andreas schmitt - georg-august-universität göttingen · y = pyrimidin; r = purin. das adenin der...
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Charakterisierung und Kristallisation des
spleißosomalen DEAD-Box Proteins Prp28
Diplomarbeit
vorgelegt von
Andreas Schmitt
aus
Clausthal-Zellerfeld
angefertigt
im Institut für Mikrobiologie und Genetik, Abteilung Molekulare Strukturbiologie
an der biologischen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen
Göttingen, Februar 2009
Referent: Prof. Dr. Ralf Ficner
Korreferent: Prof. Dr. Kai Tittmann
Tag der Abgabe der Diplomarbeit: 25.02.2009
Letzter Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008
Inhaltsverzeichnis 3
1 EINLEITUNG 6
1.1 INTRONKLASSEN 6
1.2 DER MECHANISMUS DES SPLEIßENS 8
1.3 DAS SPLEIßOSOM 9
1.4 DER SPLEIßZYKLUS 9
1.5 DEXD/H-BOX HELIKASEN 10
1.5.1 FUNKTION DER DEXD/H-BOX HELIKASEN BEIM SPLEIßVORGANG 11
1.5.2 DREIDIMENSIONALE STRUKTUR VON DEXD/H-BOX RNA-HELIKASEN 13
1.5.3 FUNKTION VON DEXD/H-BOX HELIKASEN 14
1.5.4 DIE DEAD-BOX HELIKASE PRP28 15
1.6 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 17
2 MATERIAL UND METHODEN 18
2.1 MATERIAL 18
2.1.1 REAGENZIEN 18
2.1.2 GERÄTE 18
2.1.3 SONSTIGE MATERIALIEN 19
2.1.4 CHROMATOGRAPHIESÄULEN 19
2.1.5 VEKTOREN 20
2.1.6 ENZYME 20
2.1.7 RNA-OLIGONUKLEOTIDE 20
2.1.8 DNA-OLIGONUKLEOTIDE 20
2.1.9 KIT-SYSTEME 20
2.1.10 GRÖßENSTANDARDS 21
2.1.11 ORGANISMEN MIT RESISTENZEN 21
2.1.12 KRISTALLISATIONSSCREENS 21
2.1.13 ANTIBIOTIKA MIT ARBEITSKONZENTRATIONEN 21
2.1.14 COMPUTERPROGRAMME 21
2.2 METHODEN 22
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22
2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion 22
Inhaltsverzeichnis 4
2.2.1.2 DNA-Sequenzierung 23
2.2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 24
2.2.2.1 Herstellung und Selektionsbedingungen von LB-Agarplatten und LB-
Flüssigmedium 24
2.2.2.2 Herstellung chemisch kompetenter Escherichia coli-Zellen 25
2.2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen 25
2.2.2.4 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 26
2.2.2.5 Kontrolle der Expression rekombinanter Proteine 27
2.2.2.6 Zellernte und Aufschluss von Expressionskulturen 27
2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 28
2.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 28
2.2.3.1.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford 28
2.2.3.1.2 Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung 29
2.2.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE) 29
2.2.3.3 Anfärben von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue 31
2.2.3.4 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation 32
2.2.3.5 Chromatographische Methoden 33
2.2.3.5.1 Affinitätschromatographie 33
2.2.3.5.1.1 Affinitätschromatographische Reinigung von
Hexa-Histidin-Fusionsproteinen 33
2.2.3.5.2 Größenauschlusschromatographie 34
2.2.3.6 Bestimmung von Bindungskonstanten 36
2.2.3.6.1 Fluoreszenztitration 36
2.2.3.6.1.1 Datenaufnahme 37
2.2.3.6.1.2 Korrekturfaktoren 37
2.2.3.6.1.3 Datenauswertung 38
2.2.3.7 Bestimmung der ATPase Aktivität 39
2.2.3.7.1 Datenauswertung 40
2.2.4 KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN 40
2.2.4.1 Kristallisation von Proteinen 40
2.2.4.2 Fein-screening und Additive 42
2.2.4.3 Quervernetzung mit Glutaraldehyd 43
2.2.5 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 43
Inhaltsverzeichnis 5
3 ERGEBNISSE 44
3.1 EXPRESSION VON PRP28∆N 44
3.2 REINIGUNG VON PRP28∆N 45
3.2.1 AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG ÜBER HIS-TRAP-SÄULEN 45
3.2.2 GRÖßENAUSSCHLUßCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG ÜBER
GELFILTRATIONSSÄULEN 46
3.3 KRISTALLISATION VON PRP28∆N 48
3.3.1 ENTFERNUNG DER C-TERMINALEN HEXA-HISTIDIN-SEQUENZ 49
3.3.2 FEIN-SCREENING 50
3.4 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 51
3.5 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG 52
3.5.1 ATPASE AKTIVITÄT 52
3.5.1.1 Stimulation der ATPase Aktivität durch RNA 55
3.5.2 BINDUNGSSTUDIEN MIT ADP UND ATP 58
3.5.2.1 Bestimmung der Anregungs- und Emissionswellenlänge 58
3.5.2.2 Dissoziationskonstante von Prp28∆N mit mant-ADP und mant-ATP 59
4 DISKUSSION 62
4.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON PRP28∆N 62
4.2 KRISTALLISATION VON PRP28∆N 63
4.3 RÖNTGENBEUGUNGSEXPERIMENTE 64
4.4 ATPASE ASSAY 64
4.4.1 KONTROLLE DES ASSAYS MIT PRP22∆N 64
4.4.2 ATPASE-AKTIVITÄT VON PRP28 66
4.4.3 BINDUNGSSTUDIEN MIT ATP UND ADP 67
5 ZUSAMMENFASSUNG 68
6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 69
7 LITERATURVERZEICHNIS 71
8 DANKSAGUNG 77
Einleitung___________________________________________________________ 6
1 Einleitung
Bei eukaryotischen Organismen liegt die genetische Information in Form chromosomaler
DNA im Zellkern vor. Die in der Nukleinsäuresequenz der DNA enthaltene Information
muss für die Proteinbiosynthese in prä-messenger RNA (prä-mRNA) umgewandelt
werden, was durch den Vorgang der Transkription geschieht. Anschließend erfolgt die
Prozessierung, in deren Verlauf nicht-kodierende Sequenzen aus der prä-mRNA entfernt
werden und außerdem chemische Modifikationen erfolgen, wie z.B. die Anheftung einer
5’-Guanosin-Kappe (5’-cap). Die nun gereifte mRNA verlässt den Zellkern und wird im
Cytoplasma von den Ribosomen während der Proteinbiosynthese in ein Polypeptid
translatiert, dessen Gestalt und biologische Funktion maßgeblich von der Primärstruktur
der Aminosäuresequenz abhängt.
Im Unterschied zu prokaryotischen Organismen sind bei eukaryotischen Organismen die
einzelnen Gene auf der chromosomalen DNA von nicht-kodierenden Abschnitten
unterbrochen, den sog. Introns (engl. intervening regions) (Berget et al. 1977; Chow et al.
1977). Diese Abschnitte müssen vor der Translation der transkribierten prä-mRNA
entfernt, und die für die Proteinsynthese kodierenden Abschnitte, die Exons (engl.
expressed regions), miteinander Verknüpft werden. Diese Prozesse laufen in einem als
Spleißen bekannten Vorgang ab und werden vom Spleißosom katalysiert.
Durch die Introns in ihrer DNA haben Eukaryoten die Möglichkeit die Exons in
unterschiedlichen Kombinationen zusammenzufügen, indem z.B. einige Exons mit
ausgeschnitten werden. Dies kann z.B. in Abhängigkeit des Zelltyps geschehen, in
welchem das Gen exprimiert wird. Für Eukaryoten ergibt sich durch dieses alternative
Spleißen der Vorteil, dass ein Gen für unterschiedliche Proteine kodieren kann, und somit
die Sequenzen des Genoms vielfältiger genutzt werden können.
1.1 Intronklassen
In Eukaryoten sind verschiedene Klassen von Introns bekannt, welche sich im
Mechanismus des Spleißens unterscheiden. Dazu zählen die Gruppe I und Gruppe II
Klassen der selbstspleißenden Introns, ebenso wie t-RNA Introns sowie die in Eukaryoten
am häufigsten vorkommenden spleißosomalen Introns.
Einleitung___________________________________________________________ 7
Selbstspleißende Introns benötigen keine zusätzlichen Proteine zur Durchführung der
Spleißreaktion. Stattdessen wird das Reaktionszentrum hierbei aus Sekundär- und
Tertiärstrukturen der Intron-RNA selbst gebildet. Von selbstspleißenden Introns sind zwei
Gruppen bekannt, Gruppe I und Gruppe II, die sich in Details ihres Reaktionsmechanismus
unterscheiden, wobei beide Reaktionsmechanismen eine große Ähnlichkeit zu dem
Mechanismus bei spleißosomalen Introns aufweisen (Moore et al. 1993; Nielson 1998;
Peebles et al. 1986; van der Veen et al. 1986; Madhani und Guthrie 1992).
Selbstspleißende Introns treten in Mitochondrien und Chloroplasten von Pilzen und
Pflanzen, in Eubakterien sowie in rRNAs einiger Protozoen auf (Zaug et al. 1983; Cech
1993).
Auch tRNAs z.B. von Hefe enthalten Introns (Lopez und Séraphin 2000). Bei diesen ist
der Spleißvorgang allerdings von einer Endonuklease abhängig, die Intron und Exon
voneinander trennt. Die Exons werden danach in einer ATP-abhängigen Reaktion durch
eine tRNA-Ligase wieder miteinander verbunden (Abelson et al. 1998).
Die in Eukaryonten am häufigsten vorkommenden Introns gehören zur Klasse der
spleißosomalen Introns. Bei diesen wird die Spleißreaktion durch das Spleißosom, einem
dynamischen RNA-Protein-Komplex katalysiert.
Das Spleißosom erkennt dabei hochkonservierte Sequenzen der prä-mRNA, wobei
Untereinheiten des Spleißosoms bestimmte Konsensussequenzen an den Übergängen von
Exon und Intron erkennen und daran binden. Etwa 100 Nukleotide aufwärts der 3´-
Spleißstelle befindet sich die Verzweigungsstelle (branchpoint), welche ein für die erste
Spleißreaktion wichtiges Adenin enthält (Burge et al. 1998).
Abb. 1: Intron Konsensussequenz bei Hefe. Y = Pyrimidin; R = Purin. Das Adenin der Verzweigungsstelle ist rot markiert (nach Burge et al. 1998)
Einleitung___________________________________________________________ 8
1.2 Der Mechanismus des Spleißens
Der eigentliche Spleißvorgang besteht aus zwei aufeinander folgenden
Umesterungsschritten (Abb. 2). Im ersten Schritt erfolgt ein nukleophiler Angriff der 2´-
Hydroxylgruppe des branchpoint Adenins auf das Phosphat der 5´-Spleißstelle. Dadurch
entsteht an dieser ein freies 5´-Exon mit einer freien 3´-Hydroxylgruppe. Das Intron liegt
nach diesem ersten Schritt in einer lassoförmigen Struktur (engl. lariat) vor, die durch die
2´-5´-Phosphodiesterbindung zwischen dem branchpoint Adenin und dem Phosphat der 5´-
Spleißstelle gebildet wird. Im zweiten Reaktionsschritt kommt es nun zu einem
nukleophilen Angriff der freien 3´-Hydroxylgruppe des 5´-Exon auf das Phosphat der 3´-
Spleißstelle. Dabei werden die beiden Exons durch eine 3´-5´-Phosphodiesterbindung
miteinender verknüpft. Das Intron wird als Intron-Lariat freigesetzt (Grabowski et al.
1984; Ruskin et al. 1984).
In beiden Reaktionsschritten muss keine zusätzliche Energie aufgewandt werden, da es
sich lediglich um Umesterungsreaktionen handelt, und nicht um die Hydrolyse und
anschließende Neubildung von Phosphodiesterbindungen.
Abb. 2: Spleißreaktion. Die Spleißreaktion läuft in zwei Umesterungsschritten ab, durch welche die gespleißte mRNA und das Intron-Lariat entstehen (Newman 1998).
Einleitung___________________________________________________________ 9
1.3 Das Spleißosom
Die Erkennung von Anfang und Ende des Introns sowie die Katalyse des Spleißvorgangs
erfolgt durch das Spleißosom. Dieses ist ein großer, dynamischer Komplex aus RNA und
Proteinen mit einer Masse von bis zu 2 MDa, welches Anfang und Ende der Introns mit
hoher Präzision erkennt. Der gesamte Komplex aus 5 Ribonucleoproteinkomplexen (small
nuclear ribonucleoprotein particles, snRNPs) wird sukzessiv um die prä-mRNA herum
aufgebaut.
Das Spleißosom besteht dabei aus den snRNPs U1, U2, U4, U5 und U6, sowie mehreren
assoziierten, nicht-spleißosomalen Proteinen. Jedes der snRNPs besteht aus einer kurzen,
uridinreichen RNA mit ca. 100-200 bp sowie den sieben Sm-Proteinen B, D1, D2, D3, E,
F, G, welche vermutlich zu einem heptameren Ring zusammengelagert sind (Kambach et
al. 1999). Eine Ausnahme stellt hier snRNP U6 dar, welches zu den Sm-Proteinen
homologe Lsm-Proteine enthält. Zusätzlich ist jedes snRNP noch mit mehreren
spezifischen Proteinen assoziiert (Will und Lührmann 2006).
Des Weiteren gibt es noch viele nicht-snRNP-Proteine, die für die Funktion des
Spleißosoms essentiell sind. In Saccharomyces cerevisiae sind über 70 solcher Proteine
bekannt. Diese werden ihrer Funktion entsprechend meist mit Prp bezeichnet, was für pre-
mRNA processing steht.
1.4 Der Spleißzyklus
Der Aufbau des Spleißosoms um die prä-mRNA beginnt mit der Anlagerung des U1
snRNP an die 5´-Spleißstelle, wo die RNA von U1 Basenpaarungen mit der prä-mRNA
eingeht und damit den sog. E-Komplex bildet. Dieser erste Schritt ist im Unterschied zu
allen nachfolgenden nicht mit der Hydrolyse von ATP verbunden. Nachfolgend bindet das
U2 snRNP über Basenpaarungen zwischen der snRNA und der prä-mRNA an die
Verzweigungsstelle des Intron, womit der A-Komplex entsteht (Makarov et al. 2002). Es
folgt die Anlagerung von U4/U5/U6, dem sog. tri-snRNP (Stevens et al. 2002; Malca et al.
2003). Der entstandene B-Komplex durchläuft anschließend einige
Konformationsänderungen um ein aktives Zentrum auszubilden. Hierbei wird zunächst die
Basenpaarung zwischen U1 und der 5´-Spleißstelle ebenso wie die Interaktion der U6
snRNA mit der U4 snRNA aufgelöst, woraufhin U1 sowie U4 den Komplex verlassen
Einleitung___________________________________________________________ 10
(Konarska et al. 1987; Cheng et al. 1987). Die dadurch erreichte aktive Konformation des
Spleißosoms wird C-Komplex genannt. Die U6 snRNA bildet nun Basenpaarungen sowohl
mit der 5´-Spleißstelle als auch mit der U2 snRNA aus. Infolgedessen werden die an der
ersten Umesterungsreaktion beteiligten Nukleotide der 5´-Spleißstelle sowie des
branchpoint in räumliche Nähe zueinender gebracht. Nach den beiden
Umesterungsschritten (1.2) zerfällt der Komplex aus snRNPs und mRNA, wobei das
Intron in Form des Lariat freigesetzt und später abgebaut wird (1.2). Die snRNPs werden
regeneriert und stehen dann für einen weiteren Spleißzyklus zur Verfügung.
Abb. 3: Der Spleißzyklus. Schematische Darstellung der Assemblierung des Spleißosoms an der prä-mRNA mit anschließender Freisetzung von mRNA und Intron-Lariat
Die prozessierte mRNA wird aus dem Zellkern ins Cytoplasma transportiert, wo sie durch
die Ribosomen in eine Aminosäuresequenz translatiert wird.
1.5 DExD/H-Box Helikasen
Wie bereits in 1.2 erwähnt, benötigt die eigentliche Spleißreaktion keine aus der Hydrolyse
von ATP gewonnene Energie. Es ist jedoch Energie in Form von ATP für die
Assemblierung, Umlagerung und den Zerfall des Spleißosoms nötig. DExD/H-Box RNA
Helikasen liefern die Energie für die notwendigen Umlagerungen durch die Hydrolyse von
ATP.
Einleitung___________________________________________________________ 11
Helikasen haben im Allgemeinen die Fähigkeit an doppelsträngige Nukleinsäureketten zu
binden, und diese unter ATP-Verbrauch zu entwinden. Es kann sich dabei sowohl um
RNA als auch um DNA handeln. Man teilt die Helikasen nach ihren Sequenzmotiven in
fünf verschiedene Superfamilien ein, wobei die DExD/H-Box-RNA-Helikasen zur
Superfamilie 2 (SF2) gezählt werden. Allen DExD/H-Box Helikasen gemeinsam ist eine
ca. 400 Aminosäuren große Helikasedomäne, welche ihrerseits aus bis zu acht
konservierten Sequenzmotiven besteht (Motiv I, Ia, Ib, II, III, IV, V, VI). Motiv I, auch
Walker A Motiv genannt, ist an der ATP-Bindung und Hydrolyse beteiligt und essentiell
für alle Helikasen. Die Motive Ia und Ib binden an das Riboserückgrat des RNA-
Substrates. Namensgebend für DExD/H-Box Helikasen ist die Aminosäuresequenz von
Motiv II oder Walker B Motiv, wobei sich der Name aus dem Ein-Buchstaben Code der
Aminosäuren ergibt. Die Sequenz beginnt bei allen DExD/H-Box Helikasen mit Aspartat
(D) und Glutamat (E). Die darauf folgende Aminosäure ist variabel (x). Die vierte
Aminosäure kann entweder Aspartat (D) oder Histidin (H) sein. Je nach
Aminosäuresequenz in Motiv II werden die Helikasen weiter unterteilt. Motiv II ist
außerdem an der ATP-Bindung beteiligt, genauso wie die Motive V und VI. Motiv IV
bindet an RNA während die Funktion von Motiv III die Verbindung von RNA-bindenden
Bereichen mit ATPase-Bereichen ist. Die Bindung an RNA erfolgt dabei ausschließlich
über Interaktionen mit dem Ribose-Phosphat Rückgrat, nicht aber mit den Basen. Daraus
ergibt sich zwar eine Spezifität für RNA, die aber unabhängig von der Basensequenz ist.
DEAD-Box Helikasen besitzen drei zusätzliche Motive, Q, GG und QxxR Motiv. Anhand
der Kristallstruktur der DEAD-Box Helikase Vasa aus Drosophila melanogaster mit einem
gebundenem ATP-Analogon konnte gezeigt werden, dass das Q-Motiv mit dem Adeninteil
des ATP interagiert (Sengoku et al. 2006). Das Q-Motiv ist daher wahrscheinlich für die
ATP-Spezifität von DEAD-Box Helikasen verantwortlich. Helikasen ohne das Q-Motiv
zeigen diese Spezifität nicht.
1.5.1 Funktion der DExD/H-Box Helikasen beim Spleißvorgang
Bei Saccharomyces cerevisiae sind insgesamt acht für den Spleißvorgang essentielle
DExD/H-Box Helikasen bekannt. Diese sind im einzelnen Prp5, Sub2, Prp28, Brr2, Prp2,
Prp16, Prp22 und Prp43. In Tab. 1 ist aufgeführt, in welchen Schritten des Spleißvorgangs
welche DExD/H-Box Helikase beteiligt ist.
Einleitung___________________________________________________________ 12
Abb. 4: DExD/H-Box Helikasen im Spleißzyklus mit den ATP-verbrauchenden Schritten (nach Staley und Guthrie 1998)
Tab. 1: Spleißosomale DExD/H-Box Helikasen von S. cerevisiae mit ihren Funktionen während des Spleißprozesses
DExD/H-Box
Helikase
Helikasemotiv Funktion
Prp5 DEAD U2 Anlagerung
Sub2 DECD U2 Anlagerung
Prp28 DEAD Entwindung U1 / 5´-Spleißstelle
Brr2 DEIH Entwindung U4 / U6
Prp2 DEAH erste Umesterungsreaktion
Prp16 DEAH Umlagerung für zweite Umesterung
Prp22 DEAH mRNA Freisetzung
Prp43 DEAH Lariat Freisetzung
Einleitung___________________________________________________________ 13
1.5.2 Dreidimensionale Struktur von DExD/H-Box RNA-Helikasen
Der Sequenzabschnitt, welcher die konservierten Motive der DExD/H-Box Helikasen
enthält, erstreckt sich über eine Länge von etwa 300 – 400 Aminosäuren und bildet die
katalytisch aktive Helikasedomäne. Durch Röntgenstrukturanalyse konnte bereits von
einigen DExD/H-Box Helikasen der Superfamilie 2 die dreidimensionale Struktur
bestimmt werden. Dabei handelt es sich u.a. um den humanen Spleißfaktor UAP56
(Homolog zu Sub2 in Saccharomyces cerevisiae) (Shi et al. 2004), den Translations-
Initiationsfaktor eIF4A aus Saccharomyces cerevisiae (Caruthers et al. 2000), die Helikase
NS3 aus dem Hepatitis C Virus (Yao et al. 1997), MjDEAD aus Methanococcus jannashii
(Story et al. 2001) sowie um das DEAD-Box Protein Vasa aus Drosophila melanogaster
(Sengoku et al. 2006). In allen genannten Arbeiten wurde jeweils nur die Helikasedomäne
kristallisiert, während die N- und C-terminalen Bereiche fehlten.
Die Kristallstrukturen ergaben, dass die eigentliche Helikasedomäne aus zwei einzelnen,
kovalent verbundenen Subdomänen besteht. Beide Subdomänen entsprechen in ihrem
Aufbau aus fünf β-Faltblättern umlagert von fünf α-Helices der Faltung der RecA-Helikase
aus E. coli (Cordin et al. 2006). Hierbei befinden sich die Motive Q, I, Ia, Ib, II und III auf
der N-terminalen Subdomäne, während auf der C-terminalen Subdomäne die Motive IV,
QxxR, V und VI zu finden sind. Fast alle konservierten Sequenzmotive befinden sich dabei
nicht auf den Sekundärstrukturelementen, sondern auf Schleifen zwischen diesen (Cordin
et al. 2006).
Bei Betrachtung der Strukturen kann man außerdem feststellen, dass die Faltung der
Helikase-Subdomänen bei allen Helikasen sehr ähnlich ist, die Orientierung der beiden
Subdomänen zueinander jedoch eine große Variabilität aufweist. Dies deutet darauf hin,
dass die beiden Subdomänen flexibel miteinander verbunden sind, und sich ihre
Orientierung zueinander durch die Bindung von Substraten ändert. Eine solche
substratinduzierte Konformationsänderung konnte für die DEAD-Box-RNA-Helikase
YxiN aus Bacillus subtilis durch FRET-Experimente gezeigt werden (Theissen et al.
2008).
In der aktiven Konformation, welche wahrscheinlich der von mit RNA und ATP
kristallisiertem Vasa entspricht, liegen die Helikase-Subdomänen nahe beieinander. Die
auf beide Subdomänen verteilten konservierten Sequenzmotive der DEAD-Box Helikase
befinden sich damit in räumlicher Nähe zueinander und formen zwischen den Subdomänen
Einleitung___________________________________________________________ 14
eine ATP-Bindetasche, sowie eine sich über beide Subdomänen erstreckende RNA-
Bindestelle. (Sengoku et al. 2006)
1.5.3 Funktion von DExD/H-Box Helikasen
Wie bereits erwähnt, verknüpfen Helikasen die Hydrolyse von ATP mit der Entwindung
von RNA. Es gibt dabei verschiedene Modelle, die den Reaktionsmechanismus und den
Ablauf der Trennung von RNA-RNA-Bindungen zu erklären versuchen (Soultanas und
Wigley 2000, 2001; Tanner und Linder 2001; Rocak und Linder 2004; Tuteja und Tuteja
2004; Cordin et al. 2006)
Anerkannte Modelle sind das Raupenmodell (engl. inchworm) sowie das active rolling
Modell. Bei letzterem muss die Helikase als Dimer vorliegen. Beide Dimere haben dabei
eine unterschiedliche Konformation, wobei eine Konformation eine hohe Affinität zu
doppelsträngiger RNA, die andere zu einzelsträngiger RNA aufweist. Die Bindung und
Hydrolyse von ATP ist jeweils mit einer Konformationsänderung verbunden, was dazu
führt, dass die Helikase an dem RNA-Substrat entlangwandert und es dabei entwindet.
Beim inchworm- Modell geht man davon aus, dass die Helikase wie eine Raupe auf einem
RNA-Strang entlangwandert, und dabei den anderen verdrängt. Hierbei ist es nicht
notwendig, dass die Helikase als Dimer vorliegt. Beide Helikase-Subdomänen binden an
das RNA-Substrat, die Bindung und Hydrolyse von ATP führt dann auch hier zur
Konformationsänderung, wodurch die Helikase auf dem RNA-Strang eine
Kriechbewegung ausführt. Zusätzliche Domänen der Helikase Binden dabei an die RNA
und verhindern so, dass sich die Helikase auf dem Strang in beide Richtungen bewegen
kann (Velankar et al. 1999; Lee und Yang 2006).
Einleitung___________________________________________________________ 15
Abb. 5: Modelle für die Funktion von Helikasen. Das active rolling Modell muss die Helikase als Dimer vorliegen, beim inchworm-Modell ist ein Monomer ausreichend (nach Tanner und Linder 2001)
Prozessive DExD/H-Box Helikasen wie z.B. das vom Hepatitis C Virus kodierte NS3
könnten nach diesem Modell funktionieren (Cheng et al. 2007; Dumont et al. 2006;
Büttner et al. 2007)
Bei Helikasen der DEAD-Box Familie wird davon ausgegangen, dass sie nach einem
anderen Prinzip funktionieren, da man bei ihnen eine RNA-Entwindung in beide
Richtungen festgestellt hat. Außerdem sind DEAD-Box-RNA Helikasen keine prozessiven
Helikasen, sondern sie entwinden nur kurze RNA-Duplexe (Cordin et al. 2006). Anhand
der dreidimensionalen Struktur der DEAD-Box Helikase Vasa wurde ein Modell für die
Funktion der DEAD-Box Helikasen erstellt. Dabei findet eine kooperative Bindung der
Helikasedomäne an ATP sowie den RNA-Strang statt. Die RNA wird dadurch derart
gebogen, dass die Interaktion mit einem anderen RNA-Strang destabilisiert wird. Durch
die anschließende Hydrolyse des gebundenen ATP verringert sich die Affinität zum
gebundenen RNA-Strang und die Helikase löst sich ab.
1.5.4 Die DEAD-Box Helikase Prp28
Prp28 ist ein essentielles DEAD-Box Protein aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae,
welches an der Assemblierung des Spleißosoms beteiligt ist. Es besteht aus
588 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 66,6 kDa. Der isoelektrische Punkt pI
liegt bei 9,36. Die Analyse der Aminosäuresequenz von Prp28 ergab, dass sich die
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Helikasedomäne am C-terminus befindet. Sie besteht aus zwei Subdomänen, der DEAD-
Box-Domäne sowie der HelicC-Domäne (helicase superfamily c-terminal domain) (Abb.
6). Im Unterschied zum humanen Prp28 Ortholog hPrp28 besitzt Prp28 aus S. cerevisiae
keine RS-Domäne am N-terminus. Diese Domäne verdankt ihren Namen dem hohen
Gehalt an Arginin (R) und Serin (S). In hPrp28 wird diese Domäne von der Protein-Kinase
SRPK2 phosphoryliert, wodurch es eine stabile Interaktion mit dem tri-snRNP eingeht. Da
Prp28 aus Hefe diese Domäne fehlt, wird es nicht phosphoryliert, was ein Grund dafür sein
könnte, dass es im Gegensatz zu seinem humanen Ortholog nicht mit dem tri-snRNP
assoziiert ist (Mathew et al. 2008).
Abb. 6: Domänenübersicht von Prp28. In Orange bzw. Rot: C- bzw. N-terminale Subdomäne der Helikasedomäne. Die Zahlen geben die Position in der Aminosäuresequenz an.
Identifiziert wurde Prp28 durch eine Mutation, bei der ein Glycin gegen Glutamat
ausgetauscht wurde, was zu einem kältesensitiven Phänotyp führte. Sequenzvergleiche mit
bekannten Proteinen zeigten eine große Sequenzübereinstimmung mit Proteinen aus der
Familie der ATP-abhängigen RNA-Helikasen (Strauss und Guthrie 1991). In Folge der
G297E Mutation kam es in vivo zu einer Agglomeration von spleißosomalen Komplexen,
bei denen die Entwindung der U4 und U6 snRNPs nicht stattgefunden hatte. Der
Spleißzyklus musste also durch den Ausfall von Prp28 in einem Schritt vor der U4/U6-
Entwindung unterbrochen worden sein. Eine Mutation der 5´-Spleißstelle, welche zu mehr
Basenpaarungen zwischen der U1 snRNA und der prä-mRNA führte, bewirkte ebenfalls
eine Anhäufung von spleißosomalen Komplexen, bei denen all fünf snRNPs enthalten
sind, und in denen U4 und U6 gepaart vorliegen. Durch Zugabe von Prp28 und ATP war
es in vitro möglich diese Komplexe wieder aufzulösen. Prp28 hat also die Funktion, die U1
snRNA von der 5´-Spleißstelle zu lösen und somit den Austausch gegen das U6 snRNP zu
ermöglichen (Staley und Guthrie 1999; de la Cruz et al. 1999). Bestätigt wird diese
Beobachtung durch die Tatsache, dass bei einer Schwächung der Interaktion zwischen 5´-
Spleißstelle und U1 snRNP durch Mutation der U1 snRNA Prp28 nicht mehr essentiell ist.
In vitro wir die Aktivität von Prp28 möglicherweise von Prp8 reguliert, wobei Prp8 die
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Aktivität von Prp28 solange inhibiert, bis die 5´-Spleißstelle sicher erkannt wurde (Kuhn et
al. 1999 u. 2002)
1.6 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand in der Expression und Reinigung der
spleißosomalen DEAD-Box Helikase Prp28 aus Saccharomyces cerevisiae. Das hochreine
Protein sollte anschließend kristallisiert werden, da dies die Voraussetzung für die
Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur ist. Des Weiteren sollten mit den
erhaltenen Kristallen Röntgenbeugungsexperimente durchgeführt werden.
Außerdem stand die biochemische Charakterisierung in Vordergrund, bei welcher die in
vitro ATPase-Aktivität von Prp28 bestimmt werden sollte. Zu diesem Zweck war es zuerst
nötig mit einem bereits vorhandenen Protein einen nicht-radioaktiven Assay zu etablieren,
welcher reproduzierbare Ergebnisse liefert. Anschließend sollte die ATPase-Aktivität von
Prp28 untersucht werden, und in diesem Zuge die enzymkinetischen Parameter Vmax und
KM bestimmt werden.
Material und Methoden 18
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Reagenzien
Alle Feinchemikalien und organischen Substanzen wurden von den Firmen AppliChem
(Darmstadt), BioRad (München), Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Mettler-Toledo
(Steinbach), MWG Biotech (München), Roth (Karlsruhe) oder Sigma-Aldrich (Steinheim)
bezogen und besitzen den Reinheitsgrad pro analysis. Dabei wurde in der Regel der
günstigste Anbieter gewählt.
2.1.2 Geräte
AbiPrism 3100 DNA Sequencer Applied Biosystems, Darmstadt
Agarosegelelektrophorese-Kammer BioRad, München
Äkta Prime GE Healthcare, Freiburg
Autoklav HST 4-5-8 Zirbus, Bad Grund
Auftragungsschleifen 5 ml GE Healthcare, Freiburg
Binokulare Carl Zeiss, Jena
Feinwaagen Sartorius, Göttingen
Fluorimeter Fluoromax III Horiba Jobin Yvon, USA
Gelschüttler Promax 1020 Heidolph, Schwabach
Innova 4230 Schüttelinkubator New Brunswick Scientific,
Nürtingen
Inkubator Mytron Schütt, Göttingen
Magnetrührer IKAMAG REO IKA, Staufen
Microfluidizer 110 S Microfluidics, USA
PCR-Whatman Biometra T personal Biometra, Göttingen
pH-Meter Beckman Coulter, Krefeld
Photometer Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe Accu-Jet Brand, Wertheim
Rotor JA-20 / JA-30.50 Ti Beckman Coulter, Krefeld
Rotor JLA 8.1000 Beckman Coulter, Krefeld
Material und Methoden 19
Superloops GE Healthcare, Freiburg
Elektrophoresekammer Hoefer miniVE GE Healthcare, Freiburg
Sonifier 250 Branson, USA
Spektralphotometer Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5417 R Eppendorf, Hamburg
Vortexer Schütt, Göttingen
Zentrifuge Allegra 21R Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti J-20 XPIJA-20 Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti J-30 I Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti JA-20 Beckman Coulter, Krefeld
2.1.3 Sonstige Materialien
Sterilfilter Millipore, USA
Glasgeräte Merck, Darmstadt
Crystal Clear Tape Henkel, Aachen
Reaktionsgefäße (0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml) Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Deutschland
24Well Kristallisationsschalen sitting drop Hampton Research, USA
Pipetten (verstellbar) Eppendorf, Hamburg
Vivaspin Konzentratoren Vivascience, Hannover
JA30-Zentrifugenröhrchen Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifugenbecher ( 1 l, 500 ml) Beckman Coulter, Krefeld
2.1.4 Chromatographiesäulen
HisTrap FF 5ml Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
Material und Methoden 20
Superdex 75 HiLoad (26/60) Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
2.1.5 Vektoren
pET-21a (C-terminaler His-tag,) Novagen Merck, Darmstadt
2.1.6 Enzyme
Carboxypeptidase B Boehringer, Ingelheim
2.1.7 RNA-Oligonukleotide
Die RNA-Oligonukleotide für die Aktivitätsmessungen wurden von IBA, Göttingen
bezogen und waren HPLC-gereinigt
Oligo-Name Sequenz
PolyA20 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
2.1.8 DNA-Oligonukleotide
Alle Primer wurden von MWG Biotech, München bezogen
T7
5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG – 3’
T7 term
5’ - CTA GTT ATT GCT CAG CGG T – 3’
2.1.9 Kit-Systeme
EnzChek Phosphate Assay Kit Invitrogen, USA
Material und Methoden 21
2.1.10 Größenstandards
Protein Molekular Weight Marker #SM0431 Fermentas, St. Leon-Rot
2.1.11 Organismen mit Resistenzen
Stammsammlung der AG Ficner, Molekulare Strukturbiologie, Universität Göttingen
E. coli Rosetta 2 (DE3) (Chloramphenicol)
2.1.12 Kristallisationsscreens
Crystal Screen 1 Hampton Research, USA
Crystal Screen 2 Hampton Research, USA
Crystal Screen Lite Hampton Research, USA
Crystal Screen Cryo Hampton Research, USA
Crystal Screen PEG/Ion Hampton Research, USA
Additiv Screen 1-2 Hampton Research, USA
Footprint Screens 1-2 Stura et al., 1999
JB Screen 1-9 Jena Bioscience, Jena
Magic Screen 1 – 3 Biogenova, USA
The Opti Salts Qiagen, Hilden
2.1.13 Antibiotika mit Arbeitskonzentrationen
Ampicillin (100 µg/ml) Roche, Mannheim
Chloramphenicol (20 µg/ml) Roth, Karlsruhe
2.1.14 Computerprogramme
Sigmaplot 11.0 Systat Software, Erkrath
GENtle 1.9.4 Magnus Manske, Köln
Material und Methoden 22
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) dient zur
spezifischen Amplifikation von Desoxyribonukleinsäuren (DNA). Da das Enzym DNA-
Polymerase die Nukleinsäurekette jedoch nicht de novo synthetisieren kann, werden kurze
DNA-Oligonukleotide benötigt (20-30 Basen), die das 3´- und das 5´-Ende der zu
amplifizierenden DNA-Sequenz flankieren und zu ihr komplementär sind. Darüber hinaus
werden alle Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), die zu amplifizierende Sequenz
(Matrize) und eine hitzestabile DNA-Polymerase (z.B. aus Thermus aquaticus) benötigt.
Ein Reaktionszyklus besteht aus drei Schritten:
1. Die DNA-Doppelhelix muss zunächst durch die Erhöhung der Temperatur auf 95 °C in
ihre beiden komplementären Stränge zerlegt werden (Denaturierung).
2. Durch die Senkung der Temperatur 5 °C unter den Schmelzpunkt der DNA-
Oligonukleotide können sich diese hochspezifisch an die zu amplifizierende DNA-
Sequenz anlagern (Hybridisierung).
3. Die DNA-Synthese erfolgt durch Änderung der Temperatur auf das Optimum der
jeweilig verwendeten DNA-Polymerase (Elongation).
Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab, so dass die im vorherigen Zyklus
generierten DNA-Fragmente im Folgezyklus wieder als Matrizen dienen können. Durch
diese periodische Anordnung der Schritte nimmt die Zahl der DNA-Moleküle nahezu
exponentiell zu.
Ein typisches PCR-Programm ist im Folgenden beschrieben: 1. Denaturierung 95 °C 5 Minuten
2. Denaturierung 95 °C 30 Sekunden
3. Primer Hybridisierung x °C 20 Sekunden
4. Elongation y °C z Minuten
5. Abschlußelongation 72 °C 10 Minuten
Material und Methoden 23
Die Temperatur „x“ bei der die Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide stattfindet, hängt
von der Schmelztemperatur derselben ab. Dabei wird die Hybridisierungstemperatur in der
Regel 5 °C unter der Schmelztemperatur der Oligonukleotide gewählt. Die optimale
Elongationstemperatur „y“ variiert zwischen den Polymerasen. So liegt sie für die Taq-
Polymerase bei 72 °C, wogegen sie für die Pfu-Polymerase 68 °C beträgt. Die
Elongationsdauer „z“ ist sowohl von der Länge des zu replizierenden Fragments als auch
von der Replikationsgeschwindigkeit der eingesetzten Polymerase abhängig.
2.2.1.2 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von DNA wird in Anlehnung an die „didesoxy-Methode“ nach Sanger
(1977) durchgeführt. Dabei werden bei der Amplifikation der zu sequenzierenden DNA in
einer Reaktion Kettenabbrüche der Polymerase-Reaktion durch den zufälligen Einbau
eines fluoreszenzmarkierten ddNTPs (didesoxy-Ribonukleosidtriphosphat) erzeugt. Da
hier die 3´-OH-Gruppe fehlt, kommt es zum Kettenabbruch. Der Statistik folgend ist damit
jedes mögliche, auf ddNTP-endende Fragment im Ansatz enthalten. Die entsprechenden
Fragmente unterschiedlicher Länge mit den jeweils fluoreszenzmarkierten ddNTP-Enden,
werden durch lange Kapillaren getrennt und detektiert. Mit dem Seq-Mix BigDye
Terminator v1.1 von Applied Biosystems kann die komplette Reaktion in einem einzigen
Ansatz durchgeführt werden. Für einen typischen Sequenzierungsansatz werden pipettiert:
200 - 400 ng zu sequenzierendes Fragment (Template)
8 pmol DNA-Oligonukleotid (Primer)
1,5 μl Seq-Mix
1,5 μl Seq-Puffer
add 10 μl H2O
Das Programm für Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2.2.2.1 genannten Programm
analog, wobei die optimale Temperatur für die Polymerisation bei 60 °C liegt. Die
Hybridisierungstemperatur ist abhängig von den verwendeten DNA-Oligonukleotiden.
Nach der Reaktion werden die Produkte für den Sequenzierungsautomaten gereinigt, um
Material und Methoden 24
störende Faktoren wie DNA-Oligonukleotide, Polymerase und restliche ddNTPs zu
entfernen. Hierzu wird dem Ansatz hinzupipettiert:
1 μl 0,125 M EDTA
1 μl 3 M Natriumacetat
50 μl Ethanol (96 %)
Der Ansatz wird vorsichtig durchmischt, für 5 Minuten inkubiert und anschließend bei
16000 x g für 15 Minuten und bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen,
das Pellet in 70 μl Ethanol (70 %) gewaschen und erneut für 5 Minuten zentrifugiert. Das
Pellet wird 2 Minuten an der Luft getrocknet und schließlich in 10 μl HiDye
aufgenommen.
Die gereinigten DNA-Fragmente werden in einem Kapillarsequenzierer von Applied
Biosystems (2.1.2) analysiert.
2.2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2.2.1 Herstellung und Selektionsbedingungen von LB-Agarplatten und LB-Flüssigmedium
LB-Agarplatten werden benutzt, um einzelne Bakterienkolonien wachsen zu lassen. Die
Herstellung der Platten muss unter sterilen Bedingungen ablaufen. Dazu werden die unten
aufgeführten Substanzen gemischt und autoklaviert. Falls Antibiotika verwendet werden,
werden diese nach dem Abkühlen des LB-Agars auf ca. 45°C in der erforderlichen Menge
zugegeben.
LB-Flüssigmedium wird verwendet, um die in den Zellen enthaltene DNA in größerem
Maßstab zu vermehren. Je nach Zellstamm und Plasmidsystem werden auch hier
Antibiotika eingesetzt.
LB-Medium LB-Agarplatten
1 % (w/v) Trypton 500 ml LB-Medium
0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1,5 % (w/v) Agar-Agar
0,5 % (w/v) NaCl
Material und Methoden 25
Sterilisation durch Autoklavieren Sterilisation durch Autoklavieren
2.2.2.2 Herstellung chemisch kompetenter Escherichia coli-Zellen
Das Einführen von Plasmiden in E. coli Zellen nennt man Transformation (2.2.2.3). Damit
Zellen Plasmide aufnehmen können, müssen sie kompetent gemacht werden, das heißt die
Zellmembran muss in einen porösen Zustand versetzt werden. Durch die entstandenen
Poren können Plasmide oder andere DNA-Fragmente in die Zelle gelangen. Aus einer
Dauerkultur werden mit einem sterilen Zahnstocher einige Zellen herausgekratzt. Diese
werden auf einer LB-Agarplatte bei 37°C über Nacht im Brutschrank angezogen. Hat der
Zellstamm eine eigene Antibiotikaresistenz, wird die LB-Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum hergestellt. Von einem Klon auf der LB-Agarplatte wird
dann eine 5 ml Übernachtkultur in flüssigem LB-Medium angesetzt und über Nacht bei
37°C inkubiert. Diese Vorkultur wird dann durch Überführen in 500 ml LB-Medium und
Mischen auf 1:100 verdünnt und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 angezogen. Die
Zellernte erfolgt durch Zentrifugation mit 3000 x g für 10 Minuten bei 4°C. Das
entstandene Zellpellet wird mit 150 ml eiskaltem TFB1-Puffer resuspendiert und für 5
Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 x g für
und 4°C für 10 Minuten pelletiert. Dieses Zellpellet wird in 5 ml eiskaltem TFB2-Puffer
vorsichtig resuspendiert und unter Kühlung in 50 µl Aliquots aufgeteilt. Die Zellen werden
durch flüssigen Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.
TFB1-Puffer TFB2-Puffer
0,03 M Kaliumacetat pH 7,0 0,01 M NaMOPS pH 7,2
0,05 M MnCl2 0,075 M CaCl2
0,01 M CaCl2 0,01 M RbCl2
0,1 M RbCl2 15 % (v/v) Glyzerin
15 % (v/v) Glyzerin
pH 5,8 mit 0,2 M Essigsäure einstellen pH 6,5 mit 1 M NaOH einstellen
Sterilfiltrieren Sterilfiltrieren
2.2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen
Material und Methoden 26
Das Einbringen von DNA in kompetent E. coli Zellen erfolgt nach folgender Methode: 50
µl kompetente Zellen (2.2.2.2) werden für 10 Minuten auf Eis aufgetaut. 100 – 200 ng
eines gereinigten Plasmids werden zu den Zellen gegeben, vermischt, für 30 Minuten auf
Eis inkubiert und für 1 Minute einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt. Nach einer
Abkühlungsphase von 5 Minuten auf Eis wird 1 ml LB-Medium (2.2.2.1) ohne
Antibiotikum zu den Zellen gegeben. Der Ansatz wird unter Schütteln (400 Upm) bei 37°C
für 45 Minuten inkubiert und die Zellen danach bei 5000 x g und 4°C für 1 Minute
abzentrifugiert. Das Pellet wird in 100 µl LB-Medium resuspendiert und auf einer LB-
Agarplatte ausgestrichen. Die Platte enthält ein Antibiotikum, gegen welches das
transformierte Plasmid eine Resistenz vermittelt, um Zellen ohne Plasmid
auszuselektieren. Diese Platte wird bei 37°C über Nacht inkubiert.
2.2.2.4 Expression rekombinanter Proteine in E. coli
Rekombinante Proteine sind Proteine die auf DNA-Ebene über molekularbiologische
Methoden in Plasmide (2.1.5) mit bestimmten Eigenschaften eingebaut werden. Dabei
erhält das Gen des Proteins einen Replikationsursprung und einen induzierbaren Promotor,
in der Regel einen durch IPTG induzierbaren Lac-Promotor. Ferner wird das Gen so in das
Plasmid eingebaut, dass es korrekt im offenen Leserahmen liegt. Das Plasmid enthält eine
Antibiotikaresistenz, die es ermöglicht, im Expressionsmedium auf Zellen mit Plasmid zu
selektieren. Es gibt Expressionsstämme, die schon Plasmide mit bestimmten Eigenschaften
tragen und deshalb mehrere Resistenzen besitzen. Rekombinante Proteine werden in
Labororganismen produziert, in welchen sie in der Natur in der Regel nicht vorkommen.
Durch induktive Expression durch IPTG, welches auf den Lac-Promoter wirkt, erreicht
man oft eine stark gesteigerte Expression des rekombinanten Proteins, im Vergleich zur
Expression des nativen Proteins in den Zellen des Ursprungsorganismus. Deshalb spricht
man in diesem Fall auch von der Überexpression eines rekombinanten Proteins. Oft ist
diese Überexpression über eine Polyacrylamidgelelektrophorese (2.2.3.2) der Proteine
einer Zelle erkennbar. Dabei vergleicht man das gesamte Proteom vor und nach der
Induktion der Expression. Die Expression rekombinanter Proteine in E. coli kann in 2YT-
Medium mit entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden. Vom transformierten
Expressionsstamm (2.2.2.3) wird eine 10 ml Vorkultur angesetzt, die bei 37°C über Nacht
im Schüttler (200 Upm) anwächst. Danach werden für die Hauptultur 500 ml 2YT Medium
Material und Methoden 27
mit Antibiotikum gemischt und im Verhältnis 1:100 mit der Vorkultur angeimpft. Die
Zellen wachsen bei 37°C im Schüttler (200 Upm) bis zu einer OD600 von 0,5 – 0,8. Bei
einer OD600 zwischen 0,5 und 0,8 wird die Expression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG
induziert und für 18-24 Stunden bei 16 °C im Schüttler (200 Upm) durchgeführt. Die
OD600 wird am Ende der Expression bestimmt. Danach erfolgt die Zellernte (2.2.2.6).
2YT-Medium
2 % (w/v) Trypton
2 % (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v) NaCl
Sterilisation durch Autoklavieren
2.2.2.5 Kontrolle der Expression rekombinanter Proteine
Die Kontrolle der Expression erfolgt über Polyacrylamidelektrophorese (2.2.3.2). Dazu
wird von der Kultur direkt vor der Induktion 1 ml abgenommen. Die Zellen werden für 1
Minute bei 11.000 x g pelletiert und das Pellet mit Laemmli-Probenpuffer (2.2.3.2)
resuspendiert., für 5 Minuten bei 95°C gekocht und durch SDS-PAGE analysiert.
2.2.2.6 Zellernte und Aufschluss von Expressionskulturen
Um die exprimierten rekombinanten Proteine (2.2.2.4) aus den Zellen zu isolieren, müssen
die Zellen geerntet und aufgeschlossen werden. Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation mit
4.800 x g für 20 Minuten bei 4°C. Nach dem Entfernen des Überstands wird das Pellet
entweder sofort aufgeschlossen oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für bis zu
6 Monaten bei -20°C gelagert.
Für den Aufschluss der Zellen wird das Pellet in kaltem Lysispuffer resuspendiert. Die
Zusammensetzung des Lysispuffers richtet sich nach den Eigenschaften des zu
isolierenden Proteins und ist am Ende dieses Abschnitts für Prp28∆N angegeben. Der pH-
Wert des Puffers richtet sich nach dem isoelektrischen Punkt des Proteins. Salze und
Glycerin beeinflussen die Löslichkeit beim Aufschluss und Proteaseinhibitoren verhindern
den Abbau des rekombinanten Proteins durch beim Aufschluss freigesetzte Proteasen. Der
Aufschluss von Zellen wird im pneumatischen Zelldesintegrator (2.1.2) durchgeführt. Das
Material und Methoden 28
Prinzip besteht darin, die Zellen in einer Kapillaren unter großem Druck
aufeinanderprallen zu lassen. Mechanische Kräfte lassen die Zellen aufbrechen. Für einen
effizienten Aufschluss wird das Zellpellet gewogen und pro Gramm Pellet mit 3-5 ml
Lysispuffer resuspendiert.
Im mit Lysispuffer äquilibrierten und eisgekühlten Fluidizer werden die Zellen 3-mal mit
einem Druck von 80-90 psi aufgeschlossen. Anschließend wird das Lysat in JA30-
Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 30.000 x g für 60 Minuten und 4°C
ultrazentrifugiert. Gelöstes Protein befindet sich im Überstand, Zelltrümmer und unlösliche
Proteine sind im Pellet. Die Effizienz des Aufschlusses und die Löslichkeit des
rekombinanten Proteins wird nach jedem Aufschluss in einem Polyacrylamidgel (2.2.3.2)
überprüft. Es werden je 20 µl von Lysat, Überstand und resuspendiertem Pellet mit 20 µl
Laemmli-Probenpuffer gemischt. Danach werden die Proben 5 Minuten bei 95°C gekocht
und zusammen mit der Expressionskontrolle (2.2.2.5) auf einem Polyacrylamidgel
analysiert.
Lysispuffer von His-Fusionsproteinen:
50 mM HEPES/NaOH pH 7,5
600 mM NaCl
2 mM β-Mercaptoethanol
2.2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
Alle in diese Diplomarbeit angegebenen Proteinkonzentrationen wurden mittels zweier
Methoden bestimmt, nach der Methode von Bradford, sowie unter zu Hilfenahme des
molaren Extinktionskoeffizienten
2.2.3.1.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford
Das Prinzip der Methode liegt in der Anfärbung von Proteinen mit dem Farbstoff
Coomassie Blue G-250, welcher spezifisch an Arginin-, Tryptophan-, Tyrosin, Histidin-
und Phenylalaninreste bindet. Arginin wird dabei achtmal stärker als die anderen
Material und Methoden 29
Aminosäuren gebunden. Die Bindung des Farbstoffs an Aminosäuren führt zu einer
Veränderung des Absorptionsmaximums. Freies Coomassie Brilliant Blue G-250 hat ein
Maximum bei 470 nm, gebundenes bei 595 nm. Die Änderung der Absorption bei 595 nm
wird photometrisch bestimmt. Sie verhält sich im Bereich OD595 0,1-0,9 annähernd
proportional zur Proteinkonzentration. Dabei entspricht eine OD595 von 0,1 ungefähr 0,1
mg/ml Protein.
2.2.3.1.2 Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung
Diese Methode beruht auf der Absorption von Proteinen bei 280 nm aufgrund ihres
Gehalts an Tryptophan und Tyrosin. Enthält ein Protein x Tryptophanreste und y
Tyrosinreste, errechnet sich der theoretische molare Extinktionskoeffizient nach folgender
Formel:
ε280(denat) = x (Tyr)*1280 M-1cm-1 + y (Trp) * 5690 M-1cm-1
Dieser Wert gilt jedoch nur für ein entfaltetes Protein. Der molare Extinktionskoeffizient
eines nativen Proteins wird nach der Methode von Gill und Hippel (1989) bestimmt.
Puffer A: Puffer B: 6 M Guanidiniumchlorid 150 mM KCl 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,5
Es werden identische Proteinmengen in Puffer A und Puffer B überführt
(Endkonzentration etwa 0,5 mg/ml). Die Ansätze werden für 2 h bei 37°C inkubiert. Puffer
A führt dabei zu einer Denaturierung des Proteins, während Puffer B das native Protein
enthält. Nach Äquilibrierung der Proben auf 20°C wird die UV-Absorption bei 280 nm
gemessen. Für den nativen Extinktionskoeffizienten gilt:
ε280(nativ) = ε280(denat) * OD280(Puffer B) / OD280(Puffer A)
2.2.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE)
Die Auftrennung von Proteinen anhand ihrer Größe erfolgt mittels der SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (LAEMMLI, 1970). Das Detergenz
Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfat, SDS) denaturiert Proteine und bildet
mit ihnen Komplexe. Damit verleiht es dem Protein eine stark negative Ladung, die eine
Material und Methoden 30
gerichtete Wanderung im elektrischen Feld zur Anode ermöglicht. Die Eigenladung des
Proteins wird weitgehend maskiert und ermöglicht somit eine Trennung der Proteinen
ausschließlich nach ihrer Größe. Polyacrylamid dient als Trägermaterial und ist ein
molekulares Sieb mit gleichmäßigen Vernetzungsgrad. Das Prinzip der diskontinuierlichen
Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von Proteinen vor der eigentlichen
Trennung durch einen Sprung des pH-Wertes von zwei übereinander geschichteten
Polyacrylamidgelen. Das untere Trenngel enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,8
und einem Leition hoher Ionenbeweglichkeit. Der pH-Wert des darüber geschichteten
Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6,8. Das Leition des Sammelgels besitzt eine geringere
Ionenbeweglichkeit. Der Elektrodenpuffer enthält ein Folgeion geringer
Ionenbeweglichkeit, dessen Ladung allerdings abhängig vom pH-Wert ist.
Durch das Einschalten des Stromes bewegen sich die Leitionen des Laufpuffers mit hoher
Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und überholen dabei die aufgetragenen
Proteine. Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und
erhöhter Feldstärke, aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt werden.
Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei größer als die der Folgeionen, aber langsamer
als die der Leitionen. Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe Front an dem
Feldstärkesprung.
Beim Auftreffen auf das Trenngel ändern die Folgeionen aufgrund des erhöhten pH-
Wertes ihre Ladung und damit ihre Ionenbeweglichkeit. Sie überholen die Proteine, die
sich dann wieder in einem Gebiet konstanter Feldstärke bewegen. Die Folge ist eine
Auftrennung der am Trenngel komprimierten Proteinfront. Das Trenngel wirkt dabei als
Molekularsieb, da die Proteine durch die weit engeren Poren des Trenngels in
Abhängigkeit ihrer Masse verlangsamt und so ihrer Größe nach getrennt werden. Das
Herstellen der SDS-Gele erfolgt mit dem Protein-Elektrophoresesystem Hoefer miniVE
von GE Healthcare, Freiburg (2.1.2). Dabei wird pro Gel eine Keramikplatte und eine
Glasplatte mit Ethanol gewaschen und staubfrei trocken gerieben. Diese Platten werden
mit Abstandshaltern auf 1 mm Abstand gehalten und in einer Gießvorrichtung für vier
Gele eingespannt. Das Trenngel wird als erstes gegossen, indem der Raum zwischen dem
Platten bis auf 2 cm unterhalb des oberen Randes mit polymerisierender Trenngellösung
aufgefüllt wird. Das Trenngel wird mit Isopropanol überschichtet. Dies wird danach
entfernt, das Gel mit Wasser gewaschen und der restliche Raum mit Sammelgellösung
gefüllt. In diese wird ein Kamm mit der benötigten Taschengröße gesteckt.
Material und Methoden 31
Nicht sofort benötigte Gele werden bis zu einer Woche bei 4°C in nasse Tücher
eingewickelt gelagert. Die Gele werden mit den Platten in die Gelhalterung eingespannt
und in die Laufkammer eingehängt. Diese wird mit der benötigten Menge Laufpuffer
gefüllt, der auch in das obere Reservoir gefüllt wird. Danach wird vorsichtig der Kamm
gezogen und die Geltaschen mit Hilfe einer Spritze und Laufpuffer gespült. Die
aufzutragenden Proteinproben werden 1:1 mit 2x Laemmli-Probenpuffer gemischt und für
5 Minuten bei 95°C gekocht.
1-20 µl dieser Proben werden mit einer 100 µl Hamilton-Pipette in die Geltaschen geladen.
Zusätzlich wird ein Proteinmarker mit bekannten Molekülgrößen aufgetragen. Die
Elektrophorese wird für 1-2 Stunden mit einer Stromstärke von 25 mA durchgeführt bis
die Lauffront des Laemmli-Probenpuffers unten aus dem Gel läuft. Danach wird das Gel
aus den Platten genommen, das Sammelgel entfernt und das Trenngel gefärbt (2.2.3.3).
Trenngel (10, 12,5 oder 15 %) Sammelgel (5 %)
10/12,5/15 % (w/v) Acrylamid 5 % (w/v) Acrylamid
0,375 M Tris/HCl pH 8,8 0,125 M Tris/HCl pH 6,8
0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS
0,1 % (v/v) TEMED 0,1 % (v/v) TEMED
0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat 0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat
Laufpuffer Laemmli-Probenpuffer (2x)
0,025 M Tris-HCl 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8
0,192 M Glycin 0,07 M SDS
0,1 % (w/v) SDS 50 % (v/v) Glyzerin
0,1 % (w/v) Bromphenolblau
5 % (v/v) 2-Mercaptoethanol
2.2.3.3 Anfärben von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue
Zum Anfärben der Proteine im Gel wird Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung benutzt.
Proteinmengen bis zu 0,1 µg pro 0,5 cm Bande können mit Coomassie noch sichtbar
gemacht werden. Das Gel wird nach der SDS-PAGE (2.2.3.2)aus den Platten genommen
und in eine Lösung aus 100 ml Entfärbelösung und 300 µl Coomassie Brilliant Blue G-250
Material und Methoden 32
gegeben. Dann wird das Gel für eine Minute in der Mikrowelle auf höchster Stufe erhitzt
und auf einer Wippe für 5 Minuten gefärbt. Die Entfärbung erfolgt für eine Stunde in
Entfärbelösung.
Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung
1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 in Ethanol
Entfärbelösung
10 % (v/v) Ethanol
5 % (v/v) Essigsäure
Nach dem Entfärben werden die Gele mit einem Scanner (Snapscan 50, AGFA)
digitalisiert und in den Dateiformaten TIFF und JPG gespeichert.
2.2.3.4 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation
Eine einfache und schnelle Methode, um Proteinlösungen zu konzentrieren, ist die
Zentrifugation der Lösung in Gefäßen, welche am Boden eine Membran mit definierter
Porengröße besitzen (Konzentratoren). Unter dieser Membran ist ein weiteres Gefäß
aufgesetzt, welches den Durchfluss auffängt. Bei einem ideal globulären Proteinmolekül
korreliert die Anzahl der Aminosäuren mit dem Durchmesser in einem definierten
Verhältnis, genannte Stokes-Radius. Dadurch können sich Teilchen, welche kleiner sind
als der Durchmesser der Pore, also kleine Proteine, Wasser und gelöste Ionen durch diese
Membran in das Auffanggefäß bewegen. Das zu konzentrierende Protein wird hierbei
zurückgehalten, wodurch sich seine Konzentration stetig erhöht.
Die Zentrifugationen erfolgen bei 3000-4000 x g bei 4°C so lange, bis die gewünscht
Proteinkonzentration erreicht ist. Es wird sowohl die Konzentration der Proteinlösung nach
der Zentrifugation bestimmt (Bradford, 2.2.3.1.1) als auch die Menge an Protein im
Durchfluss. Die Proteine werden auf einem Polyacrylamidgel (2.2.3.2) analysiert. Beim
Einengen von Proteinlösungen werden Vivaspin-Konzentratoren der Firma Vivascience
verwendet.
Material und Methoden 33
2.2.3.5 Chromatographische Methoden
Chromatographische Methoden werden verwendet, um große Mengen von Proteinen
aufzureinigen oder Eigenschaften einzelner Proteine zu untersuchen. Es gibt zahlreiche
chromatographische Trennmethoden, wie z.B. Affinitäts-, Größenausschluss-,
Ionenaustausch-, Dünnschicht- oder Gaschromatographie.
Bei der nativen Trennung von Proteinen wird meist auf Affinitäts-, Ionenaustausch- und
Ausschlusschromatographie zurückgegriffen. Alle Trennmethoden erfolgen an Säulen
(2.1.4) die mit Hilfe eines Chromatographiesystems (2.1.2) kontrolliert werden, welches
die jeweiligen Verlaufsdiagramme im Computer dokumentiert. Es werden Fraktionen
gesammelt, die je nach erforderlicher Trenngenauigkeit zwischen 0,5-10 ml groß sind. Die
Verlaufsdiagramme jeder Proteinchromatographie sind im Ergebnisteil (3) aufgeführt. In
den folgenden Abschnitten werden die in dieser Arbeit benutzten chromatographischen
Methoden beschrieben.
2.2.3.5.1 Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen von
Säulenmaterial und Protein. Abhängig von der Beschaffenheit des Säulenmaterials und der
Probe binden die Moleküle an die Matrix. Das Adsorbens kann von der Säule durch
kompetitive Verdrängung, Konformationswechsel durch Änderung des pH-Wertes oder
durch Änderung der Ionenstärke eluiert werden. Die Affinitätschromatographie stellt eine
sehr spezifische und selektive Trennmethode für Biomoleküle dar.
2.2.3.5.1.1 Affinitätschromatographische Reinigung von Hexa-Histidin-Fusionsproteinen
Proteine, die mit N- oder C-terminaler His-Sequenz exprimiert werden, lassen sich selektiv
über eine Affinitätschromatographie mittels immobilisierter Metallchelatkomplexe
reinigen (engl. immobilized metal chelating affinity chromatography, IMAC). Hierbei
bilden zwei Histidine über die freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffatome koordinative
Bindungen zu einem immobilisierten Metallion aus. Dabei bildet sich ein Chelatkomplex,
der kompetetiv durch Imidazol aufgelöst werden kann. Die Metallionen (z. B. Nickelionen)
Material und Methoden 34
müssen dabei zweiwertig sein und sind meist an Nitrilotriessigsäure-Sepharose (NTA)
gebunden.
In dieser Arbeit werden für die Reinigung von Proteinen mit Hexa-Histidin-Sequenz die
HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säulen (5 ml, GE Healthcare) benutzt. Als Metallion
wird Nickel eingesetzt, das über vier koordinative Bindungen an NTA gebunden ist. NTA
ist seinerseits kovalent an die Sepharose-Trägermatrix gebunden. Zur Entfernung von an
das Zielprotein gebundener RNA wird nach dem Probenauftrag mit 2-3 Säulenvolumen
Waschpuffer gewaschen. Durch die darin enthaltenen 2 M LiCl wird evtl. an das
Zielprotein gebundene RNA gefällt und somit vom Protein entfernt. Um unspezifisch an
das Säulenmaterial gebundene Proteine zu eluieren, wird zunächst ein Stufengradient auf
8% Elutionspuffer angelegt. Die reversible Wechselwirkung von Metallion und Histidin-
Sequenz am Zielprotein wird durch einen linearen Gradienten von 9-100 % Elutionspuffer
gelöst. Alle Chromatographien dieser Art werden ebenfalls bei 4 °C und einer Flussrate
von 2 ml/Minute durchgeführt.
Bindepuffer Elutionspuffer
50 mM HEPES/NaOH pH 7,5 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5
600 mM NaCl 600 mM NaCl
2 mM β-Mercaptoethanol 2 mM β-Mercaptoethanol
20 mM Imidazol 200 mM Imidazol
Waschpuffer
50 mM HEPES/NaOH pH 7,5
600 mM NaCl
2 M LiCl
2 mM β-Mercaptoethanol
20 mM Imidazol
2.2.3.5.2 Größenauschlusschromatographie
Die Größenausschlusschromatographie trennt Moleküle nach ihrer Größe. Die hierbei
verwendeten Chromatographiesäulen bestehen aus einem porösen Gelmaterial (Sepharose)
mit definierter Porengröße. Das Trennverhalten basiert auf den unterschiedlichen
Material und Methoden 35
hydrodynamischen Volumina der Probenmoleküle. Je nach Molekülgröße, Molekülgestalt
und gewählten Säuleneigenschaften dringen die Moleküle unterschiedlich tief in die
Gelmatrix ein. Kleineren und globulären Molekülen steht dabei mehr Raum zur Verfügung
als größeren und langgestreckten. Daher erfahren kleinere Moleküle durch das tiefere
Eindringen in die Gelmatrix eine Verzögerung und eluieren später von der Säule als
größere. Die Größenausschlusschromatographie ist daher eine Methode, um Proteine nach
den ersten Reinigungsschritten von weiteren Verunreinigungen zu trennen. Die Auflösung
der Trennung ist abhängig von der Fließgeschwindigkeit und dem aufgetragenen
Probenvolumen. Eine niedrige Fließgeschwindigkeit und kleine Probenvolumina erzielen
bessere Auflösungen. Diese Trennmethode wird im Rahmen diese Arbeit ausschließlich
für präparative Reinigungen von Proteinen verwendet. Die HiPrep 26/60 Superdex75 Säule
(2.1.4) eignet sich zur Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse von weniger als 75
kDa. Ihre Gelmatrix besteht aus Allyldextran, das kovalent zu N,N’-Methylenbisacrylamid
verknüpft ist. Nach Äquilibrierung der Säule mit 1,5-fachem Säulenvolumen Laufpuffer
wird die Probe auf die Säule gegeben. Das maximale aufgetragene Probenvolumen beträgt
2 % des Säulenvolumens, das entspricht 6,4 ml bei der XK 26/60 Säule. Alle
aufgetragenen Proteinkonzentrationen sind nicht höher als 8 mg/ml. Die Proteinprobe wird
von der Säule mit Puffer eluiert und das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die
Ausschlusschromatographie erfolgt für alle Proteine bei 4 °C und einer
Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Minute. Die Analyse der Fraktionen erfolgt anschließend
durch SDS-PAGE (2.2.3.2)
Laufpuffer für Prp28∆N-His
10 mM HEPES/NaOH pH 7,5
150 mM KCl
2 mM β-Mercaptoethanol
Material und Methoden 36
2.2.3.6 Bestimmung von Bindungskonstanten
Die Stärke der Bindung zwischen einem Protein und seinem Liganden kann mit der
Dissoziationskonstanten KD beschrieben werden. Es gilt:
][][*][
PLLPK D =
[P]: Konzentration des freien Proteins [L]: Konzentration des freien Liganden [PL]: Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes
Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten für die Interaktion von Prp28 mit ATP und
ADP wurde die Methode der Fluoreszenztitration (2.2.3.6.1) angewandt. Es wurde der KD-
Wert bei 25°C in Bindungspuffer ermittelt.
Bindungspuffer:
10 mM Hepes/NaOH, pH 7,5
150 mM KaCl
10 mM MgCl2
2.2.3.6.1 Fluoreszenztitration
Die Bestimmung des KD-Wertes erfolgt über die Messung der Abnahme der Tryptophan-
Fluoreszenz des Proteins mit zunehmender Ligandenkonzentration. Als Ligand werden
mant- ADP und mant-ATP (Jena Bioscience, Jena) verwendet (Abb. 7). Die mant-Gruppe
ist ein Fluorophor, das bei 355 nm maximal angeregt wird und bei 448 nm maximal
fluoresziert. Da sich die Anregungswellenlänge mit der Tryptophan-Fluoreszenz von
Proteinen überschneidet, kommt es bei Bindung des mant-Nukleotids zu einem
Energietransfer zwischen der Tryptophan- Fluoreszenz des Proteins und der mant-Gruppe
(FRET-Effekt). Dadurch nimmt die Tryptophan-Fluoreszenz ab.
Material und Methoden 37
Abb. 7: mant-ADP
2.2.3.6.1.1 Datenaufnahme
Für mant-ATP und mant-ADP werden jeweils Ausgangslösungen hergestellt, deren
Konzentrationen über UV-Absorption bei 255 nm genau bestimmt werden. Gemäß den
Herstellerangaben wird als Extinktionskoeffizient ε255 nm = 23300 M-1cm-1 verwendet.
Es werden jeweils 120 μl Proben in Bindungspuffer (2.2.3.6) vorbereitet. Sie enthalten 1
μM Protein und unterschiedliche Konzentrationen des Liganden. Jede Probe wird dreimal
unabhängig voneinander angesetzt. Nach dem Mischen werden die Ansätze 45 min bei 25
°C inkubiert, damit sich das Bindungsgleichgewicht einstellt.
Die Fluoreszenzmessungen werden mit einem Spektrofluorimeter Fluoromax III (2.1.2) bei
25 °C durchgeführt. Es werden 0,2 x 1 cm Küvetten verwendet. Gemessen wird das
Fluoreszenzsignal (S/R, in der Einheit cps – counts per second) bei 330 nm nach Anregung
bei 295 nm. Der Öffnungsschlitz für die Anregung ist 2 nm breit, derjenige für die
Detektion 5 nm. Die Detektion erfolgt während 1 Minute mit einer Integrationszeit von 0,5
Sekunden. Für jede Probe wird der Mittelwert berechnet und um den Beitrag des Puffers
korrigiert.
2.2.3.6.1.2 Korrekturfaktoren
Die mant-Gruppe absorbiert einen kleinen Anteil der Anregungs- und
Fluoreszenzstrahlung. Dieser Anteil wird mit zunehmender Ligandenkonzentration größer
und verringert das beobachtete Fluoreszenzsignal (S/R). Durch Multiplikation mit
Korrekturfaktoren wird dieser inner filter effect ausgeglichen (Birdsall et al. 1983).
Die Korrekturfaktoren basieren auf dem Lambert-Beer-Gesetz. Es wird dabei vereinfacht
angenommen, dass das gemessene Fluoreszenzsignal im Küvettenmittelpunkt entsteht.
Material und Methoden 38
Dann muss bezogen auf 0,2 x 1 cm2 Küvetten die Anregungsstrahlung eine Weglänge von
0,5 cm und die Fluoreszenzstrahlung eine Strecke von 0,1 cm zurücklegen. Mit den
molaren Extinktionskoffizienten ε295nm(mant) und ε330nm(mant) ergibt sich:
(S / R)korr = (S / R)gemessen * 10 ε295nm(mant)*[L]*0,5cm * 10 ε330nm(mant)*[L]*0,1cm
[L]: mant-ATP- oder -ADP-Konzentration
Der erste Exponentialterm korrigiert die Absorption der Anregungsstrahlung, der zweite
Term die Absorption der Fluoreszenzstrahlung.
2.2.3.6.1.3 Datenauswertung
Die Gesamtkonzentration [P]0 des Proteins setzt sich aus der Konzentration des freien
Proteins [P] und des Protein-Ligand-Komplexes [PL] zusammen: [P]0 = [P] + [PL]. Damit
lässt sich die Gleichung für den KD-Wert (2.2.3.6) umformen zu:
DKLLP
PL+
=][
][][][ 0
[L]: Konzentration des freien Liganden
Diese Gleichung hat dieselbe Form wie die Michaelis-Menten Gleichung. Bei der Messung
ist [PL] proportional zu der Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz ΔF. Maximal kann [PL]
den Wert von [P]0 erreichen. Darum gilt:
DKLLF
F+
Δ=Δ
][][max
Setzt man vereinfachend [L] gleich der zugegebenen Gesamtkonzentration des Liganden,
so lässt sich mit dieser Formel KD aus den Typtophan-Fluoreszenzmessungen berechnen.
Es wird das korrigierte Fluoreszenzsignal (S/R) gegen [L] aufgetragen und an folgende
Gleichung angepasst:
Material und Methoden 39
Dkorr KL
LFFRS
+Δ
−=][
][)/( max
max
Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr
Der Kurvenangleich wird mit dem Programm SigmaPlot durchgeführt. Da die oben
angegebene Gleichung dieselbe Form wie die Michaelis-Menten Gleichung hat, gilt in
analoger Weise außerdem der Eadie-Hofstee-Plot:
][max LFKFF D
Δ−Δ=Δ
Trägt man also ΔF gegen ΔF/[L] auf, so ergibt sich eine Gerade, aus deren Steigung KD
abgelesen werden kann. Dies ist eine alternative Möglichkeit, den KD-Wert aus den
Meßergebnissen zu bestimmen.
2.2.3.7 Bestimmung der ATPase Aktivität
Die Kinetik eines Enzyms lässt sich mit den beiden Parametern KM und Vmax beschreiben.
Dabei beschreibt der Wert Vmax einen Zustand der Sättigung, in welchem die
Umsatzgeschwindigkeit v nicht mehr durch Erhöhung der Substratkonzentration gesteigert
werden kann. Die Michaelis-Menten Konstante KM gibt die Substratkonzentration an, bei
der Vmax/2 erreicht ist.
][][*max
SKSV
vM +
=
[S] = Konzentration des Substrats
Zur Bestimmung von KM und Vmax wird in einer Messreihe die Anfangsgeschwindigkeit
der Reaktion v bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] gemessen. In dieser Arbeit
wurde dazu das EnzChek® Phosphate Assay Kit der Firma Invitrogen (2.1.9) verwendet.
In diesem ist das Enzym Purin Nukleosid Phosphorylase enthalten, welches in
Anwesenheit von Phosphat das ebenfalls im Kit enthaltene Substrat 2-amino-6-mercapto-
7-methylpurine-Ribosid (MESG) zu Ribose-1-Phosphate und 2-amino-6-mercapto-7-
Methylpurine umwandelt. Dies ist mit einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von
330 nm zu 360 nm verbunden, wodurch sich ein direkter proportionaler Zusammenhang
Material und Methoden 40
zwischen Absorptionszunahme und Freisetzung von Phosphat durch ATPase-Aktivität von
Prp28 ergibt. Die Absorptionszunahme bei 360 nm wird Photometrisch gemessen.
Für die einzelnen Messungen werden jeweils 100 µl Proben angesetzt. Diese enthalten das
Protein in einer Konzentration von 1 µM sowie ATP in Konzentrationen von 0 – 500 µM.
Die Ansätze werden vor der Zugabe von ATP 10 min bei 25 °C im Photometer inkubiert.
Unmittelbar nach der ATP-Zugabe wird die Messung gestartet.
Die Anfanggeschwidigkeit v0 in ∆E/min wird anhand der Anfangssteigung der gemessenen
Absorptionsänderung bestimmt.
Von allen Messungen wurden Negativkontrollen ohne ATP bzw. ohne Protein
durchgeführt, um sicherzustellen, dass die gemessene Absorptionsänderung wirklich von
der ATPase-Aktivität des zu testenden Proteins stammt.
2.2.3.7.1 Datenauswertung
Die Datenauswertung erfolgt nach Lineweaver-Burk. Bei diesem Linearisierungsverfahren
wird 1/v auf der Y-Achse gegen 1/[S] auf der X-Achse aufgetragen. Die dabei entstehende
Gerade hat die Steigung KM/Vmax, und schneidet die Y-Achse bei 1/Vmax sowie die X-
Achse bei -1/KM. Zusätzlich erfolgt die Auswertung durch Kurvenanpassung mit
SigmaPlot an die Michaelis-Menten Gleichung
][][*max
SKSV
vM +
=
[S] = Konzentration des Substrats
Anschließend wurde mit dem Quotionten aus Vmax und der eingesetzten
Enzymkonzentration von 1µM die Wechselzahl kcat bestimmt.
2.2.4 Kristallographische Methoden
2.2.4.1 Kristallisation von Proteinen
Die Kristallisation von Proteinen ist die Voraussetzung für eine hochaufgelöste,
dreidimensionale Strukturanalyse mit Hilfe von Röntgenbeugungsexperimenten. Generell
bilden sich Kristalle durch regelmäßiges Aneinanderlagern von Proteinmolekülen in einer
Material und Methoden 41
genau definierten, sich immer wiederholenden räumlichen Ausrichtung. Bei diesem
Vorgang spielen die thermodynamische und die kinetische Komponente entscheidende
Rollen. Die thermodynamische Komponente setzt voraus, dass sich das Protein in
übersättigtem Zustand in Lösung befindet. Durch das Aggregieren von Protein sinkt die
Konzentration und durch die H2O Freisetzung aus der Hydrathülle der Proteine erreicht die
Lösung einen Zustand höherer Entropie, ein thermodynamisch bevorzugter Zustand.
Geschieht dies zu schnell (in sehr stark übersättigten Proteinlösungen), bilden sich keine
geordneten Kristalle und das Protein präzipitiert ungeordnet. Geschieht es dagegen zu
langsam (in nicht oder nur leicht übersättigten Proteinlösungen) bilden sich gar keine
Kristalle oder sie entstehen erst nach Monaten oder Jahren. Aus diesem Grund muss auch
die kinetische Komponente der Kristallisation berücksichtigt werden, um in akzeptabler
Zeit geordnete Kristalle zu erhalten.
Wegen einer Fülle von beeinflussenden Parametern ist das Kristallwachstum von Proteinen
nicht planbar. Zu diesen Parametern gehören chemische Substanzen,
Proteinkonzentrationen und Temperaturen. Deshalb greift man zu Anfang auf initiale
Kristallisationstests zurück (2.1.12), um erste Kristallisationsbedingungen für ein Protein
zu finden. Bei diesen initialen Kristallisationsansätzen handelt es sich um eine Sammlung
von empirisch ermittelten Anfangsbedingungen, die relativ häufig zur Kristallisation
verschiedener Proteine geführt haben. Eine solche Bedingung besteht meistes aus einem so
genannten Präzipitans, welches die Löslichkeit des Proteins herabsetzt und verschiedenen
anderen Zusätzen. Man beginnt in der Regel mit einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml,
überprüft, ob das Protein sofort ausfällt und passt die Konzentration entsprechend an.
Die langsame Übersättigung der Proteinlösung erreicht man über die Methode der
Dampfdruckdiffusion. Dabei wird eine bestimmte Menge an gereinigtem Protein zu einer
Lösung mit genau definierten Bedingungen gegeben. Über eine Gasphase steht diese
Mischung in Kontakt mit einem Reservoir, in dem sich nur die Lösung ohne Protein
befindet. Der Dampfdruck des Wassers lässt es entlang des Konzentrationsgradienten in
das Reservoir diffundieren, der Kristallisationstropfen verkleinert sich und wird
konzentriert. Die Kristallisation wird in dieser Arbeit im so genannten sitzenden (engl.
sitting drop) Tropfen durchgeführt. Dabei werden Kristallisationsplatten (2.1.3) mit 24
Ansätzen verwendet, deren einzelne Kammern einen zentralen Stempel enthalten, der in
der Mitte eine Vertiefung für die Proteinlösung besitzt. Der Stempel ist umgeben von
einem Reservoir in das die Bedingung vorgelegt wird, in der das Protein kristallisieren soll.
Material und Methoden 42
Das Volumen der vorgelegten Bedingung beträgt in den hier durchgeführten
Kristallisationsversuchen immer 500 µl, die Temperatur wenn nicht anders angegeben 4°C.
Für die initialen Kristallisationstests wird 1 µl aus dem Reservoir in die Vertiefung des
Stempels gegeben und 1 µl der Proteinlösung zugesetzt. Die Kristallisationsplatte wird
nach dem Pipettieren von 12 Bedingungen immer sofort mit Klarsichtklebeband
verschlossen, um ein Austrocknen zu vermeiden und ein Mikroklima herzustellen.
In regelmäßigen Abständen wird der Topfen mit dem Binokular nach möglichen Kristallen
oder aussichtsreichen Bedingungen überprüft und Entwicklungen notiert. Mit einer
Digitalkamera auf einem Binokular werden Erfolg versprechende Bedingungen im
Computer dokumentiert.
2.2.4.2 Fein-screening und Additive
In den seltensten Fällen findet man gut streuende Kristalle in initialen
Kristallisationsbedingungen. Mit Erfolg versprechenden Bedingungen führt man deshalb
ein so genanntes Fein-screening durch, um die Kristallisationsbedingungen zu verbessern.
Dabei werden folgende Veränderungen an den Ursprungsbedingungen getestet:
- pH-Wert erhöhen / erniedrigen in kleinen Schritten
- Proteinkonzentration erhöhen / erniedrigen
- Proteinlösung / Reservoir-Tropfenverhältnis ändern
- Kation oder Anion der Salze variieren
- Temperatur verändern (20°C, 10°C, 4°C)
- Additive testen
- Mikro-Seeding
Hat man verbesserte Bedingungen gefunden, werden die Kristalle im
Röntgenbeugungsexperiment getestet. Reichen die Verbesserungen nicht aus, um die
Kristallordnung zu erhöhen, wird auch auf diese neue Bedingung ein Fein-screening
durchgeführt.
Material und Methoden 43
2.2.4.3 Quervernetzung mit Glutaraldehyd Um während der Röntegbeugungsexperimente am Kristall auftretende Strahlenschäden
möglichts gering zu halten, wird der Kristall vor der Datensammlung in flüssigem
Stickstoff eingefroren, und während des gesamten Experimentes in einem Stickstoffstrom
mit einer Temperatur von ca. 100 K gehalten. Dabei treten am Kristall Belastungen auf,
welche die Kristallordnung zerstören und damit negativen Einfluss auf die
Beugungseigenschaften des Kristalls haben können. Um des Kristall zu stabilisieren, kann
die Methode der Quervernetzung angewandt werden.
Die Kristalle wurden dazu für zwei Stunden in einer 2 % (w/v) Glutaraldehyd-Lösung bei
4 °C inkubiert. Das Glutaraldehyd diffundiert dabei in den Kristall und bildet
Querverbindungen zwischen Lysinresten der Aminosäurekette aus, die Den Kristall
stabilisieren.
2.2.5 Röntgenbeugungsexperimente Mittels Röntgenkristallographie ist es möglich, die molekulare Struktur großer
Makromoleküle wie Proteine aufzuklären. Notwendig dafür sind geeignete Kristalle des
entsprechenden Proteins. Der Kristall wird dann mit einem Röntgenstrahl definierter
Wellenlänge bestrahlt. Trifft dieser auf den Proteinkristall, so wird er gestreut und das
Streuungsmuster wird detektiert. Da das Streuverhalten von der Orientierung des Kristalls
abhängt, wird er während der Messung gedreht, um möglichst alle Streu-Reflexe zu
erfassen.
Vor der Datensammlung wird der Kristall in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann auf
einem Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse
montiert. In dieser Position wird der Kristall durch einen mit flüssigem Stickstoff
gekühlten Cryostrom auf einer Temperatur von 100 K gehalten. Die Datensammlung bei
tiefen Temperaturen verringert die Schädigung des Kristalls durch die Strahlung und
ermöglicht dadurch häufig die Aufnahme mehrerer Datensätze von einem einzigen
Kristall.
Röntenbeugungsexperimente von Prp28∆N-Kristallen wurden am ID 23-2 Strahl der
European Syncrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble) sowie durch Dr. Jana
Schmitzova an dem 14.1-Strahl des Berliner Elektronensynchrotrons (BESSY, Freie
Universität Berlin) durchgeführt.
Ergebnisse 44
3 Ergebnisse
3.1 Expression von Prp28∆N
Zu Beginn dieser Arbeit wurde von Dr. Jana Schmitzova (Universität Göttingen) das
Konstrukt pET-21a-Prp28∆N zur Verfügung gestellt. Dieses enthält den Vektor pET-21a
und die kodierende Sequenz für die Aminosäuren 131 - 588 von Prp28. Diese N-terminale
verkürzte Variante von Prp28 wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit als Prp28∆N
bezeichnet. Die DNA von Prp28∆N wurde über die Restriktionsschnittstellen NdeI und
XhoI in den entsprechend geschnittenen Vektor inseriert. Dieser enthält zusätzlich eine
kodierende Sequenz, welche eine Hexa-Histidin-Affinitätssequenz C-terminal an das zu
exprimierende Protein anfügt.
Vor der Expression wurde das Plasmid mittels Sequenzanalyse (2.2.1.2) auf Fehlerfreiheit
überprüft.
Das Plasmid wurde in chemisch kompetenten Zellen des E. coli Stammes Rosetta 2 (DE3)
transformiert, die Expression erfolgte wie in (2.2.2.4) beschrieben.
Die Zellernte erfolgte bei 4 °C und 5750 x g, anschließend wurden die Zellen
aufgeschlossen (2.2.2.6)
Aufschluss, Überstand und Pellet wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die vor der
Induktion aus der Kultur genommene Probe ging vor dem Auftrag auf das Gel verloren.
Die SDS-PAGE (Abb. 8) zeigt im Aufschluss eine deutliche Überexpression von Prp28∆N
mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 51 kDa. Nach der Zentrifugation waren
sowohl im Überstand wie auch im Pellet größere Mengen von Prp28∆N vorhanden, wobei
das Verhältnis etwa 1:1 beträgt. Da die Menge im Überstand ausreichend groß für die
weiteren Experimente war, wurde darauf verzichtet, die Löslichkeit des Proteins weiter zu
verbessern.
Ergebnisse 45
3.2 Reinigung von Prp28∆N
3.2.1 Affinitätschromatographische Reinigung über His-Trap-Säulen
Der Überstand nach der Zentrifugation wurde über eine HiTrapChelating Ni-NTA-
Sepharose-Säule gereinigt (2.2.3.5.1.1).
Abb. X: Chromatogramm von Beladung und Elution der HiTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule. Die Schulter im vorderen Bereich des Maximums bei 150 ml deutet auf eine Verunreinigung des eluierten Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm; rot: Leitfähigkeit; grün: Anteil Elutionspuffer; rot gekennzeichnet: eluiertes Protein)
Die Elution mit einem Gradienten von 0 – 100 % Elutionspuffer führte zu einem
Elutionsmaximum von etwa 350 mAu bei 160 ml mit einer leichten Schulter im vorderen
Bereich. Danach flacht die Kurve wieder ab, und es zeigt sich kein weiteres Maximum
mehr. Das Maximum in der Kurve der Leitfähigkeit wurde durch das Waschen der Säule
mit 2 M LiCl hervorgerufen.
Einzelne Fraktionen des Säulenlaufs wurden auf einem SDS-Gel analysiert. Dabei zeigte
sich, dass neben dem Protein mit Histidin-Affinitätssequenz weitere Proteine an die Säule
gebunden haben, welche im Elutionsmaximum von der Säule eluieren. Eines mit etwa 80
kDa und eines mit etwa 28 kDa. Hauptsächlich jedoch Protein mit ca. 50 kDa, was relativ
Ergebnisse 46
genau dem überexprimierten Prp28∆N mit einem theoretischen Molekulargewicht von
51,1 kDa entspricht.
Prp28∆N
Abb. 8: SDS-PAGE des Prp28∆N-Aufschlusses und der Histidin-Affinitätschromatographie. M = Marker; A = Aufschluss; Ü = Überstand; P = Pellet; F8 – F47 = Fraktionen der Histidin-Affinitätschromatographie. Im Aufschluss ist die Überexpression eines ca. 51 kDa großen Proteins zu erkennen (roter Pfeil). Sowohl im Überstand als auch im Pellet befinden sich größere Mengen dieses Proteins. Das exprimierte Protein Prp28∆N ist in den Fraktionen 30 bis 47 deutlich zu sehen (schwarzer Pfeil). Ebenso ist ein verunreinigendes Protein mit einer Größe von etwa 28 kDa zu sehen, welches wahrscheinlich die Schulter im Elutionsmaximum in Abb. X verursacht.
3.2.2 Größenausschlußchromatographische Reinigung über Gelfiltrationssäulen
Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Größenausschlusschromatographie mittels einer
Gelfiltrationssäule Superdex 75 26/60 (2.2.3.5.2) durchgeführt. Ziel war es, alle
Fremdproteine vom überexprimierten Fusionsprotein Prp28∆N zu trennen.
Dazu wurde die Probe auf die Säule appliziert und der Lauf mit einer Geschwindigkeit von
1 ml/min bei 4 °C durchgeführt.
Im Chromatogramm entspricht das erste Maximum bei etwa 100 ml dem
Ausschlussvolumen der Säule. Alle Proteine sowie Proteinkomplexe die größer als ca. 130
kDa sind, werden hier eluiert. Das zweite Maximum bei etwa 115 ml Elutionsvolumen
entspricht dem Fremdprotein, welches als deutliche Bande in Abb. 10 zu sehen ist. Das
dritte Maximum bei ca. 160 ml Elutionsvolumen stellt das überexprimierte Protein
Prp28∆N dar.
Ergebnisse 47
Abb. 9: Chromatogramm der Größenauschlusschromatographie über eine Superdex 75 26/60 Gelfiltrationssäule. Prp28∆N Maximum bei 170 ml. Die Asymmetrie des Maximums weist auf eine Verunreinigung des Proteins hin. (blau: UV-Absorption bei 280 nm)
Die einzelnen Fraktionen wurden per SDS-PAGE analysiert.
Abb. 10: SDS-PAGE der Größenausschlusschromatographie. M: Größenstandard; 13 -24: Fraktionen der Größenausschlusschromatographie aus Abb. 9
Ergebnisse 48
Auf dem SDS-Gel (Abb. 10) entspricht Spur 1 dem erstem Maximum, und somit dem
Ausschlussvolumen. Die hier laufenden Proteine sind meist mißgefaltet und lagern sich
über hydrophobe Bereiche zu Komplexen zusammen. Die Banden in Spur 1 sind nur sehr
schwach, was wahrscheinlich auf die geringe Proteinkonzentration zurückzuführen ist. Die
zweite Spur entspricht Fraktion 15 in Abb. 9. Hier ist eine deutliche Bande bei ca. 66 kDa
zu sehen, welche das zweite Maximum im Chromatogramm hervorruft. Die Spuren 3 – 6
repräsentieren die Fraktionen 20 – 21 und 23 – 24, welche dem dritten Maximum
entsprechen. Es sind sehr starke Banden bei etwa 50 kDa zu beobachten, welche dem
überexprimierten Protein Prp28∆N entsprechen. Die Proben wurden auf 5 mg/ml
konzentriert. Eine anschließende erneute Analyse mittels SDS-PAGE zeigte, dass die in
Abb. 10 in Spur 4 zu sehende Bande bei etwa 20 kDa durch den Prozess des
Ankonzentrierens (2.2.3.4) entfernt werden konnte. Die Probe besaß somit eine
ausreichende Reinheit um damit biochemische Charakterisierungen sowie
Kristallisationsversuche durchführen zu können.
Es ergab sich eine Ausbeute von ca. 8,5 mg reinem Protein pro Liter Expressionskultur.
3.3 Kristallisation von Prp28∆N
Ein zentraler Punkt dieser Diplomarbeit bestand in der Kristallisation von Prp28∆N. Für
die Kristallisationsversuche wurde das Protein in einer Konzentration von 4 mg/ml
eingesetzt. In das Reservoir wurden jeweils 500 µl der Bedingung vorgelegt, anschließend
1 µl der Bedingung in die zentral liegende Vertiefung (engl.: well) pipettiert und mit 1 µl
der Proteinlösung gemischt. Die Platten wurden unmittelbar danach verschlossen und bei 4
°C gelagert. Es wurden folgende Screens pipettiert:
Crystal Screen I
Crystal Screen II
Crystal Screen lite
Crystal Screen Cryo
JB 1 – 9
Magic Screen 1 – 3
Footprint Screen I
The Opti Salts
Ergebnisse 49
Crystal Screen PEG/Ion
Additive Screen 1 – 2
In etwa 50 % der Fälle präzipitierte das Protein nach einigen Tagen in der
Kristallisationsbedingung. Es konnten keine Anzeichen von Kristallisation oder
Kristallisationsvorstufen wie z.B. granulöse Strukturen oder Sphärolithe gefunden werden.
Um die DEAD-Box Domäne in der Lösung zu stabilisieren, wurde in den
Kristallisationstropfen 2mM Adenosin-5'-(β,γ,-imido)triphosphat (AMP-PNP) (Abb. 11)
hinzugegeben.
O
N
N
N
N
NH2
O
O
OH
OHP
O- P
O-
O
OO
-
O-
NH
O
P
Abb. 11: AMP-PNP
Dieses Molekül ist ein Analog von ATP, welches aufgrund der Imidogruppe jedoch nicht
von Prp28∆N hydrolysiert werden kann. Ziel war es das Protein durch die Interaktion mit
AMP-PNP zu stabilisieren. Es konnte jedoch kein positiver Einfluss von AMP-PNP auf die
Kristallisation von Prp28∆N festgestellt werden.
3.3.1 Entfernung der C-terminalen Hexa-Histidin-Sequenz
Da sämtliche Kristallisationsversuche nicht erfolgreich waren, wurde versucht, die für die
Reinigung des Proteins benötigte Hexa-Histidin-Sequenz am C-terminus des Proteins zu
entfernen, da diese sich evtl. störend auf die Kristallisation auswirken könnte. Da das
rekombinante Protein über keine Proteaseschnittstelle zwischen der Sequenz von Prp28∆N
und der Hexa-Histidin-Sequenz verfügte, konnte diese nicht durch Verdau mit einer
Ergebnisse 50
spezifisch schneidenden Protease entfernt werden. Stattdessen wurde ein Verdau mit
Carboxypeptidase B durchgeführt. Carboxypeptidasen sind Metalloproteine, die Proteine
vom Carboxyterminus aus angreifen (sog. Exopeptidasen). Carboxypeptidase B spaltet
dabei nach basischen Aminosäuren.
Zum Verdau wurde Carboxypeptidase B in einem molaren Verhältnis von 1:1000 mit
Prp28∆N für 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend in die vorgelegte
Kristallisationsbedingung pipettiert.
Das so verdaute Protein bildete in einer Bedingung des JB 5 Screen sehr viele jedoch sehr
kleine plattenförmige Kristalle.
Abb. 12: Prp28∆N-Kristalle in Bedingung 13 von JB 5 Zusammensetzung: 0,2 M NH4SO4; 22 % (w/v)
PEG 8000; 0,1 M MES pH 6,5
3.3.2 Fein-screening
Da die beobachteten Kristalle mit ca. 30 µm x 20 µm x 5 µm zu klein für
Röntgenbeugungsexperimente am zur Verfügung stehenden Röntgendiffraktometer waren,
wurde ein Fein-screening (2.2.4.2) durchgeführt, um die Größe und Qualität der Kristalle
zu verbessern.
Dabei wurde die NH4SO4-Konzentration in den Bedingungen in 0,02 M Schritten, der pH-
Wert in 0,1 Schritten und die PEG 8000 Konzentration in 0,5 % Schritten geändert.
Außerdem wurde je eines der folgenden Salze in Konzentrationen von 0,05 – 0,3 M in die
einzelnen Bedingungen gegeben:
Ergebnisse 51
NaCl
HCOO- / Na+
CH3COO- / Na+
NaSCN
Durch dieses Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich auf etwa
150 µm x 90 µm x 20 µm gesteigert werden (Abb. 13). Die Kristalle wiesen fast alle eine
dreieckige Form auf, wenige waren quaderförmig. Allen Kristallen gemein war das starke
Wachstum in zwei Dimensionen, während das Wachstum in die dritte Dimension deutlich
geringer war.
A B C
Abb. 13: Prp28∆N-Kristall in optimierten Bedingungen. Durch das Fein-screening konnte die Größe der Kristalle deutlich gesteigert werden. (A) Bedingung im Tropfen: 0,06 M NaSCN, 0,22 M NH4SO4, 20% (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,8; (B) 0,12 M CH3COO- / Na+, 0,24 M NH4SO4, 20,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,6; (C) In einer Bedingung mit 0,24 M NaSCN, 0,28 M NH4SO4, 21,5 % (w/v) PEG8000, 0,1 M MES pH 6,7 bildeten sich lange, stäbchenförmige Kristalle.
3.4 Röntgenbeugungsexperimente
Mit den Kristallen aus Abb. 13 (A) und (B) wurden sowohl am Röntgendiffraktometer der
Molekularen Strukturbiologie, Göttingen als auch durch Dr. Jana Schmitzova mit
Synchrotronstrahlung am BESSY, Berlin Röntgenbeugungsexperimente durchgeführt. In
beiden Fällen ergab sich eine Auflösung von lediglich 8 Å. Daraufhin wurde versucht,
durch Behandlung der Kristalle mit Glutaraldehyd (2.2.4.3) die Stabilität des Kristalls zu
erhöhen um höher auflösende Beugungsdaten zu erhalten. Diese Versuche erwiesen sich
jedoch als nicht erfolgreich, da sich die Auflösung nicht verbessern ließ.
Ergebnisse 52
Mit den langen, stäbchenförmigen Kristallen aus Abb. 13 wurden
Röntgenbeugungsexperimente mit Synchrotronstrahlung an der Microfocus Beamline
ID23-2 des ESRF Grenoble, Frankreich durchgeführt, da es hier möglich war, den
Röntgenstrahl auf einen geringeren Durchmesser als den Kristalldurchmesser zu
fokussieren. Dies ermöglicht eine hohe Strahlintensität im Kristall bei gleichzeitig
geringerem Hintergrund, als dies bei einem schwächer fokussierten Strahl der Fall ist,
dessen Durchmesser größer als der Durchmesser des zu messenden Kristalls ist.
Abb. 14: Beugungsbild eines Prp28∆N Kristalls aus Abb. 13 (C) Aufgenommen an der Beamline ID23-2 ESRF, Grenoble. Wellenlänge: 0,873 Å, Detektorentfernung 372.31 mm, Belichtungszeit: 1 sek., Auflösungsgrenze: ca. 7 Å
Die maximal erreichte Auflösung betrug auch in diesem Fall nur etwa 7 Å, was zur
Bestimmung der dreidimensionalen Kristallstruktur von Prp28∆N nicht ausreichend ist.
3.5 Biochemische Charakterisierung 3.5.1 ATPase Aktivität Die RNA-Helikase-Aktivität von DEAD-Box Proteinen setzt die Hydrolyse von ATP
voraus. Dementsprechend weisen viele dieser Proteine eine in vitro ATPase Aktivität auf.
In dieser Arbeit sollte ein Test zur quantitativen Bestimmung der ATPase-Aktivität von
Proteinen etabliert werden. Hierbei kam der kommerziell erhältliche EnzCheck Phosphate
Ergebnisse 53
Assay der Firma Invitrogen zum Einsatz, bei welchem in einer Phosphatabhängigen
Reaktion das Substrat MESG enzymatisch umgesetzt wird (2.2.3.7). Zur Kontrolle des
Assays wurde eine vom N-terminus um 464 Aminosäuren verkürzte Variante des
spleißosomalen DEAH-Box Proteins Prp22 aus Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, deren
KM-Wert für die ATPase Aktivität aus der Literatur bekannt ist (Tanaka und Schwer 2005).
Vor Beginn der Messungen wurde der molare Extinktionskoeffizient ε von 2-amino-6-
mercapto-7-Methylpurin bei 360 nm bestimmt. Dazu wurden in einer Messreihe
Reaktionsansätze bestehend aus MESG, Purin Nukleosid Phosphorylase und Puffer mit
Phosphat in Konzentrationen von 0 – 100 µM inkubiert und die Absorption bei 360 nm
gemessen.
y = 0,01x
00,20,40,60,8
11,21,41,6
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Phosphat [µM]
Extin
ktio
n 36
0nm
Abb. 15 Phosphatstandard zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten. Die gemessenen Punkte liegen auf einer Geraden mit der Steigung 0,01
Die gemessene Extinktion wurde gegen die Phosphatkonzentration aufgetragen. Aus der
Steigung der Geraden ergab sich ein molarer Extinktionskoeffizient ε von 0,01/µM*cm.
Zur Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax und der
Substratkonzentration, bei der Vmax/2 erreicht ist (KM-Wert) wurden Proben mit je 1µM
Prp22∆N angesetzt und 10 min in der Küvette im Photometer bei 25 °C inkubiert. Danach
wurde ATP in Konzentrationen von 0 – 500 µM zum Reaktionsansatz hinzugegeben und
die Absorption bei 360 nm über eine Zeitspanne von 5 min gemessen. Jede Probe wurde
dreimal unabhängig voneinander angesetzt und gemessen. Die Datenauswertung erfolgte
gemäß Lineweaver-Burk.
Ergebnisse 54
y = 0,389x + 0,011
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
1/ATP [µM]
1/v
[µm
ol/(l
*min
)]
Abb. 16: Lineweaver-Burk Diagramm der gemittelten ATPase Aktivität von Prp22∆N. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse aufgetragen. Es ergibt sich folgende Gleichung für die Gerade: y = 0,389 + 0,011 , was einem KM-Wert von 35,22 µM und einem Wert von 90,53 µmol/(l*min) für Vmax entspricht Wie erwartet liegen die einzelnen Messwerte mit nur geringer Abweichung auf einer
Geraden. Aus der Steigung dieser Geraden ergab sich für Prp22∆N ein KM-Wert von 35,22
± 7,36 µM µM sowie ein Wert von 90,53 ± 8,23 µmol/(l*min) für Vmax.
Weiterhin wurde der KM-Wert sowie Vmax durch Kurvenanpassung an die Michaelis-
Menten-Gleichung mit dem Programm SigmaPlot bestimmt.
ATP [µM]
0 100 200 300 400 500
v [µ
mol
/(l*m
in)]
0
20
40
60
80
100
120
Abb. 17: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Dabei ergibt sich ein KM-Wert von 30,51 ± 9,78 µM sowie ein Wert von 101,93 ± 16,27 µmol/(l*min) für Vmax
Ergebnisse 55
Hierbei ergab sich für den KM-Wert 30,51 ± 9,78 µM und für Vmax 101,93 ± 16,27
µmol/(l*min).
Die Messungen zur Bestimmung der ATPase Aktivität von Prp28∆N wurden auf die
gleiche Weise durchgeführt. Es konnte dabei nach Abzug der Referenzmessungen ohne
Prp28∆N jedoch keine signifikante Absorptionsänderung beobachtet werden. Der durch
Kurvenanpassung ermittelte KM-Wert liegt bei 1,24 ± 3,41 µM, Vmax hat einen Wert von
0,057 ± 0,012 µmol/(l*min). Daraus ergibt sich zusammen mit der Proteinkonzentration
von 1µM eine Wechselzahl von 0,00095 s-1, was einem Umsatz von 1 Molekül ATP pro
1000 Sekunden entspricht.
ATP [µM]
0 200 400 600 800 1000 1200
v [µ
mol
/(l*m
in)]
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Abb. 18: ATPase-Aktivität von Prp28∆N. Es ist die Reaktionsgeschwindigkeit v bei verschiedenen ATP Konzentrationen aufgetragen. Eine Signifikante ATPase-Aktivität kann nicht beobachtet werden.
3.5.1.1 Stimulation der ATPase Aktivität durch RNA
Da Helikasen wie Prp28 und Prp22 in vivo während des Spleißvorgangs an RNA binden
und diese entwinden, sollte die Auswirkung von an das Protein gebundener RNA auf die
ATPase-Aktivität untersucht werden. Für die Messungen wurde Poly-Adenin RNA mit
einer Kettenlänge von 20 Nukleotiden verwendet, da für diesen RNA-Typ bereits
Messwerte bezüglich der ATPase-Aktivität von Prp22 in der Literatur vorliegen, die zum
Ergebnisse 56
Vergleich herangezogen werden können. Die Messungen erfolgten wie in (2.2.3.7)
beschrieben. Zusätzlich wurde RNA in Konzentrationen von 0 – 10 µM zu den einzelnen
Messansätzen hinzugefügt.
ATP [µM]
0 100 200 300 400 500
v [µ
mol
/(l*m
in)]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 100 200 300 400 500
Abb. 19: ATPase-Aktivität von Prp22∆N in Anwesenheit von Poly-Adenin RNA. Aufgetragen ist die Reaktionsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen die ATP Konzentration auf der X-Achse. Für 0 und 10 µM RNA sind außerdem die Graphen aus der Kurvenanpassung aufgetragen (●: ohne RNA; ○: 1 µM RNA; ▼: 2 µM RNA; ∆: 4 µM RNA; ■: 10 µM RNA
Wie man in Abb. X sieht, ergibt sich bei steigender RNA-Konzentration ein deutlicher
Anstieg von Vmax. Die durch Kurvenanpassung mit SigmaPlot erhaltenen Werte lauten wie
folgt:
RNA-Konzentration KM [µM] Vmax [µmol/(l*min)]
0 µM (zum Vergleich) 30,51 ± 9,78 101,93 ± 7,85 1 µM 45,19 ± 4,55 114,82 ± 6,59 2 µM 58,72 ± 7,72 128,16 ± 9,97 4 µM 72,32 ± 7,12 153,73 ± 9,34 10 µM 81,28 ± 5,93 185,80 ± 8,48 Zusätzlich erfolgte die Auftragung der Messwerte nach Lineweaver-Burk. Durch die Art
der Auftragung werden hierbei die Messwerte bei niedrigen ATP-Konzentrationen stärker
gewichtet.
Ergebnisse 57
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
1/ATP [µM]
1/v
[µm
ol/(l
*min
)]
1 µM RNA 2 µM RNA 4 µM RNA 10 µM RNA ohne RNA
Abb. 20: Lineweaver-Burk-Diagramm der ATPase-Aktivität von Prp22∆N bei unterschiedlichen PolyA-RNA Konzentrationen. Es ist 1/Anfangsgeschwindigkeit v auf der Y-Achse gegen 1/ATP Konzentration in µM auf der X-Achse für RNA-Konzentrationen von 0µM (schwarz), 1 µM (rot), 2 µM (gelb), 4 µM (blau) und 10 µM (grün) aufgetragen. Aus den Steigungen der Geraden ergeben sich folgende KM-Werte: 0 µM RNA: 35,22 µM; 1 µM RNA: 34,89 µM; 2 µM RNA: 28,28 µM; 4 µM RNA: 52,18 µM; 10 µM RNA: 54,29 µM Die aus der Steigung der Geraden durch die Messpunkte erhaltenen Werte lauten wie folgt:
RNA-Konzentration KM [µM] Vmax [µmol/(l*min)]
0 µM (zum Vergleich) 35,22 ± 7,36 90,53 ± 8,23
1 µM 34,89 ± 6,78 94,36 ± 5,68 2 µM 28,28 ± 7,83 76,76 ± 8,43
4 µM 52,18 ± 5,24 117,25 ± 6,97 10 µM 54,29 ± 8,66 137,12 ± 9,74 Bei Prp28∆N zeigte sich in Anwesenheit von RNA auch bei Zugabe von hohen
Konzentrationen ATP (bis 5 mM) keine messbare ATPase-Aktivität.
Ergebnisse 58
3.5.2 Bindungsstudien mit ADP und ATP Eine Ursache für die fehlende in vitro ATPase Aktivität von Prp28∆N könnte sein, dass die
Konformation von isoliertem Prp28∆N derart verändert ist, dass keine ATP Bindung mehr
möglich ist. Um dies zu überprüfen, wurden Bindungsstudien durchgeführt, in deren
Verlauf die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion von Prp28∆N mit ATP und ADP
bestimmt wurde.
Es kam hierbei ein fluorimetrisches Verfahren zum Einsatz, bei dem die durch Bindung
eines Liganden hervorgerufene Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz gemessen wurde
(2.2.3.6.1). Bei diesen Liganden handelte es sich um mant-modifizierte Nukleotide. Die
mant-Gruppe ist ein Fluorophor, dessen Anregungswellenlänge sich mit der
Emissionswellenlänge von Tryptophan überschneidet. Bei Bindung eines mant-
modifizierten Nukleotid kommt es zu einem Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen
Tryptophan und der mant-Gruppe, was in der Abnahme der Tryptophan-Fluoreszenz
resultiert.
3.5.2.1 Bestimmung der Anregungs- und Emissionswellenlänge
Zur Ermittlung geeigneter Wellenlängen für Anregung sowie die Emissionsmessungen
wurden zunächst ein UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP und ein
Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N aufgenommen.
A B
Wellenlänge [nm]
250 300 350 400 450
Abs
orpt
ion
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Wellenlänge [nm]
300 320 340 360 380 400 420 440 460
Fluo
resz
enz
[cps
]
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
6e+6
Abb. 21: (A) UV-Absorptionsspektrum von mant-ADP. Die Kurve zeigt zwei Maxima bei 260 nm sowie bei 350 nm. (B) Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm. Das Fluoreszenzmaximum befindet sich bei 350 nm.
Ergebnisse 59
Da Prp28∆N neben 5 Tryptophanen auch 14 Tyrosine enthält, in diesem Experiment aber
selektiv nur die Fluoreszenz der Tryptophane gemessen werden sollte, sollte eine
Anregungswellenlänge ≥ 295 nm gewählt werden, da unterhalb dieser Wellenlänge auch
die Tyrosine angeregt werden. Gleichzeitig sollte die Anregungswellenlänge aber auch so
gewählt werden, dass möglichst wenig Strahlung von mant-ADP bzw. mant-ATP
absorbiert wird, um den inner filter effect (2.2.3.6.1.2) möglichst gering zu halten.
Im UV-Absorbtionsspektrum zeigte sich für mant-ADP ein Minimum bei 292 nm. Für
mant-ATP trifft das gleiche zu. Zur Anregung der Tryptophane wurde daher eine
Wellenlänge von 295 nm gewählt.
Zur Messung der Tryptophan-Fluoreszenz sollte eine Wellenlänge gewählt werden, bei der
die Fluoreszenz der Tryptophane stark ist, die Absorption durch den Liganden mant-ADP
bzw. mant-ATP aber wiederum gering. Das Fluoreszenzspektrum von Prp28∆N zeigt ein
Maximum bei einer Wellenlänge von 345 nm. Allerdings tritt bei dieser Wellenlänge auch
eine starke Absorption durch die mant-Gruppe auf, die im UV-Absorptionsspektrum ein
Maximum bei 350 nm zeigt. Zur Messung der Fluoreszenz wurde daher eine Wellenlänge
von 330 nm verwendet. Bei dieser Wellenlänge absorbiert die mant-Gruppe deutlich
weniger stark, während die Fluoreszenz der Tryptophane nur geringfügig schwächer ist.
3.5.2.2 Dissoziationskonstante von Prp28∆N mit mant-ADP und mant-ATP
Zur Bestimmung des KD-Wertes wurden Proben mit 1 µM Prp28∆N und variierenden
Konzentrationen von mant-ADP (0 – 100 µM) bzw. mant-ATP (0 – 200 µM) angesetzt.
Die Proben wurden für 45 min bei 25 °C im Fluorimeter inkubiert, damit sich ein
Bindungsgleichgewicht einstellen konnte. Danach wurde jede Probe bei 295 nm angeregt
und das Fluoreszenzsignal bei 330 nm gemessen. Aufgrund der teilweise hohen
Ligandenkonzentrationen in den einzelnen Proben konnte ein inner filter effect trotz
Optimierung der Wellenlängen (2.2.3.6.1.1) nicht immer vermieden werden. Aus diesem
Grund wurden die gemessenen Fluoreszenzsignale entsprechend korrigiert (2.2.3.6.1.2).
Die dazu nötigen molaren Extinktionskoeffizienten für mant-ADP und mant-ATP wurden
aus dem UV-Absorptionsspektrum abgelesen. Es ergaben sich folgende Werte:
ε295nm = 463 M-1 cm -1 und ε330nm = 3550 M-1 cm-1.
Die Auswertung erfolgte gemäß dem Eadie-Hofstee Plot nach folgender Formel:
Ergebnisse 60
][max LFKFF D
Δ−Δ=Δ
Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr
[L] = Konzentration von mant-ADP bzw. –ATP [KD] = Dissoziationskonstante
Wie zu erwarten war, liegen die Werte für mant-ADP relativ gut auf einer Geraden mit
einer Steigung von -14,56 cps/(cps/µM). Daraus ergibt sich für mant-ADP ein KD-Wert
von 14,6 µM. Die Werte für mant-ATP liegen hingegen weit gestreut vor, was ein Hinweis
auf einen sehr hohen KD-Wert ist.
mant-ADP
y = -14,563x - 992146
-920000-820000-720000-620000-520000-420000-320000-220000-120000-20000
-55000 -45000 -35000 -25000 -15000 -5000
∆F/[L] [cps/µM]
∆F [c
ps]
mant-ATP
-600000
-500000
-400000
-300000
-200000
-100000
0-200000 -150000 -100000 -50000 0
∆F/[L] [cps/µM]
∆F [c
ps]
Abb. 22: Eadie-Hofstee Plot. Aufgetragen ist die Änderung des Fluoreszenzsignals ∆F auf der Y-Achse gegen die Änderung des Fluoreszenzsignals geteilt durch die Konzentration des Liganden mant-ADP bzw. mant-ATP auf der X-Achse. Für mant-ADP beträgt die Steigung der Geraden durch die Messwerte -14,56, was einem KD-Wert von 14,56 µM entspricht. In die Auftragung der Messwerte von mant-ATP konnte keine Gerade eingepasst werden.
Zusätzlich zur Auftragung gemäß Eadie-Hofstee wurden die KD-Werte durch
Kurvenanpassung bestimmt. Dabei wurden die Messwerte mit dem Programm SigmaPlot
an folgende Formel angepasst:
Dkorr KL
LFFRS
+Δ
−=][
][)/( max
max
Fmax = maximales korrigiertes Fluoreszenzsignal (S / R)korr ∆Fmax = maximaler Betrag der Steigung von (S / R)korr
Ergebnisse 61
mant-ADP [µM]
0 20 40 60 80 100 120
Fluo
resz
enz
(S /
R)k
orr [
cps]
1,2e+6
1,4e+6
1,6e+6
1,8e+6
2,0e+6
2,2e+6
2,4e+6
2,6e+6
Abb. 23: Kurvenanpassung mit SigmaPlot. Es ist sind die korrigierten Fluoreszenzwerte auf der X-Achse gegen die mant-ADP Konzentration in µM auf der auf der Y-Achse aufgetragen. Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM
Für mant-ADP ergibt sich ein KD-Wert von 14,2 ± 1,7 µM, was relativ gut mit dem Wert
aus dem Eadie-Hofstee-Plot übereinstimmt. In die Auftragung der Messwerte für mant-
ATP konnte keine Kurve eingepasst werden.
Diskussion 62
4 Diskussion Ziel dieser Diplomarbeit war die Etablierung eines nicht-radioaktiven ATPase-Assays zur
Charakterisierung von ATP-hydrolysierenden Proteinen wie z.B. Helikasen. Des Weiteren
sollte die spleißosomale DEAD-Box Helikase Prp28 aus Saccharomyces cerevisiae
gereinigt und anschließend kristallisiert werden, was die Grundlage für eine spätere
röntgenkristallographische Strukturaufklärung darstellen sollte.
Das Protein Prp28 konnte in einer N-terminal verkürzten Form mit einer C-terminalen
Hexa-Histidin-Affinitätssequenz durch mehrere Aufreinigungsschritte in reiner Form
gewonnen werden (3.2). Kristallisationsversuche mit diesem Protein blieben zunächst
erfolglos, auch die Zugabe eines Interaktionspartners führte zu keiner Verbesserung (3.3).
Erst durch Behandlung des Proteins mit der Protease Carboxypeptidase B konnten erste
kleine Kristalle beobachtet werden (3.3.1). Durch Variation der
Kristallisationsbedingungen konnte die Größe der Kristalle soweit gesteigert werden, dass
sie zu Röntgenbeugungsexperimenten genutzt werden konnten. Hierbei wurde jedoch nur
eine sehr niedrige Auflösung erzielt, die im Verlauf dieser Arbeit nicht gesteigert werden
konnte (3.4).
Zur Messung der ATPase Aktivität wurde ein Assay etabliert. Als Positivkontrolle kam das
spleißosomale Protein Prp22 zum Einsatz, welches N-terminal verkürzt war, und von dem
eine in vitro Aktivität bereits in vorhergehenden Arbeiten gezeigt wurde.
Die ATPase-Aktivität von Prp22 konnte mit dem neu zu etablierenden Assay
reproduzierbar quantifiziert werden (3.5.1). Prp28 zeigte hingegen keine messbare
ATPase-Aktivität, welche auch nicht durch die Zugabe von RNA stimuliert werden konnte
(3.5.1.1) Daraufhin durchgeführte Bindungsstudien gaben Hinweise darauf, dass Prp28 in
vitro zwar ADP jedoch kein ATP bindet (3.5.2.2).
4.1 Expression und Reinigung von Prp28∆N
Prp28∆N wurde mit einer Hexa-Histidin-Sequenz in E. coli exprimiert und anschließend
über zwei Chromatographiesäulen gereinigt. Die Reinigung verlief erfolgreich, es wurden
insgesamt ca. 70 mg reines Protein erhalten, welches sowohl für die
Kristallisationsexperimente als auch für Aktivitätstests sowie Bindungsstudien verwendet
wurde. Die Ausbeute hätte noch gesteigert werden können, da ein größerer Teil des
Diskussion 63
Zielproteins nach dem Zellaufschluss unlöslich im Pellet verblieb. Eine Optimierung des
Aufschlusspuffers oder die Zugabe von 2 % Ethanol zur Expressionskultur zur Stimulation
der Synthese von Faltungshelfern (Chaperonen) hätte zu einer höheren Löslichkeit und
damit zu einer höheren Ausbeute führen können. Da die Menge an löslichem Protein mit
70 mg für die durchzuführenden Experimente jedoch ausreichend hoch war, wurden diese
Optimierungsansätze nicht weiter verfolgt.
4.2 Kristallisation von Prp28∆N
Zur Kristallisation wurde das Protein in einer Konzentration von 4,5 mg/ml eingesetzt. Die
Kristallisation verlief zunächst nicht erfolgreich, es konnten in keiner der verwendeten
Bedingungen Kristalle oder Kristallvorstufen wie z.B. Sphärolithe gefunden werden. Auch
der Zusatz des Interaktionspartners AMP-PNP in den Kristallisationstropfen führte zu
keiner Verbesserung. Allerdings präzipitierte das Protein in ca. der Hälfte der Bedingungen
des Screens Footprint I, was auf eine zur Kristallisation geeignete Proteinkonzentration
hinwies.
Ein möglicher Grund für die bisher nicht erfolgreiche Kristallisation von Prp28 könnte die
zur Reinigung des Proteins benötigte Hexa-Histidin-Affinitätssequenz am C-terminus des
Proteins sein. Da diese frei beweglich und somit ungeordnet ist, könnte sie die zur
Kristallbildung nötige periodische Zusammenlagerung stören.
Um dies zu verhindern und damit die Kristallisation von Prp28 zu ermöglichen, wurde
versucht, die Hexa-Histidin-Affinitätssequenz mittels der Protease Carboxypeptidase B zu
entfernen (3.3.1).
Erneute Kristallisationsversuche ergaben kleine Kristalle in einer Bedingung welche
NH4SO4, PEG 8000 sowie MES mit einem pH-Wert von 6,5 enthielt. Im anschließenden
Fein-Screening zeigte sich, dass die Bildung von Kristallen durch einen pH-Werte unter
6,7 sowie durch den Zusatz von Natrium-Salzen positiv beeinflusst wird.
Durch das Fein-Screening konnten die Kristalle bis auf eine Größe von ca.
150 µm x 90 µm x 20 µm gebracht werden. Diese wurden für die nachfolgenden
Röntgenbeugungsexperimente verwendet.
Diskussion 64
4.3 Röntgenbeugungsexperimente
In den durchgeführten Röntgenbeugungsexperimenten streuten alle getesteten
Kristallformen nur bis zu einer Auflösung von maximal 7Å. Ein möglicher Grund für diese
niedrige Auflösung kann in der C-terminalen Helikasesubdomäne begründet liegen. Bei
der Strukturaufklärung des DEAD-Box Proteins eIF4A zeigte sich eine hohe Flexibilität in
der RNA-bindenden Helikasesubdomäne (Caruthers et al. 2000) ebenso wie bei der
Lösung der Struktur eines DEAD-Box Proteins aus Methanococcus jannashii (Story et al.
2001). Durch diese Flexibilität können sich Fehler in der Packung des Kristalls ergeben,
welche dann zu schlecht streuenden Kristallen führen. Zur Verbesserung der Streuung zu
höheren Auflösungen wurden verschiedene Versuche unternommen. Die Kristallisation
mit gebundenem AMP-PNP sollte die Helikase-Subdomänen in einer definierten Position
stabilisieren, und damit die Ordnung im Kristall verbessern. Diese Maßnahme zeigte
jedoch keine Wirkung auf die im Röntgenbeugungsexperiment erzielte Auflösung. Die
später durchgeführten Messungen zur Bindung von ATP an Prp28∆N (3.5.2.2) zeigten
jedoch, dass Prp28∆N nicht oder nur sehr schwach an ATP bindet. Da AMP-PNP ein ATP-
Analogon ist, liegt die Vermutung nahe, dass auch dieses von Prp28∆N nicht gebunden
wurde, und die Orientierung der Helikase-Subdomänen zueinander nicht in einer
definierten Konformation stabilisiert wurde. Eine weitere Möglichkeit die Flexibilität der
Domänen einzuschränken, welche in Rahmen dieser Arbeit nicht mehr zum Einsatz kam,
wäre das Protein mit RNA als einem Interaktionspartner der Helikasedomäne zu
kristallisieren. Auch hierdurch kann das Protein in einer definierten Konformation
stabilisiert werden, was zu einer verbesserten Ordnung im Kristall führt. Somit erhöht sich
die Periodizität im Kristall, und es stehen mehr Atome für konstruktive Interferenz zur
Verfügung, was im Röntgenbeugungsexperiment zu höheren Auflösungen führen könnte.
4.4 ATPase Assay
4.4.1 Kontrolle des Assays mit Prp22∆N
Neben der Kristallisation sollte Prp28∆N in Bezug auf seine ATPase-Aktivität
biochemisch charakterisiert werden, und zu diesem Zwecke ein ATPase Aktivitätstest
etabliert werden.
Diskussion 65
Die zur Validierung der Ergebnisse durchgeführte Positivkontrolle wurde mit der N-
terminal verkürzten Helikase Prp22 durchgeführt, von der eine in vitro Aktivität bereits aus
vorhergehenden Arbeiten bekannt ist.
Die Auswertung der Messungen durch Kurvenanpassung mit SigmaPlot ergab für Prp22
ohne RNA einen KM-Wert von 30,51 µM mit einer mittleren Abweichung von ± 9,78 µM.
Die Auftragung nach Lineweaver-Burk ergab einen KM-Wert von 35,22 µM, die mittlere
Abweichung betrug hier ± 7,36 µM. Die Abweichung der Werte voneinander ergibt sich
aus den unterschiedlichen Methoden der Auftragung. Bei der reziproken Auftragung nach
Lineweaver-Burk werden die bei niedrigen ATP-Konzentrationen gemessenen Werte
durch die Art der Auftragung gegenüber den bei hohen ATP-Konzentrationen gemessenen
Werten stärker gewichtet als bei der Kurvenanpassung durch SigmaPlot.
Die veröffentlichten KM-Werte für Prp22 weichen mit 700 µM erheblich davon ab (Tanaka
und Schwer 2005). Allerdings wurde in der genannten Veröffentlichung Prp22 in voller
Länge eingesetzt, während in dieser Arbeit aus Gründen der Verfügbarkeit eine N-terminal
verkürzte Variante zum Einsatz kam (Abb. 24). Der entfernte N-terminale Bereich
beinhaltet beim wildtyp Prp22 ein sog. S1 Motiv, welches wahrscheinlich an der RNA-
Bindung beteiligt ist (Schneider et al. 2001). Kinetische Untersuchungen mit Prp22-
Mutanten ohne S1-Motiv haben allerdings gezeigt, dass das Fehlen des S1-Motivs keine
Auswirkungen auf die Aktivität des Enzyms hat (Schneider et al. 2001).
S1 HelicC DEAH HA2 DUF
Prp22
Prp22∆N
Abb. 24: Domänenstruktur von Prp22. blau: S1; orange: DEAH; rot: HelicC; grau: HA2; grün: Domäne unbekannter Funktion (Domain of unknown function: DUF)
Vergleichbares ergaben auch die durchgeführten Aktivitätstests mit RNA. Es zeigte sich
ein deutlicher Einfluss von RNA auf die ATPase-Aktivität. Der Wert von Vmax konnte
durch Zugabe von RNA von 101,93 µmol/(min*l) auf bis zu 185,8 µmol/(min*l) bei einer
RNA Konzentration von 10 µM gesteigert werden, was einer Steigerung der Aktivität von
82 % entspricht. Daraus kann geschlossen werden, dass das S1-Motiv für die Bindung von
RNA nicht zwingen notwendig ist, oder Prp22∆N ein weiteres Motiv zur Bindung von
Diskussion 66
RNA besitzt. Warum die Zugabe von RNA bei gleichzeitig steigender Vmax zu einem
steigenden KM-Wert führte, konnte nicht abschließend geklärt werden. Möglicherweise
stabilisiert die RNA die Helikasedomäne in einer Weise, die zu einer schlechteren
Zugänglichkeit der ATP-Bindungstasche führt, und somit die Affinität von Prp22∆N zu
ATP herabsetzt. Auch wäre es möglich, dass die negativ geladene RNA die Interaktion von
ATP, welches ebenfalls negative Ladungen trägt, mit der ATP-Bindetasche direkt
behindert.
4.4.2 ATPase-Aktivität von Prp28
Bei den durchgeführten Messungen konnte für Prp28 keine signifikante in vitro ATPase-
Aktivität ermittelt werden. Der ermittelte KM-Wert liegt bei 1,24 ± 3,41 µM. Die
Abweichung vom Mittelwert ist in diesem Fall größer als der ermittelte KM-Wert, was auf
die extrem niedrigen und zusätzlich stark schwankenden Werte aus den einzelnen
Absorptionsmessungen zurückzuführen ist. Ein niedriger KM-Wert weist im Allgemeinen
auf eine hohe Affinität zwischen Substrat und Enzym hin. Die in diesem Fall ermittelte
Aktivität Vmax fällt mit 0,057 ± 0,012 µmol/(l*min) und einer Wechselzahl von 0,00095 s-1
jedoch so gering aus, dass man kaum von einer eindeutigen physiologisch signifikanten
ATPase-Aktivität sprechen kann.
Die fehlende in vitro ATPase-Aktivität ist insofern ungewöhnlich, als dass Prp28∆N alle
konservierten Sequenzmotive einer DEAD-Box Helikase enthält, was darauf hinweist, dass
es in vivo eine ATPase-Aktivität besitzt.
Häufig lässt sich die Aktivität von DEAD-Box Helikasen durch RNA erhöhen, dieses war
auch in dieser Arbeit bei der DEAH-Box Helikase Prp22∆N der Fall (3.5.1.1). Bei
Prp28∆N ergab sich durch den Zusatz von RNA keine Änderung in der Aktivität. Hier sind
offenbar noch weitere Komponenten zur Aktivierung nötig, welche in vivo wahrscheinlich
vorhanden sind. In vorhergehenden Arbeiten wurde gezeigt, dass das humane Ortholog
hPrp28 in vitro ebenfalls keine ATPase-Aktivität zeigt. Ebenso wurde bei hPrp28, welches
aus HeLa-Zellen isoliert wurde, eine in vitro nicht vorhandene Helikaseaktivität beobachtet
(Laggerbauer et al. 1998), welche ebenso auf das fehlen der ATPase-Aktivität
zurückzuführen sein könnte. Auch die DEAD-Box Helikase RhlB aus E. coli zeigte nur in
Verbindung mit RNase E als Interaktionspartner in vitro ATPase- und Helikaseaktivität.
(Carpousis et al. 2008)
Diskussion 67
Um die Ursache für die nicht vorhandene ATPase-Aktivität besser erklären zu können,
wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit die Bindung von ATP und ADP an Prp28∆N
untersucht.
4.4.3 Bindungsstudien mit ATP und ADP
Damit ein Protein ATP hydrolysieren und damit eine ATPase-Aktivität aufweisen kann, ist
es zunächst einmal nötig, dass das betreffende Protein ATP bindet. Bei den mittels
Fluoreszenztitration durchgeführten Untersuchungen konnte jedoch keine Interaktion
zwischen ATP und Prp28∆N nachgewiesen werden (3.5.2.2). Allerdings kann mit der
verwendeten Messmethode eine Dissoziationskonstante nur bis etwa 100 µM relativ genau
bestimmt werden. Bei höheren Liganden-Konzentrationen wird der inner filter effect trotz
Anpassung der Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Berechnung von
Korrekturfaktoren zu groß, womit die Auswertung sehr fehleranfällig wird.
Für ADP war mit den durchgeführten Fluoreszenztitrationsmessungen eine Interaktion mit
Prp28∆N nachweisbar. Der durch Kurvenanpassung ermittelte KD-Wert liegt bei 14,2 µM
mit einer Abweichung vom Mittelwert von 1,7 µM. Der Wert aus dem Eadie-Hofstee-Plot
stimmt damit sehr gut überein (3.5.2).
Die veröffentlichten Dissoziationskonstanten für die Interaktion von DEAD-Box Helikasen
mit ATP liegen im Allgemeinen zwischen 50 µM und 1000 µM (Cordin et al. 2006).
Daher wäre es evtl. möglich, mit anderen Methoden wie z.B. der Isothermen Titrations-
Kalorimetrie (engl. ITC) auch für Prp28∆N eine Interaktion mit Prp28∆N nachzuweisen.
Zusammenfassung 68
5 Zusammenfassung
Die DNA eukaryotischer Organismen sowie die einiger Archäen enthält sowohl
kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche, Introns und Exons. Nach der Transkription
müssen die Introns aus der prä-mRNA entfernt werden. Dieser Vorgang, das sog. Spleißen,
wird von einem großen Protein-RNA-Komplex, dem Spleißosom katalysiert. Das
Spleißosom besteht aus 5 Untereinheiten, den sog. snRNPs (small nuclear
ribonucleoprotein particles). Der Aufbau des Spleißosoms erfolgt sukzessiv an der prä-
mRNA, wobei die snRNPs untereinander und mit der mRNA interagieren. Die Bildung des
aktiven Spleißosoms erfordert einige Umlagerungen der snRNPs, wobei RNA-RNA-
Interaktionen aufgebrochen werden müssen. Eine entscheidende Rolle bei diesen
Umlagerungen spielen DExD/H-Box-RNA-Helikasen, welche unter ATP-Verbrauch
RNA-Duplexe entwinden. Eine dieser Helikasen ist Prp28, welche für die Entfernung des
U1-snRNP von der 5´-Spleißstelle verantwortlich ist.
In dieser Arbeit wurde ein C-terminales Fragment von Prp28 rekombinant in Escherichia
coli exprimiert und anschließend gereinigt. Daraufhin wurde versucht, das Protein zu
kristallisieren. Die Kristallisationsversuche waren erfolgreich, allerdings war die mit den
Kristallen im Röntgenbeugungsexperiment erhaltene Auflösung zu gering zur Bestimmung
der dreidimensionalen Kristallstruktur.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die biochemische Charakterisierung der
ATPase-Aktivität von Prp28. Dazu wurde zunächst ein Test zur Messung dieser Aktivität
etabliert, der mit dem spleißosomalen DEAH-Box-Protein Prp22 reproduzierbare
Ergebnisse lieferte. Für Prp28 konnte jedoch keine in vitro ATPase Aktivität gezeigt
werden. Daraufhin wurde in Bindungsstudien die Interaktion von Prp28 mit ATP
untersucht, wobei keine signifikante Interaktion festgestellt werden konnte.
Abkürzungsverzeichnis 69
6 Abkürzungsverzeichnis
α alpha
Å Angström [1 Å = 0.1 nm]
Abb. Abbildung
AS Aminosäuren
ADP Adenosindiphosphat
ATP Adenosintriphosphat
Β beta
bp Basenpaare
c Konzentration [M]
° C Grad Celsius
cm Zentimeter
d.h. das heißt
Da Dalton [g/mol]
ddH2O bidestilliertes Wasser
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
ddNTP Didesoxynukleotidtriphosphat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dsDNA doppelsträngige DNA
E. coli Escherichia coli
et al. et altera
EtOH Ethanol
γ gamma
IPTG Isopropyl-β-D-isothiogalactosid
k kilo (als präfix)
λ Wellenlänge [nm]
l Liter
LB Luria Bertani
μ mikro (als Präfix)
m milli (als präfix)
M Molarität
Abkürzungsverzeichnis 70
mAU Milliabsorptionseinheiten
mRNA Messenger RNA
MW Molekulargewicht [g/mol]
n nano (als Präfix)
OD Optische Dichte
PAGE Polyacryamidgel-elektrophorese
PCR Polymerasekettenreaktion
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
prä-mRNA mRNA-Vorläufer
RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Sm Steven Miller
snRNA small nuclear RNA
snRNP small nuclear Ribonucleoprotei particels
Tab. Tabelle
TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin
Tm Schmelztemperatur
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
Upm Umdrehungen pro Minute
U snRNP Uridinrich small nuclear ribonucleoprotein
UV Ultraviolett
V Volumen
vgl. vergleiche
v/v Volumenprozent (volume per volume)
w/v Gewichtsprozent (weight per volume)
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2)
z.B. zum Beispiel
ε Molarer Extinktionskoeffizient [M-1 cm-1]
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Danksagung 77
8 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner möchte ich für die Möglichkeit, meine Diplomarbeit in der
Molekularen Strukturbiologie anzufertigen sowie für die interessante Aufgabenstallung
danken.
Herrn Prof. Dr. Kai Tittmann danke ich für die Übernahme des Korreferates.
Bei Dr. Jana Schmitzove bedanke ich mich sehr herzlich für die Bereitstellung der
klonierten Vektoren mit Prp28∆N bedanken.
Thomas Moneke und Stephanie Schell danke ich für die vielen nützlichen Anregungen,
Diskussionen und Hilfestellungen sowie für die kritische Durchsicht der Arbeit. Weiterhin
möchte ich Eike Schulz für die großartige Arbeitsatmosphäre danken.
Meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben, bin ich für die ständige
Unterstützung sehr dankbar.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Sarah Seifert, für die seelische
Unterstützung in weniger erfolgreichen Momenten sowie die unzähligen schönen Tage.