T.C.TÜRKİYE BİLİMSEL VE TEKNOLOJİK ARAŞTIRMA KURUMU BAŞKANLIĞI

Araştırma Destek Programları Başkanlığı

Konu : 114Z599 Numaralı Proje - Sonuç Raporu

Sayın Hüsniye Tansel YALÇIN

Yürütücülüğünü yaptığınız 114Z599 numaralı ve "Türkiye'deki Bazı Amfibi TürlerininDeri Sekresyonlarının Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi" başlıklı projenizin Sonuç Raporu,Grup Yürütme Komitemizin 27.10.2016 tarih ve 41 sayılı toplantısında görüşülmüş ve ilgiliraporun kabulüne karar verilmiştir. Bu proje kapsamında yapacağınız çıktılarınıza ilişkin bilgilerin ardeb-pts.tubitak.gov.tradresinden erişebileceğiniz çıktı ekleme bölümüne girilmesi ve ilgili dosyaların bu bölümeyüklenmesi önem taşımaktadır. Bilgilerinizi saygılarımla rica eder, çalışmalarınızda başarılar dilerim.

Bilgi Notu:

Sayı : 27798170/161.10/E.236661 16/11/2016

Dr. Demet DAŞKINKİMYA, BİYOLOJİ ARAŞTIRMA DESTEK

GRUBUGrup Yürütme Komitesi Sekreteri

Bu belge, 5070 sayılı Elektronik İmza Kanununa göre Güvenli Elektronik İmza ile imzalanmış ve proje yürütücüsünün (HÜSNİYE TANSELYALÇIN) TÜBİTAK ARDEB PROJE TAKİP SİSTEMİ hesabına yüklenmiştir.Evrak doğrulaması talepleri, ebys@tubitak.gov.tr adresine e-posta yollanılarak yapılabilir.

Atatürk Bulvarı No:221 06100 Kavaklıdere/ANKARATelefon No: (0312) 468 53 00 Fax No: (0312) 427 74 89e-Posta: iletisim@tubitak.gov.tr İnternet Adresi: www.tubitak.gov.tr

Bilgi için: Giray BULUTÜnvanı: Bil.Prog.Uzmanı

Tel: 0312 298 11 96

1

- TÜBİTAK tarafından kabul edilebilir geçerli bir mazeret bildirilmeksizin; proje gelişme raporlarının sözleşmede

belirtilen tarihlerde, proje sonuç raporlarının ise, sözleşmede belirtilen proje bitiş tarihinden itibaren 2 (iki) ay

içinde gönderilmemesi halinde, ilgili rapor dönemine ait Proje Teşvik İkramiyeleri (PTİ) ödenmeyecektir.

- Proje ekibi tarafından, TÜBİTAK desteği ile yürütülmekte/sonuçlandırılmış olan projeler kapsamında yapılan

yayınlarda [makale, kitap, bildiri (sözlü sunum/poster sunum), tez, yayılım vb.] proje sözleşmesi ve TÜBİTAK

Araştırma ve Yayın Etiği Kurulu Yönetmeliği (AYEK) gereğince ilgili proje numarası ile birlikte TÜBİTAK desteği

belirtilmelidir.

- Proje sözleşmeniz gereği, proje kapsamında yapacağınız hiçbir yayın, iş ve işlemde TÜBİTAK logosu

kullanılamaz.

- 03/11/2012 tarihinden sonra sonuçlanan projelerde, projelerin yürütücü ve araştırmacılarını ödüllendirmek

amacıyla Proje Performans Ödülü (PPÖ; ppo.tubitak.gov.tr) uygulamasına başlanmıştır. Bu uygulamaya paralel

olarak proje çıktılarının değerlendirilmesi de ARDEB Proje Takip Sistemi (ardeb-pts.tubitak.gov.tr) üzerinden

yapılmaktadır. Bu kapsamda projenize ait çıktıların PTS'ye yüklenmesi önem taşımaktadır.

Bu belge, 5070 sayılı Elektronik İmza Kanununa göre Güvenli Elektronik İmza ile imzalanmış ve proje yürütücüsünün (HÜSNİYE TANSELYALÇIN) TÜBİTAK ARDEB PROJE TAKİP SİSTEMİ hesabına yüklenmiştir.Evrak doğrulaması talepleri, ebys@tubitak.gov.tr adresine e-posta yollanılarak yapılabilir.

Atatürk Bulvarı No:221 06100 Kavaklıdere/ANKARATelefon No: (0312) 468 53 00 Fax No: (0312) 427 74 89e-Posta: iletisim@tubitak.gov.tr İnternet Adresi: www.tubitak.gov.tr

Bilgi için: Giray BULUTÜnvanı: Bil.Prog.Uzmanı

Tel: 0312 298 11 96

2

Türkiye'deki Bazı Amfibi Türlerinin Deri Sekresyonlarının Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi

Program Kodu: 3001

Proje No: 114Z599

Proje Yürütücüsü: Doç. Dr. Hüsniye Tansel YALÇIN

Araştırmacılar Prof. Dr. Bayram GÖÇMEN Doç.Dr. Ayşe NALBANTSOY Bursiyer Uzm. Mert KARIŞ

AĞUSTOS 2016 İZMİR

III

İÇİNDEKİLER DİZİNİ

ÖNSÖZ .................................................................................................................................. I

ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................................. VI

ÖZET ................................................................................................................................. VIII

ABSTRACT .......................................................................................................................... IX

1. GİRİŞ ................................................................................................................................ 1

2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................................. 4

2.1. Türkiye’de Genel Dağılış Gösteren Amfibiler ve Genel Dağılış Alanları ....................... 4

2.2. Amfibi Deri Sekresyonlarının Genel Özellikleri ............................................................ 6

2.3. Antimikrobiyal Peptidler ............................................................................................... 7

2.3.1. Anyonik Antimikrobiyal Peptidler .............................................................................. 9

2.3.2. Katyonik Antimikrobiyal Peptidler ............................................................................10

2.4. Amfibi Deri Salgılarının Biyoteknolojik Kullanımı ve Terapötik Potansiyeli ..................14

2.5. Amfibi Deri Sekresyonlarının Antimikrobiyal ve Sitotoksik (Kanser ve Normal

Hücrelerde) Etkileri ...........................................................................................................16

3. MATERYAL VE METOD ..................................................................................................23

3.1. Arazi Çalışmaları ........................................................................................................23

3.2. Salgı Sağımı ..............................................................................................................23

3.3. Liyofilizasyon .............................................................................................................24

3.4. Total Protein Miktarları Tayini.....................................................................................24

3.5. Protein Profillerinin Belirlenmesi (SDS PAGE) ...........................................................26

3.6. Antimikrobiyal Aktivite ................................................................................................28

3.6.1.Broth Mikrodilusyon Yöntemi ....................................................................................29

3.7. Sitotoksisite ................................................................................................................30

3.7.1. Hücre Hatları ve Kültürlerin Devamlılığı ..................................................................30

3.7.2.Sitotoksisite ve Hücre Canlılık Testleri .....................................................................30

3.8. Hemolitik Aktivite ........................................................................................................31

4. BULGULAR ..................................................................................................................32

4.1. Arazi Çalışmaları ........................................................................................................32

IV

4.2. Liyofilizasyon .............................................................................................................40

4.3. Protein Miktar Tayini ..................................................................................................41

4.4. Protein Profillerinin Belirlenmesi (SDS-PAGE) ..........................................................42

4.5. Antimikrobiyal Aktivite Sonuçları ................................................................................48

4.6. In Vitro Sitotoksisite Sonuçları ....................................................................................52

4.7. Hemolitik Aktivite Sonuçları ........................................................................................62

5. TARTIŞMA ve SONUÇ .....................................................................................................65

6. KAYNAKLAR ....................................................................................................................73

VIII

ÖZET

Amfibi deri sekresyonları geleneksel olarak bazı yaraların ve hastalıkların tedavisinde

kullanılmaktadır. Türden türe farklılık gösteren biyolojik olarak aktif içerik özellikle

peptidler/proteinler, steroidler ve alkaloidler açısından oldukça zengindir. Bu nedenle amfibi

deri sekresyonlarının peptid/protein bazlı ilaç geliştirme çalışmalarının doğal kaynaklarından

biri olabileceği düşüncesi bu alandaki ilgili çalışmaların son zamanlarda artmasına neden

olmuştur.

Amfibi deri sekresyonları üzerine yapılan çalışmalar son yıllarda yurtdışında artış

göstermesine karşın Türkiye’de bu konu ile ilgili kapsamlı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu

projede, Burdur, Antalya ve Muğla illerinde dağılış gösteren Likya semenderleri ile İzmir ili de

dahil edilerek bulunan diğer bazı amfibi türlerinin deri sekresyonları ile çalışılmıştır. Bu

kapsamda detaylı iki arazi çalışması düzenlenmiş ve saha çalışmaları sırasında Likya

semenderlerine ait yeni bir endemik alttür (L. billae eikeae) ülkemiz amfibi faunasına

kazandırılmıştır. Ayrıca L. antalyana antalyana, L. a. gocmeni, L. flavimembris flavimembris

ve L. f. ilgazi alttürleri için yeni lokaliteler kaydedilmiştir. Bireysel farklılıkları standardize

etmek amacıyla aynı türün farklı bireylerinden çok küçük elektriksel uyarı verilerek toplanan

sekresyon örnekleri örnekleme havuzunda bir araya getirilmiş denemelerde kullanılmak

üzere liyofilize edilmiştir. Farklı türlerden alınan sekresyonlar için protein miktarı, SDS-PAGE

protein profili, antimikrobial aktivite ve normal ve kanserli hücre hatları üzerindeki sitotoksik

etkileri belirlenmiştir. Ayrıca, amfibi salgıları hemolitik etkilerinin varlığı açısından da

araştırılmıştır.

Sonuç olarak, taranan 19 farklı deri salgısı örneğinin tamamının az veya çok

biyoaktivite gösterdiği ortaya konmuştur. Projenin hedef grubu Likya semenderlerinden

özellikle L. l. luschani deri sekresyonu en yüksek sitotoksik etkiyi (A-549 ve MPanc-96

üzerinde) gösterirken, çalışılan diğer amfibi türlerinden Bufo bufo deri/parotoid sekresyonu

en yüksek sitotoksik etkiyi (çalışılan hücre hatlarının tamamında) göstermiştir. Çalışılan deri

sekresyonları arasından en yüksek antimikrobiyal aktiviteyi Pelophylax bedriagae deri

sekresyonu göstermiştir. Hemolitik aktivite sonuçlarına bakıldığında Likya semenderleri ve

Bufo bufo deri salgılarının hemolitik aktivitesinin olmadığı, diğer türlerin deri salgılarının ise

çok düşük hemolitik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Amfibi, deri sekresyonu, antimikrobiyal aktivite, sitotoksisite,

hemolitik aktivite, SDS-PAGE

IX

ABSTRACT

Amphibian skin secretions have traditionally been used in the treatment of some

wounds and diseases. Biologically active content that differs from species to species is quite

rich especially in terms of peptides / proteins, steroids and alkaloids. Therefore, the idea of

amphibian skin secretion as one of the natural sources of peptide/protein-based drug

development has recently been increased the relevant studies in this field.

Although studies carried out on amphibian skin secretions have increased in other

countries in recent years, there are no comprehensive studies on this subject conducted in

Turkey. Within the scope of this project, skin secretions of Lycia salamanders and some

other amphibian species distributed in the provinces of Burdur, Antalya, Mugla and Izmir

were studied. Therefore, two detailed fieldworks were arranged and during the fieldworks, a

new endemic subspecies (L. billae eikeae) belonging to the Lycian salamanders was

determined and added to Turkey’s amphibian fauna. In addition, new localities were

discovered and recorded for the subspecies L. antalyana antalyana, L. a. gocmeni, L.

flavimembris flavimembris and L. f. ilgazi. In order to standardize individual differences, the

secretion samples collected from various individuals of the same species via very mild

electrical stimulation were gathered in the sampling pool and lyophilized to use in the

experiments. The amount of protein (Bradford method), SDS - PAGE protein profile,

antimicrobial activity, on normal and cancer cell lines were determined for secretions

obtained from different species. In addition, amphibian secretions were investigated in terms

of the presence of hemolytic effects.

Consequently, all of the 19 different skin secretion samples showed a greater or lesser

bioactivity. Of the Lycian salamanders, the target group of the project, especially the skin

secretion of L. l. luschani showed the highest cytotoxic effect (over A-549 and MPanc-96)

whereas of the other amphibian species studied, the skin / parotoid secretion of Bufo bufo

showed the highest cytotoxic effect (in all the cell lines studied). Of the skin secretions

studied, the skin secretion of pelophylax bedriagae demonstrated the highest antimicrobial

activity. The hemolytic activity results revealed that while the skin secretions of Lycian

salamanders and Bufo bufo did not have hemolytic activity, skin secretions of the other

species had very low hemolytic effect.

Keywords: Amphibian, skin secretion, antimicrobial activity, cytotoxicity, hemolytic

activity, SDS-PAGE.