1

ANTIMIKROBIÁLNA REZISTENCIA MIKROORGANIZMOV

VYIZOLOVANÝCH Z MLIEKA A MASLA A ICH IDENTIFIKÁCIA

ZA POMOCI MALDI-TOF MS BIOTYPERVedecká monografia

KEY Publishing s.r.o.Ostrava

2018

Miroslava Kačániová, Simona Kunová, Ľudmila Nagyová, Elena Horská, Peter Haščík

© Miroslava Kačániová, Simona Kunová, Ľudmila Nagyová, Elena Horská, Peter Haščík 2018

ISBN 978-80-7418-299-0

DOI: https://doi.org/10.15414/2018.9788074182990

Názov: Antimikrobiálna rezistencia mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a masla a ich identifikácia za pomoci MALDI-TOF MS BiotyperAutori: prof. Ing. Miroslava Kačániová, PhD.

Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra mikrobiológiedoc. Ing. Simona Kunová, PhD.Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra hygieny a bezpečnosti potravínprof. Ing. Ľudmila Nagyová, PhD.Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta ekonomiky a manažmentu, Katedra marketingu a obchoduprof. Ing. Dr. Elena HorskáSlovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta ekonomiky a manažmentu, Katedra marketingu a obchodudoc. Ing. Peter Haščík, PhD. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov

Recenzenti: doc. RNDr. Leona Buňková, PhD.Univerzita Tomáša Baťu v Zlíne, Technologická fakulta, Ústav inžinierstva ochrany životného prostrediaprof. Ing. Stanislav Kráčmar, CSc.Vysoká škola obchodní a hotelová v Brne, Katedra gastronómie

KATALOGIZACE V KNIZE - NÁRODNÍ KNIHOVNA ČR

Kačániová, Miroslava Antimikrobiálna rezistencia mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a másla a ich identiikácia za pomoci MALDI-TOF MS biotyper : vedecká monografia / Miroslava Kačániová, Simona Kunová, Ľudmila Nagyová, Elena Horská, Peter Haščík. -- Ostrava : Key Publishing s.r.o., 2018. -- 105 stran Anglické resumé ISBN 978-80-7418-299-0 (brožováno)

579.842.1/.2 * 579.864 * 615.33.015.8 * 615.28.015.8 * (048.8:082) - enterobakterie- laktobacily- rezistence vůči antibiotikům- rezistence vůči antimikrobiálním látkám- kolektivní monografie

579 - Mikrobiologie [2]

Poďakovanie

Vedecká monografia bola realizovaná a. financovaná za podpory projektu APVV-16-0244 Kvalitatívne faktory vplývajúce na výrobu a spotrebu mlieka a syrov.

Autori

Obsah Zoznam tabuliek ............................................................................................................. 6

Zoznam obrázkov ........................................................................................................... 7

Zoznam skratiek a značiek ............................................................................................. 8

Úvod ................................................................................................................................. 9

1 Prehľad súčasného stavu riešenej problematiky .................................................... 11

1.1 Z histórie mlieka a masla ........................................................................................ 11

1.2 Definícia mlieka ...................................................................................................... 11

1.2.1 Faktory ovplyvňujúce zloženie mlieka ........................................................... 12

1.2.2 Chemické zloženie mlieka .............................................................................. 13

1.3 Komplexná mikrobiológia mlieka .......................................................................... 16

1.3.1 Psychrotrofné baktérie .................................................................................... 18

1.3.2 Enterobaktérie ................................................................................................. 20

1. 4 Enterokoky ............................................................................................................. 23

1.5 Pozitívny význam baktérií mliečneho kvasenia ...................................................... 25

1.6 Definícia masla ....................................................................................................... 26

1.6.1 Patogénna mikroflóra masla ............................................................................ 27

1.7 Antibiotiká .............................................................................................................. 28

1.7.1 Z histórie vývoja antibiotík ............................................................................. 28

1.7.2 Definícia antibiotík .......................................................................................... 28

1.8 Mechanizmy pôsobenia antibiotík .......................................................................... 30

1.8.1 Antibiotiká inhibujúce syntézu bakteriálnej bunky ......................................... 32

1.8.2 Antibiotiká inhibujúce bunkovú proteosyntézu .............................................. 33

1.8.3 Antibiotiká ovplyvňujúce priepustnosť membrány ......................................... 34

1.8.4 Antibiotiká inhibujúce syntézu nukleových kyselín ....................................... 35

1.8.5 Antibiotiká blokujúce dôležité metabolické procesy ...................................... 35

1.9 Antibiotická rezistencia .......................................................................................... 35

1.9.1 Modifikácia cieľového miesta ......................................................................... 36

1.9.2 Inaktivácia účinkom enzýmov ........................................................................ 38

1.9.3 Redukcia priepustnosti membrány .................................................................. 39

1.9.4 Aktívny eflux z bunky ..................................................................................... 40

1.10 Klasifikácia antibiotík ........................................................................................... 41

1.10.1 β-laktámové antibiotiká ................................................................................. 41

1.10.2 Aminoglykozidy ............................................................................................ 43

1.10.3 Fluorochinolóny ............................................................................................ 43

1.10.4 Makrolidy ...................................................................................................... 44

1.10.5 Linkozamidy .................................................................................................. 46

1.10.6 Amfenikoly .................................................................................................... 46

1.10.7 Tetracyklíny ................................................................................................... 47

1.10.8 Glykopeptidové a polypeptidové antibiotiká ................................................ 47

1.10.9 Sulfonamidy .................................................................................................. 49

1.10.10 Nové skupiny antibiotík .............................................................................. 49

1.11 Metódy na identifikáciu baktérií v mlieku a mliečnych výrobkoch ..................... 50

1.11.1 Identifikácia mikroorganizmov metódou MALDI-TOF MS biotyper .......... 50

2 Cieľ práce ................................................................................................................... 53

3 Materiál a metodika ................................................................................................... 54

3.1 Odber vzoriek mlieka a masla ................................................................................. 54

3.1.1. Celkový prehľad odoberaných vzoriek mlieka a masla ................................. 54

3.2 Izolácia mikroorganizmov ...................................................................................... 55

3.2.1 Kultivácia mikroorganizmov ........................................................................... 56

3.2.2 Selektívne agary .............................................................................................. 57

3.2.3 MRS agar ......................................................................................................... 57

3.2.4 VČŽL agar ....................................................................................................... 58

3.2.5 Rekultivácia a čistenie kultúr .......................................................................... 58

3.3 Identifikácia mikroorganizmov ............................................................................... 59

3.3.1 Príprava MALDI matrice ................................................................................ 59

3.3.2 Príprava vzorky ............................................................................................... 59

3.4 Testovanie citlivosti na antibiotiká ......................................................................... 60

3.4.1 Aplikované MIC stripy u Lactobacillaceae ..................................................... 61

3.4.2 Aplikované antibiotické disky u Enterobacteriaceae ...................................... 62

3.5 Štatistické vyhodnotenie výsledkov ........................................................................ 66

4 Výsledky a diskusia .................................................................................................... 67

4.1 Stanovenie počtu mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a masla ................... 67

4.2 Identifikácia mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a masla ........................... 69

4.3 Antibiotická rezistencia čeľade Enterobacteriaceae ............................................... 73

4.3.1 Zistenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB ................................ 74

4.3.2 Zosumarizovanie výsledkov pre konkrétne triedy ATB ................................. 75

4.3.3 Základná štatistika výsledkov učeľade Enterobacteriaceae ........................... 76

4.4.1 Stanovenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB ........................... 78

4.5 Antibiotická rezistencia bakteriálnych druhov iných čeľadí vyizolovaných z

mlieka a masla .......................................................................................................... 80

4.5.1 Vyhodnotenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB ...................... 81

4.5.2 Zosumarizovanie výsledkov pre konkrétne triedy ATB ................................. 82

4.5.3 Základná štatistika výsledkov u iných čeľadí ................................................. 83

Záver .............................................................................................................................. 85

Zoznam tabuliek

Tab. 1 Chemické zloženie mlieka rôznych cicavcov v g.100 g-1 mliek 14

Tab. 2 Priemerný obsah minerálnych látok v mlieku 15

Tab. 3 Celkový prehľad odoberaných vzoriek mlieka a masla 54 Tab. 4 Celkový prehľad odoberaných vzoriek mlieka a masla 55 Tab. 5 Celkový prehľad odoberaných vzoriek mlieka a masla 55 Tab. 6 MIC stripy použité pre jednotlivé druhy baktérií 61 Tab. 7 MIC stripy použité pre jednotlivé druhy baktérií 62 Tab. 8 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií 62 Tab. 9 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií 62 Tab. 10 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií 63 Tab. 11 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií 64 Tab. 12 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií 64 Tab. 13 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií 65 Tab. 14 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Enterobacteriaceae 65 Tab. 15 Zóny pre zistenie antibiotickej rezistencie u Enterococcus spp. 65 Tab. 16 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Pseudomonas spp. 65 Tab. 17 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Staphylococcus spp. 66 Tab. 18 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Acinetobacter spp. 66 Tab. 19 Počet vyrastených baktérií v masle v log KTJ.g-1 a v mlieku v log KTJ.ml-1 67 Tab. 20 Počet vyrastených baktérií v masle v log KTJ.g-1 a v mlieku v log KTJ.ml-1

.68 Tab. 21 Počet vyrastených baktérií v masle v log KTJ.g-1 a v mlieku v log KTJ.ml-1 68 Tab. 22 Vyizolované druhy baktérií (%) 70 Tab. 23 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla 70 Tab. 24 Vyizolované druhy baktérií (%) 71 Tab. 25 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla 72 Tab. 26 Vyizolované druhy baktérií (%) 72 Tab. 27 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla 73 Tab. 28 Antibiotická rezistencia ku príslušnej antibiotickej triede u bakteriálnych zástupcov čeľade Enterobacteriaceae 76 Tab. 29 Štatistické zhodnotenie antibiotickej rezistencie čeľade Enterobacteriaceae 77 Tab. 30 Vyjadrenie antibiotickej rezistencie a citlivosti čeľade Lactobacillaceae v µl.ml-1 u konkrétnych druhov 78 Tab. 31 Antibiotická rezistencia ku príslušnej antibiotickej triede u bakteriálnych

zástupcov iných čeľadí 83

Tab. 32 Štatistické zhodnotenie antibiotickej rezistencie bakteriálnych druhov

z iných čeľadí 83

Zoznam obrázkov

Obr. 1 Rod Lactobacillus na MRS agare 57 Obr. 2 Čeľad Enterobacteriaceae na VČŽL agare 58 Obr. 3 Preočkovanie kultúr 59 Obr. 4 Antibiotická rezistencia čeľade Enterobacteriaceae vyjadrená v percentách 74 Obr. 5 Grafické zobrazenie priemerov inhibičných zón čeľade Enterobacteriacea 75 Obr. 6 Zóna inhibície pri C. braakii 75 Obr. 7 Antibiotická rezistencia čeľade Lactobacillaceae vyjadrená v percentách 78 Obr. 8 Zóny inhibície MIC pri testovaní Lactobacillus paracasei 79 Obr. 9 Antibiotická rezistencia iných čeľadí vyjadrená v percentách 81 Obr. 10 Grafické zobrazenie priemerov inhibičných zón iných čeľadí 82

Obr. 11 Inhibičná zóna u E. faecalis 82

Obr. 12 Inhibičná zóna u P. putida 82

Zoznam skratiek a značiek

Aa aminokyselina

°C stupeň Celzia

CO2 oxid uhličitý

DNA deoxyribonukleová kyselina

G + grampozitívne

G - gramnegatívne

MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight mass spectrometrym

MRS agarová živná pôda pre kultiváciu laktobacilov NADPH nikotínadeníndinukleotidfosfát RNA ribonukleová kyselina rRNA ribozomálna ribonukleová kyselina

tRNA transferová ribonukleová kyselina VČŽL agarová živná pôda s kryštálovou violeťou, neutrálnou

červeňou, žlčovými soľami a laktózou HCCA kyselina škoricová

Úvod

Antibiotická rezistencia je obrovským globálnym problémom, pretože neustále

narastá počet baktérií s odolnosťou na aplikované antibiotiká. Dnes, v dobe rýchleho

vývoja antibiotickej rezistencie je veľmi náročné bojovať proti nej. Za jednu

z najvýznamnejších alternatív v boji proti rezistencii je možné považovať len uvážlivé

a účelné predpisovanie antibiotík v prípadoch, kedy je to naozaj dôležité a potrebné. Aby

sa však ich predpisovanie stalo skutočne opodstatneným, je potrebné poznať mechanizmy

rezistencie jednotlivých bakteriálnych druhov a mať čo najlepšie poznatky o citlivosti

jednotlivých infekčných pôvodcov.

Prvé zmienky o existencii antibiotickej rezistencii siahajú až do roku 1950, kedy sa

po slávnom objave penicilínu Alexandrom Flemingom v roku 1928 stávali baktérie proti

nemu rezistentné. Od tej doby nadobudla antibiotická rezistencia obrovské rozmery. Stále

častejšie sú popisované nové a nové mechanizmy antibiotickej rezistencie. Rovnako sa

novým predmetom skúmania stávajú aj gény a vektory prenosu jednotlivým mechanizmov.

Pre ľudí sa za obrovskú hrozbu pokladá čoraz rýchlejší nárast infekčných ochorení, ktoré

vyvolávajú multirezistentné kmene baktérií. Jedná sa o baktérie, ktoré sú rezistentné na

viaceré antibiotiká patriace do rôznych tried. Znamená to, že jedna baktéria vykazuje

rezistenciu ku väčšiemu počtu antibiotických tried, a rovnako k tomu prispôsobujú aj

viaceré typy mechanizmov rezistencie. Medzi takéto kmene baktérií patri Staphylococcus

aureus, ktorý rezistencii podlieha veľmi rýchlo. Aby antibiotická rezistencia nemala

stúpajúcu tendenciu, je preto nutné preskúmať túto problematiku ako u ľudí, tak aj

u zvierat. Len týmto spôsobom bude možné uskutočniť kontrolu nad použitím antibiotík,

a rovnako aj prevenciu nad nekontrolovaným šírením multirezistentných kmeňov baktérií.

Vhodné je preto položiť si otázku: ,,Prečo vlastne antibiotická rezistencia vzniká?"

Jedným z dôvodov je nekontrolované používanie antibiotík v liečbe širokého spektra

bakteriálnych ochorení.

Ďalším dôvodom pre vznik rezistencie je i skutočnosť, že antibiotiká sa používali aj

u zvierat. Živočíšna výroba prosperuje a množstvá zvierat sú čím ďalej väčšie. Dochádza

tak k premnoženiu patogénnych mikroorganizmov, a k vzniku infekcií. Antibiotiká sa

dostali konzumáciou mäsa do ľudského tela. Dochádza tak k mutácii génov na

bakteriálnom chromozóme a vzniká rezistencia, ktorá sa ďalej šíri z baktérie na baktériu.

Toto je prípad získanej rezistencie. Existuje však aj prirodzená rezistencia bakteriálnych

10

druhov. Je to schopnosť baktérií odolávať antibiotikám vlastnou štruktúrnou a funkčnou

charakteristikou.

Na mieste je aj otázka ,,Akým spôsobom dokážu rôzne druhy baktérií odolávať

účinku antibiotík?" Nápomocné k tomu je im množstvo najrôznejším mechanizmov

rezistencie. Za potenciálny prostriedok v boji proti rezistencii sa preto pokladá aj výskum

nových druhov antibiotík, s novými mechanizmami účinnosti, ku ktorým by baktérie

nevykazovali rezistenciu.

11

1 Prehľad súčasného stavu riešenej problematiky

1.1 Z histórie mlieka a masla

Prvé zmienky o mlieku siahajú až do obdobia neolitu, čo je mladšia doba kamenná.

Neolit je obdobím, kedy ľudia postupne prechádzali od lovu zvierat k zberu postupne až

k usadlejšiemu spôsobu života (Barłowska et al., 2011).

Je to už takmer 8 000 rokov, čo sa začal rozmach chovu dojníc. Prvé pokusy

o skrotenie prežúvavcov ako kôz, oviec alebo kráv sa uskutočnili

v oblasti Stredného východu. Mlieko sa od tej doby stalo cenným zdrojom potravy,

predovšetkým v oblastiach, kde je rozšírený chov zvierat. Týmto spôsobom sa otvorila

možnosť úpravy stravovacích návykov, a to hlavne v odvetví dojčenskej výživy (Kohler,

2013).

Mliečnu kultúru tiež dopĺňa posvätnosť kravy v starovekom Egypte, Iráne a Indii.

História mlieka sa viaže aj k obdobiu stredoveku, kde mnísi vrátane benediktínov boli

hlavnými výrobcami syrov (bishop, munster) v Európe. Techniky výroby syrov, masla

a fermentovaných mliečnych výrobkov boli známe, a mali značný význam v živote

človeka už dávno pred tým, než došlo k rozvoju priemyslu a vedeckej revolúcie v Európe

počas 19. storočia (Konte, 1999).

Postupne sa rozvíjali nové možnosti získania potravy. Spolu s rozvojom

poľnohospodárstva zohrala dôležitú úlohu aj domestikácia zvierat, ktorá umožnila stály

prísun ich mäsa, kožušín a samozrejme mlieka (Bartowska et al., 2011).

Prvé zmienky o masle sa začali šíriť až neskôr. Maslo je jeden z prvých mliečnych

výrobkov, ktoré boli vôbec vyrobené. Obchod s maslom sa na medzinárodnej úrovni začal

rozvíjať od 14. storočia. Vo veľkom sa maslo začalo vyrábať až od roku 1877, kedy bol

objavený mechanický oddeľovač na smotanu (Budhkar et al., 2014).

1.2 Definícia mlieka

Mlieko je dôležitou súčasťou zdravej a vyváženej stravy ľudí. Je to prvá potrava,

s ktorou ľudia prichádzajú po narodení do kontaktu. Je bohatým zdrojom energie, živín

a rôznych vitamínov. Svoju úlohu zohráva aj pri vývoji kostnej hmoty (Pereira, 2014).

Aj keď najčastejšie konzumovaným mliekom je kravské mlieko, konzumujú sa aj iné

druhy mliek ako sú napr. kozie, ovčie, byvolie a ťavie (Guetouache et al., 2014).

12

Mlieko sa skladá zo 4 fyzikálnych fáz. Plynná fáza obsahuje CO2 v čase dojenia

mlieka. Tukovú fázu tvoria bunky tuku, ktoré pozostávajú z lipidov a komponentov

rozpustných v tukoch. Globuly tuku sú obklopené fosfolipidmi a membránou bielkovín.

Koloidnú fázu tvoria kazeínové micely, ktoré sú prepojené s fosfátmi a citrátmi vápnika

a horčíka. Štvrtá vodná fáza pozostáva z rozpustných proteínov, laktózy a minerálnych

látok (Guetouache et al., 2014).

Zloženie jednotlivých komponentov sa mení. Z kvantitatívneho hľadiska obsahuje

mlieko 4 hlavné zložky – vodu, tuk, bielkoviny a laktózu. Súčasťou mlieka sú aj minoritné

komponenty, a to minerálne látky, enzýmy, vitamíny a rozpustné plyny (Guetouache et al.,

2014).

Mlieko, ktoré je určené na ľudskú spotrebu musí spĺňať určité požiadavky. To

znamená, že musí pochádzať zo zdravých, dobre živených laktujúcich kráv. Ak pochádza

z infikovaných kráv v dôsledku zápalu vemena, nie je určené na ľudskú spotrebu a po

vykonaní veterinárnej prehliadky je vylúčené. Optimálna teplota mlieka je 4 °C počas

všetkých operácií, vrátane dodávky pre spotrebiteľa (Kohler, 2013).

Napriek mnohým pozitívam, ktoré mlieko má je vynikajúcim médiom pre rast

mnohých mikroorganizmov, a to hlavne pre druhy – Lactobacillus, Streptococcus,

Staphylococcus a Micrococcus. Môže dôjsť k jeho kontaminácii pri samotnom dojení

prostredníctvom ľudí, ktorí dojenie vykonávajú, alebo prostredníctvom nádob na dojenie

(Rehman et al., 2014).

1.2.1 Faktory ovplyvňujúce zloženie mlieka

Zastúpenie hlavných komponentov mlieka ako sú tuk, bielkoviny, voda a laktóza

ovplyvňujú rôzne faktory. Zmeny vo výžive zvierat môžu veľmi ľahko meniť koncentráciu

mliečnych bielkovín a tuku. Práve koncentrácia tuku je na zmeny vo výžive najcitlivejšia,

a môže kolísať v rozsahu takmer 3 %. Koncentrácia mliečnych bielkovín kolíše v rozsahu

0,6 %. Koncentrácia laktózy a minerálnych látok nie je citlivá na zmeny vo výžive zvierat.

Na zloženie mlieka vplýva aj množstvo ďalších faktorov. Patria sem jednotlivé druhy

zvierat, z ktorých sa získava mlieko, genotyp, podmienky životného prostredia, laktačná

fáza, úroveň produkcie mlieka, nutričný stav zvierat, ochorenia ako sú mastitídy, ročné

obdobie a vek kráv (Looper, 2013).

Najvyššia koncentrácia mliečneho tuku a bielkovín je počas skorej

a neskorej fázy laktácie. Najnižšia koncentrácia je počas vrcholovej produkcie mlieka. Pod

vplyvom ročných období je najvyšší podiel tuku a bielkovín počas jesene a zimy.

13

A naopak, najnižší je počas jari a leta. Pôsobením faktora veku ostáva koncentrácia tuku

relatívne konštantná na rozdiel od bielkovín, ktorých koncentrácia sa pribúdajúcim vekom

dojníc znižuje. V súčasnosti existuje niekoľko postupov riadeného kŕmenia,

prostredníctvom ktorých je možné zlepšiť úroveň koncentrácie tuku a bielkovín. Existujú

tiež stratégie, ktoré optimalizujú funkcie bachora kráv, a tak vedú k maximalizácii

produkcii mlieka (Looper, 2013).

1.2.2 Chemické zloženie mlieka

Kravské mlieko pozostáva v priemere z 87 % vody, 4-5 % laktózy, 3 % bielkovín,

3-4 % tuku, 0,8 % minerálnych látok a 0,1 % vitamínov (Pereira, 2014).

V najvyššom množstve je v mlieku zastúpená voda, ktorej množstvo je riadené

množstvom laktózy syntetizovanej sekrečnými bunkami mliečnej žľazy (Fillion, 2006).

V mlieku sú prítomné aj sacharidy. Hlavným sacharidom je laktóza. Je to disacharid

zložený z jednej molekuly glukózy a jednej molekuly galaktózy, ktoré sú spojené

β-1,4-glykozidickou väzbou. Aj keď laktóza patrí medzi cukry, má nižšiu sladkosť ako

ostatné cukry, napr. sacharóza, glukóza a pod. Jej koncentrácia sa pohybuje medzi 4,5 až

5,2 g.100 g-1 mlieka. Tento cukor slúži aj ako substrát počas fermentácie mlieka baktériami

mliečneho kvasenia. Pre ne laktóza slúži ako zdroj energie (Fillion, 2006).

Hlavnými zložkami mlieka, ktoré majú súčasne aj najväčšiu nutričnú hodnotu sú

jeho bielkoviny. Liter mlieka obsahuje až 32 g bielkovín (Pereira, 2014).

Mliečne bielkoviny sú heterogénnou skupinou zlúčenín, ktoré sa vyznačujú

odlišnosťami vo svojom zložení a vlastnostiach. Delia sa na jednotlivé frakcie a to na

kazeín a srvátku (Bartowska et al., 2011).

Bielkoviny mlieka, ktoré sú nerozpustné vo vode sa nazývajú kazeíny. Predstavujú

80 % mlieka. Srvátkové bielkoviny, ktoré sú rozpustné vo vode predstavujú 80 % z obsahu

mlieka (Pereira, 2014).

Oba druhy bielkovín sú charakterizované ako vysoko kvalitné. Sú všeobecne

považované za najlepší zdroj bielkovín vo výžive ľudí. Jednotlivé profily aminokyselín

v oboch typoch bielkovín sa úplne odlišujú. Na aminokyseliny s rozvetveným reťazcom je

bohatá srvátka. Obsahuje hlavne valín, leucín, izoleucín a lyzín. U kazeínu prevyšuje

podiel histidínu, metionínu a fenylalanínu (Boye et al., 2012).

Vyznačujú sa množstvom rôznych účinkov na ľudské zdravie ako sú napr.

antibakteriálne, antimikróbne, antitrombotické, antivírusové, protiplesňové a tiež

antihypertenzívne účinky (Mills et al., 2011).

14

V súčasnosti sa pri kazeínoch rozlišujú štyri rôzne frakcie – αs1, αs 2, β a κ kazeíny.

Ľudské mlieko neobsahuje frakciu αs1, ktorá je hlavným faktorom v rozvoji alergií

mliečnych bielkovín. Naopak obsahuje významné množstvo β-kazeínov (Bartowska et al.,

2011).

Čo sa týka srvátkových bielkovín tie sa delia na α laktoalbumín, β-laktoglobulín,

imunoglobulíny, sérový albumín, laktoferín, laktoperoxidázu, lyzozým a transferín

(Pereira, 2014). Niektoré z nich preukazujú aj pozitívne účinky na ľudské zdravie.

Laktoferín spolu s β laktoglobulínom a α laktoalbumínom má pozitívny vplyv na

potlačenie rastu nádoru na mozgu. Zohrávajú aj ďalšie dôležité úlohy v ľudskom

organizme. Β-laktoglobulín je nosičom vitamínu a má aj antioxidačné účinky. Na druhej

strane laktoferín je kľúčovým prvkom nielen pri vstrebávaní železa, ale aj vo vývoji

antioxidačných a antikarcinogénnych účinkov (Pereira, 2014).

Hlavná úloha kazeínov spočíva v transporte vápnika a fosforu a zlepšenia ich

vstrebávania v žalúdku. Kazeíny podporujú aj vznik bioaktívnych peptidov, ktoré majú

pozitívny vplyv na zdravie ľudí. Ako bolo spomenuté vyššie, môže ísť v prevažnej miere

o antihypertenzíva, antitrombotiká a antioxidanty (Zimecki et al., 2007).

Lipidy sú látky, ktoré najlepšie definujú energetickú hodnotu, technologickú

vhodnosť a prispievajú tiež k nutričnej hodnote mlieka. Miestom syntézy mliečneho tuku

sú mliečne bunky, ktoré sa nachádzajú vo vemene. Lipidy sa formujú do inklúzií, ktoré sa

postupne zväčšujú a migrujú do horných častí bunky, z ktorých sa vo forme guličiek

presúvajú do zberného lúmena (El Zeini, 2006).

Mliečny tuk tvoria mnohé zložky, avšak v najväčšej miere sú zastúpené

triacylglyceroly, ktoré tvoria až 98 % ich obsahu. Medzi ďalšie zložky patria fosfolipidy,

cholesterol, diacylglyceroly a voľné mastné kyseliny. V mliečnom tuku sa nachádzajú aj

stopové množstvá uhľovodíkov a rôzne aromatické zlúčeniny (Pereira, 2014).

Tab. 1 Chemické zloženie mlieka rôznych cicavcov (g.100 g-1 mlieka)

(Konte, 1999 – upravené)

Druhy Voda Bielkoviny Tuk Laktóza

krava 87,2 3,5 3,7 4,9

ovca 82,7 5,5 6,4 4,7

koza 86,5 3,6 4,0 5,1

ťava 87,7 3,5 3,4 4,7

15

Nasýtené mastné kyseliny sú podstatnou zložkou frakcie tuku. Tvoria až 70 % jeho

obsahu. Z nich najdôležitejšie sú kyseliny – palmitová, myristová a stearová. Nenasýtené

mastné kyseliny reprezentujú 30 % obsahu tuku. Ich najväčší podiel tvorí kyselina olejová

(Mansson, 2008).

Mlieko obsahuje významné množstvo minerálnych látok, a to hlavne vápnik, fosfor,

chlorid, horčík, sodík, draslík, jód a malé množstvo železa. Vápnik a fosfor sú potrebné pre

správny vývoj kostí a vývoj novorodencov (Al-Wabel, 2008).

V súčasnej modernej strave je práve mlieko hlavným zdrojom vápnika. Priemerná

koncentrácia vápnika je 1200 mg na liter mlieka. Čo sa týka železa – jeho koncentrácia je

do značnej miery ovplyvnená prítomnosťou laktoferínu. Najnižšie množstvo železa sa

nachádza v kozom mlieku, zatiaľ čo ťavie mlieko je najviac bohaté na tento minerál. Aj

napriek nízkej koncentrácii je železo z kozieho mlieka biologicky dostupnejšie ako to,

ktoré sa nachádza v kravskom mlieku. Je to spôsobené vyšším podielom nukleotidov

v kozom mlieku, a teda dochádza k jeho lepšej absorbcii z čreva. Stopové prvky, ktoré sú

zastúpené v mlieku zinkom, selénom a meďou (Raynal-Ljutovac et al., 2008).

Tab. 2 Priemerný obsah minerálnych látok v mlieku (Pereira, 2014 – upravené)

Minerálne látky Množstvá (mg.100 g-1)

vápnik 119-124

fosfor 93-101

horčík 11-14

draslík 151-166

zinok 0,4-0,6

Mlieko je aj bohatým zdrojom vitamínov. Obsahuje vitamíny rozpustné v tukoch

ako A, D, E a aj vitamíny rozpustné vo vode ako sú napr. vitamín C

a vitamíny skupiny B, tzv. B-komplex. Obsah vitamínov rozpustných v tuku je

podmienený prítomnosťou mliečneho tuku. Čím je ho viac, tým je aj obsah týchto

vitamínov vyšší. Z toho vyplýva, že odtučnené mlieko obsahuje oveľa nižšie množstvo

vitamínov rozpustných v tukoch ako plnotučné mlieko. V niektorých krajinách je

odstredené mlieko obohacované o vitamíny A a D. Zabezpečí sa tým zvýšenie jeho

nutričnej hodnoty. Vitamíny sú dôležitou zložkou mlieka, pretože majú rôzne prospešné

účinky na ľudský organizmus. Vitamín A je potrebný na rast, vývoj, imunitu a zdravie očí.

16

Jeho obsah ovplyvňujú niektoré faktory ako sú krmivo zvierat, ročné obdobie a iné

(Gaucheron, 2011).

Vo všeobecnosti má ovčie a kozie mlieko viac vitamínu A ako kravské mlieko.

Kozie mlieko obsahuje aj riboflavín, tiamín, niacín a kyselinu pantoténovú. Obsahuje päť

krát menej vitamínu B12 a kyseliny listovej. Ich nedostatok v ľudskej strave spôsobuje

vznik anémie (Raynal-Ljutovac, 2008).

Vitamín D sa vo veľkom množstve v mlieku nevyskytuje. Avšak niektoré štúdie

naznačujú, že tento vitamín má antikarcinogénne a kardioprotektívne účinky. Má zásadný

význam pre vstrebávanie vápnika, dôležitého pre rast kostí a môže byť aj faktorom

v prevencii osteoporózy. V mlieku sa nachádza aj značné množstvo vitamínov skupiny B,

ktoré pokrývajú 10-15 % odporúčaného denného príjmu. Sú dôležité enzymatické

kofaktory, ktoré sú súčasťou metabolických dráh dôležitých pre tvorbu energie, živín

a syntézu hormónov (Pereira, 2014).

V mlieku je tiež zastúpený aj vitamín C. Najvyššie množstvo vitamínu C je v ťavom

mlieku, kde je jeho obsah 30 násobne prevýšený oproti množstvu v kravskom mlieku.

V púštnych oblastiach je tak toto mlieko často jediným zdrojom vitamínu C (Bartowska et

al., 2011).

1.3 Komplexná mikrobiológia mlieka

Mlieko je tekutina s vysokou výživnou hodnotou, ktorá sa získava od rôznych

živočíšnych druhov – kráv, oviec, kôz, tiav a byvolov. Zdrojom tejto hodnotnej tekutiny je

aj človek. Aj keď mlieko obsahuje látky potrebné pre život ako sú bielkoviny, vitamíny či

lipidy, za určitých podmienok môže byť veľmi dobrým substrátom aj pre rast

a rozmnožovanie mikroorganizmov. Ideálnym prostredím pre ich prospievanie je takmer

neutrálne pH a vysoká aktivita vody (Quickly et al., 2013).

Mlieko a mliečne výrobky môžu predstavovať potenciálne zdravotné riziko, ak sa

pasterizáciou neodstránia patogénne baktérie (Rehman et al., 2014).

Po požití patogénov môžu vzniknúť ochorenia s rôznym stupňom závažnosti.

Najčastejšie k nim dochádza konzumáciou kontaminovaného mlieka a mliečnych

výrobkov druhmi rodu Salmonella, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus a Listeria

(Quigley et al., 2011).

Baktérie sa do mlieka dostávajú rôznymi spôsobmi. Mikroorganizmy, ktoré sú

prítomné v podstielke môžu kontaminovať povrch struku, a teda aj potenciálne vstúpiť do

17

mlieka. Aj v prístrojoch slúžiacich na dojenie sa tiež nachádzajú mikroorganizmy, ktoré sa

môžu dostať do čerstvo nadojeného mlieka (Vacheyrou et al., 2011).

Medzi hlavné kontaminanty mlieka patria aj Escherichia coli

a Staphylococcus aureus. Znečistenie mlieka ovplyvňuje niekoľko faktorov. Medzi tie

najhlavnejšie patrí znečistenie mlieka fekáliami. Kontaminanty vo fekáliách pochádzajú

prevažne z krmiva, ktoré bolo kontaminované (Aycicek et al., 2005).

S. aureus sa dostáva do mlieka z dojacieho zariadenia, manipuláciou ľudí a cez

mliečnu žľazu. Nebezpečný je vďaka produkcii enterotoxínov, ktoré prežijú pasterizačné

teploty (Quigley et al., 2011).

Z patogénov sa vyskytuje v mlieku aj Listeria monocytogenes, Yersinia

enterocolitica a Brucella spp., ktoré sú schopné prežiť nízke teploty a tak vyvolať rôzne

ochorenia. Na vzniku akútnej gastroenteritídy sa podieľa hlavne Y. enterocolitica (Quigley

et al., 2011).

Bolo zistené, že prítomnosť mikroorganizmov v kravskom mlieku závisí od toho

v akom prostredí boli zvieratá kŕmené, t. j. či boli kŕmené vo vnútri alebo vonku, v akých

priestoroch sa nachádzali a aká fáza laktácie práve prebiehala. Prítomnosť rôznych

populácií mikroorganizmov v surovom mlieku má veľký význam v čase jeho spracovania.

Má vplyv na jeho trvanlivosť, organoleptické vlastnosti, výťažnosť a rovnako aj na jeho

kazenie (Samaržija et al., 2012).

Dominantnou populáciou vyskytujúcou sa pred pasterizáciou v mlieku oviec, kráv

a kôz sú baktérie mliečneho kvasenia. Sú to baktérie, ktoré fermentujú laktózu na laktát.

Z nich sa najčastejšie v mlieku nachádzajú zástupcovia rodu Lactobacillus, Lactococcus,

Streptococcus, Enterococcus a Leuconostoc (Quickly et al., 2011).

Samotné mlieko je prirodzeným stanovišťom pre baktérie mliečneho kvasenia,

ktoré sú dôležité ako konzervačné činidlá, vytvárajú chuť produktov a zlepšujú ich

organoleptické vlastnosti (Gemechu, 2015).

V mlieku je prítomnosť baktérií mliečneho kvasenia prirodzená alebo sú

naočkované ako štartovacie kultúry (Delavenne et al., 2012).

Počas skladovania mlieka dochádza v ňom k rôznorodým zmenám. Keďže sa

obvykle skladuje pri nízkych teplotách, rast mikroorganizmov je v takýchto podmienkach

obmedzený. Výnimkou sú psychrotolerantné mikroorganizmy, ktoré v chladných

podmienkach proliferujú, a sú tak hlavnou príčinou kazenia mlieka počas jeho skladovania.

Zahŕňajú zástupcov rodu Pseudomonas a Acinetobacter (Quickly et al., 2011).

18

Ak sú v mlieku prítomné koliformné baktérie, kvasinky alebo sporulujúce baktérie

dochádza v syroch k produkcii plynov a tým aj k tvorbe veľkých dutín, čo negatívne

ovplyvňuje ich výrobu (Ledenbach a Marschal, 2009).

Mikrobiologické zloženie mlieka má značný vplyv na kvalitu mlieka

a mliečnych produktov, ale zároveň vplýva aj na zdravie konzumenta. Na jednej strane

môže byť mlieko zdrojom závažných ochorení v tom prípade, ak obsahuje patogény, na

druhej strane ak sa v ňom nachádzajú dobré mikroorganizmy, môže konzumácia surového

mlieka prispieť k lepšiemu zdraviu konzumenta. Tie môžu mať pozitívny vplyv na

trávenie, zníženie výskytu alergií, astmy a atopických ekzémov. Najlepšie pôsobia

v prvých rokoch života človeka (Hantsis-Zacharov a Halpern, 2007).

Z tohto hľadiska je dôležité preskúmať jednotlivé mikrobiologické populácie mlieka

prostredníctvom použitia metód na ich detekciu. Rovnako je potrebné objasniť aj ich

potenciálne použitie v oblasti priemyslu, dôkladne zvážiť ich prínos pre kvalitu mliečnych

výrobkov a zdravie konzumenta (Quckly et al., 2013).

1.3.1 Psychrotrofné baktérie

V súčasnosti sa mlieko skladuje prevažne v chladných skladoch, kde je

ponechávané dlhšiu dobu. To vedie k premnoženiu psychrotrofných baktérií. Tie sú

momentálne hlavným problémom mliekarenského priemyslu, pretože patria medzi hlavné

príčiny kazenia mlieka a spôsobujú jeho ekonomické straty na trhu. Psychrotrofné baktérie

vo všeobecnosti produkujú extracelulárne a intracelulárne termorezistentné enzýmy

(proteázy, lipázy a fosfolipázy), ktoré sa podieľajú na vyššie spomenutých problémoch

v mliekarenskom priemysle (Samaržija et al., 2012).

Mnohé z nich zostávajú účinné aj po tepelnom ošetrení mlieka, čo vedie ku kazeniu

ošetreného mlieka. Je to spôsobené postpasterizačnou kontamináciou výrobkov. Väčšina

psychrotrofných baktérií spôsobujúcich kazenie mlieka nemá patogénne účinky. Niektoré

z týchto druhov však majú schopnosť produkovať toxíny a vykazujú rezistenciu proti

antibiotikám. Preto sú z týchto dôvodov považované za oportúnne ľudské patogénne

baktérie (Senesi a Ghelardi, 2010).

Psychrotrofné mikroorganizmy sú definované ako skupina rôznych druhov baktérií,

ktoré sú schopné rásť pri teplote 7 °C alebo nižších teplotách, bez ohľadu na ich optimálnu

teplotu rastu. Sú to všadeprítomné mikroorganizmy, predovšetkým však vo vode a v pôde,

ale aj vo vzduchu. Ich optimálna metabolická aktivita je vyjadrená pri teplotách 20-30 °C.

Avšak môžu rásť a rozmnožovať sa aj pri nízkych teplotách vďaka obsahu

19

polynenasýtených mastných kyselín v ich membránových lipidoch (Sillankorva et al.,

2008).

Psychrotrofné baktérie izolované z chladeného mlieka zaraďujeme medzi gram

negatívne a gram pozitívne baktérie patriace do 7 tried. Dominantnými triedami sú

Gammaproteobacteria, Bacilly a Actinobacteria. Zatiaľ čo Alphaproteobacteria,

Betaproteobacteria, Flavoproteobacteria a Sphingobacteria patria medzi menej významné

triedy (Hantsis-Zacharov a Halpern, 2007).

G- populáciu reprezentujú rody ako Pseudomonas, Aeromonas, Serratia,

Enterobacter a Flavobacterium. G+ rody baktérií reprezentujú rody Bacillus, Clostridium,

Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Arthobacter, Streptococcus,

Staphylococus a Lactobacillus (Martin et al., 2007).

Medzi najčastejšie izolované rody patrí Bacillus. Súčasne patrí medzi psychrotrófne

aj termorezistentné rody, pretože dokáže prežiť aj tepelné ošetrenie mlieka. Je to

G+ baktéria tvaru tyčinky. Najčastejšie izolovanými druhmi sú B. cereus, B. subtilis a tiež

B. licheniformis. Sú typické vytváraním extra a intracelulárnych hydrolytických enzýmov.

Okrem produkcie enzýmov sa vyznačujú aj tvorbou toxínov, ktoré sú pôvodcami rôznych

ochorení v potravinách (Samaržija et al., 2012).

Príkladom môže byť častý kontaminant B. cereus produkujúci viac druhov

enterotoxínov, ktoré sú zodpovedné za ľudské infekcie a intoxikácie. Produkuje napr.

cytotoxín K, ktorý je spojený s ochorením zažívacieho ústrojenstva. Ide o enterotoxín,

ktorý sa uvoľňuje v tenkom čreve po konzumácii kontaminovanej potraviny. Avšak

produkuje aj emetický enterotoxín, ktorý sa vylučuje priamo do potravín a spôsobuje

intoxikácie, ktoré sa prejavujú nevoľnosťou a zvracaním po 1-6 hodinách po konzumácii

potraviny (Senesi a Gheraldi, 2010).

Rovnako baktérie rodu Pseudomonas patria medzi popredných predstaviteľov

psychrotrofných baktérií v chladenom mlieku, ale aj v masle. Sú to heterogénne

a ekologicky významné skupiny baktérií. Nemajú náročné nutričné požiadavky a preto je

možné ich nájsť takmer všade. Vyskytujú sa v pôde, vo vode, v prachu a boli dokonca

izolované aj z klinických nástrojov a v kozmetických prípravkoch. Z nich sa najčastejšie

vyskytuje P. fluorescens, P. gessardii, P. fragi a P. lundensis (de Oliveira et al., 2015).

Baktérie tohto rodu tvoria 65-70 % všetkých psychrotrofných baktérií

vyizolovaných z mlieka. Charakteristickou črtou rodu Pseudomonas je ich schopnosť rásť

pri nízkych teplotách v rozmedzí od 3-7 °C. V kyslej smotane a cmare redukujú obsah

20

diacetylu, čo vedie k vytvoreniu nežiaducej jogurtovo zelenej príchute (Ledenbach

a Marschal, 2009).

Schopnosť psychrotrofných mikroorganizmov odolávať čisteniu spočíva

v skutočnosti v tom, že mnoho druhov dokáže produkovať biofilm, ktorý im umožňuje rásť

v prostredí. Biofilm je spoločenstvom mikroorganizmov, ktoré sú viazané k určitému

povrchu. Pozostáva z nukleových kyselín, lipidov, polysacharidov a proteínov (de Oliveira

et al., 2015).

Takmer všetky druhy majú schopnosť priľnúť k povrchu pevných látok a tvoriť

biofilm na vnútorných plochách mliečnych zariadení. Biofilm sa veľmi ťažko odstraňuje

bežnými čistiacimi prostriedkami, a tak sa stáva trvalým zdrojom kontaminácie mlieka

(Sillankorva et al., 2008).

1.3.2 Enterobaktérie

Prítomnosť indikátorových mikroorganizmov odráža mikrobiologickú kvalitu

potravín vo vzťahu k ich bezpečnosti. Enterobaktérie sú bežne sa vyskytujúcou skupinou

baktérií vo vode, pôde, rastlinách, ale aj v tráviacom trakte teplokrvných živočíchov.

Typické koliformné baktérie patria do rodu Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,

Hafnia, Serratia, Klebsiella a Citrobacter. Všeobecným indikátorom vody a mliečnych

výrobkov je E. coli. Koliformné baktérie všeobecne slúžia ako indikátory nesprávnych

hygienických podmienok v mliekarňach počas výroby a spracovania mlieka (Lee et al.,

2009).

Väčšina predstaviteľov enterobaktérií patrí do čeľade Enterobacteriaceae.

Koliformné baktérie sú G- aeróbne alebo fakultatívne anaeróbne nesporulujúce tyčinky,

ktoré sú schopné fermentovať laktózu pri teplote 32-35 °C za vzniku kyselín a plynov,

ktoré vytvárajú do 48 hodín (Martin et al., 2016).

Už dlhé obdobie slúžia enterobaktérie ako indikátory fekálneho znečistenia. Podľa

nedávnych výskumov sa však dokázalo, že len zlomok z nich je fekálneho pôvodu.

Väčšina z nich patrí medzi mikroorganizmy znečisťujúce životné prostredie (Martin et al.,

2016).

Prítomnosť eneterobaktérií v syroch závisí od toho, akým spôsobom boli vyrábané.

V surovom mlieku je ich výskyt bežný. Pri výrobe pasterizovaných syrových výrobkoch sú

eliminované procesom pasterizácie (Martin et al., 2016).

21

Podobne ako psychrotrofné baktérie aj koliformy môžu redukovať obsah diacetylu

v kyslej smotane, následne tak dochádza k tvorbe jogurtovej príchute. Ich rastový potenciál

sa zvyšuje aj počas zrenia mäkkých, plesnivých syrov (Ledenbach a Marschall, 2009).

Escherichia coli

E. coli je fakultatívna anaeróbna baktéria, ktorá sa vyskytuje všade, ale najčastejšie

osídľuje črevný trakt ľudí a zvierat. Prítomnosť tohto patogénu indikuje v potravinách

fekálne znečistenie. Počas procesu konzervovania potravín je obvykle zničená. Avšak

môže sa stať, že tento proces prežije. Je to spôsobené opätovnou kontamináciou výrobkov

počas výroby. Jej prítomnosť vo výrobkoch je spôsobená hlavne nedodržiavaním

technologických režimov, nerešpektovaním procesných noriem a nedostatkami v osobnej

hygiene (Zeinhom a Abdel-Latef, 2014).

E. coli je patogén vyskytujúci sa v životnom prostredí a bezprostrednej blízkosti

kráv a to vo vode, pôde, hnoji a podstielke. Môže sa tak dostať na vemeno kravy

a preniknúť do mlieka. Je producentom toxínov, ktoré môžu zničiť bunkové membrány

a poškodiť mliečnu žľazu, čo v konečnom dôsledku vedie k vzniku mastitíd u dojníc

(Caine et al., 2013).

Prevažná väčšina týchto tyčinkovitých baktérií nepredstavuje nebezpečenstvo

pre zdravie konzumenta, ale niektoré sérotypy môžu spôsobiť alimentárne intoxikácie.

Hlavným a najnebezpečnejším patogénom z druhu enterohemoragických E. coli je sérotyp

O157:H7. Je dôvodom znepokojenia v oblasti mliekarenského priemyslu. Prítomnosť

E. coli v spracovanom mlieku je spôsobená aj manipuláciou znečistenými rukami

a nedostatočným povedomím o hygiene (Picozzi, 2005).

Je pôvodcom veľmi závažnej hemoragickej kolitídy, trombotickej

trombocytopenickej purpurei a hemolytického uremického syndrómu. Hlavným zdrojom

enterohemoragickej E. coli sú mäsové výrobky ako hamburgery a krvavé steaky. Zdrojom

sú napr. aj mliečne výrobky a nepasterizované mlieko (Picozzi, 2005).

Enteropatogénny sérotyp E. coli je hlavným pôvodcom hnačkových ochorení

u malých detí. Obsahuje enterotoxín, ktorý sa podieľa aj na vzniku gastroenteritíd. E. coli

je jedným z mnohých patogénov, ktoré v mlieku a mliečnych výrobkoch spoľahlivo

indikujú kontamináciu fekáliami, pôdou a vodou (Zeinhom a Abdel-Latef, 2014).

Enteroagregatívna E. coli je charakteristická amplifikovaným eagg génom. Patrí

medzi hlavných pôvodcov hnačkových ochorení u ľudí vo vyspelých a rozvojových

krajinách (Caine et al., 2013).

22

Ostatné druhy enterobaktérií

Až 26 druhov obsahuje rod Enterobacter. Z biologického materiálu však zatiaľ bolo

vyizolovaných len 10 druhov. Zástupcovia tohto rodu dobre rastú na bežných médiách

a pohyb vykonávajú prostredníctvom bičíkov (Public Health England, 2014).

Najčastejším vyskytujúcim sa zástupcom je E. aerogenes. Osídľuje črevnú

mikroflóru ľudí a zvierat, a veľmi často sa vyskytuje v prírodnom prostredí (Tančinová et

al., 2008).

Rovnako do tohto rodu patrí aj druh Enterobacter cloaceae. V roku 1980 bol vďaka

tvorbe žltého pigmentu identifikovaný ako nový druh mikroorganizmu a jeho meno bolo

zmenené na E. sakazakii. Neskôr v roku 2007 sa na základe rozdielnych genotypových

a fenotypových vlastností tohto mikroorganizmu zistilo, že obsahuje viac druhov.

Za pomoci molekulárnych techník sa podarilo vyizolovať až 210 kmeňov druhu

E. sakazakii, na základe čoho došlo k jeho začleneniu do nového rodu s názvom

Cronobacter, ktorý patrí do čeľade Enterobacteriaceae (Blažková et al., 2010).

Rod Yersinia patrí do významnej skupiny bakteriálnych patogénov. A to hlavne

druhy ako Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis a Y. pestis (Zeinhom a Abdel-Latef,

2014).

Y. eneterocolitica je malý G- kokobacil patriaci do rodu Yersinia a čeľade

Yersiniaceae. Zaraďuje sa medzi psychrotropné baktérie, ktoré prosperujú pri nízkych

teplotách. Y. enterocolitica je najviac spájaná s prejavmi gastroenteritídy u ľudí. Niektoré

štúdie uvádzajú prítomnosť tejto baktérie v mlieku a mliečnych výrobkoch, ktoré patria

medzi najčastejšie konzumované živočíšne produkty. Pre zdravie ľudí môže byť

Y. enterocolitica rizikovým faktorom, pretože má schopnosť rásť v surovom mlieku

a dokáže byť životaschopná pri nízkych teplotách dlhú dobu (Myers et al., 2005).

Baktérie rodu Salmonella sú druhou najčastejšou príčinou ochorení, ktoré sú

spôsobené konzumáciou kontaminovanej potraviny. Salmonelóza patrí medzi

najdôležitejšie zoonotické bakteriálne črevné infekčné nákazy. Medzi jej najvýznamnejšie

sérotypy patria S. enteritidis subsp. enteritidis a S. typhimurium (Forshell a Wierup, 2006).

Typickými príznakmi salmonelóz sú kŕče, bolesti brucha, hnačky, vracanie a často

sprevádzané aj horúčkou. Celosvetovo patrí salmonelóza medzi najčastejšie ochorenia

z potravín spôsobujúce gastrointestinálne ťažkosti. Hlavné zdroje prenosu sú voda a vajcia,

ale aj surové potraviny. Zdrojom ochorenia môžu byť aj mliečne produkty a mlieko, ak sa

23

konzumuje surové a nesprávne pasterizované. Dokonca tvorí vysoké percento salmonelóz

(Zeinhom a Abdel-Latef, 2014).

Zástupcovia rodu Klebsiella sú G- baktérie, ktoré patria medzi hlavných pôvodcov

nozokomiálnych infekcií. V 75-86 % prípadov sa zo všetkých druhov tohto rodu vyskytuje

K. pneumoniae. Avšak častým zástupcom je aj K. oxytoca (Hansen et al., 2004).

Prítomnosť rodu Proteus je detegovaná najmä v súvislosti s tráviacim systémom

zvierat a ľudí. Nie všetky jeho druhy sú patogénne. Avšak patogénne druhy sú pôvodcami

infekcií močového ústrojenstva (Tančinová et al., 2008).

Rod Citrobacter pozostáva z 11 druhov a je bežnou súčasťou črevnej mikroflóry

u zvierat a ľudí (Public Health England, 2014).

Druhy patriace do tohto rodu sú podmienečne patogénne a vo vyšších

koncentráciách vyvolávajú ochorenia u jedincov so slabšou imunitou. Častým patogénom

mlieka a mliečnych výrobkov je C. freundii a C. braakii (Tančinová et al., 2008).

1. 4 Enterokoky

Enterococcus je zvláštnym a kontraverzným rodom baktérií mliečneho kvasenia.

Enterokoky patria medzi G+ ubikvitné mikroorganizmy vyskytujúce sa v najrôznejších

prostrediach. Vďaka svojej robustnosti dokážu prežívať v pôde, vode, piesku,

na rastlinách, ale aj v jedle. V závislosti od jednotlivých kmeňov sú ich funkcie rôzne.

Môžu byť považované za štartovacie kultúry, probiotiká alebo organizmy spôsobujúce

patogenitu a následné kazenie (Quigley et al., 2011).

Avšak enterokoky sú schopné vyvolávať aj oportúnne infekcie zahŕňajúce

endokarditídu, bakteriémiu, meningitídu, ranové infekcie, infekcie močových ciest

a infekcie krvného riečišťa (Gaspar et al., 2009).

Na základe svojich psychrotrofných vlastností, schopnosti existencie v najrôznejších

substrátoch a schopnosti prežiť pasterizačné teploty môžu byť súčasťou mikrobiologického

zloženia surového, ale aj pasterizovaného mlieka (Giraffa et al., 2003).

Ak sa počas získavania, manipulácie a spracovávania mlieka nedodržiavajú

podmienky správnej hygieny a sanitácie, tak sa v mlieku môžu veľmi ľahko objaviť

enterokoky. Pochádzajú z rôznych zdrojov, a to z výkalov, krmiva, prachu, vody, ale aj

zo samotného vemena dojníc. Do mlieka môžu preniknúť primárnou a sekundárnou

kontamináciou. Medzi zdroje kontaminácie patria aj prístroje používané na dojenie,

samotný odev a znečistené ruky dojičov (Greifová et al., 2003).

24

Bolo však preukázané, že ich prítomnosť v mlieku nesúvisí len s fekálnou

kontamináciou. Okrem priameho prenikania z ľudských a zvieracích výkalov, môžu

vstúpiť do mlieka aj nepriamo z kontaminovaných vodných zdrojov (Giraffa et al., 2003).

Medzi najčastejšie druhy enterokokov vyskytujúcich sa v mlieku a mliečnych

výrobkoch patria Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Okrem nich sa môže

v mlieku vyskytnúť aj E. durans, E. italicuss a E. mundtii (Quigley et al., 2011).

Vysoká teplota spracovávanej smotany počas výroby masla stačí na to, aby bola

zničená väčšina enterokokových baktérií. Predpokladom ich neprítomnosti je dobrá

hygiena počas výroby. Ak sú v masle enterokoky predsa prítomné, je to spôsobené

opätovnou kontamináciou počas výroby (Quigley et al., 2011).

Okrem patogénnych vlastností majú enterokoky aj prospešné biochemické

vlastnosti. Mnohé kmene enterokokov, ale hlavne E. faecalis a E. faecium dokážu

produkovať bakteriocíny s inhibičným účinkom proti patogénnym baktériám S. aureus,

Vibrio cholerae, L. monocytogenes, Clostridium spp. vrátane Clostridium botulinum

a Clostridium perfringens (Giraffa et al., 2003).

Enterococcus faecalis

E. faecalis je G+ komenzál, ktorý je súčasťou črevnej mikroflóry širokej škály

organizmov. Avšak nachádza sa aj na rastlinách, vo vode, v potravinách a v pôde.

Je prevládajúcim patogénom počas výskytu mastitíd u kráv, čo v konečnom dôsledku

ovplyvňuje zdravotný stav vemena a rovnako aj kvalitu mlieka (Buhnik-Rosenblau et al.,

2013).

E. faecalis patrí medzi najviac študované druhy rodu Enterococcus. Je to spôsobené

jeho prevládajúcim výskytom v prostrediach bežných pre ľudí a zvieratá. E. faecalis je

zodpovedný až za 80 % nozokomiálnych infekcií vyvolaných enterokokmi. Jeho nadmerné

zastúpenie medzi klinickými izolátmi môže byť spôsobené prirodzeným výskytom

v prírode, ale aj prítomnosťou virulentných faktorov. Medzi najznámejšie faktory

virulencie patria metaloproteáza a gelatináza so schopnosťou degratovať niektoré substráty

ako sú želatína, hemoglobín, kazeín a bioaktívne peptidy (Gaspar et al., 2009).

Z viac ako 20 druhov rodu Enterococcus sa v potravinách a s nimi súvisiacich

stanovištiach vyskytuje E. faecalis najčastejšie spolu s E. faecium (Giraffa, 2003).

Okrem toho, že vyvoláva infekcie má značný význam v potravinárskej výrobe.

E. faecalis je baktéria mliečneho kysnutia, ktorá prispieva k zreniu a vývoju arómy

tradične vyrábaných syrov. Prevláda hlavne v kyslých stredomorských syroch. Niektoré

25

jeho kmene sú súčasťou štartovacích kultúr európskych syrov a dokonca niektoré jeho

kmene sa využívajú aj ako probiotiká, a tak majú pozitívny vplyv na zdravie ľudí (Buhnik-

Rosenblau et al., 2013).

1.5 Pozitívny význam baktérií mliečneho kvasenia

Mlieko obsahuje rozmanité populácie baktérií. Mnohé z nich prispievajú

k prirodzenej fermentácii. Využívajú sa pri výrobe fermentovaných produktov k docieleniu

žiaducich vlastností. Baktérie mliečneho kvasenie sú skupinou G+, nesporulujúcich kokov

alebo tyčiniek, ktoré produkujú kyselinu mliečnu počas fermentácie sacharidov

(Gemechu, 2015).

Patria medzi priemyselne dôležité baktérie, pretože sa používajú pri produkcii

mlieka a mliečnych výrobkov ako sú syry, jogurty, kefír a cmar. Druhy, ktoré sa používajú

najčastejšie patria do rodov Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc a Streptococcus

(Sharma et al., 2012).

Prvým predstaviteľom technologicky významných baktérií je rod Lactococcus.

Tvorí ho štrnásť druhov, dva poddruhy a jeden biovar. V surovom mlieku a syroch

dominujú hlavne L. lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris. Využitie majú ako

štartovacie kultúry pri výrobe syrov. Ich hlavnou úlohou pri výrobe syrov je okysľovanie

prostredníctvom produkcie laktátu. Avšak prispievajú aj k proteolýze a premene

aminokyselín na chuťové zložky aldehydy a ketóny (Smit et al., 2005).

Ďalším rozmanitým rodom vyskytujúcim sa v mlieku je rod Lactobacillus. Čoraz

častejšie sa pre svoje pozitívne vlastnosti aplikuje v mliekarenskom priemysle. Hlavne

vďaka proteolytickej aktivite a schopnosti produkovať aromatické komponenty

a exopolysacharidy. Prostredníctvom týchto atribútov prispieva ku kvalite a nutričnej

hodnote mliečnych výrobkov. Obzvlášť dôležité v mliekarenskom priemysle sú

L. helveticus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus a L. delbruecki ssp. lactis (Quigley et al.,

2011).

L. helveticus má množstvo vlastností, ktoré sú žiaduce pri výrobe syrov. Ide hlavne

o rýchlosť autolýzy, čo vedie k uvoľneniu vnútrobunkových enzýmov, k zníženiu horkosti

a zvýšeniu chuťových vlastností syrov (Broadbent et al., 2011).

L. delbrueckii je tradičnou populáciou v nespracovanom mlieku a v tradične

vyrábaných syrov. L. bulgaricus je v dôsledku celosvetového použitia pri výrobe jogurtov

jedným z najvýznamnejších laktobacilov vôbec. Kmeň 2038 má množstvo jedinečných

26

funkcií vrátane sady génov zapojených do syntézy exopolysacharidov, ktoré zlepšujú

textúru a viskozitu hotových výrobkov (Quigley et al., 2011).

Z rodu Leuconostoc sa v mlieku najčastejšie vyskytujú druhy L. mesenteroides

a L. pseudomesenteroides. Tieto druhy majú schopnosť produkovať plyn (Cardamone et

al., 2011).

Metabolizujú laktózu a citrát, produkujú laktát, acetát, etanol a mnohé iné látky

prispievajúce k organoleptickým vlastnostiam fermentovaných mliečnych výrobkov

(Quigley et al., 201).

Slúžia k predĺženiu trvanlivosti výrobkov a zachovávajú ich nutričnú hodnotu.

Hrajú kľúčovú úlohu pri premene mlieka ako suroviny na konečné fermentované mliečne

produkty. Avšak najdôležitejšiu úlohu zohrávajú pri dodávaní kyslosti, dotváraní chuti

a textúry hotového výrobku. Zabezpečené je to premenou mliečnych bielkovín za využitia

ich proteolytických vlastností. Charakteristickou črtou fermentovaných mliečnych

produktov je mierne kyslá chuť a príjemná sviežosť (Kongo, 2013).

V dôsledku produkcie kyselín dochádza k zníženiu pH pod hodnotu 4 a k inhibícii

patogénnych mikroorganizmov, ktoré by mohli spôsobiť kazenie potravín alebo vyvolať

rôzne ochorenia (Kongo, 2013).

Najčastejšie používanou živnou pôdou na ich kultiváciu je MRS agar. Tradične sú

tieto baktérie kultivované a izolované samostatne. Nedávne výskumy však preukázali, že

vzájomnou interakciou baktérií mliečneho kvasenia sa zvyšuje ich účinnosť v spojitosti

s mliečnych kvasením. Dobrým príkladom je použitie L. lactis a L. raffinolactis ako jednej

štartovacej kultúry počas mliečnej fermentácie. Keďže odlišné druhy baktérií dodávajú

kyslú chuť mlieku odlišne, tak sa ich vzájomnou interakciou docieli maximalizácia účinku

(Quigley et al., 201).

Baktérie mliečneho kvasenia sa používajú aj ako súčasť probiotických potravín,

pretože dokážu produkovať bakteriocíny, ktoré inhibujú škodlivé baktérie. Vzájomná

interakcia baktérií mliečneho kvasenia je dôležitá aj pre zvýšenie probiotického účinku,

ktorý má pozitívny vplyv na ľudské zdravie. Bolo preukázané, že práve probiotiká

stimulujú imunitný systém aktiváciou imunitných buniek (Sharma et al., 2012).

1.6 Definícia masla

Maslo je mliečny produkt vytvorený na báze emulzie typu voda v oleji. Vyrába sa

mútením z čerstvej alebo fermentovanej smotany, pričom sa oddeľuje tuk od cmaru. Práve

mliečny tuk predstavuje podstatnú zložku masla. Mliečne bielkoviny v ňom slúžia ako

27

emulgátory. Kravské mlieko sa využíva najčastejšie na jeho výrobu. Okrem neho sa vyrába

aj z mlieka oviec, kôz, ale aj bizónov (Budhkar et al., 2014).

Základom pre výrobu je smotana. Je to emulzia, ktorá vzniká dispergovaním jednej

kvapaliny do druhej. V tomto prípade malé kvapôčky tuku dispergujú vo vode. Tukové

kvapôčky sú tvorené fosfolipidmi, mastnými kyselinami a proteínmi, ktoré im bránia

vo vzájomnom zhlukovaní. Avšak mútením smotany jednotlivé globule do seba narážajú.

Takto postupne dochádza k ich zhlukovaniu. Vytvorí sa maslové zrno obklopené vodou. Je

to vlastne cmar, ktorý je potrebné v ďalšom kroku oddeliť. Tento krok sa zabezpečí

stlačením masla do pevnej hmoty (Fernandes, 2009).

Na výrobu masla sa používa sladká a kyslá smotana. Pri použití kyslej smotany

baktérie mliečneho kysnutia skvasujú citrát za vzniku diacetylu a acetoínu. Vytvorený

diacetyl inhibuje v masle činnosť G- baktérií a plesní (Fernandes, 2009).

V chlade má maslo pevnú konzistenciu. Pri izbovej teplote sa zmäkčuje a je tak

vhodné na roztieranie. Pri teplote 32-35 °C dochádza k jeho topeniu (Fernandes, 2009).

Vo všeobecnosti obsahuje maslo minimálne 80 % tuku, 15-17 % vody a 0,1 až 1 %

sacharidov a proteínov (Budhkar et al., 2014).

1.6.1 Patogénna mikroflóra masla

Maslo určené na komerčné účely je vyrábané z pasterizovanej smotany. Práve

smotana je hlavným zdrojom mikroorganizmov v masle. Všeobecne sú pasterizáciou

smotany zničené G- mikroorganizmy, kvasinky a plesne. Avšak psychrotrofné

mikroorganizmy ako Bacillus a Clostridium tieto teploty prežijú. Rovnako aj niektoré

kmene Lactobacillus a Enterococcus. Pasterizačné teploty dokáže prežiť aj Mycobacterium

paratuberculosis. Ak sa maslo vyrába z nepasterizovanej smotany môže obsahovať

S. aureus, Brucella abortus, Streptococcus agalactiae a Streptococcus pyogenes (Budhkar

et al., 2014).

Problémy s rozvojom mikroorganizmov v masle spočívajú najmä

v postpasterizačnou neopatrnosťou pri skladovaní masla. Maslo je skladované pri nízkych

teplotách a to menej ako 10 °C. Je to teplota nevyhovujúca pre väčšinu mikroorganizmov.

Psychrotrofné mikroorganizmy však tieto teploty prežívajú. Rovnako aj nadmerná vlhkosť

v sklade a priepustné obaly môžu spôsobovať rast psychrotrofných mikroorganizmov na

povrchu masla. Všetky druhy rodu Pseudomonas izolované z masla patria medzi tieto

patogény (Fernandes, 2009).

28

Maslo vyrobené z pasterizovanej smotany podlieha hydrolytickému žltnutiu ľahšie,

ako to, ktoré je vyrobené z kyslej smotany. Môžu v ňom však rásť kvasinky ako Yarowia

lipolytica, Torulopsis, Cryptococcus a Rhodotorula, ktoré obľubujú nízke pH.

V nesolenom masle sú typickými patogénmi E. coli, L. monocytogenes a Salmonella spp.

V balených aj nebalených maslách sa bežne vyskytujú druhy kvasinky z rodu Candida,

a to najmä C. kefyr (Fernandes, 2009).

1.7 Antibiotiká

1.7.1 Z histórie vývoja antibiotík

Moderná éra používania antibiotík začala objavením penicilínu Alexandrom

Flemingom v roku 1928. Od tej doby dokázali antibiotiká pretransformovať modernú

medicínu a zachrániť milióny životov. Po prvý raz boli predpísané v liečbe závažných

infekcií v roku 1940. Penicilín sa tak stal úspešným počas druhej svetovej vojny. Avšak

od roku 1950 bola liečba náročnejšia, pretože mikroorganizmy sa proti nim stávali

rezistentnými. A tak všetky pokroky v liečbe bakteriálnych infekcií sa počas poslednej

dekády stali ohrozenými (Sengupta et al., 2013).

Reakciou na vznikajúcu rezistenciu proti penicilínu bol objav nových β-laktámových

antibiotík, ktorým sa aspoň na chvíľu podarilo obnoviť dôveru v zavedenie antibiotík

do liečby. Po určitej dobe bol zaznamenaný prípad rezistencie baktérie S. aureus na

methicilín v Spojených štátoch amerických a vo Veľkej Británii. Bohužiaľ rezistencia

začala byť pozorovaná takmer u všetkých antibiotík, ktoré boli doteraz vyvinuté. Neskôr

bol do praxe zavedený vankomycín ako možná liečba rezistencie na methicilín. Avšak aj

v tomto prípade boli hlásené prípady rezistencie (Sengupta et al., 2013).

Na konci roku 1960 bolo vo farmaceutickom priemysle vyprodukovaných množstvo

nových antibiotík, ktoré by dokázali riešiť situácie rezistencie na tieto liečivá. Postupom

času však produkcia poklesla. Od roku 2015 po mnohých desiatkach rokov od prvého

pacienta liečeného antibiotikami je možné hovoriť, že antibiotiká sa stávajú hrozbou

ľudstva (Spellberg a Gilbert, 2014).

1.7.2 Definícia antibiotík

Antibiotiká sú prírodné zlúčeniny, ktoré produkujú mikroorganizmy a to baktérie,

huby, ale aj aktinomycéty. Za hlavné zdroje antibiotík sa považujú rody Penicillium,

Streptomyces, Actinomycetes a Bacillus (Bbosa et al., 2014).

29

Ich účinok spočíva v selektívnom potláčaní rastu a vývoja mikroorganizmov.

Mechanizmom účinku spôsobujú usmrtenie baktérií a teda majú baktericídny účinok alebo

inhibujú ich rast, čo znamená, že majú účinok bakteriostatický. Sú najčastejšie

používanými liečivami pri liečbe bakteriálnych infekcií na celom svete. Ich vývoj mal

slúžiť k vyhubeniu ochorení, ktoré vo veľkom ničili ľudstvo (Walsh, 2003).

Vývoj antibiotík a ich zavedenie do praxe má niekoľko výhod. Okrem skutočnosti,

že slúžia na záchranu životov mnohých pacientov, ich kľúčová úloha spočíva v dosahovaní

pokrokov v medicíne a chirurgii. Majú preventívne a liečebné účinky u ľudí, ktorí

dostávajú chemoterapiu, u ľudí trpiacich nejakým chronickým ochorením ako je napr.

diabetes. Slúžia ako účinná liečba v konečných štádiách ochorení obličiek, alebo počas

reumatoidnej artritídy. Aplikujú sa pacientom, ktorí sú po zložitých chirurgických

zákrokoch a to po transplantáciách orgánov a implantáciách kĺbových náhrad (Sengupta et

al., 2013).

Okrem toho, že antibiotiká sa používajú na liečbu ochorení u ľudí, majú svoje

opodstatnenie aj v poľnohospodárskej prvovýrobe. Počty zvierat spoločne ustajnených

v maštaliach sa neustále zvyšujú. Živočíšna výroba je stále intenzívnejšia. Množstvo

patogénov, ktoré prispievajú k šíreniu infekčných pôvodcov, tak rýchlo narastá.

V dôsledku týchto skutočností je potrebné využívať agresívne stratégie na riadenie infekcií

u zvierat. V tomto smere sa využíva antibiotická terapia (Landers et al., 2012).

Antibiotiká sa pridávali do krmiva zvierat z niekoľkých dôvodov. Používali sa na

liečbu klinických ochorení, na prevenciu vzniku ochorení a na podporu rastu zvierat. Mohli

byť aplikované na liečbu jedného zvieraťa alebo na veľkú skupinu zvierat. Napr. 16 %

všetkých dojníc v Spojených štátoch amerických liečených na mastitídu dostávalo

antibiotickú terapiu. Avšak takmer všetky dojnice dostávali vnútro vemenné infúzie

s obsahom antibiotika s ochranným účinkom, ktoré slúžili ako prevencia a kontrola

možných mastitíd. Používali sa predovšetkým penicilíny, cefalosporíny, ale aj iné

β-laktámové antibiotiká (Landers et al., 2012).

Aplikácia antibiotík sa uskutočňuje aj inými spôsobmi. Môžu byť podávané vo

forme tekutiny – vody alebo injekcie, pridávajú sa do krmiva, aplikujú sa orálne alebo

formou pasty. Mnohé z nich sú v tráviacom trakte zvierat veľmi zle absorbované, čo má

za následok 30 až 90 % vylúčenie pôvodnej zlúčeniny. Do prostredia prenikajú rôznymi

spôsobmi, a to prostredníctvom výrobnej činnosti, ako súčasť nespotrebovaných

a expirovaných zlúčenín, exkrementov zvierat, ktoré sa potom používajú na hnojenie

30

pôdy. Rezíduá antibiotík tak môžu preniknúť do povrchových a následne podzemných vôd,

čo môže podporiť rozvoj antibiotickej rezistencie mikroorganizmov. Približne 90-95 %

kmeňov S. aureus je rezistentných na penicilín (Sarmah et al., 2006).

Rôzne antibiotiká pôsobia na baktérie rôznym spôsobom. Niektoré pôsobia cielene

na bunkovú stenu, iné na bunkové membrány a ďalšie na bunkový metabolizmus baktérií.

Existuje viacero mechanizmov účinku antibiotík na baktérie. Niektoré inhibujú syntézu

bunkovej steny, ako napr. betalaktámové antibiotiká. Iné narúšajú funkciu bunkovej

membrány alebo inhibujú syntézu proteínov, inhibujú syntézu nukleových kyselín ako

DNA tak aj RNA. Ďalšie zase inhibujú intermediárny metabolizmus (Vittek, 2008).

Najnovšie výskumy dokazujú, že používanie antibiotík môže mať negatívny účinok

na ľudský mikrobióm. Je to označenie hromadného genómu všetkých mikróbov,

(mikroflóry alebo mikrobiálnej flóry), ktoré žijú na povrchu alebo vo vnútri ľudského tela.

Výskumy preukázali, že antibiotiká môžu spôsobovať nerovnováhu v kvalite a kvantite

mikroflóry, a tak ovplyvniť imunitu hostiteľa. Štúdie na novorodencoch preukázali

stimuláciu imunitnej odpovede na základe ovplyvňovania ich mikroflóry a zvýšenia

koncentrácie neutrofilov (Glick, 2016).

Rovnako môže používanie antibiotík znížiť tiež funkciu mikrobiómov, a tak zvýšiť

sklon k vzniku imunitne regulovaných ochorení. Modifikácia mikrobiómu je spojená

so vznikom obezity 1. a 2. typu. Opakované užívanie antibiotík je rovnako spojené

so vznikom rakoviny. Pozitívnou je skutočnosť, že ak sa dobre preskúma črevná

mikroflóra umožní sa tak vzniku nových liečebných stratégií zahŕňajúc probiotiká

a prebiotiká (Glick, 2016).

Mnohé antibiotiká sú chemicky príbuzné, a tak sa rozdeľujú do tried. Aj keď majú

podobné štruktúrne a funkčné vlastnosti, sú medzi nimi rozdiely vo farmakológii

a v spektre aktivity. Antibiotiká sa delia podľa mechanizmu účinku na niekoľko skupín

(Vittek, 2008).

1.8 Mechanizmy pôsobenia antibiotík

Cielené pôsobenie antibiotík a ich príslušné priame účinky sú všeobecne dobre

známe. Usmrtenie bunky je však zložitý proces, ktorý začína fyzikálnymi interakciami

medzi molekulami antibiotika a pokračuje ich špecifickým cieľovým účinkom v baktérii.

Dochádza ku zmenám postihnutých baktérií na biochemickej, molekulárnej

a ultraštrukturálnej úrovni. Existuje niekoľko mechanizmov, na základe ktorých antibiotiká

usmrcujú bakteriálnu bunku (Kohanski et al., 2010).

31

Antibiotiká sa na základe mechanizmu účinku rozdeľujú do týchto skupín:

- antibiotiká inhibujúce syntézu bakteriálnej bunkovej steny,

- antibiotiká ovplyvňujúce funkciu cytoplazmatickej membrány,

- antibiotiká inhibujúce syntézu proteínov,

- antibiotiká, ktoré blokujú dôležité metabolické procesy,

- antibiotiká inhibujúce syntézu nukleových kyselín (Soares et al., 2012).

Pôsobenie antibiotík a teda ich mechanizmy účinku môžu byť klasifikované

na základe bunkových komponentov alebo systémov, ktoré ovplyvňujú. Mechanizmom

účinku antibiotík môže nastať smrť bunky, a teda účinok je baktericídny alebo dochádza

len k inhibícii rastu buniek, a tak je ich pôsobenie baktericídne. Ťažiskom pôsobenia

antibiotík je DNA, RNA, bunková stena a proteosyntéza (Walsh, 2003).

Účinok bakteriostatických antibiotík je zameraný hlavne na ribozomálnu syntézu

bielkovín. Do tejto skupiny antibiotík patria tetracyklíny, aminoglykozidy, makrolidové

antibiotiká a chloramfenikol (Kohanski et al., 2010).

Skupinu baktericídnych antibiotík zastupujú β-laktámové antibiotiká,

fluorochinolóny a aminoglykozidové antibiotiká. Rifamycíny patria do skupiny

bakteriostatických aj baktericídnych antibiotík. Baktericídny účinok fluorochinolónov

spočíva v poškodení vlákien DNA naviazaním liečiva na enzýmy. Niektoré štúdie

poukazujú nato, že u G+ baktérií je cieľovým enzýmom topoizomeráza IV a u G- baktérií je

primárnym cieľom enzým topoizomeráza II. Fluorochinolóny sa dokážu naviazať na

topoizomerázy, vytvoriť komplex a rozštiepiť DNA. Dochádza k tvorbe zlomov na

dvojvláknovej DNA a k odumretiu buniek, ktoré sú buď závislé alebo nezávislé na syntéze

proteínov. Podstatnú úlohu v usmrtení bunky sprostredkovanej fluorochinolónmi zohráva

aj expresia proteínov (Rubinstein, 2001).

β-laktámové antibiotiká inhibujú transpeptidáciu peptidoglykánových reťazcov

väzbou na penicilín viažuce proteíny. Dochádza k autolýze bunkovej steny, následne

k lýze, a v konečnom dôsledku k usmrteniu bunky. Aminoglykozidy pôsobia tak, že sa

viažu na 30S podjednotku ribozómu a spôsobujú nesprávne začlenenie aminokyselín

do postupne sa predlžujúcich peptidov. Dochádza k tvorbe proteínov s nesprávnou

konformáciou. Ak sa takéto proteíny začlenia do bunkového obalu vedie to k vyššiemu

príjmu lieku. Toto spolu so zvýšenou väzbou ribozómov vedie k bunkovej smrti (Kohanski

et al., 2010).

32

Inhibícia RNA syntézy rifamycínovými antibiotikami má podobne ako inhibícia

DNA syntézy katastrofický efekt na metabolizmus nukleových kyselín a je účinným

prostriedkom, ktorý dokáže vyvolať usmrtenie bakteriálnej bunky. Rifamycíny sa

vyznačujú baktericídnym, čiže usmrcujúcim účinkom na G+ baktérie, ale pri G- baktériách

inhibujú rast baktérií, a teda pôsobia bakteriostaticky. Patria k prvej línii antibiotík, ktoré

sa používajú ako účinná terapia proti mykobaktériám. Z dôvodu rýchleho nárastu

antibiotickej rezistencie sa častejšie používajú ako súčasť kombinovanej terapie (Campbel

et al., 2001).

1.8.1 Antibiotiká inhibujúce syntézu bakteriálnej bunky

Bakteriálna bunka je tvorená vrstvami peptidoglykánu, ktorý sa inak nazýva aj

mureín. Ide o kovalentne zosieťovanú štruktúru, ktorej mechanická pevnosť je veľmi

dôležitá na to, aby baktérie dokázali prežiť v podmienkach životného prostredia, ktoré

môžu byť narušené vysokým osmotickým tlakom. Ak sa tak stane, dochádza k bunkovej

lýze a k usmrteniu bunky (Kohanski et al., 2010).

Do kategórie antibiotík inhibujúcich syntézu bakteriálnej bunky patria penicilíny

a ostatné β-laktámové antibiotiká, glykopeptidové antibiotiká a polypeptidové antibiotiká,

ale aj iné tvorené zložitou štruktúrou (Park a Uehara, 2008).

Penicilíny spolu s ostatnými β-laktámovými antibiotikami patria do skupiny

baktericídnych antibiotík. Ich mechanizmom je bakteriálnu bunku usmrtiť inhibíciou

syntézy peptidoglykánu. Penicilíny prostredníctvom β-laktámového kruhu inhibujú

množstvo enzýmov podieľajúcich sa na včleňovaní monomerických stavebných blokov

do stavebných blokov polyméru, čo je dôležitým krokom pri syntéze bunkovej steny.

Vo všeobecnosti sa tieto enzýmy nazývajú penicillin binding proteins (PBPs), čo sú vlastne

transpeptidázy. Inhibíciou enzýmov nedochádza k tvorbe nových peptidoglykánových

reťazcov, ani k ich zosieťovaniu. Dochádza k lýze bunky, pretože osmotický tlak vo vnútri

bunky je veľmi vysoký. Nakoniec bakteriálna bunka hynie (Park a Uehara, 2008).

β-laktámové a glykopeptidové antibiotiká sú skupiny zasahujúce do jednotlivých

krokov syntézy bunkovej steny, a tak narúšajú jej homeostázu. Liečba infekcií inhibítormi

syntézy bunkovej steny môže viesť k zmene tvaru a veľkosti bunky, navodzuje reakcie

bunky na stres a v konečnom dôsledku vyvolá lýzu bunky (Kohanski et al., 2010).

Glykopeptidové antibiotiká pôsobia cielene na G+ baktérie naviazaním sa

na acyl-D-alanyl-D-alanín, ktorý tvorí koncovú časť rastúceho peptidoglykánu

nachádzajúcu sa na vonkajšej strane cytoplazmatickej membrány (Binda et al., 2014).

33

Medzi antibiotiká inhibujúce syntézu bunkovej steny patria aj tie, ktoré viažu

stavebný blok bunkovej steny lipid II. Lipid II. je tzv. achillovou pätou pre mechanizmus

účinku antibiotík. Tvorí ho baktoprenol, ktorý pozostáva z kyseliny N acetyl murámovej,

disacharidových jednotiek, 11 izoprénových jednotiek a N acetyl glukozamínu. Antibiotiká

viažuce lipid II blokujú priebeh transglykozilačných a traspeptidačných reakcií (Breukink

a de Kruijff, 2006).

Medzi inhibítory syntézy bunkovej steny patrí aj polypeptidové antibiotikum

polymyxín. Presný mechanizmus pôsobenia týchto antibiotík nie je celkom známy

a konečný. Na základe uskutočnených biofyzikálnych štúdií bolo navrhnutých niekoľko

modelov mechanizmu účinku. Všeobecne však prevláda názor, že polymyxíny sú

membránovo povrchovo aktívne a ich cieľovým miestom pôsobenia vo vonkajšej

membráne G- baktérií je lipid A (Velkov et al., 2013).

Polymyxíny sprostredkúvajú fúziu vnútorných častí vonkajšej membrány

a vonkajšej časti cytoplazmatickej membrány obklopujúcej periplazmatický priestor, čo

indukuje výmenu fosfolipidov a osmotickú nerovnováhu, ktorá končí bunkovou smrťou

(Velkov et al., 2013).

1.8.2 Antibiotiká inhibujúce bunkovú proteosyntézu

Antibiotiká inhibujúce syntézu bunkových bielkovín sa rozdeľujú na 2 skupiny. Tie,

ktoré ovplyvňujú 30S podjednotku ribozómu sú aminoglykozidy a tetracyklíny.

Antibiotiká zasahujúce do 50S podjednotky ribozómu sú chloramfenikol, makrolidy

a linkozamidy (Kohanski et al., 2010).

Antibiotiká inhibujúce bunkovú proteosyntézu naviazaním sa na 30S podjednotku

ribozómu ako sú tetracyklíny zabraňujú naviazaniu enzýmu aminoacyltRNA syntetázy

do A miesta ribozómu. Preruší sa tak tvorba iniciačného komplexu potrebného

pre bunkovú proteosyntézu, ktorá nemôže ďalej prebiehať a zastaví sa (Soares et al., 2012).

Inhibítory 50S podjednotky ribozómu pracujú mechanizmom fyzického blokovania

iniciácie proteínovej translácie, čím dochádza k inhibícii enzýmu peptidyltransferázy

a zabraňuje sa predlžovaniu peptidového reťazca (Kohanski et al., 2010).

Mechanizmus účinku aminoglykozidových antibiotík kanamycínu, streptomycínu

a gentamycínu spočíva v naviazaní sa na 16S rRNA čo je vlastne zložka 30S podjednotky

ribozómu. Antikodón tRNA nie je schopný naviazať sa, a tak dochádza k inhibícii

translácie. Je to trieda antibiotík, ktorej mechanizmus je založený na chybnom preložení

34

proteínov začlenením nevhodnej aminokyseliny do rastúceho polypeptidového reťazca.

Tieto vlastnosti sú typické pre usmrtenie bunky (Gualerzi et al., 2014).

Chloramfenikol účinkuje naviazaním sa na 50S podjednotku ribozómu,

čím dochádza k inhibícii funkcie enzýmu peptidyltransferázy, ktorý katalyzuje tvorbu

peptidovej väzby medzi aminokyselinou a polypeptidovým reťazcom (Zuorro, 2014).

Makrolidové a linkozamidové antibiotiká inhibujú syntézu proteínov naviazaním sa

na 50S podjednotku ribozómu. Avšak ich skutočný mechanizmus bol popísaný až

nedávno. Štruktúra makrolidov je tvorená 12 až 16 členným laktónovým kruhom

a nadväzovanými cukrami. Mechanizmus účinku je úzko spätý s ich štruktúrou. Makrolidy

bránia v predlžovaní polypeptidového reťazca väzbou na akýsi tunel, ktorý je súčasťou

50S podjednotky ribozómu. Výsledkom je hromadenie toxických peptidyltransferáz veľkej

podjednotky ribozómu (Poulsen et al., 2000).

1.8.3 Antibiotiká ovplyvňujúce priepustnosť membrány

Bunkové membrány baktérií sú zaujímavejším cieľovým miestom účinku

antibiotika ako intracelulárne priestory. V zásade je to spôsobené tým, že sú viac

vystavované okolitému prostrediu a sú dostupnejšie. Avšak len málo antibiotík, ktoré

využívajú mechanizmus ovplyvňovania priepustnosti membrány je dostatočne

selektívnych pri liečbe bakteriálnej infekcie. G- baktérie sú vo väčšine prípadov odolné

k antibiotikám, ktoré pôsobia týmto mechanizmom účinku (Gill et al., 2015).

Hlavnou zložkou vonkajšej membrány G- baktérií je lipopolysacharid. Antibiotikum,

ktoré dokáže vonkajšiu membránu G- baktérií narušiť je polymyxín B. Patrí do skupiny

lipopeptidových antibiotík a je produkovaný G+ baktériou Bacillus polymyxa (Velkov et

al., 2013).

Daptomycín je lipopeptidové antibiotikum produkované pôdnou baktériou

Streptomyces roseosporus. Účinkuje len na G+ baktérie, pretože vonkajšou membránou

G- bakérií nedokáže preniknúť. Mechanizmus účinku daptomycínu spočíva vo väzbe

na cytoplazmatickú membránu, čo následne vedie k depolarizácii membránového

potenciálu. V bakteriálnej bunke tak dochádza k narušeniu základných procesov (Zhang et

al., 2014).

Telavancín, ktorý bol nedávno objavený patrí medzi lipoglykopeptidové antibiotiká

s dvojitým mechanizmom účinku. Okrem inhibície bakteriálnej bunkovej membrány,

ovplyvňuje aj funkčnosť cytoplazmatickej membrány. Používa sa na liečbu

nozokomiálnych pneumónií (Nannini, 2012).

35

1.8.4 Antibiotiká inhibujúce syntézu nukleových kyselín

Do jednotlivých fáz tvorby nukleových kyselín DNA a RNA zasahujú niektoré

antibiotiká, ktoré na syntézu pôsobia inhibične. Do tejto skupiny antibiotík patrí rifampicín

a chinolóny (Gualerzi et al., 2014).

Chinolóny veľmi úspešne zasahujú a inhibujú DNA gyrázu. Mechanizmus

pôsobenia chinolónov je zameraný na špecifickú inhibíciu reakcií DNA gyrázy ako je

superšpiralizácia a rozpletanie DNA s následným poškodením. Pre antibiotiká je DNA

gyráza veľmi zaujímavým cieľovým miestom (Collin et al., 2011).

Medzi inhibítory syntézy RNA patrí semisyntetické baktericídne antibiotikum

rifampicín. Mechanizmus účinku spočíva v inhibícii syntézy mRNA polymerázy, ktorá je

závislá na DNA. Rifampicín začína účinkovať ešte predtým, ako dochádza ku samotnej

transkripcii (Campbell, 2001).

1.8.5 Antibiotiká blokujúce dôležité metabolické procesy

Do tejto skupiny patrí trimetoprim a sulfonamidy, ktoré zasahujú do metabolizmu

kyseliny listovej v bakteriálnej bunke kompetitívnou inhibíciou biosyntézy

tetrahydrofolátu. Úlohou tetrahydrofolátu je zabezpečovať transport fragmentov uhlíka,

ktoré sú potrebné pre syntézu proteínov a nukleových kyselín DNA a RNA v bunkovej

stene baktérií (Liwa a Jaka, 2015).

Pre väčšinu organizmov je syntéza kyseliny listovej dôležitá. Avšak niektoré

organizmy dokážu jej syntézu obísť svojou schopnosťou používať exogénny tymidín.

Mechanizmus účinku sulfonamidov je založený na kompetitívnej inhibícii konverzie

pteridínu a kyseliny para aminobenzoovej (PABA) na kyselinu dihydrolistovú

(dihydrofolát). Sulfonamidy sú charakteristické vyššiou afinitou pre pteridín syntetázu ako

PABA. Trimetoprim inhibuje syntézu tetrahydrofolátu naväzovaním sa na enzým

dihydrofolátreduktázu. K tomuto enzýmu má obrovskú afinitu (Liwa a Jaka, 2015).

1.9 Antibiotická rezistencia

Čoraz väčším globálnym problémom sa stávajú baktérie, ktoré sú odolné voči

antibiotikám. Je veľmi náročné proti rezistencii bojovať. Súčasné urýchlenie negatívneho

vývoja antibiotickej rezistencie ukazuje, že len účelné a uvážlivé používanie antibiotík je

spôsob ako spomaliť stúpajúci nárast rezistencie. Aby sa stalo predpisovanie antibiotík

skutočne účelným, je potrebné poznať mechanizmy rezistencie baktérií a mať čo najlepšie

poznatky o citlivosti jednotlivých pôvodcov infekcií (Nikš et al., 2006).

36

Za potrebné sa pokladá preštudovanie problematiky antibiotickej rezistencie u ľudí

a zvierat. Na základe čoho bude možné vykonávať kontrolné opatrenia pri použití

antibiotík a zabezpečiť prevenciu v šírení multirezistentných kmeňov baktérií. Znížená

citlivosť proti antibiotikám je zakódovaná vo viacerých génov, z ktorých mnohé sú

prenášané medzi baktériami (Zouhairi et al., 2010).

Stále častejšie sú popisované nové mechanizmy rezistencie proti antibiotikám a nové

gény a vektory prenosu týchto mechanizmov. Najväčšou hrozbou pre ľudí vôbec je prudký

nárast infekcií vyvolaných multirezistentnými baktériami. Nekontrolované používanie

antibiotík v liečbe ochorení v prostredí vedie k neustálemu zvyšovaniu miery rezistencie

na ne. Medzi mikroorganizmy, ktoré podliehajú rezistencii veľmi rýchlo patrí určite

S. aureus (Zouhairi et al., 2010).

Okrem existujúcej rezistencii na antibiotiká, je v súčasnosti veľkým problém aj

nedostatok nových antibiotík. Rezistencia môže byť prirodzená, ale aj získaná. Získať

rezistenciu je možné mutáciou génov na bakteriálnom chromozóme alebo získaním génov

od inej bakteriálnej bunky, tzv. transferom génov prostredníctvom transdukcie, konjugácie

alebo transformácie. Prirodzená rezistencia bakteriálnych druhov na konkrétne antibiotiká,

je schopnosť baktérií odolávať im svojou vlastnou štruktúrnou a funkčnou

charakteristikou. Príkladom môže byť lipopeptid daptomycín, ktorý vykazuje účinnosť

proti G+ baktériám, ale G- baktérie sú proti nemu odolné (Blair et al., 2015).

1.9.1 Modifikácia cieľového miesta

Interakcia medzi antimikrobiálnou látkou a jej cieľovým miestom je veľmi

špecifická. Aj najmenšia modifikácia cieľového miesta môže ovplyvniť väzbu antibiotika

na svoj cieľ (Giedraitien et al., 2011).

Väčšina antibiotík sa na svoj cieľ naviaže vysokou afinitou a zabráni tak

normálnemu fungovaniu cieľového miesta. Avšak v niektorých prípadoch mu modifikácie

stále umožňujú vykonávať bežné činnosti, ak sa dokáže u neho rozvinúť rezistencia (Blair

et al., 2015).

Z β-laktámových antibiotík tento typ rezistencie využíva S. pneumoniae, u ktorého

dochádza ku modifikácii penicilín viažucich proteínov, čo sa prejavuje zníženou afinitou

na naviazanie antibiotika (Nagai et al., 2002).

Niektoré mikróby vďaka mutačným zmenám cieľového miesta dokážu odolávať

účinku antibiotika. Ide o prípad rezistencie stafylokokov na oxacilín, ktorý patrí

do kategórie β-laktámových antibiotík. Rezistencia je založená na mutačných zmenách

37

v pôvodných penicilín viažucich proteínoch a na získaní rôznych PBP, na ktoré antibiotiká

nie sú schopné naviazať sa (Bbosa et al., 2014).

Tento typ rezistencie je dobre popísaný aj pri baktériách rezistentných

na aminoglykozidové antibiotikum streptomycín a makrolidové antibiotikum erytromycín.

Obe antibiotiká účinkujú nadväzovaním na ribozóm a inhibíciou proteosyntézy buniek

baktérií. Modifikáciou proteínu S12, ktorý je súčasťou 30S podjednotky ribozómu sa stane

ribozóm necitlivý na účinok streptomycínu. Pri rezistencii na erytromycín je mechanizmus

účinku založený na mutácii L4 a L12 proteínov tvoriacich súčasť 50S podjednotky

bakteriálneho ribozómu (Sengupta et al., 2013).

Rezistencia proti rifampicínu funguje mechanizmom modifikácie cieľového miesta.

Účinok tohto antibiotika spočíva vo väzbe na β-podjednotku enzýmu RNA polymerázy

a v inhibícii jeho aktivity. Avšak pri rezistencii baktérie Mycobacterium tuberculosis sa

β-podjednotka enzýmu modifikuje a zabráni sa tak správnemu účinku rifampicínu

(Sengupta et al., 2013).

Pri chinolónoch (fluorochinolónov) dochádza k zmene podjednotky enzýmu DNA

gyrázy čo ovplyvňuje schopnosť chinolónov naviazať tento enzým a zasahovať do činností

DNA. Rovnako tiež dochádza k zmene enzýmu topoizomerázy IV. Ak ide o prvý zásah

do štruktúry cieľových enzýmov, označuje sa tento pojem ako primárna mutácia.

Pri sekundárnej mutácii dochádza k zvýšeniu bakteriálnej rezistencie na fluorochinolóny.

Tento mechanizmus vzniku rezistencie je najlepšie popísaný u druhov S. aureus a E. coli.

Vyskytuje sa aj u druhov Klebsiella pneumoniae a Camphylobacter jejuni (Hanulík et al.,

2010).

Aminoglykozidové antibiotiká účinkujú nadväzovaním na podjednotky

bakteriálneho ribozómu, a tak v nich inhibujú syntézu proteínov. Avšak mechanizmus

rezistencie proti aminoglykozidom je zameraný na modifikáciu cieľových ribozómov

metyláciou. Gény kódujúce enzýmy zodpovedné za tento mechanizmus rezistencie boli

detegované v bakteriálnych patogénoch čeľade Enterobacteriaceae a to armA a rmt gény

kódujúce metyltransferázu (Fritsche et al., 2008).

Lipopeptidové antibiotikum daptomycín, ktoré sa zameriava na aniónové fosfolipy

cytoplazmatickej membrány gram- baktérií dokáže inkorporovať do membrány a spôsobiť

depolarizáciu a stratu vnútrobunkového obsahu. S. aureus sa však stal rezistentným proti

daptomycínu. Bodová mutácia mprF proteínu, ktorý tvorí súčasť aniónových fosfolipidov

38

vedie k remodelácii obsahu fosfolipidov v membráne, a zmene membránového potenciálu.

Výsledkom je sťažená väzba daptomycínu na bakteriálnu bunku (Blake a Neill, 2013).

1.9.2 Inaktivácia účinkom enzýmov

Enzymaticky katalizovaná modifikácia antibiotika je hlavným mechanizmom

antibiotickej rezistencie. Na rozdiel od ostatných mechanizmov sa týka liekov s podobnou

štruktúrou. Medzi hlavné enzýmy podieľajúce sa na inaktivácii antimikrobiálnych látok

patria β-laktamázy, enzýmy modifikujúce aminoglykozidy a acetyltransferázy

modifikujúce chloramfenikol (Liwa a Jaka, 2015).

V rámci rezistencie sú najvýznamnejšie β-laktamázy produkované

gram-baktériami, ktoré sú kódované na chromozómoch a plazmidoch. Β-laktamázy

inhibujú takmer všetky β-laktámové antibiotiká obsahujúce vo svojich štruktúrach esterové

a amidové väzby. Patria sem penicilíny, cefalosporíny, karbapenémy a monobaktámy

(Liwa a Jaka, 2015).

Rezistencia proti β-laktámovým antibiotikám spočíva v zničení β laktámového

kruhu práve prostredníctvom produkcie β-laktamáz. Antibiotiká strácajú schopnosť

naviazať sa na penicilín viažuce proteíny, vďaka ktorým dochádzalo k inhibícii syntézy

bunkovej steny. Takýto mechanizmus rezistencie využíva S. aureus a rôzne druhy z čeľade

Enterobacteriaceae, ktoré sú rezistentné na penicilín, ale aj cefalosporín (Brook, 2004).

V poslednom období je produkcia širokospektrálnej betalaktamázy čoraz

rozšírenejšia medzi jednotlivými kmeňmi baktérií. Najväčší výskyt zaznamenala v čeľadi

Enterobacteriaceae. Enzým je označovaný skratkou ESBL-Extended-Spectrum

Beta-Lactamase. Považuje sa za hlavný dôvod rezistencie na aztreonam

a oxyiminocefalosporíny. Najčastejším producentom ESBL sú G- baktérie a to E. coli a K.

pneumoniae. Za rozšírenie ESBL zodpovedajú plazmidy (Turner, 2005).

Štruktúra širokospektrálnych karbapeménových antibiotík tvorená substitúciou

atómu síry v polohe 1 atómom uhlíka je veľmi pevná, a účinne odoláva pôsobeniu

β-laktamázových enzýmov. Avšak β-laktamázy skupiny b dokážu karbapenémy

hydrolyzovať. K tomu, aby bol ich účinok dostatočný proti karbapenémom, vyžadujú

dvojmocné katióny zinku (Dale-Skinner a Bonev, 2009).

Rezistencia G- baktérií proti aminoglykozidovým antibiotikám môže byť

prirodzená a získaná. Burkholderia cepacia má v sebe prirodzene zakódovanú rezistenciu

na aminoglykozidy. Získaná rezistencia je typická pre E. coli, P. aeruginosa

a K. pneumoniae. Tento typ rezistencie je mnohokrát kódovaný génmi s miestom

39

lokalizácie na plazmidoch. Pri aminoglykozidoch sa najčastejšie uplatňuje enzymatická

inaktivácia prostredníctvom adenylácie, acetylácie a fosforylácie (Avent et al., 2011).

Pri chloramfenikole je mechanizmus rezistencie založený na prítomnosti enzýmu

acetyltransferázy, ktorá účinne inhibuje antibiotický účinok chloramfenikolu. Všetky

acetyltransferázy prenášajú do pozície 3 na chloramfenikole acetylovú skupinu čo vedie

k jeho inhibícii (Roberts a Schwarz, 2009).

Tet(x) gén kóduje enzým, ktorý modifikuje a inaktivuje tetracyklínové antibiotiká

vrátane tigecyklínu. Pre svoje fungovanie potrebuje prítomnosť kyslíka. Avšak izolovaný

bol z rodu Bacteroides, ktorý patrí medzi striktné anaeróby. Nepredpokladá sa preto,

že funkcia tet(x) prebieha v jeho prirodzenom hostiteľovi. Okrem kyslíka vyžaduje pre

svoje fungovanie aj NADPH (Roberts a Schwarz, 2009).

1.9.3 Redukcia priepustnosti membrány

Vnútorná membrána G- baktérii je pre antibiotiká menej priepustná ako tá pri G+. Je

to zapríčinené jej pevnou povahou, ktorú si zabezpečuje vďaka vonkajšej vrstve

obsahujúcej lipid A a vnútornej vrstve pozostávajúcej z fosfolipidov (Liwa a Jaka, 2015).

Vonkajšia membrána vytvára akúsi semipermeabilnú bariéru, ktorou hydrofilné

antibiotiká laktámy a chinolóny dokážu preniknúť len prostredníctvom porínových

proteínov. Pre E. coli z čeľade Enterobacteriaceae sú hlavnými porínmi OmpF a OmpC.

Antibiotická rezistencia nastane zmenou funkcie a aktivity týchto porínov (Nordmann et

al., 2012).

Zmena aktivity porínov zahŕňa zmenu polohy, zníženú expresiu a mutáciu kanála

proteínových porínov, čo v konečnom dôsledku vedie k strate citlivosti na antibiotiká

(Nordmann et al., 2012).

Na rozdiel od divokých kmeňov baktérií, ktoré antibiotiká tolerujú, vznik mutantov

a následných mutácii redukuje permeabilitu membrány a vedie k rezistencii. Príkladom je

Neisseria gonorrhoea, ktorá je pôvodcom pohlavne prenosnej choroby kvapavky. Zníženú

citlivosť na antibiotiká môže získať mutačnými zmenami génov, ktoré kódujú

membránové proteíny-poríny. V jej prípade ide o inhibíciu prenikania tetracyklínových

a penicilínových antibiotík do bunky, v dôsledku čoho sa stáva imúnnou voči ich účinku

(Sengupta et al., 2013).

V prípade lipopeptidového antibiotika daptomycínu je rezistencia voči nemu

spôsobená vnútornými rozdielmi v zložení cytoplazmatickej membrány, ktorá je pri G-

baktériách tvorená nižším podielom aniónových fosfolipidov, pokiaľ pri G+ je ich počet

40

vyšší. Pri G+ baktériách je tak redukovaná účinnosť vápenatých iónov, ktoré

sprostredkúvajú správne zacielenie daptomycínu do cytoplazmatickej membrány, ktorá

zabezpečuje jeho antibakteriálnu aktivitu (Randal et al., 2013).

Mechanizmus zmeny priepustnosti membrány sa uplatňuje aj pri

fluorochinolónoch. Zníženie koncentrácie antibiotika v bakteriálnych bunkách sa

zabezpečí redukciou počtu porínov v bakteriálnej stene (Hanulík et al., 2010).

1.9.4 Aktívny eflux z bunky

Bakteriálne efluxné pumpy sú transportéry závislé od energie. Vypudzujú rôzne

toxické zlúčeniny zahŕňajúc antimikrobiálne látky von z bunky. Aktívny eflux je jeden

z hlavných mechanizmov, ktorým patogény dokážu odolávať účinku antibiotík (Liwa

a Jaka, 2015).

Efluxné pumpy prispievajú zásadným spôsobom k ochrane G- baktérií

pred účinkom antibiotík používaných v liečbe infekcií vyvolaných G+ baktériami.

Pozostávajú z troch častí, a to z vlastnej pumpy lokalizovanej vo vnútornej membráne,

z porínu a adaptérového proteínu vo vonkajšej membráne. Adaptérový proteín udržiava

celý komplex spolu (Blair et al., 2015).

Tet pumpy sú transportéry špecifické pre jeden substrát. Iné zase transportujú pestrú

škálu štrukturálne odlišných substrátov (fluorochinolóny, tetracyklíny a makrolidy). Takéto

efluxné pumpy sú známe pod názvom multidrug resistance (MDR) efluxné pumpy

na základe schopnosti prispievať k mnohopočetnej liekovej rezistencii (Giedraitien et al.,

2011).

Zodpovednosť za rezistenciu voči fluorochinolónom, chloramfenikolu,

tetracyklínu a erytromycínu majú silnejšie MDR efluxné pumpy. Export chloramfenikolu

z bakteriálnej bunky E. coli zabezpečujú AcrAB-TolC systémy. V prípade P. aeruginosa

vylučovanie chloramfenikolových antibiotík z bunky zabezpečuje zvýšená expresia

MexAB-OprM a MexCD-OprJ systémov (Roberts a Schwarz, 2009).

Aby bola schopnosť tetracyklínov preniknúť k ribozómom inhibovaná, je potrebné

znížiť ich koncentráciu vo vnútri buniek vypumpovaním antibiotika von z bunky.

Mechanizmus aktívneho efluxu tetracyklínov je najznámejším a najlepšie preskúmaným

mechanizmom rezistencie. Gény efluxných systémov sú lokalizované na chromozóme.

V poslednom období bolo objavených mnoho tetracyklínových génov zodpovedných

za rezistenciu. Gémy tat(A) a tat(E) boli nájdené medzi členmi rodov Enterobacteriaceae,

Haemophilus, Vibrio a Aeromonas. Gény tat(P) boli objavené medzi členmi rodu

41

Clostridium. Tat(K) a tat(L) gény sa nachádzajú v niektorých G+ baktériách (Soares et al.,

2012).

Makrolidy patriace do skupiny hydrofóbnych antibiotík sú vylúčené z buniek G-

pomocou transportérov kódovaných na chromozómoch. Mechanizmus vypudenia

makrolidových antibiotík z G+ baktérií rodu Staphylococcus zabezpečujú transportné

systémy, ktoré sú kódované génom msr (A). Avšak tieto gény nie sú kódované

v chromozóme, ale na plazmide (Leclercq, 2002

1.10 Klasifikácia antibiotík

1.10.1 β-laktámové antibiotiká

β-laktámy boli prvé antibiotiká, ktoré boli popísané. β-laktámové antibiotiká sú

pravdepodobne jedny z najdôležitejších terapeutických prostriedkov v histórii medicíny.

Spolu s glykopeptidmi patria medzi antibiotiká, ktoré interferujú s jednotlivými krokmi

homeostatickej biosyntézy bunkovej steny. Tvoria 55 % všetkých antibiotík, takže

rezistencia v tejto skupine antibiotík patrí medzi klinicky významné (Vittek, 2008).

Zástupcovia tejto skupiny antibiotík obsahujú vo svojich štruktúrach štvorčlenný

β-laktámový kruh. Z dôvodov zabezpečenia ich účinnosti je potrebné, aby bol tento kruh

neporušený a boli schopné prenikať cez bunkovú membránu. Dochádza u nich

k naviazaniu a inhibícii syntézy penicilín viažucich proteínov, medzi ktoré patrí

karboxypeptidáza, transglykozidáza a transpeptidáza, a tým k inhibícii syntézy bunkovej

steny. U tejto skupiny antibiotík je znášanlivosť veľmi dobrá a výskyt nežiaducich účinkov

je minimálny. Toxický účinok je tiež minimálny. Medzi podtriedy β-laktámových

antibiotík patria karbapenémy, cefalosporíny, penicilíny, monobaktámy a klavámy (Kong

et al., 2010).

Penicilíny patria medzi deriváty kyseliny 6-aminopenicilínovej. Základnú chemickú

štruktúru všetkých penicilínov tvorí betalaktámový a tiazolidínový kruh a bočný reťazec.

Na bočný reťazec sa nadväzujú rôzne funkčné skupiny, ktoré majú odlišný vplyv

na farmakokinetické vlastnosti celkové spektrum aktivity penicilínov (Levy, 2007).

Podľa spektra aktivity sa penicilíny delia na úzkospektrálne a širokospektrálne.

Fermentáciou Penicillium crysogenium sa produkuje Penicilín G (benzylpenicilín) patriaci

do kategórie prírodných penicilínov. Patrí medzi úzkospektrálne penicilíny s účinkom na

G+ koky, streptokoky skupiny A a anaeróbne streptokoky. Medzi prírodné penicilíny patrí

aj penicilín V, ktorý má slabší účinok na anaeróbne streptokoky ako benzylpenicilín.

Prírodné penicilíny sa vyznačujú vynikajúcou účinnosťou aj na spirochéty (Levy, 2007).

42

Aby bola účinnosť penicilínov rozšírená aj na G- organizmy bolo potrebné urobiť

zmeny v postrannom reťazci penicilínových zlúčenín. Pridaním aminoskupiny k základnej

štruktúre vznikli aminopenicilíny. Hlavným predstaviteľom tejto skupiny penicilínov je

ampicilín, ktorý má rozšírené spetrum účinku na G+ aj G- baktérie. Pre širšie spektrum

gram- účinnosti proti P. aeruginosa vznikli karboxypenicilíny, ktoré zahŕňajú

dvoch predstaviteľov a to carbenicillín a ticarcillín. Medzi penicilíny patria aj

ureidopenicilíny a to azlocilín, mezlocilín a piperacilín (Levy, 2007).

Cefalosporíny sú široko spektrálne antibiotiká s dobrým účinkom na G+ aj

G- baktérie. Patria medzi deriváty kyseliny 7 amino cefalosporánovej. Na základe svojich

vlastností ako je antimikrobiálne spektrum, odolnosť proti β-laktamázam, schopnosti

prenikať bunkovou stenou a farmakokinetických vlastností sa delia do štyroch generácií

(Kong et al., 2010).

Do prvej generácie cefalosporínov patrí cefapirín, cefalexín, cefazolín, cefadroxil

a cefalotín. Majú veľmi dobrú účinnosť proti G+ baktériám. Spomedzi všetkých generácií

majú najslabšiu účinnosť na G- baktérie. Druhú generáciu tvoria cefaklor, cefprozil,

cefuroxím, cefuroxím axetil, cefoxitín a cefamandol. Majú dobrú účinnosť

na G+ streptokoky a stafylokoky. Na G- pôsobia slabo. Do tretej generácie patria

cefoperazón, ceftazidín, ceftriaxon a ceftazidín. Naopak táto generácia cefalosporínov má

lepší účinok na G- ako na G+ baktérie. Štvrtú generáciu tvoria cefepím a cefpirom

s rovnako dobrým účinkom na G+, ako aj na G- baktérie (Kong et al., 2010).

Cefalosporíny sú malo toxické antibiotiká so širokým spektrom účinku

na enterobaktérie, klebsiely, stafylokoky a pseudomonády. Pri ľahších infekciách sa

podávajú samostatne. Pri závažnejšom ochorení je potrebná ich kombinácia spolu

s fluorochinolónmi, aminoglykozidmi a makrolidmi. Rezistenciu na ne vykazujú

Enterococcus faecalis, Legionella pneumophila, Mycoplasma, Chlamydophila pneumoniae

a mykobaktérie (Levy, 2007).

Karbapenémy majú zo všetkých β-laktámových antibiotík najširšie spektrum účinku

a najlepšiu účinnosť na G+ a G- baktérie. Do tejto skupiny patrí imipenem, panipenem

a doripeném s účinkom na G+ baktérie. Meropeném, biapenem a ertapeném sú o niečo

účinnejšie proti G- baktériám (Papp-Wallace et al., 2011).

Do poslednej skupiny β-laktámových antibiotík patria monobaktámy. Aztreonam je

jediný predstaviteľ tejto skupiny antibiotík. Vo svojej štruktúre obsahuje β-laktámový kruh

a vyznačuje sa monocyklickou štruktúrou tzn., že obsahuje jeden β-laktámový kruh.

43

Ostatné antibiotiká z tejto skupiny obsahujú vo svojej štruktúre dva kruhy a patria medzi

bicyklické antibiotiká (Solensky et al., 2011).

1.10.2 Aminoglykozidy

Aminoglykozidy sú veľkou prirodzene sa vyskytujúcou skupinou antibiotík, ktoré

sa používajú od roku 1940. Ich chemická štruktúra je zložená z aminocyklitolového kruhu

na, ktorý sú naviazané dva aminocukry. Táto skupina antibiotík sa rozdeľuje na niekoľko

generácii na základe svojej hlavnej štruktúry, ktorú tvorí buď streptamín, streptidín alebo

2- deoxystreptamín (Gualerzi et al., 2014).

Ich primárnym pôsobiskom lokalizácie je 30S podjednotka prokaryotického

ribozómu. Ich účinnosť spočíva v zabránení syntézy bakteriálnych proteínov väzbou

na bakteriálnu bunkovú stenu a poškodzovaní metabolizmu baktérií zásahom do

translačného mechanizmu bunky (Avent et al., 2011).

Dvojicu najbežnejšie používaných parenterálnych aminoglykozidov tvoria

gentamicín a amikacín. Iným spôsobom aplikácie je inhalácia prostredníctvom

rozprašovača. Do tejto skupiny patrí tobramycín. Intraventrikulárne sa podáva

aminoglykozidové antibiotikum gentamycín. Paromomycín a neomycín sa pre svoju

účinnosť v čreve aplikujú orálne, pretože nepatria medzi systémovo absorbovateľné

antibiotiká. Prvý zástupca aminoglykozidových antibiotík streptomycín je spolu

s kanamycínom v súčasnosti používaný zriedkavejšie (Avent et al., 2011).

Okrem pozitívnych účinkov aminoglykozidov na ľudské zdravie sú známe aj

prípady toxicity. Významné toxické účinky boli zaznamenané v spojitosti so sluchom, a to

ototoxicita, nefrotoxicita, čiže toxický účinok na obličky a v ojedinelých prípadoch aj

neuromuskulárna toxicita. Riziko toxicity závisí od určitých faktorov a to od existujúceho

ochorenia, závažnosti ochorenia, súčasne podávaných liekov a od genetickej predispozície.

Dlhodobé užívanie aminoglykozidov sa preukázalo ako nezávislý rizikový faktor vo vývoji

toxicity. Aby bolo možné minimalizovať toxicitu antibiotika, a optimalizovať terapiu je

potrebné využiť kľúčovú stratégiu v podobe monitorovania liečiv použitých na terapiu

(Avent et al., 2011).

1.10.3 Fluorochinolóny

Fluorochinolóny sú čisté syntetické prípravky s antibakteriálnym účinkom. Spolu

s β-laktámovými antibiotikami a makrolidmi patria medzi najčastejšie používané

antibiotiká v liečbe bakteriálnych ochorení. Veľmi často sa používajú vďaka širokému

44

spektru účinku, ktoré zahŕňa G- aj G+ baktérie. Veľmi dobre sa vstrebávajú

z gastrointestinálneho traktu po perorálnom podaní, a majú dobré baktericídne účinky.

Sú preto bežne používanými antibiotikami v humánnej aj veterinárnej praxi (Appelbaum

a Hunter, 2000).

Tieto účinky sú dané väzbou fluorochinolónov na enzymatický komplex, ktorý

zabezpečuje rozpletanie dvojvláknovej bakteriálnej DNA. Takéto rozpletanie je z hľadiska

bakteriálnej bunky dôležité. Bez tohto kroku by neprebehla transkripcia genetickej

informácie a ani delenie. Tieto kroky zabezpečujú dva enzýmy, a to topoizomeráza a DNA

gyráza, ktoré majú veľmi podobnú štruktúru, a rovnako aj ich podjednotky sú kódované

podobnými génmi. Podjednotka topoizomerázy je kódovaná génmi parC a parE.

Podjednotka DNA gyrázy je kódovaná génmi gyrA a gyrB (Hanulík et al., 2010).

Podobne ako βlaktámové antibiotiká sa delia do niekoľkých generácií, tak aj

u fluorochinolónov sú známe štyri generácie. Prvou generáciou sú nefluorované chinolóny.

Sem patrí kyselina nalidixová a kyselina oxolinová. Pôsobia na G- baktérie, a to hlavne

na E. coli a iné enterobaktérie, ktoré sú potom vylučované z tela močom. Druhú generáciu

antibiotík tvorí ofloxacín, a jeho L-isomér levofloxacín. Patrí sem aj ciprofloxacín

a pefloxacín. Tieto antibiotiká sú charakteristické systémovým účinkom

a hlavne účinkom na široké spektrum gram- baktérií. Tretiu generáciu liečiv reprezentuje

gatifloxacín, grepafloxacín a sparfloxacín. Do štvrtej generácie patrí moxifloxacín, ktorý

má rozšírené spektrum účinku na G+ baktérie. Moxifloxacín veľmi dobre inhibuje rast

Streptococcus pneumoniae (Jindrák et al., 2007).

Fluorochinolóny patria k dôležitým antimikróbnym prípravkom, a preto je potreba

naďalej udržiavať ich účinnosť a možnosť použitia v klinickej praxi (Hanulík et al., 2010).

1.10.4 Makrolidy

Makrolidové antibiotiká sa používajú na liečbu infekcií dýchacích a močových

ciest. Majú účinok ako na G- tak aj na G+ mikróby. Účinok majú aj na chlamýdie

a mykoplazmy. Aplikujú sa tiež na zle kultivovateľné patogény, na ktoré β-laktámové

antibiotiká nezaberajú (Havlík, 2009).

Makrolidy sa podávajú v dlhších časových intervaloch a v pomerne nízkych

dávkach. Vo svojej štruktúre obsahujú veľké laktónové jadro na ktorom je 12-16 atómov

uhlíka. Makrolidy sú ďalšou skupinou antibiotík konštrukčne odlišných

od aminoglykozidov, ktoré inhibujú bakteriálnu syntézu bielkovín. Ireverzibilne sa naviažu

45

na 50S subjednotku ribozómu. V bunke sa nahromadia di a tripeptidy. Bielkoviny sa ďalej

nedokážu syntetizovať a bunka postupne umiera (Leclercq, 2002).

Pôsobenia makrolidov na rozdiel od β-laktámových antibiotík je bakteriostatické.

Až pri vyšších koncentráciách môže dôjsť k baktericídnemu účinku. Účinok makrolidov je

zameraný na G+ aj G- baktérie. Prenikajú intracelulárne, a veľmi dobre sa dostávajú

do pľúc aj mäkkých tkanív. Používajú sa prevažne na liečbu infekcií vyvolaných

intracelulárnymi mikroorganizmami ako sú Legionella pneumophila, Chlamydia

trachomatis a Mycoplasma pneumoniae (Mokrý et al., 2013).

Makrolidové antibiotiká vo všeobecnosti spôsobujú veľmi zriedkavé alergické

problémy na rozdiel od penicilínov a cefalosporínov. Najväčší negatívny vplyv majú na

oblasť žalúdka. Prvé antibiotikum, ktoré bolo zavedené do praxe bol erytromycín. Aj keď

pri správnej aplikácii je jeho účinok dobrý, môže v ojedinelých prípadoch spôsobovať

nevoľnosť a zvracanie. Ďalej sem patrí Rovamycín, ktorý má menej nežiaducich účinkov

a používa sa v liečbe toxoplazmózy tehotných žien a novorodencov. Aplikuje sa aj

pri liečbe stomatologických infekcií a mastitíd (Brysier a Butzler, 2003).

Makrolidové antibiotiká sa veľmi dobre a ľahko vstrebávajú z tráviaceho traktu.

Pacientom sa podávajú predovšetkým perorálne a nespôsobujú veľa nežiaducich účinkov,

nakoľko majú nízku úroveň toxicity. Rýchlosť resorbcie je daná metabolizmom

prebiehajúcim v pečeni (Havlík, 2009).

Od roku 1970 boli vyvinuté semisyntetické makrolidy, aby sa znížila dávka

aplikovaného liečiva a dávkovací interval. Sú to tzv. makrolidy druhej generácie.

Modifikáciou štruktúry erytromycínu a naviazaním rôznych radikálov na tieto štruktúry

vznikali postupne roxitromycín a klaritromycín (Gualerzi et al., 2014).

Roxitromycín a klaritromycín sa vyznačujú minimálnymi nežiaducimi účinkami.

Sú účinnejšie ako prirodzené makrolidy, pretože udržujú hladinu liečiva v sére dlhšiu

dobu. Je možné podávať ich menej často počas dňa. Niektoré sa aplikujú dvakrát a niektoré

dokonca len raz denne. Z uvedených dôvodov stúpla ich spotreba niekoľkonásobne za

veľmi krátke obdobie. V liečbe chlamýdií a infekcií spôsobených netypickými mikróbami

sa používajú ako lieky prvej voľby (Gualerzi et al., 2014).

Medzi makrolidy druhej generácie patrí roxitromycín. Liek nepôsobí nepriaznivo

pre tehotné ženy, avšak v liečbe ľudí so zníženou funkciou pečene je potrebné znížiť dávku

na polovicu. Medzi najčastejšie predpisované makrolidy patrí klaritromycín, ktorý bol

vytvorený metyláciou hydroxylovej skupiny na šiestom uhlíku erytromycínu. Na rozdiel

46

od roxitromycínu nie je vhodné ho predpisovať tehotným ženám. Klaritromycín sa často

kombinuje s inými liečivami a používa sa na liečbu pozitívnych nálezov Helicobacter

pylori (Bryskier a Butzler, 2003).

Neskôr koncom osemdesiatych rokov 20. storočia vznikol azitromycín podobným

princípom založeným na modifikácií erytromycínu. Tým, že vo svojej štruktúre obsahuje

atóm dusíka, patrí do skupiny azalidov. Jeho kinetika pracuje iným spôsobom ako

u ostatných makrolidov. Koncentruje sa v leukocytoch a veľmi ľahko preniká do tkanív.

Jeho hladina v krvnom sére nie je takmer vôbec merateľná. Spektrum účinnosti je podobné

ako u ostatných makrolidov. Výhoda spočíva v tom, že má vyššiu účinnosť na G- baktérie

ako ostatné z tejto skupiny antibiotík (Gualerzi et al., 2014).

Do poslednej skupiny makrolidov patria ketolidy. Ketónová väzba nahradila cukor

kladinózu, ktorý bol vylúčený zo štruktúry erytromycínu v polohe C3. Táto podskupina

makrolidov má vyššiu účinnosť ako ostatné podskupiny, no zatiaľ sú skúsenosti s ním

obmedzené (Havlík, 2009).

1.10.5 Linkozamidy

Triedu linkozamidových antibiotík tvorí prírodný produkt linkomycín

a polosyntetické deriváty klindamycín a pirlimycín. Po prvýkrát bola táto skupina

antibiotík charakterizovaná v roku 1960. Od tej doby sa používa na liečbu širokého spektra

infekčných ochorení. Klindamycín sa používa na liečbu infekcií, ktoré spôsobujú

stafylokoky a streptokoky. Ide najmä o infekcie kože, kostí a kĺbov. Mechanizmus účinku

likozamidov spočíva v blokovaní bakteriálnej proteosyntézy naviazanín na 23S rRNA,

ktorá je súčasťou 50S podjednotky ribozómu (Morar et al., 2009).

1.10.6 Amfenikoly

Predstaviteľom tejto skupiny je chloramfenikol, ktorý produkuje aktinomycéta

Streptomyces venezuelae. Patrí medzi širokospektrálne antibiotiká s účinkom na široké

spektrum G+ aj G- baktérií. V minulosti sa získaval fermentačným spôsobom, ale

v súčasnosti sa získava už len synteticky. V dnešnej dobe sa chloramfenikol používa málo,

pretože sa zistilo, že spôsobuje hematotoxické účinky. Z tohto dôvodu sa teraz používa až

vtedy, keď na ochorenie neúčinkujú iné antibiotiká (Levy, 2007).

Mechanizmus účinku chloramfenikolu spočíva v naviazaní sa na 50S podjednotku

ribozómu. Následne dochádza k inhibícii enzýmu peptidyltransferázy, ktorý je potrebný

na katalyzovanie vytvorenia peptidových väzieb medzi rastúcim polypeptidovým reťazcom

a aminokyselinou (Zuorro., 2014).

47

1.10.7 Tetracyklíny

Tetracyklíny sú širokospektrálnou skupinou antibiotík. Prvým tetracyklínom bol

prirodzene produkovaný chlórtetracyklín. Neskôr sa do praxe zaviedla druhá a tretia

generácia semisyntetických derivátov tetracyklínu ako je doxycyklín a minocyklín.

V poslednej dobe sa používajú glycylcyklíny a tigecyklíny (Nguyen et al., 2014).

Medzi baktérie, ktoré produkujú tetracyklíny patria Streptomyces rimosus,

Streptomyces aureofaciens, Actinomadura brunea a Micromonospora (Gualerzi et al.,

2014).

Základná štruktúra tetracyklínov pozostáva z redukovaného naftacénu.

Tetracyklínové antibiotiká a ich zlúčeniny sú účinné pri liečbe rôznych kožných ochorení.

Spolu s minocyklínom a doxicyklínom sú účinné pri iečbe akné, a to najmä počas

zápalovej fázy ochorenia. Ich účinok spočíva v redukcii pôvodcu kožného mazu (Sapadin

a Fleischmajer, 2006).

Hlavným cieľom tetracyklínov v bakteriálnej bunke je inhibícia syntézy bielkovín

naviazaním sa na komplex ribozómov. Hlavným cieľovým miestom naviazania

tetracyklínov je 30S podjednotka ribozómu. Vplyvom tetracyklínových antibiotík tak

do A miesta na ribozóme nemôže vstúpiť aminoacyl-tRNA. Dôsledkom tohto javu je

nedostatok stavebných aminokyselín na tvorbu polypeptidového reťazca (Nightingale et

al., 2007).

Terapeutické účinky tetracyklínov a ich analógov sa okrem liečby akné používajú aj

pri liečbe rubeoly, sarkoidózy, nádorových metastázach a autoimunitných ochorení, ako je

napr. reumatoidná artritída (Sapadin a Fleischmajer, 2006).

1.10.8 Glykopeptidové a polypeptidové antibiotiká

Základná štruktúra glykopeptidových antibiotík je zložená zo siedmych

aminokyselín, ktoré po vzájomnom prepojení vytvárajú konkávnu štruktúru (Gualerzi et

al., 2014).

Glykopeptidy, medzi ktoré patrí teikoplanín a vankomycín sú antibiotikami

poslednej voľby pri liečbe závažných infekčných ochorení, ktoré spôsobujú G+ ľudské

patogény – ako sú S. aureus, Enterococcus a Clostridium difficale (Rossolini et al., 2014).

Vankomycín a teikoplanín patria medzi prírodné produkty. Glykopeptidové

antibiotiká sú glykozilované peptidy neribozomálneho pôvodu produkované rôznorodou

skupinou pôdnych aktinomycét (Binda et al., 2014).

48

Vankomycín produkuje Amycolatopsis orientalis. Toto antibiotikum bolo prvýkrát

použité v praxi v roku 1958. Zatiaľ, čo teikoplanín vyprodukovaný pôdnou aktinomycétou

Actinoplanes teichomyceticus bol prvýkrát popísaný v roku 1978 a aplikovaný do praxe

v roku 1988 (Rossolini et al., 2014).

Vankomycín s teikoplanínom majú podobné antibakteriálne spektrum proti

G+ baktériám avšak teikoplaním vykazuje zvýšenú účinnosť proti rodom Staphylococcus,

Streptococcus a Enterococcus (Van Banbeke, 2006).

Medzi glykopeptidové antibiotiká zaraďujeme aj semisyntetické glykopeptidy. Sú

to glykopeptidové deriváty prírodných produktov glykopeptidov vankomycínu

a teikoplanínu. Tvoria zároveň druhú generáciu glykopeptidov (Van Banbeke, 2006).

Derivátom vankomycínu je telavancín, ktorý bol do klinickej praxe zavedený

v roku 2009. Od pôvodnej zlúčeniny sa líši pridaním hydrofóbnej a hydrofilnej skupiny

ku štruktúre vankomycínu. Vyznačuje sa silnejším účinkom proti S. pneumoniae, S. aureus

a Enterococcus. Ďalším derivátom vankomycínu je oritavancín rovnako produkovaný

aktinomycétou A. orientalis. Jeho výhodou je silnejší účinok proti streptokokom

a C. difficale. Semisyntetickým derivátom teikoplanínu je dalbavancín. V porovnaní

s vankomycínom vykazuje zvýšenú in vitro aktivitu ku väčšine G+ patogénnym baktérií

(Zhanel et al., 2010).

Polypeptidové antibiotiká sú chemicky odlišnou skupinou antibiotík, ktoré

pozostávajú z neproteínových polypeptidových reťazcov. Patria sem kolistín, gramicidín,

bacitracín a polymyxín B. Hlavnú skupinu tvorí polymyxín a bacitracín. Bacitracín pôsobí

na G+ baktérie rovnako ako gramicidín. Zatiaľ čo polymyxín na G- baktérie. Polymyxíny

sa v súčasnosti používajú ako posledná voľba v liečbe infekcií spôsobených G- baktériami,

ktoré sú v podstate odolné proti všetkých súčasným antibiotikám (Velkov et al., 2013).

Polymyxíny boli objavené pred viac ako 50-timi rokmi. Polymyxín B a kolistín

(polymyxín E) sú sekundárne metabolity, ktoré produkuje pôdna baktéria Bacillus

polymyxa. Keďže sa odlišujú len v jednej aminokyseline polypeptidového reťazca, ich

štruktúra je veľmi podobná. Kolistín a polymyxín B sú úzkospektrálne antibiotiká

s účinkom na G- baktérie. Používajú sa predovšetkým na liečbu infekcií, ktoré spôsobujú

P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae a Acinetobacter baumannii. Od roku 1970 sa

postupne začali používať menej, pretože po intravenóznej aplikácii pôsobili neuro a nefro

toxicky (Velkov et al., 2013).

49

1.10.9 Sulfonamidy

Sulfonamidy spolu s trimetoprímom sú dôležitou súčasťou vo vývoji antibiotík,

a považujú sa za najväčší triumf vedeckej medicíny. Sulfonamidy patria medzi analógy

kyseliny p aminobenzoovej (PABA), ktorá je pri produkcii kyseliny listovej rastovým

faktorom. Cieľovým enzýmom v bakteriálnej bunke je pre sulfonamidy dihydropteroát

syntáza, ktorý je kľúčovým pre tvorbu kyseliny listovej. Cicavčie bunky majú nedostatok

tohto enzýmu a z tohto dôvodu nemôžu produkovať kyselinu listovú. Sú preto závislé na

jej dodávkach. Práve toto tvorí základ pre selektívne pôsobenie sulfonamidov na

bakteriálne bunky (Sköld, 2010).

V súčasnej dobe nepatria medzi veľmi často používané antibiotiká. Dôvodom je fakt,

že u liečených pacientov vyvolávajú pomerne často nežiaduce účinky, a to hlavne na koži

a krvotvorbe. Príčinou ich obmedzeného používania je i skutočnosť, že po zavedení do

klinickej praxe nastal veľmi skoro rozvoj rezistencie (Sköld, 2010).

Cieľovým miestom pôsobenia trimetoprímu je enzým dihydrofolát reduktáza

nachádzajúci sa v baktériách. Na tento enzým účinkuje selektívne. K sulfonamidom sa

priraďuje preto, lebo sa vo svojom mechanizme účinku stretáva s bakteriálnym

metabolizmom folátu rovnako ako ony. Je charakteristický širokým spektrom účinku

(Sköld, 2010).

1.10.10 Nové skupiny antibiotík

Aby bolo možné neustále modernizovať oblasť medicíny, kľúčovým krokom v tejto

oblasti je objav nových antibiotík. Pre problémy s rezistenciou na antibiotiká, je veľmi

potrebné zaoberať sa vývojom nových antibiotík s doteraz nepoznanými, novými

mechanizmami účinku, proti ktorým nebudú baktérie rezistentné. Od roku 2000 bolo

zaregistrovaných niekoľko nových tried antibiotík. Ich chemická štruktúra je vo veľkej

väčšine odvodená od pôvodných antibiotík (Butler a Cooper, 2013).

Z novej triedy lipopetidových antibiotík bol do praxe ako prvý uvedený daptomycín

s cieľovým účinkom na G+ baktérie. V bakteriálnej bunke sa nadväzuje na jej

cytoplazmatickú membránu, a následne zasahuje do jej funkcií. Jeho použitie je indikované

pri závažných infekciách močových ciest a brucha (Hayden a Reyal, 2005).

V roku 2014 bola udelená registrácia antibiotiku s názvom nemonoxacín. Vyrába sa

v perorálnej aj parenterálnej liekovej forme. Pri pneumóniách sa preferuje forma

parenterálna a pri liečbe diabetickej nohy s obsahom infekčných vredov a pri rôznych

infekciách kože je zase preferovaná formou perorálna forma (Poole, 2014).

50

V roku 2015 prešlo registráciou antibiotikum oritavancín. Je to semisyntetický

derivát reprezentujúci skupinu lipoglykopeptidových analógov. Patrí do druhej generácie

glykopeptidových antibiotík, ktoré majú vo svojej štruktúre začlenenú lipofilnú molekulu.

Je vhodný pri liečbe kožných infekcií s akútnym priebehom u dospelých ľudí. Jeho

biologický polčas je predĺžený na 200-400 hodín. (Bouza a Burillo, 2010).

Liečba infekcií vyvolaných G- baktériami je veľmi náročná a liekov, ktoré dokážu

preniknúť ich odolnou membránou je nedostatok.

. V mnohých krajinách je výskum nových antibiotík prioritou. Skupina tetracyklínových

antibiotík sa v roku 2005 rozrástla o liečivo s názvom tigecyklín. Konkrétne je tento

derivát tetracyklínov zaradený medzi glycylcyklíny. Charakterizuje ho široké spektrum

účinku proti G+ aj G- baktériám. Používa sa pri liečbe závažných kožných a brušných

infekcií (Nguyen et al., 2014).

V roku 2000 telithromycín zo skupiny makrolidových antibiotík bol uvedený na trh.

Je to liečivý prípravok na liečbu akútnych sinusitíd a akútnych aj chronických bronchitíd.

Aplikuje sa perorálne a jeho účinok sa prejavuje systémovo. Avšak vyvoláva aj nežiaduce

účinky medzi, ktoré patrí obzvlášť závažné zlyhanie pečene (Lonks a Goldmann, 2005).

Vývoj nových antibiotík je nemysliteľný bez baktérií, ktoré sú náročné na

kultiváciu v laboratóriu. Tie tvoria až 99 % všetkých baktérií. Pre výskum sú zaujímavé aj

z toho dôvodu, že doposiaľ neboli dostatočne využité na vývoj nových antimikrobiálnych

látok. Vedeckému tímu univerzity Northeastern sa podarilo objaviť molekulu antibiotika,

ktoré nesie názov teixobactín. pretože ho nebolo možné izolovať v laboratórnych

podmienkach, bolo izolované z pôdnej baktérie Eleftheria terrae. Na jeho objavenie bola

použitá nová metóda Ichip, slúžiaca na kultiváciu baktérií v pôde. S pomocou tejto

technológie je tak možné izolovať nové antimikrobiálne látky, na ktoré zatiaľ nie sú

vyvinuté žiadne známky rezistencie (Nichols et al., 2010).

1.11 Metódy na identifikáciu baktérií v mlieku a mliečnych výrobkoch

1.11.1 Identifikácia mikroorganizmov metódou MALDI-TOF MS biotyper

MALDI-TOF MS biotyper poskytuje vysokorýchlostnú, cenovo výhodnú, silnú

a precísnu identifikáciu a taxonomickú klasifikáciu mikroorganizmov pomocou

hmotnostnej spektrometrie (Biswas a Rolain, 2013).

Skratka MALDI-TOF MS pozostáva z jednotlivých slov a to Matrix–Assisted Laser

Desorption/Ionization Time of Flight mass spectrometry. V preklade ide o hmotnostnú

51

spektrometriu s laserovou desorbciou a ionizáciou za účasti matrice s preletovým

analyzátorom. V porovnaní s konvenčnými alebo molekulárno-biologickými metódami je

snahou tejto metódy vylepšovať identifikáciu (Pinto et al., 2010).

MALDI-TOF je nová metóda, ktorá slúži na rutinnú identifikáciu baktérií

v klinických mikrobiologických podmienkach. Presná identifikácia baktérií je veľmi

dôležitá v prípade vzplanutia infekčných ochorení a má rovnako dôležitú úlohu

v diagnostike a liečbe ochorení (Bizzini a Greub, 2010).

MALDI-TOF MS biotyper pracuje na báze identifikácie mikroorganizmov

porovnávaním výsledkov s databázou. Vzhľadom k tomu, že dokáže detegovať veľké

množstvo bielkovín je vhodnou metódou na rozlíšenie veľmi príbuzných druhov, a tak

umožňuje ich klasifikáciu nielen na druhovej úrovni, ale často aj na úrovni poddruhov

a kmeňov (Huong et al., 2014).

Aby bolo možné získať reprodukovateľné hmotnostné spektrum, je potrebné

pracovať s čistými kultúrami baktérií. Príprava vzorky na identifikáciu mikroorganizmov

závisí nielen od zdroja, z ktorého boli izolované, ale aj od chemickej povahy zloženia

bunkovej steny (Biswas a Rolain, 2013).

Metóda pracuje na princípe aplikácie laserového žiarenia na kryštály matrice

so vzorkou. Dochádza k desorbcii molekúl matrice spolu s molekulami vzorky a v tom

istom čase prebieha ionizácia molekúl vzorky odovzdaním vodíkových iónov od matrice

(De Marco a Ford, 2013).

Pre analýzu je veľmi dôležitý výber matrice. Pre UV lasery sú dobrou voľbou

aromatické karboxylové kyseliny (hlavne deriváty kyseliny benzoovej), ktoré sa

najčastejšie rozpúšťajú vo vodnom roztoku acetonitrilu (De Marco a Ford, 2013).

V ďalšom kroku po aplikácii extrakčného napätia medzi MALDI doštičku a vstupnú

štrbinu preletového analyzátora nastáva podľa zvolenej polarity napätia extrakcia nabitých

molekúl a analýza v preletovom hmotnostnom analyzátore (TOF). Okrem extrakcie

a analýzy je princípom TOF analyzátora aj meranie doby letu iónov. Tie sú urýchlené

v dôsledku pôsobenia napätia na extrakčnú mriežku. Ióny získavajú rýchlosť na základe

svojej hmotnosti m a veľkosti náboja z. Hmotnosť iónov sa získava na konci separátora,

kde je umiestnený detektor, ktorý dopadajúce ióny zachytáva. Získaná kinetická energia je

priamo úmerná iónovému náboju, ale nepriamo úmerná jeho hmotnosti. V závislosti od

doby letu molekúl analyzátorom k detektoru, ktorý je na konci analyzátora sa vypočíta zo

vzťahu m/z rozdielna rýchlosť iónov s rôznym pomerom (De Marco a Ford, 2013).

52

Dáta, ktoré sú získané z hmotnostnej spektrometrie sa vyhodnotia a následne sa

porovnávajú s knihovňou hmotnostných spektier mikroorganizmov v programe nazývanom

MALDI biotyper. Získané údaje slúžia na identifikáciu mikroorganizmov na úrovni rodov,

druhov a dokonca aj kmeňov (Huong et al., 2014).

Vyhodnotením porovnávaných dát môže nastať zhoda alebo nezhoda s hmotnostným

spektrom vzorky. Výsledky sú vyhodnocované prostredníctvom skóre. 3 je najvyššia

hodnota, ktorá môže byť dosiahnutá. Skóre je označené farebne a to červenou farbou, čo

znamená žiadnu zhodu, žltou čiastočnú zhodu alebo zelenou farbou, čo predstavuje väčšiu

zhodu. Môže existovať viacero príčin, prečo dochádza k nezhodám počas porovnávania dát

s knihovňou. Môže to súvisieť s nesprávnou kultiváciou mikroorganizmov alebo môže

dôjsť ku kontaminácii vzoriek inými mikroorganizmami (Huong et al., 2014).

Táto metóda sa zdá byť spoľahlivou a bezpečnou pri identifikácii klinicky

významných baktérií ako sú napr. Enterobacteriaceae, stafylokoky a streptokoky.

Databáza je neustále skvalitňovaná, a to pravidelnou aktualizáciou dát každé 3 až 6

mesiacov (Lavigne et al., 2012).

Pomocou metódy MALDI-TOF MS boli v poslednom období detegované

rezistenčné markery niektorých antimikrobiálnych látok. Niektoré štúdie naznačujú, že

hmotnostná spektrometria má schopnosť rozlišovať citlivé kmene S. aureus od kmeňov

rezistentných na meticilín. Táto technológia sa ukazuje byť vhodnou voľbou aj

pri identifikácii enterokokov rezistentných na vankomycín. Aby bolo možné tento prístup

použiť aj na detekciu aminoglykozidovej rezistencie, je potrebné túto technológiu ďalej

rozvíjať (Singhal et al., 2015).

Vzniká tak nutnosť overovať ju v bežných laboratóriách, a tak zvážiť nahradenie

rutinných metód MALDI TOF MS. Nedávno boli popísané mechanizmy rezistencie

detekované touto metódou, ktoré zahŕňajú expresiu efluxných púmp a poškodenie porínov.

Schopnosť využiť tento prístup na detekciu mechanizmov rezistencie produkovaných

bakteriálnymi patogénmi je kľúčovým prvkom, ktorý znamená revolúciu

v klinickej mikrobiológii (Lavigne et al., 2012).

53

2 Cieľ práce

Cieľom vedeckej štúdie bolo izolovať zo vzoriek mlieka a masla koliformné baktérie

zastupujúce čeľad Enterobacteriaceae a zástupcov čeľade Lactobacillaceae, ktoré sa

vyznačujú pozitívnymi účinkami na ľudské zdravie. Vo vedeckej monografii sú

spracované vzorky masla a mlieka pochádzali z jarného obdobia z domáceho chovu, ale aj

z predajne obchodného reťazca. V období leta a jesene sa pracovalo so vzorkami masla

a mlieka získanými už len z domáceho chovu. Parciálnym cieľom bolo identifikovať

odoberané vzorky za pomoci hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF MS Biotyper

a následne testovať ich antibiotickú rezistenciu.

54

3 Materiál a metodika

3.1 Odber vzoriek mlieka a masla

Pre potreby výskumu sa spracovávali vzorky mlieka a masla, postupne získavané od

apríla do novembra roku 2017. Odber a následne výskumná časť bola rozdelená do troch

ročných období – jar, leto a jeseň. V každom ročnom období bolo získaných 12 vzoriek,

z toho 6 vzoriek mlieka a 6 vzoriek masla. Spolu za 3 ročné obdobia bolo získaných 36

vzoriek. V jarnom období boli vzorky získané z domáceho chovu, ako aj

z obchodných reťazcov. Avšak v lete a v jeseni boli vzorky získané len z domáceho chovu

z obce Dobroč. Zdrojom vzoriek z tohto súkromného chovu bolo kravské mlieko.

Získavanie vzoriek mlieka prebiehalo vždy po bezprostrednom nadojení. Mlieko bolo

odobrané do sterilných skúmaviek. Na vzorky masla sa muselo čakať jeden, resp. dva dni,

kým bolo mlieko spracované do konečného produktu. Rovnako aj tieto vzorky boli

odobrané do sterilných skúmaviek.

3.1.1. Celkový prehľad odoberaných vzoriek mlieka a masla

Obdobie: JAR

Tab. 3 Celkový prehľad odoberaných vzoriek kravského mlieka a masla

Číslo vzorky

Typ živočíšneho produktu

Miesto odberu

Dátum odberu

Pôvod vzoriek

1. maslo Nitra 6.4.2017 obchod 2. maslo Nitra 6.4.2017 obchod 3. maslo Nitra 6.4.2017 obchod 4. maslo Nitra 6.4.2017 obchod 5. maslo Dobroč 6.4.2017 domáci chov 6. maslo Dobroč 6.4.2017 domáci chov 7. mlieko Nitra 6.4.2017 obchod 8. mlieko Nitra 6.4.2017 obchod 9. mlieko Dobroč 5.4.2017 domáci chov

10. mlieko Dobroč 5.4.2017 domáci chov 11. mlieko Nitra 5.4.2017 obchod 12. mlieko Nitra 5.4.2017 obchod

Zdroj: vlastný výskum

55

Obdobie: LETO

Tab. 4 Celkový prehľad odoberaných vzoriek kravského mlieka a masla Číslo

vzorky Typ

živočíšneho produktu

Miesto odberu

Dátum odberu

Pôvod vzoriek

1. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 2. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 3. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 4. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 5. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 6. maslo Dobroč 12.6.2017 domáci chov 7. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov 8. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov 9. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov

10. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov 11. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov 12. mlieko Dobroč 12.6.2017 domáci chov

Zdroj: vlastný výskum

Obdobie: JESEŇ

Tab. 5 Celkový prehľad odoberaných vzoriek kravského mlieka a masla Číslo

vzorky Typ

živočíšneho produktu

Miesto odberu

Dátum odberu

Pôvod vzoriek

1. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 2. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 3. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 4. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 5. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 6. maslo Dobroč 6.11.2017 domáci chov 7. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov 8. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov 9. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov

10. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov 11. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov 12. mlieko Dobroč 6.11.2017 domáci chov

Zdroj: vlastný výskum

3.2 Izolácia mikroorganizmov

Po odobratí mlieka boli vzorky naočkované. Z každej vzorky mlieka bolo pipetou

odobraných 5 ml a následne prenesených do 45 ml fyziologického roztoku.

Zo vzoriek masla bolo odvážených 5±0,01 g, ktoré boli tiež prenesené do 45 ml

fyziologického roztoku. Zmiešaním vzoriek s fyziologickým roztokom sa dosiahlo riedenie

10-1. Následne vzorky boli vložené na 15 minút do trepačky. Trepaním sa docielilo dobré

56

premiešanie a homogenizácia vzoriek. Potom boli vzorky premiestnené do skúmaviek,

v ktorých sa pripravili príslušné riedenia. Ako už bolo skôr spomenuté, prvé riedenie bolo

10-1. Každé ďalšie riedenie sa pripravilo nasledovným spôsobom odberu – 1 ml

z predchádzajúceho riedenia s následným prenesením do ďalšej skúmavky, v ktorej bolo

9 ml fyziologického roztoku. Z každej vzorky boli pripravené riedenia 10-2 a 10-3. Po tejto

príprave boli vzorky následne naočkované. Spolu bolo pripravených 36 vzoriek, t. j.

v každom ročnom období sa skúmalo a vyhodnocovalo 12 vzoriek. Pre každú vzorku boli

pripravené štyri Petriho misky. Pre riedenie 10-2 dve misky, z ktorých jedna slúžila ako

kontrolná miska. Pre riedenie 10-3 boli rovnako pripravené dve misky, z ktorých jednu opäť

tvorila kontrolná vzorka.

Vzorky boli očkované rozterom na Petriho miske. Postup prebiehal nasledovne:

• agar bolo potrebné vychladiť na teplotu 60 °C,

• vychladený agar bol naliaty do Petriho misiek do výšky približne 1 cm – pre

laktobacily sa používal MRS agar a pre koliformné baktérie VČŽL agar,

• agar sa nechal stuhnúť,

• vodnú paru, ktorá sa nachádzala na povrchu misiek sme streli vatou, ktorá bola

predtým namočená do etanolu, a tak sa zabezpečila jej sterilizácia,

• na stuhnutý agar bolo pipetou prenesených po 1 ml roztoku z riedení 10-2 a 10-3;

z každého riedenia tak bol dva krát prenesený roztok; jednu z dvoch misiek vždy

tvorila kontrolná vzorka,

• následne bol roztok roztrený po povrchu živnej pôdy L-tyčinkou, ktorá bola

predtým vysterilizovaná namočením do etanolu a vypálením nad plameňom

kahana.

Kultivácia enterobaktérií prebiehala v aeróbnych podmienkach po dobu 48 hodín

a pri teplote 37 °C. Pred kultiváciou laktobacilov bol pripravený anaerokult

s anaerostatom. Kultivácia prebiehala za anaeróbnych podmienok po dobu 48-72 hodín, pri

teplote 37 °C.

3.2.1 Kultivácia mikroorganizmov

Kultivácia je proces, pri ktorom sa uskutočňuje pestovanie mikroorganizmov

v laboratórnych (umelo vytvorených) podmienkach, prostredníctvom ktorým sa zabezpečí

ich optimálny rast a vývoj. Pre správny priebeh kultivácie je veľmi dôležité zabezpečiť

správnu teplotu a dĺžku kultivácie, vlhkosť, prítomnosť, resp. neprítomnosť kyslíka, tlak,

svetlo, ale aj iné podmienky. Pre každú kultúru mikroorganizmov je potrebné vybrať

57

optimálnu kultivačnú pôdu, ktorá vyhovuje nárokom jednotlivých druhov

mikroorganizmov. V prípade realizovaného výskumu bola na kultiváciu zástupcov

enterobaktérií použitá živná pôda s názvom VČŽL a pre kultiváciu rodu Lactobacillus

živná pôda MRS. Kultivácia prebiehala v termostatoch alebo termoboxoch, v ktorých bolo

možné podľa typu zariadenia regulovať teplotu, vlhkosť, dĺžku kultivácie, ale aj zloženie

atmosféry (prítomnosť a neprítomnosť kyslíka).

3.2.2 Selektívne agary

Selektívne agary sa v mikrobiológii používajú na podporu rastu určitého druhu

baktérií z daného spoločenstva mikroorganizmov. Selektívny charakter rozličných typov

agarov sa zakladá na obsahu selektívne účinných látok v živnom médiu. Sú to látky, ktoré

účinne potláčajú rast a rozmnožovanie nevhodných mikroorganizmov. Na základe týchto

faktov sa mohol riešiteľský kolektív už od samého začiatku výskumu venovať

v experimentálnej časti monografie vybraným skupinám mikroorganizmov.

3.2.3 MRS agar

MRS agar je selektívne živné médium, ktoré sa používa na izoláciu a kultivovanie

baktérií rodu Lactobacillus. V laboratórnych podmienkach je to vhodné médium pre

zabezpečenie hustého a rýchleho rastu náročných laktobacilov. MRS agar bol pomenovaný

podľa jeho vynálezcov – Deman, Rogos a Sharpe. Táto živná pôda sa uskladňuje chránená

pred priamym slnečným žiarením pri teplote 2-8 ºC. Autoklávuje sa pri teplote 121 ºC, po

dobu 15 minút.

Obr. 1 Rod Lactobacillus na MRS agar Zdroj: Kačániová (2017)

58

3.2.4 VČŽL agar

VČŽL agar je selektívne živné médium, ktoré sa používa na detekciu a stanovenie

počtu enterobaktérií patriacich do čeľade Enterobacteriaceae. Táto živná pôda sa používa

na mikrobiologickú analýzu mlieka a mliečnych výrobkov. VČŽL agar pozostáva zo

žlčových solí, kryštálovej violete, laktózy a neutrálnej červene. Inhibuje rast hlavne

stafylokokov a ďalších Gram pozitívnych baktérií. Optimálna teplota pre uskladnenie

živnej pôdy je 2-8 ºC. VČŽL agar sa môže skladovať až do teploty 23 ºC, ale musí byť

chránený pred priamym slnečným žiarením.

Obr. 2 Čeľad Enterobacteriaceae na VČŽL agare Zdroj: Kačániová (2017)

3.2.5 Rekultivácia a čistenie kultúr

Do pripravených Petriho misiek sme naliali 20-30 ml agaru. Misky s naliatym

agarom boli ponechané na stuhnutie pri izbovej teplote. Prebytočná voda bola vysušená

v sušičke pri teplote 60 ºC. Vatou, predtým namočenou do etanolu, sme zotreli

skondenzovanú vodnú paru na hornej časti misiek. Po dostatočnom stuhnutí a vysušení

agaru bola naň pomocou bakteriologického očka prenesená jedna, výskumným tímom

zvolená, kolónia baktérií z vyizolovaného počtu. Pred samotnou rekultiváciou bolo

bakteriologické očko vysterilizované vypálením nad plameňom kahana. Následne bolo

ochladené na okraji Petriho misiek. S využitím čiarkovacej metódy bola vybraná

bakteriálna kultúra rozotrená po povrchu agaru. Kultivácia prebehla podľa podmienok

vyššie popísaných (viď. kapitola 3.2).

59

Obr. 3 Preočkovanie kultúr Zdroj: Kačániová (2017)

3.3 Identifikácia mikroorganizmov

V realizovanom experimente bola použitá na identifikáciu mikroorganizmov

metóda MALDI-TOF MS biotyper s využitím hmotnostnej spektrometrie. Riešiteľský tím

sa pre jej výber rozhodol z dôvodov, že je to veľmi rýchla a vysoko spoľahlivá metóda

identifikácie.

3.3.1 Príprava MALDI matrice

Prvý krok pozostával z prípravy zásobného roztoku, ktorý tvoril 50 % acetonitril,

47,5 % voda a 2,5 % kyselina trifluorooctová. Z toho bolo potrebné na prípravu 1 ml

zásobného roztoku napipetovať do Eppendorfovej skúmavky 500 µl 100 % acetonitrilu,

475 µl destilovanej vody a 25 µl 100 % kyseliny trifluorooctovej.

Druhým krokom bola vlastná príprava roztoku MALDI matrice a to pridaním 250 µl

zásobného roztoku do jednej skúmavky s HCCA matrix portioned. Roztok sa dal

vortexovať až do úplného rozpustenia všetkých kryštálov (kontrola pohľadom oproti

svetlu). Takto pripravený roztok MALDI matrice je možné v tme a pri laboratórnej teplote

uskladňovať 2-3 týždne.

3.3.2 Príprava vzorky

Pre uskutočnenie samotnej prípravy vzorky bolo podstatným krokom získanie čistej

kultúry baktérií, ktorú sme nadobudli kultiváciou mikroorganizmov, čistením čiarkovacou

metódou a opätovnou rekultiváciou.

60

V prvom kroku sme napipetovali 300 µl destilovanej vody do 1,5 ml Eppendorfovej

skúmavky. Odobraný biologický materiál z Petriho misky bol pridaný do Eppendorfovej

skúmavky s destilovanou vodou a premiešaný. V druhom kroku sme pridali 900 µl etanolu

a opätovne premiešali. Potom bola pripravená zmes centrifugovaná s maximálnymi

otáčkami 2 minúty. Vytvorený supernatant sme zliali a znovu centrifugovali. Zvyšky

etanolu boli odstránené odpipetovaním. Vzniknutý pelet bol ponechaný v laboratóriu

niekoľko minút na odstátie a vysušenie. Do dobre vysušeného peletu bolo pridaných 50 µl

70 % kyseliny mravčej. Obsah bol opäť dôkladne premiešaný pipetou a zvortexovaný. Ako

aj v predchádzajúcom prípade, rovnako aj teraz sme pridali 50 µl acetonitrilu. Nasledovala

dvojminútová centrifugácia pri maximálnych otáčkach. Nakvapkali sme 1 µl supernatantu

na doštičku a nechali dobre zaschnúť. Ihneď po zaschnutí sme prekryli supernatant

pripraveným 1 µl roztokom MALDI matrice a nechali ho dôkladne zaschnúť. Po tomto

kroku bolo už všetko pripravené na analýzu a identifikáciu mikroorganizmov.

Princípom hmotnostnej spektrometrie je získať informácie o samotnej štruktúre až

po aminokyselinovú sekvenciu proteínov. Nadobudnuté informácie sa používajú pri

prehľadávaní proteínových a nukleotidových databáz, s cieľom identifikovať samotné

proteíny. Postup získania jednotlivých informácií o proteínoch sa skladá z troch etáp. Prvú

etapu zahŕňa príprava vzorky, druhú laserová ionizácia a desorbcia s využitím matrice,

a tretiu analýza hmoty (viď. kapitola 1.10. Metódy na identifikáciu baktérií v mlieku

a mliečnych výrobkoch – Gálová et al., 2013).

3.4 Testovanie citlivosti na antibiotiká

Citlivosť voči antibiotikám v prípade Enterobacteriaceae bola testovaná s použitím

diskovej difúznej metódy, ktorej sa často pripisuje aj názov Kirby-Bauerov test. Princíp

tejto metódy spočíva v tom, že roztieraním sa naočkuje suspenzia baktérií na živnú pôdu –

Müller-Hinton a ISO sensitiv agar obohatený 10 % MRS agar. Po naočkovaní baktérií sa na

Petriho misky poukladajú v dostatočnej vzdialenosti od seba antibiotické disky s vopred

stanovenou koncentráciou účinnej látky. Po procese kultivácie sa okolo diskov odčítajú

inhibičné zóny. Charakteristickým znakom antibiotických diskov je, že na nich baktérie

nedokážu rásť a vytvárať kolónie. Pod vplyvom antibiotika je ich rast potlačený, alebo sú

počas kultivácie usmrtené. Použitím diskovej difúznej metódy je možné zistiť či baktérie

vykazujú citlivosť na antibiotiká, priemernú citlivosť alebo rezistenciu (Atlas, 1997).

V prípade baktérií z čeľade Lactobacillaceae bola na testovanie antibiotickej

citlivosti použitá semikvantitatívna metóda E-test.

61

Testovanie citlivosti na ATB pomocou E-testu slúži na stanovenie minimálnej

inhibičnej koncentrácie (MIC), ktorá u testovaného antibiotika predstavuje najnižšiu

koncentráciu. Po inkubácii trvajúcej v rozpätí 18-24 hodín nastáva zastavenie rastu

jednotlivých testovaných baktérií. MIC prúžky aplikované na hodnotenie citlivosti

Lactobacillaceae na antibiotiká sú kalibrované. E-test sa podobá diskovej difúznej metóde

používanej pri Enterobacteriaceae. Robí sa prostredníctvom plastových prúžkov, ktoré sú

rozčlenené na jednotlivé zóny. V každej zóne je koncentrácia antibiotík rôzna. Je to vlastne

stupnica, na ktorej sú vyznačené jednotlivé hodnoty MIC. Pri E-teste dochádza k difúzii

antibiotika do média, pričom sa tvorí inhibičná zóna rastu baktérií. Tvar tejto zóny sa

podobá kvapke alebo slzičke. V miestach, kde sa konce stripu zbiehajú, je koncentrácia

antibiotika rovnaká ako hodnota MIC (Atlas, 1997).

3.4.1 Aplikované MIC stripy u Lactobacillaceae

Po naočkovaní bakteriálnej suspenzie sme postupne pomocou sterilnej pinzety

aplikovali MIC stripy na povrch agaru a to tak, aby časť stripu, ktorá obsahuje najnižšiu

koncentráciu ATB bola na povrch agaru pridaná ako prvá. Postupovali sme opatrne, aby

bola zabezpečená dobrá priľnavosť celej dĺžky MIC stripu k povrchu agaru.

V realizovanom experimente boli na hodnotenie antibiotickej citlivosti u laktobacilov

použité dve antibiotiká – vankomycín a gentamicín s rovnakou koncentráciou

0,015-256 µg.ml-1. Pri inkubovaní Petriho misiek boli zvolené podmienky spĺňajúce

požiadavky kultivácie zástupcov čeľade Lactobacillaceae. Výsledky antibiotickej

rezistencie boli vyhodnotené prostredníctvom (EUCAST, 2017).

Obdobie: JAR

Tab. 6 MIC stripy použité pre jednotlivé druhy baktérií Mikroorganizmus Názov ATB Trieda ATB Skratka

ATB Koncentrácia

v stripe (µg.ml-1)

Lactobacillus paracasei

gentamicín aminoglykozidy CN 0,015-256 vankomycín glykopeptidy VA 0,015-256

Lactobacillus rhamnosus

gentamicín aminoglykozidy CN 0,015-256 vankomycín glykopeptidy VA 0,015-256

Zdroj: (EUCAST, 2017)

62

Obdobie: LETO

Tab. 7 MIC stripy použité pre jednotlivé druhy baktérií Mikroorganizmus Názov ATB Trieda ATB Skratka

ATB Koncentrácia

v stripe (µg.ml-1)

Lactobacillus plantarum

gentamicín aminoglykozidy CN 0,015-256 vankomycín glykopeptidy VA 0,015-256

Zdroj: (EUCAST, 2017)

3.4.2 Aplikované antibiotické disky u Enterobacteriaceae Suspenziu baktérií, ktorá bola pred samotným naočkovaním na Müller-Hinton agar

nariedená na štandardnú denzitu roztoku o hodnote 0,5 McF° sme naniesli na živnú pôdu.

Antibiotické disky boli potom postupne rozmiestnené po dvojiciach na povrch

kultivačného média. Na testovanie antibiotickej citlivosti boli použité antibiotiká uvedené

v nasledujúcich tabuľkách.

Obdobie: JAR

Tab. 8 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií Mikroorganizmus Názov ATB Trieda ATB Skratka ATB Koncentrácia

v disku (µg)

Enterococcus faecalis

doripeném karbapenémy DOR 10 vankomycín glykopeptidy VA 5

Citrobacter freundii ampicilín penicilíny AMP 2 norfloxacín chinolóny NOR 10

Pseudomonas aeruginosa

doripeném karbapenémy DOR 10

Staphylococcus epidermidis

ampicilín penicilíny AMP 10 tetracyklin tetracyklíny TE 30

vankomycín glykopeptidy VA 0,015-256 Zdroj: (EUCAST, 2017) Obdobie: LETO

Tab. 9 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií Mikroorganizmus Názov ATB Trieda ATB Skratka ATB Koncentrácia

v disku (µg)

Acinetobacter calcoaceticus

imipeném karbapenémy IMP 10

tetracyklín tetracyklíny TE 30 Pseudomonas putida

doripeném karbapenémy DOR 10

63

Klebsiella oxytoca

ampicilín penicilíny AMP 10

chloramfenikol amfenikoly C 30

Enterobacter cloaceae

kyselina nalidixová

chinolóny NA 30

ofloxacín fluorochinolóny OFX 5

Citrobacter braakii

ampicilín penicilíny AMP 10

norfloxacín fluorochinolóny NOR 10 Citrobacter freundii

ampicilín penicilíny AMP 10 norfloxacín fluorochinolóny NOR 10

Raoueltella terigenna

ampicilín penicilíny AMP 10 chloramfenikol amfenikoly C 30

Raoueltella ornithinolytica

ampicilín penicilíny AMP 10 chloramfenikol amfenikoly C 30

Enterococcus faecalis

doripeném karbapenémy DOR 10 vankomycín glykopeptidy VA 5

Serratia liquefaciens

norfloxacín fluorochinolóny NOR 10 tetracyklín tetracyklíny TE 30

vankomycín glykopeptidy VA 0,015-256 Zdroj: (EUCAST, 2017)

Obdobie: JESEŇ

Tab. 10 Antibiotické disky použité pre jednotlivé druhy baktérií Mikroorganizmus Názov ATB Trieda ATB Skratka ATB Koncentrá-

cia v disku (µg)

Klebsiella oxytoca amikacín aminoglykozidy AK 10

ciprofloxacín fluorochinolóny CIP 10

gentamicín aminoglykozidy CN 10 imipeném karbapenémy IMP 10

Serratia liquefaciens

amikacín aminoglykozidy AK 10

ciprofloxacín fluorochinolóny CIP 10

gentamicín aminoglykozidy CN 10

imipeném karbapenémy IMP 10

Escherichia coli amikacín aminoglykozidy AK 10

ciprofloxacín fluorochinolóny CIP 10

gentamicín aminoglykozidy CN 10

imipeném karbapenémy IMP 10 Enterobacter amikacín aminoglykozidy AK 10

64

asburiae ciprofloxacín fluorochinolóny CIP 10

gentamicín aminoglykozidy CN 10

imipeném karbapenémy IMP 10

Pantoea agglomerans

amikacín aminoglykozidy AK 10

ciprofloxacín fluorochinolóny CIP 10

gentamicín aminoglykozidy CN 10

imipeném karbapenémy IMP 10

Raoueltella ornithinolytica

amikacín aminoglykozidy AK 10 ciprofloxacín ciprofloxacín CIP 10 gentamicín gentamicín CN 10 imipeném imipeném IMP 10

Zdroj: (EUCAST, 2017)

Tab. 11 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií Bakteriálny druh Druh masla/mlieka Skratka použitého ATB

C. freundii kravské maslo AMP, NOR K. oxytoca kravské maslo/mlieko AMP, C, AK, CIP, CN, IMP E. cloacae kravské mlieko NA, OFX C. braakii kravské maslo AMP, NOR R. terrigena kravské maslo/mlieko AMP, C R. ornithinolytica kravské maslo/mlieko AMP, C, AK, CIP, CN, IMP S. liquefaciens kravské maslo NOR, TE, AK, CIP, CN, IMP E.coli kravské maslo/mlieko AK, CIP, CN, IMP En. Asburiae kravské maslo AK, CIP, CN, IMP P. agglomerans kravské maslo AK, CIP, CN, IMP Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: AMP – ampicilín, C – chloramfenikol, AK – amikacín, CIP – ciprofloxacín, CN – gentamicín, IPM – imipeném, NA – kyselina nalidixová, OFX – ofloxacín, NOR – norfloxacín, TE – tetracyklín

Tab.12 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií Bakteriálny druh Druh masla/mlieka Skratka použitého ATB

L. rhamnosus kravské maslo CN, VA L. paracasei kravské maslo/mlieko CN, VA L. plantarum kravské maslo CN, VA Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: CN – gentamicín, VA – vankomycín

65

Tab. 13 Zhrnutie antibiotík aplikovaných na jednotlivé druhy baktérií Bakteriálny druh Druh masla/mlieka Skratka použitého ATB

Enterococcus faecalis kravské maslo/mlieko DOR,VA Pseudomonas aeruginosa kravské maslo/mlieko DOR Pseudomonas putida kravské maslo/mlieko DOR Staphylococcus aureus kravské mlieko AMP, TE Acinetobacter calcoaceticus kravské maslo IMP, TE Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: DOR – doripeném, VA – vankomycín, IMP – imipeném, AMP – ampicilín, TE – tetracyklín

Tab. 14 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Enterobacteriaceae Názov ATB Skratka ATB (mm)

S ≥ (mm) R <

ampicilín AMP 14 14 norfloxacín NOR 24 22 chloramfenikol C 17 17 amikacín AK 18 15 ciprofloxacín CIP 26 24 gentamicín CN 17 14 imipenem IMP 22 16 kyselina nalidixová NA - - ofloxacín OFX 24 22 tetracyklín TE - - Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: S ≥ veľkosť inhibičnej zóny pre citlivé baktérie, R < veľkosť inhibičnej zóny pre rezistentné baktérie

Tab. 15 Zóny pre zistenie antibiotickej rezistencie u Enterococcus spp. Názov ATB Skratka ATB (mm)

S ≥ (mm) R <

doripeném DOR - - vankomycín VA 12 12 Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: S ≥ veľkosť inhibičnej zóny pre citlivé baktérie, R < veľkosť inhibičnej zóny pre rezistentné baktérie

Tab. 16 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Pseudomonas spp. Názov ATB Skratka ATB (mm)

S ≥ (mm) R <

doripeném DOR 25 22 Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: S ≥ veľkosť inhibičnej zóny pre citlivé baktérie, R < veľkosť inhibičnej zóny pre rezistentné baktérie

66

Tab. 17 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Staphylococcus spp. Názov ATB Skratka ATB (mm)

S ≥ (mm) R <

ampicilín AMP 18 18 tetracyklín TE 22 19

Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: S ≥ veľkosť inhibičnej zóny pre citlivé baktérie, R < veľkosť inhibičnej zóny pre rezistentné baktérie

Tab. 18 Údaje pre určenie antibiotickej rezistencie u Acinetobacter spp. Názov ATB Skratka ATB (mm)

S ≥ (mm) R <

imipeném IMP 23 17 tetracyklín TE - -

Zdroj: (EUCAST, 2017) Legenda: S ≥ veľkosť inhibičnej zóny pre citlivé baktérie, R < veľkosť inhibičnej zóny pre rezistentné baktérie

3.5 Štatistické vyhodnotenie výsledkov

Výsledky boli štatisticky vyhodnotené pomocou programu Microsoft Office Excel

2007. Z výsledných priemerov boli k antibiotikám štatisticky vypočítané priemerné

hodnoty priemerov druhov baktérií čeľade Enterobacteriaceae a iných zástupcov. Pre

získané priemery bola vypočítaná aj smerodajná odchýlka, na základe ktorej je možné

určiť, ako sa hodnoty priemeru odchyľujú od priemerných hodnôt. V programe Microsoft

Office Excel 2007 bol na záver vypočítaný aj variačný koeficient, na základe ktorého je

medzi získanými priemermi porovnávaná variabilita.

67

4 Výsledky a diskusia

4.1 Stanovenie počtu mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a masla

Cieľom prvej časti realizovaného výskumu bolo zistiť počet mikroorganizmov

izolovaných z mlieka a masla. Počty boli stanovené u enterobaktérií patriacich do čeľade

Enterobacteriaceae, ktoré rástli na VČŽL agare. Rovnakým spôsobom sa zisťovali počty

aj u baktérií čeľade Lactobacillaceae, ktoré rástli na selektívnom živnom médiu s názvom

MRS agar. Mikroorganizmy boli počítané vždy po prvotnej kultivácii v každom ročnom

období.

Obdobie: JAR

Tab. 19 Počet vyrastených baktérií v mlieku v log KTJ.g-1 a v masle v log KTJ.ml-1 Číslo vzorky Enterobacteriaceae Lactobacillaceae

1. 4,37 3,14

2. 2,30 0,00 3. 0,00 3,28 4. 4,08 1,70 5. 2,60 3,01 6. 0,00 0,00 7. 1,70 0,00 8. 1,70 1,70 9. 0,00 2,00

10. 2,54 1,70 11. 2,00 0,00 12. 0,00 1,70

Zdroj: vlastný výskum

V jarnom období sa počet enterobaktérií vo vzorkách masla pohyboval v rozmedzí

od 0,00-4,37 log KTJ.g-1, v mlieku od 0,00-2,54 log KTJ.ml-1. Počty laktobacilov boli

nižšie a kolísali od 0,00-3,28 log KTJ.g-1 v masle a od 0,00-2 log KTJ.ml-1 v mlieku.

68

Obdobie: LETO

Tab. 20 Počet vyrastených baktérií v mlieku v log KTJ.g-1 a v masle v log KTJ.ml-1

Číslo vzorky Enterobacteriaceae Lactobacillaceae 1. 4,84 4,19 2. 4,53 4,42 3. 4,81 4,39 4. 4,70 4,41 5. 4,62 4,12 6. 4,71 4,37 7. 2,00 1,70 8. 1,70 2,00 9. 1,70 1,70

10. 0,00 0,00 11. 3,40 3,28 12. 2,54 3,60

Zdroj: vlastný výskum

V období leta počty enetrobaktérií získané zo vzoriek masla kolísali od 4,53-4,84 log

KTJ.g-1, vo vzorkách mlieka od 0,00-3,40 log KTJ.ml-1. Pri laktobaciloch boli

zaznamenané podobné výsledky. V prípade masla počty sa pohybovali v rozmedzí od 4,12

-4,42 log KTJ.g-1 a vo vzorkách mlieka od 0,00-3,60 log KTJ.ml-1.

Obdobie: JESEŇ

Tab. 21 Počet vyrastených baktérií v mlieku v log KTJ.g-1 a v masle v log KTJ.ml-1

Číslo vzorky Enterobacteriaceae Lactobacillaceae 1. 2,60 1,70 2. 2,78 2,78 3. 2,74 2,70 4. 4,53 4,29 5. 4,61 3,90 6. 4,77 3,99 7. 2,40 0,00 8. 2,54 0,00 9. 2,78 2,30

10. 1,70 0,00 11. 1,70 0,00 12. 1,70 1,70

Zdroj: vlastný výskum

Počas jesene boli u enterobaktérií zaznamenané počty v masle od 2,60-4,77 log

KTJ.g-1, v mlieku bol ich počet nižší a to od 1,70-2,78 log KTJ.ml-1. Vyšší počet

69

laktobacilov sa nachádzal v masle ako v mlieku a to od 1,70-4,29 log KTJ.g-1. Počet

laktobacilov vo vzorkách mlieka sa pohyboval od 0,00-2,30 log KTJ.ml-1.

V štúdii Bezeková et al. (2013) sa autori zaoberali problematikou laktobacilov vo

vzorkách surového kravského mlieka, odoberaných z cisterien a zistili, že počty týchto

baktérií sa pohybovali od 2,73 log KTJ.ml-1 do 6,28 log KTJ.ml-1. Hodnoty laktobacilov

kolísali od 2,74 do 6,28 log KTJ.ml-1. Vo výskumným tímom realizovanom výskume sa

počty laktobacilov pohybovali v priemere od 1,70 do 4,42 log KTJ.ml-1 za 3 ročné obdobie.

Výskumnému tímu sa podarilo stanoviť nižšie počty laktobacilov v porovnaní s touto

štúdiou. Výsledky tohto výskumu je však možné porovnať s nami realizovaným

výskumom len orientačne, pretože vzorky mlieka boli v prípade uvádzaného výskumu

odoberané z cisterien, no v nami realizovanom výskume z mlieka z domáceho chovu

a z obchodu.

Výsledky publikované v predloženej monografii je však možné komparovať

s výsledkami publikovanými autorom Shabani (2003), ktorého výskum bol zameraný na

sledovanie enetrobaktérií v surovom kravskom mlieku. V tejto štúdii boli spracované počty

enterobaktérií v 40-tich vzorkách surového kravského mlieka v regiónoch Albánska.

V našich výsledkoch z kravského mlieka bolo zistené, že priemerné počty enetroaktérií sa

pohybovali od 2,26 log KTJ.ml-1 do 6,37 KTJ.ml-1. Hodnoty enetrobaktérií kolísali od 2,26

do 6,37 log KTJ.ml-1. V nami realizovanom výskume boli pri enetrobaktériách

zaznamenané nižšie počty, ktoré sa v priemere pohybovali od 1,70 do 4,84 log KTJ.ml-1 za

3 ročné obdobie.

V práci Meshref (2010) sa zisťovali počty enterobaktérií vo vzorkách masla

odobraných z rôznych domácich chovov v Egypte. V tomto prípade sa počty enterobaktérií

vo vzorkách masla pohybovali v rozmedzí od 2,61 do 4,17 log KTJ.g-1, t. j. od 2,6 do 4,20

log KTJ.g-1. V výskumným tímom realizovanom experimente boli vo vzorkách masla

zistené vyššie počty enterobaktérií, a to v priemere od 2,30 do 4,84 log KTJ.g-1.

4.2 Identifikácia mikroorganizmov vyizolovaných z mlieka a masla

Výskumný tím mal v realizovanom experimente k dispozícii spolu 36 vzoriek.

Z nich sa v každom ročnom období, t. j. jar, leto, jeseň pracovalo s 12 vzorkami. Polovicu

z nich tvorili vzorky mlieka a druhú polovicu vzorky masla. Snahou výskumného tímu

bolo vyizolovať pestrú škálu mikroorganizmov patriacich do čeľade Enterobacteriaceae

a Lactobacillaceae. Po izolácii bola testovaná citlivosť baktérií voči vybraným druhom

antibiotík.

70

Obdobie: JAR

Tab. 22 Vyizolované druhy baktérií (v %)

Druh baktérie Počet pozitívnych vzoriek/ celkový počet vzoriek

Percentuálny podiel

Enterococcus faecalis 3/12 25,00 Citrobacter freundii 2/12 16,66

Pseudomonas aeruginosa 5/12 41,66 Lactobacillus rhamnosus 2/12 16,66 Lactobacillus paracasei 1/12 8,33

Staphylococcus epidermidis 2/12 16,66

Zdroj: vlastný výskum

Zo zástupcov čeľade Enterobacteriaceae sa výskumnému tímu počas jarného

obdobia podarilo z 12 vzoriek mlieka a masla v dvoch prípadoch izolovať C. freundii.

Baktérie patriace medzi Lactobacillaceae boli izolované v troch prípadoch. L. rhamnosus

sa vo vzorkách vyskytoval dva krát a L. paracasei sa podarilo izolovať raz. Výskum však

potvrdil prítomnosť zástupcov aj iných čeľadí – zástupcov čeľade Enterococcaceae v troch

prípadoch, pričom sa jednalo vždy o E. faecalis, až v piatich prípadoch sa vyskytla

P. aeruginosa a v dvoch prípadoch išlo o S. epidermidis.

Obdobie: JAR

Tab. 23 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla

Číslo vzorky Druh baktérie

1. C. freundii, L. paracasei 2. E. faecalis, P. aeruginosa 3. L. rhamnosus 4. E. faecalis,C. freundii 5. L. rhamnosus 6. P. aeruginosa 7. S. epidermidis 8. E. faecalis 9. P. aeruginosa

10. S. epidermidis 11. P. aeruginosa 12. P. aeruginosa

Zdroj: vlastný výskum

Na identifikáciu mikroorganizmov bola použitá veľmi moderná, rýchla a precízna

metóda MALDI TOF MS biotyper, ktorá je detailnejšie popísaná v kapitole 1.11.

Prostredníctvom nej bolo možné počas jari izolovať zo vzoriek masla, t. j. 1-6 E. faecalis,

C. freundii, L. rhamnosus, L. paracasei a P. aeruginosa. Zo vzoriek 9, 11 a 12, ktoré

71

prezentovali mlieko bola izolovaná P. aeruginosa, zo vzoriek 7 a 10 S. epidermidis a zo

vzorky 8 E. faecalis.

Obdobie: LETO

Tab. 24 Vyizolované druhy baktérií (%)

Druh baktérie Počet pozitívnych vzoriek/ celkový počet vzoriek

Percentuálny podiel

Acinetobacter calcoaceticus 1/12 8,33 Pseudomonas putida 2/12 16,66 Klebsiella oxytoca 7/12 58,33 Citrobacter freundii 2/12 16,66 Citrobacter braakii 1/12 8,33 Enterobacter cloacae 1/12 8,33 Raoultella terrigena 2/12 16,66 Raoultella ornithinolytica 6/12 50,00 Enteroccus faecalis 5/12 41,66 Serratia liqueciens 1/12 8,33 Lactobacillus plantarum 1/12 8,33

Zdroj: vlastný výskum

Z 12-tich letných vzoriek sa podarilo vyizolovať až v 7 prípadoch K. oxytoca,

v 6 prípadoch R. ornithinolytica, v 2 prípadoch R. terrigena a C. freundii. Baktérie

E. cloacae, S. liquefaciens a C. braakii boli izolované len v jednom prípade. Všetky tieto

baktérie patria do čeľade Enterobacteriaceae. Zo zástupcov Lactobacilaceae výskumný

tím izoloval v jednom prípade len jednu baktériu, a to L. plantarum. Identifikovaní boli aj

zástupcovia iných čeľadí – dvakrát sa vo vzorkách vyskytla baktéria P. putida patriaca do

čeľade Pseudomonadaceae, paťkrát bola izolovaná baktéria E. faecalis patriaca do čeľade

Enterococcaceae a raz Acalcoaceticus z čeľade Moraxellaceae.

Obdobie: LETO

Tab. 25 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla

Číslo vzorky Druh baktérie

1. C. freundii, R. ornithinolytica, L. plantarum2. K. oxytoca, R. ornithinolytica. C. braakii,

E. faecalis 3. C. freundii, S. liquefaciens, R.

ornithinolytica, E. faecalis 4. K. oxytoca, R. ornithinolytica 5. A.calcoaceticus, K. oxytoca, R.

72

ornithinolytica, E. faecalis 6. P. putida, R. terrigena, E. faecalis 7. K. oxytoca, En. asburiae 8. K. oxytoca, R. terrigena 9. E. cloacae, R. ornithinolytica

10. Negatívna 11. K. oxytoca, E. faecalis 12. P. putida, K. oxytoca

Zdroj: vlastný výskum

V období leta boli zo vzoriek masla 1-6 identifikované baktérie C. freundii, R.

ornithinolytica, R. terrigena, K. oxytoca, E. faecalis, S. liquefaciens, C. braakii,

L. plantarum, A. calcoaceticus a P. putida. Z letných vzoriek mlieka bola jedna – vzorka

10 negatívna. Vo vzorkách 7, 8, 9, 11 a 12 sa nachádzali baktérie K. oxytoca,

En. asburiae, E. cloacae, E. faecalis, R. terrigena, R. ornithinolytica a P. putida.

Obdobie: JESEŇ

Tab. 26 Vyizolované druhy baktérií (%)

Druh baktérie Počet pozitívnych vzoriek/ celkový počet vzoriek

Percentuálny podiel

Klebsiella oxytoca 5/12 41,66 Serratia liquefaciens 2/12 16,66 Escherichia coli 6/12 50,00 Enterobacter asburiae 1/12 8,33 Enterococcus faecalis 1/12 8,33 Pantoea agglomerans 1/12 8,33 Raoultella ornithinolytica 7/12 58,33 Lactobacillus paracasei 8/12 66,66

Zdroj: vlastný výskum

V jesennom období boli výskumom získané izoláty baktérie E. coli

(v 6 prípadoch), K. oxycota (v 5 prípadoch) a až v 7 prípadoch sa podarilo vyizolovať

R. ornithinolytica. Baktéria S. liquefacines sa vyskytla dvakrát, En. asburiae

a P. agglomerans raz. Všetky uvedené baktérie patria do čeľade Enterobacteriaceae. Až

v 8 prípadoch sa podarilo izolovať z Lactobacilaceae baktériu L. paracasei, päťkrát bola

izolovaná E. faecalis zastupujúca čeľaď Enterococcaceae.

73

Obdobie: JESEŇ – 12 vzoriek

Tab. 27 Vyizolované druhy baktérií z mlieka a masla

Číslo vzorky Druh baktérie

1. E. coli, K. oxytoca, L. paracasei 2. P. agglomerans, R. ornithinolytica,

L. paracasei, En. asburiae 3. S. liquefaciens, K. oxytoca, L. paracasei 4. K. oxytoca, R. ornithinolytica, E. faecalis,

L. paracasei 5. S. liquefaciens, R. ornithinolytica,

L. paracasei 6. E. coli, R. ornithinolytica, L. paracasei 7. E. coli, K. oxytoca, R. ornithinolytica 8. R. ornithinolytica 9. E. coli, R. ornithinolytica, L. paracasei 10. negatívna 11. E. coli, K. oxytoca 12. E. coli, L. paracasei

Zdroj: vlastný výskum

Vo všetkých vzorkách masla (1 až 6) sa nachádzali E. coli, K. oxytoca,

P. agglomerans, R. ornithinolytica, S. liquefaciens, E. faecalis, En. asburiae

a L. paracasei. Vo vzorkách mlieka (7 až 12) boli identifikované E. coli, K. oxytoca,

R. ornithinolytica a L. paracasei. Vo vzorke 10 nebol identifikovaný žiadny

mikroorganizmus, táto vzorka vykazovala negativitu.

4.3 Antibiotická rezistencia čeľade Enterobacteriaceae

Výskumný tím počas realizovaného experimentálneho skúmania sa dopracoval

k nasledovným výsledkom, že 100 % všetkých izolovaných baktérii z čeľade

Enterobacteriaceae vykazovalo rezistenciu voči ampicilínu a ofloxacínu. Z izolátov bolo

75 % citlivých na norfloxacín. Z izolovaných baktérií sa na hranici rezistencie a citlivosti

na norfloxacín nachádzalo 25 %. Pri amikacíne, ciprofloxacíne a chloramfenikole bola

detegovaná 100 % citlivosť izolátov. V prípade gentamicínu vykazovalo citlivosť 83,4 %

izolátov a na rozhraní medzi citlivosťou a rezistenciou sa nachádzalo 16,6 % izolátov.

Rezistentných proti imipenemu bolo 83,4 % izolátov. Naopak 25 % izolátov sa nachádzalo

na prahu citlivosti a rezistencie voči imipenemu.

Pri zisťovaní citlivosti a rezistencie na antibiotiká sa postupovalo podľa tabuliek

vytvorených EUCAST Clinica. Avšak v prípade tetracyklínu a kyseliny nalidixovej nebolo

74

možné dopracovať sa k údajom o inhibičných zónach ATB. Výskumný tím preto

postupoval podľa knihy Atlas (1997) a zistil, že 100 % izolovaných baktérií bolo citlivých

na kyselinu nalidixovú. Rovnako aj v prípade tetracyklínu išlo o 100 % citlivosť izolátov.

Pri veľkom množstve baktérií bola detegovaná citlivosť. Avšak podstatne veľká časť zo

všetkých izolovaných baktérií vykazovala aj 100 % rezistenciu na antibiotiká. Dôvodom

tohto stavu bola mutácia niektorých bakteriálnych génov, alebo gény získali od inej

bakteriálnej bunky.

Antibiotikum ampicilín, na ktorý vykazovali baktérie 100 % rezistenciu, patrí do

triedy penicilínov. Rovnako aj pri ofloxacíne, ktorý je fluorochinolón, bola detegovaná

100 % rezistencia.

0

20

40

60

80

100

120

AMP NOR C AK CIP CN IMP NA OFX TE

rezistentné intermediátne citlivéAntibiotiká

Obr. 4 Antibiotická rezistencia čeľade Enterobacteriaceae (v %) Zdroj: vlastný výskum

Legenda: AMP – ampicilín, C – chloramfenikol, AK – amikacín, CIP – ciprofloxacín, CN – gentamicín, IPM – imipeném, NA – kyselina nalidixová, OFX – ofloxacín, NOR – norfloxacín, TE – tetracyklín

4.3.1 Zistenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB

Po nameraní priemerov inhibičných zón jednotlivých ATB boli tieto údaje

spracované do tabuľky. K priemerom inhibičnej zóny sme sa dopracovali meraním

inhibičnej zóny od jedného okraja po druhý. Merania sa realizovali na troch miestach.

Priemerná hodnota bola vypočítaná na základe meraní v týchto miestach. Takto získaný

priemer sme opäť spracovali do tabuľky, a to konkrétne, pre jednotlivé ATB a druhy

baktérií, na ktorých bola testovaná antibiotická rezistencia. Z uvedených priemerov bola

nakoniec vypočítaná priemerná hodnota inhibičnej zóny pre druhy baktérií patriacich do

An

tib

ioti

cká

rezi

sten

cia

v%

75

čeľade Enterobacteriaceae. Z uvedených údajov bol zhotovený graf priemerných

inhibičných zón pre konkrétne antibiotiká.

Obr. 5 Grafické zobrazenie priemerov inhibičných zón čeľade Enterobacteriacea

Zdroj: vlastný výskum

Legenda: AMP – ampicilín, C – chloramfenikol, AK – amikacín, CIP – ciprofloxacín, CN – gentamicín, IPM – imipeném, NA – kyselina nalidixová, OFX – ofloxacín, NOR – norfloxacín, TE – tetracyklín

Obr. 6 Zóna inhibície pri C. braakii Zdroj: Kačániová (2017)

4.3.2 Zosumarizovanie výsledkov pre konkrétne triedy ATB

Tab. 28 Antibiotická rezistencia ku príslušnej antibiotickej triede bakteriálnych zástupcov čeľade Enterobacteriaceae

Trieda ATB Názov ATB R/P R/P (%) I/P I/P (%) C/P C/P (%)

Karbapenémy imipenem 1/6 16,6 0/6 0 5/6 83,4 Penicilíny ampicilín 6/6 100 0/6 0 0/6 0 Fluorochinolóny

ciprofloxacín 0/6 0 0/6 0 6/6 100 ofloxacín 1/1 100 0/1 0 0/1 0

norfloxacín 0/4 0 ¼ 25 ¾ 75

76

Chinolóny kyselina nalidixová

0/1 0 0/1 0 1/1 100

Aminoglykozidy

amikacín 0/6 0 0/6 0 6/6 100 gentamicín 0/6 0 1/6 16,6 5/6 83,4

Fenikoly chloramfenikol 0/3 0 0/3 0 3/3 100 Tetracyklíny tetracyklín 0/1 0 0/1 0 1/1 100

Zdroj: vlastný výskum Legenda: R/P – rezistentné baktérie/počet, I/P- intermediátne baktérie/počet, S/P- citlivé baktérie/počet

Po zosumarizovaní všetkých výsledkov výskumu sa zistilo, že v nami realizovanom

výskume vykazovali baktérie najvyššie hodnoty rezistencie ku viacerým triedam antibiotík.

Konkrétne bola detegovaná 100 % rezistencia voči fluorochinolónovému antibiotiku

ofloxacín a ampicilínu patriacemu ku penicilínom. Na základe výsledkov publikovaných

Hanulíkom et al. (2010), v ktorej sa autori zaoberali problematikou antibiotík a rezistencie

na antibiotiká. Rezistencia voči fluorochinolónom mohla byť napr. spôsobená zmenou

a inhibíciou enzýmov topoizomerázy IV a DNA gyrázy, ktoré sú potrebné pre naviazanie

antibiotika na cieľové miesto.

Práca Liwa a Jaka (2015), ktorá sa zaoberala antibiotickou rezistenciu čeľade

Enterobacteriaceae poskytla informácie, že pre penicilínové antibiotiká spočíva rezistencia

v zničení β-laktámového kruhu produkciou β-laktamáz. Nie je však možné s určitosťou

potvrdiť, že to bolo tak aj v nami realizovanom výskume, nakoľko jeho cieľom nebola

detekcia a popisovanie jednotlivých enzýmov. Na druhej strane bakteriálne druhy

vykazovali aj relatívne vysokú citlivosť. Dokonca v piatich prípadoch sa jednalo o 100 %

citlivosť voči jednotlivým antibiotickým triedam. Bolo to tak v prípade fluorochinolónov,

aminoglykozidov, chinolónov, tetracyklínov a u fenikolových antibiotík.

4.3.3 Základná štatistika výsledkov učeľade Enterobacteriaceae

Tab. 29 Štatistické zhodnotenie antibiotickej rezistencie čeľade Enterobacteriaceae ATB Počty výskytu Priemer v mm S.D. v (%)

Imipenem 6 24,16 4,49 18,60 Ampicilín 6 1,66 3,73 224,70 Ciprofloxacín 6 31,11 2,36 7,59 Ofloxacín 1 21,00 0,00 0,00 Norfloxacín 4 29,50 4,27 14,47 Kyselina nalidixová

1 19,00 0,00 0,00

Amikacín 6 20,83 1,86 8,93

77

Gentamicín 6 17,83 1,77 10,10 Chloramfenikol 3 24,66 2,87 11,64 Tetracyklín 1 35,00 0,00 0,00

Zdroj: vlastný výskum

Z nameraných priemerov inhibičných zón boli pre jednotlivé antibiotiká vypočítané

priemerné hodnoty. Ako je možné vidieť z tabuľky 29, v niektorých prípadoch vyšli

smerodajné odchýlky v nulových hodnotách. Stalo sa tak preto, lebo pri bakteriálnych

druhoch boli dané antibiotiká použité len jeden raz. Z tohto dôvodu vyšli aj výsledné

variačné koeficienty nulové. Bolo to spôsobené tým, že jednotlivé hodnoty priemerov boli

v niektorých prípadoch rovnaké, t. j. podobali sa. Bol to prípad ofloxacínu, kyseliny

nalidixovej a tetracyklínu. Zo stanovených priemerov inhibičných zón bol vypočítaný

priemer pre imipenem 24,16±4,49 a pre ampicilín 1,66±3,73. Pre ciprofloxacín bol priemer

31,11±2,36 a norfloxacín 29,50±4,27. Priemer stanovený z priemerných inhibičných zón

pre amikacín bol 20,83±1,86, gentamicín 17,83 ± 1,77 a chloramfenikol 24,66 ± 2,87.

Výsledky nami realizovaného výskumu je možné komparovať s výsledkami

dosiahnutými Caine et al. (2013), ktorým sa podarilo izolovať E. coli zo surového

kravského mlieka z rôznych lokálnych fariem v Južnej Afrike. V priemere túto baktériu

identifikovali z celkového počtu 200 druhov v 48 prípadoch, čo predstavovalo 24 %. Pri

vyhodnocovanú výsledkov uviedli, že sa jednalo o nedostatočnú hygienu na farmách, ako

aj nízke povedomie ľudí o hygiene. Obdobná situácia sa mohla zopakovať aj v nami

realizovanom výskume, pretože ako bolo spomenuté už vyššie, v jesennom období sa nám

podarilo izolovať E. coli až z polovice vzoriek.

S výsledkami výskumu autorov Caine et al. (2013) je možné porovnať aj testovanie

antibiotickej citlivosti, ktorú vykonali diskovou difúznou metódou. Za týmto účelom

používali rôzne typy antibiotík. Citlivosť na gentamicín detegovali až u 100 % izolátov.

V nami realizovanom výskume bola rezistencia testovaná s využitím amikacínu,

gentamicínu, ciprofloxacínu a imipenemu. V prípade gentamicínu boli dosiahnuté rovnaké

výsledky a tak isto 100 % izolátov vykazovalo citlivosť na toto antibiotikum.

Vo výskume zameranom na rezistencie čeľade Lactobacillaceae výskumný tím

zistil, že izoláty L. rhamnosus a L. paracasei boli rezistentné na vankomycín. Pri

L. plantarum bola detegovaná citlivosť. To znamená, že 75 % izolátov bolo rezistentných

na vankomycín a 25 % vykazovalo citlivosť. Vo všetkých troch prípadoch bola detegovaná

100 % citlivosť na gentamicín. Postupovalo sa podľa Atlas (1997).

78

Obr. 7 Antibiotická rezistencia čeľade Lactobacillaceae (v %) Zdroj: vlastný výskum

Legenda: CN – gentamicín, VA – vankomycín

4.4 Antibiotická rezistencia čeľade Lactobacillaceae

4.4.1 Stanovenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB

Tab. 30 Vyjadrenie antibiotickej rezistencie a citlivosti čeľade Lactobacillaceae (µl.ml-1) u konkrétnych druhov

Druh baktérie Aplikované ATB s uvedenou koncentráciou

gentamicín vankomycín

L. rhamnosus citlivý pri c = 0,5 µl.ml-1 rezistentný pri c = 0 µl.ml-1

L. paracasei citlivý pri c = 0,25 µl.m l-1 rezistentný pri c = 0 µl.ml-1

L. plantarum citlivý pri c = 0,16 µl.ml-1 citlivý pri c = 1 µl.ml-1

Zdroj: vlastný výskum

Na základe týchto údajov je možné vyhodnotiť, že v prípade použitia vankomycínu

s koncentráciou MIC v stripe (c=0,015-256 µg.ml-1) vznikla v dvoch prípadoch

pri L. rhamnosus a L. paracasei inhibičná zóna v tvare pretiahnutej slzičky, pretože obidva

druhy baktérií vôbec nerástli, nakoľko boli rezistentné. Druh L. rhamnosus bol citlivý na

gentamicín pri koncentrácii c=0,5 µl.ml-1, L. paracasei pri c=0,25 µl.ml-1

a L. plantarum pri c=0,16 µl.ml-1 izolátov len v 25 %. Vo zvyšných 75 % sa jednalo

o rezistenciu na vankomycín.

79

Obr. 8 Zóny inhibície MIC pri testovaní Lactobacillus paracasei

Zdroj: Kačániová (2017)

V mlieku a rovnako aj v mliečnych výrobkoch je z baktérií mliečneho kvasenia

dominujúcim druhom baktéria L. plantarum. Avšak v realizovanom výskume bol

identifikovaný len v letnom období. Nachádzal sa v jednej vzorke masla, a tak tvoril len

8,33 % vyizolovaných druhov. Rovnako ako bol L. plantarum identifikovaný v masle, tak

ho izolovali z mliečnych výrobkov aj vo svojom výskume Mathara et al. (2008).

Ostatné druhy čeľade Lactobacillaceae boli detegované v lete. Konkrétne to bol

L. rhamnosus v dvoch vzorkách masla, kde predstavoval 16,66 % podiel izolátov.

L. paracasei bol izolovaný len v jednom prípade. Rovnako to bolo zo vzorky masla. Tvoril

8,33 % vyizolovaných druhov baktérií.

Pri testovaní antibiotickej rezistencie u čeľade Lactobacillaceae boli aplikované

dve antibiotiká – gentamicín a vankomycín. Všetky tri druhy L. rhamnosus, L. paracasei

a L. plantarum vykazovali citlivosť voči gentamicínu pri používaných koncentráciách

c=0,16 µl.ml-1, c=0,25 µl.ml-1 a c=0,5 µl.ml-1. Tieto výsledky je preto možné porovnať so

štúdiou autorov Zhou et al. (2010), v ktorej bola naopak pri L. plantarum detegovaná

rezistencia na gentamicín.

Jednotlivé výsledky sa od štúdie k štúdii rôznia. D´Aimmo et al. (2007) testovali

antibiotickú rezistenciu laktobacilov spolu so streptokokmi a bifidobaktériami.

Na testovanie používali antibiotiká tetracyklín, gentamicín, ampicilín a erytromycín.

V prípade gentamicínu boli hodnoty MIC medzi 2-16 µl.ml-1. V nami realizovanom

výskume sa pre gentamicín pracovalo s hodnotami MIC medzi 0,16-0,5 µl.ml-1.

Gad et al. (2014) počas svojho experimentu izolovali z farmaceutických

a mliečnych výrobkov streptokoky, laktokoky a laktobacily. Detegovali u nich rezistenciu

80

na β-laktámové antibiotiká. V ich výskume boli streptokoky a laktokoky citlivé na

vankomycín. Naopak druhy baktérií čeľade Lactobacillaceae boli voči nemu rezistentné.

Rezistenciu testovali aj na tetracyklín a zistili, že z testovaných druhov baktérií mnohé

vykazovali voči nemu citlivosť. Pre porovnanie výsledkov dosiahnutých v nami

realizovanom výskume s ich výsledkami je možné konštatovať, že aj v našom výskume bol

L. rhamnosus rezistentný voči vankomycínu. Rovnako tak to bolo aj pri L. paracasei.

V prípade L. plantarum bola detegovaná citlivosť na vankomycín.

Essid et al. (2009) počas experimentálnej práce zaoberajúcej sa laktobacilmi došli

k záveru, že všetky baktérie, ktoré izolovali z tradičného masla boli citlivé na amikacín,

cefuroxím, gentamicín a streptomycín. Rezistenciu detegovali u 70,5 % izolovaných

druhov a to voči ampicilínu a penicilínu G. S výsledkami nášho výskumu to môžeme

porovnať len čiastočne, nakoľko sme na testovanie antibiotickej rezistencie použili len dve

antibiotiká – gentamicín a vankomycín. Avšak rovnako aj v nami realizovanom výskume

vyšla pri druhoch L. plantarum, L. rhamnosus a L. paracasei detegovaných vo vzorkách

masla 100 % citlivosť týchto izolátov na gentamicín.

4.5 Antibiotická rezistencia bakteriálnych druhov iných čeľadí vyizolovaných z mlieka a masla

Počas cielenej izolácie druhov baktérií z čeľade Enterobacteriaceae

a Lactobacillaceae na Petriho miskách vyrástli aj iné druhy baktérií, ktoré patria do iných

čeľadí. Pravdepodobne boli pre tieto cielené druhy baktérií vytvorené vhodné kultivačné

podmienky, alebo sa na Petriho miskách začali rozrastať v dôsledku sekundárnej

kontaminácie z okolitého prostredia. Aj keď patria medzi iné druhy, rovnako ich

riešiteľský tím testoval po identifikácii na antibiotickú rezistenciu. Podarilo sa mu

identifikovať a testovať G+ baktériu Staphylococcus epidermidis a Enterococcus faecalis.

Z G- baktérií bola antibiotická rezistencia testovaná na Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas putida a Acinetobacter calcoaceticus. Riešiteľský tím počas testovania

uvedených druhov zistil, že 100 % baktérií bolo rezistentných na ampicilín, doripenem

a vankomycín. V prípade rezistencie na tetracyklín zaznamenal z dvoch prípadov v jednom

rezistenciu. Rezistentný bol S. epidermidis a citlivý na tetracyklín bol A. calcoaceticus.

V tomto prípade bolo citlivých 50 % a rezistentných tiež 50 % baktérií na tetracyklín.

100 % citlivosť bola detegovaná len v prípade A. calcoaceticus na imipenem. Pri testovaní

citlivosti a rezistencie daných bakteriálnych druhov boli rovnako ako v prípade

Enterobacteriaceae používané tabuľky vytvorené EUCAST Clinica. Avšak údaje

81

o tetracyklíne sa nepodarilo získať. Chýbajúce údaje boli preto doplnené z Atlas (1997)

tak, ako to bolo aj v prípade baktérií čeľade Enterobacteriaceae.

0

20

40

60

80

100

120

DOR VA AMP TE IMPrezistentné intermediátne citlivé

Obr. 9 Antibiotická rezistencia iných čeľadí vyjadrená v percentách Zdroj: vlastný výskum

4.5.1 Vyhodnotenie priemerov inhibičných zón pre jednotlivé ATB

Rovnako ako u čeľade Enterobacteriaceae, tak aj u iných druhov boli odmerané

inhibičné zóny ATB, spracované do tabuľky. Riešiteľský tím postupoval aj v tomto

prípade rovnakým spôsobom. Zóny boli merané z jednej strany na druhú v troch rôznych

miestach. Na základe toho bola potom vypočítaná priemerná hodnotu z týchto miest.

Výsledky boli opäť spracované do tabuľky pre bakteriálne druhy a jednotlivé druhy ATB.

Zo získaných priemerov bol vypočítaný priemer inhibičných zón pre tieto ostatné druhy

baktérií. Po spracovaní všetkých údajov boli výsledky výskumu graficky zobrazené.

Obr. 10 Grafické zobrazenie priemerov inhibičných zón iných čeľadí

Zdroj: vlastný výskum Legenda: DOR - doripenem, VA - vankomycín, AMP - ampicilín, TE - tetracyklín, IMP - imipenem

Ant

ibio

tick

á r

ezis

tenc

ia v

%

82

Obr. 11 Inhibičná zóna u E. faecalis

Zdroj: Kačániová (2017)

Obr. 12 Inhibičná zónu u P. putida

Zdroj: Kačániová (2017)

4.5.2 Zosumarizovanie výsledkov pre konkrétne triedy ATB

Tab. 31 Antibiotická rezistencia ku príslušnej antibiotickej triede u bakteriálnych

zástupcov iných čeľadí

Trieda ATB Názov ATB R/P R/P (%) I/P I/P (%) C/P C/P (%)

karbapenémy

doripenem 4/4 100 0/4 0 0/4 0 imipenem 0/1 0 0/1 0 1/1 100

penicilíny ampicilín 1/1 100 0/1 0 0/1 0 glykopeptidy vankomycín 2/2 100 0/2 0 0/2 0 tetracyklíny tetracyklín ½ 50 0/0 0 ½ 50

Zdroj: vlastný výskum Legenda: R/P – rezistentné baktérie/počet, I/P- intermediátne baktérie/počet, S/P- citlivé baktérie/počet

83

Na základe získaných údajov riešiteľský tím zistil, že bakteriálne druhy iných čeľadí

vykazovali 100 % rezistenciu na doripenem, patriaci medzi karbapenemy

a k ampicilínu, ktorý zastupuje triedu antibiotík s názvom penicilíny. Rovnako bola

detegovaná 100 % rezistencia na glykopeptid vankomycín. Pri tetracyklíne, ktorý sa

nachádza v triede tetracyklínových antibiotík bola v jednom z dvoch prípadov detegovaná

citlivosť. To znamená, že 50 % izolátov bolo rezistentných voči tetracyklínu. Na druhej

strane bolo 50 % izolátov naň citlivých, pretože v jednom prípade sa vytvorila inhibičná

zóna. V prípade karbapenemového antibiotika imipenemu bola zaznamenaná 100 %

citlivosť bakteriálnych druhov.

4.5.3 Základná štatistika výsledkov u iných čeľadí

Tab. 32 Štatistické zhodnotenie antibiotickej rezistencie bakteriálnych druhov z iných

čeľadí

ATB Počty výskytu priemer S.D. v (%)

doripenem 4 16,75 1,30 7,76 imipenem 1 22,00 0,00 0,00 ampicilín 1 0,00 0,00 0,00 vankomycín 2 0,00 0,00 0,00 tetracyklín 2 17,50 6,50 0,37

Zdroj: vlastný výskum

Po zmeraní priemerov inhibičných zón sa výskumný tím dopracoval k priemerných

hodnotám pre jednotlivé typy antibiotík. Z tabuľky 32 je možné vidieť, že v prípade

imipenemu, ampicilínu a vankomycínu boli zistené smerodajné odchýlky a z toho plynúce

variačné koeficienty v nulových hodnotách. K týmto výsledkom sa dospelo z dôvodu, že sa

pri imipeneme a ampicilíne sa antibiotická rezistencia testovala len v jednom prípade.

V prípade vankomycínu sa rezistencia testovala v dvoch prípadoch, avšak pre inhibičné

zóny bol pre doripenem stanovený priemer 16,75±1,3 a tetracyklín 17,5±6,5.

Görner a Valík (2004) vo svojich štúdiách uvádzajú, že zástupcovia rodu

Pseudomonas a to P. putida a P. fluorescens tvoria v surovom kravskom mlieku 47-84 %

populácie. V realizovanom výskume sa podarilo izolovať v jarnom období z rodu

Pseudomonas P. aeruginosa v piatich vzorkách. Boli vyizolované z mlieka aj masla

s percentuálnym podielom 41,66 %. V lete boli z tohto rodu izolované P. putida

z dvoch vzoriek. V jednom prípade sa jednalo o mlieko, a v druhom bol detegovaný vo

vzorke masla.

84

V našich vzorkách bol z čeľade Enterococcaceae izolovaný len druh E. faecalis

patriaci do rodu enterokokov. Na základe toho je možné získané výsledky porovnať

so štúdiou Citak et al. (2005).

Z enterokokov boli aj v ich experimente izolované z mlieka hlavne E. faecalis a to

v 54,2 %. Počas ich experimentálnej práce sa im však zo vzoriek surového mlieka podarilo

izolovať aj iné druhy enterokokov ako napr. E. faecium, E. durans, E. italicus

a E. malodoratus. Pri spomínaných druhoch baktérií bola testovaná citlivosť na antibiotiká,

a to na vankomycín, ampicilín, tetracyklín, gentamicín, erytromyxín a teikoplanín. Kým

v ich prípade bola najvyššia rezistencia dosiahnutá na tetracyklín, v našom prípade bola

dosiahnutá 100 % rezistencia na doripenem aj vankomycín.

Aj vo výskumných prácach iných autorov patrí E. faecalis medzi dominantné druhy

enterokokov, ktoré boli izolované z mlieka, ale aj z mliekarenských zariadení (Teixeira et

al., 2005; Gomes et al., 2008).

V ďalšej výskumnej činnosti Citak et al. (2006) detegovali vysokú rezistenciu voči

streptomycínu (97 %) a erytromycínu (95 %). Podľa Valenzuela et al. (2008), ktorí počas

testovania rezistencie na E. faecalis a E. faecium zistili, že E. faecalis bol v najväčšom

počte prípadov rezistentný voči rifampicínu a to až v 8/9 prípadov, nasledovala rezistencia

proti ciprofloxacínu 6/9 a na erytromycín bol rezistentný v 5/9 prípadov. Najnižší počet

prípadov rezistencie bolo detegovaných pri vankomycíne, a to len 1/9. V prípade

E. faecium bolo najviac izolátov rezistentných voči ciprofloxacínu a to až v 12/16

prípadov. Počet izolátov rezistentných na vankomycín bol len 2/9. Na základe týchto štúdií

je možné komparovať aj nami dosiahnuté výsledky. Pri menovaných autoroch boli zistené

nízke počty izolátov rezistentné voči vankomycínu. V našom prípade to bolo naopak,

a počas experimentálnej časti práce vo všetkých 3 ročných obdobiach bol E. faecalis

rezistentný na vankomycín. Okrem neho bol na testovanie antibiotickej rezistencie

používaný aj doripenem patriaci do triedy karbapenémov. Rovnako aj naň bola

zaznamenananá 100 % rezistencia E. faecalis.

85

Záver

Cieľom výskumu spracovaného vo vedeckej monografii bolo izolovať rôznorodé

bakteriálne druhy patriace do čeľade Enterobacteriacea a rovnako aj druhy baktérií čeľade

Lactobacillaceae, u ktorých bola testovaná citlivosť na vybrané typy antibiotík. Vo

výskume sa však podarilo izolovať aj zástupcov iných čeľadí. Aj u nich bola tiež testovaná

citlivosť na antibiotiká. Experiment prebiehal tak, že po izolácii a následnej identifikácii

bakteriálnych druhov prostredníctvom modernej a rýchlej metódy MALDI-TOF MS

biotyper bola na nich testovaná citlivosť.

Riešiteľský tím rozdelil izoláciu mikroorganizmov do trojročného obdobia.

V každom ročnom období pracoval s 12 vzorkami. V jarnom období testovania pochádzali

vzorky zo súkromného chovu, ale aj z obchodnej prevádzky. V nasledujúcom letnom

a jesennom období sa pracovalo so vzorkami masla a mlieka len z domáceho chovu.

Prvých 6 vzoriek tvorilo kravské maslo, ktoré bolo vyrobené z mlieka troch rôznych

dojníc, pričom od každej dojnice boli pre potreby výskumu získané dve vzorky masla.

Druhú polovicu vzoriek tvorilo surové kravské mlieko, odobraté rovnako od troch dojníc.

Aj v tomto prípade boli od každej dojnice získané dve vzorky. Najnižší počet enteroaktérií

bol zaznamenaný vo vzorke mlieka z domáceho chovu v letnom období. Naopak najvyšší

počet bol zistený vo vzorke masla z obchodného reťazca v jarnom období. Pri

laktobaciloch bol najnižší počet získaný v jarnom období zo vzorky mlieka z obchodného

reťazca. Najvyšší počet laktobacilov bol vo vzorke masla z domáceho chovu v letnom

období.

V jednotlivých ročných obdobiach sa výskumnému tímu podarilo izolovať

rôznorodé druhy baktérií patriacich prevažne do čeľade Enterobacteriaceae. V mnohých

prípadoch boli izolované Klebsiella oxytoca, Escherichia coli a Raoultella ornithinolytica.

Pri určovaní antibiotickej rezistencie u Enterobacteriaceae sa vychádzalo z tabuliek

EUCAST Clinica. Chýbajúce údaje o tetracyklíne a kyseline nalidixovej boli doplnené

z Atlas (1997). Z laktobacilov boli v priebehu jari, leta a jesene izolovaní traja zástupcovia

– Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei a Lactobacillus rhamnosus. Citlivosť

izolátov na antibiotiká bola stanovená na základe údajov z Atlas (1997). Z iných čeľadí

boli vo všetkých troch ročných obdobiach izolovaný E. faecalis, ktorý patrí do čeľade

Enterococcaceae. Izolované boli však aj iné druhy. Rovnako aj tieto izoláty boli použité

na testovanie citlivosti. Pri určovaní citlivosti a rezistencie sa údaje vychádzalo z Atlas

86

(1997). Antibiotická rezistencia pri Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae a zástupcov

iných čeľadí boli vyhodnocované osobitne.

Na základe vyhodnotenia údajov boli spracované závery výskumu, v ktorých sa

uvádza, že v čeľadi Enterobacteriaceae bolo 100 % testovaných druhov baktérií

rezistentných na ampicilín a ofloxacín. Naopak u podstatne väčšieho počtu baktérií bola

detegovaná 100 % citlivosť na amikacín, ciprofloxacín, gentamicín a tetracyklín. Pri

norfloxacíne bola zaznamenaná 75 % citlivosť izolátov a 25 % druhov bolo na hranici

rezistencie a citlivosti. Výskum poukázal na 83,4 % citlivosť na gentamicín a 16,6 % na

rozhraní citlivosti a rezistencie. Citlivosť v tejto čeľadi bola testovaná aj pri imipeneme.

Zistiné bolo, že až 83,4 % izolátov vykazovalo naň citlivosť a 16,6 % rezistenciu.

Pri osobitnom vyhodnotení údajov pre čeľad Lactobacillaceae sa zistilo, že 75 %

izolovaných druhov baktérií bolo rezistentných a 25 % citlivých na vankomycín. V prípade

druhého testovaného antibiotika – gentamicínu bola zaznamenaná 100 % citlivosť.

Na záver bola testovaná antibiotická rezistencia vybraných druhov baktérií iných

čeľadí. Výskumný tím zistil, že 100 % izolovaných druhov bolo rezistentných na

doripenem, vankomycín a ampicilín. Pri tetracyklíne vykazovalo 50 % izolátov rezistenciu

a 50 % testovaných druhov citlivosť. Pri imipeneme bola detegovaná 100 % citlivosť

baktérií iných čeľadí.

Vzniknutá rezistencia mohla byť spôsobená prirodzeným zakódovaním rezistencie

v štrukturálnych a funkčných vlastnostiach jednotlivých baktérií. Na strane druhej prípady

rezistencie u nami testovaných druhov baktérií na antibiotiká mohli byť výsledkom

génovej mutácie alebo mohli byť zapríčinené transferom génov od jednej baktérie k druhej.

Avšak aká je skutočnosť, to sa môžeme len domnievať.

Výskumným tímom vyhodnotené výsledky boli potom pri každej z testovaných

čeľadí porovnané s výsledkami štúdií iných autorov. Výsledky zo zahraničných

experimentov tvorili prevažne izoláty zo surového kravského mlieka. Preto aj komparácia

spracovaných výsledkov bola realizovaná hlavne s nimi.

Poznatky potrebné pre spracovanie prehľadu teoretickej časti monografie boli

čerpané od rôznych autorov, ktorí sa zaoberali problematikou mlieka, mliečnych

produktov, antibiotík a k nich prislúchajúcej rezistencii. Nakoľko riešená problematika

patrí v súčasnej dobe medzi globálne problémy, je potrebné ju skúmať a objasniť dôvody

vzniku antibiotickej rezistencie, ktorá je pre ľudstvo stále väčšou hrozbou.

87

Abstrakt

Antibiotiká, prírodné zlúčeniny produkované rôznymi skupinami mikroorganizmov.

Hlavnými producentami sú mikroorganizmy patriace do rodov Penicillium, Streptomyces,

Actinomycetes a Bacillus. Antibiotiká sa používajú na liečbu bakteriálnych infekcií ľudí

a zvierat po celom svete. Rezistencia voči nim môže byť prirodzená alebo získaná. Znížená

citlivosť baktérií na antibiotiká je zakódovaná vo viacerých génoch, z ktorých mnohé sú

prenášané medzi baktériami. V experimentálnej časti monografie bola testovaná

antibiotická rezistencia baktérií patriacich do čeľade Enterobacteriaceae

a Lactobacillaceae. V závere sa výskumný tím zameral aj na detekciu antibiotickej

rezistencie iných bakteriálnych čeľadí. Baktérie boli izolované zo vzoriek kravského

mlieka a masla. V mnohých prípadoch boli izolované hlavne Klebsiella oxytoca,

Raoultella ornithinolytica a Escherichia coli. Výskumný tím izoloval však aj Enterococcus

faecalis a Pseudomonas putida, ktoré nepatria do čeľade Enterobacteriaceae. Z čeľade

Lactobacillaceae boli vyizolované Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei

a Lactobacillus plantarum. Najvyšší počet enterobaktérií bol 4,84 log KTJ.g-1 vo vzorke

masla z domáceho chovu a najnižší 1,70 log KTJ.ml-1 vo vzorke mlieka z obchodu.

Rovnako najvyšší počet laktobacilov (4,42 log KTJ. g-1) bol zistený vo vzorke masla

z domáceho chovu a najnižší 1,70 log KTJ.g-1 vo vzorke mlieka z obchodu. Získané druhy

boli identifikované pomocou modernej a rýchlej metódy MALDI TOF MS biotyper. Na

testovanie antibiotickej rezistencie u Enterobacteriaceae a iných čeľadí bola použitá

disková difúzna metódu. Výskumný tím aplikoval na laktobacily kvantitatívnu metódu

s názvom E-test. Tabuľky priemerov získal od EUCAST Clinica. Chýbajúce údaje boli

doplnené z Atlas (1997). Na testovanie antibiotickej rezistencie boli použité antibiotiká

doripenem a imipenem zo skupiny karbapenémov a ampicilín zo skupiny penicilínov.

Z aminoglykozidov boli použité gentamicín a amikacín, z fluorochinolónov ciprofloxacín,

ofloxacín a norfloxacín. Okrem uvedených boli použité aj tetracyklín a chloramfenikol. Pri

niektorých testovaných antibiotikách bola detegovaná rezistencia. Až 100 % rezistencia

izolátov bola zistená na ampicilín, doripeném a ofloxacín. Naopak nulová rezistencia

baktérií bola detegovaná na amikacín a ciprofloxacín. Antibiotickú rezistenciu je potrebné

testovať, pretože neustále rastie počet baktérií s odolnosťou na použivané antibiotiká.

Kľúčové slová: antibiotiká, antibiotická rezistencia, baktérie, maslo, mlieko

88

Abstract

Antibiotics are natural compounds produced by various groups of microorganisms.

The genus Penicillium, Streptomyces, Actinomycetes and Bacillus are the main microbial

producers of antibiotics. Antibiotics are used for treatment of human and animal bacterial

infections in all the world. Resistance of them can be intrinsic or acquired. Lowered

sensibility of bacteria to antibiotics is encoded in several genes, many of which are

transferred between bacteria. In the experimental part of monography was tested the

antibiotic resistance of bacteria belonging to Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae

family. At the conclusion is detected the antibiotic resistante of other bacterial family. The

bacteria were isolated from samples of cow milk and butter. In many cases were isolated

mainly Klebsiella oxytoca, Raoultella ornithinolytica and Escherichia coli. Enterococcus

faecalis and Pseudomonas putida, which do not belong to Enterobacteriaceae family.

There were islolated Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus

plantarum from Lactobacillaceae family. The highest number of coliform bacteria was

4.84 log KTJ.g-1 in the sample of butter from domestic livestock and the lowest number

was 1.70 log KTJ.ml-1 in the sample of milk from a store. Likewise, the highest number of

lactobacilli was 4.42 log KTJ.g-1 in the sample of butter from domestic livestock and the

lowest amount was 1.70 log KTJ.ml -1 in the sample of milk from a store. The modern and

rapid MALDI-TOF MS biotyper method for identification of the acquired species was

used. Disc diffusion method for testing the antibiotic resistance in Enterobacteriaceae and

other bacterial family was applied. Quantitative method called E-test for Lactobacillus had

been used. The tables of diameters were obtained from EUCAST Clinica. We

complemented the missing data from Atlas (1997). For testing the antibiotic resistance

were used doripenem and imipenem from carbapenem antibiotics family and ampicillin

from the penicillin antibiotics family. We used gentamicin and amikacin from

aminoglycosidesand ciprofloxacin, ofloxacin and norfloxacin, from fluorochinolonswere.

Tetracycline and chloramphenicol. Some of tested antibiotics resistance were detected. To

ampicillin, doripenem and ofloxacin we observed up to 100 % resistance of the isolates.

Not bacteria resistance was detected to amikacin and ciprofloxacin. Test of antibiotic

resistance it is necessary to test, because of increasing number of bacteria with resistance

of commonly used antibiotics.

Key words: antibiotics, antibiotic resistance, bacteria, butter, milk

89

Zoznam použitej literatúry

AL-WABEL, N. A. 2008. Mineral contents of milk of cattle, camels, goats and sheep in

the central region of Saudi Arabia. In Asian Journal of Biochemistry, vol. 3, no. 6, pp.

373-375. ISSN: 1996-0700. Dostupné na internete: http://scialert.net/qredirect.php?

doi=ajb.2008.373.375&linkid=pdf

APPELBAUM, P. C. – HUNTER, P. A. 2000. The fluoroquinolone antibacterials: past,

present and future perspectives. In International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 6,

no. 1, pp. 5-15. ISSN: 0924-8579. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/

science/article/pii/S0924857900001928.

ATLAS, R. 1997. Principles of microbiology. Boston: WCB/McGraw-Hill, 1997. 1298 s.

ISBN 0-8151-0889-3.

AVENT, M. L. – ROGERS, B.A. – CHENG, A. C. et. al. 2011. Current use of

aminoglycosides: indications, pharmacokinetics and monitoring for toxicity. In Internal

Medicine Journal [online], vol. 41, 2011, pp. 441-449. ISSN: 1445-5994. Dostupné na

internete: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.14455994.2011.02452.x/full˃.

AYCICEK, H. S. – CAKIROGLU, K. – STEVENSON, T. H. 2005. Incidence of

Staphylococcus aureus in ready to eat meals from military cafeterias in Ankara. Turkey. In

Food Control [online], vol. 16, no. 6, pp. 531-534. ISSN: 0956-7135. Dostupné na

internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095671350400088X.

BARŁOWSKA, J. – SZWAJKOVSKA, M. – LITWINCUZK, Z. et al. 2011. Nutritional

value and technological suitability of milk from various animal species used for dairy

production. In Food Science and Food Safety [online], vol. 10, no. 6, pp. 291-302. ISSN:

1541-4337. Dostupné na internete: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1111/j.1541-

4337.2011.00163.x/full.

BEZEKOVÁ, J. – LAVOVÁ, M. – ČANIGOVÁ, M. et al. 2013. Hodnotenie vybraných

vlastností neštartovacích baktérií mliečneho kysnutia. In Potravinárstvo [online], vol. 7,

Special Issue, pp. 53-57. ISSN: 1337-0960. Dostupné na internete:

www.potravinarstvo.com

BINDA, E. – MARINELLI, F. – MARCONE, G. L. 2014. Old and new glycopeptide

antibiotics: action and resistance. In Antibiotics [online], vol. 3 (4), pp. 572-594. ISSN:

2079-6382. Dostupné na internete: http://www.mdpi.com/2079-6382/3/4/572.

BISWAS, S. – ROLAIN, J. M. 2013. Use of MALDI-TOF mass spectrometry for

identification of bacteria that are difficult to culture. In Journal of Microbiological

90

Methods [online], vol. 92, no. 1, pp. 14-24. ISSN: 0167-7012. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167701212003478.

BIZZINI, A. – GREUB, G. 2010. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification. In Clinical

Microbiology and Infection [online], vol. 16, no. 11, pp. 1614–1619. ISSN: 1198-743X.

Dostupné na internete: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-0691.2010.033

11.x/full.

BLAKE, K. L. – O’NEILL, A. J. 2013. Transposon library screening for identification of

genetic loci participating in intrinsic susceptibility and acquired resistance to

antistaphylococcal agents. In Journal of Antimicrobial Chemotherapy [online], vol. 68, no.

1, pp. 12–16. ISSN: 0305-7453. Dostupné na internete: https://academic.oup.com/jac

/article/68/1/12/673540/Transposon-library-screening-for-identification-of.

BLAIR, J. M. A. – WEBBER, M. – BAYLAY, A. et al. 2015. Molecular mechanisms of

antibiotic resistance. In Nature Reviews Microbiology. [online], vol. 13, pp. 42-51. ISSN:

1740-1526. Dostupné na internete: http://www.nature.com/nrmicro/journal/v13/n1/full/

nrmicro3380.html.

BLAŽKOVÁ, M. – FUKAL, L. – RAUCH, P. 2010. Nebezpečný patogen Enterobacter

sakazakii a jeho detekce. In Chemické listy [online], vol. 104, pp. 113-118 [cit. 2016- 02-

06]. ISSN: 1213-7103. Dostupné na internete: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2010

_02_113-118.pdf.

BOUZA, E. – BURILLO, A. 2010. Oritavancin: a novel lipoglycopeptide active against

gram positive pathogens including multiresistant strains. In International Journal of

Antimicrobial Agents [online], vol. 36, no. 5, pp. 401-407. ISSN: 0924-8579. Dostupné na

internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924857910003304.

BOYE, J. – WIJESINHA-BETTONI, R. – BURLINGAME, B. 2012. Protein quality

evaluation twenty years after the introduction of the protein digestibility corrected amino

acid score method. British Journal of Nutrition [online], vol. 108, no. 2, pp. 183-211.

ISSN: 0007-1145. Dostupné na internete: https://www.cambridge.org/core/services/aop-

cambridge-core/content/view/S0007114512002309.

BREUKINK, E. – DE KRUIJFF, B. 2006. Lipid II as a target for antibiotics. In Nature

Reviews Drug Discovery, vol. 5, no. 4, pp. 321–332. ISSN: 1474-1776.

BROADBENT, J. – CAI, H. – LARSEN, R. et al. 2011. Genetic diversity in proteolytic

enzymes and amino acid metabolism among Lactobacillus helveticus strains. In Journal of

91

Dairy Science [online], vol. 94, no. 9, pp. 4313-4328. ISSN: 0022-0302. Dostupné na

internete: http://digitalcommons.usu.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1609&context=nfs

_facpub.

BROOK, I. 2004. β-Laktamase-producing bacteria in mixed infections. In Clinical

Microbiology and Infection [online], vol. 10, no. 9, pp. 777-785. ISSN: 1435-4373.

Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X146

29050.

BRYSKIER, A. – BUTZLER, J. P. 2003. Macrolides. Eight Edition. Philadelphia: Elsevier

Churchill Livingstone, pp. 310-325. ISBN: 9780125264518.

BUDHKAR, Y. A. – BANKAR, S.B. – SINGHAL, R. S. 2014. Milk and milk products:

microbiology of cream and butter. In Encyclopedia of Food Microbiology. New York:

Academic Press, pp. 728–737. ISBN: 9780123847300.

BUHNIK-ROSENBLAU, K. – EFIMOV, V. – POLEG, Y. et al. 2013. Biodiversity of

Enterococcus faecalis based on genomic typing. In International Journal of Food

Microbiology [online], vol. 165, no. 1, pp. 27-34. ISSN: 0168-1605. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160513001839.

BUTLER, M. S – BLASKOVICH, M. A – COOPER, M. A. 2013. Antibiotics in the

clinical pipeline. In Journal of antibiotics, vol. 66, no. 10, pp. 571-591. ISSN: 0021-8820.

CAINE, L. – PEKANA, A. – LUKANJI, Z. et al. 2013. Pathogenic Escherichia coli strains

in raw milk obtained from two farms of the eastern cape province, South Africa. In

International Journal of Environmental Research and Public Health, vol. 11, pp. 11950-

11963.

CAMPBELL, E. A. – KORZHVENA, N. – MUSTAEV, A. et al. 2001. Structural

mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. In Cell [online], vol.

104, no. 6, pp. 901–912. ISSN: 0092-8674. Dostupné na internete: http://www.science

direct.com/science/article/pii/S0092867401002860.

CARDAMONE, L. – QUIBERONI, A. – MERCANTI, D. J. et al. 2011. Adventitious

dairy Leuconostoc strains with interesting technological and biological properties useful

for adjunct starters. In Dairy of Science Technology [online], vol. 91, no. 4, pp. 457–470.

ISSN: 1958-5586. Dostupné na internete: https://link.springer.com/article/10.1007/s13594-

011-0022-9.

CITAK, S. – YUCEL, N. – MENDI, A. 2005. Antibiotic resistance of enterococcal

isolates in raw milk. In Journal of Food Processing and Preservation [online], vol 29,

92

no. 3-4, p. 183–195. ISSN: 0145-8892. Dostupné na internete: http://onlinelibrary.wiley.

com/doi/10.1111/j.1745-4549.2005.00022.x/full.

CITAK, S. – GUNDOGAN, N. – MEND, A. 2006. Occurence, isolation and antibiotic

resistance of Enterococcus species isolated from raw milk samples in Turkey. In

Milchwissenschaft [online], vol. 61, no. 2, pp. 150-152. ISSN: 0026-3788.

COLLIN, F. – KARKARE, S. – MAXWELL, A. 2011. Exploiting bacterial DNA gyrase

as a drug target: current state and perspectives. In Applied Microbiology and

Biotechnology [online], vol. 92, no. 3, pp. 479-497. ISSN: 0175-7598. Dostupné na

internete: https://link.springer.com/article/10.1007/s00253-011-3557-z.

COTON, M. – DELBES, P. C. – IRLINGER, F. et al. 2012. Diversity and assessment of

potential risk factors of Gram-negative isolates associated with French cheeses. In Food

Microbiology [online], vol. 29, no. 1, pp. 88-98 ISSN: 0740-0020. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S074000201100205X#.

DALE - SKINNER, J.W. – BONEV, B. B. 2009. Molecular Mechanisms of Antibiotic

Resistance. In The Need for Novel Antimicrobial Therapies. Weinheim: Wiley-VCH

Verlag, 322 p. ISBN: 9783527622931.

D´AIMMO, M. R. – MODESTO, M. – BIAVATI, B. 2007. Antibiotic resistance of lactic

acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products. In

International Journal of Food Microbiology [online], vol. 115, no. 1, pp. 35-42. ISSN:

0168-1605. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016

8160506005071.

DELAVENNE, E. – MOUNIER, E. – DENIEL, F. et al. 2012. Biodiversity of antifungal

lactic acid bacteria isolated from raw milk samples from cow, ewe and goat over one-year

period. In International Journal of Food Microbiology, vol. 155, no. 3, pp.185-190.

DEMARCO, M. L. – FORD, B. A. 2013. Beyond identification: emerging and future uses

for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. In Clinics in

Laboratory Medicine [online], vol. 33, no. 3, pp. 611-628. ISSN: 0272-2712. Dostupné na

internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S027 2 2 7 1 2 1 3 00022X.

de OLIVIERA, G. B. – FAVARIN, L. – LUCHESE, H. R. et al. 2015. Psychrotrophic

bacteria in milk: how much do we really know? In Brazilian Journal of Microbiology

[online], vol. 46, no. 2, pp. 313-321. ISSN: 1678-4405. Dostupné na internete:

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822015000200313.

93

ESSID, I. – MEDIN, M – HASSOUNA, M. 2009. Technological and safety properties of

Lactobacillus plantarum strains isolated from a Tunisian traditional butter. In African

Journal of Food Science [online], vol. 81, no. 1, pp. 203-208. ISSN: 0309-1740. Dostupné

na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030917400800243X.

EL-ZEINI, H. M. 2006. Microstructure rheological and geometrical properties of fat

globules of milk from different animal species. In Polish Journal of Food and Nutrition

Sciences, vol. 15/56, no. 2, pp. 147–154. ISSN: 1230-0322.

FERNANDES, R. 2009. Microbiology Hand Book of Dairy products: mechanisms and

pathogenesis. Cambridge: RSC Publishing, p. 177. ISBN: 978-1-905224-62-3. Dostupné

na internete: <http://ssu.ac.ir/cms/fileadmin/user_upload/Daneshkadaha/dbehdasht/beh

dasht_ imani/book/Microbiology_Handbook__Dairy_Products.pdf >.

FILLION, M. M. 2006. Amélioration de la stabilité thermique du lait par modulation du

potentiel d’oxydoréduction. In Thèses et mémoires, pp. 23 – 447. Dostupné na internete:

< http://hdl.handle.net/20.500.11794/18853.

FINKEL, R. – CUBEDDU, L. – MECHELLE, C. et al., 2009. Pharmacology. Four

Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, p. 564. ISBN-13: 978-078177155.

FORSHELL, L. P. – WIERUP, M. 2006. Salmonella contamination: a significant

challenge to the global marketing of animal food products. In Revue Scientifique et

Technique-Office International des Epizooties, vol. 25, no. 2, pp. 541-554. ISSN: 0253-

1933.

FRITSCHE, T. R. – THOMAS, R. – CASTANHEIRA, M. et al. 2008. Detection of

methyltransferases conferring high-level resistance to aminoglycosides in

Enterobacteriaceae from Europe, North America, and Latin America. In Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, vol. 52, no. 5, pp. 1843-1845. ISSN: 0066-4804.

GAD, G. F. – ABDEL-HAMID, A. M. – FARAG. Z. S. 2014. Antibiotic resistance in

lactic acid bacteria from some pharmaceutical and dairy products. In Brazilian Journal of

Microbiology [online], vol. 45, no. 1, pp. 25-33. ISSN: 1517-8382. Dostupné na internete:

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1517-83822014000100005&script=sci_arttext.

GÁLOVÁ, Z. – BALÁŽOVÁ, Ž. – CHRENEK, P. et al. 2013. Metódy a techniky

génových manipulácií. 1. vyd. Nitra: SPU, 190 s. ISBN: 978-80-552-1092-6.

GASPAR, F. – TEIXEIRA, N. – RIGOTTIER, G. et al. 2009. Virulence of Enterococcus

faecalis dairy strains in an insect model: the role of fsrB and gelE. In Microbiology SGM.

vol. 155, pp. 3564-3571. ISSN 1350- 0872.

94

GAUCHERON, F. 2011. Milk and dairy products: a unique micronutrient combination.

In The Journal of the American College of Nutrition. vol. 30, no. 5, pp. 400-409. ISSN:

0731-5724.

GEMECHU, T. 2015. Review on lactid acid bacteria function in milk fermentation and

preservation. In African Journal of Food Science [online], vol. 9, no. 4, pp. 170-175. ISSN:

1996-0794. Dostupné na internete: http://www.academicjournals.org/article/article1427200

390_Gemechu.pdf.

GIEDRAITIEN, A. – VITKAUSKIENE, A. – NAGINIENE, R. et al. 2011. Antibiotic

resistance mechanisms of clinically important bacteria. In Medicina (Kaunas). vol. 47, no.

3, pp. 137-146. ISSN: 1648-9144.

GILL, E. E – FRANCO, O. L – HANCOCK, R. E. W. 2015. Antibiotic adjuvants: diverse

strategies for controlling drug-resistant pathogens. In Chemical biology and drug design

[online], vol. 85, no. 1, pp. 56-78. ISSN: 1747-0285. Dostupné na internete: http://online

library.wiley.com/doi/10.1111/cbdd.12478/full.

GIRAFFA, G. 2003. Functionality of enterococci in dairy products. In International

Journal of Food Microbiology [online], vol. 88, no. 2-3, pp. 215-222. ISSN: 0168-1605.

Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160503001

831.

GLICK, M. 2016. Antibiotics the good, the bad, and the ugly. In Journal of the American

Dental Association [online], vol. 147, no. 10, pp. 771-773. ISSN: 0002-8177. Dostupné na

internete: https://www.researchgate.net/publication/308627125_Antibiotics_The_Good_

the_Bad_and_the_Ugly.

GOMES, B. C. – ESTEVES, C. T. – PALAZZO, I. C. V. et al. 2008. Prevalence and

characterization of Enterococcus spp. isolated from Brazilian foods. In Food Microbiology

[online], vol. 25, no. 5, pp. 668 – 675. ISSN: 0740-0020. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002008000555.

GÖRNER, F. – VALÍK, Ľ. 2004. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava:

Vydavateľstvo MALÉ CENTRUM. 528 s. ISBN: 80-967064-9-7.

GREIFOVÁ, M. – GREIF, G. – LEŠKOVÁ, E. et al. 2003. Enterokoky – ich hodnotenie

v mliekarenskej technológii. In Mliekarstvo, roč. 34 (2), s. 42-44. ISSN: 1210-3144.

GUETOUACHE, M. – GUESSAS, B. – MEDJEKAL, S. 2014. Composition and

nutritional value of raw milk. In Biological Sciences and Pharmaceutical Research

95

[online], vol. 2, no. 10, pp. 115-122. ISSN: 2350-1588. Dostupné na internete:

https://www.researchgate.net/publication/278785108.

HANSEN, D. S. – AUCKEN, H. N. – ABIOLA, T. et al. 2004. Recommended test panel

for differentiation of Klebsiella Species on the basis of a trilateral interlaboratory evalution

of 18 biochemical tests. In Journal of Clinical Microbiology [online], vol. 42, no. 8, pp.

3665-3669 [cit. 2016-02-06]. ISSN: 1098-1137. Dostupné na internete:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15297514

HANTSIS - ZACHAROV, E. – HALPERN, M. 2007. Culturable psychrotrophic bacterial

communities in raw milk and their proteolytic and lipolytic traits. ISSN: 1098-5336. In

Applied and Environmental Microbiology. [online], vol. 73, no. 22, pp. 7162–7168.

Dostupné na internete: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2168224/

HANULIK, V. – SEDLÁKOVÁ, M. – PETRŽELOVÁ, J. et al. 2010. Možnosti

fluorochinolonů v současné praxi. In Klinicka Farmakologie a Farmacie, vol. 24, no. 4,

pp. 184-186. ISSN: 1212-7973.

HAVLIK, Jiří. 2009. Makrolidy pro praxi. In Medicina pro praxi [online], vol. 6, no. 6, pp.

304-307. ISSN 1803-5310. Dostupné na internete: http://www.medicinapropraxi.cz/

pdfs/med/2009/ 06/04.pdf.

HAYDEN, M. K. – REYAI, K. 2005. Development of daptomycin resistance in vivo in

methicillin- resistant Staphylococcus aureus. In Journal of Clinical Microbiology, vol. 43,

no. 10, úú. 5285–5287. ISSN: 0095-1137.

HUONG, T. T. – KOMÍNKOVÁ. M. – GURÁŇ, R. et al. 2014. Identifikace

mikroorganismů pomocí MALDI-TOF MS. In Journal of Metallomics and

Nanotechnologies, vol. 1, no. 2, pp. 64-66. ISSN 2336-3940.

JINDRÁK, V, – URBÁŠKOVÁ, P. – NYČ, O. 2007. Fluorochinolony – kriticky ohrožená

skupina antibiotik. In Practicus . vol. 6,pp. 6–11.

KOHANSKI, M. A. – DWYER, D. J. – COLLINS, J. J. 2010. How antibiotics kill

bacteria: from targets to networks. In Nature Reviews Microbiology, , vol. 8, no. 6, p. 423-

435. ISSN: 1740-1526.

KOHLER, G. 2013. Note d’information relative à la vente directe de lait cru. Projet des

Pyrénées. In Atlantiques: pp.1 – 4.

KONG, K. F. – SCHNEPER, L. – MATHEE, K. 2010. Beta-lactam antibiotics: from

antibiosis to resistance and bacteriology. In APMIS [online], vol. 118, no. 1, pp. 1-36.

96

ISSN 0903-4641. Dostupné na internete: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.

1600-0463.2009.02563.x/full

KONGO, M. 2013. Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and Livestock

Purposes. 1. vyd. Rijeka, Croatia: InTech. 670 s. ISBN 978-953-51-0955-6.

KONTE, M. 1999. Le lait et les produits laitiers. Développement de systèmes de

productions intensives en Afrique de l’ouest. Université de Nouakchott (R.I.M) Faculté des

Sciences et Technologies des aliments, B. P. 5026. ISRA/ URV – LNERV/FEVRIER : 2-

25.

LANDERS, T. F. – BEVIN, C. – THOMAS, E. et al. 2012. A review of antibiotic use in

food animals: perspective, policy, and potential. In Public Health Reports [online], vol.

127, no. 1, pp. 4-22, ISSN: 0033-3549. Dostupné na internete http://pubmedcentral

canada.ca/pmcc/articles/PMC3234384/pdf/phr12700004.pdf

LAVIGNE, J. P. – ESPINAL, P. – DUNYACH, C. et al. 2012. Mass spectrometry: a

revolution in clinical microbiology. In Clinical Chemistry and Laboratory Medicine

[online], vol. 51, no. 2, pp. 257- 270 [cit. 2016-02-08]. ISSN: 1437-4331. Dostupné na

internete: DOI: 10.1515/cclm-2012-0291.

LECLERCQ, R. 2002. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature

of the resistance elements and their clinical implications. In Clinical Infectious Diseases

[online], vol. 34, no. 4, pp. 482-492. ISSN: 1058-4838. Dostupné na internete:

https://academic.oup.com/cid/article/doi/10.1086/324626/412492/Mechanisms-of-Resistan

ce-to-Macrolides-and-Lincosamides-Nature-of-the.Resistance-Elements-and-their-Clinical

-Implications.

LEDENBACH, L. H – MARSCHAL, R. T. 2009. Microbiological spoilage of dairy

products. USA: Springer, 2009. 369 s. ISBN 978-1-1-4419-0825-4.

LEE, Y. G. – WU, H. Y. – HSU, C. L et al. 2009. A rapid and selective method for

monitoring the growth of coliforms in milk using the combination of amperometric sensor

and reducing of methylene blue. In Sensors and Actuators by Chemical. [online], vol. 141,

no. 2, pp. 575-580. ISSN 0925-4005. Dostupné na internete: https://ir.nctu.edu.tw/

bitstream/11536/6686/1/000270343000034.pdf

LEVY, S. B. 2007. Antibiotický paradox. 1. vyd. Praha: Academia, 2007. 312 s. ISBN

978- 80-200-1485-6.

LIWA, A. C. – JAKA, H. 2015. Antimicrobial resistance: mechanisms of action of

antimicrobial agents. In Formatex Research Center, pp. 876-885.

97

LONKS, J. R. – GOLDMANN, D. A. 2005. Telithromycin: a ketolide antibiotic for

treatment of respiratory tract infections. In Clinical Infectious Diseases [online], vol. 40,

no. 11, pp. 1657-1664. ISSN 1058-4838. Dostupné na internete: https://academic.oup.

com/cid/article/40/11/1657/447340/Telithromycin-A-Ketolide-Antibiotic-for-Treatment.

LOOPER, M. 2013. Factors affecting milk composition of lactating cows. University of

Arkansas System.

MANSSON, H. L. 2008. Fatty acids in bovine milk fat. In Food and Nutrition Research,

vol. 52, pp. 1-3. ISSN: 1654-661X. Dostupné na internete: http://www.tandfonline.

com/action/journalInformation?journalCode=zfnr20.

MARTIN, N. H. – TRMČIC, A. – HSIEH, T. H. et al. 2016. The evolving role of

coliforms as indicators of unhygienic processing conditions in dairy foods. In Frontiers in

Microbiology [online], vol. 7, pp. 1-8. ISSN: 1664-302X. Dostupné na internete:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5043024/.

MARTÍN, R. J. – ZOETENDAL, E. G. – JIMENEZ, E. et al. 2007. In Research in

Microbioly. [online], vol. 158, no.1, pp. 31–37. ISSN: 0923-2508. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0923250806002476.

MATHARA, J. M. – SCHILLINGER, U. – KUTIMA, P. M. et. al. 2008. Functional

properties of Lactobacillus plantarum strains isolated from Maasai traditional fermented

milk products in Kenya. In Current Microbiology [online], vol. 56, no. 4, pp. 315-321.

ISSN: 0343-8651. Dostupné na internete https://link.springer.com/article/10.1007/s00284-

007-9084-6

MESHREF, M. S. 2010. Microbiological quality and safety of cooking butter in Beni-Suef

governorate-Egypt. In African Health Sciences [online], vol. 10, no. 2, pp. 193-198.

ISSN: 1680-6905. Dostupné na internete: https://www.ajol.info/index.php/ahs/article/

view/60078.

MILLS, S. – ROSS R. P. – HILL. C. et al. 2011. Milk intelligence: mining milk for

bioactive substances associated with human health. In International Dairy Journal

[online], vol. 21, pp 377–401. ISSN: 0958-6946. Dostupné na internete:

http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0958694611000021.

MOKRÝ, J. – PORVAZNÍK, I. – VÁŇA, J. 2013. Vybrané kapitoly z klinickej

farmakológie Antimikrobiálne látky I. – farmakológia. 1. vyd. Martin: Jesseniova lekárska

fakulta UK (JLF UK) v Martine, 2013. 160 s. ISBN 978-80-89544-48-6.

98

MORAR, M. – BHULLAR, K. – HUGHES, D. W. et al. 2009. Structure and mechanism

of the lincosamide antibiotic adenylyltransferase linB. In Structure [online], vol.17, no.12,

pp. 1649-1659. ISSN: 0969-2126. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/

science/article/pii/S0969212609004201.

MYERS, K. M. – GABA, J. – AL- KHALDI, S. F. 2006. Molecular identification of

Yersinia enterocolitica isolated from pasteurized whole milk using DNA microarray chip

hybridization. In Molecular and Cellular Probes [online], vol. 20, no. 2 , pp. 71-80. ISSN

0890-8508. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0890

850805000782.

NAGAI, K. – DAVIES, T. A. – JACOBS, M. R. et al. 2002. Effects of amino acid

alterations in penicillin-binding proteins (PBPs) 1a, 2b, and 2x on PBP affinities of

penicillin, ampicillin, amoxicillin, cefditoren, cefuroxime, cefprozil, and cefaclor in 18

clinical isolates of penicillin-susceptible, Qintermediate, and-resistant pneumococci. In

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 46, no. 5, pp. 1273-1280. ISSN: 0066-4804.

NANNINI, E. C. 2012. Telavancin for the treatment of hospital-acquired pneumonia:

findings from the ATTAIN studies. In Expert Review of Anti Infective Therapy, vol. 10,

no. 8, pp. 847–854. ISSN 1478-7210.

NGUYEN, F. – STAROSTA, A. L. – ARENZ, S. et al. 2014. Tetracycline antibiotics and

resistance mechanisms. In Biological chemistry, vol. 395, no. 5, pp. 559-575. ISSN: 2333-

1240.

NIGHTINGALE, CH. – NIGHTINGALE, M. – AMBROSE, P. G. et al. 2007.

Antimicrobial pharmacodynamics in theory and clinical practise. Second Edition. New

York: Informa Healthcare, 2007, p. 536. ISBN 978-1-4200-1713-7.

NICHOLS, D. – CAHOON, N. – TRAKHTENBERG, E. M. et al. 2010. Use of ichip for

high-throughput in situ cultivation of “uncultivable” microbial species”. In Applied and

Environmental Microbiology, vol. 76, no. 8, pp. 2445–2450. ISSN 1098-5336.

NIKŠ, M. 2006. Rezistencia na antibiotiká. In Internal medicine, vol. 6, no. 9, pp. 466-476.

ISSN 1335-8359.

NORDMANN, P. – DORTET, L. – POIREL, L. 2012. Carbapenem resistance in

Enterobacteriaceae: here is the storm! In Trends in Molecular Medicine [online], vol. 18,

no. 5, pp. 263-272. ISSN: 1471-4914. Dostupné na internete http://www.sciencedirect.

com/science/article/pii/S1471491412000378.

99

PAPP-WALLACE, K. M. – ENDIMIANI, A. – TARACILA, M. A. et al. 2011.

Carbapenems: past, present, and future. In American Society for Microbiology, vol 55, no.

11, pp. 4943-4960. ISSN: 1098-6596.

PARK, J. T. – UEHARA, T. 2008. How bacteria consume their own exoskeletons

(turnover and recycling of cell wall peptidoglycan). In Microbiology and Molecular

Biology Review, vol. 72, no. 2 , pp. 211–227. ISSN: 1092-2172.

PELISSER, M. R. – KLEIN, C. S. – ASCOLI, K. R. et al. 2009. Occurrence of

Staphylococcus aureus and multiplex PCR detection of classic enterotoxin genes in cheese

and meat products. In Brazilian Journal of Microbiology [online], vol. 40, no. 1, pp. 145-

148. ISSN: 1517-8382. Dostupné na internete: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/

PMC3768504/.

PEREIRA, P.C. 2014. Milk nutritional composition and its role in human health. In

Nutrition [online], vol. 30, no. 6, pp. 619-627. Dostupné na internete:

https://www.lbs.co.il/data/attachment-files/2015/08/26529_milk.pdf.

PICOZZI, C. 2005. Phenotypic and genotypic characterization of sorbitol negative or slow

fermenting (Suspected O157) Escherichia coli isolated from milk samples in Lombardy

region. In Letters in Applied Microbiology [online], vol. 40, no. 6, pp. 491-496. ISSN:

1472-765X. Dostupné na internete: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1472-

765X.2005.01718.x/epdf.

PINTO, L, – POETA, P. – VIEIRA, S. et al. 2010. Genomic and proteomic evaluation of

antibiotic resistance in Salmonella strains. In Journal of Proteomics [online], vol. 73, no.

8, pp. 1535–1541. ISSN 1874-3919. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/

science/article/pii/S1874391910000837.

POOLE, R. M. 2014. Nemonoxacin: first global approval. In Drugs, vol. 74, no. 12, pp.

1445–1453. ISSN 0012-6667.

POULSEN, S. M – KOFOED, C. – VESTER, B. 2000. Inhibition of the ribosomal

peptidyl transferase reaction by the mycarose moiety of the antibiotics carbomycin,

spiramycin and tylosin. In Journal of Molecular Biology [online], vol. 304, no. 3, pp. 471-

81. ISSN: 0022-2836. Dostupné na internete http://www.sciencedirect.com/science/article/

pii/S0022283600942293.

PUBLIC HEALTH ENGLAND. 2014. Identification of Enterobacteriaceae. In Standards

for Microbiology Investigations [online], no. 4, pp. 1-34 [cit. 2016-02-06]. Dostupné na

100

internete: https://www.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/

423601/ID_16i4.pdf.

RANDALL, C. P. – MARINER, K. R. – CHOPRA, I. et al. 2013. The target of

daptomycin is absent from Escherichia coli and other gram-negative pathogens. In

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 57, no. 1, pp. 637-639. ISSN: 0066-4804.

RAYNAL-LJUTOVAC, K. – LAGRIFFOUL, G. – PACCARD, P. et al. 2008.

Composition of goat and sheep milk products: an update. In Small Ruminant Research

[online], vol. 79, no. 1, pp. 57–72. ISSN: 0921-4488. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0921448808001375.

RANG, H. P. – HERDENSON, G. – FLOWER, R. et al. 2012. Rang and Dale`s

pharmacology. Second Edition. Churchill Livingstone: Elsevier, 2012, pp. 777. ISBN:

978-0702034718.

REHMAN, M. U – RASHID, M. – SHEIKH, J. A. et al. 2014. Molecular epidemiology

and antibiotic resistance pattern of enteropathogenic Escherichia coli isolated from bovines

and their handlers in Jammu, India. In Journal of Advanced Veterinary and Animal

Research [online], vol. 1, no. 4 pp. 177-181. ISSN: 2311-7710. Dostupné na internete:

http://bdvets.org/JAVAR/V1I4/a30_pp177-181.pdf.

ROBERTS, M. C – SCHWARZ, S. 2009. Antimicrobial drug resistance. New York City:

Humana Press, p. 889. ISBN: 978-1-60327-592-7.

ROSSOLINI, G. M. – ARENA, F. – POLLINI, S. 2014. Novel infectious diseases and

emerging gram-positive multiresistant pathogens in hospital and community acquired

infections. Berlin: Springer Verlag, p. 26. ISBN: 978-3- 642-39967-1.

RUBINSTEIN, E. 2001. History of quinolones and their side effects. In Chemotherapy.

vol. 47, no. 3, pp. 3-8. ISSN: 0009-3157.

SAIDI, R. – KHELEF, D. – KAIDI, R. 2014. Antibiotic susceptibility of

Enterobacteriaceae species isolated from mastitic milk in Algeria. In Asian Pacific

Journal of Reproduction [online], vol. 3, no. 4, pp. 311-316. ISSN: 2305-0500. Dostupné

na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2305050014600452.

SALMAN, A. M. – HAMAD, I. M. 2011. Enumeration and identification of Coliform

bacteria from raw milk in Khartoum State, Sudan. In Journal of Cell and Animal Biology.

[online], vol. 5, no. 7, pp. 121-128. ISSN: 1996-0867. Dostupné na internete:

http://www.academicjournals.org/article/article1380273340_Salman%20and%20Hamad.

pdf.

101

SAMARŽIJA, D. – ZAMBERLIN, Š. – POGAČIĆ, T. 2012. Psychrotrophic bacteria and

milk quality. In Mljekarstvo, vol. 62, no. 2, pp. 77-95. ISSN: 1517-8382.

SAPADIN, A. N. – FLEISCHMAJER, R. 2006. Tetracyclines: nonantibiotic properties

and their clinical implications. In Journal of the American Academy of Dermatology

[online], vol. 54, no. 2, pp. 258-265. ISSN: 0190-9622. Dostupné na internete:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0190962205032317.

SARMAH, A. – MEYER, M. – BOXALL, A. 2006. A global perspective on the use, sales,

exposure pathways, occurrence, fate and effects of veterinary antibiotics (VAs) in the

environment. In Chemosphere [online], vol. 65, no. 5, pp. 725-759. ISSN 0045-6535.

Dostupné na internete: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004565350600

3213>.

SHABANI, L. 2003. Microbial pollution of milk by environment as an indicator of its

contamination rate. In Journal of Environmental Protection and Ecology. vol. 4, no. 2, pp.

401-405. ISSN: 1311-5065.

SENESI, S. – GHELARDI, E. 2010. Production, secretion and biological activity of

Bacillus cereus enterotoksins. In Toxins. [online], vol. 2, no.7, pp. 1690-1703. ISSN: 2072-

6651. Dostupné na internete: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3153264/.

SENGUPTA, S. – CHATTOPADHYAY, M. K.– GROSSART, H. P. 2013. The

multifaceted roles of antibiotics and antibiotic resistance in nature. In Frontiers in

Microbiology [online], vol. 4, no. 47, pp. 1-13. ISSN: 1664-302X. Dostupné na internete:

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2013.00047/full.

SHARMA, R. – SANODIYA, B. – BAGRODIA, D. et al. 2012. Efficacy and potential

of lactic acid bacteria modulating human health. In International Journal of Pharma and

Bio Sciences [online], vol. 3, no. 4, pp. 935-939, ISSN 0975-6299. Dostupné na internete

https://www.researchgate.net/publication/232613912_Efficacy_and_potential_of_lactic_ac

id_bacteria_modulating_human_health.

SILLANKORVA, S. – NEUBAUER, P. – AZEREDO, J. 2008. Pseudomonas fluorescens

biofilms subjected to phage philBBPF7A. In BMC Biotechnology [online], vol. 8, no. 79,

ISSN: 1472-6750. Dostupné na internete: http://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/

articles/10. 1186/1472-6750-8-79.

SINGHAL, N. – KUMAR, M. – KANAUIJA, P. K. et al. 2015. MALDI-TOF mass

spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. In

102

Frontiers in Microbiology [online], vol. 6, pp. 791. ISSN: 1664-302X. Dostupné na

internete: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.00791/full.

SKÖLD, Ola. 2010. Sulfonamides and trimethoprim. In Expert Review of Anti-infective

Therapy, vol. 8, no. 1, pp. 1-6, ISSN 1478- 7210.

SMIT, G. – SMIT, B. A. – ENGELS, W. J. M. 2005. Flavour formation by lactic acid

bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. In FEMS Microbiology

Reviews [online], vol. 29, no. 3, pp. 591–610. ISSN: 0168-6445. Dostupné na internete:

http://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1016/j.fmrre.2005.04.002/full.

SOARES, G. – FIGUEIREDO, L. C. – FAVERI, M. et al. 2012. Mechanisms of action of

systemic antibiotics used in periodontal treatment and mechanisms of bacterial resistance

to these drugs. In Journal of Applied Oral Science [online], vol. 20, no. 3, pp. 295-309.

ISSN: 1678-7757. Dostupné na internete: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1678-

77572012000300002.

SOLENSKY, Roland. 2011. Penicillin-allergic patients: Use of cephalosporins,

carbapenems, and monobactams. Dostupné na internete: https://pdfs.semanticscholar.

org/610d/98b0c656b6ea1991a1529138f61ef020e9d6.pdf

SPELLBERG, B. – GILBERT, D. N. 2014. The future of antibiotics and resistance:

a tribute to a career of leadership by John Bartlett. In Clinical Infectious Diseases [online],

vol. 59, no. 2, pp. S71–S75. ISSN: 1058-4838. Dostupne na internete: https://www.ncbi.

nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176319/pdf/ciu392.pdf.

QUIGLEY, L. – SULLIVAN, O. – BERESFORD, T. P. et al. 2011. Molecular approaches

to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. In International

Journal of Food Microbiology [online], vol. 150, no. 2-3, pp. 81–94. ISSN: 0168-1605.

Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016816051100

4454.

QUICKLY, L. – SULLIVAN, O. – STANTON, C. et al. 2013. The complex microbiota of

raw milk. In Federation of European Microbiological Societies [online], vol. 37, no. 5, pp.

664-698. ISSN: 1574-6976. Dostupné na internete: https://academic.oup.com/femsre/

article/37/5/664/ 541439/The-complex-microbiota-of-raw-milk.

TANČINOVÁ, D. – MAKOVÁ, J. – FELŠÖCIOVÁ, S. et al. 2008. Mikrobiológia

potravín. 2. vyd. Nitra: SPU, 150 s. ISBN: 978-80-552-0145-0.

TEIXEIRA, P. – LOPES, Z. – AZEREDO, J. 2005. Physicochemical surface

characterization of a bacterial population isolated from a milking machine. In Food

103

Microbiology [online], vol. 22, no.2-3, pp. 247-251. ISSN: 0740-0020. Dostupné na

internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002004000516.

TURNER, P. J. 2005. Extended-spectrum beta-lactamases. In Clinical Infections diseases

[online], vol. 41, no. 4, pp. S273-S275. ISSN: 1537-6591. Dostupné na internete:

https://academic.oup.com/cid/article/41/Supplement_4/S273/289461/Extended-Spectrum-

Lactamases.

UALERZI, C. – BRANDI, L. – FABBRETTI, A. et. al. 2014. Antibiotics: targets,

mechanisms and resistance. Weinheim: Wiley-VCH, 2014. p. 576. ISBN: 978-3-527-

65971-5.

VACHEYROU, M. – NORMAND, A. – GUYOT, P. et al. 2011. Cultivable microbial

communities in raw cow milk and potential transfers from stables of sixteen French farms.

In International Journal of Food Microbiology [online], vol. 146, no. 3, pp. 253–262.

ISSN: 0168-1605. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/

pii/S01681605110011397.

VALENZUELA, A. S. – OMAR, N. B. – ABRIOUEL, H. et al. 2008. Risk factors in

enterococci isolated from foods in Morocco: Determination of antimicrobial resistance and

incidence of virulence traits. In Food and Chemical Toxicology [online], vol. 49, no. 8, pp.

2648-2652. ISSN: 0278-6915. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/

science/article/pii/S0278691508002056.

VAN BAMBEKE, F. 2006. Glycopeptides and glycodepsipeptides in clinical

development: a comparative review of their antibacterial spectrum, pharmacokinetics and

clinical efficacy. In Current Opinion in Investigational Drugs [online], vol. 7, no. 8, pp.

740–749. ISSN: 1472-4472. Dostupné na internete: http://www.facm.ucl.ac.be/Full-texts-

FACM/Vanbambeke-2006-3.pdf.

VELKOV, T. – ROBERTS, K. D. – NATION, R. L. et al. 2013. Pharmacology of

polymyxins: new insights into an 'old' class of antibiotics. In Future Microbiology [online],

vol. 8, no. 6, pp. 711-724. ISSN: 1746-0913. Dostupné na internete: https://www.ncbi.

nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3852176/.

VITEK. 2008. Antibiotic classification and modes of action: antibiotic classification.

VITEK 2-Technology. © bioMérieux, Inc., Customer Education. http://www.biomerieux-

usa.com/upload/VITEK-Bus-Mo dule-1-Antibiotic-Classification-and-Modes-of-Action-1.

Pdf.

104

WALSH, C. 2003. Antibiotics: action, origins, resistance. Washington, DC: ASM Press.

p. 345. ISBN: 9781555817886. Dostupné na internete: http://dx.doi.org/10.1016/ j.bjbas.

2014.10.006.

ZHANEL, G. G. – CALIC, D. – SCHWEIZER, F. 2010. New lipoglycopeptides:

a comparative review of dalbavancin, oritavancin and telavancin. In Drugs, vol. 71, no. 5,

pp. 859–886. ISSN: 0012-6667.

ZHANG, T. – MURAIH, J. K – MACCORMICK, B. et al. 2014. Daptomycin forms

cation- and size-selective pores in model membranes. In Biochimica et Biophysica Acta-

Biomembranes [online], vol. 1838, no. 10, pp. 2425-2430. ISSN: 0006-3002. Dostupné na

internete http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273614001862.

ZHOU, J. S. – PILLIDGE, C. J. – GOPAL, P. K. et al. 2010. Antibiotic susceptibility

profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. In International

Journal of Food Microbiology [online], vol. 98, no. 2, pp. 212-217. ISSN: 0168-1605.

Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S01681605040

02843,

ZIMECKI, M. – KRUZEL, M. L. 2007. Milk-derived proteins and peptides of potential

therapeutic and nutritive value. In Journal of Experimental Therapeutics & Oncology. vol.

6, no. 2, pp. 89-106. ISSN: 1359-4117

ZOUHAIRI, O. – SALEH, N. – ALWAN, I. et al. 2010. Antimicrobial resistance of

Staphylococcus species isolated from Lebanese dairy-based products. In Emro Journal

Articles [online], vol. 16, no. 12, pp. 1221-1225. ISSN: 1020-3397. Dostupné na internete

http://apps.who.int/iris/handle/10665/118057.

ZUORRO, A. – FIDALEO, M. – LAVECCHIA, R. et al. 2014. Degradation and antibiotic

activity reduction of chloramphenicol in aqueous solution by UV/H2O2 process. In

Journal of Environmental Management 1. [online], vol. 133, pp. 302-308. ISSN: 0301-

4797. Dostupné na internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301479

713007536.

105

ČÁST

Složení vědecké redakční rady

doc. Ing. František Bartes, CSc.

doc. JUDr. PhDr. Jiří Bílý, CSc.

Ing. Zdeněk Novotný, CSc.

prof. Ing. Oldřich Rejnuš, CSc.

doc. JUDr. Karel Schelle, CSc.

Dr. Petr Rožňák, CSc., dr.h. c.

Ing. Josef Novotný, Ph.D.

prof. Ing. Miroslava Kačániová, PhD., doc. Ing. Simona Kunová, PhD., prof. Ing. Ľudmila Nagyová, PhD., prof. Ing. Elena Horská, doc. Ing. Peter Haščík, PhD.

ANTIMIKROBIÁLNA REZISTENCIA MIKROORGANIZMOV VYIZOLOVANÝCH Z MLIEKA A MASLA A ICH IDENTIFIKÁCIA ZA POMOCI MALDI-TOF MS BIOTYPER

Vydalo nakladatelství KEY Publishing s.r.o., Nádražní 733/176, 702 00 Ostrava-Přívoz,

jako svoji 405. publikaciTisk: NOVPRESS s.r.o., nám. Republiky 15, 614 00 Brno

Vydáno v roce: 2018Vydání: první

Náklad: 100 ksPočet stran: 106

© Miroslava Kačániová, Simona Kunová, Ľudmila Nagyová, Elena Horská, Peter Haščík 2018

ISBN 978-80-7418-299-0 DOI: https://doi.org/10.15414/2018.9788074182990