weichteilsubstitution mit hilfe von injizierten
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Weichteilsubstitution mit Hilfe von injizierten
Präadipozyten-Fibrinkonstrukten
Aus der chirurgischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs Universität Freiburg Abt. Plastische und Handchirurgie
Ärztlicher Direktor: Univ. Prof. Dr. G. B. Stark
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen
Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs Universität
vorgelegt 2007 von Niklas Thomas Baerlecken
geboren in Freiburg im Breisgau
II
Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Prüfer: Prof. Dr. med. Jörg Borges 2. Prüfer: PD. Dr. med. Nadir Ghanem
Jahr der Promotion: 2007
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1
1.1. Weichteilgewebssubstitution 1 1.1.1 Indikation 1 1.1.2 Therapie 21.2. Tissue Engineering 41.3. Fettaugmentation 5 1.3.1 Geschichte 5 1.3.2 Klinik 61.4. Fettgewebe 8 1.4.1 Reifes Fettgewebe 8 1.4.2 Präadipozyten 101.5. Angiogenese 121.6. Zellmatrix 141.7. Fragestellung 15
2. Material und Methoden 18
2.1 Zellkultur 18 2.1.1. Präadipozyten-Isolation 18 2.1.2. CASY-Zellmessung 20 2.1.3. Kultivierung und Passagierung von Präadipozyten 20 2.1.4. Präadipozyten-Differenzierung 21
2.1.5. Isolation human dermal mikrovaskulärer Endothelzellen (HDMVEC)
22
2.1.6. Kultivierung und Passagierung von HDMVEC 23 2.1.7. HDMVEC Sphäroid-Kulturen 23 2.1.8. Isolation von Fibroblasten 24 2.1.9. Kultivierung und Passagierung von Fibroblasten 25 2.1.10. Kryokonservierung von Zellen 26 2.1.11. Auftauen kryokonservierter Zellen 262.2. Histologie 27 2.2.1. Doppelfärbung Hämalaun-Eosin (HE) 27 2.2.2. Oilred-O-Färbung 27 2.2.3. Sudanrot-IV-Färbung 29 2.2.4. Elastica-von Giesson 30 2.2.5. Immunhistochemie 31 2.2.6. Vitalitätsfärbung YoYo 32 2.2.7. In situ Zellproliferationskit, BrdU 32 2.2.8. Gewebeeinbettung und histologische Aufarbeitung 33 2.2.8.1. Kryo-Einbettung 33 2.2.8.2. Paraffin-Einbettung 342.3. Langzeittierversuch 35 2.3.1. Athymische Nacktmaus 35 2.3.1.1. Versuchstiere 35 2.3.1.2. Fibrin 36 2.3.1.3. Transplantation von Zell-Matrix-Konstrukten 37 2.3.1.4. Tätowierung 38 2.3.1.5. Biopsieentnahme 38 2.3.2. Auswertung 39 2.3.2.1. Bewertung der explantierten Proben 39
I
2.3.2.2. Histomorphometrie 40 2.3.3. Magnetresonanztomographie 412.4. Tierversuchsaufbau 422.5. Photographien 432.6. Materialien 44 2.6.1. Gerätschaften 44 2.6.2. Verbrauchsmaterialien 44
3. Ergebnisse 45
3.1. Isolation, Kultivierung, Implantation und Explantation 453.2. Ergebnisse der Versuchsgruppen 46 3.2.1. Gruppe 1: 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin 46 3.2.2. Gruppe 2: 5 Mill. Fibroblasten in 1 ml Fibrin 53
3.2.3 Gruppe 3: 5 Mill. Präadipozyten mit 1 Mill. koimplantierten HDMVEC als Sphäroide in 1 ml Fibrin
58
3.2.4. Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin
63
3.2.5 Gruppe 5: 30 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin 65 3.2.6. Gruppe 6: 1 ml Fibrin ohne Zellen 673.3. Vergleich der Gruppe 1 mit den anderen Gruppen 68 3.3.1. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 2 68 3.3.2. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 3 69 3.3.3. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 4 71 3.3.4. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 5 72
4. Diskussion 74
4.1. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 744.2 Der Aussagewert des Tiermodells 744.3. Präadipozyten und Fibroblasten 75
4.3.1. Potenzial der Präadipozyten im Vergleich zu Fibroblasten für Weichteilgewebesubstitution
75
4.3.2. Vergleich mit anderen Transplantationen von Präadipozyten 77 4.3.3. Fibroblasten als Weichteilsubstitut in anderen Arbeitsgruppen 794.4. Präadipozyten und Angiogenese 80
4.4.1. Effekt der Koimplantation von HDMVECs als Sphäroide und Präadipozyten
80
4.4.2. Weitere Verfahren zur Angiogenese von Weichteilgewebesubstituten
81
4.5. Mehrfachinjektion 834.6. Zusammenspiel von Fibrin- und Präadipozytenkonzentration 84
4.6.1. Der Effekt einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten auf die Persistenz und Steigerung des Volumens
84
4.6.2. Senkung des Fibrins im Verhältnis zu den Präadipozyten 854.7. Aussichten 85 4.7.1. Dermolipektomien und Liposuktionen 85 4.7.2. Spender- und Empfängerregion 86 4.7.3. Einfluß der Kryokonservierung auf die Präadipozyten 87 4.7.4. Übernahme von Techniken aus dem autologen Fetttransfer 874.8. Stellung der vorliegenden Arbeit innerhalb des „Tissue Engineering“ 87
5. Zusammenfassung 89
II
6. Literaturverzeichnis 90
7. Curriculum vitae 99
8. Danksagung 101
9. Veröffentlichungen 102
9.1. Orginalarbeiten 1029.2. Kongressbeiträge 1029.3. Publizierte Abstracts 103
10. Erklärung über die Beteiligung Dritter 104
III
Abkürzungsverzeichnis In Text verwendete Abkürzungen können in der folgenden alphabetischen Auflistung nachgeschlagen werden. Abkürzung Volltext
Abb. Abbildung Aq. bidest. Aqua bidestillata; destilliertes Wasser Aq. deion. Aqua deionisata; deionisiertes Wasser bFGF basic Fibroblast Growth Factor CAM Chorioallantois-Membran DMEM Dulbecco´s Modified Eagle S Medium DMSO Dimethylsulphoxid ECBM Endothelial Cell Basal Medium ECGM Endothelial Cell Growth Medium EGF Epidermal Growth Factor et al. et alteri, und andere (Mitarbeiter) EZM Extrazelluläre Matrix FBS Fetal Bovine Serum; fötales Rinderserum FCS Fetal Calf Serum: fötales Kälberserum Flt-1 FMS-like tyosine kinase-1 GM-CSF Granulocytes-Monocytes-Colony Stimulating Factor HDMVEC Humane Dermale Mikrovaskuläre Endothelzellen HE Hämalaun-Eosin HSA Humanes Serumalbumin K.I.E Kallikrein Inhibierende Einheiten I.E. Internationale Einheiten IGF-1 Insulin-like-Growth-Factor-1
MRT Magnetresonanztomographie PBS phosphate buffer solution PDGF Platelet-derived Growth Factor PGA-PLLA Polyglycolic acid poly-L-lactic acid matrix RGD R-Arginin-Glycin-D-Asparagin pH pH-Wert, pondus hydrogenii; negativer dekadischer Logarithmus
der Wasserstoffionenkonzentration PLGA Poly-(lactic-co-glycolic)-acid; Copolymer Präad Präadipozyten p.t. post transplantationem; nach erfolgter Transplantation Tab. Tabelle VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Vergr. Vergrößerung ZMK Zell-Matrix-Konstrukt
IV
1. Einleitung
1.1. Weichteilgewebssubstitution
1.1.1 Indikation Der Ersatz von Weichteilgewebe spielt in der plastischen und rekonstruktiven
Chirurgie eine wesentliche Rolle. Sowohl angeborene als auch erworbene
Weichteilgewebsdefekte können einer Therapie bedürfen. Zu den angeborenen
Weichteilgewebsdefekten zählen u.a. die angeborene Mammahypoplasie, das
Polland-Syndrom, ein einseitiger Fehlbildungskomplex von Brustdrüse, Brustmuskel,
Haut und Anhangsgebilde mit evtl. Mitbeteiligung von Rippen- und
Handfehlbildungen sowie die Hemiatrophia faciei progressiva (Fokin 2002; Finch
2003; Sadove 2005). Die erworbenen Weichteilgewebsdefekte sind weitaus
vielfältiger. Hier lassen sich traumatische, postoperative, autoimmunreaktive,
medikamentöse, infektiöse und sonstige Ursachen unterscheiden. Infolge eines
Traumas kann z.B. durch Nervenläsion Gewebe atrophieren. Postoperative
Weichteilgewebsverluste entstehen beispielsweise nach Mastektomie bei
Mammakarzinom. Zu den Autoimmunerkrankungen mit Weichteilgewebedefekt
gehören insbesondere Kollagenosen wie Sclerodermia en coup de sabre.
Medikamentöse Ursachen sind zu finden bei HIV-Erkrankten mit High Active Anti-
Retroviral Therapy (HAART)-Assoziation. Diese HIV-Kombinationstherapie aus
Nukleosidalen, nukleotidalen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, nichtnukleotidalen
Reverse-Transkriptase-Inhibitoren sowie Protease-Inhibitoren kann Lipohypotrophien
im Gesicht und an den Extremitäten verursachen. Ansonsten sind noch verschiedene
Pannikulitiden zu nennen, welche durch Entzündungen und Einschmelzungen des
Unterhautfettgewebes gekennzeichnet sind.
Ein weiteres Feld für die Weichteilgewebssubstitution bietet sich in der kosmetischen
Chirurgie. Hier kann die Weichteilgewebsersatz bei der Beseitigung von
eingezogenen Narben, Altersfalten sowie zur Augmentation im Nasolabial-, Lippen-,
Glabella-, Wangen-, Stirn-, Kinn- und Handrückenbereich eingesetzt werden
(Goodstein 1996; Cortese 2000; Hernandez-Perez 2001; Ramirez 2001).
1.1.2 Therapie Plastisch-chirurgische Standardtherapie sind lokalregionale und freie mikrovaskuläre
Lappenplastiken sowie die Transplantation autologen Gewebes ohne
mikrovaskulären Gefäßanschluss. Bei Lappenplastiken entsteht stets ein Hebedefekt
sowie intra- und postoperative Risiken, die zur Infektion, Wundheilungsstörung,
Narbenbildung und bis zum vollständigen Lappenverlust führen können.
Beispielsweise treten bei dem unter den Lappen am häufigsten für die
Brustaugmentation verwendeten freien transversen rectus abdominis
muskulokutanen (TRAM) und dem deep inferior epigastric perforator (DIEP) Lappen
in 11% der Fälle Fettnekrosen, in 3% venöse Kongestion, in 5 % eine abdominelle
Schwellung auf (Nahabedian 2005; Bajaj 2006). Neben diesen Komplikationen sind
noch die hohen Operationskosten zu bedenken und desweiteren sind mit diesen
Techniken bezüglich des Volumens Grenzen gesetzt.
Silikon wird weltweit in der plastischen Chirurgie als Volumensubstitut für die
Brustaugmentation verwendet. Grundsubstanz von Silikon ist Silizium.
Makromoleküle, die abwechselnd Silizium- und Sauerstoffatome enthalten, werden
als Polysiloxane oder Silikon bezeichnet. Die verschiedenen Silikonarten
unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Länge der Polymerketten. Flüssiges
Silikon besteht aus linearen Kurzketten und wird in verschiedenen Reinheitsgraden
v.a. in der Industrie verwendet. Silikongel entsteht, wenn die Ketten in einer
dreidimensionalen Struktur gebunden sind. Die Entstehung wird durch die Zugabe
von Platin katalysiert. Silikonelastomere bestehen aus stark verbundenen Ketten.
Alle Brustimplantate, unabhängig von Füllmaterial, haben eine Umhüllung aus
Silikonelastomer.
Cronin und Gerow entwickelten Silikongelimplantate, welche erstmals von Cronin
1962 für die Brustaugmentation verwendet wurden (Brown 2005).
Silikonbrustimplantate existieren in einer Vielzahl verschiedener Grössen und
Formen, rund und anatomisch, mit hohem, mittlerem und flachem Profil. Trotz jener
Vorteile hinsichtlich seiner universellen Verfügbarkeit und Vielfalt birgt Silikon auch
einige Risiken in sich (Ellenbogen 1975; Gerszten 1999). Von 1992 bis 2005 wurden
Silkonimplantate sowie injizierbares Silikon von der Food and Drug Administration
(FDA) in Amerika verboten. Die Entscheidung der FDA beruhte auf gehäuften
Vorfällen von Kapselkontrakturen, Autoimmunreaktionen und Revisionen (Kessler
2
1992). Außerdem finden sich Berichte, dass bei fazialen Injektionen multiple Knoten
und Streifen durch Granulome aufgetreten sind (Shafir 2005).
Kollagen wird in vielfältiger Form angeboten. Am häufigsten wurde bovines Kollagen
in den letzten 20 Jahren eingesetzt. Seine Nebenwirkungen sind allerdings zahlreich,
insbesondere Hypersensibilitätsreaktionen, wie Erythema, Induration oder Pruritus
(Framer 1984) (Cooperman 1985). Neben diesen typischen Nebenwirkungen können
auch lokale Abszesse, Gewebsnekrosen und granulomatöse Fremdkörper auftreten
(Moscana 1993). Bovines Kollagen ist auch in Verruf geraten, da es eine mögliche
Infektionsquelle für BSE sein könnte. Dies wurde jedoch bislang nicht bewiesen und
ist aufgrund der Hygienevorschriften für die Produktion unwahrscheinlich. Vor allem
den Hypersensibilitätsreaktionen kann vorgebeugt werden durch einen zweimaligen
Hautsensibilitätstest im Abstand von 6 Wochen.
Homologes Kollagen wird in Form von Dermatologen® von Collagenesis und
Cymetra® von Life angeboten. Hauptrisiko sind Krankheitsübertragungen;
vorgebeugt wird diesem Risiko durch Suchtests für HIV, Hepatitis B und C sowie
andere Krankheiten (Maloney 2004). Autologes Kollagen namens Autologen® von
Collagenesis sind isolierte dermale Matrixkomponenten aus Hautbiopsien von
Patienten, die wiederum vor allem bei Gesichtsstraffungen, Blepharoplastiken und
Abdominoplastiken anfallen. Hauptvorteil ist das Fehlen von
Hypersensibilitätsreaktionen. Nachteile sind eine hohe Resorptionsrate, ein
Sekundärdefekt durch die Hautbiopsie sowie hohe Kosten (Narins 2005; Eppley
2006).
Auch Hyaluronsäure dient wie Kollagen zur Behebung kleinerer
Weichteilvolumendefizite, wie Augmentation von Lippen und Glättung von Falten.
Hyaluronsäure gehört zu den Makromolekülen der Glycosaminoglycane. Es stellt
eine natürliche Komponente der extrazellulären Matrix dar. Der hydrophile Anteil der
Hyaluronsäure zieht Wasser aus dem Extrazellulärraum und erzeugt auf diese Weise
ein Volumen. Der Vorteil von Hyaluronsäure ist, dass sie in allen Spezies identisch ist
und somit selbst keine Hypersensibilitätsreaktionen hervorrufen sollte. Jedoch sind
die Hyaluronsäurederivate häufig mit Hyaluronsäure-assoziierten Proteinen
ausgestattet, welche wiederum Hypersensibilitätsreaktionen hervorrufen können
(Patel 2006). Ein anderer Vorteil gegenüber anderen Füllmaterialien wie Kollagen
besteht darin, dass Hyaluronsäure das injizierte Volumen weitgehend beibehält.
3
Infolgedessen sind keine Überkorrekturen bei der Injektion nötig. Die Haltbarkeit
beträgt zwischen 4 bis 9 Monate (Matarasso 2006).
1.2. Tissue Engineering
Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Feld aus Ingenieurwissenschaften,
Medizin, Naturwissenschaften sowie Informationswissenschaften, die gemeinsam
versuchen, Gewebesubstitute für verletztes, funktionsloses oder fehlendes
Körpergewebe zu entwickeln. Formell wurde der Begriff „tissue engineering“ 1987
anlässlich des „inaugural tissue engineering meetings at Lake Tahoe, California“
eingeführt (Skalak 1988; Cima 1991; Nerem 1991; Langer 1993; Schultheiss 2000).
Die Anfänge des Tissue Engineering lassen sich im Wesentlichen in der Prothetik,
Transplantationschirurgie sowie in der Zellkulturtechnik finden.
Die Entwicklung von Gewebeersatz kann bis in das frühe 16. Jahrhundert
zurückverfolgt werden. Ambroise Paré (1520-1590), ein bedeutsamer französischer
Militärarzt, beschreibt in seinem Werk „Dix livres de la chirurgie“ von 1564
Zahnersatz durch künstliche Zähne sowie Nasenersatz (Paré 1634). John Hunter
(1728-1793) führte bereits homologe Transplantationen von Zähnen am Menschen
durch, sogenanntes “scion-tooth” (Hunter 1771) (Hunter 1835-1837). Der Chirurg
Johann Friedrich Dieffenbach (1792-1847) führte im Rahmen seiner Doktorarbeit von
1822 „Nonnulla de Regeneratione et Transplantatione“ Hauttransplantationen durch
(Lampe 1934).
Neben diesen frühen chirurgischen Leistungen sind noch jene der
Zellkulturtechnologie zu nennen. Rudolf Virchow (1821-1902) eröffnete mit seinem
Werk „Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische und
pathologische Gewebelehre“ erste Grundverständnisse über die Zelle (Virchow
1858). Leo Loeb schlug als erster in-vitro-Kultivierung in seiner Publikation von 1897
vor (Loeb 1897). Ross G. Harrison (1870-1959) und Alexis Carrel (1873-1944)
trieben wesentlich die Zellkulturtechnik durch Forschung und Verbreitung voran
(Harrison 1907).
Heute hat sich Tissue Engineering zu einem eigenen Gebiet entwickelt, in welches
laut Miller und Patrick mehr als 3,5 Milliarden Dollar seit den frühen 90er Jahren
investiert wurden (Miller 2003). Derzeitig sind zwar nur drei Produkte auf dem Markt,
4
aber aufgrund großer Investitionen werden in den nächsten Jahren wahrscheinlich
noch weitere folgen (Omstead 1998).
1.3. Fettaugmentation 1.3.1 Geschichte Die Fettaugmentation lässt sich mehr als 100 Jahre in die Vergangenheit
zurückverfolgen. Der erste Gebrauch von freiem autologem Fett bei Menschen wurde
von Neuber im Jahr 1893 durchgeführt, bei dem mehrere kleine Transplantate für die
Füllung eines Weichteilgewebsverlustes verwendet wurden. Neuber benutzte nur
suffizientes Fett als Weichteilgewebsersatz und berichtete über exzellente
Ergebnisse (Neuber 1893). Weniger Erfolg hatte er mit größeren Transplantaten
„grafts larger than an almond would not give good results“ (Billings 1989). Ellenbogen
(1886) berichtete einstweilige Ergebnisse bei dem Gebrauch von freien autologen
Fetttransplantaten von der Größe einer Perle für die Korrektur von Aknenarben,
posttraumatischen Defekten, nasolabialen Falten, Gesichtsfalten,
Narbeneinziehungen, Gewebedepressionen an den Augenlidern und
Kinnaugmentationen (Billings 1989). Lexer beschrieb 1909 den ersten erfolgreichen
Gebrauch von größeren Fetttransplantationen. Er entnahm ein 12 x 12 cm großes
autologes Fetttransplantat vom Abdomen für die Therapie einer Gewebedepression
im unteren infraorbitalen Bereich und für ein regredientes Kinn (Billings 1989). Diese
autologen Transplantate hatten einen Durchmesser von 4 bis 6 mm. Czerny
rekonstruierte als Erster 1895 aus einem Lipom eine Brust. Lexer führte 1931
ebenfalls eine Brustrekonstruktion durch; das Fett wurde allmählich resorbiert wegen
ungenügender Blutversorgung. Weitere Persönlichkeiten, die eine
Brustrekonstruktion mit freiem autologen Fettgewebe durchführten, waren May
(1941) und Schorcher (1957).
Jedoch waren die Ergebnisse nicht so gut wie erhofft und die wenigen guten
Ergebnisse ließen sich nur selten wiederholen (Beahm 2003). Implantate wurden
meist progressiv absorbiert und fibröses Gewebe ersetzte allmählich das
Fettgewebe, da die Fettzellen wegen ungenügender Versorgung zugrunde gingen
und das Proliferationsvermögen der wenigen verbliebenden Fettzellen zu limitiert war
(Ersek 1991; Kononas 1993). Die Zell-Überlebens-Theorie von Peer wurde in diesem
Zusammenhang bekannt (Peer 1950). Er ging davon aus, daß die Entwicklung des
5
Fetttransplantates von der Zahl individuell überlebender Fettzellen abhängig ist.
Histologische Veränderungen im Bereich des Transplantates wurden 1956 von Peer
im Detail erläutert. Er beschreibt eine 50%ige Volumenreduktion des
Fettgewebstransplantates innerhalb eines Jahres unter Ausbildung einer
ausgeprägten Fremdkörperreaktion, zentralen Fettzellnekrosen, Ölzysten und einer
nur im Randbereich des Transplantates stattfindenden Vaskularisierung (Peer 1956).
Das Interesse versiegte wegen der hohen Resorption und unvorhersagbaren
Volumenverlusten (Homicz 2004). Mit der Liposuktion entfachte das Interesse wieder
in den 70iger Jahren des letzten Jahrhunderts.
1.3.2 Klinik In der Klinik wird heute mit Hilfe verschiedener Techniken die freie autologe
Fetttransplantation durchgeführt, wobei die autologe Transplantation hauptsächlich
für die Korrektur kleinerer Gewebedefizite oder kosmetischer Mängel gebraucht wird.
Die Fettgewinnung erfolgt meist durch Liposuktion. Alternativ kann auch das
überschüssige Fettgewebe aus Dermolipektomien eingesetzt werden. Bei einer
maschninell extrahierten Reduktionsliposuktion wird das mit
Tumeszenzlokalanästhesie unterspritzte subkutane Fett durch stumpfe Kanülen von
3-4 mm Dicke mittels Fächerförderungstechnik über ein geschlossenes System
mittels Vakuumpumpe aspiriert in einem Behälter aufgefangen (Ramirez 2001). Es
sollte beachtet werden, dass der Unterdruck im Absaugsystem -0,7 bar nicht
überschreitet, da sonst eine zu hohe Schädigung der Fettzellen erfolgt. Findet keine
Reduktionsliposuktion statt, kann das Fett durch den manuell erzeugten Unterdruck
einer Spritze aspiriert werden. Bei der manuellen Aspirationslipektomie erhält man
ein Aspirat aus Fettzellen mit Blutzellen und extrazelluären Bestandteilen, jedoch
ohne größere Bindegewebssepten. Das mit Hilfe dieser Techniken gewonnene Fett
wird dem Patienten injiziert.
Als Indikationen für die freie autologe Fettaugmentation gilt die altersbedingte
Lipoatrophie im Gesicht sowie die Glättung von großen und tiefen Falten im
Nasolabial-, Mundwinkel- und Glabellabereich, des seitlichen Wangenbereichs, an
Stirn, Kinn und Handrücken sowie die Vergößerung der Lippen (Coleman 2006).
Weiterhin finden sich in der Literatur der letzten Jahre Fettaugmentation im
Periorbital-, Gesäß-, Waden-, Knöchel- und Genitalbereich (Hernandez-Perez 2001).
6
Auch wurde versucht bei Sclerodermia circumscripta en coup de sabre mit
Hemiatrophia faciei (Romberg-Syndrom), Pannikulitiden, Lipodystrophien fehlendes
Fettgewebe durch autologen Fetttransfer zu ersetzen (Drake 1996; Cortese 2000;
Fulton 2000).
Vorzug der autologen Fetttransplantation soll aus kosmetischer Sicht eine geringe
Anzahl von Nachbehandlungen sein - meist zwischen 1 bis 3 Nachinjektionen - bei
einem als gut tituliertem Aussehen (Fournier 1998; Eremia 2000; Hanke 2000).
Desweiteren handelt es sich bei der Aspiration des Fettgewebes um einen minimal-
invasiven Eingriff.
Auf der anderen Seite werden auch einige Nebenwirkungen und Komplikationen der
derzeitigen Fetttransplantation beschrieben. Es können leichte Schwellungen
innerhalb von Stunden bis Tagen, Erytheme, Hämatome sowie
Sensibilitätsstörungen auftreten (Sattler 2001; Lenzen 2004).
Konturunregelmäßigkeiten können mit der Zeit entstehen, wenn mehr als 8-10 ml pro
Region injiziiert werden; die Konturunregelmäßigkeiten sind dann Folge von
Einschmelzungen und Entwicklung von makroskopisch sichtbaren oder tastbaren
Lipogranulomen oder Ölzysten (Fournier 1998; Fournier 2000). Ölzysten lassen sich
häufig mikroskopisch nachweisen, haben jedoch für die Gesundheit des Patienten
keine Bedeutung (von Heimburg 2001). Manchmal treten nach Tagen lokalisierte
Indurationen im injizierten Bereich auf, die spontan nach wenigen Wochen
verschwinden. Ganz vereinzelt wurde über Infektionen wie Abszesse oder Erysipele
berichtet (Fournier 1998; De Pedroza 2000). Allerdings können auch schwere
Komplikationen vorkommen, wie das Aufftreten einer Fettembolie in der A. centralis
retinae mit unilateralem Visusverlust nach Injektion in die Glabella (Teimourian 1988;
Shiffman 2001).
Für den Einsatz der Augmentation mit freiem autologen Fett gelten folgende
Kontraindikationen: Akute Entzündungen im Unterspritzungsareal, Schwangerschaft,
Stillzeit, Koagulopathie und therapeutische Antikoagulation (Lenzen 2004).
Außerdem müssen auch Nebenwirkungen und Komplikationen bedacht werden, die
durch die Fettgewinnung entstehen können bzw. bei Liposuktion und
Dermatolipektomien bestehen. So wurden beispielsweise Pulmonalembolien im
Rahmen von Fettreduktionen als ernste Komplikationen beschrieben (Richling 2004;
Matarasso 2005).
7
Durch den Einsatz des Tissue Engineering hofft man auf der einen Seite, die
Nebenwirkungen und Komplikationen zu vermindern und auf der anderen Seite, die
Vorteile der Fettaugmentation, wie das natürliche Gefühl und Aussehen, zu
optimieren, denn die Zahl plastischer und ästhetischer Eingriffe ist relativ hoch und
steogend. Laut der American Society for Aesthetic Plastic Surgery wurden beinahe
8,3 Mill. kosmetisch chirurgische und nicht-chirurgische Prozeduren 2003 in den USA
durchgeführt; dies ist ungefähr eine 299%ige Steigerung gegenüber 1997 (Sarwer
2005).
1.4. Fettgewebe 1.4.1 Reifes Fettgewebe 10-25 % des normalgewichtigen Menschen besteht aus Fettgewebe und bei einem
typisch 70 kg schweren Mann speichert das Fettgewebe ungefähr 565000 kJ Energie
in Form von Triacylglycerinen. Das Fettgewebe wird meist als eine Sonderform des
retikulären Bindegewebes beschrieben. Zwei Arten des fettspeichernden Gewebes
finden sich im menschlichen Körper: Weißes und braunes Fettgewebe.
Braunes bzw. plurivakuoläres Fettgewebe findet sich beim Neugeborenen; das fetale
Fettgewebe unterscheidet sich von dem des univakuolären Fettgewebes, da es nicht
als Energielieferant, sondern als Wärmequelle für den Säugling fungiert.
Im Elektronenmikroskop unterscheidet sich das braune Fettgewebe durch eine
immense Anzahl von Mitrochondrien, was mit ihrer Funktion als Wärmequelle durch
Lipolyse im Zusammenhang steht. Wegen der hohen Dichte an Mitochondrien sind
braune Fettzellen besonders eosinophil und erscheinen so in der H&E-Färbung
bräunlich. Plurivakuoläres Fett verschwindet allmählich während der Entwicklung
vom Kind zum Erwachsenen bis auf Rudimente, z.B. im Mediastinum und an der
Aorta (Kugler 1994).
Das weiße Fettgewebe, auch univakuoläres Fettgewebe genannt, entwickelt sich aus
embryonalem Mesenchym. Es bilden sich aus den mesenchymalen Zellen zunächst
spindelförmige Adipoblasten. Diese Adipoblasten beinhalten zunächst keine
Fettvakuolen, bis sie wiederum zu Präadipozyten reifen und sich schließlich zu reifen
Fettzellen, den Adipozyten, entwickeln. Die Adipozyten speichern Fett als
Energiequelle für andere Körperzellen. In den Fettzellen werden vorwiegend
8
Triacylglycerine gespeichert. Das Fettgewebe ist also auf die Veresterung von
Fettsäuren und auf ihre Freisetzung von Triacylglycerinen spezialisiert.
Neben den Fettzellen finden sich im Fettgewebe noch Zellen aus der stromal-
vaskulären Fraktion. Die stromal-vaskuläre Fraktion bildet sich aus den
Makrophagen, Fibroblasten, Perizyten, Mastzellen, mikrovaskulären Endothelzellen,
den Präadipozyten sowie Zellen des lockeren Bindegewebes.
Beim Erwachsenen stellt univakuoläres Fettgewebe die Hauptform des Fettgewebes
dar und fungiert als Energiespeicher, endokrines Organ und auch als
Supportgewebe. Über Rezeptoren an den Adipozyten wird die Aufnahme und
Abgabe von Fett reguliert. Die Rezeptoren sprechen hauptsächlich auf verschiedene
Wachstumsfaktoren, Insulin, Glukokortikoide, Schildrüsenhormone und Noradrenalin
an. Bedeutende Wachstumsfaktoren sind u.a. der platelet-derived growth factor
(PDGF) aus Thrombozyten, Fibroblast Growth Factor (FGF), insulin-like growth
factor, Transforming Growth Factor (TGF). Diese Wachstumsfaktoren werden im
Anschluß an Gewebeschäden sezerniert und induzieren neben der Proliferation von
Fettzellen auch die Entwicklung neuer Blutgefäße. Insulin sorgt durch die
Bereitstellung für den Aufbau der Triglyzeride, indem es eine hormonsensible Lipase
hemmt, weshalb bei niedrigem Insulingehalt die Lipolyse beschleunigt ist. Ein
ausgeprägtes Kapillarbett und das autonome Nervengewebe sind mit dem
Fettgewebe verbunden (Rosell 1979; Crandall 1997). Die örtliche Freisetzung von
Noradrenalin stimuliert die Freigabe von gespeichertem Fett in das Blut; außerdem
ist das Wachstum der Fettzellen von der sympathischen Innervation und von
Neurotransmittern abhängig (Thompson 1986).
An manchen Stellen polstert kollagenfaseriges Gewebe - sogenannte Septen -
jeweils eine größere Anzahl an Fettzellen. Die Septen stellen sowohl morphologisch,
funktionell als auch angiologisch selbständige Einheiten dar. Sie verfügen über eine
terminale Zirkulation. Während die Arterie gewöhnlich in der Achse des Läppchens
verläuft, sammeln paarige Venen das Blut an der Oberfläche der Arterie. Die Septen
wirken als verformbares, stoßdämpfendes Supportgewebe, insbesondere an den
Regionen wie den Fußsohlen, dem Gesäß, den Nierenkapseln und den
retrobulbären Fettkörpern der Augenhöhle.
9
1.4.2 Präadipozyten Die frühesten Vermutungen über die Existenz von Fettzellen wurden von Fleming
1871 geäußert, der vermutete, dass die Adipozyten aus speziellen mesenchymalen
Zellen heranreifen (Johnson 1988).
Wassermann und Hausberger untermauerten mit ihren Versuchen diese Therorie in
den Jahren 1926 und 1938. In einem Leitartikel aus dem Jahre 1948 schrieben
Wertheimer und Shapiro, dass Fettgewebe aus primitiven Vorläuferzellen entsteht
und diese Zellen eine ähnliche Struktur aufweisen wie Fibroblasten (Wertheimer
1948). 1955 veröffentlichte Hausberger schließlich die Theorie, dass der Präadipozyt
bzw. der mesenchymale Vorläufer der Fettzelle sich durch Zelldifferenzierung zu
einer reifen Fettzelle umzuwandeln vermag (Hausberger 1955).
Meilensteine in der frühen Forschung zur Adipozytendifferenzierung unter in vitro
Bedingungen sind die Arbeiten von Smith 1971, der erstmals das Wachstum von in
Kultur befindlichen, fibroblastenähnlichen Zellen aus humanem Fettgewebe
beschrieb (Smith 1971).
1979 entwickelten Green und Kehinde Kulturtechniken, um die Präadipozyten-
Zelllinien (3T3-L1, 3T3-F442A) zu selektionieren, die sich in reife Fettzellen
differenzieren konnten (Billings 1989). Diese Zellen wurden subkutan in Nacktmäuse
injiziert, welche sich nach 6 Wochen in reife Fettzellen entwickelt hatten. Van und
Roncari (1982) konnten ebenso in vivo die Differenzierung von Präadipozyten zu
Adipozyten nachweisen und trugen so zur weiteren Etablierung von Primärkulturen
der stromal-vaskulären Fraktion bei (Van 1976; Van 1977; Van 1978; Cryer 1982).
Slavin (1979) und Cinti et al. (1984) beschrieben durch Versuche an Mäusen und
Ratten, daß Präadipozyten zwischen dem 17. Tag pränatal und dem 3. Tag postnatal
als fibroblastenähnliche Strukturen auftreten (Slavin 1979; Cinti 1984). Die Lipide
werden erst als kleine intrazelluläre Tröpfchen akkumuliert, welche später zu einer
einzigen großen Vakuole verschmelzen. Hausman (1983) stellte weiterhin in
ultrastrukturellen Studien an jungen Ratten die rasche Entwicklung der
Präadipozyten im subkutanen Gewebe dar, welche sich durch große Kapillaren von
mehr als 4 μm Lumendurchmesser und durch eine hohe Lipoproteinlipaseaktivität
auszeichnete (Hausman 1983).
Im Tissue Engineering werden heute zwei verschiedene Ansätze für die
Adipogenese verfolgt (Masuda 2004). Ziel beider ist, durch Neovaskularisation und
10
Akkumulation von Präadipozyten und eine im Anschluß daran erfolgende
Differenzierung zu reifen Adipozyten zu gelangen. Während in Primärkulturen bereits
zur Differenzierung von Präadipozyten junger Spender niedrige Insulin-
Konzentrationen (1-10nM) in Anwesenheit von fötalem Kälberserum (FCS) bzw.
hohen Insulinkonzentrationen (1-10µM) unter serum-freien Bedingungen genügen
können (Deslex 1987; Hauner 1989; Ailhaud 1997), ist die Differenzierung in-vivo
erschwert. Im implantierten Gewebe sind Präadipozyten anfangs wegen Ischämie
bzw. einer inadäquaten Blutversorgung nicht optimalen Voraussetzungen
ausgesetzt, da diese Faktoren Zellnekrose und einen Stillstand der Differenzierung
von Präadipozyten induzieren können (Billings 1989). Wenn die Vaskularisierung
vollständig ist, wandeln sich die Präadipozyten in Adipozyten um. Die drohende
Ischämie bzw. die inadäquate Versorgung kann einerseits durch Nährstoffe aus der
Trägermatrix überbrückt werden und andererseits kann durch angiogenetische und
adipogenetische Faktoren, wie bFGF, Insulin, insulin-like growth factor-I, die Zeit bis
zur physiologischen suffizienten Vaskularisierung verkürzt werden. Solch eine
Adipogenese wurde in-vivo herbeigeleitet durch Injektion einer mit FGF-2 zusätzlich
versehenen rekonstituierten Basalmembran, die aus einem Maussarkom entwickelt
wurde und unter dem Namen Matrigel bekannt ist (Kawaguchi 1998; Tabata 2000).
Matrigel weist jedoch eine hohe Speziesabhängigkeit auf, weshalb ein Matrigel für
den Menschen noch entwickelt werden muß (Beahm 2003).
Ein anderer Ansatz besteht darin, isolierte Präadipozyten in einer Matrix mit oder
ohne Koimplantation eines anderen Zelltyps zu implantieren. Weiterhin können
alternativ zu Präadipozyten auch mesenchymale Stammzellen verwendet werden
(Kim 2005). Derzeitig stehen diploide Präadipozyten von verschiedenen Nagetieren,
vom Schwein sowie vom Menschen zur Verfügung. Anders als diese Zelllinien, die
aus Stammzellen entwickelt werden müssen, können Präadipozyten relativ leicht und
in hoher Stückzahl aus Liposuktionen und Dermolipektomien isoliert werden (Beahm
2003).
Für die Koimplantation kommen Endothelzellen zur Steigerung der Angiogenese und
Differenzierung der Präadipozyten sowie Fibroblasten, also Zellen aus der stromal-
vaskulären Fraktion, in Frage.
11
1.5. Angiogenese Angiogenese spielt bei der Etablierung neuen Gewebes eine wesentliche Rolle.
Vaskulogenese und Angiogenese sind die physiologischen Prozesse zur Bildung von
Gefäßen. Vaskulogenese ist definiert als die Differenzierung von Angioblasten in
Endothellzellen und die De-novo-Formation eines einfachen Gefäßnetzes.
Angiogenese ist das Wachstum neuer Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen.
Im Embryo bilden sich noch Gefäße durch Vasculogenese und Angiogenese. Im
Erwachsenenalter ist die Bildung neuer Blutgefäße nur bei bestimmten
physiologischen Prozessen anzutreffen, wie im weiblichen Genitaltrakt bei
Schwangerschaft, in der Plazenta bei Schwangerschaft und während der
Wundheilung. Bei dieser Gefäßbildung handelt es sich hauptsächlich um
Angiogenese. Eine Dysregulation der Angiogenese wird bei verschiedenen
Pathogenesen angenommen, wie bei der vaskulären Retinopathie, der rheumatoiden
Arthritis sowie bei Tumoren.
Zwei verschiedene Mechanismen der Angiogenese werden beschrieben: Sprouting
bzw. Gefäßaussprossung und Intussuszeption. Die intussuszeptive Angiogenese
entsteht duch die Insertion interstitieller zellulärer Spalten in das Lumen
präexistierender Gefäße. Das darauf folgende Wachstum dieser Spalten und ihre
Stabilisierung resultiert in der Teilung der Gefäße und der Remodulierung des
lokalen Netzwerkes. Angiogenese duch Gefäßaussprossung setzt sich aus zwei
Phasen zusammen: Wachstum und Stabilisierung neuer Gefäße. Während der
Initialphase verlaufen folgende Prozesse: Ablösung von der Basalmembran des
„Mutter“-Gefäßes und von der umgebenden interstitiellen Matrix, Migration der
Endothelzellen in den geschaffenen Raum durch angiogenetische Faktoren,
Proliferation der Endothelzellen hinter der migrierenden Front, Lumenformation von
Schleifen durch Anastomose der Gefäßsprosse. Die Stabilisierungsphase besteht
aus dem Stillstand der Endothelzellproliferation, Rekonstruktion der Basalmembran
um die neuen Kapillaren sowie Anlage und Bedecken der unreifen Kapillare mit
Perizyten.
Eine wichtige Rolle spielen verschiedene Wachstumsfaktoren. Diese
angiogenetischen Wachstumsfaktoren besitzten die Fähigkeit, Neovaskularisation in
vivo zu induzieren und können in vier Klassen gegliedert werden: vascular
12
endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived
growth factors (PDGF) und transforming growth factors (TGF) (Ahrendt 1998).
VEGF ist ein Endothel spezifisches Mitogen, das von spezifischen Zellen sezerniert
wird (z.B. retinale Zellen, Myokardzellen und Präadipozyten). Vier Isoformen von
VEGF werden exprimiert. Hypoxische Zustände, wie bei Ischämie, stimulieren die
Expression von VEGF aus verschiedenen Zellen und korrespondierenden VEGF-
Rezeptoren auf Endothelzellen. Sowohl auf zellulärer als auch auf Gewebeebene
steigert VEGF mikrovaskuläre Permeabilität und fördert die Extravasation des
Blutplasmas (Sato 1995).
Vier der fibroblast growth factors haben Einfluß auf Zellen des Gefäßsystems: FGF-1
(acidic oder aFGF), FGF-2 (basic oder bFGF), FGF-4 und FGF-5. Alle haben einen
mitogenen Effekt auf Endothelzellen. bFGF stimuliert Endothelzellproliferation und -
migration wird von den Endothelzellen produziert, um Perizyten zu rekrutieren.
PDGF ist ein potenter Stimulator für das Wachstum und die Motilität der Fibroblasten
und der glatten Muskelzellen, aber es wirkt auch auf Endothelzellen und Neurone.
PDGF wird von Thrombozyten, Endothelzellen und Muskelzellen synthetisiert.
TGF-β und seine Rezeptoren sind wichtige Regulatoren der Endothelzellproliferation
sowie für die Etablierung und Beständigkeit der Gefäßintegrität. Der Effekt von TGF-
β auf die Angiogenese beruht wahrscheinlich auf dem Rekrutieren von Makrophagen
und Fibroblasten, die angiogenetische Faktoren sezernieren. TGF-β fungiert
wahrscheinlich weiterhin als Stabilisator neu geformter Gefäße durch Rekrutieren
von glatten Muskelzellen und Perizyten sowie durch Förderung ihrer Proliferation.
TGF-β induziert PDGF-Expression durch Endothelzellen sowie VEGF und bFGF-
Expression in glatten Muskelzellen.
Weiterhin existieren fünf Angiopoeitinproteine: ANG-1, -2, -3, -4 und -5. Angiopoietin-
1 wird von periendothelialen Zellen exprimiert, während die anderen Angiopoietine
von anderen Zellen hergestellt werden, wie Zellen der umbilikalen Venen oder
fetalen Alveolarzellen (Satchell 2001). Angiopoietin-1 initiert und stabilisiert mittels
TIE-2-Rezeptoren das Gefäßwachstum (Stoeltzing 2002).
Im Tissue Engineering wird mit verschiedenen Angiogenesemodellen versucht,
diesen natürlichen Prozess für die Etablierung eines neuen Gewebes zu induzieren
und zu optimieren. Nicht-bradytrophes Gewebe kann nicht allein durch Diffusion
versorgt werden, wenn es mehr als 150-200 μm von der Blutversorgung entfernt ist
13
(Cassell 2002). Zumal Fettgewebe sehr gefäßreich ist; die Anzahl seiner Kapillaren
ist ungefähr 2-3 mal so groß wie die von Skelettmuskeln (Beahm 2003).
1.6. Zellmatrix Einer Zellmatrix sollten bestimmte Eigenschaften zueigen sein, damit die darin
befindlichen Zellen letztlich als Gewebesubstitut zurückbleiben. Die Matrix sollte als
zellulärer Anker sowie als formgebende Struktur für das Konstrukt dienen; weiterhin
sollte sie begünstigende mechanische und chemische Möglichkeiten besitzen. Die
Matrix muß bio- sowie zytokompatibel und biologisch abbaubar sein, vorhersehbare
Resorptionszeiten haben und nur vitales Gewebe zurücklassen. Es darf keine
toxischen Nebenprodukte produzieren, die die Morbidität des Empfängers erhöhen
könnte (Beahm 2003).
Es sollte eine adäquate Porengröße anbieten. Die optimale Porengröße variert je
nach Gewebe. 5 μm sind favorisiert für Neovaskularisation, 5 bis 15 μm steigert das
Einwachsen von Fibroblasten, und größere Porengrößen bis zu 500 μm werden
benötigt für das Überleben von transplantierten Zellen (Whang 1999). Idealerweise
sollte die Matrix mit wachstumssteigernden Faktoren ausgestattet sein, d.h. eine
Quelle für Wachstumsfaktoren sein, Rezeptoren und Adhäsionsmoleküle anbieten
können.
Folgende Matrizes wurden bislang für die Transplantation von Präadipozyten im
Tissue Engineering gebraucht:
Poly L-lactic-co-glycolic acid (PLGA) wurde mit autologen Präadipozyten subkutan in
Ratten transplantiert (Patrick 1999). Das Volumen des neugebildeten Fettgewebes
soll bis zum 2. Monat konstant geblieben sein und danach zu schrumpfen begonnen
haben; nach 5 Monaten war kein Gewebe mehr vorzufinden (Patrick 1999; Patrick
2002). Weiterhin wurden mit Hyaluronsäure und Hyaluronsäure modifizierte Träger
(HYAFF 11) mit humanen Präadipozyten in Mäusen für 3 und 8 Wochen verwendet
(von Heimburg 2001; Hemmrich 2005; Hemmrich 2006).
In unserem Versuchen wurde Fibrin DuoSM von Baxter als Zellmatrix verwendet.
Fibrin hat sowohl den Vorteil berechenbar bezüglich seiner Resorptionzeit zu sein als
auch angiogenetische Eigenschaften zu besitzen (Whang 1999; Cassell 2002).
Im Jahr 1909 gebrauchte Bergel erstmals trockenes Plasma als Quelle für Fibrinogen
und Fibrin Fleeze, um Hämostase zu bewirken (Bergel 1909). Young and Medawar
14
setzten Fibrin bei Nähten von peripheren Nerven im Tiermodel im Jahr 1940 ein
(Young 1940). 1944 benutzten Tidrick and Warner erstmals eine Zusammensetzung
aus Fibrinogen (20–50 g/l) und bovinem Thrombin, um bessere Ergebnisse bei
Hautlappen zu erreichen (Tidrick 1944). In den kommenden Jahrzehnten erfolgten
Weiterentwicklungen und klinische Studien zum Nutzen des Materials (Sprangler
1975; Radosevich 1997).
Das medizinisch genutzte Fibrin beinhaltet im Wesentlichen Fibrinogen, Thrombin,
Fibronektin, Faktor XIII, Aprotinin und Tranexamsäure (Buchtaa 2005; Mosesson
2005). Thrombin reguliert die Polymerisationsrate des Fibrins, indem es das
Fibrinogen in Fibrinmonomere spalten lässt, welche sich spontan quervernetzen.
Möglicherweise soll Thrombin auch mitogene Effekte auf Fibroblasten und
Endothelzellen ausüben (Sierra 1993). Fibronektin ist ein Glykoprotein, welches die
Adhäsion des Fibrinkonstruktes via Faktor XIII steigert. Außerdem soll Fibronektin
eine Rolle bei der Zellmigration spielen (Matras 1985). Aprotinin und Tranexamsäure
verlangsamen die Fibrinolyse. Desweiteren bietet Fibrin eine Bindungsaffinität für
bFGF (Browder T 2000). Bei teils aufgelöster Struktur kann Fibrin als Gleitschiene für
die Endothelzellmigration und die Röhrenformation der Kapillaren fungieren.
Allerdings finden sich während der Fibrinolyse auch Inhibitoren der Angiogenese, wie
z.B. Angiostatin und Plasmin. Angiostatin inhibiert Endothelzellproliferation und
Matrixmetalloproteinasen. Das Zusammenspiel angiogenetischer und
antiangiogenetischer Faktoren wird allerdings auch als notwendig für die
Gefäßentwicklung angesehen (Dallabrida S M 2000). Wenn z.B. Endothelzellen in
Fibrin ausgesät werden, organisieren sich die Endothelzellen zu kapillarähnlichen
Strukturen aufgrund der mechanischen Fähigkeiten und der angiogenetischen
Degradationsprodukte (Vailhe B 1997).
1.7. Fragestellung Diese Arbeit stellt die Weiterführung mehrerer vorangegangener Arbeiten dar. Diese
Arbeiten haben in In-vitro-, Semi-in-vivo- und kurzdauernden In-vivo-Versuchen
Präadipozyten, Fibroblasten, HDMVEC sowie verschiedene Matrizes bezüglich ihres
Potenzials für die Weichteilsubstitution untersucht. Die vorangegangenen Arbeiten
sowie diese haben als Ziel, ideale Weichteilgewebeäquivalente für eine mögliche
15
zukünftige kinische Anwendung zu entwickeln. In diesem Rahmen stellte sich
folgende Fragestellung:
• Mit Hilfe einer Versuchsgruppe mit Präadipozyten in Fibrin und einer
Versuchsgruppe mit Fibroblasten in Fibrin sollte ermittelt werden, inwiefern
sich diese nach 4 Wochen, 3 Monaten und 6 Monaten qualitativ und
quantitativ unterscheiden. In der Dissertation von Dr. Tegtmeier aus der
gleichen Arbeitsgruppe wurden die optimalen Kulturmedien und die
Trägermatrix für Präadipozyten eruiert (Tegtmeier 2004). Ebenso wurde dies
bereits für Fibroblasten im Labor ZKF untersucht. Allerdings wurden
Tierversuche mit Fibroblasten und Präadipozyten in Fibrin nur für einen
Zeitraum von 4 Wochen durchgeführt und ihre Ergebnisse wurden nicht
miteinander in einer Studie verglichen. Ein längerer Zeitraum ist insofern
bedeutsam, da in der Literatur nach 3-5 Monaten ein stetiger Rückgang des
Volumens der Implantate beschrieben wird (Patrick 1999).
• Der Vergleich einer Versuchsgruppe aus HDMVEC als Sphäroide und
koimplantierten Präadipozyten in Fibrin mit einer Versuchsgruppe aus
Präadipozyten in Fibrin soll zeigen, ob die HDMVEC als Sphäroide
wesentliche Effekte auf die Vaskularisierung und die Differenzierung der
Präadipozyten haben. In Vorarbeiten wurden bereits in einem In-vivo-Versuch
an athymischen Nacktmäusen Koimplantation von HDMVEC mit
Präadipozyten in Fibrin durchgeführt, um die Vaskularisierung und
Differenzierung der Implantate zu verbessern. Jedoch wurden die HDMVEC
nicht als Sphäroide hinzugegeben, sondern als Zellsuspension. In einem
neuen Ansatz mit Hilfe von Sphäroiden wurden die Auswirkungen auf die
Konstrukte, bestehend aus Präadipozyten in Fibrin, untersucht. In einem
Chorionallantois-Membran (CAM) – Zylindermodell sowie an maximal 2
Wochen dauernden Tierversuchen wurde eine verbesserte Vaskularisierung
der Implantate mit HDMVEC-Sphäroiden gegenüber den Implantaten ohne
HDMVEC-Sphäroide vorgefunden (Torio-Padron 2003; Müller 2005).
• Durch die Gegenüberstellung einer Mehrfachinjektion gegenüber einer
Einfachinjektion von Präadipozyten in Fibrin soll ersichtlich werden, ob ein
besseres Ergebnis hinsichtlich des Volumenersatzes bewirkt werden kann. In
anderen Arbeiten wird zahlreich beschrieben, dass erst nach mehrfacher
16
Injektion eines Substitutes mit oder ohne Zellen, wie Kollagen, Isolagen® oder
autologer Fetttransplantation, ein Volumenersatz für einen längeren Zeitraum
erzielt wird (Homicz 2004).
• Letztlich soll auch geklärt werden, ob eine höhere Präadipozytenanzahl in
Fibrin einen beständigeren und größeren Volumenersatz bewirken kann. In
Vorversuchen wurde die Präadipozytenzahl im Verhältnis zur Fibrinmenge
variiert und die in Gruppe 1 verwandte Relation von Präadipozyten zu Fibrin
als das optimale Verhältnis evaluiert. Auch stellt sich die Frage, ob dieses
Verhältnis für längere In-vivo-Versuche ebenso anzunehmen ist.
17
2. Material und Methoden Sämtliche Arbeiten wurden, sofern nicht anderweitig beschrieben, im Tissue
Engineering Labor der Abteilung Plastische und Handchirurgie bzw. im
Gebäudekomplex der Zentralen Klinischen Forschung der Universität Freiburg i. B.,
Breisacherstr. 66, 79106 Freiburg, durchgeführt. Die Arbeiten wurden in Steriltechnik
an einer Reinraumwerkbank durchgeführt. Zellkulturen wurden, soweit nicht
ausdrücklich davon abweichend beschrieben, im Brutschrank bei 37°C. und 5% CO2
inkubiert.
2.1 Zellkultur
2.1.1. Präadipozyten-Isolation Reagentien: PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfat in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Kollagenase II (Fa. Sigma, Cat. No. 6885, Deisenhofen, Deutschland) D(+)-Glucose, C6H12O6 Mr= 180.16 g/Mol (Fa. Merck Cat. No. 8337.1000, Darmstadt, Deutschland) BSA, Fraktion V, Pulver, Quelle: Rinderblut (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 11018-025, Carlsbad, USA) HEPES-Pufferlösung 1M (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15630-056, Carlsbad, USA) Tris (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15504-012, Carlsbad, USA) NaCl (Fa. Merck, Cat. No. 159-302-500, Darmstadt, Deutschland) KCl (Fa. Merck, Cat. No. 104935, Darmstadt, Deutschland) CaCl2 (Fa. Merck, Cat. No. 102880, Darmstadt, Deutschland) MgSO4 * 7H2O (Fa. Merck, Cat. No. 105882, Darmstadt, Deutschland) NaH2PO4 (Fa. Merck, Cat. No. 106370, Darmstadt, Deutschland) Na2HPO4 (Fa. Merck, Cat. No. 106585, Darmstadt, Deutschland) NH4Cl (Fa. Merck, Cat. No. 101142, Darmstadt, Deutschland) Endothelial Cell Growth Medium MV (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) Humane Präadipozyten wurden nach einem modifizierten Präparationsprotokoll nach
Hauner et al. (Hauner 1989) aus subkutanem Fettgewebe isoliert. Sämtliche zur
Präparation verwendeten Instrumente und Flüssigkeiten lagen steril vor. Zur Isolation
verwendete Fettgewebsbiopsien stammten von einem Patienten im Alter von 46
Jahren, der sich einer elektiven plastischen Abdominoplastik unterzogen hatte. Der
Patient hatte zuvor sein Einverständnis zur wissenschaftlichen Verwendung des
resezierten Gewebes gegeben. Das Gewebe wurde unter sterilen Bedingungen
entnommen und in sterilen Behältern in PBS, versetzt mit 1% Penicillin /
Streptomycin und 1% Amphotericin B, in das Tissue Engineering Labor verbracht.
18
Primärzellkulturen wurden durch mechanische und enzymatische Dissoziation des
Fettgewebes gewonnen.
In Steriltechnik wurde dabei das Gewebe zunächst manuell zerkleinert, begleitendes
Bindegewebe reseziert und die Gewebeproben in PBS gewaschen, um
kontaminierendes Blut zu entfernen. 25-30g zerkleinerte Fettgewebestücke wurden
in ein 50ml Falcon Tube mit 20ml 3.5%iger Albumin-Phosphatpuffer-Lösung (NaCl
135mM, KCl 4.7mM, CaCl2 2.5mM, MgSO4 7H2O 1.25mM, NaH2PO4 1.25mM,
Na2HPO4 1,25mM, HEPES 10mM, pH 7.4), 0.5mg/ml D-Glucose und 2mg/ml
Kollagenase II überführt und für verschiedene Zeitintervalle in einem
Schüttelwasserbad bei 37.0°C. inkubiert. Jeweils in Zeitabständen von 15-30
Minuten wurden die Digestionsansätze mittels eines Reagenzglasschüttlers gründlich
durchmischt. Das Digestat wurde zentrifugiert (1100 U/min, 10min, 21.0°C.) und der
mehrschichtige Überstand über dem Zellpellet verworfen. Das Zellpellet wurde für
10min in 20ml Lyse-Puffer resuspendiert (Tris 17mM, NH4Cl 16mM in Aq. bidest.),
um die Blutkontamination des aufgearbeiteten Gewebes weiter zu reduzieren.
Anschließend wurde erneut zentrifugiert. Der Überstand über dem resultierenden
Zellpellet wurde verworfen, das Zellpellet in 20ml PBS resuspendiert und mittels
eines Zellsiebes filtriert (Falcon Cell Strainer, 70μm Porengröße). Nach einem
erneuten Zentrifugationsschritt wurde das Zellpellet in Endothelial Cell Growth
Medium MV (ECGM), welchem 100 U/ml Penicillin, 0.1mg/ml Streptomycin und
2.5μg/ml Amphotericin B zur Infektionsprophylaxe zugesetzt sowie Fetales Bovines
Serum (FBS, Hitzeinaktivierung des Komplementsystems bei 56°C. im Wasserbad
über 30 Minuten) zu 10% des Serumanteil im Medium zur Serumsupplementierung
hinzugefügt wurde, resuspendiert, die Zellzahl mittels eines Hämozytometers bzw.
eines Zählautomaten bestimmt und die Zellen mit einer Zelldichte von
2.7x104Zellen/cm2 in einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die gesamte Präparation
wurde dabei mittels eines standardisierten Protokolls dokumentiert.
19
2.1.2. CASY-Zellmessung Reagentien: CASY1 Cell Counter + Analyser System Model TT (Schärfe System, Reutlingen, Germany) CASYTON isotone Salzlösung (Schärfe System, Cat. No. 043-90037P Reutlingen, Germany)
Die CASY 1 Technologie von Schärfe System verbindet Verfahren der
Partikelmesstechnik, das „Widerstandsmessprinzip“, mit einer Methode der
Signalauswertung, der „Pulsflächenanalyse“. Zur Messung werden die Zellen in einer
schwachen Elektrolytlösung resuspendiert und mit konstanter
Strömungsgeschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt.
Hierzu wird das Zellpellet in 10ml Zellmedium verdünnt und von dieser
Zellsuspension wurden wiederum 100μl entnommen. Die 100μl-Lösung wurde in
10ml isotone Salzlösung CASYTON verdünnt und diese mittels CASY 1 Cell Counter
+ Analyser System Model TT ausgewertet.
2.1.3. Kultivierung und Passagierung von Präadipozyten Reagentien: FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfate in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Die Primärkulturen von Präadipozyten wurden in einer Zelldichte von 2.7x104
Zellen/cm2 in einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die Zellkulturen wurden mit einem
Volumen von vorbehandelten 12-15ml Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM)
überschichtet, wie dies bereits in dem Abschnitt 2.1.1. beschrieben wurde. Nach ca.
12h wurde das Zellkulturmedium mit nicht adhärenten Zellen abgezogen, die
Kulturflasche durch Zugabe von 10ml PBS unter vorsichtigem Schütteln für 1-2
Minuten gespült und erneut mit Zellkulturmedium überschichtet. Ein Mediumwechsel
wurde jeden zweiten Tag durchgeführt. Bei Erreichen einer Konfluenzrate der
Zellkultur von 85-95% wurde diese passagiert. Primärkulturen wurden dabei als p0-
Kultur bezeichnet, folgende Kulturenpassagen als p1, p2, usw.. Nach Abziehen des
Kulturmediums wurde die Zellkultur zunächst mit PBS gespült, um zurückgebliebene
Serumbestandteile zu eliminieren. Einer Zellkultur wurden 2ml einer auf 37.0°C.
20
vorgewärmten Trypsin-Lösung zugesetzt und die Zellkultur für die Dauer der
Dissoziationszeit der Zellen von 3-5min im Brutschrank inkubiert. Die Trypsinwirkung
wurde phasenkontrastmikroskopisch kontrolliert, die abgerundeten Zellen durch
intermittierendes Klopfen an die Unterseite der Kulturflasche abgelöst und die
Trypsinwirkung durch Zugabe von 8ml einer 10%-igen FCS-PBS-Lösung gestoppt.
Lose anhaftende Zellen wurden mit PBS abgespült. Die resultierende Zellsuspension
wurde in ein Falcon Tube überführt, abzentrifugiert (1100 U/min, 21.0°C., 10 Minuten
Dauer), der resultierende Zellpellet in 10 ml Zellkulturmedium resuspendiert und die
Zellzahl mittels eines CASY-Zellzählers bestimmt. Im Anschluss wurde die
passagierte Zellkultur mit einer Zelldichte von 1.0-2.0x104 Zellen/cm2 ausgesät.
2.1.4. Präadipozyten-Differenzierung Reagentien: Dexamethason ( 9a-Fluoro-16a-Methylprednisolon) (Fa. Sigma, Cat. No. D 4902, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 5mg/ml (860µM): 7.5mg + 1.5ml Aq. bidest. + 15 µl Eisessig) Endothelial Cell Basal Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22220, Heidelberg, Deutschland, keine Zusätze von Wachstumsfaktoren o. Serum) Insulin, human, rekombinant, Quelle: E. coli, approx. 28 USP Einheiten/mg (Fa. Sigma, Cat. No. I 0259, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 1mM: 3.9mg + 10ml Ethanol absolut) Mehylisobutylxanthin (3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX)) (Fa. Sigma, Cat. No. I 7018, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 25 mM: 11mg + 1ml Aqua bidest + 1ml Ethanol absolut) Eisessig (Essigsäure, Fa. Merck, Cat. No. 100056, Darmstadt, Deutschland) Zur Ausdifferenzierung kultivierter Präadipozyten zu Adipozyten wurden konfluente
Zellkulturen mit einem Differenzierungsmedium, basierend auf DMEM/Ham´s F-12
Medium (Mischungsverhältnis 1:1, Bezeichnung dieses Differenzierungsmediums im
folgenden als Medium B) bzw. ECBM behandelt. Diesen wurden 3% FBS, 100nM
Insulin, 1μM Dexamethason und für die ersten drei Tage der Differenzierung 0.2mM
Methylisobutylxanthin beigefügt. Die Stocklösungen wurden aliquotiert, bei -20°C.
gelagert und bei Bedarf aufgetaut. Das Differenzierungsmedium wurde für jede
Differenzierungsreihe frisch angesetzt. Ein Mediumwechsel wurde jeden zweiten Tag
durchgeführt, wobei vorsichtig 50% des Mediumüberstandes abgezogen und ersetzt
wurde. Ein vollständiger Mediumwechsel führte zur Ablösung der differenzierten
Adipozyten von der Kulturflaschenoberfläche. Die Zelldifferenzierung wurde,
entsprechend dem Protokoll, über einen Zeitraum von 16 Tagen durchgeführt.
Hierbei wurde der Vergleich anhand der Morphologie sowie der
Differenzierungsfähigkeit hinsichtlich der Bildung von Fettvakuolen durch Färbung mit
Oil-red-O durchgeführt.
21
2.1.5. Isolation human dermal mikrovaskulärer Endothelzellen (HDMVEC) Reagentien: Dynabeads®M450 (Ziege-anti-Maus IgG, zusätzliche Materialien; DYNAL MPC (Magnetvorrichtung), Dynal Mixers (Mischvorrichtung), Fa. Dynal, Cat. No. 110.05, Hamburg, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) Monoclonal Mouse Anti-Human Endothelial Cell, CD 31 (Klon JC/70A, Maus IgG1, Fa. Dako, Cat. No. M 0823, Carpinteria, USA) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfate in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich)
Humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMVEC) wurden aus Dermis
mehrerer Spender isoliert. Eine Mischzellkultur eines Dermisbiopsates wurde durch
Trypsin-Digestion, mechanische Separation, Zellfiltration und Zentrifugation nach
einem modifizierten Protokoll nach Hewett et al. (Hewett PW 1993; Hewett PW 1996)
gewonnen, in Endothelial Cell Growth Medium resuspendiert und in Gelatine
beschichteten Kulturflaschen (T25) mit einer Zelldichte von 3.5x104Zellen/cm2
ausplattiert. Das verwendete Endothelial Cell Growth Medium wurde bei allen
Anwendungen vorbehandelt, wie dies auch bei der Isolierung und Kultivierung der
Präadipozyten die Regel war. Bei Konfluenz der Mischzellkultur wurden humane
dermale mikrovaskuläre Endothelzellen unter Verwendung eines Maus-anti-human
CD31 (PECAM1) Antikörpers sowie eines Dynabeads®M450 Systems (Ziege-anti-
Maus IgG gekoppelt an Magnetperlen (magnetic beads)) aus der Mischzellkultur
isoliert und in ECGM kultiviert.
22
2.1.6. Kultivierung und Passagierung von HDMVEC Reagentien: Zellkulturmedien (s.o.) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV) Die Kultivierung und Passagierung der HDMVEC erfolgte auf ähnliche Weise wie die
Kultivierung und Passagierung der Präadipozyten. Bei 80-90% Konfluenz der
Endothelzellkultur wurden die Zellen passagiert. Nach Abziehen des Kulturmediums
und anschließender Spülung mit PBS wurden der Zellkultur 1.0-1.5ml auf 37°C.
vorgewärmtes Trypsin zugegeben. Die Kulturflasche wurde ca. 10 Mal langsam
gewendet, um eine gleichmäßige Benetzung der Zellkultur mit Trypsin zu erzielen. Im
Anschluß wurden 50% des Trypsins wieder abgezogen. Unter Beobachtung durch
ein Zellkulturmikroskop wurde abgewartet, bis sich ca. 90-95% der Endothelzellen
abgerundet und diese durch intermittierendes Klopfen vom Boden der
Zellkulturflasche gelöst hatten. Die Zellen wurden in 10ml ECGM resuspendiert, um
die Trypsinwirkung zu stoppen. Die Zellsuspension wurde anschließend in ein 50ml
Falcon Tube überführt, die Kulturflasche mit 5ml ECGM nachgespült und die
Zellsuspension zentrifugiert (1000 U/min, 4°C., 8min). Das resultierende Pellet wurde
in 5ml ECGM resuspendiert, die Zellzahl ausgezählt (s. 2.1.2.) und die
Zellsuspension mit einer Zelldichte von 1.0-1.2x104Zellen/cm2 in Gelatine-
beschichteten Kulturflaschen (P75) ausplattiert.
2.1.7. HDMVEC Sphäroid-Kulturen Reagenzien: Endothelial Cell Basal Medium MV (Fa. Promocell, Cat. No. C-22210, Heidelberg, Deutschland) FCS Rundboden-96-Vertiefungen-Platte (Fa. Greiner, Cat. No. 650185, Frickenhausen, Deutschland) Carboxymethylcellulose (Fa. Sigma, Cat. No. M-0512, Steinheim, Deutschland) Sphäroide wurden nach einem modifizierten Protokoll nach Korff et al. hergestellt
(Korff 1998). Dazu wurden in 500 ml Methocel-Konzentrat 6g Carboxymethylcelluose
in 250 ml, auf 60 °C erhitztem, Endothelzellbasalmedium (ECBM) gelöst. Diese
Lösung wurde mit 250 ml ECBM, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin/Streptomycin und
Fungizone beinhaltend, gemischt und bei 4°C für 2 Stunden gerührt. Die
resultierende, geleeartige Lösung wurde bei 5000 g für 4 Stunden zentrifugiert. Der
klare Überstand wurde abgenommen und anschließend für die Versuche verwendet.
23
Endothelzellen einer hochkonfluenten Kultur wurden trypsiniert, die Zellzahl bestimmt
und eine definierte Menge in methocelhaltiges Medium (20% Methocel-Konzentrat,
80 % basales ECBM + 10% FCS) eingebracht, so dass eine Konzentration von 2200
HDMVECs pro 150 μl erreicht wurde. 150 μl der Zellsuspension wurden in jede
Vertiefung einer nicht-adhärenten Rundboden-96-Vertiefungen-Platte gebracht und
bei 37°C (5% CO2, 100% Luftfeuchtigkeit) kultiviert. In jeder Vertiefung bildet sich ein
Sphäroid, bestehend aus ca. 2200 Zellen. Waren die Sphäroide am dritten oder
vierten Tag nach Beginn der Inkubation kugelförmig, wurden sie mit dem Medium
mittels einer Eppendorf-Pipette in ein 50 ml Falcon-Tube transferiert, 3 Minuten bei
350 g zentrifugiert und für die Implantation genutzt. Pro Konstrukt wurden 1 Million
HDMVECs bzw. ca. 454 Sphäroide verwendet.
2.1.8. Isolation von Fibroblasten Reagentien: DMEM (1x) High Glucose (für dermale Fibroblasten) (PAA Laboratories Cat. No. E15-810GmbH Pasching, Austria) ohne Sodium Pyruvat, mit L-Glutamin, Endotoxin getestet, Dispase (Gibco Invitrogen Corporation, Cat.No. 17105-041, Karlsruhe, Deutschland) Ethanol (Fa.J.T. Baker Cat. No. 8006) Kollagenase II (Fa. Sigma, Cat. No. 6885, Deisenhofen, Deutschland) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Die Fibroblasten wurden aus der Haut gewonnen, die bei einer Dermolipektomie
einer Patientin im Alter von 42 Jahren zur Verfügung gestellt wurden. Zuerst wurde
die Subkutis abpräpariert. Daraufhin wurde die Haut abwechselnd mit 70%igen
Alkohol und PBS gesäubert. Die gesäuberte Haut wurde in 1% Dispase über Nacht
bei 4°C und anschließend weitere 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Dann wurde die Epidermis mit Hilfe einer Pinzette abgelöst. Die restliche Dermis
wurde in kleine Stücke geschnitten und im Anschluß in Kollagenase Typ II für 2
Stunden im Schüttelbad verdaut. Der flüssige Überstand wurde durch ein
Zellnylonnetz filtriert und 10 Minuten lang bei 1200 u.p.m und 4 °C zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in DMEM-Kulturmedium
resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels eines Hämozytometers bzw. eines
Zählautomaten bestimmt und die Zellen mit einer Zelldichte von 2.7x104Zellen/cm2 in
einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die gesamte Präparation wurde dabei mittels
eines standardisierten Protokolls dokumentiert.
24
2.1.9. Kultivierung und Passagierung von Fibroblasten Reagentien: Zellkulturmedien (s.o.) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Nachdem die isolierten Fibroblasten mit einer Zelldichte von 2.7x104 Zellen/cm2 in
einer P75-Kulturflasche verteilt wurden, wurden die Zellen mit 12-15ml Kulturmedium
überschichtet. Nach ca. 12h wurden die nicht adhärenten Zellen entfernt mittels 10ml
PBS unter vorsichtigem Schütteln für 1-2min und erneuter Zugabe von
Zellkulturmedium. Ein Mediumwechsel wurde jeden 2.Tag durchgeführt. Wenn die
Zellkultur zu 85-95% konfluierte, erfolgte eine erneute Passagierung. Das
Kulturmedium wurde abgezogen und die Zellkultur zunächst mit PBS gespült, um
zurückgebliebene Serumbestandteile zu eliminieren. Die Zellkultur wurde mit einer
2ml auf 37.0°C. vorgewärmter Trypsin-Lösung für die Dauer einer Dissoziationszeit
von 3-5min im Brutschrank inkubiert. Die Ablösung der Zellen wurde durch das
Trypsin mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskopes beobachtet. Die abgerundeten
Zellen vorsichtig von der Unterseite der Kulturflasche abgeklopft. Daraufhin wurde
8ml einer 10%-igen FCS-PBS-Lösung zu den trypsinierten Fibroblasten
hinzugegeben, um den dissoziierenden Effekt des Trypsins zu stoppen. Die
abgelösten Zellen wurden durch eine Pipette aus der Kulturflasche in ein Falcon
übertragen. Die erhaltene Zellsuspension wurde abzentrifugiert (1100 U/min,
21.0°C., 10min Dauer). Aus der Zentrifugation resultierte ein Zellpellet, welches in
10ml Zellkulturmedium resuspendiert und dessen Zellzahl mittels des CASY-
Zellzählers bestimmt wurde. Im Anschluss wurde die passagierte Zellkultur mit einer
Zelldichte von 1.0-2.0x104 Zellen/cm2 ausgesät.
25
2.1.10. Kryokonservierung von Zellen Reagentien: DMSO (Dimethylsulphoxid, Fa. Sigma, Cat. No. D 2650 , Deisenhofen, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum, Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Zur Kryokonservierung von Zellkulturen wurde zunächst entsprechend dem Protokoll
zur Zellpassagierung vorgegangen. Nach erfolgter Zellauszählung wurden die Zellen
erneut zentrifugiert (1100 U/min, 4°C., 10min) und in auf 4°C. temperierten
Einfriermedium (Zellkulturmedium mit 50% FBS Anteil) mit einer Zielzellkonzentration
von 3.6-4.0x106Zellen/ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in Cryo Tubes
aliquotiert (500μl Zellsuspension, ≅ 1.8–2.0x106 Zellen) und mit 500μl
Einfriermedium, 20% DMSO beinhaltend, überschichtet. Die Endkonzentration von
DMSO betrug 10% (vol/vol). Aliquotierung und Überschichtung wurden auf Eis
durchgeführt und die Zellproben in einem Nalgene® Cryo 1°C Freezing Kontainer bei
–80°C eingefroren. Hierdurch ließ sich ein langsames Einfrieren der Zellen (1°C./min)
erzielen. Nach 24h wurden die Zellproben in flüssigen Stickstoff für eine bis zu
einjährige Lagerung überführt.
2.1.11. Auftauen kryokonservierter Zellen Reagentien: FBS: Foetal Bovine Serum, Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Zellkulturmedien (s.o.) Die Cryo Tubes mit den Zellproben wurden bis zum Auftauen auf Eis gelagert. Die
Zellproben wurden im Wasserbad bei 37.0°C. unter leichtem Schwenken (Dauer: 40-
50s) aufgetaut bis nur noch ein stecknadelkopfgroßes Eisklümpchen zurückblieb.
Anschließend wurden sie sofort in 20ml Kulturmedium (20-50% FBS-Anteil)
resuspendiert, um eine Verdünnung des zytotoxischen DMSO zu erzielen. Nach
Zentrifugation (1100 U/min, 21°C., 10min) wurden die Zellen in 12-15ml
Kulturmedium resuspendiert und in einer Zellkulturflasche (P75) mit einer Zelldichte
von ca. 1.8-2.6x104Zellen/cm2 ausplattiert. Nach 24h wurde das Kulturmedium mit
nicht adhärenten Zellen abgezogen, die Kulturflasche mit PBS gespült und erneut mit
Kulturmedium überschichtet.
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2.2. Histologie
2.2.1. Doppelfärbung Hämalaun-Eosin (HE) Reagentien: Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Roti®Histokit (Fa. Roth, Cat. No. 6638.1, Karlsruhe, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Mayer´s Hämalaun (Fa. Merck, Cat. Nr. 1092490500, Darmstadt, Deutschland) Eosin (Fa. Shandon Inc., Cat. Nr. 6766007, Pittsburgh, USA) 2-Propranol (Fa. Merck, Cat. No. 159191, Darmstadt, Deutschland) Die HE-Färbung ist eine einfache, rasch durchzuführende Übersichtsfärbung. Es
wurde nach folgendem Arbeitsprotokoll vorgegangen:
1. Hämalaun-Färbung, Dauer: 2 min
2. Bläuen des Präparates, Dauer: 2x5min H2O (Temperatur: 21°C.)
3. Eosin-Gegenfärbung, Dauer: 90s
4. Differenzierungsreihe:
5. 70%iger Alkohol, Dauer: 30 s (Propranolol)
6. 80%iger Alkohol, Dauer: 60 s (Propranolol)
7. 96%iger Alkohol, Dauer: 60 s. (Propranolol)
8. 99%iger Propranolol, Dauer: 60 s
9. Rotihistol (variable Länge)
10. Eindeckeln mit Roti®Histokit
2.2.2. Oil-red-O-Färbung Reagentien: Oil-Red-O (C.I. 26125, Solvent Red 27, C62H24N4O) (Fa. Sigma, Cat. No. O-0625, Deisenhofen, Deutschland) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Aquatex (Fa. Merck, Cat. 1.08562, Darmstadt, Deutschland) Formaldehydlösung min. 37% pro analysi (Fa. Merck, Cat. No. 1.04003.1000, Darmstadt, Deutschland) Mayer´s Hämalaun (Fa. Merck, Cat. Nr. 1092490500, Darmstadt, Deutschland) CaCl2 (Fa. Merck, Cat. No. 102880, Darmstadt, Deutschland) Die Oil-red-O-Färbung ist eine Färbung zur allgemeinen Lipiddarstellung. Der
Färbemechanismus beruht auf der besseren Löslichkeit des Fettfarbstoffes in den
Lipiden des Gewebes gegenüber dem Lösungsmittel, in dem es angeboten wird.
Empfohlen wird die Verwendung von Gefrierschnitten von in Bakers Formol-Kalzium
fixiertem Material, obwohl auch mit dieser Methode eine Fixierung der Lipide nicht
garantiert werden kann. Es wurde nach einem Arbeitsprotokoll nach Romeis
vorgegangen:
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Herstellung von Formol-Kalzium nach Baker: 1. Lösen von 1g CaCl2 in 80ml Aq. bidest.
2. Zugabe von 10ml Formol (ca. 37%)
3. Neutralisation durch Zugabe von Ca2HCO3
Herstellung der Oil-red O-Färbelösung:
1. Herstellung einer Stammlösung: Lösen von 0.5g Oil-red-O in 100ml 99%igem
Isopropylakohol
2. Herstellung der Gebrauchslösung: Mischung von 6 Teilen der Stammlösung
mit 4 Teilen Aq. bidest.
3. Stehen lassen der Gebrauchslösung für 24h und anschließende Filtration
Oil-red-O-Färbung:
1. Trocknung der unfixierten Gefrierschnittpräparate
1. Spülung der Gefrierschnittpräparate bzw. der Zellkulturen in Chamber Slides
(vorherige Fixierung mit Bakers Formol-Kalzium) in H2O
2. Einbringen in 60%igen Isopropylalkohol, Dauer: 5min
3. Färbung in frisch filtrierter Oil-red-O-Gebrauchslösung, Dauer: 10-12min
4. Differenzierung in 60%igen Isopropylalkohol, Dauer: 4-6s
5. Auswaschen in Aq. bidest.
6. Kernfärbung mit Mayer´s Hämalaun, Dauer: 1-2min
7. Abspülen mit Aq. bidest. und Bläuen unter fließendem Wasser, Dauer: 5-
10min
8. Eindeckeln mit Kaisers Glyceringelatine oder Aquatex
Nach erfolgter Färbung stellen sich Lipide kräftig rot, Kerne blau dar.
28
2.2.3. Sudanrot-IV-Färbung SudanIV Sigma-Aldrich Chemie GmbH Cat. No. 064K3710 Steinheim, Germany Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Aceton pro anlysi ( CH3COCH3) (Fa. Merck, Cat. No. 1000141011, Darmstadt, Deutschland) Die Sudanrot-IV-Färbung stellt eine Alternative zur Oil-red-O-Färbung dar. Neutrales
Fett wird hierbei orange bis orangerot und Kerne blau angefärbt. Es werden
Gefrierschnitte mit einer Schnittdicke von 7-9μm verwendet. Eine Gegenfärbung
erfolgt mit Hämalaun nach Mayer.
Ansezten der Färbelösungen - Sudanrot:
Je 1 g von trockenem Sudan IV in einer trockenen Flasche mischen. 200 ml der
Herxheimer Mischung (= gleiche Teile 70%iger Alkohol und Aceton) zugeben und gut
schütteln.
Einige Tage ruhen lassen.
Färbetechnik:
1. 70%iger Alkohol 5 Min.
2. Sudanmischung 1 Min.
3. 50%iger Alkohol, um die Reaktion zu stoppen
4. 70%iger Alkohol
5. kurz in Brunnenwasser spülen
6. Hämalaun nach Mayer 2 Min.
7. Bläuen in kaltem Brunnenwasser 10 Min.
8. Eindeckeln (Kaiser Glyceringelatine)
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2.2.4. Elastica-Van Giesson Reagentien: GIEMSA: Accustain GIEMSA Stain Modified (Fa. Sigma, Cat. No. GS-500) Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Die Elastika van Gieson- Färbung wurde mit dem Accustain GIEMSA Stain Modified
durchgeführt. Die Gewebeschnitte werden mit einer Hämatoxylin-Jod-Eisen-(III)-
Chloridlösung gefärbt. Der positive geladene Farblack wird an das stark saure
Elastomuzin, eine Komponente der elastischen Fasern, angelagert. Anschließend
wird differenziert und mit einer van Gieson-Lösung gegengefärbt.
Herstellung der Lösungen:
1. 20 ml alkoholische Hämatoxylinlösung (Cat. No. HT25-1)
2. 3 ml Eisen-(III)-chlorid-Konzentrat (Cat. No. HT25-2)
3. 8 ml Jodlösung nach Weigert (Cat. No. HT25-3)
4. 5 ml Aq. dest.
5. Gut mischen
Differenzierungslösung:
1. 37 ml Aqua dest.
2. 3 ml Eisen-(III)-chlorid-Konzentrat (Cat. No. HT25-2)
3. gut mischen, täglich frisch ansetzen
Färbevorschrift
1. Entparaffinierte Schnitte in Aqua dest.
2. Färbelösung 10 Min.
3. Aqua dest. gut spülen
4. Differenzierung einige Sek.
5. Leitungswasser, fließend 5 Min.
6. 95% Alkohol kurz spülen
7. Aqua dest. kurz spülen
8. van Gieson-Lösung 2 min.
9. 95% Alkohol kurz spülen
10. abs. Alkohol, Xylol, in Rotihistol eindeckeln
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2.2.5. Immunhistochemie Reagentien: Mouse-on-Mouse Immunodetection Kit (M.O.M.® Kit, Fa. Linaris, Cat. No. EMP 2200, Wertheim-Bettingen, Deutschland) Monoclonal Mouse Anti – Vimentin (Fa. Dako, Cat. No. M7020, Clostrup, Denmark) H2O2 (35%-ige Lösung, Fa. Merck, Cat. No. 1.08600.1000, Darmstadt, Deutschland) Pferde-Serum (Fa. Gibco, Cat. No. 16050-130, Carlsbad, USA) Ziegen-Serum (Fa. Sigma, Cat. No. G 9023, Deisenhofen, Deutschland) Peroxidase Blocking Reagent (Fa. Dako, Cat. No. S 2001, Carpinteria, USA) DAB (Liquid DAB + Substrate-Chromogen System, Fa. Dako, Cat. No. K 3467, Carpinteria, USA) AEC (Liquid AEC + Substrate-Chromogen System, Fa. Dako,, Cat. No. K 3461, Carpinteria, USA) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck, Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Dako EnVision™+, Ziege Anti-Maus, Peroxidase (Fa. Dako, Cat. No. K4000, Carpinteria, USA) Monoclonal Mouse Anti-Human Endothelial Cell, CD 34 (Fa. Dako, Cat. No. M 0823, Carpinteria, USA, Klon JC/70A, monoclonal mouse IgG1) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Immunhistochemische Analysen wurden an 10µm dicken Gefrier- und
Paraffinschnitten von Präparaten aus allen Versuchsgruppen durchgeführt. Es
kamen dabei monoklonale Antikörper spezifisch für Vimentin (1:50) und CD 34 (1:50)
zum Einsatz. Bei allen immunhistochemischen Färbungen wurde jeweils eine Positiv-
(humane Haut) und eine Negativkontrolle (murine Haut) angefertigt. Es wurde ein
Mouse-on-Mouse Immunodedection Kit (Fa. Linaris) für die Färbungen verwendet.
Ziel war die Blockierung endogener Maus-Immunglobuline im Mausgewebe vor
Inkubation mit dem Sekundärantikörper, um so das Problem der starken
Hintergrundfärbung bei Verwendung monoklonaler Maus-Primärantikörper und anti-
Maus IgG Sekundärantikörper zu vermeiden. Wesentliche Bestandteile des
M.O.M.™-Immunodetection Kit sind das IgG-Blockierungs-Reagenz, ein Protein-
Verdünnungspuffer, biotinylierte anti-Maus IgG Sekundärantikörper und ein
VECTASTAIN Elite ABC-Reagenz mit HRP-gekoppelten Antikörpern. Es wurde nach
dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Alle Präparate wurden vor bzw.
zwischen den Inkubationsschritten mit PBS gespült. Alle Inkubationsschritte erfolgten
bei 21°C. in einer Feuchtkammer, um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern.
Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation der Präparate für 10min in
PBS, beinhaltend 1% H2O2 und 1% Pferdeserum, reduziert. Pro Objekträger wurden
125μl des mit einem im Kit enthaltenen Puffer (M.O.M. diluent) verdünnten
Primärantikörpers aufgetragen und für 30min inkubiert. Zur Entwicklung wurde das
HRP-Substrat AEC bzw. DAB wie oben beschrieben zugegeben.
31
2.2.6. Vitalitätsfärbung YoYo Reagentien YOYO-1iodide Molecular Probes Lot. No. 4971-13 Leiden, Netherlands PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland)
Bei der Vitalitätsfärbung werden nur intakte Nukleinsäuren angefärbt, so dass keine
denaturierten Nukleinsäuren markiert werden. Auf diese Weise kann nekrotisches
Gewebe von vitalem Gewebe differenziert werden. Hierzu wird YoYo 1:1000 mit PBS
verdünnt und auf die Schnitte pipettiert. Nach 9 Minuten Inkubation wird mit PBS
gewaschen und anschließend mit Aquatex eingedeckelt. Parallel erfolgte eine H&E-
Färbung des jeweiligen Schnittes. Unter dem Fluoreszenzmikroskop erfolgt die
Analyse, welche zusätzlich mit der histologischen Färbung in H&E verglichen wird.
2.2.7. In situ Zellproliferationkit, BrdU
Reagentien In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS (Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Cat.No. 1810740, Penzberg, Germany) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) HCl MERCK KgaA Cat. No. 100319 Darmstadt, Germany
Mit Hilfe des In Situ Zellproliferationskit für die Detektion von 5-Bromo-2´-Deoxyuridin
(BrdU) können DNA synthetisierende Zellen von ruhenden Zellen differenziert
werden. BrdU ist analog zu Thymidin und kann statt Thymidin in die DNA von Zellen
in der S-Phase eingebaut werden. Der Assay ist eine immunhistochemische Technik,
die einen monoklonalen Antikörper aus der Maus gegen BrdU nutzt. Die Prozedur
besteht aus folgenden Schritten:
a. Das BrdU gelabelte Reagenz wird in das Tier injiziert. Dann wird das Tier
getötet und das Fettgewebe für Schnitte präpariert.
b. Die Präparate werden mit Trypsinlösung bedeckt und für 5-15 Min bei 37°C
inkubiert.
c. Die DNA im fixierten BrdU gelabelten Gewebe wird durch HCl-Säure
denaturiert.
d. Es folgt die Detektion des inkorporierten BrdU mit einem Fluoreszenzfarbstoff
konjugierten anti-BrdU monoklonalen Antikörper.
e. Die Proben können letztlich unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert
werden.
32
Die Detektion von Zellen in der S-Phase kann einen Hinweis geben, ob die
vorliegenden Zellen möglicherweise Tumoreigenschaften besitzen.
2.2.8. Gewebeeinbettung und histologische Aufarbeitung 2.2.8.1. Kryo-Einbettung Reagentien: Tissue Freezing Medium ™ (Fa. Jung, Cat. No. 0201 08926, Karlsruhe, Deutschland) Kryotom (Fa. Leica, CM 3050) Saccharose (Sucrose), C12H22O11, Mr= 342.30 g/Mol (Fa. Merck, Cat. No. 1.07687.1000, Darmstadt, Deutschland) K2HPO4 (Fa. Merck, Cat. No. 105099, Darmstadt, Deutschland) KH2PO4 (Fa. Merck, Cat. No. 105108, Darmstadt, Deutschland) Super Frost®Plus Objektträger (25x75x1.0 mm Fa. Menzel-Gläser, Cat. No. 041300, Heidelberg, Deutschland) Zur Cryo-Einbettung von Gewebebiopsaten wurden diese nach Biopsatentnahme in
Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffer eingelegt und später in Tissue Freezing
Medium eingebettet. Es wurde nach folgendem Arbeitsprotokoll vorgegangen:
Ansetzen des Kaliumhydrogenphospatpuffers: Ansatz: Stammlösung KH2PO4/K2HPO4 Puffer 0,2 M
• 1,088 g K2HPO4 in 40ml Aqua bidest lösen
• 13,92 g KH2PO4 in 400 ml Aqua bidest lösen
Beide Lösungen mischen und pH-Wert auf pH 7.4-7.8 einstellen. Zur Herstellung der
Gebrauchslsg. (0.1 M): 100 ml 0,2 M KH2PO4/K2HPO4 Puffer mit 100 ml Aqua bidest
verdünnen
Ansetzen des Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffers: Zu 100 ml 0,1 M KH2PO4/K2HPO4 Puffer 15 g Saccharose ( Fa. Merck) zugeben.
Einbettung: 1. Biopsieentnahme
2. Explantat in 4-5ml 15%ige Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffer-Lsg.
geben, Einwirkzeit ca. 15 min., Explantat aus Lösung entnehmen, abtropfen
lassen und in Tissue Freezing Medium (Fa. Leica) überführen (in vorbereiteter
würfelförmiger Aluform), Einwirkzeit bei Raumtemperatur ~15min.
3. Aluform mit Explantat auf Kühlplattform (in flüssigem Stickstoff (–80° C.)
stehend) stellen und langsame Aushärtung des Tissue Freezing Mediums
abwarten.
33
4. Aluform für 24h in –20°C. Gefrierschrank überführen (weitere Verfestigung,
optimale Schneidetemperatur der Objekte im Cryostat bei –22 bis –25°C.
Objekttemperatur)
Histologische Aufarbeitung:
Die Präparate wurden mit einem Kryotom (Fa. Leica, CM 3050) bei -24°C.
Objekttemperatur geschnitten. Zum Schneiden wurde die Aluform entfernt, das
Objekt nach Wunsch orientiert und mittels eines Tropfens Tissue Freezing Mediums
auf der Objektplatte fixiert. Es wurden Schnitte mit 5-15µm Schnittdicke hergestellt,
auf Objektträger aufgezogen und diese bis zur Verwendung bei -20°C. eingefroren.
2.2.8.2. Paraffin-Einbettung Reagentien: Paraplast Tissue Embedding Medium 1kg (Tyco Healthcare Group LP, Cat.No. 0120388895010064, Mansfield, USA) Coultergefäße (Coulter Electronics Ltd., Cat.No. 5634220003 Fullerton, USA) Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Isopropranol (Fa. Merck, Cat. No. 159191, Darmstadt, Deutschland) Leica EG1160 Paraffinausgießstation (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070637101, Nußloch, Deutschland) Leica TP1020 Histokinette (Leica Microsystem GmbH, Wetzlar, Germany) Memmert Wärmeschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH + Co. KG Schwabach, Deutschland) Mikrotom RM 2165 Rotationsmikrotom (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070037105, Nußloch, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Die Hautbiopsien wurden in einer 3,5%ige Formalinlösung für mindestens 8 Stunden
aufbewahrt. Im Anschluß wurden die Hautbiopsien in Histokinette-Kassetten
eingespannt.
Folgende Schritte erfolgten im Infiltrationsautomaten bzw. Histokinette:
1. Station: 70%ige Ethanol 1Std.
2. Station: 96%ige Ethanol 1Std.
3. Station: 96%ige Ethanol 1Std.
4. Station: 100%ige Ethanol 1Std.
5. Station: 100%ige Ethanol 1,5Std.
6. Station: Isopropanol + Rotihistol 1:1 2Std.
7. Station: Rotihistol 2Std.
8. Station: Rotihistol 1Std.
9. Station: Paraffin 2Std.
10. Station: Paraffin 1,5Std.
11. Station: Paraffin 1Std.
Die Biopsien wurden aus den Kassetten entfernt und mit Hilfe der
Paraffinausgießstation eingeblockt.
34
Die ausgehärteten Blöcke wurden mit Hilfe des Rotationsmikrotoms geschnitten und
auf die Objektträger fixiert.
2.3. Langzeittierversuch
2.3.1. Athymische Nacktmaus
2.3.1.1. Versuchstiere Männliche athymische Nacktmäuse (Fa. Charles River Laboratories, Balb/cnu/nu-
Mäuse von Iffa Credo, Frankreich, Alter: 49-56 Tage) dienten als Versuchstiere. Die
Tiere waren in der Versuchstierhaltung der Abteilung Chirurgische Forschung des
Universitätsklinikums Freiburg untergebracht, lebten in einem regelmäßigen
zwölfstündigen Hell-Dunkel-Zyklus und hatten freien Zugang zu Standardfutter (Fa.
Sniff, Deutschland) und Trinkwasser, dem ein Oxytetracyclin/Vitaminpräparat
beigemischt wurde. Es wurde ein ‚laminar air flow’ Käfigsystem (Duoflo, Fa. Bioclean
Lab Procedures, Inc., Maywood, NY, USA) zur Haltung verwendet. Präoperativ
wurden 5-6 Tiere in einem Käfig auf Spreu gehalten, postoperativ wurden die Tiere
einzeln auf Zellstoffunterlagen gesetzt. Die Eingriffe wurden in tiefer
Inhalationsnarkose (Halothan 2.5%, 2-3l/min NO2) nach Desinfektion der Rückenhaut
unter sterilen Kautelen durchgeführt. In der postoperativen Phase wurde der
Gesundheitszustand der Tiere täglich durch das Tierpflegepersonal, alle 2-3 Tage
durch die Operateure selbst überprüft. Eine deutliche Verschlechterung des
Allgemeinzustandes der Tiere bzw. Infektionen im Bereich des Operationsgebietes
hätte zu einem vorzeitigen Studienabbruch geführt. Alle Tierversuche waren von dem
Tierschutzbeauftragten des Universitätsklinikums Freiburg (Hr. Dr. Roth) und dem
Amt für Öffentliche Ordnung – Veterinärbehörde (Fr. Dr. Dietrich) – genehmigt
(Tierversuchsvorhaben „Transplantation kultivierter Präadipozyten und
Endothelzellen zum Ersatz von Weichteilgeweben“; Registrier-Nummer: G-02/03,
Aktenzeichen : 35-9185.81/1/597).
35
2.3.1.2. Fibrin Reagenzien: Aprotinin Aprot. Bay 5 ml 3000 KIE/ml (Cat. No. B20142 Fa. Baxter AG Wien Austria) Baxter Thrombin-Verdünnungspuffer, 40mM CaCl2 . 2H2O, 171mM NaCl, 40mM Glycin, 50g HSA/l (Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) CaCl2 * 2H2O (Fa. Merck, Cat. No. 102880-100, Darmstadt, Deutschland) Verdünnungspuffer Calciumcl. USA 40 mmol/Liter 2ml (Cat. No. B20821 Fa. Baxter AG Wien Austria) Fibrinkleber Tissucol DuoS Immuno (Fa. Baxter Hyland Immuno, 0,5 ml Cat. No. B1330520110616, 1ml Cat. No. B1331020110614, 2ml Cat. No. B1332020110601, Tissucol Kit (lyophilisierte Komponenten) 2ml Cat. No. B193224011060, Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) NaCl (Fa. Merck, Cat. No. 159-302-500, Darmstadt, Deutschland) Na3Citrat (Fa. Merck, Cat. No. 106446-500, Darmstadt, Deutschland) Thrombin Human (Pulver) 500 IE/ml 5ml (Cat. No. B205521 Fa. Baxter AG Wien Austria) Die Fibrinogenlösung wurde unter Rühren aus 1ml 70-110mg/ml Fibrinogenpulver,
1ml Aprotinin und 2ml 0,9%iger NaCl hergestellt. Die Thrombinlösung setzte sich aus
Thrombin Human 500 IE/ml der Fa. Baxter, 1ml CaCl2 und 6ml Verdünnungspuffer,
so dass eine 1ml Lösung ca. 70 I.E. Thrombin enthält. Die angesetzten
Gebrauchslösungen der einzelnen Komponenten wurden in Spritzen aufgezogen und
in die Applikationsvorrichtung eingepasst. Die Zellfraktion (10-60 Millionen
Zellen/1000μl Thrombinvolumen) wurde dabei in die Thrombin-Komponente
eingebracht, mehrfach resuspendiert und unverzüglich eingesetzt, um eine möglichst
gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Fibrinmatrix zu erzielen. Es
mussten hierbei die final erwünschten Thrombinkonzentrationen pro 1ml
Konstruktvolumen berücksichtigt werden. Zur Applikation der Zellen wurde ein Zwei-
Spritzen-Applikationssystem zur simultanen Einbringung beider Fibrinkleber-
Komponenten (Thrombin, Fibrinogen) eingesetzt (Abb. 1.). Nach Aufsetzen des
Verbindungsstückes und der Applikationsnadel wurde das Zell-Matrix-Konstrukt mit
einem Gesamtvolumen von 1ml in die Flanke der Maus gespritzt. Ein
Applikationssystem konnte so für 2 Zell-Matrix-Konstrukte eingesetzt werden.
36
37
S
Abb. 1. Doppelspritzeninjektionssystem für Fibrinkleber. Bestehend aus einer Halterung für zwei identische Spritzen und einem gemeinsamen Stempel, mit dem Volumina beider Fibrinkleberkomponenten (Fibrinogenfraktion, Thrombinfraktion mit Zellresuspendat) über ein gemeinsames Anschlußstück in einer Kanüle gleichmäßig durchmischt und injiziert werden können. In in vitro Untersuchungen wurde eine annähernd gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Fibrinmatrix gefunden.
2.3.1.3. Transplantation von Zell-Matrix-Konstrukten Die Rückenhaut wurde durch eine Sogvorrichtung angehoben. Diese ist ähnlich einer
von Marler et al. (Marler JJ 2000) beschriebenen Applikationsmethode zur
Standardisierung der vom Transplantat eingenommenen Grundfläche, Form und
Lokalisation an der Mausflanke. Durch Applikation eines definierten, lokal begrenzten
Unterdrucks auf der Haut und seitlicher subkutaner Injektion unter diesen Bereich
kann das Zell-Matrix-Konstrukt auf diesen Bereich begrenzt werden. Dieser Sog
wurde erzeugt durch eine Spritze, dessen Ende entfernt wurde und die Ränder
abgeschliffen wurden. Mit Hilfe dieser präparierten Spritze konnte ein Unterdruck
hergestellt werden bei gleichzeitigem Ziehen am Kolben und Anlegen an die Haut.
Neben Vorteilen im Tierversuch ermöglicht diese Technik u.a. die Applikation von
Fibrinkleberzusammensetzungen mit niedriger Thrombinkonzentration und
langsamer Aushärtungskinetik.
Unter Verwendung eines Zwei-Spritzen-Applikationssystems zur zeitgleichen
Injektion wurden die Zell-Fibrinogen-Fraktion und die Thrombinkomponente unterhalb
des Panniculus carnosus injiziert.
Innerhalb jeder Versuchsgruppe wurden an jeder Maus zwei Transplantationen
durchgeführt. Transplantationsorte waren die rechte und linke Flanke.
Transplantationsort, Gruppen-zugehörigkeit, Besonderheiten während der
Transplantation und Transplantationsverlauf wurden streng protokolliert.
pritzenhalterung
Anschlußstück
Einlumige Kanüle
Fibrinogenkomponente
ThrombinkomponenteThrombinkomponente
2.3.1.4. Tätowierung Material: Spezialtätowierfarbe Hauptner Herberholz Germany
Die Tätowierung wird mit einer sterilen chirurgischen Pinzette und einer speziellen
Tätowierfarbe vorgenommen. Mit Hilfe der Pinzette werden kleine Stiche entlang des
Randes von dem injezierten Konstrukt appliziert. Dann wird ungefähr eine
Fingerspitze der Tätowierpaste auf die erzeugten Stichmale einmassiert. Diese
Prozedur erfolgt stets nach Injektion der Konstrukte in die linke und rechte Flanke der
Maus. Die Maus wurde währenddessen narkotisiert. Die Tätowierungen mussten
gelegentlich nach 2 bis 4 Wochen wiederholt werden.
2.3.1.5. Biopsieentnahme Nach Ablauf der jeweils vorab festgelegten Versuchsdauer erfolgte vor
Biopsatentnahme die tierschutzgerechte Tötung der Versuchstiere entsprechend den
Forderungen durch Kohlendioxid-Inhalation (CO2) in einem Euthanasiekasten und
anschließender Luxation der Halswirbelsäule (Okzipitalgelenkluxation). Die Biopsien
der gesamten Körperwand von 1.5cmx1.5cm Größe wurden im Bereich der
Transplantationsorte entnommen. Die Biopsien wurden dem Protokoll für
Gewebeeinbettung folgend vor Ort in zwei gleiche Teile geschnitten. Die eine Hälfte
wurde in Tissue Freezing Medium überführt und bis zur histologischen Aufarbeitung
bei –20°C. gelagert. Die andere Hälfte wurde zunächst in 4%iger Formalinlösung
über einen Zeitraum von 15h fixiert und später in Paraffin eingebettet. Durch diese
Vorgehensweise konnten die Vorzüge der Kryo- und der Paraffineinbettung für die
histologische Analyse genutzt werden.
38
39
2.3.2. Auswertung 2.3.2.1. Bewertung der explantierten Proben Vor der Explantation wurden die entnommenen Proben bezüglich ihrer Größe
bewertet. Die Skala der Bewertung reichte von 0 bis 4. Null bedeutet, dass kein
implantiertes Gewebe vorgefunden werden konnte. Mit 1 wurden die Proben
beziffert, bei denen nicht mit Sicherheit ein Implantat verneint oder bejaht werden
konnte. Proben mit der Bewertung 2 waren kleine Implantate, d.h. sie ließen sich
noch von dem umgebenden Gewebe abgrenzen. Sie waren flächig von ungefähr
einem halben bis ganzen Zentimeter Durchmesser und ohne Erhabenheit. Mit 3
wurden Proben bewertet, welche leicht erhaben und von mittlerer Größe waren.
Proben mit der Bezifferung 4 waren ungefähr 3 mm erhaben und in der Fläche einen
Durchmesser von 1 cm (Abb.2.).
Für die Untergruppen 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3, 6.1 ,6.2, 6.3 sowie
für die Gruppen 4 und 5 wurden jeweils 8 Mittelwerte errechnet. Der einzelne
Mittelwert resultierte aus Quersumme aus der Beurteilung des einzelnen
Konstruktes. Jede dieser Gruppen wurde in Form von BoxPlots und auch als
Stabdiagramm für ein besseres Verständnis der Daten dargestellt. Die Gruppen
wurden untereinander wiederum mit Hilfe des Mann-Whitney-Wilcoxon-Test
Skala
0 Kein Implantat sichtbar
1 Implantat, welches nicht mit Sicherheit von der Umgebung abgegrenzt werden konnte
2 Implantat mit einem Durchmesser von 0,5-1cm und mit flacher Oberfläche
3 Implantat mit einem Durchmesser von 0,5-1cm und mit erhabener Oberfläche bis zu 3mm
4 Implantat mit einem Durchmesser von mind. 1cm und mit erhabener Oberfläche von 3mm
Abb.2. Schema für die Bewertung der explantierten Proben
bezüglich ihrer Signifikanz untersucht. Zur Erstellung der BoxPlots und des Mann-
Whitney-Wilcoxon-Tests wurde das Programm SPSS verwendet.
2.3.2.2 Histomorphometrie Material: DatInf Measure Version 1.0 (DatInf GmbH, Tübingen, Deutschland) SPSS Version 13.0 für Windows (SPSS Incorporation, Chicago, USA) Die morphometrische Analyse histologischer Präparate der Tierversuchsgruppen
wurde mit dem computergesteuerten Image-Analyse-Programm DatInf Measure
Version 1.0 der DatInf GmbH in Tübingen durchgeführt. Hierzu wurden
standardisierte Digitalaufnahmen der einzelnen Präparate (Weißabgleich,
Lichttemperatur 3200 K, standardisiertes Aufnahmefenster in 25facher
Vergrößerung) mit einer hochauflösenden Digitalkamera angefertigt. Das Programm
kann nicht mit Bildern im TIF-Format arbeiten, sondern nur mit Bildern im JPEG-
Format. Daher ist die Bildqualität nicht so gut wie bei anderen mikroskopischen
Bildern.
Von jedem Konstrukt wurde jeweils das Bild mit der größten Fläche herausgesucht.
Es wurden nur Flächen von Konstrukten verwertet, die in der Immunhistologie ein
positives Ergebnis vorweisen konnten. Mit Hilfe des DatInf Measure-Programm
wurde auf einem Bild die markierte Fläche errechnet. Hierzu mußte die gewünschte
Fläche mit dem Cursor markiert werden und auf der Photographie ein Maßstab
angegeben werden (Abb. 3. u. 4.). Auf diese Weise wurde sichergestellt, dass nur die
Fläche des neugebildeten humanen Gewebes ausgemessen wurde. Konstrukte ohne
eine positive Immunhistologie wurden bei der späteren Berechnung der
Abb.3. Beispiel für die histomorphometrische Messung bei einem Bild der Gruppe 5
Abb.4. Beispiel für die histomorphometrische Messung bei einem Bild der Gruppe 5
40
Durchschnittsfläche mit 0 angegeben, wobei die Gesamtzahl n konstant blieb. Für die
Untergruppen 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3, 6.1 ,6.2, 6.3 sowie für die
Gruppen 4 und 5 wurden jeweils 8 Maximalwerte errechnet. Jede dieser Gruppen
wurde in Form von BoxPlots dargestellt. Die Gruppen untereinander wiederum
wurden mit Hilfe des Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bezüglich ihrer Signifikanz
untersucht. Zur Erstellung der BoxPlots und des Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests
wurde das Programm SPSS verwendet.
2.3.3. Magnetresonanztomographie Material und Reagentien: Magnetom Trio, ein Ganzkörper 3 Tesla Magnetresonanzsystem (Siemens AG München, Germany) 2,2,2 Tribromoethanol 99% 25g (Fa. Sigma-Aldrich, Cat. No. T48402, Deisenhofen, Deutschland ) + tert – Amylalkohol 99% 100ml (Fa. Sigma-Aldrich Cat. No. W205605, Deisenhofen, Deutschland ) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Avertinlösung: 1g Tribromoethanol gelöst in 1 ml Amylalkohol = 100%iges Avertin (Stammlösung) 1ml 100%iges Avertin in 40 ml steriles PBS lösen = 2,5%iges Avertin Anwendung: 1 μl/ g Maus intraperitoneal Bei einem Versuchstier der Gruppe 1.4 wurden von dem rechten Konstrukt MRT-
Bilder aufgenommen, um einen Eindruck von der Morphologie des implantierten
Gewebes im noch intakten Organismus zu gewinnen. Die MRT-Aufnahmen wurden
in den Einrichtungen der Radiologie in der Uniklinik Freiburg unter Anleitung von
Prof. Dr. M. Uhl durchgeführt. Mit Hilfe der Immunhistologie wurde nach Explantation
verifiziert, dass es sich um humanes Gewebe handelte. Für die Aufnahmen musste
das Tier in eine tiefe Narkose gebracht werden; hierzu wurde Avertin verwendet. Das
narkotisierte Tier wurde nach den Aufnahmen von ca. 10 Minuten Dauer mit Hilfe von
körperwarmen Gelpacks gewärmt, da die Gefahr der Entstehung einer Hypothermie
infolge der tiefen Narkose bestand. Die Explantation erfolgte 5 Stunden nach den
MRT-Aufnahmen, sodass ein direkter Vergleich zwischen den MRT-Aufnahmen und
den histologischen Schnitten möglich war.
41
2.4. Tierversuchsaufbau Insgesamt gliedert sich der Versuch in 6 Gruppen. Die Gruppe 1 ist in 4
Untergruppen untergliedert und die 2. Gruppe sowie die 3. Gruppe sind jeweils in
drei Untergruppen unterteilt.
Gruppe 1: Injektion von 5 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und
linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c
Nacktmaus.
Gruppe 1.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)
Gruppe 1.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)
Gruppe 1.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)
Gruppe 1.4: Explantation von 8 Konstrukten nach 9 Monaten (n = 8)
Gruppe 2: Injektion von 5 Mill. Fibroblasten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und
linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c
Nacktmaus.
Gruppe 2.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)
Gruppe 2.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)
Gruppe 2.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)
Gruppe 3: Koimplantation von 5 Mill. Präadipozyten und 1 Mill. HDMVECs als
Späroide mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und linke Flanke unterhalb des
Panniculus carnosus einer athymischen balb/c Nacktmaus.
Gruppe 3.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)
Gruppe 3.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)
Gruppe 3.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)
Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die
rechte und linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c
Nacktmaus. Injektionen erfolgten nach der Implantation 4 Wochen und 3 Monate
später. Insgesamt wurden 15 Mill. Präadipozyten in jeweils eine Flanke injeziert (n =
8).
42
Gruppe 5: Injektion von 30 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte
und linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c
Nacktmaus (n = 8).
Gruppe 6: Injektion von 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und linke Flanke unterhalb
der Panniculus carnosus einer athymischen balb/c Nacktmaus mit Explantation nach
4 Wochen (n = 8)
2.5. Photographien Aufnahmen histologischer Schnittpräparate wurden mit einem Zeiss Axioplan
Durchlichtmikroskop unter Verwendung des Photosystems AxioVision durchgeführt.
Von allen relevanten Präparaten wurden Digitalaufnahmen mit einer
hochauflösenden Digitalkamera Axiocam color VDC12 angefertigt. In die originalen
Digitalbilder wurden lediglich mittels Adobe Photoshop® z.T. Buchstaben,
Größenmaßstäbe und Legenden eingefügt. Bei unscharfen oder verwaschenen
Bildern wurde der Bildkontrast erhöht. Eine weitere digitale Bearbeitung der
Aufnahme fand nicht statt.
43
2.6. Materialien
2.6.1. Gerätschaften accu-jet® Pipettierhilfe (Fa. Brand GmbH, Cat. No. 265 04, Wertheim, Deutschland) Autoklav Dampfsterilisator Ventilab HP669-H (Fa. MMM (Münchner Medizin Mechanik GmbH, Planegg, Deutschland) Brutschrank BSS 160 Brutgerät (Fa. Grumbach Brutgeräte GmbH, Aßlar, Deutschland) Kryotom CM 3050 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Heerbrugg, Niederlande) Digitalkamera Mikroskop, Axiocam color 12VDC (Fa. Carl Zeiss, Jena, Deutschland) Eppendorf Research® Pipetten 0,1-2,5μl, 0,5-10μl, 2-20μl, 10-100μl, 100-1000μl (Fa. Eppendorf, Deutschland) Feder Histologie Einmalklingen S3 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Heerbrugg, Niederlande) Gefrierschrank (-20° C.) Ökoplus Elektronik (Fa. Siemens, München, Deutschland) Gefrierschrank (-80° C.) (Fa. Forma Scientific, Deutschland) Glasswaren Pyrex® (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Inverses Mikroskop Axiovert 25 (Fa. Carl Zeiss Jena, Jena, Deutschland) Laminar air flow, Mikrobiologische Sicherheitswerkbank, Klasse II, Serie SE, Modell 51424/5 (Fa. Microflow, Andover, Großbritannien) Leica TP1020 Histokinette (Leica Microsystem GmbH, Wetzlar, Germany) Leica EG1160 Paraffinausgießstation (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070637101, Nußloch, Deutschland) Memmert Wärmeschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH + Co. KG Schwabach, Deutschland) Mikrotom RM 2165 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Cat.No. 070037105, Heerbrugg, Niederlande) Mikroskope (Fa. Carl Zeiss, Standard 20; Axioplan 2, Axiovert 100, Jena, Deutschland) Mikroskop-Software (Fa. Carl Zeiss, Aufnahme-Software AxioVision, Image-Analyse Software KS 300, Jena, Deutschland) Millipore– Anlage: Milli – Q PF PLUS (MILLIPORE Corp, Cat. Nr. PF03292, Bedford, USA) Nalgene® Cryo 1° C. Freezing Container “Mr. Frosty” (Fa. Nalgene, Cat. No. 5100, Wiesbaden, Deutschland) Neubauer-Zählkammer / Hämocytometer (Fa. Roth, Cat. No. T728.1, Karlsruhe, Deutschland) Paraffinausgießstation Leica EG1160 (Fa. Leica Instruments GmbH Cat No. 070637101, Nussloch, Deutschland) Reagenzglasschüttler Reax control (Heidolp-Elektro, Kelheim, Deutschland) Schüttlerwasserbad SWB 20 (Fa. Haake, Karlsruhe, Deutschland) Stickstofftank Chronos 100 (Fa. MG-Messer Griesheim GmbH, Krefeld, Deutschland) Trockenschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH, Schwabach, Deutschland) Vakuumpumpe ME 25 (Fa. Vacuubrand, Wertheim, Deutschland) Zellkulturbrutschrank HeraCell (Fa. Heraeus (Kendro), Cat. No. 51013569, Berlin, Deutschland) Zentrifugen (Fa. Sorvall (Kendro), Berlin, Deutschland)
2.6.2. Verbrauchsmaterialien Cyogenic Vials (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Bottle Top Filters (Fa. Corning Costar, Cat. No. 430513, Bodenheim, Deutschland) Coultergefäße (Coulter Electronics Ltd., Cat.No. 5634220003 Fullerton, USA) Deckgläser (Fa. Roth, 24 x 40 mm Cat. Nr. H875.1, 24 x 24 mm Cat. Nr. H1870, Fa. Roth, Karlsruhe, Deutschland) Falcon®Cell Culture Inserts (Fa. Falcon, Cat. No. 3104, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Companion TC Plate (Fa. Falcon, Cat. No. 3504, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Cell Strainer (Fa. Falcon, Cat. No. 2350, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Blue Max™ Conical Centrifuge Tubes (Fa. Falcon, 15ml, 50ml, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Fibrinkleber Tissucol DuoS Immuno (Fa. Baxter Hyland Immuno, 0,5 ml Cat. No. B1330520110616, 1ml Cat. No. B1331020110614, 2ml Cat. No. B1332020110601, Tissucol Kit (lyophilisierte Komponenten) 2ml Cat. No. B193224011060, Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) Filterpapier, Porengröße 320 mm. (Folded Filters Fa. Schleicher & Schnell, Dassel, Deutschland) Incidin, Incidin Perfekt (Fa. Henkel Hygiene GmbH, Düsseldorf, Deutschland) Injektionsspritzen (Fa. Braun, 2ml Cat. No. 09066500, 5ml Cat. No. 09066527, 10 ml Cat. No. 09066535, Melsungen, Deutschland) Kanülen 100 Sterican (Braun, 0,40 x 20 mm G20 Cat. No. 9013601, 0,60 x 30 mm G14 Cat. No. 9013318, 0,80 x 40 mm G2 Cat. No. 9013105, 0,90 x 70 mm G1 Cat. No. 9012001, Melsungen, Deutschland) Kulturflaschen p25 (Cat. No. 430639), p75 (Cat. No. 430641) (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Millex®-GV Sterilizing Filter Unit (Fa. Millipore, SLGV 025 LS, 0.22μm Durapore® membrane filter, Bedford, USA) Parafilm Pasteur-Pipetten pH-Papier: PH – Fix 0,0 – 6,0 (Fa. Macherey-Nagel, Cat. Nr. 92115, Düren, Deutschland) Serologische Pipetten (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml, Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Einmalskalpelle (Fa. Feather, Tokio, Japan)
44
45
3. Ergebnisse
3.1. Isolation, Kultivierung, Implantation und Explantation Aus dem Fett- und Hautgewebe der Dermolipektomien konnten die Zellen
entsprechend den Protokollen isoliert werden. Die Isolation und Kultivierung
gestalteten sich bei den Präadipozyten und Fibroblasten ohne Schwierigkeiten, da
beide Zellen zum einen in hoher Anzahl im Gewebe der Dermolipektomien
vorhanden sind und zum anderen in ihren Kulturmedien gut proliferieren können. Die
Isolierung und vor allem die Kultivierung der HDMVECs sind im Vergleich zu den
Präadipozyten und Fibroblasten erschwert durch zusätzliche Arbeitsschritte.
Die Implantation verlief bei allen Gruppen ohne größere Komplikationen. Mit Hilfe der
Vakuumspritze konnte eine präformierte Höhle erzeugt werden, in die das Fibrin
injiziert werden konnte (Abb. 5). In manchen Fällen musste durch leichten Druck mit
den Fingern das injizierte Fibrin unterhalb der Haut nachmodeliert werden.
Abb. 5. Subkutane Injektion einer Fibrinmatrix. In Inhalationsnarkose wurde jedem Tier beidseitig paravertebral 1ml Fibrinmatrix subkutan injiziert. Dazu wurde die Rückenhaut mittels Vakuumspritze angehoben und die Fibrinmatrix in die Subcutis unterhalb des Panniculus carnosus eingespritzt.
46
Bei der Explantation konnte die Injektionsstelle wegen der Tätowierung bei
Implantation leicht aufgefunden werden. Die Explantation verlief bei jeder Gruppe
ohne Probleme.
3.2. Ergebnisse der Versuchsgruppen 3.2.1. Gruppe 1: 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin Die Gruppe 1 setzt sich aus vier Untergruppen zusammen. Die Untergruppe 1.1
wurde nach 4 Wochen explantiert. Bei den 8 injizierten Zellmatrix-Konstrukten
bestehend aus Fibrin und Präadipozyten konnten 3 makroskopisch und 5
histologisch beim geplanten Explantationszeitpunkt (nach 4 Wochen) identifiziert
werden. Die histologischen Untersuchungen zeigten unterhalb des Panniculus
carnosus ein kleines Fibrinkonstrukt (rechter Kasten in Abb. 6) und oberhalb der
Skelettmuskulatur (Pfeil in Abb. 6). Reife Fettzellen sind ebenso auf der im rechten
Kasten auf der Abb. 6, in der Vergrößerung Abb. 7 sowie in der Oil-red-O-Färbung
(Abb. 8) erkennbar; allerdings deutlich geringer vertreten im Vergleich zum restlichen
Gewebe. Auf den Abb. 9 u. 10 ist der immunhistologische Nachweis zu beobachten.
Abb. 6. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25
47
In der Gruppe 1.2 nach 3 Monaten Implantationszeit ließen sich makroskopisch die
implantierten Zellmatrix-Konstrukt in ähnlicher Weise abgrenzen wie bei der
Explantation nach 4 Wochen. Es konnten vier Konstrukte makroskopisch und
mikroskopisch festgestellt werden. Ferner zeigten manche Konstrukte auf
mikroskopischen Aufnahmen einen hohen Differenzierungsgrad im Sinne einer
Neubildung von Fettgewebe und zusätzlich eine Volumenzunahme. Wie auf
Abbildung 11 und 12 ersichtlich, kann unterhalb des Panniculus carnosus teils reifes,
gut ausdifferenziertes Fettgewebe erkannt werden. In der Vergrößerung (Abb. 13-14)
sind Fettzellen mit ihrer typischen univakuolären Struktur zu beobachten. In der Anti-
Vimentin-Färbung (Abb. 15-16) wird deren humaner Ursprung bestätigt. Die Zellen
Abb. 7. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb. 8. G1.1 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x400
Abb. 9. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb. 10. G1.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200
48
imponieren jeweils durch den rötlichen Schimmer des humanen Vimentins im
Übergang zwischen Zellwand und Extrazellulärmatrix.
Abb. 11. G1.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb.12. G1.2 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x25
Abb. 13. G1.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb.14 . G1.2 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x200
Abb. 15. G1.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25 Abb. 16. G1.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
49
In der Gruppe 1.3 waren die meisten Konstrukte, von denen 4 auffindbar waren,
makroskopisch vor der Explantation erhabener als die der Gruppen 1.1 und 1.2.
Mikroskopisch ähnelten die Konstrukte, von denen sechs identifiziert werden
konnten, hinsichtlich ihrem Differenzierungsgrad der Gruppe 1.2 (Abb. 17-20), jedoch
war das Gewebe hier deutlich homogener organisiert und das vorhandene
Fettgewebe voluminöser.
Die Gruppe 1.4 wies makroskopisch 6 Explantate nach 9 Monaten auf, jedoch
konnten von diesen nur 5 histologisch wieder aufgefunden werden (Abb. 21 u. 22.).
Hinsichtlich der Größe und des Differenzierungsgrades zeigten sich histologisch
geringe Unterschiede im Vergleich zu der Gruppe 1.3. Die Implantate wiesen von
einem hohen Differenzierungsgrad und ließen sich von ihrer Umgebung leicht
abgrenzen (Abb. 23-25). Zusätzlich wurden bei dieser Gruppe noch eine MRT und
eine BrdU-Färbung angefertigt. In der MRT ließ sich an der lebenden Maus wenige
Stunden vor der Explantation deutlich abgrenzbares Fettgewebe an der
Abb. 17. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 18. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100
Abb. 19. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100 Abb. 20. G1.3 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
50
Implantationsstelle identifizieren (Abb. 26). Die BrdU-Färbung sicherte, dass sich
kein Liposarkom oder ein anderes Malignom im Laufe der Implantationszeit gebildet
hatte. Die Anzahl der sich in der S-Phase befindlichen Zellen im Implantat entspricht
denen im gesundem humanem und murinem Fettgewebe (Abb. 27 - 29).
1 cm
Abb. 25. G1.4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
Abb. 24. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100
Abb. 23. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 21. G1.4 Maus vor Explantation Abb. 22. Explantat der G1.4 Maus
51
Innerhalb der Gruppe 1 konnten im Verlauf der Implantation keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der makroskopischen Bewertung bei Explantation sowie der
histomorphometrischen Untersuchung vorgefunden werden (Abb. 30 - 31). Allerdings
Abb.26. MRT-Bild von G1.4, oben der Rücken von der athymischen Nacktmaus, markiert ist das reife humane Fettgewebe auf der rechten Seite
Abb.28. G1.4 Paraffin-Schnitt, BrdU-Färbung von murinen Adipozyten in der athymischen Nacktmaus , x100 Abb.27. G1.4 Paraffin-Schnitt, BrdU-Färbung von humanen
Adipozyten in der athymischen Nacktmaus , x100
Abb. 29. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung entsprechender Abschnitt des BrdU-Bildes von den humanen Adipozyten in der athymischen Nacktmaus, x100
52
kann nach Wilcoxon für unverbundene Stichproben von einer signifikanten
Größenzunahme bei allen Untergruppen der Gruppe 1 im Vergleich zu der
Kontrollgruppe 6, deren Konstrukt nur aus Fibrin bestand, nachgewiesen werden.
Eine Tendenz hinsichtlich einer Größenzunahme könnte in Anbetracht des
steigenden Medians und des Maximalwertes bei der makroskopischen wie auch bei
der mikroskopischen Bewertung angenommen werden. Zwar kann keine signifikante
Größenzunahme dargestellt werden, jedoch kann durchaus von einer
Größenkonstanz im Zeitraum von 4 Wochen bis 9 Monaten ausgegangen werden.
Ska
la
Abb. 30: Makroskopische Bewertung der Gruppe 1
Abb. 31: Histomorphometrie der Gruppe 1
53
Im Laufe der Implantationszeit haben sich die humanen Präadipozyten deutlich zu
adultem Fettgewebe entwickelt. Wie auf den obigen Bildern zu erkennen, nimmt der
Anteil von Fettzellen innerhalb des Implantates von 4 Wochen auf 3 Monate und von
3 Monaten auf 6 Monaten deutlich zu, so dass in den Gruppen 1.3 und 1.4 reifes
Fettgewebe anzutreffen war. Ferner konnten keine Ölzysten oder Nekrosen in der
Nähe des relativ gut strukturierten univakuolären Fettgewebes beobachtet werden.
3.2.2. Gruppe 2: 5 Mill. Fibroblasten in 1 ml Fibrin Die Gruppe 2 beinhaltet drei Gruppen mit Explantationszeitpunkten nach 4 Wochen,
3 und 6 Monaten. Der Aufbau der Gruppe 2 entspricht dem der Gruppe 1; die
Gruppe 2 verwendet statt humaner Präadipozyten humane Fibroblasten.
Bei der Gruppe 2.1 konnten vier Konstrukte am Tag der Explantation an der
Injektionsstelle makroskopisch identifiziert werden. Mikroskopisch zeigten sich
Konstrukte von kleinerer bis mittlerer Dimension unterhalb des Panniculus carnosus
im Vergleich zu den Konstrukten der anderen Versuchsgruppen (Abb. 32 u. 33). Von
diesen konnten vier immunhistologisch nachgewiesen werden (Abb. 34 und 35). Wie
auf der Abbildung ersichtlich ist, fand eine Vaskularisierung des Konstruktes durch
murine Gefäße statt (Pfeile in Abb. 33). Mit einer Oil-Red-Färbung konnte die
Neubildung von Fettgewebe ausgeschlossen werden.
Abb. 32. G2.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung , x25 Abb. 33. G2.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100
54
Auch in der Gruppe 2.2 war die makroskopische Abgrenzung schwieriger als nach 4
Wochen (Gruppe 2.1), da sich bei Explantation scheinbar 6 Konstrukte fanden, von
denen in der Histologie nur 3 bestätigt werden konnten. Wie nach 4 Wochen waren
die Fibrinmatrix-Konstrukte nach 3 Monaten von mittlerer Dimension (Abb. 36).
Trotzdem zeigten sich histologisch deutliche Unterschiede bezüglich der Qualität des
ausgebildeten Gewebes im Vergleich zu den Präadipozyten-Konstrukten. Zum
Beispiel zeigten sich im Zentrum sowie in der Peripherie Kalzifikationen (Abb. 36 u.
37). Auf der YoYo-Färbung (Abb. 38) war die Kalzifikation nahezu ausgespart von
dem fluoreszierenden Marker, so dass anscheinend kaum Zellen mit intakten
Ribonukleitiden vorhanden waren. Innerhalb und in der Peripherie dieser
Kalzifikationen fanden sich positive humane Fibroblasten in der Immunhistologie
(Abb. 39 u. 40). Dies sagt jedoch nichts bezüglich der Vitalität dieser Fibroblasten
innerhalb der Kalzifikation aus. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um
dystrophische Kalzifikationen aufgrund ungenügender Versorgung der im Zentrum
befindlichen Zellen. Eine metaplastische Kalzifikation kann nicht gänzlich
ausgeschlossen werden. Hinsichtlich der Differenzierung der Fibroblasten zu
Fibrozyten sollte die Elastika-Färbung Aufschluß geben (Abb. 41), jedoch konnten
die typischen Charakteristika, wie die beiden länglich ausziehenden Enden mit Zelle
im Zentrum sowie die elastischen Fasern, nicht eindeutig nachgewiesen werden.
Abb. 34. G2.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25 Abb. 35. G2.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
55
Abb. 36. G2.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 37. G2.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100
Abb. 38. G2.2 Kryo-Schnitt, YoYo-Färbung, x25
Abb. 39. G2.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100 Abb. 40. G2.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200
56
In der Gruppe 2.3 wurden insgesamt 5 Konstrukte makroskopisch und ebenso 5
histologisch erkannt. Auf der dermalen Seite und im Zentrum ist hauptsächlich
Bindegewebe anzutreffen (Abb. 42 - 44). Auf der muskulären Seite hingegen lassen
sich den adipozyten-ähnliche Zellen erkennen, welche aber im Gegensatz zu
humanen Adipozyten einen größeren Durchmesser aufweisen, andere Zellwände
haben und ein dickflüssigeres Zytoplasma aufweisen. Diese Orientierung ist
allerdings nicht für alle Explantate typisch; in anderen Explantaten war das lockere
Bindegewebe mit den Adipozyten-ähnlichen Zellen durchmischt. Auch in dieser
Gruppe konnten Explantate mit dystrophischen Verkalkungen, wie in der Gruppe 2.2,
vorgefunden werden.
Abb. 41. G2.2 Kryo-Schnitt, Elastica-Färbung, x100
Abb. 42. G2.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 43. G2.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100
57
Hinsichtlich der Größe können bei den makroskopischen sowie
histomorphometrischen Bewertungen keine wesentlichen Unterschiede zwischen den
Gruppen der Fibroblasten in Fibrin nachgewiesen werden (Abb. 46 u. 47.). Für die
Gruppe 2 kann also auch im Verlauf von 4 Wochen bis 6 Monaten eine
Volumenkonstanz angenommen werden. Die Untergruppen zeigen zwar keinen
signifikanten Unterschied untereinander, jedoch sind fast alle Messungen außer der
histomorphometrischen Auswertung von Gruppe 2.2 signifikant höher gegenüber der
Kontrollgruppe.
Abb. 44. G2.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25
Abb. 45. G2.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
Ska
la
Abb. 46. Makroskopische Bewertung der Gruppe 2
58
Zusammenfassend kann bezüglich der Gruppe 2 gesagt werden, daß die
Fibroblasten in Fibrin für einen Zeitraum von 6 Monaten persistieren können. Jedoch
fanden sich innerhalb der Fibroblasten und dem reifen Bindegewebe in der
histologischen Auswertung auch jene Inhomogenität der Implantate in Form von
Kalzifikationen und atypischen Fettzellen.
3.2.3 Gruppe 3: 5 Mill. Präadipozyten mit 1 Mill. koimplantierten
HDMVEC als Sphäroide in 1 ml Fibrin
Die Gruppe 3 gliedert sich in drei Untergruppen mit Explantationszeitpunkt nach 4
Wochen (G3.1), 3 Monaten (G3.2) und 6 Monaten (G3.3). In der Gruppe 3.1 waren
vier Konstrukte beim Explantationszeitpunkt leicht abgrenzbar, aber nur drei ließen
sich histologisch finden. Histologisch zeigten sich undifferenzierte Konstrukte ohne
Anzeichen einer Ischämie (Abb. 48 und 49). In der Mitte von 2 Konstrukten schienen
die Zellen unterhalb des Panniculus carnosus dichter gedrängt zu sein als in der
Peripherie (Abb. 50 und 51). Hinsichtlich der Morphologie unterschieden sich die
Zellen im Zentrum und in der Peripherie nicht. Evtl. könnte dies jedoch mit einer
besseren Versorgung in der Peripherie in Zusammenhang stehen.
Abb. 47. Histomorphometrische Bewertung der Gruppe 2
59
Bei der Gruppe 3.2 konnten makroskopisch 4 und histologisch 2 Konstrukte
festgestellt werden. Die Konstrukte waren bezüglich ihrer Größe gering bis mäßig
ausgebildet. Im Allgemeinen waren die Präadipozyten gering differenziert, d.h., es
konnten wenige Zellen mit Vakuolen bzw. vakuolen-ähnlichen Strukturen erkannt
werden (Abb. 52 - 54). Ausgeprägte Anzeichen für Kapillar- bzw. Gefäßbildung
waren nicht anzutreffen.
Abb. 48. G3.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 49. G3.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25
Abb. 50. G3.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x400
Abb. 51. G3.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x400
60
In der Gruppe 3.3 zeigen sich makroskopisch 2 und histologisch 5 positive
Explantate. Histologisch haben sich nur wenige Präadipozyten differenziert (Abb. 55
und 56). Unterhalb der Maushaut liegt größtenteils faserreiches Gewebe. Die
wenigen differenzierten Adipozyten sind gut durch angrenzende Gefäße
vaskularisiert (Abb. 57 - 60). Zeichen für eine bessere Differenzierung der
Präadipozyten oder einer Größenzunahme des implantierten Konstrukts können im
Vergleich zu der Gruppe 3.2 nicht festgestellt werden. Abb. 61 zeigt ein Beispiel für
die CD34-Immun-Färbung zum Nachweis humaner Endothelzellen. Obwohl dieses
Konstrukt im Vergleich zu anderen noch relativ gut ausgeprägt war, konnten keine
Zeichen humaner Endothelzellen aufgefunden werden, wie auch in den anderen
Konstrukten von G3.1 bis G3.3.
Abb. 53. G3.2 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 52. G3.2 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 54. G3.2 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
61
Abb. 55. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 56. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25
Abb. 57. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100
Abb. 58. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
Abb. 59. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x200
Abb. 60. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200
62
Abb. 61. G3.3 Kryo-Schnitt, CD34-Färbung, x100
Ska
la
Abb. 62. Makroskopische Bewertung der Gruppe 3
Abb. 63. Histomorphometrische Bewertung der Gruppe 3
Die Gruppe 3 zeigt einen signifikanten Unterschied zu der Kontrollgruppe bei der
makroskopischen Begutachtung (Abb. 62). Bei der Histomorphometrie unterscheidet
sich einzig die Gruppe 3.3 signifikant zu der Kontrollgruppe (Abb. 63). Gruppe 3.3
kann nämlich im Gegensatz zu den anderen zwei Subgruppen zum Zeitpunkt der
Explantation genügend Konstrukte mit positiver Histologie aufweisen. Allerdings
konnten diese bei der subjektiven Begutachtung meist nicht mit Sicherheit erkannt
werden, weshalb die anderen drei positiven Explantate meist mit 1 beziffert wurden.
Bezüglich der Größe kann eine Persistenz angenommen werden; eine Tendenz zur
Zunahme des Implantates besteht nicht. Die leichte Zunahme bei der Gruppe 3.3
nach 6 Monaten im Vergleich zu den Gruppe 3.1 und 3.2 ist eher durch die erhöhte
Anzahl positiver Explantate als durch eine Volumensteigerung der Konstrukte zu
begründen.
3.2.4. Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten in 1ml
Fibrin Gruppe 4 weist sowohl makroskopisch als auch histologisch gut ausgeprägte
Konstrukte auf. Bei der Explantation wurden 5 Konstrukte entdeckt, später in der
Histologie konnten insgesamt 6 Fettgewebe-ähnliche Strukturen identifiziert werden.
Die Präadipozyten haben sich zu adulten Adipozyten entwickelt (Abb. 64 und 65).
Die Bilder zeigen ein gut strukturiertes Fettgwebe ohne Zeichen von Zelluntergängen
(Abb. 66 - 67). In den Abb. 68 und 69 lassen sich die morphologischen Unterschiede
verschiedener Entwicklungstadien der humanen Fettzelle (Pfeil links oben und unten)
sowie der morphologische Unterschied von humanen und murinen Fettzellen (Pfeil
rechts oben) beobachten. Während rechts in den Bildern die ausdifferenzierten
humanen Adipozyten mit einem Zelldurchmesser von 80 – 130 μm betrachtet werden
können, finden sich links Fettzellen auf dem Weg von ihrem Präadipozyten- zum
Adipozytenstadium. Rechts oben in den Bildern befinden sich oberhalb des
Panniculus carnosus die murinen Adipozyten, welche im Vergleich zu den reifen
humanen Fettzellen einen deutlich kleineren Zelldurchmesser aufweisen.
Die makroskopische Bewertung und die Histomorphometrie der Gruppe 4 sind
signifikant höher im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Abb. 70 u. 71). Zu einem
späteren Explantationszeitpunkt hätte die makroskopische und
histomorphometrische Bewertung vielleicht noch bessere Ergebnisse geboten, da
63
64
zum Zeitpunkt der Explantation nicht alle injizierten Präadipozyten zu Fettzellen
ausgereift waren (Abb. 68 und 69).
Abb. 64. G4 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 65. G4 Kryo-Schnitt, Oil-Red-Färbung, x25
Abb. 66. G4 Paraffin-Schnitt, H&E -Färbung, x25 Abb. 67. G4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin- Färbung, x25
Abb. 68. G4 Paraffin-Schnitt, H&E -Färbung, x100 Abb. 69. G4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
65
3.2.5 Gruppe 5: 30 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin Bei Gruppe 5 ließen sich 6 Konstrukte makroskopisch und 7 histologisch erkennen.
Die sechsfache Zellzahl hat sich sowohl auf die Größe als auch die Qualität des
neugebildeten Fettgewebes positiv ausgewirkt (Abb. 72 - 73). Trotz der insgesamt
der großen Volumina des vorzufindenden Gewebes im Vergleich zu den anderen
Vergleichsgruppen sind peripher und zentral liegende Zellen gut entwickelt und
zeigen keine Anzeichen von Zelluntergängen, Ölzysten oder Kalzifikationen. In
zahlreichen Fällen konnte die Zusammenlagerung einzelner Fettzellen und ihre
Umrahmung durch Bindegewebssepten in einer Form nachgewiesen werden, wie sie
Ska
la
Abb. 70. Makroskopische Bewertung der Gruppe 4
Abb. 71. Histomorhometrische Auswertung der Gruppe 4
66
für matures humanes Fettgewebe histologisch typisch ist. Die Immunhistologie hat
zudem auch erhärtet, daß es sich um humane Adipozyten handelt (Abb. 74 u. 75).
Hinsichtlich der Größe sind beide Auswertungen signifikant gegenüber der
Kontrollgruppe (Abb. 76 u. 77); außerdem zeigt die Gruppe auch im Vergleich mit
allen anderen Gruppen, außer mit Gruppe 4, einen signifikanten Größenunterschied.
Abb. 73. G5 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x25Abb. 72. G5 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25
Abb. 74. G5 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25
Abb. 75. G5 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100
67
3.2.6. Gruppe 6: 1 ml Fibrin ohne Zellen Die Gruppe 6 diente als Kontrollgruppe für die Gruppen 1 bis 5. Nach 4 Wochen konnten unterhalb der Panniculus carnosus kein Fibrin und keine Zellen vorgefunden
werden (Abb. 78). Nur Reste der Faszie zwischen dem Panniculus carnosus und der
Skelettmuskulatur fanden sich in manchen Schnitten. Aufgrund dessen wurde bei der
Statistik die Gruppe 6 im Vergleich mit den anderen Gruppen immer gleich Null
gesetzt, da in der subjektiven makroskopischen Bewertung und in der
Histomorphometrie kein Volumen ersichtlich und messbar war. Fast alle Gruppen
Ska
la
Abb. 76. Makroskopische Bewertung der Gruppe 5
Abb. 77. Histomorphometrische Auswertung der Gruppe 5
68
waren signifikant im Vergleich zu Gruppe 6, einzig die Gruppen mit weniger als 5
positiven Explantaten konnten keine Signifikanz vorweisen.
3.3. Vergleich der Gruppe 1 mit den anderen Gruppen 3.3.1. Vergleich zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 Nach 4 Wochen ließ sich noch kein wesentlicher Unterschied zwischen den beiden
Gruppen feststellen. Die Gruppe 2 schien subjektiv geringfügig mehr Volumen
aufzuweisen, während die Präadipozyten anfingen sich zu differenzieren. Bei den
Gruppen 1.2 und 2.2 fanden sich deutlichere Unterschiede. Die Gruppe 1.2 hatte
einen höheren Anteil differenzierter Zellen als die Gruppe 2.2 aufzuweisen (Abb. 11
u. 32). Die Gruppe 2.2 schien subjektiv an Volumen abzunehmen und in einigen
Implantaten konnten Kalzifikationen angetroffen werden. Hierbei handelt es sich
wahrscheinlich um dystrophische Kalzifikationen aufgrund ungenügender
Gefäßversorgung der Fibroblasten im Zentralbereich des Implantates. Nach 6
Monaten treten diese Unterschiede stärker hervor. Zudem finden sich in den
Explantaten der Gruppe 2.3 neben den Fibroblasten untypische Adipozyten
humanen Ursprungs. Der Volumenunterschied nach 6 Monaten ist zwar nicht
signifikant, aber der Maximalwert der Gruppe 2.3 ist bei Histomorphometrie ca. 40%
geringer als der Maximalwert der Gruppe 1.3 (Abb. 79 u 80).
Abb. 78. G6 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, 25x
69
3.3.2. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 3 Nach 4 Wochen unterscheiden sich die beiden Gruppen nicht wesentlich. Die Gruppe
1 zeigte tendenziell mehr sich differenzierende Präadipozyten mit multi- oder
univakuolärer Struktur. Nach 3 Monaten fanden sich bei Gruppe 1 subjektiv deutlich
mehr differenzierte Präadipozyten (Abb. 11 u. 42). Die Gruppe 1.3 nach 6 Monaten
bot ein homogenes Bild differenzierter Fettzellen, während bei der Gruppe 3.3 nach 6
Monaten nur einige wenige adulte Fettzellen anzutreffen waren. Statt differenzierter
Zellen konnten einige fibroblasten-ähnliche Zellen humanen Ursprungs und häufig
auch ein ausgeprägter Randsaum aus murinen Bindegewebe vorgefunden werden.
Signifikant ist der Unterschied bei der Histomorphometrie und bei der
Ska
la
Abb. 79. Makroskopische Bewertung von G1 und G2
Abb. 80. Histomorphometrische Auswertung von G1 und G2
70
makroskopischen Bewertung der Konstrukte bei der Explantation nicht, aber die
histomorhometrischen Maximalwerte liegen bei der Gruppe 3.3 mit dem Wert 3,44
mm² und bei der Gruppe 1.3 mit dem Wert 4,68 mm² relativ weit auseinander (Abb.
81 u. 82).
Ska
la
Abb.81. Makroskopische Bewertung von G1 und G3
Abb. 82. Histomorphometrische Auswertung von G1 und G3
71
3.3.3. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 4 Beide Gruppen weisen differenzierte Adipozyten humanen Ursprungs auf (Abb. 20 u.
69). In keinem Explantat beider Gruppen fanden sich atypische Auffälligkeiten im
Sinne von Zelluntergängen, Kalzifikationen oder Infektionen. Tendenziell konnte
sowohl in der Histomorphometrie als auch bei der makroskopischen Bewertung ein
Unterschied hinsichtlich der Größe der beiden Gruppen bemerkt werden (Abb. 83 u.
84). Der Median bei der makroskopischen Bewertung der Gruppe 4 beträgt 3 und der
Median bei der Histomorhometrie 2,9 mm², während die Gruppe 1.3 die Mediane 1
und 0,75 mm² vorweist. Ebenso unterschiedlich sind auch die Maximalwerte bei der
Histomorphometrie. So konnte bei der Gruppe 1.3 eine Maximalfläche von 4,68 mm²
gemessen werden, bei der Gruppe 4 ein durchschnittlicher Maximalwert von 9,6
mm². Auch wenn dieser Unterschied nicht signifikant ist, so lässt sich zumindest eine
Tendenz erahnen.
Ska
la
Abb.83. Makroskopische Bewertung von G1.3 und G4
72
3.3.4. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 5 Hinsichtlich der Differenzierung der Präadipozyten unterscheiden sich die beiden
Gruppen kaum; beide weisen einen Zellverband aus reifen Fettzellen auf. Auch
fanden sich beiden Gruppen keine Zeichen von Zelluntergängen oder Infektionen
(Abb. 17 u. 72). Signifikante Unterschiede finden sich sowohl bei der
Histomorphometrie als auch bei der makroskopischen Bewertung der Explantate
(Abb. 85 u. 86). Während der Median und der Maximalwert bei der
Histomorphometrie für die Gruppe 1.3 bei 0,75 mm² und 4,68 mm² liegt, betragen sie
für die Gruppe 5 4,55 mm² und 16,38 mm². Zumal hier nur eine durchschnittliche
Flächenmessung vorliegt und der Median der Gruppe 5 mehr als das Siebenfache
über dem Wert der Gruppe 1.3 und der Maximalwert der Gruppe 5 beinahe 2,5 mal
so groß ist wie der Maximalwert der Gruppe 1.3, könnte vermutet werden, dass die
sechsfache Zellzahl der Gruppe 5 sich beinahe proportional auf die Ausbildung des
Endvolumens ausgewirkt haben könnte. Die Volumenzunahme wurde jedoch
weniger durch ein vermehrtes Tiefenwachstum erreicht, sondern vielmehr durch ein
Wachstum im horizontalen Verlauf zur Haut und Skelettmuskulatur; die maximale
Tiefe eines Implantates betrug ca. 2,5 mm, welche in der Gruppe 5 gemessen
werden konnte.
Abb. 84. Histomorphometrische Auswertung von G1.3 und G4
73
Zudem wies die Gruppe 5 einen signifikanten Größenunterschied in der
Histomorphometrie gegenüber allen Gruppen, außer der Gruppe 4, auf.
Ska
la
Abb. 85. Makroskopische Bewertung von G1.3 und G5
Abb. 86. Histomorphometrische Auswertung von G1.3 und G5
4. Diskussion
4.1. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Ziel dieser Arbeit soll die Entwicklung eines alternativen Verfahrens zur
Weichteilsubstitution verschiedener Defektarten mit Hilfe der Verwendung von Tissue
Engineering sein. Diese Technik soll ermöglichen, auf synthetische Ersatzmaterialien
und invasive bzw. risikoreiche Operationen zu verzichten. Die Rekonstruktion oder
Augmentation soll mit autologem Gewebe erfolgen, sodass fehlendes Gewebe nicht
nur plastisch, sondern auch bezüglich seiner qualitativen Eigenschaften ohne
Unterschied ersetzt wird.
Forschungsschwerpunkte wurden in folgenden Bereichen des Tissue Engineering
gesetzt: (a) Vergleich zwischen Präadipozyten und Fibroblasten; (b) Vergleich
zwischen Präadipozyten und Präadipozyten mit HDMVEC als Sphäroide; (c)
Vergleich zwischen Einfachinjektion und Mehrfachinjektion von Präadipozyten; (d)
Vergleich zwischen einfacher Zellzahl und erhöhter Zellzahl von Präadipozyten.
4.2. Der Aussagewert des Tiermodells Die athymische Nacktmaus als Versuchstier hat sowohl Vor- wie auch Nachteile. Ihre
Vorteile sind die Immuninkompetenz gegenüber xenogen Zellen, wie die hier
verwendeten humanen Präadipozyten, Fibroblasten und HDMVECs, und ihre leichte
Pflegbarkeit. Zudem sind ethisch-moralische Bedenken bei einer größeren Anzahl an
Versuchstieren geringer anzusehen als bei Affen oder Menschen.
Nachteilig ist ihre Größe, da aufgrund ihrer geringen Körpergröße 1 ml Fibrin schwer
in eine bestimmte anatomische Struktur appliziert werden kann, wie z.B. der Brust,
der Lippe oder im Verlauf eines bestimmten Gefäßes, zumal 1 ml bei einer 28 g
schweren Maus ungefähr 2 – 3 Litern bei einem Menschen entsprechen würde. Ein
genereller Nachteil bei Tierversuchen ist zudem, dass Beobachtungen und
Messungen während der Implantationszeitraumes sich schwierig und häufig auch
kostspielig gestalten, wie PKH gelabelte Zellen, MRT-Aufnahmen oder regelmäßige
Gewichtskontrollen. Aufgrund dieser Untersuchungen kann häufig kaum eine
Aussage getroffen werden hinsichtlich endokriner oder supportiver Einflüssen, die auf
die implantierten Zellen einwirken.
Auch kann keine definitive Aussage getroffen werden, ob ein autologer Transfer
humaner Präadipozyten in Fibrin den gleichen, einen positiveren oder negativeren
74
Verlauf auf die Entwicklung vitalen Fettgewebes als Weichteilgewebeersatz nehmen
würde. Die bestehende Immunkompetenz bei einer autologen Transplantation sollte
keinen Effekt auf das Resultat haben. Sehr wohl könnte beispelsweise humanes
Insulin und humane Wachstumsfaktoren auf injizierte humane Präadipozyten in
Fibrin einen anderen Effekt ausüben als murines Insulin und murine
Wachstumsfaktoren, da humanes Insulin sich einerseits durch seine Struktur
unterscheidet und andererseits auch in anderen Mengen sezerniert wird als in
anderen Organismen. Ähnliche Aussagen können wahrscheinlich auch bezüglich der
Geschwindigkeit der Vaskularisierung getätigt werden.
4.3. Präadipozyten und Fibroblasten
4.3.1. Potenzial der Präadipozyten im Vergleich zu Fibroblasten für Weichteilgewebesubstitution
Drei Aspekte spielen eine wesentliche Rolle bei der Diskussion um die Fragestellung,
ob Präadipozyten oder Fibroblasten in Fibrin besser für die Weichteilsubstitution
geeignet sind:
1. Größe des erzielten Volumens bei gleicher Ausgangszahl
2. Histologische Qualität
3. Für welchen Defekt eignet sich welche Zelle am besten?
Zu 1.: Beide Gruppen zeigen im Zeitraum von 4 Wochen bis 6 Monaten keinen
signifikanten Unterschied bezüglich des erzielten Volumens. Allerdings weist die
Gruppe 1 mit den Präadipozyten über diesen Zeitraum eher eine Tendenz zur
Volumenzunahme auf, während die Gruppe 2 mit Fibroblasten zu einer
Volumenabnahme tendiert.
Zu 2.: Die Gruppe 1 entwickelte sich zu ihrem Vorteil im Gegensatz zu der Gruppe 2.
In der Gruppe 1 differenzierten sich die Präadipozyten ohne Zeichen von Nekrosen,
Ölzysten und Kalzifikationen zu reifen Adipozyten; die Fibroblasten differenzierten
sich zwar ebenso, jedoch neigte ein Anteil bei einigen Implantaten mit Fibroblasten
zu dystrophischen Verkalkungen und es fanden sich Adipozyten-ähnliche Zellen.
Letzteres ist für die Weichteilsubstitution kein Nachteil, die dystrophischen
Verkalkungen sind jedoch störend für eine Weichteilsubstitution.
75
In Anbetracht von Aspekt 1 und 2 ließe sich vermuten, dass sowohl die Verkalkungen
als auch die mögliche Tendenz zu einer Volumenabnahme auf eine geringere
Vaskularisation der Implantate mit Fibroblasten zurückzuführen sein könnte.
Zu 3.: Unabhängig von der zu erreichenden Volumensubstitution und der Qualität der
verwendeten Zellen stellt sich auch die Frage, welcher Weichteildefekt sollte mit
Fibroblasten oder Präadipozyten korrigiert werden. Die Konsistenz von reifem
Bindegewebe ist straffer und stärker als die von adultem Fettgewebe. Wird
Weichteilgewebe beispielsweise für die Konturverluste durch muskuläre Atrophie
benötigt, wäre ein straffes und festes Weichteilgewebesubstitut wie Fibroblasten in
Fibrin oder Isolagen statt Präadipozyten in Fibrin oder autologem Fetttransfer
überlegenswert. Für die Augmentation von Lippen oder der Brust wären wiederum
die Präadipozyten wegen ihrer weicheren Konsistenz von Vorteil. Desweiteren liegt
bei den Patienten in der Regel eine größere Quelle für Präadipozyten vor, so dass
größere Areale mit autologen Zellen therapiert werden könnten.
Sowohl Fibroblasten als auch Präadipozyten sind zur Weichteilsubstitution geeignet.
In dieser Studie stellten sich die Präadipozyten in Fibrin als besserer
Weichteilgewebeersatz als die Fibroblasten in Fibrin heraus. Im Gegensatz zu den
Fibroblasten entwickelten sich die Präadipozyten zu einem morphologisch
äquivalenten Fettgewebe ohne Zeichen von Zellnekrose oder atypischen Zellen. Dies
soll nicht bedeuten, dass Fibroblasten prinzipiell als Weichteilgewebesubstitut zu
verwerfen wären. Vielleicht können die Mängel, welche in dieser Studie bei den
Fibroblasten aufgetreten sind, durch eine andere Trägermatrix wie Hyaluronsäure,
Kollagen oder eine Mischung verschiedener extrazellulärer Bestandteile behoben
werden. Schließlich ist das Ziel, für jeden Weichteilgewebedefekt möglichst das
beste Weichteigewebeäquivalent als Therapie anwenden zu können.
76
4.3.2. Vergleich mit anderen Transplantationen von Präadipozyten Die ersten Implantationen von Präadipozyten in Tiere dienten v.a. als Beweis für die
Existenz von Präadipozyten (Green H 1979; Van 1982). Für diese Implantationen
wurden jedoch noch keine Matrizes verwendet oder adipogene Faktoren hinzugefügt.
Bisher zur Transplantation von humanen Präadipozyten eingesetzte Biomatrizes sind
Alginate (Halberstadt C 2002), Fibrin (Wechselberger 2002; Cho 2005),
Mikrosphären aus Gelatine (Kimura Y 2003), poröse, bioabbaubare
Polymerschwämme (PLGA) (Patrick 1998; Patrick 1999; Yuksel E 2000) sowie
Kollagen- und Hyaluronsäureschwämme (von Heimburg 2001; Hemmrich 2005). In
der Literatur finden sich nur wenige Langzeittierversuche. Die meisten Tierversuche
weisen eine Spanne von 2 bis 8 Wochen auf. Nach dieser Zeit sind Aussagen
hinsichtlich der Differenzierung und der Volumenpersistenz eingeschränkt zu
betrachten, da z.B. die Präadipozyten nach 8 Wochen meist noch nicht vollständig
differenziert sind. Die wenigen Langzeittierversuche haben Implantationszeiten von 3
bis 12 Monaten. Der Vergleich dieser Versuche ist wiederum nur begrenzt möglich,
da autologe und xenogene Präadipozyten, verschiedene Matrizes, unterschiedliche
Zellzahlen pro Injektionsvolumen sowie andere Faktoren variieren.
Studien zur Eignung von Fibrinkleber zur Transplantation von Präadipozyten wurden
von Schöller et al. sowie von Cho et al. publiziert (Schoeller 2001; Cho SW 2005).
Die Gruppe von Schöller et al. transplantierte epididymale Präadipozyten von Ratten
innerhalb einer Fibrinmatrix in präformierte, hochvaskularisierte, intramuskuläre
Kapseln mit gutem Erfolg. Ihre Implantationsdauer betrug maximal 12 Monate, die
implantierte Zellzahl ist jedoch reduziert und das Vaskularisierungspotential der
Empfängerstelle unterhalb des Musculus rectus abdominis erhöht.
In der Gruppe von Cho et al. wurden 8 Mill. humane Präadipozyten in 200 μl Fibrin
athymischen Nacktmäusen implantiert (Cho SW 2005). Das Fibrin wurde mit PGA-
PLLA- [polyglycolic acid poly-(L)-lactic acid] Fasern modifiziert. Der Versuch dauerte
6 Wochen und wies eine signifikante Steigerung der Differenzierung und der
Volumenpersistenz bei dem modifizierten Fibrin mit PGA-PLLA gegenüber dem
einfachen Fibrinkonstrukt nach.
In der Gruppe von Kimura et al. wurden auch humane Präadipozyten in weibliche
BALB/c Mäuse für 6 Wochen implantiert, jedoch diente als Matrix eine mit bFGF
bestückte Mikrosphäre aus Gelatine (Kimura Y 2003). Eine Versuchsgruppe hatte die
77
gleiche Zellzahl mit 5 Mill. Präadipozyten wie die Gruppe 1.3 aus der vorliegenden
Versuchsreihe. In der Histomorphometrie betrug der Maximalwert 3mm² in der
Gruppe von Kimura et al., während der Maximalwert in Gruppe 1.3 sich bei ca. 2,5
mm² befand. Jedoch wurden bei Kimura et al. mit 1 Mill. Präadipozyten fast
identische Werte erreicht. Auf den Bildern erschienen die Präadipozyten mit 50-100
μm Vakuolendurchmesser deutlicher differenziert zu sein, was vielleicht auf das
bFGF in der Matrix zurückzuführen ist.
Bei Halberstadt et al. wurden Alginate mit und ohne RGD, die mit autologen
Präadipozyten besiedelt waren, in den Nacken von Schafen für 3 Monate
transplantiert (Halberstadt 2002). RGD bezeichnet eine R-Arginin-Glycin-D-
Asparagin-Sequenz, welche die Adhäsion von Zellen an Proteinbestandteile von
Alginaten, Fibronektin und dergleichen erhöhen soll. Ein Alginat von Halberstadt
beinhaltete ca. 30 Mill. Präadipozyten. In der Histomorphometrie konnte explantiertes
Fettzellgewebe mit einer Fläche von 45 bis 55 mm² gemessen werden. Jedoch
konnte nicht geklärt werden, ob es sich bei diesen Fettgewebeexplantaten um die
eingebrachten Präadipozyten oder um eingewachsene Fettzellen handelte.
Versuche von von Heimburg et al. dienten zur unterschiedlichen Eignung
verschiedener Trägermatrizes wie Kollagen und HYAFF zur Transplantation von
Präadipozyten in athymische Nacktmäuse (von Heimburg 2001). Die Dauer betrug 3
und 8 Wochen, während dieser Zeit nahmen die Kollagenkonstrukte an Gewicht ab
und die HYAFF-Schwämme an Gewicht zu. In beiden Matrizes fanden sich kaum
differenzierte Zellen (Hemmrich 2005).
Patrick et al. benutzten PLGA-Matrizes, die mit humanen Präadipozyten besiedelt
wurden, zur Augmentation von Fettgewebe in Wistar-Ratten. Nach einem
anfänglichen Volumenanstieg innerhalb der ersten 2 Monate schrumpften die
Implantate zunehmend, so dass am Ende des Langzeittierversuches nach 6
Monaten kaum humane Präadipozyten oder humane Adipozyten angetroffen werden
konnten. Als Ursache wird eine zu geringe Vaskularisation des implantierten
Konstruktes vermutet (Patrick 1998; Patrick 1999; Patrick CW 2000; Patrick 2002).
78
4.3.3. Fibroblasten als Weichteilsubstitut in anderen Arbeitsgruppen
Ein alternativer Tissue-Engineering-Ansatz zur Rekonstruktion von Weichteilgewebe ist die Transplantation von Fibroblasten-Kulturen. Auf zwei andere
Langzeittierversuche mit Fibroblasten möchte ich hier eingehen. In der Arbeitsgruppe
von Marler et al. wurden Alginatgele in Verbindung mit und ohne RGD-Sequenzen
verwandt, welche eine bessere Adhäsion der Zellen an den Alginatgelen ermöglichen
sollen (Marler JJ 2000). Diese wurden jeweils mit 20 Mill. allogene Fibroblasten
besiedelt und für einen Zeitraum von 8 Wochen in männliche Lewisratten implantiert.
Marler beschreibt eine Volumenpersistenz sowie Volumenzunahme der Konstrukte.
Von ähnlichen Vorkommnissen wie die Kalzifikation der Konstrukte in dieser Arbeit
findet sich nicht in Malers Studie. Jedoch schließt dies nicht aus, dass sich
Kalzifikationen nicht noch nach 8 Wochen hätten bilden können. Zumal sich in der
hier vorliegenden Studie sich auch erst nach 3 Monaten die ersten Kalzifikationen
zeigten. Die in der Studie verwendeten modifizierten Alginatgele könnten jedoch
auch für Tissue-Engineering-Ansätze mit Präadipozyten von Interesse sein.
In der Arbeit von Masuda et al. wurden Gelatinematrizes, die mit bFGF und IGF-I
modifiziert wurden, verwendet (Masuda 2004). Diese Konstrukte wurden in 6
Wochen alte Wistar-Ratten implantiert. Durch die Wachstumsfaktoren wurden lokale
autologe Fibroblasten stimuliert, in die Matrix zu immigrieren und zu proliferieren.
Nach 6 Wochen waren die Matrizes besiedelt und es wurde ein Volumenanstieg
verzeichnet. Auch hier ist der Implantationszeitraum relativ kurz. Es wäre interessant,
ob eine zusätzliche Implantation von Fibroblasten einen additiven Effekt bezüglich
des Volumenanstiegs hätte und ob bFGF und IGF-I eine Kalzifikation sowie andere
negative Verläufe verhindern könnte.
Im Gegensatz zu Präadipozytenmodellen für den Weichteilgewebeersatz werden
Fibroblasten in Form des Isolagens bereits seit 6 Jahren klinisch an Patienten für die
Behebung kleinerer Weichteilgewebsdefekte erprobt (Watson D 1999; Weiss 2005).
Klinische Studien von Watson D. et al. sowie Weiss R.M. et al. berichten von guten
Ergebnissen in Zeiträumen von 1 bis 2 Jahren. Auch wenn bei den klinischen
Versuchen und den Tierversuchen keine Kalzifikationen oder andere
Zellveränderungen bislang zu beobachten, kann durchaus die Frage gestellt werden,
warum mit den Präadipozytenmodellen bislang noch kein klinischer Versuch
durchgeführt wurde. Bei den vorliegenden Tierversuchen mit Präadipozyten traten
79
keine potenziellen Risiken für den Patienten auf. Der Einsatz autologer
Präadipozyten z.B. bei eingesunkenen Narben oder Falten sowie anderen kleineren
Weichteilgewebeverlusten und –konturdeformitäten wäre durchaus denkbar.
4.4. Präadipozyten und Angiogenese 4.4.1. Effekt der Koimplantation von HDMVECs als Sphäroide auf
Präadipozyten
Bei der Gruppe 3 wurde beabsichtigt, durch Koimplantation von HDMVEC als
Sphäroide eine bessere Vaskularisation des Konstruktes und einen positiven Einfluß
auf die Differenzierung der Präadipozyten zu erreichen. Weder konnte eine bessere
Vaskularisation noch eine bessere Differenzierung festgestellt werden. In der
Immunhistologie der Gruppe 3 mit Hilfe eines spezifischen CD34 – Antikörpers ließen
sich zu keinem Explantationszeitpunkt HDMVECs innerhalb des Implantates
feststellen. Die Präadipozyten entwickelten sich im Vergleich zu denen aus Gruppe 1
nur spärlich zu adulten Fettzellen. Zum spätesten Explantationszeitpunkt fand sich
zudem auch zunehmend murines Bindegewebe um und in dem Implantat.
Das Sphäroidmodell fußt auf der Erkenntnis, dass ein interzellulärer Kontakt der
Endothelzellen nötig ist, um deren Zelluntergang zu verhindern und die Formation
eines neuen Gefäßsystems zu erzeugen. Werden Endothelzellen in
Einzellsuspension in Konstrukte auf der Basis extrazellulärer Matrizes eingebracht,
erfolgt innerhalb kurzer Zeit ihr Zelluntergang (Schechner 2000). In Fibringelen
bewirken Wachstumsfaktoren das Überleben und die Proliferation von
Endothelzellen, aber nicht deren Differenzierung. Unentbehrliche Voraussetzung für
die Differenzierung scheint das Bestehen von Zell-Zell-Kontakten zu sein (Kadish J L
1979; Nehls V 1995; Koolwijk P 1996; Bach 1998), welche durch die Akkumulation
der HDMVECs in dem Sphäroid gewährleistet wird.
In CAM - Versuchen konnten zwar zunehmende Vaskularisation und eine Anbindung
der Gefäße der CAM an die aus HDMVEC gebildeten Gefäßen nachgewiesen
werden (Borges 2003), aber diese Ergebnisse ließen sich im Langzeittierversuch
nicht reproduzieren. Möglicherweise wurden diese Effekte bezüglich Vaskularisation
und Differenzierung durch das Methocel, welches ein Bestandteil des Sphäroides ist,
verhindert, da Methocel toxisch auf Zellen wirken kann. Dieser zelltoxische Effekt tritt
80
vielleicht erst nach längerer Zeit auf, so dass dieser in kürzer dauernden Versuchen
wie bei dem CAM-Versuch nicht zu Tage treten konnte. Eine andere Möglichkeit
wäre, dass sich das Verhältnis von HDMVECs, Präadipozyten und Fibrin negativ
ausgewirkt hat. Ein Überschuss angiogenetischer Faktoren kann sich auch als
hinderlich für die Vaskularisation erweisen, da Gefäßbildung aufgrund einer
Disbalance verschiedener angiogenetischer Faktoren eine verstärkte Migration der
Endothelzellen eine Formation derselben zu einem Gefäß verhindern kann (Browder
T 2000).
4.4.2. Weitere Möglichkeiten für die Angiogenese von
Weichteilgewebesubstituten
In Anbetracht der Ergebnisse aus dem vorliegenden in-vivo Versuch und aus dem
CAM-Versuch sollte das Sphäroidmodell nicht verworfen, sondern überarbeitet
werden. Beispielsweise könnte das Methocel durch einen anderen chemischen Stoff,
welcher keinen zelltoxischen Effekt aufweist, ersetzt werden. Neben dem
Sphäroidmodell wären auch noch andere Modelle zur Steigerung der Vaskularisation
denkbar. Durch Anastomosen oder Einbringen eines Gefäßastes aus einem anderen
Versorgungsgebiet könnte an der Implantationsstelle die Gefäßvernetzung bzw. die
Durchblutung gesteigert werden (Cronin 2004). Neben konventionellen chirurgischen
Interventionen könnte mit den Präadipozyten in Fibrin ein oder mehrere resorbierbare
Röhrchen koimplantiert werden, die mit Endothelzellen und glatten Muskelzellen
ausgekleidet sind (Niklason 1997; Soker 2000; Cassell 2002; Berglund 2003; Unger
RE 2004). Eine Anastomose, das Einbringen eines Gefäßastes oder die
Koimplantation eines oder mehrerer resorbierbarer Röhrchen würden jedoch einen
chirurgischen Eingriff erfordern, so dass es sich nicht mehr um einen minimal-
invasiven Eingriff handeln würde, wie die Injektion von Präadipozyten in dieser
Arbeit.
Neben den bioartifiziellen Gefäßen wäre auch eine therapeutische Angiogenese oder
eine therapeutische Vaskulogenese, auch Arteriogenese genannt, denkbar. Die
therapeutische Angiogenese induziert mit Hilfe von angiogenetischen Faktoren, wie
bFGF, aFGF oder VEGF, ein Gefäßnetz. Diese angiogenetischen Faktoren können
über die Matrix lokal an die innewohnenden Zellen und das angrenzende Gewebe
abgegeben werden, systemisch appliziert oder durch Transfektion der implantierten
81
Zellen produziert werden (Bauters 1994; Takeshita 1994; Asahara T 1996; Isner JM
1996; Takeshita 1996; Schumacher 1998). Bei der therapeutischen Vaskulogenese
werden durch GM-CSF die hämapoetische Stammzellproduktion, insbesondere
Makrophagen, stimuliert (Takahashi 1999). Bei GM-CSF handelt es sich um den
Kolonie stimulierender Faktoren der Granulozyten- und Makrophagenzelllinie. Hierbei
wirkt GM-CSF chemotaktisch auf die Makrophagen, so dass diese sich an Gefäße in
dem Areal anhaften, in welchem das GM-CSF appliziert wird, und dort durch
sekretierte Substanzen die Arteriogenese beschleunigen. Therapeutisch wurde GM-
CSF v.a. hinsichtlich der Arteriosklerose untersucht (Schaper 2003).
Auch wenn sich die erfolgreichsten Implantate ohne einen zusätzlichen Stimulus zu
reifem Gewebe entwickelten, so könnte durch eine forcierte Angiogenese das
Resultat noch verbessert werden. Wie in dem Abschnitt 3.2.4. vermerkt, vermochten
die Implantate, maximal 2 bis 3 mm in die Tiefe zu wachsen. Bei den größeren
Implantaten siedelten sich die Zellen vor allem in der Ebene ab und weniger in die
Tiefe. Vielleicht wäre durch eine der oben genannten Methoden für eine geförderte
Vaskularisation des entstehenden neuen Fettgewebes eine Möglichkeit gegeben, die
Distanz von 2 bis 3 mm zwischen Haut und Skelettmuskulatur deutlich zu
vergrößern. Bioartifizielle Gefäße in Kombination mit einer angiogen wirkenden
Matrix wäre wahrscheinlich die viel versprechendere Lösung, da diese den
Präadipozyten nicht nur eine verbesserte Vaskularisation ermöglichen würden,
sondern auch den Präadipozyten als Leitschiene die Wachstumsrichtung vorgeben
könnte.
82
4.5. Mehrfachinjektion
Bei der Gruppe 4 wurden am Implantationszeitpunkt, 4 Wochen und 3 Monate nach
Implantation jeweils 5 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin injiziert. Es wurden also
insgesamt 15 Mill. Präadipozyten in die gleiche Stelle appliziert. Im Vergleich mit der
Gruppe 1.3 erscheint der Größenunterschied zwar deutlich zu sein, jedoch ist dieser
nach Mann-Whitney-U-Test nicht signifikant (Abb. 86 u. 87). Während in der
Histomorphometrie der Gruppe 4 der Median 2,9 mm² und Maximalwert 9,34 mm²
beträgt, liegen diese bei 0,75 mm² und 4,68 mm² in der Gruppe 1.3. Hierbei muß
auch bedacht werden, dass in manchen Implantaten auch noch nicht völlig
differenzierte humane Fettzellen der letzten Injektion vorzufinden waren, welche
wahrscheinlich noch zu einem weiteren Volumenwachstum zu einem späteren
Zeitpunkt beigetragen hätten, wie in dem Abschnitt 3.2.4. näher ausgeführt wurde.
Trotz fehlender statistischer Signifikanz erscheint die Mehrfachinjektion einen
Volumenzuwachs zu bewirken. Es finden sich hinsichtlich Differenzierungsgrad und
sonstigen qualitativen Merkmalen keine Unterschiede zwischen der Gruppe 1.3 und
Gruppe 4.
Die Mehrfachinjektion hat zudem weitere Vorteile für den Patienten und für die
Zellzüchtung. Beispielsweise kann dem Patienten eine geringe Menge bei der ersten
Injektion verabreicht werden, so dass nach Ablauf der Differenzierung der Zellen
durch den Patienten und den Operateur entschieden werden kann, ob mehr injiziert
werden soll oder Konturen nachgebessert werden müssen. Bei größeren
Weichteildefekten und insbesondere bei Weichteilaugmentationen wird der Patient
durch kleine allmähliche Applikationen weniger belastet. Durch ausreichende
Intervallzeiträume wird den entstandenen Kapillaren eine Remodelierung und das
Enstehen größerkalibriger Gefäße gestattet (Nor 2001). Für das Labor bedeutet eine
Mehrfachinjektion in Abständen von Wochen oder Monaten mehr Zeit, um die nötige
Zellzahl zu isolieren und zu kultivieren.
Bei der Mehrfachinjektion traten zwar keine Probleme auf, jedoch könnte die Frage
gestellt werden, wie groß die Abstände zwischen den Injektionen für eine optimale
Volumenvergrößerung sein sollten. In unserem Versuchsaufbau wurde ein Abstand
von 4 Wochen und von 2 Monaten gewählt. Bei den Routinebeobachtungen der
Mäuse zeigte sich tendenziell, dass die erste Nachinjektion weniger effektiv war als
die zweite Nachinjektion.
83
4.6. Zusammenspiel von Fibrin- und Präadipozytenkonzentration
4.6.1. Der Effekt einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten auf die
Persistenz und Steigerung des Volumens
Die Gruppe 5 zeigte ein signifikant größeres Explantationsvolumen als alle anderen
Gruppen, abgesehen von der Gruppe 4. Wie bereits in dem Abschnitt 3.3.5.
dargelegt, liegt im Vergleich zu Gruppe 1.3 fast ein proportionales Verhältnis
zwischen erhöhter Zellzahl und erreichter Substitution vor. Interessant ist
desweiteren, dass auch in dieser Gruppe 1ml Fibrin für die Zellsuspension und die
Injektion der Zellen verwandt wurden. Dies würde erlauben wesentlich weniger Fibrin
zu verwenden. Auf diese Weise könnten die Präadipozyten präziser an eine
bestimmte Stelle appliziert werden und die Differenz zwischen Injektionsvolumen und
Endvolumen wäre deutlich kleiner.
Anscheinend müssen die angiogenetischen Faktoren der Präadipozyten und des
Fibrins ausgereicht haben, um eine frühzeitige Vaskularisation zu bewirken.
Schließlich finden sich auch in der Gruppe 5 keine Anzeichen von Zellnekrose,
Fibrose und Entzündungsreaktionen, die auf eine irreguläre Entwicklung der
Präadipozyten hinweisen würden.
In dieser Gruppe konnte das größte Explantat angetroffen werden mit einer Fläche
von 16 mm². Übertragen auf eine 70 kg schwere Person wäre dies ungefähr ein 7 cm
durchmessende Kugel. Sicherlich kann das vorliegende Ergebnis nicht eins zu eins
von der Maus auf den Menschen übertragen werden, aber auch nur ein Bruchteil
dieser Kugel könnte in der plastischen und ästhetischen Chirurgie Verwendung als
Weichteilgewebeersatz dienen.
84
4.6.2. Senkung des Fibrins im Verhältnis zu den Präadipozyten Aufgrund der Ergebnisse der Gruppe 5 wäre es möglich, die Fibrinmenge zu
reduzieren. In der Gruppe 5 war das Verhältnis von Fibrin zur Anzahl der
Präadipozyten um das sechsfache geringer als bei den anderen Gruppen, trotzdem
hat sich diese Gruppe äußerst vorteilhaft entwickelt. Eine geringere Menge Fibrin
würde eine bessere Applikation erlauben, da einerseits insbesondere bei
Tierversuchen an Mäusen oder Ratten das Fibrinkonstukt gezielter in eine bestimmte
anatomische Struktur injiziert werden könnte und andererseits das Injektionsvolumen
mehr dem Endvolumen der implantierten Zellen entsprechen würde.
4.7. Aussichten 4.7.1. Dermolipektomien und Liposuktionen
Im weiteren Verlauf könnten Präadipozyten aus Dermolipektomien und
Präadipozyten aus Liposuktionen in einem mindestens 3 Monate dauernden
Tierversuch verglichen werden, da in der vorliegenden Studie ausschließlich
Präadipozyten aus Dermolipektomien verwendet wurden. In der Literatur finden sich
meist nur Vergleiche von adulten Fettzellen aus Dermolipektomien und Liposuktionen
(Nguyen A 1990; Kononas 1993; Boschert MT 2002; Butterwick 2002; Rohrich RJ
2003). Fettzellen aus Liposuktion sollen die gleiche strukturelle Integrität besitzen,
aber eine geringere zelluläre Aktivität als Fettzellen aus Dermolipektomien (Pu 2005).
Diese Feststellungen können allerdings nicht übertragen werden auf Präadipozyten,
da die adulten Fettzellen beispielsweise einen stärkeren Metabolismus und eine
geringere mechanische Widerstandskraft als Präadipozyten besitzen.
Von Heimburg et al. berichtet von der Überlegenheit der Liposuktion gegenüber der
Dermolipektomie hinsichtlich der Überlebensfähigkeit der Präadipozyten nach 24
Stunden (von Heimburg 2004). Huss et al. wiederum untersuchten Präadipozyten
aus Zellkulturen, Dermolipekomien und Liposuktionen (Huss 2002). Als Kriterien
wurde Anzahl der gesunden Zellen durch Trypan-Blau in der Neubauer-Zählkammer,
die Expression von Glyzerol-3-Phosphatase-Dehydrogenase (G3PDH) sowie die
histologische Bewertung herangezogen. Lediglich bezüglich der G3PDH-Expression
wiesen die liposuktionierten Präadipozyten eine geringere Ausprägung auf, so dass
die Präadipozyten aus Dermolipektomien als überlegen angesehen wurden.
85
Beide Arbeiten klären jedoch nicht, wie sich Präadipozyten aus Dermolipektomien
und Liposuktionen nach mehreren Passagierungen in Zellmedien verhalten. Auch
wurde nicht die Differenzierungfähigkeit der Präadipozyten in-vitro oder in-vivo aus
Liposuktion und Dermolipektomie überprüft; schließlich entwickeln sich
Präadipozyten vor allem in-vivo über einen längeren Zeitraum, wie in dieser Arbeit
ansatzweise gezeigt werden konnte. Derzeitig wird in unserer Arbeitsgruppe u.a.
versucht, diesen Fragen näher zu kommen.
4.7.2. Spenderregion und Empfängerregion
Die Aussagen bezüglich der Spenderregion sind in der Literatur verschieden.
Manche Autoren präferieren Fett aus dem Gesäß und der Lende, da dieses
gegenüber den Ernährungszustand relativ resistent sei (Markey AC 2000), andere
Fettgewebe vom inneren und äußeren Oberschenkel oder das abdominelle Fett
(Coleman 1995). Eine andere Studie wiederum berichtet, dass keine spezifische
Spenderregion nötig wäre, denn die Fähigkeit für die Fettaugmentation wäre bei allen
Spenderregionen im gleichen Maße vorhanden (Rohrich RJ 2003).
Außerdem könnten verschiedene Lokalisationen für die Injektion miteinander
verglichen werden, wie z.B. die Schädelkalotte, die Hüften, der Bauch, die Brust, etc..
Die Injektionspunkte sollten sich unterscheiden bezüglich ihrer Durchblutung, ihres
Weichteilgewebeanteils und anderer Kriterien. Auch hierzu finden sich in der Literatur
nur Aussagen über reife Fettzellen, die wiederum nicht einheitlich sind (De Pedroza
2000). Für diesen Versuch würde man von Mäusen wegen ihrer geringen Größe
abraten, stattdessen würden sich Ratten empfehlen.
86
4.7.3. Einfluß der Kryokonservierung auf die Präadipozyten
Weiterhin könnte der Einfluß des Einfrierens auf die Präadipozyten in diesem
Rahmen untersucht werden. Das Einfrieren von Fettzellen erlaubt mehrere
Implantationstermine über einen längeren Zeitraum mit einer einmaligen
Fettentnahme, was das Wohlbefinden des Patienten steigern sowie Kosten und Zeit
reduzieren würde. Auf adulte Fettzellen hat Einfrieren keinen signifikanten negativen
Effekt, da adulte Fettzellen wahrscheinlich wegen ihres Lipidspeichers gegenüber mit
Wasser gefüllten Zellen nur geringen Volumenveränderungen ausgeliefert sind
(MacRae JW 2004). Wie Präadipozyten auf Einfrieren reagieren bzw. inwiefern sie
nach dem Auftauen differenzieren können, ist noch nicht detailliert untersucht. In
diesem Versuchsaufbau konnte kein negativer oder positiver Effekt vermutet werden,
da die nach mehr als einem Jahr aufgetauten Präadipozyten, für die Gruppe 1.4
verwendet wurden, weder hinsichtlich ihrer Kultivierung noch hinsichtlich ihrer
Implantatbeständigkeit gegenüber frisch isolierten Zellen im Nachteil gestanden
hatten.
4.7.4. Übernahme von Techniken aus dem autologen Fetttransfer Während bei dem Weichteilgewebsersatz durch Präadipozyten bislang vor allem die
Isolation, Zellkulturtechnik sowie die Trägermatrix optimiert wurde, wurde parallel die
Liposuktions- und Applikationstechnik bei der autologen Transplantation von
Fettgewebe in mehrerer Hinsicht optimiert. In Zukunft wäre es durchaus interessant,
dieses Wissen für den klinischen Einsatz zu kombinieren (Fournier 2000; Markey
2000).
4.8. Stellung der vorliegenden Arbeit innerhalb des „Tissue Engineering“ Kleinere Weichteilverluste sowie Konturunebenheiten könnten durch Injektion von
humaner Präadipozyten in Fibrin behoben werden. Die humanen Präadipozyten
scheinen in Fibrin fähig zu sein, ein suffizientes Gefäßnetz zu induzieren und sich so
zu reifen Fettgewebe zu entwickeln. Jedoch wäre eine geringe Überkorrektur und
eventuell auch Mehrfachinjektionen nötig.
Für größere Volumina, welche eine größere Distanz zwischen der Gefäßversorgung
und der implantierten Zellen aufweisen, müssen Techniken entwickelt werden, die
87
die Vaskularisation des neu entstehenden Gewebes schnell vorantreiben oder einen
stetigen Aufbau des Gewebes erlauben.
Es müsste zudem auch gesichert werden, ob die Isolation der Präadipozyten statt
aus Dermolipektomien auf eine andere Weise für eine Weichteilsubstitution möglich
ist. Schließlich würde es sich nicht anbieten eine Dermolipekomie durchzuführen, um
z.B. eine Lippe zu augmentieren. Der Einsatz von Liposuktionen zur Gewinnung von
Präadipozyten wäre diesbezüglich sicherlich eine interessante alternative Methode.
Trotz der letzteren Punkte würde die Injektion von Präadipozyten in Fibrin eine
interessante Alternative zu derzeitigen Methoden , wie die Injektion von
Hyaluronsäurepräparaten und Kollagen sowie Silikonimplantaten, darstellen da diese
Methode einen minimal-invasiven Eingriff mit geringen Risiken und Gewebe durch
autologes Gewebe ersetzen würde.
88
5. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene injizierbare Fibrin-Konstrukte an Mäusen für
den Weichteilgewebeersatz getestet. Es sollte geklärt werden, ob Präadipozyten und
Fibroblasten reifes, stabiles Fett- bzw. Bindegewebe bilden können. Durch eine Koimplantation
von Präadipozyten und Sphäroiden aus human dermalen mikrovaskulären Endothelzellen sollte
die Vaskularisierung und das verbleibende Volumen des Konstruktes verbessert werden. Eine
Mehrfachinjektion von Präadipozyten sollte einen sukzessiven Gewebeaufbau ermöglichen.
Zudem sollte der Einfluss einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten geprüft werden.
Die Zellen wurden aus Dermolipektomien isoliert, kultiviert und mit Fibrin in athymische BALB´c
Nacktmäuse injiziert. Präadipozyten mit und ohne Sphäroide aus HDMVECs sowie Fibroblasten
wurden nach 4 Wochen, 3 und 6 Monaten explantiert, bei den Präadipozyten erfolgte eine
weitere Explantation nach 9 Monaten. Die Explantation erfolgte nach 6 Monaten in diesen
Gruppen. Als Kontrolle dienten zelllose Fibrinkonstrukte. Die Fallzahl je Gruppe betrug n=8. Die
Explantate wurden histologisch und morphometrisch ausgewertet.
Zu allen Explantationszeitpunkten konnte neugebildetes Gewebe in allen Gruppen außer in der
Kontrolle festgestellt werden. Die Präadipozyten differenzierten und bildeten reifes Fettgewebe
ohne Nekrosen oder Ölzysten. Die Fibroblasten konnten zwar aufgefunden werden, jedoch
entwickelten diese nach 3 Monaten Kalzifikationen und fettähnliche Zellen. Die Gruppe mit
HDMVEC zeigte weniger reife Fettzellen und keine verbesserte Vaskularisierung. Die
Präadipozyten der Mehrfachinjektion entwickelten sich zu einem homogenen fettähnlichen
Gewebe. Diese Gruppe wies nicht signifikant, aber tendenziell größere Konstrukte auf. Die
erhöhte Zellzahl war signifikant größer gegenüber fast allen Gruppen, ohne dabei qualitative
Einschränkungen aufzuweisen.
Hinsichtlich der Differenzierung und Stabilität erwiesen sich die Präadipozyten als Alternative für
den Weichteilgewebeersatz. Aufgrund der Kalzifikationen und fettähnlichen Zellen erschienen
Fibroblasten in Fibrin als Alternative nicht geeignet zu sein; jedoch könnten durch andere
Matrizes die Nachteile beseitigt werden. HDMVEC-Sphäroide optimierten weder die Größe
noch die Vaskularisierung, so dass das Modell weiter ausgearbeitet werden müsste. Ein
sukzessiver Aufbau sowie nachträgliche Korrekturen können durch Mehrfachinjektion
ermöglicht werden. Anhand der erhöhten Zellzahl konnte dargelegt werden, dass in-vivo höhere
Zellvolumina bei konstanter Fibrinmenge ohne Nekrosen implantiert werden können.
Die Arbeit legt dar, daß alternativ zu gängigen Methoden mit Hilfe von Präadipozyten eine
Weichteilgewebesubstitution möglich ist. Sie bieten Persistenz, können in verschiedenen
Zellzahlen und zu mehreren Zeitpunkten injiziert werden. Für Fibroblasten und HDMVECs
müssen wegen der Kalzifikationen und geringeren Differenzierung der injizierten Zellen andere
Methoden zur Differenzierung entwickelt werden.
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7. Curriculum vitae
50996 Köln, 3 Mai 2007 Im Park 4 Tel. 0221 35 21 88 nithoba@gmx.de
1. PERSÖNLICHE DATEN • geb. 17.7.1980 in Freiburg im Breisgau
• ledig • Eltern:
Stefan Baerlecken, Dipl. Volkswirt, Marie-Luise Baerlecken, geb. Müller, Juristin
• Geschwister: Daniel Baerlecken, Dipl. Architekt
2. AUSBILDUNGSDATEN • Abitur am Friedrich-Wilhelm-Gymnasium Köln 2000
• Humanmedizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. 2007 WS2000/01-WS2006/07
• August 2002 Ablegung des Physikums • August 2003 Ablegung des 1. Staatsexamens • März 2006 Ablegung des 2. Staatsexamens • Mai 2007 Ablegung des 3. Staatsexamens • Fremdsprachen: Englisch
3. FAMULATUREN
Februar bis April 2003 Dr. I. Säckler, Köln
• Orthopädische Praxis • Dauer 30 Tage
Februar bis März 2004 Prof. Dr. M. Zeitz, Berlin
• Abteilung Rheumatologie der Benjamin-Franklin-Universitätsklinik der Charité
• Dauer 30 Tage
Juli bis September 2005 Prof. Dr. W. L. Gross, Bad Bramstedt
• Abteilung Rheumatologie, Innere Medizin, Klinikum der Universität Lübeck und Kiel in Bad-Bremstedt
• Dauer 30 Tage
Oktober bis November 2005
Prof. Dr. G. R. Burmester, Berlin
• Abteilung Rheumatologie, Innere Medizin, Universitätsklinikum Berlin Charité Mitte
4. PRAKTISCHES JAHR
2006 - 2007
1. Tertial Hautklinik der Universitätsklinik Freiburg 2. Tertial Innere Medizin Kreiskrankenhaus Lörrach
• 5 Wochen Onkologie Station Kandertal • 3 Wochen Kardiologie Station Schwarzwald • 4 Wochen Ambulanz und Notaufnahme • 3 Wochen Intensivstation
3. Tertial Chirurgie Kreiskrankenhaus Lörrach
• 10 Wochen Allgemein- und Viszeralchirurgie • 5 Wochen Unfallchirurgie
5. DOKTORARBEIT „Weichteilsubstitution mit Hilfe von injizierten Präadipozyten“ Beginn einer
experimentellen Doktorarbeit im Tissue Engineering Labor Stark der Abteilung Plastische und Handchirurgie der Universität Freiburg bei Prof. Dr. J. Borges; März 2003 bis Juli 2005,
6. HILFSWISSENSCHAFT-
LICHER ASSISTENT Entwicklung und Evaluation von Klassifikationsmethoden, Validierung
medizinischer Klassifikationen und Thesauren für das DIMDI in Köln von November 2004 bis Dezember 2006. Kodierrichtlinien und Verschlüsselungshilfen für Diagnosen und Prozeduren in Zusammenarbeit mit dem InEK in Siegburg. Mitwirkung bei der Entwicklung einer internationalen Klassifikation für Prozeduren durch die WHO.
Projektmanager: Dr. Albrecht Zaiß und Dr. Susanne Hanser
7. BERUFSBEGINN Seit dem 1.6.07 Assistenzarzt in der Abteilung Klinische Immunologie und Rheumatologie der medizinischen Hochschule Hannover
Freiburg, den 02. November 2007
(Niklas Thomas Baerlecken)
100
8. Danksagung
Ich möchte mich bei allen bedanken, die mir diese Arbeit ermöglicht haben:
Herrn Prof. Dr. med. Jörg Borges und Herrn Prof. Dr. med. G.B. Stark danke ich für
die Vergabe, Betreuung und Diskussion der Arbeit. Dr. med. Torio danke ich für die
interessanten Ideen sowie für die freundliche und anregende Hilfsbereitschaft.
Den Mitarbeitern und Doktoranden des ZKF möchte ich herzlich für die freundliche
und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre danken. Ein ganz besonderer Dank geht dabei an
Frau Heide Marniga und Frau Beate vom Hövel für ihre Unterstützung im Labor, die
mir mit Rat und Tat stets zur Seite standen Desweiteren wünsche ich den derzeitigen
und zukünftigen Doktoranden viel Erfolg für die Zukunft.
Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, die mir das Medizinstudium
ermöglicht haben, und an meinen Bruder, der mir stets in der Vergangenheit wie
auch heute geholfen hat. Meinen Freunden möchte ich für ein nettes Privatleben
neben Studium und Doktorarbeit danken.
101
9. Veröffentlichungen
9.1. Originalarbeiten
• Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and Basic Coding
System of CCAM. Susanne Hanser, Niklas Baerlecken, Albrecht Zaiß,
Germain medical science (gms), e-journal , 2005: 85-87
• Engineering of adipose tissue by injection of human preadipocytes within fibrin
glue, Torio-Padron N, Baerlecken N, Momeni A, Stark G.B., Borges J.,
Aesthetic Plastic Surgery 2007 Mar 22
9.2. Kongressbeiträge • Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and Basic Coding
System of CCAM Susanne, Hanser, Niklas Baerlecken, Albrecht Zaiß 50.
GMDS Jahrestagung
• Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and CCAM Basic
Coding System, Zaiß A, Hanser S, Baerlecken N, WHO Newsletter, 2005; 3
(2): 1 (WHO-FIC Meeting 2005, 16-22.10.2005, Tokyo)
• Injection of human preadipocytes within fibrin glue, an alternative for volume
augmentation in plastic surgery? Baerlecken N, Torio-Padron N, Momeni A,
Stark G.B., Borges J., 9. Chirurgische Forschungstage, 19-21. September
2005, Frankfurt am Main
• Langzeituntersuchungen nach subkutaner Injektion humaner Präadipozyten
bzw. Fibroblasten zum Weichteilgewebeersatz, Torio-Padron N, Baerlecken N,
Momeni A, Stark G.B., Borges J., 36. Jahreskongress VDPC Vereinigung der
Deutschen Plastischen Chirurgen, 27.9-1.10.2005, München und Starnberg
• Weichteil-Tissue-Engineering: Der potentielle Einsatz von Präadipozyten-
Fibrin-Konstrukten in der Mamma-Chirurgie, Torio-Padron N, Baerlecken N,
Momeni A, Stark G.B., Borges, 24.Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft
für Senologie, 2.-4.9.2004, Freiburg
102
9.3. Publizierte Abstracts • Weichteil-Tissue-Engineering: Der potentielle Einsatz von Präadipozyten-
Fibrin-Konstrukten in der Mamma-Chirurgie, Torio-Padron N, Baerlecken N,
Momeni A, Stark G. B., Borges J, Onkologie 2004;27(suppl 2):1-66
103
10. Erklärung über die Beteiligung Dritter
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus
anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter
Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht entgeldliche
Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere
Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar
geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt
der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Freiburg, den .......................... ................................................. (Niklas Thomas Baerlecken)
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