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ANALISIS DE LA PROLIFERACION CELULARPOR CITOMETRIA DE FLUJO

0 50 100 150 200 250Fluorescence Intensity (IRFL)

020406080

100120140160

Freq

uen

cy

Parámetros Indicadores de Proliferación Celular

G1

MG2

S G0

Células quiescentes

Posición en el ciclo celular:

• DNA• RNA• Proteínas totales• Membranas• Orgánulos• Masa celular

Células en ciclo

Cinética del ciclo celular:

• Síntesis de DNA• Antígenos de proliferación• División celular

Regulación del ciclo celular:

• Proteínas reguladoras

Consecuencias del ciclo celular

• Número de células• Historia replicativa• Diferenciación fenotípica• Muerte celular

Análisis Citométrico de la Proliferación Celular

• Análisis monoparamétrico del contenido en DNA

• Análisis multiparamétrico del DNA:

• DNA + parámetros estructurales

• DNA + parámetros funcionales

• Análisis de otros parámetros asociados a proliferación


Análisis monoparamétrico del contenido en DNA:

• Estimación de la distribución de las fases del ciclo

• Suele ser técnicamente más simple

• Requiere un control estricto de los métodos

• Requiere análisis matemático complejo

• Se utiliza con mucha frecuencia

0 1023DNA

0256

Events


Análisis multiparamétrico del contenido en DNA:

• Mayor complejidad técnica

• Mayor grado de información biológica

Fluorescence

Forwa

rd S

catt

er


• Análisis multiparamétrico del DNA:

•Identificación de subfases en el ciclo celular

• Análisis de la cinética del ciclo celular

• Análisis de la regulación del ciclo celular

• Compartimentación funcional del ciclo celular

•Identificación de subpoblaciones específicas

• Relación entre activación y proliferación

• Relación entre proliferación y diferenciación


• Análisis de otros parámetros asociados a proliferación:

• Recuento absoluto del número de células:

• Muestreado volumétrico

• Fluoroesferas de concentración calibrada

• Análisis del aumento de masa celular:

• Morfología

• Contenido en proteína total

• Análisis del reparto de masa en la escisión celular:

• Fluorocromos trazadores

Contenido nuclearde DNA

Emisión de fluorescencia

Salida de voltaje del fotomultiplicador

Conversión analógica-digital

Intensidad de fluorescencia

488 nm 610 nm

Número de CanalNú

mer

o de

Cél

ulas

Tiempo

Vol

taje

Voltaje

Eve

ntos

Colorante fluorescente unido estequiométricamente

Principios del Análisis Citométrico de DNA

GG22MM GG00

GG11

ss

0 200 400 600 800 1000

GG00GG11

ss GG22 MM

Contenido en DNA

Con

taje

2C2C 4C4C

Análisis citométrico del ciclo celularAnálisis citométrico del ciclo celular

Purdue University Cytometry Laboratories

0 200 400 600 800 1000

INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA

0 7

5 1

50 2

25 3

00

Análisis citométrico del Ciclo CelularAnálisis citométrico del Ciclo Celular

2C2C 4C4C


NU

MER

O D

E C

ÉLU

LAS HISTOGRAMA DE DNA

EN UNA POBLACION ASINCRONICA

CUESTIONES EN EL ANALISIS DEL DNAPOR CITO M ETRIA DE FLUJO

PROBLEMAS DEL ANALISIS DEL DNAPOR CITOMETRIA DE FLUJO

1. ANTES DEL CITO M ETRO

2. EN EL CITOMETRO

3. DESPUES DEL CITOMETRO

1. ANTES DEL CITO M ETRO

• PREPARACION DE LA MUESTRA• Células aisladas

• Núcleos aislados

• Material fresco vs fijado

• TINCION: FLUOROCRO M O S

• MANTENIMIENTO DE LA INDIVIDUALIDAD CELULAR

• ENRIQUECIMIENTO DE MUESTRAS DILUIDAS

• PREPARACION AUTOMATICA DE MUESTRAS

OBTENCION DE SUSPENSIONES CELULARES O NUCLEARES

Células en suspensión natural: sangre periférica, cultivos

Tejidos blandos: médula ósea, ganglio

Tejido fijado y parafinado

Lisis de la membrana y destrucción del citoplasma

Tumores sólidos en fresco

Cultivos en monocapa

TECNICAS DE DISOCIACION

OBJETIVO

• Obtención de poblaciones representativas• Rendimiento suficiente

• Preservación de la superficie celular

METODOS DE DISOCIACION

•Disociación mecánica

•Disociación enzimática

•Disociación mixta

TUM O RES SOLIDOS

Desmosomas intercelulares

Carcinomas de células escamosas

Unión al estroma y lámina basal

Adenocarcinomas

DISPERSION MECANICA

• Trituracion con bisturí

• Raspado de superficie externa

• Aspiración con aguja fina

DISPERSION ENZIMATICA• Con proteasas

• Con colagenasas

• Con cocktails de enzimas proteolíticos

COMPARACION DE LOS METODOS DE DISOCIACION

MECANICA

Rendimiento adecuado

Viabilidad aceptable

Preservación de antígenos de superficie

Alteración de membrana

Posibles daños latentes

Mejor rendimiento

Mayor viabilidad

Alteración de antígenos de superficie

Posible alteración de la representatividad

ENZIMATICA

TINCION ESPECIFICA DEL DNA

• Fluorocromos utilizados

• Especificidad de unión

• Calidad de tinción

Análisis citométrico del contenido en DNA

Fluorocromos utilizados:

• No permeables :

• Yoduro de propidio, bromuro de etidio

• SYTOX, SYBR Green

• Etidio monoazida

• Permeables:

• Hoechst 3341

• DAPI

•7-Amino actinomicina D


Fluorocromos intercalantes

Fluorocromos que se unen al surco menor

Otros fluorocromos

Yoduro de Propidio Bromuro de Etidio

Hoescht 33342 DAPI

7-AAD LDS-751

ww

w.pr

obes

.co

m


Fluorocromos de cianina

Naranja de Acridina

Fluorocromos de acridina

ww

w.pr

obes

.co

m

Fluorocromos de DNA

ww

w.pr

obes

.co

m

Especificidad de unión/calidad de tinción

0 1023

0256

Events

0 1023DNA

0256

Events

Tinción insuficiente

+ 10 minutos/37ºC

DNA

DNA

Especificidad de unión/calidad de tinción

Fluorescence

For

war

d Sc

atte

r

Forward Scatter

Side

Sca

tter


Mantenimiento de la individualidad/homogeneidad:

• Eliminación de desechos (debris, background) :

• Uso de discriminadores (FL3)

• Software de substracción de ruido de fondo

Fijación de la suspensión celular:

• Fijación/permeabilización

Eliminación de agregados celulares:

• Filtración de suspensiones

• Sustracción de agregados por hardware

• Sustracción de agregados por software

Sustracción de agregados

Integral Fluorescence

Pea

k Fl

uore

scen

ce

Agregados

Eliminación por hardware (cociente Pico/Integral)

2. EN EL CITO M ETRO

• CALIBRACION DEL INSTRUMENTO

• Fluorosferas

• Partículas biológicas

• CONDICIONES ADECUADAS DE ANALISIS

• Velocidad de flujo

• Alimentación de fotomultiplicadores

• SELECCION DE POBLACIONES ADECUADAS

• CONTROLES Y STANDARDS

Selección de poblaciones

Forward Scatter

Side

Sca

tter


3. DESPUES DEL CITO M ETRO

•INTERPRETACION DE RESULTADOS:• Correlación con otras observaciones citométricas• Correlación con fenómenos de diferenciación y muerte celular• Correlación con datos clínicos

• METODOS DE SUSTRACCION DE BACKGROUND:• Núcleos cortados• Núcleos rotos• Presencia de poblaciones de interés en el background

• METODOS DE AJUSTE DE LAS FASES DEL CICLO CELULAR:• Programas de dominio público: Cylchred• Programas comerciales: MultiCycle; ModFit


Adipocitoshumanos

Cultivo decélulas

Población proliferante asincrónica

Población quiescente

Análisis monoparamétrico del DNA

Perturbación del ciclo celular: Acúmulo en fase S

Control Exp-1

Exp-3Exp-2

Fase % G0/G1: 71.3

S : 22.8G2/M : 5.9

Fase % G0/G1: 60.5

S : 35.7G2/M : 3.8

Fase % G0/G1: 61.2

S : 33.6G2/M : 5.2

Fase % G0/G1: 55.1

S : 41.4G2/M : 3.5

Estudio del ciclo celular en sincronizaciónEstudio del ciclo celular en sincronización


METODOS DE ANALISIS DEL DNA

1. Análisis monoparamétrico

2. Análisis multiparamétrico:- DNA/morfología- DNA/RNA- DNA/Proteínas totales- DNA/Proteínas específicas- DNA/Otros componentes

Análisis multiparamétrico del DNA

• DNA/Morfología (Light Scatter)

G0

SG2/M

G1

G0

G0 postmit

G2

M

G1

S

Análisis multiparamétrico del ciclo celular

• DNA/Proteínas reguladoras (Ciclinas)


Análisis multiparamétrico del DNA• DNA/Bromo-desoxi-Uridina (BrDU)

• BrDU es un análogo de timidina que se incorpora al DNAen las células en fase de síntesis

• Se revela mediante:• Anticuerpos anti-BrDU (FITC)•Inducción de roturas fotolíticas con Hoechst (SBIP)

ww

w.pr

obes

.co

m


• BrDU es un análogo de timidina que se incorpora al DNAen las células en fase de síntesis

• Se revela mediante:• Anticuerpos anti-BrDU (FITC)•Inducción de roturas fotolíticas con Hoechst (SBIP) w

ww.

prob

es.c

om


• Análisis de otros parámetros asociados a proliferación:

• Recuento absoluto del número de células:

• Muestreado volumétrico

• Fluoroesferas de concentración calibrada

• Análisis del aumento de masa celular:

• Morfología

• Contenido en proteína total

• Análisis del reparto de masa en la escisión celular:

• Fluorocromos trazadores


•Análisis del reparto de masa en la escisión celular:

• Fluorocromos trazadores: CFDA-SE

ww

w.pr

obes

.co

m

Análisis de la Heterogeneidad Celular

Análisis de la Proliferación CelularAnálisis del Ciclo Celular

Diagnóstico / Pronósticoen Oncología

Monitorización del Tratamiento

0 50 100 150 200 250Fluorescence Intensity(IRFL)

020406080100120140160

Freq

uenc

y

Diagnóstico y pronóstico del cáncer:Detección de poblaciones celulareseuploides o aneuploides.

del ciclo celular.Estimación de los tiempos de tránsito por el ciclo celular.

Aplicaciones Clínicas de la Citometría de Flujo

Análisis Citométrico del Contenido de DNA

0 50 100 150 200 250

Intensidad de Fluorescencia (DNA)

020406080

100120140160

F

recu

enci

a

Población Aneuploide

Ciclo Tetraploide

Ciclo Diploide

Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications

Bauer KD, Duque RE, Shankey TV (editors)

Williams & Wilkins, Baltimore1993

Guidelines for Implementation of Clinical DNA Cytometry

Shankey TV, Rabinovitch PS, Bagwell B, Bauer KD,

Duque RE, Hedley DW,

Cytometry 14:472-477, 1993.

Considerations for Implementation of Clinical DNA Cytometry

Samples

Adequate neoplastic material

Permanent morphologic record keptTumor heterogeneityFresh/frozen vs. paraffin-embedded

TV Shankey et al., Cytometry 14:472-277, 1993.


Fresh/frozen vs. Paraffin-embeddedAdditional biochemical markers for multiparameter analysis

Improved estimation of S-phase

Fixation artifacts, esp. near diploidQuestionable S-phase estimates

TV Shankey et al ., Cytometry 14:472-277, 1993.


Sample Processing

Cell disaggregation

Monitoring cell/nuclei yieldChoice of dye



Sample Processing

Biological standards -chicken erythrocytes, trout erythrocytes, human lymphocytes

Assignment of DNA peaks: first peak (left) assumed to be DNA diploid G0/G1 peak



Instrument Performance

Instrument linearityNumber of events analyzed

>10,000 for S-phase<10,000 for DNA Index



Ability to Detect SubPopulations

Coefficient of VariationPercent of population aneuploid

DNA Index of aneuploid peak



Problem of Aggregates

Hardware gatingvs.

Software compensation



Data/Histogram Analysis

high CV'sdebrisaggregates

Report as INADEQUATE



Data/Histogram Analysis

CV's of <8% required for S-phaseMinimal debris desiredDebris subtraction modelingAggregates obscure tetraploid G0/G1



Definition of DNA Aneuploidy

DNA Diploid vs DNA Aneuploid

Two distinct peaks requiredAneuploid population >5-10%

(>15% for S-phase determination)



S-phase, not S+G2/M, recommended for estimates of tumor cell proliferation

Total S-phase vs. tumor S-phase ?

Problem with diploid/near diploid cells



Clinical Use of S-Phase Values

Avoid use of published values of numerical cut points for prognosis

Define laboratory range of valueslow, intermediate, high tertilesfor diploid and aneuploid tumors


Breast Ovarian

Colorectal Endometrial

Non-small cell lung Bladder

Head and neck ProstateRenal

Malignancies Where DNA Index byFlow Cytometry Has Prognostic

Significance

Breast Lymphoma

Colorectal Bladder (stage?)

Prostate

Malignancies Where S-Phase Fraction byFlow Cytometry Has Prognostic Significance

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