essencial na execução da morte celular
(Strasser & Pellegrini 2004).
A progressão das lesões periapicais depende principalmente do equilíbrio entre a
morte e a sobrevivência das células que compõe o infiltrado inflamatório. Na apoptose ocorre
o encolhimento celular, condensação da cromatina nuclear e posteriormente a fragmentação
do DNA cromossômico, tendo assim, uma função importante na homeostase do tecido e na
patogênese das doenças inflamatórias (Suzuki et al. 2005, Lin et al. 2007, Martins et al. 2011,
Zhu et al. 2013). As duas principais vias para a apoptose são a via extrínseca e intrínseca. Na
via extrínseca, a apoptose celular é induzida através da ligação de alguns ligantes, tais como
Fas -FasL e TNF-α aos seus receptores (TNFR1 / 2). Na via intrínseca, a indução da apoptose
ocorre nas mitocôndrias, em conjunto com o grupo de proteínas da família Bcl-2. Esta família
consiste de um grupo de proteínas pro-apoptóticas, como a Bax, Bak entre outras e por
proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-2, Bcl-xL e outras. Como resultado da indução da morte
celular programada, tanto na via extrínseca e intrínseca, a fase de execução do presente
processo é iniciada, com uma cascata de enzimas denominadas caspases. Isto leva à
fragmentação da membrana da célula e a formação de corpos apoptóticos, que são,
posteriormente, eliminadas por células fagocíticas (Eder et al. 2013).
Alguns trabalhos tem mostrado um papel dominante da via mitocondrial na apoptose,
mediada por membros da família Bcl-2, na regulação da morte dos linfócitos T ativados
(Suzuki et al 2005, Martins et al 2011, Tripathi et al. 2013, Precone et al. 2013).
Este estudo investigou a presença da proteína Bax em linfócitos na patogênese de GPs
e CRs, uma vez que essas são importantes células envolvidas na defesa contra micro-
organismos e que são encontradas em grande quantidade nestas lesões. Na análise da
expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-Bax verificou-se a presença da proteína Bax
em linfócitos de todos os casos de GPs e CRs analisados no infiltrado inflamatório. Segundo
20
Brito et al, (2012), a presença de bactérias no canal radicular induz a apoptose dos linfócitos
T através do receptor p55, isto pode explicar a imunomarcação para proteína Bax nos
linfócitos detectada nos casos de GP e CR analisados neste estudo, o que também pode ser
corroborado pelos achados de Precone et al. (2013), os quais afirmaram que a apoptose regula
a resposta dos leucócitos durante as infecções bacterianas e estes autores demonstraram que
existe a ativação de vias pró-apoptóticas em linfócitos, mas não em granulócitos de pacientes
cirróticos com infecção bacteriana.
Nos GPs foi encontrado um maior número de linfócitos positivos quando comparado
ao CRs, porém sem diferença estatisticamente significativa (p=0,236). Este fato, talvez possa
ser explicado pela maior quantidade de infiltrado inflamatório verificado nos GP, uma vez
que a análise da intensidade do infiltrado inflamatório mostrou que 92% (n=23) possuíam
infiltrado grau II/III e nos CRs, o infiltrado grau II/III foi visto em apenas 76% (n=19) dos
casos e, além disto, 24% (6 casos) exibiram infiltrado Grau I.
Tekkeşin et al. (2012) avaliando o papel da proteína Bcl-2, Bax e Ki-67 no
revestimento epitelial e nas células do tecido conjuntivo de ceratocistos, cistos radiculares e
amesloblastomas, verificaram baixa expressão da Bcl-2 tanto no revestimento epitelial como
em células do tecido conjuntivo dos CRs, enquanto que no ceratocisto e ameloblastoma
visualizou-se uma alta expressão dessa proteína. Quando avaliaram a Bax viram que das três
lesões essa proteína estava em maior quantidade no revestimento epitelial dos cistos
radiculares o que implica no aumento da atividade apoptótica no epitélio em comparação às
outas lesões. Em contrapartida, nas células do tecido conjuntivo, a imunoexpressão da
proteína Bax foi muito baixa nos três grupos.
Na análise da espessura do revestimento epitelial dos CRs verificou-se que nas lesões
com epitélio hiperplásico houve uma maior quantidade de linfócitos Bax positivos quando
comparado ao atrófico, porém não houve diferença estatisticamente significativa entre esses
dois grupos (p=0,186). Como também não houve diferença estatística na intensidade do
infiltrado inflamatório entre lesões hiperplásicas e atróficas, pode-se sugerir que em epitélios
císticos hiperplásicos, encontra-se uma maior quantidade de linfócitos em apoptose, o que
pode denotar um ambiente de maior atividade de citocinas pró-inflamatórias como relatado na
literatura (Andrade et al. 2013), as quais levariam a uma maior proliferação do epitélio cístico
e também maior número de linfócitos ativados e, consequentemente, um maior disparo dos
processos de apoptose destes linfócitos. Em relação a isto, Martins et al. (2011), verificaram
em seu estudo que a apoptose foi mais evidente no epitélio de cisto radicular hiperplásico,
provavelmente como um mecanismo para regular a proliferação das células epiteliais basais
21
estimuladas pela concentração aumentada de infiltrado inflamatório na capsula de tecido
conjuntivo adjacente, sugerindo que o aumento da inflamação reflete no aumento da apoptose
de células epiteliais em periodontites periapicais.
Além desses resultados, viu-se também nesse estudo que a presença da proteína Bax
foi maior no infiltrado inflamatório grau III, mas que não foi observada diferença
estatisticamente significativa (p=0,476) entre os grupos grau I/II e III. Suzuki et al. (2005)
avaliando o processo de apoptose em cistos radiculares e cistos residuais viram a presença da
proteína Bax e Bcl-2 em células basais do epitélio de ambas as lesões. Estes autores
verificaram que nos CRs com infiltrado inflamatório intenso houve uma maior presença da
proteína Bax e menor de Bcl-2 do que CRs com infiltrado inflamatório leve, sugerindo dessa
forma, que essas proteínas regulam a apoptose e assim contribuem para proliferação e morte
celular de células do revestimento epitelial de lesões periapicais inflamatórias, além disso, os
autores também afirmam que a ação dos membros da família Bcl-2 é afetada pelo processo
inflamatório destas lesões.
22
CONCLUSÃO
Diante dos resultados encontrados e dos dados encontrados na literatura acredita-se
que a imunoexpressão da proteína Bax em linfócitos tanto nos GPs quanto nos CRs está
implicada no processo de apoptose de linfócitos ativados em resposta à estimulação
antigênica frequente nestas lesões periapicais e que este mecanismo é de suma importância,
tanto para limitar o dano aos tecidos saudáveis causados por estes linfócitos ativados e suas
citocinas liberadas, quanto para restaurar a homeostase do sistema imunológico no local das
lesões.
23
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27
Tabela 1- Avaliação das diferenças do numero de células Bax+ em granulomas periapicais e
cistos radiculares e suas diferenças em relação ao tipo de lesão, grau do infiltrado inflamatório
e espessura epitelial dos cistos radiculares.
Variável n Media Mediana Q25-Q75 Ranks p
Lesão
Granuloma periapical 25 34,1 31,0 18,0-38,0 27,9 0,236
Cisto radicular 25 25,6 25,0 15,5-36,5 23,1
Infiltrado inflamatório
Grau I/II 18 24,6 24,5 9,7-36,5 21,7 0,169
Grau III 32 33,1 31,5 18,5-37,7 27,6
Revestimento Epitelial
Atrófico 13 22,4 22,0 15,5-26,5 11,1 0,186
Hiperplásico 12 29,7 32,5 16,0-39,2 15,1
28
Figura 1 Imunoexpressão de Bax em lesões periapicais: a. Fotomicrografia exibindo visão
geral de GP; b. Fotomicrografia exibindo visão geral de CR; c. Fotomicrografia exibindo
imunoexpressão de Bax no infiltrado inflamatório intenso; d. Fotomicrografia exibindo
imunoexpressão de Bax moderado; e. Associação do infiltrado inflamatório com o epitélio
atrófico de CR; f. Associação do infiltrado inflamatório com o epitélio hiperplásico em CR.
(Pannoramic Viewer 1.15.2).
29
Figura 2a: Box plot do número de linfócitos imunopositivos para a proteína Bax no CR
e GP.
30
Figura 2b: Box plot da associação do número de linfócitos imunopositivos para proteína
Bax em relação à espessura do epitélio nos CRs.
31
ANEXO 1
32
33
34
ANEXO 2
REVISTA
INTERNATIONAL ENDODONTIC JOURNAL
Edited By: PMH Dummer
Impact Factor: 2.971
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clearly explained. Titles and abstracts especially should be written in language that will be
readily intelligible to any scientist.
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35
Structure
All manuscripts submitted to International Endodontic Journal should include Title Page,
Abstract, Main Text, References and Acknowledgements, Tables, Figures and Figure Legends
as appropriate
Title Page: The title page should bear: (i) Title, which should be concise as well as
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more than 30 letters and spaces); (v) No more than six keywords (in alphabetical order); (vi)
Name, full postal address, telephone, fax number and e-mail address of author responsible for
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Abstract for Original Scientific Articles should be no more than 250 words giving details of
what was done using the following structure:
• Aim: Give a clear statement of the main aim of the study and the main hypothesis tested, if
any.
• Methodology: Describe the methods adopted including, as appropriate, the design of the
study, the setting, entry requirements for subjects, use of materials, outcome measures and
statistical tests.
• Results: Give the main results of the study, including the outcome of any statistical analysis.
• Conclusions: State the primary conclusions of the study and their implications. Suggest
areas for further research, if appropriate.
Main Text of Original Scientific Article should include Introduction, Materials and
Methods, Results, Discussion and Conclusion
Introduction: should be focused, outlining the historical or logical origins of the study and
gaps in knowledge. Exhaustive literature reviews are not appropriate. It should close with the
explicit statement of the specific aims of the investigation, or hypothesis to be tested.
Material and Methods: must contain sufficient detail such that, in combination with the
references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully reproduced.
Clinical Trials should be reported using the CONSORT guidelines available
at www.consort-statement.org. A CONSORT checklist and flow diagram (as a Figure)
should also be included in the submission material.
Experimental Subjects: experimentation involving human subjects will only be published
if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including
the World Medical Association Declaration of Helsinki (version 2008) and the additional
requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts
36
must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the
understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned
principles. A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed
and approved by an ethical board should also be included. Editors reserve the right to reject
papers if there are doubts as to whether appropriate procedures have been used.
When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that
adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be
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(NIH) in the USA regarding the care and use of animals for experimental procedures or
with the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC)
and in accordance with local laws and regulations.
All studies using human or animal subjects should include an explicit statement in the
Material and Methods section identifying the review and ethics committee approval for each
study, if applicable. Editors reserve the right to reject papers if there is doubt as to whether
appropriate procedures have been used.
Suppliers: Suppliers of materials should be named and their location (Company, town/city,
state, country) included.
Results: should present the observations with minimal reference to earlier literature or to
possible interpretations. Data should not be duplicated in Tables and Figures.
Discussion: may usefully start with a brief summary of the major findings, but repetition of
parts of the abstract or of the results section should be avoided. The Discussion section should
progress with a review of the methodology before discussing the results in light of previous
work in the field. The Discussion should end with a brief conclusion and a comment on the
potential clinical relevance of the findings. Statements and interpretation of the data should be
appropriately supported by original references.
Conclusion: should contain a summary of the findings.
References
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(v) Volume number (bold) followed by a comma (,)
(vi) First and last pages
Examples of correct forms of reference follow:
Standard journal article
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Corporate author
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Tables, Figures and Figure Legends
Tables: Tables should be double-spaced with no vertical rulings, with a single bold ruling
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In general, multi-part figures should be arranged as they would appear in the final version.
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tables or histograms, for instance, can generally be stated briefly in the text instead. Figures
should not contain more than one panel unless the parts are logically connected; each panel of
39
a multipart figure should be sized so that the whole figure can be reduced by the same amount
and reproduced on the printed page at the smallest size at which essential details are visible.
Figures should be on a white background, and should avoid excessive boxing, unnecessary
colour, shading and/or decorative effects (e.g. 3-dimensional skyscraper histograms) and
highly pixelated computer drawings. The vertical axis of histograms should not be truncated
to exaggerate small differences. The line spacing should be wide enough to remain clear on
reduction to the minimum acceptable printed size.
Figures divided into parts should be labelled with a lower-case, boldface, roman letter, a, b,
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the number and the unit, and follow SI nomenclature or the nomenclature common to a
particular field. Thousands should be separated by a thin space (1 000). Unusual units or
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Figure legends: Figure legends should begin with a brief title for the whole figure and
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