univerza v ljubljani biotehniška fakulteta Študij...

Univerza v LjubljaniBiotehniška fakulteta Študij mikrobiologije

Seminarska naloga pri predmetu IDENTIFIKACIJA IN TAKSONOMIJA – GLIVE:

�lani projekne skupine: Jelka Pohar

Matej Sko�aj Brigita Radovan

3. letnik

Mentor:

Ljubljana, 3.1.2006 asist. mag. Polona Zalar, univ. dipl. biol.

Glive na sladki in slani hrani

2

UVOD ...................................................................................................................3

HIPEROSMOLARNA OKOLJA............................................................................4

VODNA AKTIVNOST ...........................................................................................4

KOMPATIBILNI TOPLJENCI...............................................................................8

PRIPRAVA IN POTEK SEMINARSKE NALOGE ..............................................12

Material in metode dela.................................................................................................. 12

REZULTATI........................................................................................................14

Glive na hrani z nizko vodno aktivnostjo:.................................................................... 14

Opisi gliv:......................................................................................................................... 16 Penicillium spp. (pri našem poskusu najve�krat izolirani predstavniki) ...................... 16 Cladosporium spp. ........................................................................................................ 18 Clonostachys spp. ......................................................................................................... 18 Fusarium spp................................................................................................................. 19 Aspergillus spp.............................................................................................................. 20 Rhizopus spp................................................................................................................. 21 Trichoderma spp. .......................................................................................................... 22

Komentar rezultatov....................................................................................................... 23

MIKOTOKSINI....................................................................................................24

ZAKLJU�EK ......................................................................................................26

VIRI.....................................................................................................................27


3

UVOD

Ljudje konzerviramo in shranjujemo živila na tak ali druga�en na�in že od pradavnine.

Spoznali smo, da živila ostanejo dalj �asa sveža, �e jih shranimo v zelo slanem ali

sladkem okolju. Tako eskimi še vedno svoj ulov iz morja shranjujejo preprosto tako, da

ga mo�no nasolijo. Slane ribe ostanejo tako užitne in primerne za prehrano še dolgo

potem, ko so bile ulovljene. Hrano pa lahko shranimo tudi v okolju z visoko vsebnostjo

sladkorja. Hrana ostane tako dalj �asa uporabna in primerna za prehrano.

Taka živila so ve�ini mikroorganizmov nedosegljiva, saj imajo nizko vodno aktivnost,

kar prepre�uje njihovo kolonizacijo. Med bolj uspešnimi pri koloniziranju teh

negostoljubnih okolij so nekatre glive. Deloma zaradi celi�ne stene in evkariotskega

izvora, deloma zaradi pretkanih mehanizmov izogibanja negativnih u�inkov takšnih

okolij. O tem v nadaljevanju.

V tej seminarskinalogi bomo skušali pojasniti, zakaj so takšna okolja neprijazna za rast in

razmnoževanje mikroorganizmov, kako so se nekatere glive prilagodile na takšna okolja

ter katere so te glive.


4

HIPEROSMOLARNA OKOLJA

Celica, ki je v okolju z znižano vodno aktivnostjo zaradi visoke koncentracije NaCl ali

drugih topljencev, se soo�a z hiperosmolarnim okoljem (posledi�no sledi prehajanje vode

iz citoplazme v okolje) in z vdorom Na + in Cl - ionov v citoplazmo in njihovo

potencialno toksi�nostjo.

Citoplazma ima nižjo vodno aktivnost od okolice. Zaradi teh prilagoditev pride do motenj

v intracelularnih procesih in do podiranja struktur, ki temeljijo na vodikovih vezeh.

Zaradi sprememb v citoplazmi proteini zavzamejo druga�no terciarno strukturo, pride pa

tudi do zmanjšane encimske aktivnosti v citoplazmi. Na novo sintetizirani proteini se

tako ne morejo pravilno zviti, kar privede do pove�anja koncentracije metabolitov, ki so

za celice lahko tudi toksi�ni. Celice se zaradi sprememb v aktivnosti in rasti prenehajo

deliti in pridejo v fazo prilagajanja na nove pogoje.

VODNA AKTIVNOST

Vodna aktivnost (aw) ozna�uje dostopnost vode za hidratacijo oz. metabolne procese v

celici. �e voda interagira s topljenci ali površino, ni na voljo za druge pocese. Definirana

je kot:

0pp

xa www == λ

�w – aktivnostni koeficient. Aktivnostni koeficient ni konstanta in v odvisnosti od

koncentracije raztopine zavzema vrednosti od 0 do 1. Odvisen je od koncentracije

topljenca v raztopini.

xw- molski delež vode

p – parcialni tlak vode nad raztopino

p0 – parcialni tlak �iste vode pri isti temperaturi

�ista voda ima vodno aktivnost 1, vse raztopine imajo aw manjšo od 1. Visoke

koncentracije topljencev v vodnih raztopinah zmanjšujejo dostopnost vode organizmom,

ki se nahajajo v takšnih okoljih. Dostopnost vode (ne pomeni isto kot koli�ina vode) za


5

organizme v okolju lahko opišemo na ve� na�inov – kot vodni potencial, kemijski

potencial vode, osmotski tlak, v zvezi z mikroorganizmi pa najpogosteje uporabljamo

vodno aktivnost. Za vlažne sisteme so vrednosti za vodno aktivnost višje od 0'80, za suhe

sisteme pa manjše od 0'70 (graf 1). �e povišamo temperaturo ali tlak, se poviša tudi

vodna aktivnost in obratno.

Podobno kot pri vseh ravnotežjih, voda prehaja iz podro�ij z višjo koncentracijo na

podro�ja z nižjo koncentracije vode. �e je celica v hipertono�nem okolju, ima citoplazma

višjo vodno aktivnost od okolice, zato voda prehaja iz celice. Zaradi teh prilagoditev

pride do motenj v intracelularnih procesih in do podiranja struktur, ki temeljijo na

vodikovih vezeh. Proteini zavzemajo druga�no terciarno strukturo. Posledi�no se

zmanjšana encimske aktivnosti. Novo sintetizirani proteini pa ne morejo pravilno zviti,

kar privede do pove�anja koncentracije metabolitov, ki pa so lahko za celice tudi

toksi�ni. Celice se zaradi sprememb v aktivnosti in rasti prenehajo deliti in pridejo v fazo

prilagajanja na nove pogoje.

Na vodno aktivnost pa vpliva tudi vsebnost vlage v ozra�ju, ki je obi�ajno med 50 in 80%

(aw= 0,50 – 0,80). Snovi z nižjo vodno aktivnostjo bodo vodo prevzele, snovi z višjo pa

bodo vodo izgubile in se izsušile zaradi težnje po izena�enju potencialov.

Graf 1: Izoterma vodne aktivnosti v odvisnosti od prisotne vlage (adsorbcija - ali desorbcija - sušenje) ter od spremembe pritiska in temperature


6

Kontrola vodne aktivnosti je zelo pomembna v prehrambeni industriji. Po eni strani zato,

da hrana med pripravo ohrani obliko, �vrstost, vonj in okus. Živila moramo v ta namen

hraniti v primernih prostorih ter na primerni temperaturi in vlagi, da se vodna aktivnost

ne spremeni. Drugi razlog pa je, ker nizka aktivnost prepre�uje mikrobno rast (tudi

patogenih mikroorganizmov) oz. kvarljivost. Visoko kvarljiva živila imajo vrednosti aw

med 0,99 in 0,95, kar omogo�a rast veliki ve�ini mikroorganizmov. Rast ve�ine (razen

tistih, ki so ustrezno prilagojene) bakterij je inhibirana pod aw= 0,91 (Tabela 2). Pod to

mejo rastejo predvsem glive. Ve�ina kvasovk raste na hrani z vodno aktivnostjo nižjo od

0,87. Ve�ina plesni ne raste pod aw 0,88. Rast gliv lahko prepre�imo, �e vodno aktivnost

spustimo pod 0, 65 aw in jo zadržimo pod to mejo. �e temperatura v živilu ali izdelku ni

enotna se lahko vodna aktivnost lokalno dvigne zaradi vlage na hladnejših podro�jih, kar

vodi v razrast glive. Meja za mikrobno rast je vodna aktivnost 0,60. Najbolj osmofilna

organizma Monascus bisporus in Saccharomyces rouxii lahko rasteta tudi pri vodnih

aktivnostih 0,62 oz. 0,61. Pod to vrednostjo pride namre� že do denaturacije DNA.

Da ohranimo primerno vodno aktivnost v hrani oz. njeno uporabnost do roka uporabe, jo

moramo shranjevati na primernem prostoru, ki ga predlaga proizvajalec. To je ponavadi

temen, suh in hladen prostor. Iz grafa 1 lahko vidimo, da sta prisotnost vlage v zraku in

temperatura klju�na dejavnika, ki vplivata na spremembe vrednosti vodne aktivnosti.

Tabela 1: Vrednosti vodne aktivnost aw za posamezna živila


7

Tabela 2: Minimalna inhibitorna aw za rast naštetih mikroorganizmov na hrani

Pri seminarski nalogi, smo želeli ugotoviti, kakšne glive rastejo na sladki in slani hrani.

Ta hrana ima veliko koncentracijo sladkorja oz. soli in tako nizko vodno aktivnost.

Pri�akovali smo, da bodo zrasle glive, ki tolerirajo nižje koncentracije vode v okolju

(osmotolerantne oz. kserotolerantne). Med predstavniki, ki so nam zrasli na slani in

sladki hrani nismo dobili nobenega zna�ilnega osmofilnega organizma, za katerega bi

bila visoka koncentracija topljencev (soli oz. glukoze) ali nizka aw pogoj za njegovo rast.

Voda difundira iz obmo�ij z višjo koncentracijo na podro�ja z nižjo v procesu osmoze.

�e je v celici raztopljenih ve� snovi, kot v okolju, potem voda vdre v celice.

�e se celica znajde v okolju z nižjo vodno aktivnostjo, potem voda odteka iz celice.

Celice se morajo v takih okoljih primerno zavarovati, da ne po�ijo oz. izgubijo vode za

metabolne procese.

Ti organizmi imajo posebne sisteme s katerimi se varujejo pred morebitnimi poškodbami

nastalimi zaradi prisotnosti NaCl.


8

KOMPATIBILNI TOPLJENCI

Kot prvi odgovor na prilagoditve na spremenjene pogoje celice v vodni aktivnosti je

sinteza kompatibilnih topljencev. To so nizkomolekularne snovi, ki sodelujejo pri

izena�itvi zunanjega osmotskega tlaka in v fizioloških koncentracijah ne vplivajo na

metabolne procese v celici. Organizmi jih lahko sami sintentizirajo in kopi�ijo znotraj

citoplazme, izven celice pa so prisotni le v sledeh. Celica z njihovo hitro sintezo zaustavi

izgubljanje vode. S pomo�jo takšnega »odgovora« teži k izena�itvi prvotnega volumna in

oblike.

V celicah so lahko prisotni tudi v velikostnem razredu molarnih koncentracij, so relativno

inertni glede na intracelularni metabolizem in služijo predvsem zniževanju intracelularne

aw, nekatere pa tudi š�itijo celi�ne strukture pred negativnimi vplivi nizke vodne

aktivnosti.

Med najbolj znane kompatibilne topljence sodijo: glicerol, arabitol, glicin betain, prolin,

ektoin, trehaloza. Uporabljajo jih evkariontski organizmi, cianobakterije, ve�ina bakterij

in manjša skupina arhej. Halofilne, kserofilne ter osmofilne glive uporabljajo glicerol in

arabitol; alge glicerol; cianobakterije uporabljajo saharozo, treharozo, glukozilglicerol oz.

glicin betain; halofilne anoksigene bakterije glicin betain; halofilne metanogene arheje

prav tako glicin betain; pri halofilnih heterotrofnih bakterijah pa je glavni kompatibilni

topljenec ektoin.

Kompatibilni topljenci se lahko kopi�ijo v halofilnih, ksenotolerantnih in osmotolerantni

organizmih. Halofili živijo v hipersalinih okoljih, osmofilom najbolj ustrezajo okolje s

povišanimi osmotskimi pritiski in kserofilni, ki preferirajo nizke vodne aktivnosti svojega

okolja.

Kot glavni intracelularni topljenec služi glicerol. Ta je deloma lipofilen in v primerjavi z

drugimi kompatibilnimi topljenci zelo u�inkovito prehaja skozi biološke membrane. V

citoplazmi ima funkcijo zaš�ite v citoplazmi topnih proteinov. Glicerol je skoraj idealen

kompatibilni topljenec, saj glede na koli�ino energije (potrebne za njegovo sintezo)


9

u�inkovito zniža aw in inertnost do celi�nih komponent. Njegova uporaba je omejena smo

na evkariotske halofilne vrste, saj steroli specifi�no uravnavajo prepustnost membran za

glicerol. Prokarionti (v ve�ino ne vsebujejo sterolov) morajo uporabljati druge,

energetsko dražje in manj u�inkovite kompatibilne topljence.

Slika 1: glicerol

Glicerol je klju�na snov, ki pomaga celicam preživeti v hiperosmolarnih pogojih. Kot

kompatibilni topljenec zmanjšuje intracelularno vodno aktivnost in pomaga vzpostavljati

pozitiven celi�ni turgor. Meritve ekstracelularne in celokupne koncentracije glicerola pri

kulturah v razli�nih koncentracijah soli v gojiš�u so pokazale, da kadar celice rastejo v

okolju brez soli, so koncentracije glicerola v njihovi notranjosti in v okolici pod mejo

detekcije. Ob pove�anih slanostih gojiš�a intracelularna koncentracija glicerola naraš�a

sorazmerno s koncentracijo NaCl v celi�nem okolju do 10%NaCl. To pomeni, da za�no

celice ob pove�ani slanosti okolja uravnavano sintetizirati glicerol. Ekstracelularna

koncentracija glicerola ostaja konstantno zelo nizka, kar pomeni, da celice zadržujejo

glicerol znotraj celic ali pa ga privzemajo nazaj iz okolja.

Pri koncentracijah NaCl v gojiš�u nad 17% se intracelularna koncentracija glicerola

bistveno ne pove�uje ve� bistveno, takrat se za�ne pove�evati njegova ekstracelularna

koncentracija. Verjetno je proizvodnja glicerola pri teh pogojih inducirana, vendar pa ga

celice ne morejo ve� zadrževati in zato je morda motena njihova homeostaza. Druga

možnost pa je, da celice za�nejo celice sintetizirati dodatne kompatibilne topljence in da

glicerol izgublja na pomenu kot klju�ni kompatibilni topljenec. Znano je, da glicerol ob


10

previsokih koncentracijah (nad 50%) ne deluje ve� zaš�itno, ampak inhibitorno na

biološke strukture.

Ve�ina preu�enih mikroorganizmov izgublja glicerol v okolje in morajo zato vzdrževati

stalno pove�ano sintezo glicerola. To zmanjša pretok metabolitov skozi glikolizo, hkrati

pa je za sintezo glicerola potreben ATP in posledi�no se za celico spremeni energetska

bilanca.

Glicerol sam tudi zaš�iti strukturo v citoplazmi topnih proteinov, še blagodejnejši vpliv

na biološke strukture pa ima disaharid trehaloza (zaš�ito intracelularnih struktur pred

razli�nimi stresnimi dejavniki, katere koncentracija se prav tako pove�a). Za mezofilne

organizme obstaja meja, nad katero tudi opisani mehanizmi niso ve� dovolj, da bi

omogo�ili nadaljnjo rast. Ta meja je dolo�ena s toksi�nostjo Na+ oz. je posledica dejstva,

da je zadrževanje glicerola znotraj celic dokaj neu�inkovito. V laboratorijskih pogojih,

kjer so gostote celic relativno zelo visoke, lahko namre� celice s produkcijo glicerola in

njegovim uhajanjem v zunajceli�ni prostor bistveno znižajo tudi zunanjo aw, kar jih vodi

v za�arani krog in v celi�no smrt.

Slika 2: Trehaloza

Pomembna sestavina membran imajo pri evkariontskih halofilnih organizmih steroli. Le

ti imajo eno klju�nih funkcij v prilagoditvi na hipersalino okolje. Nekateri organizmi s

spremembo vsebnosti sterolov v plazmalemi uravnavajo prehajanje glicerola iz celic,


11

poleg tega pa membranski steroli vplivajo na transport Na+ v celico. Glavni glivni sterol

je ergosterol, njegova biosinteza pa zelo podobna sintezi holesterola pri živalih.

Drugi pristop za izena�enje hiperosmolarnega okolja je kopi�enje visokih intracelularnih

koncentracij ionov, in sicer molarnih koncentracij K+ in Cl-, kar omogo�i izotoni�no

oziroma celo nekoliko hipertoni�no citoplazmo, hkrati pa zahteva od makromolekularnih

struktur – predvsem so s tega stališ�a preu�ene strukture proteinov – prilagojenost na

pogoje mnogo višjih ionskih jakosti, kot so prisotne v obi�ajnih vodnih raztopinah in

kakršne nastopajo v citoplazmi mezofilnih organizmov. Takšen tip prilagoditve je znan

samo pri prokariontskih organizmih, in sicer pri arhejah iz reda Halobacteriales ter pri

bakterijah iz reda Haloanaerobiales.


12

PRIPRAVA IN POTEK SEMINARSKE NALOGE

Material in metode dela

21. 11. 20005

Poskus smo nastavili tako, da smo sladko in slano hrane položili v vlažne komore

(petrijevke). Najprej smo nanje dali filter papir, nanj kanili nekaj kapljic vode, kar je

glivam omogo�ilo primerno vlago za rast ter položili vanjo še koš�ek hrane. Sladka in

slana hrana ima nizko vodno aktivnost, tako na takih vrstah produktov rastejo le glive, ki

so se zelo prilagodile takemu na�inu življenja, a o tem pozneje. Spodaj je navedena

hrana, ki smo jo porabili za poskus.

Hrana v petrijevkah:

• Beli sladkor • Rjavi sladkor • Suhe marelice • Suhe slive (doma�e & kupljene) • Kokos • Suh ananas • Suha papaja • Suhe banane • Rozine • Kompot (hruška & ribez) • Med • Marmelada • Kakav • Plesen iz marmelade • Kakav • �okolada • Slane pal�ke • Slana riba • Pršut • �ips • Gobe v slanici • Sojina omaka na MEA


13

Zatem smo ob navedenih datumih preverili rast na hrani, ter tudi izolirali zrasle glive.

Vsaki�, ko smo pregledali rast na hrani, smo pregledali tudi filter papir�ke, �e so bili

dovolj vlažni. �e niso bili, smo jih ovlažili, da je bilo v komori dovolj vlage.

24. 11. 2005

Prvi� smo pregledali preparate. Na hruškovem kompotu smo opazili 2 plesni, ki smo ju z

agarsko iglico nacepili na MEA gojiš�e.

28. 11. 2005

Najprej smo pregledali vlažne komore. Kjer je bilo potrebno navlažiti filter papir, smo

navlažili. Opazili smo nastanek plesni na kokosu, pršutu, ribi, gobah v slanici, slanih

pal�kah, bananah, in kakavu.

1. 12. 2005

Na MEA gojiš�e smo z agarsko iglico nacepili plesni s suhih banan, sojine omake, pršuta,

suhe ribe, gob v slanici, �ipsa, kokos, slane pal�ke in kakava.

Vse tri vrste gliv zrasle na suhi ribi in glive s pršuta smo nacepili smo nacepili še na slano

gojiš�e. Ugotovili smo, da je na kokosu zrasel Aspergillus, pršutu pa Penicillium.

6. 12. 2005

Pregledali smo nacepljena gojiš�a. Na �ipsu sta zrasla Penicillium in Cladosporium.

7. 12. 2005

Namo�ili smo nekatere filter papirje in nekatere kolonije precepili na gojiš�a MEA.

12. 12. 2005

Izbrali smo 4 vrste penicilijev iz banan, gob v slanici (2x), marmelade in �ipsa. Z iglo

smo jih to�kovno nacepili (na tri to�ke) na gojiš�e MEA in CREA ter inkubirali pri 25°C.

Glive, ki so zrasle na gojiš�ih je bilo potrebno izolirati v �isti kulturi, da so tako na

razpolago za nadaljnje preiskave in za v zbirko.


14

REZULTATI

Glive na hrani z nizko vodno aktivnostjo:

• Eurotium chevalieri • Eurotium echinulatum • Eurotium repens • Eurotium rubrum • Eurotium herbariorum • Eurotium amstelodami • Wallemia sebi • Alternaria restrictus • Ermascus albus • Ermascus fertilis • Xeromyces bisporus • Scopulariopsis halophilica • Chrysosporium inopus • Chrysosporium farinicola • Chrysosporium fastidium • Chrysosporium xerophilum • Polypaecilum pisce

Tabela 3: Rodovi, ki smo jih dobili na posamezni vrsti hrane in razli�na gojiš�a HRANA ROD IZGLED GOJIŠ�E RAST Kompot (hruška)

Rhizopus Bele hife, �rne bunkice

MEA

Penicillium Temno zelena, rumen reverz

MEA, MEA + 10%. CREA

++ +

Cladsporium Temno zelena kolonija, šrn reverz.

MEA

Suhe banane

Penicillium Temno zelena kolonija, rumenkast reverz.

MEA, CREA

Sojina omaka Cladosporium Temno zelena kolonija, sivo zelen reverz.

MEA

Pršut Clonostachys Bele kolonije, oranžen

MEA, MEA+10%

++ +


15

reverz. Marmelada 2x Penicillium Zelena

kolonija. MEA, CREA

Kokos Aspergillus �rne hife s �rnimi glavicami.

MEA

kvasovka Bela mazava kolonija.

MEA,

MEA + 10%

++ +

Suha riba

Penicillium Temno zelena, siv reverz.

MEA,

MEA +10%,

CREA

++ + Zelo rumeno, dobra rast.

2x Penicillium Svetlo modre, peš�ene in sive kolonije, temen reverz.

MEA, CREA

Cladosporium Olivno zelene barve, žametna struktura, �rn reverz.

MEA

�ips

Trichoderma Bela in rumeno-zelena kultura, ki je prerasla celo gojiš�e

MEA

kvasovka Bele mazave kolonije

MEA

Fusarium Bela kultura, ki je prerasle celo gojiš�e

MEA

Penicillium Temno zelena, bela obroba

MEA, CREA

Gobe v slanici

Basidiomycetae Bela kultura prerasla �ez vse gojiš�e.

MEA

Slane pal�ke Aspergillus �rne hife s �rnimi glavicami.

MEA

Kakav Penicillium Svetlo sivo zeleno, reverz, peš�ene v sredini, svetlo zelena ob robu.

MEA, CREA


16

Ugotovili smo, da nam je zraslo precej vrst Penicillium (iz banan,marmelade, suhih rib

�ipsa, gob v slanici ter kakava), poleg tega pa se Rhizopus na kompotu iz hruške,

Cladosporium (Suhe banane, sojina omaka, �ips), Clonostachys na pršutu, Aspergillus na

kokosu in slanih pal�kah, kvasovka na suhih ribah, Trichoderma na �ipsu, Fusarium na

gobah v slanici, in Basidiomycetae, ki so tudi zrasle na gobah v slanici.

Opisi gliv:

Penicillium spp. (pri našem poskusu najve�krat izolirani predstavniki)

Taksonomska razvrstitev:

Kraljestvo : Fungi

Deblo: Ascomycota

Razred: Euascomycetes

Družina: Trichomaceae

Rod: Penicillium

Vrste Penicillium spoznamo po njihovi metlasti strukturi, ki nosi spore. Razen ene izjeme

so vsi predstavniki rodu Penicillium filamentozne glive. Najdemo jih lahko v/na zemlji,

vegetaciji, na živalih, v zraku, celulozi, preprogah in skoraj povsod, kjer se pojavljajo

organske molekule. Vrste Penicillium so kontaminantne vrste, lahko povzro�ajo razne

infekcije pri bolnikih obolelih za AIDS-om in so lahko tudi indikator bolezni AIDS.

Proizvajajo mikotoksine. Nekatere vrste vklju�ujejo telemorfne oblike.

Rod Penicillium vklju�uje kar nekaj vrst, najbolj pogosti so: P. chrysogenum, P.

citrinum, P. janthinellum, P. marneffei, P. purpurogenum. Identifikacija to ravni vrste

temelji na makroskopskem pregledu kulture in mikroskopskih karakteristikah.

Vrste penicilijev dolo�ajo s pomo�jo biokemijskih testov tako, da dolo�ajo vrsto terpena,

ki ga posamezna vrsta sitentizira na kvasnem agarju. Pomagajo si tudi z dolo�evanjem

amilaznih izoencimov, ki so zna�ilni za posamezno vrsto penicilijev. Pri dolo�itvi vrste si

lahko pomagamo tudi s preu�evanjem razvejanosti fialid.

Vrste Penicillium so ob�asni (oportunisti�ni) povzro�itelji infekcij pri �loveku, te bolezni

so znane kot peniciloze. Ve�ina oportunisti�nih bolezni je posledica imunske oslabelosti.

Vrsta Penicillium verrucosum, na primer izlo�a mikotoksin, okratoksin A, ki je


17

nevrotoksi�en in kancerogen obenem. Ostale oportunisti�ne vrste lahko povzro�ajo tudi

vro�ino, anemijo, hujšanje, izpuš�aje, bolezni dihal, bolezni ustne votline, itd.

Penicillium marneffei je patogena gliva, ki prizadene bolnike z AIDS-om, ki živijo v SV

Aziji. Okužbo so zaznali tudi pri maligioznih in imunsko oslabljenih bolnikih

(kemoterapija). Bolniki se okužijo aerosolno. Tros zaidejo v plju�a in tako povzro�ijo

fungemijo, od tam pa se lahko razširijo tudi v limfni sistem, jetra, ledvice, in kosti.

Bolezenski znaki se pojavijo z izpuš�aji na koži. Bolezen je pogosto usodna. Vrste iz

rodu lahko povzro�ajo tudi kvarjenje hrane, nekateri sintetizirajo mikotoksine in tako

zastrupijo hrano. Po drugi strani so nekatere vrste zelo koristne. Nekatere vrste

oplemenitijo sire, iz drugih, kot npr. Penicillium chrysogenum pa pomagajo pri

pridobivanju antibiotika penicilina.

Kolonije penicilijev rastejo zelo hitro, so ploš�ate, filamentozne in po teksturi lahko

spominjajo na bombaž, volno ter žamet. Kolonije so na za�etku bele, nato pa postanejo

lahko modro-zelene, sivo-zelene, olivno-sive, rumene ali roza barve. Reverz je ponavadi

rumenkast.

V mikroskopskem preparatu lahko opazimo konidije, fialide, metule, enostavne ali

razvejane konidiofore in septirane hife (1,5 do 5 �m v premeru). Na koncu konidofora

izraš�ajo fialide. Metule so sekundarni izrastki, ki se formirajo na konidoforu in nosijo

fialide. Organizacija fialid je zelo tipi�na, tvorijo grmom podoben skupek. Konidiji se

sproš�ajo iz fialid (2.5- 5 µm) so sferi�ni, unicelularni in vezikularni in se nahajajo na

vrhu fialide. Ponavadi so zelenkaste barve.

Antibakterijske u�inke penicilina je odkril Alexander Fleming leta 1929. opazil je, da so

kolonije Staphilococcus aureus, ki so bile v neposredni bližini glive lizirale. Kmalu je

spoznal, da pomembnost tega glivnega metabolita, ki bi se ga lahko uporabljalo za

kontroliranje rasti bakterij. Snovi je dal ime penicilin. Ugotovil je, da penicilin zelo dobro

u�inkuje na G+ bakterije. Vrednost v svetovnem zdravstvu in aplikativno uporabo je

penicilin doživel med drugo svetovno vojno. Takrat je Flemming skupaj še s dvema

znanstvenikoma dobil Nobelovo nagrado, penicilin pa je dobil ime »�udežno zdravilo«.


18

Cladosporium spp.

Kraljestvo: Fungi

Deblo: Ascomycota

Razred: Ascomycetes

Poddeblo: Ascomycotina

Rod: Cladosporium

Pogosto jih najdemo v onesnaženih okoljih. Pojavlja se v sivi do �rni ali v temno zeleni

barvi in ima »pudrasto« teksturo. Ta rod vklju�uje preko 30 vrst. Najbolj pogosti so: C.

elatum, C. herbarum, C. sphaerospermum in C. cladosporoides. Predstavniki rod so

pigmentirane glive, ki se razširjajo preko zraka, pojavljajo pa se predvsem v

(sub)tropskem pasu. Nekateri kladosporiji pa so bili izolirani tudi iz rib, kjer so

parazitirali. So zelo preu�ene glive, saj povzro�ajo alergije, spore se prenašajo po zraku

in so tako pogost vzrok respiratornih bolezni. Lahko so tudi paraziti kože in mehkih tkiv

na nohtih. Je pogost povzro�itelj astme.

So najbolj pogosto identificirane glive v naravi. Njihovo število se pozimi zmanjša.

Najdemo jih na odmrlih rastlinah, (pokvarjeni) hrani, zemlji in tekstilu.

Najbolje raste na krompirjevem dekstroznem agarju pri 25°C. Tekstura je puhasto-

prašnato-pudrasta. Ve�ina jih raste pri T nižji od 35°C.

Pri mikroskopskem pregledu opazimo rjave hife, dvignjene in pigmentirane konidoforje

ter unicelulerne konidije.

Clonostachys spp.

Deblo: Ascomycota

Razred: Hypomycetes

Red: Hypocreales

Družina: Bionectriaceae

Rod: Clonostachys

Nekatere vrste so patogene za žuželke (mikoparaziti). Clonostachys spp. So izolirali iz

zemlje, iz živih ali odmrlih listov razli�nih rastlin. Zna�ilni so cilindri�ni konidiji. Na


19

agarju tvorijo bele kolonije. Poznanih je ve� vrst: npr. C. rosea (zna�ilen rožnat reverz)

in C. compactiuscula.

Fusarium spp.

Kraljestvo: Fungi

Deblo: Ascomycota

Red: Hypocreales

Družina: Hypocreaceae

Rod: Fusarium

Spada med filamentozne glive. Živi predvsem na rastlinah in v zemlji. Je del naravne

mikoflore. �eprav je najbolj pogosta v (sub)tropskih krajih, jo najdemo tudi v hladnejših

podro�jih. Nekatere oblike imajo tudi telomorfno obliko. Rod vsebuje ve� kot 20

razli�nih vrst.

Poleg tega, da je pogost patogen rastlin, je povzro�itelj razli�nih obolenj tudi pri ljudeh.

Te bolezni obravnavamo kot fusarioze. Napadejo predvsem imunsko oslabljene ljudi (pri

malignih obolenjih in kemoterapiji). Povzro�ajo lahko keratitis, infekcije dihal,

endokarditis, artritis. Spore te glive se lahko prenašajo z vodo in tako okužijo imunsko

oslabljene bolnike v bolnicah. Nekateri njihovi toksini so tudi alergeni.

Najbolje rastejo na dekstroznem agarju pri 25°C. Njihove kolonije so volnasto-bombažne

ter ploš�ate. Kolonije so lahko bele, kremne, oranžne, rumene, rde�e, vijoli�ne ali

rožnate. Hife lahko opazujemo makroskopsko in jih prepoznamo po temno modri barvi.

V mikroskopskem preparatu opazimo septirane hife, konidofori, fialide, makrokonidiji in

mikrokonidije lahko opazujemo s pomo�jo svetlobnega mikroskopa. Fialide so

cilindri�ne, lahko pa najdemo tudi mikro in makrofialide (v glavicah ali verigah).

Makrokonidiji (3-8*11-70µm) izraš�ajo iz fialid, te pa iz septiranih ali neseptiranih

konidoforov. So 2 ali ve� celi�ni, s tanko steno ter gladke na videz. Mikrokonidiji (2-4*4-

8µm) izraš�ajo iz na dolgih ali kratkih preprostih konidoforjih. Pove�ini so enoceli�ni in

gladki. �e so chlamidospore prisotne so le-te v parih, grozdih ali verižicah, imajo tanke

stene.


20

Aspergillus spp.

Kraljestvo: Fungi

Deblo: Ascomycota

Razred: Ascomycetes

Red: Eurotiales

Družina: Trichocomaceae

Rod: Aspergillus

Rod, ki obsega približno 200 vrst. Najdemo jo v zemlji, na propadajo�ih rastlinah,

ruševinah, naplavinah, skladiš�enem žitu. Najpogosteje se širi z suhimi sporami, s

pomo�jo vetra. Raste pri 37°C in je vrsta, ki ni zelo zahtevna glede potrebnega substrata

za rast. Raste lahko na velikem obsegu podlag. Navadno pa je za rast potrebna vodna

aktivnost med 0.71 - 0.94, ki pa variira med vrstami . Za gojenje se navadno uporablja

splošni glivni medij, na katerem dobro raste.

Spore so brezbarvne in ovalne in so zelo podobne sporam rodu Penicillium.

Aspergillus je eden izmed najbolj pogostih glivnih rodov po svetu. Med najbolj pogoste

vrste pa spada A. fumigatus. Poleg njega pa sem sodijo tudi: A. fumigatus, A. flavus, A.

niger, A. ustus, A. versicolor in drugi.

To glivo se lahko uporablja tudi v industrijske namene pri proizvodnji hrane (A. oryzae

fermentira sojo za nastanek sojine omake, A. terreus proizvaja mevinolin, ki se ga

uporablja za znižanje krvnega holesterola, A. niger se uporablja v industriji piva in

kruha.

Kot mnoge druge glive, lahko tudi ta v svojo okolico izlo�a toksi�ne produkte kot so:

aflatoksina B1 in B2, oksali�no kislino, ciklopiazoni�no kislino (cyclopiazonic acid),

koji�no kislino (kojic acid), ergotne alkaloide, fumiglaklavine, gliotoksin, fumigatoksin,

fumigilin in druge spojine.

V medicini je poznan tudi kot alergen, ki povzro�a alergije, za katere so zna�ilne visoke

vro�ine, vlaženje plju� in astma. Kot patogen in oportunisti�en organizem, ga opisujejo v

dihalih, na koži in roženici, kjer navadno povzro�a driske, nosno sinusne rane, itd.


21

Rhizopus spp.

Kraljestvo: Fungi

Deblo: Zygomycota

Razred: Zygomycetes

Red: Mucorales

Družina: Mucoraceae

Rod: Rhizopus

Rhizopus je kozmopolitski rod, ki je navzo�a povsod po svetu in vsebuje 12 vrst.

Navadno ga najdemo v gozdu in na obdelani zemlji, gnilem sadju in zelenjavi, živalskem

gnoju in kompostu. Rhizopus lahko raste na razli�nih podlagah. Najpogosteje na

pokvarjeni hrani in manj pogosto na notranjih površinskih podlagah. Vrednost vodne

aktivnosti na kateri se pojavljajo se navadno giblje okoli 0.93. Rhizopus dobro raste na

splošnem glivnem mediju in pogosto zapolni celotno petrijevko. Njegove vrste pa lahko

prerastejo tudi druge vrste in inhibirajo njihovo rast.

Širi se s pomo�jo suhimi sporami in vetra. Spore so pomembna za dolo�anje vrst, prav

tako pa so spore in sporulirajo�e strukture bistvene za razlo�evanje. Nekatere vrste

proizvajajo oglate, pigmentirane spore z brazdami.

To glivo se lahko uporablja tudi v industrijske namene. Lahko jo uporabljamo v

produkciji sirov, fermentaciji sadja, za proizvodnjo alkoholov in organskih kislin ter v

proizvodnji papirja.

Pri tem rodu do sedaj še niso odkrili morebitnih toksi�nih produktov. Odkrili pa so

alergene u�inke. Alergije navadno povzro�ajo visoko vro�ino, astmo, poškodbe plju� in

plju�nico. Lahko je tudi parazitski rastlinski patogen na krompirju, bombažu in razli�nem

sadju. Predstavniki rodu Rhizopus so tudi povzro�itelji zigomikoz (zygomycosis) pri

pacientih, ki trpijo za diabeti�ni ketoacidozami, podhranjenostjo, hudimi opeklinami.


22

Trichoderma spp.

Kraljestvo: Fungi

Deblo: Ascomycota

Razred: Euascomycetes

Red: Hypocreales

Družina: Hypocreaceae

Rod: Trichoderma

Trichoderma sp. je razširjen, ubikvitaren in kozmopolitanski rod, ki vsebuje približno 20

vrst. Nahaja se lahko v severnem gorskem in v tropskih podro�jih; v zemlji, trohne�em

lesu, žitih, citrusih, sladkem krompirju, papirju, tekstilu in vlažni volni. Širi se navadno z

vlažnimi sporami, ki jih prenašajo dež, insekti in suh veter. Za njegovo gojenje

uporabljamo splošni glivni mediju na katerem zrasejo bele puhaste kolonije. Konidiji

trichoderme so podobne oblike in velikosti kot Penicillium in Aspergillus, vendar pa tvori

lepljive skupke konidijev z zna�ilnim zelenim pigmentom, ki je zna�ilen le za to vrsto.

To glivo uporabljajo tudi v industriji. T. viride razgrajuje celulozo in izdeluje

hemicelulaze, ki se uporabljajo v proizvodnji piva, vina in prehrambnega procesiranja.

Lahko tudi pove�a aromo �aja in glivnih produktov.

Nekatere vrste rodu Trichoderma izdelujejo tudi toksi�ne produkte kot trihotecene,

(trichothecene) in cikli�ne peptide; gliotoksin, izocianide, T-2 toksin, trihodermin

(trichodermin).

Znana je tudi njihova alergena vloga, saj povzro�ajo vro�ino, seneni nahod, astmo,

plju�nico. �e okuži �loveka lahko povzro�i infekcijo plju�, vnetje potrebušnice in

nevarne infekcije pri pacientih s presaditvijo ledvic in tistih, ki potrebujejo dializo.


23

Komentar rezultatov

Iz tabele 1 je razvidno, kakšne vrednosti vodne aktivnosti imajo posamezna živila. Spodaj

so navedena, živila iz katerih smo izolirali glive z odgovarjajo�imi vodne aktivnosti.

Marmelada – aw med 0,90 in 0,80 in tudi med (bolj sladka) 0,70 in 0,60

Slana riba – aw med 0,80 in 0,70

Suho sadje (papaje, jagode, ananas, rozini, suhe banane, suhe slive, kokos) – aw med 0,70

in 0,60

Kompot (hruške in ribez) – aw med 1,00 in 0,95

Kakav – aw okoli 0,4

�ips – aw okoli 0,30

Pršut – aw med 0,95 in 0,90

Slano pecivo (slane pal�ke) – aw okoli 0,30

Gobe v slanici – aw med 1,00 in 0,95

Na teh živilih v �asu trajanja poskusa nismo zasledili rasti gliv.

�okolada – aw med 0,60 in 0,50

Med - aw med 0,60 in 0,50

Od suhega sadja ni v �asu trajanja poskusa ni zraslo ni� na koš�kih ananasa, suhih slivah,

suhih marelicah.

Kot vidimo, smo uporabili nekaj ve� sladke kot slane hrane.

Opazimo lahko, da so glive zrasle tudi na hrani, kjer je vodna aktivnost, ki je primerna za

rast precej nižja od 0,6 (�ips slane pal�ke kakav – pogojno tudi suho sadje, marmelada in

slana riba). To lahko pojasnimo s tem, da smo vsa živila imeli v vlažnih komorah, kjer je

bila vsebnost vlage ve�ja kot v zraku. �e je vlažnost ve�ja kot vodna aktivnost, bodo

vodne molekule iz zraka prehajale v živilo. Posledi�no zviša vodna aktivnost.

Na �okoladi, medu in nekaj vrstah suhega sadja, ni zraslo ni�. Suho sadje, ki je bilo

kupljeno v trgovini, je bilo tretirano s konzervansi, ki onemogo�ajo oz. zelo uspešno


24

prepre�ujejo rast mikroorganizmov in tako tudi gliv. �eprav smo tudi ta živila imeli v

vlažnih komorah, smo suhe marelice in slive imeli v ve�jih petrijevkah in škatlicah, kjer

se je filtrirni papir hitreje sušil in posledi�no vlažnost ni bila zadostna, da bi se živilu

pove�ala vodna aktivnost, kar je poleg konzervansov prepre�ilo rast. Ni� nam ni zraslo

tudi na sladkorju, medu, �okoladi. To je verjetno zaradi neugodne vodne aktivnosti.

Nekatera živila bi morali inkubirati dalj �asa (npr, koš�ke �okolade). Sladkor in med pa

imata precej nižjo vodno aktivnost oz. tudi ob vlagi v okolici, ne prevzameta toliko vode,

da bi se vodna aktivnost tako povišala, da bi bila ugodna za rast gliv. Med vsebuje tudi

H2O2, ki pa inhibitorno deluje predvsem na bakterije.

MIKOTOKSINI

Iz opisov gliv lahko vidimo, da so v ve�ini rodov (Penicillium spp., Trichoderma spp.,

Rhizopus spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Cladosporium spp.) prisotni tudi

patogeni predstavniki. Ti povzro�ajo bolezni, alergije ali pa izlo�ajo mikotoksine, ki se

akumulirajo v živilih.

Mikotoksini so sekundarni, toksi�ni produkti plesni, ki so škodljivi za živali in ljudi.

Obolenja, povzro�ena z mikotoksini imenujemo mikotoksikoze, za razliko od mikoz, ki

nastanejo zaradi infekcije živali s plesnimi. Mikotoksini dospejo v organizem

prvenstveno z zauživanjem hrane, poznana pa je tudi inhalacija in dermalna pot

njihovega vnosa. Ve�je koli�ine mikotoksinov lahko povzro�ijo akutne zastrupitve, ki

utegnejo biti letalne, dolgotrajnejše zauživanje manjših koli�in mikotoksinov pa je

povezano s kroni�nimi boleznimi, vklju�no z nastankom tumorjev. Bolezenski znaki so

odvisni od koli�ine in vrste mikotoksina, dejavnikov okolja ter zdravstvenega stanja

bolnikov. Razmnoževanje plesni pospeši višja vodna aktivnost in višja relativna vlaga

zraka kot 70%, temperature nad 130C in aerobni pogoji skladiš�enja hrane.

Mikotoksini kažejo razmeroma veliko stopnjo v specifi�nosti delovanja na posamezna

tkiva in organe. Najpogosteje so prizadeta prebavila, jetra in ledvica. Poleg tega pa

delujejo škodljivo še na krvotvorne organe, krvožilni in živ�ni sistem ter spolovila.


25

V žitih in drugih koncentratih so za zdravje ljudi najpomembnejši aflatoksini, fumonizini,

zearalenon (F-2), deoksinivalenol (DON) in ergotalkaloidi, nekoliko manj problemati�ni

pa so T-2 toksin in drugi trihoteceni, ohratoksini in citrinin. Živila predstavljajo medij za

organizme in indukcirajo sintezo toksinov. Zato je pomembno, da rast gliv na hrani

kontroliramo. Hrano moramo ustrezno shranjevati, da ne pride do razrasti gliv, ki lahko

poslabšajo zdravstveno stanje predvsem imunsko oslabljenih ljudi in tistih, ki so nagnjeni

k alergijam.

Mikotoksine v vzorcu lahko ugotavljamo na razli�ne na�ine:

1. kemijske metode:

- tankoslojna kromatografija (TLC)

- plinska kromatografija

- visokotla�na teko�inska kromatografija (HPLC)

- masna spektroskopija

- nuklearna magnetna resonanca

2. mikološka preiskava (determinacija izoliranih plesni, preiskus na toksigenost)

3. mikrobiološka preiskava (inhibicija rasti bakterij na trdnem gojiš�u)

4. biološki poskusi (npr. estrogeni u�inek F-2 na juvenilne podgane)

5. imunoencimske metode (ELISA, RIA)


26

ZAKLJU�EK Hipresladka in hiprerslana okolja so neprimerna za rast ve�ine mikroorganizmov.

Mikroorganizmi ne uspevajo zaradi prenizke koncentracije dostopne vode, ki tako ni na

voljo za metabolne procese. Problem hipreslanih okolij je v tem, da ioni, ki so v visokih

koncentracijah v raztopini, vdirajo v celice zaradi težnje po izena�itvi koncentracij na

obeh straneh membrane (v in izven celice). Primarni kolonizatorji teh okolij so nekatere

vrste gliv. V svoji citoplazmi akumulirajo višje koncentracije kompatibilnih topljencev.

To so predvsem sladkorji. Delujejo tako, da zmanjšujejo intracelularno vodno aktivnost

in pomagajo vzpostaviti pozitivni celi�ni tugor. Najbolj razširjena kompatibilna topljenca

sta trehaloza in glicerol.

Na gojiš�ih nam je zraslo precej vrst gliv. Dobili pa nismo nobenega tipi�nega

osmofilnega predstavnika, ki kot pogoj za rast zahteva hiperslano/ sladko okolje.

Življenje vedno najde pot za preživetje. Vedno preživijo najbolj pretkani in prilagodljivi,

kar glive vsekakor so.


27

VIRI

• Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2003) Brock – Biology of

Microorganisms, 10th ed. Prentice-Hall, Pearson Education International, London

• W. D. Grant: Life at low water activity, The Royal Society, Published online 12 July 2004, 1249-1267

• Water structure and behavior: Water Activity

http://www.lsbu.ac.uk/water/activity.html

• Doctor Fungus Search http://www.doctorfungus.org/search/query.asp

• Environmental Microbiology Laboratory

http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po • http://gimvic.org/projekti/timko/2002/2b/alkohol/glicerol.htm • http://www.ars.usda.gov/main/ (agricultural research service)

• http://www.aspergillus.man.ac.uk/indexhome.htm

• http://www.botany.utoronto.ca/ResearchLabs

• Mikotoksini

http://www.virtuni.net/?page_name=vu&article_id=3999

univerza v ljubljani biotehniška fakulteta Študij...

Documents