vjezba 1-replikacija dnk
Post on 17-Feb-2015
130 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
1
Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
Priprema za vježbu:
1. Ponovite koje su razlike u građi DNK i RNK.
Bez obzira na izuzetan tehnološki napredak, nijedna mašina sastavljena
ljudskom rukom nije tako savršeno organizovana, niti tako besprijekorno funkcioniše
kao organizmi u prirodi. Informacije za to savršenstvo sadržane su u njihovoj
genetičkoj strukturi, a realizacija tih infromacija teče kroz niz istovremenih i/ili
sukcesivnih reakcija, s mnoštvom kontrolnih mehanizama. Tokom vježbi iz predmeta
„Molekularna biologija“ napravićemo kratak pregled puta prijenosa genetičke info-
rmacije od razine nukleinske kiseline, pa do njene realizacije na proteinskom nivou.
UVOD
Život kakvog ga poznajemo određen je genomima bezbrojnih organizama s
kojima dijelimo planetu. Svaki organizam posjeduje genom koji sadrži biološku
informaciju potrebnu za izgradnju i održavanje života. Većina genoma, uključujući
ljudski genom i genome drugih ćelijskih organizama, građena je od DNK
(dezoksiribonukleinska kiselina), mada neki virusi imaju RNK (ribonukleinska
kiselina) genome. DNK i RNK su polimerne molekule građene od lanaca
monomernih podjedinica, označenih kao nukleotidi.
Ljudski genom, tipični genom svih višećelijskih životinja, građen je od dva
dijela:
Nuklearni genom sadrži otprilike 3 200 000 000 nukleotida DNK, podijeljenih
u 24 linearne molekule, najkraća duga 50 000 000 nukleotida, a najduža 260
000 000 nukleotida, svaka sadržana u različitom hromosomu. Od ovih 24
hromosoma, 22 su autosomna, a dva polna hromosoma, X i Y.
Mitohondrijalni genom je cirkularna DNK molekula, građena od 16 569
nukleotida, čije su multiple kopije locirane u organelama za proizvodnju
energije – mitohondrijama.
Svaka od otprilike 1013
ćelija u tijelu odraslog čovjeka ima svoju kopiju ili
kopije genoma, s izuzetkom nekoliko vrsta ćelija poput eritrocita koji nemaju nukleus
u svom zrelom, diferenciranom stanju. Velika većina ćelija su diploidne i stoga imaju
dvije kopije svakog autosomnog hromosoma, plus dva polna hromosoma, XX za
ženski ili XY za muški spol – ukupno 46 hromosoma. Ove ćelije nazivaju se tjelesnim
(somatskim), nasuprot polnim ćelijama ili gametima, koje su haploidne i imaju samo
23 hromosoma (jedna kopija svakog autosomnog hromosoma plus jedan polni
hromosom). Oba tipa ćelija imaju oko 8000 kopija mitohondrijalnog genoma, oko 10
u svakom mitohondriju.
STRUKTURA DNK
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
2
Imena James Watsona i Francis Cricka su tako blisko povezana s DNK da se
lako zaboravlja da je, kada su počeli saradnju u Cambridge, Engleska, oktobra 1951.
godine, detaljna struktura DNK polimera već bila poznata. Njihov doprinos nije bio
odrediti strukturu DNK per se, već pokazati da se u živoj ćeliji dva DNK lanca
isprepliću i formiraju dvostruki heliks.
Struktura DNK molekule danas je općepoznata stvar, stoga se nećemo ovdje
detaljno baviti time. Na slici 1.1 dat je shematski prikaz građe dijela jednog lanca
DNK, a na slici 1.2 građa četiri baze koje ulaze u njen sastav.
Adenin (A) Citozin (C) Guanin (G) Timin (T)
STRUKTURA RNK
RNK je također polinukleotid, ali se unekoliko razlikuje u odnosu na DNK
(Slika 3). Prvo, šećer u RNK nukleotidu je riboza i, drugo, RNK sadrži uracil umjesto
timina. I RNK polinukleotidi sadrže 3'-5' fosfodiesterske veze, ali su ovdje te veze
manje stabilne nego u DNK polinukleotidu. Razlog tome je indirektan efekat
Slika 1.1 (lijevo): Shematski prikaz
građe dijela DNK polinukleotida, sa
strukturom fosfodiesterske veze
Slika 1.2 (dole): Četiri baze
koje se javljaju u DNK
molekuli
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
3
hidroksilne grupe na 2' poziciji šećera. Ovo bi mogao biti razlog zašto biološke
funkcije RNK ne zahtjevaju polinukleotid duži od nekoliko hiljada nukleotida.
(A) Ribonukleotid
(B) Uracil(A) Ribonukle otid
(B) Ura cil
Osnovne osobine dvostrukog heliksa
Otkriće dvostrukog heliksa (zavojnice) od strane Watson i Cricka, u subotu 07.
marta 1953. godine, predstavlja najvažnije otkriće u biologiji tokom 20. stoljeća.
Dvostruki heliks DNK je desno-zavojni. To znači da, kad bi heliks bio stepenište,
rukohvat na vanjskoj strani stepeništa bio bi s desne strane. Dva lanca idu u suprotnim
smjerovima. Heliks je stabiliziran dvjema tipovima hemijskih interakcija:
Uparivanje baza između dva lanca uključuje stvaranje vodikovih veza između
adenina na jednom lancu i timina na drugom, ili između citozina i guanina.
Ove veze su duže i mnogo slabije u odnosu na kovalentni tip veze. AT i GC
parovi su jedini prihvatljivi parovi, dijelom zbog geometrije nukleotidnih baza
i relativne pozicije grupe koja može učestvovati u vodikovoj vezi, i dijelom
zbog toga da uparivanje mora ići između purina i pirimidina; purin-purin par
bi bio prevelik za heliks, dok bi pirimidin-pirimidin par bio premali.
Uvezivanje baza, ponekad označeno kao π - π interakcija, uključuje
hidrofobne interakcije između susjednih baznih parova i dodaje na stabilnosti
dvostrukom heliksu, kad je već heliks formiran uparivanjem komplementarnih
baza. Do ovih hidrofobnih interakcija dolazi zbog strukture vode bazirane na
vodikovim vezama, koja gura hidrofobne grupe u unutrašnje dijelove
molekule.
Oba ova tipa interakcija su važna u očuvanju stabilnosti molekule, no uparivanje
komplementarnih baza dobiva na značaju zbog svojih bioloških implikacija.
Ograničenje da se A može upariti samo s T, a G sa C, znači da DNK replikacija može
rezultirati savršenim kopijama roditeljske molekule putem jednostavnog manevra
korištenja sekvence već postojećeg lanca da bi se diktirala sekvenca novog lanca. Ovo
je matrica-ovisna sinteza DNK i predstavlja sistem koji koriste sve ćelijske DNK
polimeraze. Analog ovog procesa, matrica-ovisna sinteza RNK, koriste RNK
polimeraze u sintezi RNK kopija gena. Ove kopije čuvaju biološku informaciju
Slika 1.3: A) Shematski prikaz građe ribonukleotida; B) Građa uracila
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
4
sadržanu u sekvenci genomske DNK molekule. Jedina razlika između sinteze DNK i
RNK je u tome što se, pri sintezi RNK, adenini u DNK matrici ne vežu s timinima u
RNK kopiji. To je stoga što RNK ne sadrži timin; umjesto toga adenin se uparuje s
uracilom u DNK-RNK hibridima i u dvolančanim RNK strukturama.
REPLIKACIJA DNK
Sposobnost autoreplikacije osobina je koja odlikuje DNK nad svim ostalim
makromolekulama. Ovaj proces leži u osnovi svih drugih bioloških procesa u
organizmu i preduslov je za rast i razvoj organizma.
Replikacija DNK odvija se prije svake ćelijske diobe i omogućava kasniju
podjelu svakog hromosoma na dvije hromatide. U ovoj vježbi pokušaćemo da
razjasnimo misteriju faza replikacije DNK kod eukariota (replikacija kod prokariota
biće objašnjena tokom termina praktične nastave).
Prva važna etapa u replikaciji DNK jeste pucanje vodikovih veza između dviju
baza antiparalelnih lanaca. Odmatanje
dvaju lanaca predstavlja polaznu tačku.
Razdvajanje se događa u mjestima na
lanacima koja su bogata A-T. To je zato
što postoje samo dvije veze između
adenina i timina (tri su vodikove veze
između citozina i guanina). Helikaza je
enzim koji razdvaja dva lanca.
Inicijacijska tačka gdje razdvajanje
lanaca počinje zove se "ishodište
replikacije". Strukturu koja nastane
nazivamo "replikacijska viljuška"
(Slika 1.4).
Slika 1.4: Replikacijska viljuška
Jedan od najvažnijih koraka u replikaciji
DNK jeste vezivanje RNK primaze na
inicijacijsku tačku na roditeljskom 3'-5' lancu.
RNK primaza vezuje RNK nukleotide za 3'-5'
DNK lanac po principu komplementarnosti
(Slika 1.5). RNK nukleotidi predstavljaju
prajmer (početnicu, klicu) za vezivanje DNK
nukleotida.
Slika 1.5: Vezivanje RNK
prajmera za DNK
lanac
Helikaza
RNK prajmer
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
5
DNK polimeraze su enzimi koji imaju ključnu ulogu u replikaciji. U
eukariotskim ćelijama nalazi se najmanje 5 vrsta ovih enzima koje su označene kao
DNK polimeraze a (alfa), b (beta), g (gama), d (delta) i e (epsilon), pri čemu je
najvažnija DNK-poly d. DNK polimeraza d u 5’- 3’ pravcu povezuje nukleotide
novog lanca fosfodiesterskim vezama, pošto su se oni postavili komplementarno
(A=T, C≡G) nukleotidima starog (roditeljskog) lanca.
Proces elongacije DNK lanca odvija se drugačije na 5'-3' i 3'-5' DNK matrici
(kalupu). Novonastajući lanac koji za svoju sintezu koristi 5'-3' matricu naziva se
vodeći lanac zato što DNK polimeraza delta može da „čita“ matricu i kontinuirano,
bez prekida dodaje nove nukleotide komplementarno onima koji se nalaze na matrici
(npr. adenin nasuprot timinu).
Novonastajući lanac koji za svoju sintezu koristi 3'-5' matricu naziva se
zaostajući lanac (Slika 1.6). Obzirom da je orijentacija 3'-5' DNK matrice suprotna
radnoj orijentaciji DNK polimeraze epsilon, elongacija zaostajućeg lanca je
komplikovanija od sinteze vodećeg lanca. U zaostajućem lancu, primaza dodaje
nekoliko RNK prajmera, koji su neophodni kako bi se DNK polimeraza vezala za
njihov 3' kraj. Nadovezujući se na ove prajmere, DNK polimeraza e „čita“ matricu i
dodaje komplementarne DNK nukleotide. Fragmenti koji nastaju na ovaj način
nazivaju se Okazaki fragmenti (Slika 1.7).
Slika 1.6: Vodeći i zaostajući lanci Slika 1.7: Okazaki fragmenti
DNK polimeraza d koja, pored sintetske aktivnosti, posjeduje i 5'-3' egzo-
nukleaznu aktivnost, uklanja RNK prajmere (Slika 1.8) i zamjenjuje ih sa DNK nukle-
otidima (to je neophodno obzirom da DNK i RNK imaju unekoliko različite nukle-
otide; timin-uracil). Konačno, nastali Okazaki fragmenti bivaju spojeni radom enzima
ligaze (dodaje nedostajući fosfat u prazninu u fosfatno-šećernom skeletu DNK).
Vodeći lanac
Zaostajući lanac
Vodeći lanac
Zaostajući lanac
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
6
Po završenoj replikaciji, svaki
novonastali dvostruki DNK heliks
sastoji se od jednog starog i jednog
novog lanca. Zbog toga se za
autoreplikaciju DNK kaže da je
semikonzervativna.
Slika 1.8: Uklanjanje RNK prajmera (izvor 1.4-1.8: www.dnareplication.info)
Posljednji korak u replikaciji DNK jeste terminacija. Ovaj proces se dešava
kada DNK polimeraza dođe do kraja lanaca. Jasno je da u posljednjoj sekciji u
zaostajućem lancu, nakon uklanjanja RNK prajmera, nije moguće da DNK polimeraza
popuni prazninu (obzirom da nema prajmera). Stoga se kraj roditeljskog lanca gdje je
vezan posljednji prajmer ne replicira. Ovi krajevi linearne (hromosomske) DNK se
sastoje od nekodirajućih regiona sa ponavljajućim sekvencama i nazivaju se telomere.
Kao rezultat toga, dio telomere se uklanja prilikom svake replikacije.
Autoreplikacija DNK nije gotova dok reparacijski mehanizmi ne poprave
moguće greške nastale tokom replikacije. Enzimi tipa nukleaza uklanjaju pogrešno
sparene nukleotide, a DNK polimeraza popunjava prazninu komplementarnim
nukleotidom.
Literatura:
Dennis, P.P., Bremer, H. (1974). Differential rate of ribosomal protein synthesis in
Escherichia coli B/r. Journal of Molecular Biology 84, 407–422.
Izban, M.G., Luse, D.S. (1992). Factor-stimulated RNA polymerase II transcribes at
physiological elongation rates on naked DNA but very poorly on chromatin templates.
Journal of Biological Chemistry 267, 13647–13655
Lewin B. (2008). Genes IX. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts
http://www.johnkyrk.com/
Zadaci:
1. Pažljivo pratite prezentaciju koja prati ovu vježbu. Zabilježite u svesku detalje
koji nisu obrađeni u tekstu.
Uklonjeni prajmeri
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
7
DODATAK:
Escherichia coli ima pet DNK polimeraza
Enzim Gen Funkcija
I polA Glavni reparacijski enzim
II polB Ponavljanje replikacije
III polC Replikaza
IV dinB Translezijska replikacija
V umuD' 2C Translezijska replikacija
DNK polimeraza eukariota vrši replikaciju ili reparaciju
DNK polimeraza Funkcija Struktura
Visoko pouzdane replikaze
Αlfa Nuklearna replikacija 350 kD tetramer
Delta Nuklearna replikacija 250 kD tetramer
Epsilon Nuklearna replikacija 350 kD tetramer
Gama Mitohondrijalna replikacija 200 kD dimer
Visoko pouzdani popravak
Beta Popravak isjecanjem baza 39 kD monomer
Slabo pouzdani popravak
Ksi Popravak timinskih dimera Heteromer
Eta Popravak oštećenih baza Monomer
Jota Potreban u mejozi Monomer
Kappa Delecije i substitucije baza Monomer
Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK
8
Autor: Mariana Ruiz (slika reprodukovana uz dopuštenje autora)
Sažetak DNK replikacije. Dvostruka uzvojnica se odmotava radom helikaze i topoizomeraze. Potom, jedna DNK polimeraza
sintetizira kopiju vodećeg lanca (engl. leading strand). Druga DNK polimeraza se vezuje za zaostajući lanac (engl. lagging
strand). Ovaj enzim sintetizira diskontinuirane segmente (koji se nazivaju Okazaki fragmenti) prije nego ih spoji DNK ligaza.
top related