1

POLITECHNIKA ŚLĄSKA

Wydział Chemiczny

Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii

Iwona Wojciechowska-Witkowska

Opracowanie metod rozdzielczych do oznaczania

wybranych związków o właściwościach dezynfekujących

i konserwujących

AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ

Promotor pracy:

Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska

Gliwice 2014

2

SPIS TREŚCI AKRONIMY I SKRÓTY .......................................................................................................... 3

1. WPROWADZENIE ............................................................................................................ 4

2. PRZEGLĄD LITERATUROWY ......................................................................................... 5

3. CEL I ZAKRES PRACY .................................................................................................... 6

4. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ .................................................................................... 7

4.1. OPRACOWANIE UKŁADÓW CHROMATOGRAFICZNYCH DO ROZDZIELANIA MIESZANIN

BADANYCH ZWIĄZKÓW ........................................................................................................................ 7

4.2. PARAMETRY OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH ............................................ 9

4.3. WALIDACJA OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH ............................................ 11

4.4. PROCEDURY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO BADAŃ.................................................................... 15

4.5. APLIKACJA OPRACOWANYCH PROCEDUR ANALITYCZNYCH DO BADAŃ PRÓBEK

RZECZYWISTYCH ................................................................................................................................ 18

4.5.1. Badanie próbek wód środowiskowych .......................................................................................... 18

4.5.2. Badanie kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości .......................................................... 21

4.6. BADANIA STABILNOŚCI ANALITÓW ................................................................................................... 23

4.6.1. Stabilność metanolowych roztworów wzorcowych........................................................................ 23

4.6.2. Stabilność wzorców w wodzie rzecznej ........................................................................................ 23

4.6.3. Stabilność konserwantów w kosmetykach .................................................................................... 24

5. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ....................................................................................... 26

6. LITERATURA .................................................................................................................. 30

7. DOROBEK NAUKOWY .................................................................................................. 31

7.1. PUBLIKACJE ......................................................................................................................................... 31

7.2. ZJAZDY PTCHEM – SITPCHEM I SEMINARIA NAUKOWE ................................................................. 31

3

AKRONIMY I SKRÓTY

Akronim/ Skrót

Pełna nazwa w języku angielskim Pełna nazwa w języku polskim

2PP 2-Phenylphenol 2-Fenylofenol 4C3MPh 4-Chloro-3-methylphenol 4-Chloro-3-metylofenol

BA Benzyl Alcohol Alkohol benzylowy ChT Chloramine T Chloramina T CMI Chloromethylisothiazolinone Chlorometyloizotiazolinon GC Gas Chromatography Chromatografia gazowa HLB Hydrophile-Lipophile Balance Równowaga hydrofilowo-lipofilowa

HPLC High Performance Liquid Chromatography Wysokosprawna chromatografia cieczowa LOD Limit of Detection Granica wykrywalności LOQ Limit of Quantification Granica oznaczalności MDL Method Detection Limit Granica wykrywalności metody analitycznej MI Methylisothiazolinone Metyloizotiazolinon MP Methylparaben Metyloparaben

MQL Method Quantification Limit Granica oznaczalności metody analitycznej PS Potassium Sorbate Sorbinian potasu R Recovery Odzysk

RP Reversed Phase Odwrócony układ faz SB Sodium Benzoate Benzoesan sodu

SPE Solid Phase Extraction Ekstrakcja do fazy stałej TCC Triclocarban Triclocarban TCS Triclosan Triclosan

UAE Ultrasound Assisted Extraction Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika

wspomagana promieniowaniem ultradźwiękowym

UPLC/ UHPLC

Ultra Performance Liquid Chromatography/Ultra High Performance

Liquid Chromatography

Ultra sprawna chromatografia cieczowa/ Ultra wysokosprawna chromatografia cieczowa

4

1. WPROWADZENIE

W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania substancjami dezynfekującymi

i konserwującymi. Substancje te to związki wykazujące właściwości bakteriobójcze i bakteriostatyczne.

Stosowane są powszechnie jako dodatki zapobiegające rozwojowi bakterii, grzybów i pleśni w produktach

handlowych. Konserwanty i substancje dezynfekujące występują w takich produktach jak: farmaceutyki,

kosmetyki, środki higieny osobistej, wyroby przemysłu papierniczego i włókienniczego. Ponadto stosowane są

w działalności związanej z sektorem medycznym i weterynaryjnym, w przemyśle farb i lakierów, przy produkcji

żywic, klejów, w rymarstwie i kaletnictwie.

Zainteresowanie badaczy tematyką związków o właściwościach bakteriobójczych wynika z jednej strony

z coraz powszechniejszego ich stosowania, a z drugiej – z możliwościami wpływu tego typu substancji

na środowisko naturalne, w tym na organizmy żywe.

Na świecie coraz częściej podejmowane są badania dotyczące oznaczania substancji konserwujących

i dezynfekujących w różnych matrycach. Większość z tych badań wynika z uregulowań prawnych, które

nakładają na producentów różnorodnych produktów nakazy identyfikacji, oznaczeń ilościowych oraz badań

stabilności różnych składników w wytwarzanych produktach. Kontrola jakości farmaceutyków i kosmetyków,

a także artykułów spożywczych, jest najlepszym tego przykładem. Kontrola ta powinna dawać wiarygodne

wyniki, ze względu na bezpieczeństwo konsumentów. Możliwość szybkiej identyfikacji i oznaczeń ilościowych

poszczególnych składników jest istotnym elementem procesu produkcyjnego. Nie bez znaczenia (szczególnie

w analizach rutynowych) pozostaje również możliwość szybkiego i równoczesnego oznaczania wielu substancji

w czasie jednej analizy. Sposób i czas potrzebny na przygotowanie próbek stanowi także ważny element

procedury analitycznej.

Podejmowane są także badania związane z oceną akumulacji i wpływu różnorodnych substancji chemicznych

na organizmy żywe oraz z oznaczaniem stabilności i pozostałości tego typu zanieczyszczeń w środowisku

(m. in. w wodach, ściekach i osadach). Ich obecność w środowisku przyrodniczym stanowi bezpośrednio

potencjalne zagrożenie dla ekosystemów wodnych, a pośrednio także dla zdrowia ludzkiego. Obecność tego

typu zanieczyszczeń w środowisku zależna jest od wielu czynników, m. in.: wielkości produkcji, ilości zużycia

danych substancji, stopnia ich usunięcia w oczyszczalniach ścieków i stabilności. Jednorazowo do środowiska

nie są wprowadzane duże ilości substancji bakteriobójczych i bakteriostatycznych, jednak ze względu na

ciągłość tego procesu – może dojść do ich akumulacji. Dodatkowo w przypadku długoletniej, ciągłej akumulacji,

przy braku degradacji, negatywne oddziaływania mogą się kumulować i w przyszłości stanowić poważne

zagrożenie. Ilości substancji dezynfekujących i konserwujących oznaczane w wodach powierzchniowych są

niewielkie (od setnych części do kilkudziesięciu µg/L) i potencjalnie nie muszą zagrażać środowisku, jednak ich

różnorodność, stabilność i długotrwałe działanie – mogą powodować negatywne efekty. Trudno określić

toksyczność tych zanieczyszczeń, ponieważ dane na temat ich przewlekłego oddziaływania (na ludzi

i zwierzęta) nie są do końca poznane.

Na tle wymagań współczesnej chemii analitycznej, opracowanie metod do równoczesnego oznaczania

pozostałości substancji dezynfekujących i konserwujących w wodach powierzchniowych oraz konserwantów

w wyrobach przemysłu kosmetycznego, farmaceutycznego i chemii gospodarczej, jest tematyką wpisującą się

w aktualne obszary badań z zakresu chemii analitycznej. Opracowane metody mogłyby mieć zastosowanie

zarówno w zakładach przemysłowych (do kontroli jakości produktów w nich wytwarzanych) jak i do monitoringu

wód środowiskowych.

5

2. PRZEGLĄD LITERATUROWY

Wysokosprawna chromatografia cieczowa to technika analityczna zajmująca istotne miejsce

w oznaczaniu substancji dezynfekujących i konserwujących. Oznaczenia prezentowane w literaturze dotyczą

różnorodnych próbek: środowiskowych (wody, ścieki), produktów przemysłowych (kosmetyki, farmaceutyki)

jak i produktów spożywczych, czy próbek biologicznych. W prowadzonych oznaczeniach stosowano szereg

detektorów (m.in. detektor spektrofotometryczny, spektrometr mas), a próbki przygotowywano różnymi

technikami ekstrakcyjnymi. Zastosowanie takich sposobów izolacji analitów wynikało z bardzo zróżnicowanego

składu matrycy próbek.

Opisane metody analityczne wykorzystujące techniki chromatografii cieczowej [1–16] do oznaczania

związków wybranych do badań w niniejszej pracy, pozwalają na oznaczanie pojedynczych analitów lub

w mieszaninach z innymi substancjami m. in.: substancjami aktywnymi i nieaktywnymi farmaceutyków,

składnikami kosmetyków oraz środków higieny osobistej (innymi niż konserwanty) lub pestycydami.

Zaprezentowano również metody do równoczesnego oznaczania od dwóch do czterech konserwantów lub

substancji dezynfekujących będących przedmiotem pracy. Najczęściej równolegle oznaczano pary związków

(MP i SB, SB i PS, TCC i TCS) lub MP, TCC i TCS.

W większości z tych metod, oznaczenia prowadzone są w odwróconym układzie faz, z zastosowaniem kolumn

chromatograficznych z wypełnieniami: oktadecylosilanowym (C18), oktadecylosilanowym ze związanymi

resztkowymi grupami silanowymi (C18e), oktylosilanowym (C8), rzadko dodecylosilanowymi (C12). Stosowano

także kolumny z wypełnieniami modyfikowanymi grupami cyjanowymi, fenylowymi, diolowymi, amidowymi lub

kolumny z wypełnieniem polimerowym (np. polistyrenowym – ZirChrom-PS).

Fazy ruchome stosowane w elucji izokratycznej i gradientowej w tych oznaczeniach były bardzo zróżnicowane.

Wykorzystano rozpuszczalniki organiczne (metanol, acetonitryl, tetrahydrofuran, octan amonu) i roztwory soli

nieorganicznych (NaCl, Na3PO4, NaH2PO4, KH2PO4) lub roztwory kwasów (HNO3, H3PO4 i HClO4).

Powszechnie stosowano również dodatki kwasów organicznych: octowego, mrówkowego, trifluorooctowego,

oraz (znacznie rzadziej) dodatki amin np.: dietyloaminę, trietyloaminę, tributyloaminę czy inne odczynniki

przekształcające anality w pochodne. Jako fazy ruchome zastosowanie znalazły także roztwory buforowe

o różnym pH (bufor fosforanowy, boranowy, amonowy, octanowy, cytrynianowy).

Oznaczenia prowadzono z zastosowaniem różnych detektorów, głównie spektrofotometrycznych oraz

spektrometru mas, rzadziej z wykorzystaniem detektorów elektrochemicznych, fluorescencyjnych bądź innych.

Przedstawione w literaturze metody oznaczeń obejmują swoim zakresem różnorodne próbki. Są to próbki

środowiskowe m. in. ścieki (surowe, oczyszczone, ścieki szpitalne) oraz wody: powierzchniowe (z mórz, rzek

i jezior), podziemne (gruntowe), wodociągowe, do nawadniania oraz opadowe (np. uzyskane ze stopionego

śniegu). Badaniu poddawano także produkty przemysłowe (kosmetyki, środki higieny osobistej, leki, suplementy

diety).

Ze względu na różnorodność badanych próbek, sposoby ich przygotowania również są zróżnicowane. Poza

typowymi czynnościami związanymi z rozpuszczaniem, rozcieńczaniem, zamrażaniem, rozmrażaniem,

liofilizacją, wirowaniem, homogenizacją, filtracją, hydrolizą czy przekształcaniem w pochodne, stosuje się różne

metody do zatężenia analitów, usunięcia interferencji i oddzielenia analitów od pozostałych składników matrycy.

Zwykle w tych celach stosuje się techniki ekstrakcyjne, a bardzo często po ich zastosowaniu odparowuje się

dodatkowo ekstrahent i rozpuszcza suchą pozostałość w niewielkiej ilości rozpuszczalnika, by uzyskać jak

6

największe zatężenie badanych substancji. Zastosowanie odpowiedniej techniki ekstrakcyjnej zależy od postaci

i składu matrycowego badanej próbki. Stosowane są zarówno metody konwencjonalne (np. ekstrakcja

rozpuszczalnikiem, ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana promieniowaniem ultradźwiękowym, ekstrakcja

do fazy stałej, mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej), jak i mniej popularne (np. ekstrakcja za pomocą płynu

w stanie nadkrytycznym, ekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem sorbentu z nadrukiem molekularnym,

ekstrakcja z wykorzystaniem wirującego elementu ekstrakcyjnego, ekstrakcja za pomocą cieczy pod

zwiększonym ciśnieniem, mikroekstrakcja dyspersyjna w układzie ciecz-ciecz). W celu zatężenia próbek

stosowano także technikę chromatografii jonowej.

Technika chromatografii gazowej [17–21] była również stosowana w oznaczeniach badanych

w niniejszej pracy substancji dezynfekujących (za wyjątkiem ChT) oraz konserwujących (za wyjątkiem PS i SB).

Anality oznaczano w różnorodnych matrycach. GC wykorzystuje najczęściej konwersję chemiczną analitów za

pomocą odpowiednich odczynników, by umożliwić następnie ich analizę z odpowiednio wysoką czułością.

Detektorem stosowanym w tych oznaczeniach był spektrometr mas.

Spośród innych metod analitycznych stosowanych do oznaczania substancji dezynfekujących

i konserwujących wyróżnić można: metody spektrofotometryczne [22], chemiluminescencyjne [23],

elektrochemiczne (polarografia, woltamperometria) [24, 25], metody wykorzystujące techniki elektromigracyjne

(np. elektroforeza kapilarna, elektrochromatografia kapilarna, micelarna elektrokinetyczna chromatografia

kapilarna) [26–28]. Jest ich jednak relatywnie mniej w porównaniu do metod chromatograficznych.

W podsumowaniu przeglądu literaturowego należy zwrócić uwagę, że dotąd nie opisano metod do

równoczesnego oznaczania takiej grupy związków.

3. CEL I ZAKRES PRACY

Celem niniejszej pracy było opracowanie procedur analitycznych pozwalających na równoczesne

oznaczanie wybranych substancji bakteriobójczych i bakteriostatycznych, stosowanych jako substancje

dezynfekujące (4-chloro-3-metylofenol – 4C3MPh, chloramina T – ChT, 2-fenylofenol – 2PP, triclosan – TCS,

triclocarban – TCC) oraz konserwujące (alkohol benzylowy – BA, chlorometyloizotiazolinon – CMI,

metyloizotiazolinon – MI, metyloparaben – MP, benzoesan sodu – SB, sorbinian potasu – PS).

W ramach badań zaplanowano opracowanie układów chromatograficznych do rozdzielenia

i oznaczania mieszanin wybranych związków:

metoda do równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących (5 związków),

metoda do równoczesnego oznaczania substancji konserwujących (6 związków),

metoda do równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących i konserwujących (11 związków).

Celem badań było również opracowanie procedur przygotowania próbek do badań oraz aplikacja

opracowanych metod do oznaczania pozostałości badanych związków w wodach środowiskowych oraz do

oznaczania konserwantów w wyrobach przemysłu kosmetycznego i farmaceutycznego.

Zaplanowano również wyznaczenie stabilności długoterminowej 11 badanych związków

(konserwantów i substancji dezynfekujących) w wodach powierzchniowych oraz stabilności długoterminowej

substancji konserwujących (6 związków) w produktach kosmetycznych.

7

Do badań stosowano następujące techniki analityczne:

wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), z detekcją DAD,

ultra wysokosprawną chromatografię cieczową (UHPLC), z detekcją UV,

ekstrakcję do fazy stałej (SPE),

ekstrakcję rozpuszczalnikiem, wspomaganą promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE).

4. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ

4.1. OPRACOWANIE UKŁADÓW CHROMATOGRAFICZNYCH DO ROZDZIELANIA MIESZANIN

BADANYCH ZWIĄZKÓW

Chromatograficzne rozdzielenie i równoczesne oznaczenie wybranych grup związków, w niniejszej

rozprawie obejmowało następujące etapy prac:

dobór odpowiednich warunków rozdzielania mieszanin związków: tj. dobór fazy stacjonarnej, fazy

ruchomej, warunków elucji i innych warunków oznaczania (np. temperatury);

identyfikację oznaczanych substancji: wybór analitycznych dlugości fal dla poszczególnych

związków, rejestrację widm absorpcyjnych dla wzorców oznaczanych substancji w zakresie

promieniowania UV-Vis, zastosowanie metody dodatku wzorca do próbki (ekstraktu) i sprawdzenie

odpowiedzi układu (zwiększenia pola powierzchni pod pikiem na chromatogramie – wzrostu sygnału);

analizę ilościową analitów, którą wykonano w oparciu o wyznaczone krzywe kalibracyjne

i z uwzględnieniem odzysków analitów dla poszczególnych matryc.

Celem badań było opracowanie metod chromatograficznych do równoczesnego oznaczania substancji

dezynfekujących (5 związków: ChT, 4C3MPh, 2PP, TCS i TCC – Metoda I), substancji konserwujących

(6 związków: MI, CMI, BA, PS, SB, MP – Metoda II, Metoda IV) oraz metody pozwalającej na rozdzielenie

wszystkich 11 analitów (Metoda III). W badaniach zastosowano techniki rozdzielcze: HPLC (Metody I – III)

oraz UHPLC (Metoda IV).

Produkcja nowych i modyfikacja istniejących wypełnień kolumn chromatograficznych to jeden

z wiodących trendów w technikach chromatograficznych. Wysoka rozdzielczość kolumn, możliwość pracy

w szerokim zakresie pH eluentu oraz możliwość rozdzielania mieszanin związków o zróżnicowanych

właściwościach, to główne cechy jakimi powinny charakteryzować się nowe sorbenty. Obecnie w chromatografii

cieczowej stosuje się zwykle odwrócony układ faz, dla którego różnorodność dostępnych sorbentów jest duża.

W badaniach przetestowano kilka ich rodzajów.

Dla każdej z metod HPLC (Metoda I – III) przetestowano szereg kolumn chromatograficznych pochodzących od

różnych producentów, o różnych wymiarach i wypełnieniu (rodzaj złoża oraz sposób połączenia podstawników

z żelem krzemionkowym). Były to kolumny firmy Merck: LiChrosorb RP8 (250ᵡ4 mm, 7 µm), LiChrosorb RP18

(250ᵡ4 mm, 7 µm), LiChrosorb RP18 (125ᵡ4 mm, 7 µm), Chromolith Performance RP-18 (100ᵡ4,6 mm, -),

2x Chromolith Performance RP-18 (100ᵡ4,6 mm, -); firmy Dionex: Acclaim 120 C8 (150ᵡ4,6 mm, 3 µm), Acclaim

C18 PA II (150ᵡ2,6 mm, 3 µm); kolumna Wide Pore C18 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) firmy J.T. Baker oraz kolumna

Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) firmy Nomura Chemical.

Dla metod wykorzystujących technikę UHPLC (Metoda IV) przetestowano dwie kolumny: Chromolith®

FastGradient RP 18e (50ᵡ2 mm, -) firmy Merck oraz Hypersil GOLDTM

(50ᵡ2,1 mm, -) firmy Thermo Scientific.

8

Niektóre z wypełnień badanych kolumn, ze względu na obecność wolnych grup silanolowych mogą wykazywać

częściowo zdolność adsorpcyjną, co może powodować wystąpienie dodatkowych oddziaływań w trakcie

procesu rozdzielania chromatograficznego. W takim przypadku z pozoru analogiczne kolumny mogą

wykazywać zróżnicowane właściwości. Mechanizm procesu rozdzielania, mający miejsce w przypadku układu

RP-HPLC jest również inny niż dla procesu chromatograficznego przebiegającego w normalnym układzie faz.

W chromatografii podziałowej zachodzi zjawisko podziału (pomiędzy ciekłą fazę stacjonarną a fazę ruchomą,

zgodnie z prawem Nernsta), adsorpcja analitów na powierzchni fazy stacjonarnej oraz adsorpcja składników

fazy ruchomej na powierzchni sorbentu. Obserwować można wzajemne oddziaływania pomiędzy czynnikami:

faza stacjonarna – analit, faza ruchoma – analit oraz faza stacjonarna – faza ruchoma.

Oznaczane substancje są związkami organicznymi, o zróżnicowanej budowie i tym samym

zróżnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych. Te odmienne właściwości (np. kwasowość, lipofilowość)

mają wpływ na proces rozdzielenia chromatograficznego ich mieszanin. Wartości pKa oznaczanych związków

mieszczą się w granicach 4,2 – 15,4, a logP: 0,1 – 6,2.

W trakcie badań nad opracowaniem odpowiednich układów chromatograficznych przebadano także

różne składy fazy ruchomej, szybkość i rodzaj elucji (izokratyczny, gradientowy). Jako składniki fazy ruchomej

wykorzystano: wodę, metanol, acetonitryl, 0,05% wodny roztwór kwasu trifluorooctowego, 0,1% wodny roztwór

kwasu mrówkowego oraz ich mieszaniny. Analizy techniką HPLC prowadzono w temperaturze pokojowej

(20°C – 35°C), a techniką UHPLC w temperaturach: 12°C, 20°C i 25°C.

Dla badanych kolumn chromatograficznych i optymalnego (pod względem efektywności rozdzielenia i czasu

analizy) programu elucji (sposób elucji, natężenie przepływu, rodzaj rozpuszczalników) wyznaczono

następujące parametry chromatograficzne: czas retencji (tr), liczbę półek teoretycznych (N), współczynnik

retencji/współczynnik pojemnościowy (k’), asymetrię piku (As), zdolność rozdzielczą/rozdzielczość pików (Rs),

liczbę półek teoretycznych przypadającą na metr (N/m) oraz współczynnik selektywności/współczynnik

rozdzielenia (α).

Przy wyborze rodzaju kolumny kierowano się następującymi kryteriami – tr: minimalny (przy zachowaniu dobrej

powtarzalności analiz, dobrego rozdzielenia analitów i zachowaniu pożądanych wartości ocenianych

parametrów chromatograficznych); N > 4000; k’: 1 – 10; As: 0,95 – 1,5; Rs: > 1,7; N/m: > 20000; α > 1.

Dla Metody I parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: tr: 1,95 – 9,37 min;

N: 356 – 110363; k’: 0,17 – 7,28; As: 0,69 – 1,52; Rs: 0,60 – 33,01; N/m: 1423 – 528830; α: 0,98 – 7,02.

Dla Metody II parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: tr: 1,01 – 20,77 min;

N: 926 – 66372; k’: 0,21 – 17,32; As: 0,57 – 2,88; Rs: 0,74 – 15,41; N/m: 1452 – 139302; α: 0 – 6,19.

Dla Metody III parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn wynosiły: tr: 1,37 – 38,75 min;

N: 248 – 2567397; k’: 0,56 – 58,74; As: 0,56 – 2,86; Rs: 0 – 42,74; N/m: 1649 – 13354645; α: 0,01 – 6,80.

Dla Metody IV parametry chromatograficzne wyznaczone dla różnych kolumn chromatograficznych i trzech

testowanych temperatur (w jakich prowadzone były analizy) wynosiły: tr: 0,24 – 3,17 min; N: 108 – 71203;

k’: 0,53 – 20,37; As: 1,18 – 1,89; Rs: 1,36 – 11,81; N/m: 2841 – 221098; α: 1,06 – 6,19.

Poza porównaniem wybranych parametrów chromatograficznych, najważniejszym zadaniem jest

rozdzielenie mieszaniny wybranych związków. W prowadzonych badaniach trudne było rozdzielenie par

związków: TCS i TCC oraz PS i SB. Mimo różnic w budowach tych związków, wykazywały one w badanych

układach chromatograficznych zbliżone czasy retencji. W niektórych układach chromatograficznych były

praktycznie nierozdzielone.

9

4.2. PARAMETRY OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH

W Tabeli 1 przedstawiano warunki analiz chromatograficznych dla opracowanych czterech metod

pozwalających na rozdzielenie mieszanin wybranych związków. Przedstawione warunki analiz pozwalają na

uzyskanie satysfakcjonujących (a często także optymalnych) wartości dla rozpatrywanych (wymienionych

wcześniej) parametrów chromatograficznych.

10

Tabela 1. Warunki oznaczeń dla opracowanych metod chromatograficznych.

Metoda Technika Oznaczane

związki Kolumna

chromatograficzna Faza ruchoma Detekcja T [°C]

Objętość dozowanej

próbki [µL]

I HPLC

ChT, 4C3MPh,

2PP, TCS, TCC

Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30

(250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical)

sposób elucji t [min] MeOH [%] H2O [%] natężenie przepływu

[mL/min]

DAD Tp 20

gradientowy

0 57 43

0,9

2 90 10

3 100 0

6 100 0

10 57 43

II HPLC

MI, CMI, BA, PS, SB, MP

Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30

(250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical)

sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu

[mL/min]

DAD Tp 20

gradientowy

0 15 85

1,0

5 15 85

7 25 75

17 25 75

19 15 85

22 15 85

III HPLC

MI, CMI, BA, ChT, PS, SB,

MP, 4C3MPh, 2PP, TCS

TCC

Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30

(250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical)

sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu

[mL/min]

DAD Tp 20

gradientowy

0 5 95 0,6

7 5 95 0,6

15 20 80 0,9

30 20 80 1,2

33 5 95 1,2

42 5 95 1,2

IV UHPLC

MI, CMI, BA,

SB lub PS, MP

Chromolith® Fast Gradient RP 18e

(50ᵡ2 mm) (Merck)

sposób elucji t [min] ACN [%] 0,1% HCOOH [%] natężenie przepływu

[mL/min]

UV 12 2

gradientowy

0,0 5 95

0,7

0,3 5 95

1,0 20 80

2,0 20 80

3,0 5 95

Tp – temperatura pokojowa [°C]; ACN – acetonitryl, MeOH – metanol.

11

4.3. WALIDACJA OPRACOWANYCH METOD CHROMATOGRAFICZNYCH

Opracowane metody chromatograficzne poddano walidacji, która pozwala na ustalenie parametrów

charakteryzujących daną metodę analityczną, wskazuje jej ograniczenia oraz pozwala na sprawdzenie jej

przydatności do określonych celów. Jest to jeden z najważniejszych etapów opracowania metod analitycznych,

ponieważ parametry walidacyjne pokazują czy dana metoda i/lub procedura analityczna przebiegają w sposób

poprawny i czy wyniki są miarodajne.

Dla każdej z opracowanych w niniejszej pracy metod chromatograficznych wyznaczono: liniowość

(zakres liniowości), równanie i parametry krzywych kalibracyjnych, czułość, LOD (MDL), LOQ (MQL),

powtarzalność, precyzję pośrednią, poprawność (dokładność), odzysk, stabilność analitów,

selektywność/specyficzność. Wyznaczone parametry dotyczą analitów w roztworach metanolowych oraz

mieszanin wzorców w matrycy wody rzecznej. Parametry walidacyjne dla poszczególnych metod

chromatograficznych przedstawiono poniżej w Tabeli 2 i 3. Na Rysunkach 1 – 2 przedstawiono przykładowe

chromatogramy metanolowych roztworów wzorcowych zawierających mieszaniny odpowiednich związków.

Rysunek 1. Chromatogram mieszaniny wzorców

substancji dezynfekujących i konserwujących,

zarejestrowany przy długości fali światła: λ=274 nm

(0 – 22 min), λ=237 nm (22 – 33 min), λ=257 nm

(33 – 35 min) oraz λ=280 nm (35 – 40 min),

techniką RP-HPLC-DAD (Metoda III).

a) b)

Rysunek 2. Chromatogramy mieszanin wzorców substancji konserwujących o stężeniach: 18,33 µg/mL (MI),

25,00 µg/mL (CMI), 600,00 µg/mL (BA), 10,00 µg/mL (SB), 5,00 µg/mL (PS i MP), zarejestrowane techniką

RP-UHPLC-UV (Metoda IV) przy różnych długościach fal światła: kolor czarny λ=274 nm (0 – 1,0 min)

i λ= 237 nm (1,1 – 3,0 min) dla części (a) oraz λ= 257 nm (1,1 – 3,0 min) dla części (b); kolor zielony

λ=274 nm (0 – 1,0 min) i λ= 257 nm (1,1 – 3,0 min) dla części (a) oraz λ= 261 nm (1,1 – 3,0 min) dla części (b).

12

Tabela 2. Zestawienie wyznaczonych parametrów walidacyjnych opracowanych metod chromatograficznych (HPLC) dla substancji dezynfekujących.

Analit ChT 4C3MPh 2PP TCS TCC

Czasy retencji

tr [min] 4,4 – 27,0 6,8 – 35,9 7,1 – 36,4 8,2 – 37,8 9,4 – 38,8

SD [min] 0,1 – 0,9 0,1 – 0,3 0,1 – 0,2 0,2 – 0,3 0,2 – 0,5

Parametry krzywych

kalibracyjnych

zakres liniowości [µg/mL]

0,10 – 10,00 0,10 – 10,00 0,25 – 10,00 0,25 – 10,00 0,10 – 10,00

R2 0,9990 – 0,9999 0,9991 – 0,9993 0,9970 – 0,9990 0,9980 – 0,9996 0,9996 – 0,9999

Granice wykrywalności i oznaczalności

LOD [µg/mL] 0,018 – 0,077 0,061 – 0,43 0,036 – 0,48 0,052 – 0,57 0,023 – 0,30

LOQ [µg/mL] 0,053 – 0,23 0,18 – 1,3 0,11 – 1,5 0,16 – 1,7 0,070 – 0,89

MDL [µg/L] 0,077 – 0,60 0,074 – 1,4 0,15 – 1,6 0,24 – 1,9 0,071 – 1,0

MQL [µg/L] 0,23 – 1,8 0,22 – 4,7 0,46 – 4,8 0,72 – 5,7 0,21 – 3,0

Selektywność

α – 1,05 – 1,72 1,03 – 1,07 1,04 – 1,24 1,03 – 1,14

α* – 1,06 – 3,35 1,02 – 1,05 1,02 – 1,31 0,90 – 1,20

Precyzja

powtarzalność (CV [%])

1,0 – 5,2 1,2 – 6,2 1,3 – 4,8 0,54 – 5,1 0,68 – 4,9

poprawność (RE [%])

- 7,2 – 8,6 - 8,8 – 10 - 7,7 – 9,8 - 7,5 – 7,9 - 7,2 – 13

odzysk (R [%])

93 – 112 91 – 10 92 – 110 93 – 108 93 – 113

precyzja pośrednia (CV [%])

1,2 – 5,1 1,2 – 5,1 1,5 – 4,9 1,3 – 6,6 1,5 – 5,9

Stabilność krótko-

i długoterminowa

min. stabilność wzorców w MeOH (7 dni/12 miesięcy)

93 / 62 80 / 66 90 / 71 85 / 44 100 / 72

min. stabilność wzorców w H2O

(7 dni/24 miesiące)

13 / 11 90 / 37 99 / 24 92 / 43 94 / 65

α – współczynnik selektywności wyznaczony dla wzorców w roztworze metanolowym; α* – współczynnik selektywności wyznaczony dla matrycy wody rzecznej.

13

Tabela 3. Zestawienie wyznaczonych parametrów walidacyjnych opracowanych metod chromatograficznych (HPLC) dla substancji konserwujących.

Analit MI CMI BA PS SB MP

Czasy retencji

tr [min] 3,9 – 10,9 8,8 – 20,2 13,0 – 23,7 17,1 – 30,6 17,5 – 31,5 19,6 – 34,6

SD [min] 0,1 – 0,5 0,1 – 0,3 0,1 – 0,6 0,1 – 1,0 0,1 – 0,6 0,1 – 0,3

Parametry krzywych

kalibracyjnych

zakres liniowości [µg/mL]

1,83 – 18,33 1,00 – 25,00 10,00 – 500,00 0,50 – 15,00 0,75 – 10,00 0,50 – 10,00

R2 0,9982 – 0,9997 0,9978 – 0,9997 0,9983 – 0,9998 0,9986 – 0,9999 0,9981 – 0,9996 0,9969 – 0,9996

Granice wykrywalności i oznaczalności

LOD [µg/mL] 0,56 – 0,66 0,33 – 1,1 3,1 – 7,9 0,15 – 0,49 0,21 – 0,78 0,16 – 0,72

LOQ [µg/mL] 1,7 – 2,0 0,98 – 3,2 9,2 – 24 0,45 – 1,5 0,62 – 2,3 0,47 – 2,2

MDL [µg/L] 0,63 – 1,1 0,77 – 1,8 7,9 – 8,9 0,41 – 0,81 0,78 – 0,81 0,72 – 0,97

MQL [µg/L] 1,9 – 3,3 2,3 – 5,4 24 – 27 1,2 – 2,4 2,3 – 2,4 2,2 – 2,9

Selektywność

α – 2,57 – 4,53 1,24 – 1,52 1,17 – 1,38 0,89 – 1,01 1,15 – 1,34

α* – 2,66 – 4,63 1,14 – 1,67 1,20 – 1,40 0,92 – 1,03 1,13 – 1,27

Precyzja

powtarzalność (CV [%])

0,59 – 11 1,9 – 7,3 0,96 – 7,2 1,2 – 7,8 1,6 – 7,8 0,60 – 7,4

poprawność (RE [%])

- 6,0 – 4,4 - 8,0 – 5,5 - 4,4 – 7,8 - 5,9 – 7,7 - 7,0 – 9,1 - 5,0 – 5,5

odzysk (R [%])

94 – 104 92 – 106 96 – 108 94 – 108 93 – 109 95 – 105

precyzja pośrednia (CV [%])

1,2 – 7,2 1,8 – 9,6 2,6 – 8,0 1,1 – 7,5 1,3 – 8,4 1,1 – 8,3

Stabilność krótko-

i długoterminowa

min. stabilność wzorców w MeOH (7 dni/12 miesięcy)

100 / 98 95 / 81 97 / 82 99 / 85 65 / 48 100 / 81

min. stabilność wzorców w H2O

(7 dni/24 miesiące)

94 / 88 95 / 19 93 / 90 95 / 51 93 / 70 96 / 29

14

Metody I – III wykorzystują technikę HPLC i pozwalają na rozdzielenie mieszanin substancji

dezynfekujących lub/i konserwujących. Dedykowane są głównie do analiz pozostałości substancji

dezynfekujących i konserwantów w wodach środowiskowych. Metoda II zastosowana została także do

wykrywania i oznaczania konserwantów w kosmetykach i farmaceutykach.

Najbardziej uniwersalną metodą jest Metoda III pozwalająca na równoczesne oznaczanie wszystkich

11 wybranych analitów. Metoda I lub II mogą być jednak równie przydatne w przypadku konieczności

oznaczania tylko substancji dezynfekujących lub tylko substancji konserwujących. Ich zastosowanie pozwoli na

znaczne skrócenie czasu potrzebnego na wykonanie badań oraz obniży koszty (szczególnie rozpuszczalników

stosowanych jako fazy ruchome).

Metoda IV wykorzystuje technikę UHPLC i pozwala na rozdzielenie mieszanin konserwantów: MI, CMI,

BA, SB, MP lub MI, CMI, BA, PS, MP. Metoda ta została zastosowana do badań próbek kosmetyków,

farmaceutyków i środków czystości na zawartość poszczególnych konserwantów. Wykorzystanie techniki

ultrasprawnej chromatografii cieczowej pozwala na przyspieszenie prowadzonych analiz oraz na zmniejszenie

kosztów, związanych ze stosowanymi rozpuszczalnikami o wysokiej czystości.

Dla Metody IV (UHPLC) czasy retencji mieszczą się w granicach 0,29 – 2,54 min, ich odchylenia standardowe

wynoszą 0,001 – 0,02 min. Zakresy liniowości krzywych kalibracyjnych wynoszą: 0,25 – 100,00 µg/mL,

a ich współczynniki korelacji 0,9989 – 0,9999.

Wartości LOD i LOQ wynoszą: 0,058 – 4,4 µg/mL oraz 0,17 – 13 µg/mL. Współczynniki selektywności (α, α*)

wynoszą od 1,09 do 5,47. Powtarzalność i precyzja pośrednia (wyrażone przez CV) mieszczą się w granicach:

0,73% – 5,4% oraz 0,31% – 6,0%. Błędy względne wynoszą - 9,4% – 9,6%, a odzyski: 91% – 109%.

Parametry wyznaczonych krzywych wzorcowych oraz parametry walidacyjne opracowanych metod

chromatograficznych (Metody HPLC: I – III) przedstawiono w Tabelach 2 – 3 oraz w sposób opisowy poniżej.

Parametry dla Metody IV (UHPLC) przedstawiono w sposób opisowy powyżej.

Wysokie wartości współczynnika korelacji (0,9970 – 0,9999) potwierdzają liniowość wyznaczonych krzywych

kalibracyjnych w badanych zakresach stężeń oraz ścisłą zależność pomiędzy zmiennymi.

Wysokie wartości współczynników kierunkowych wyznaczonych krzywych kalibracyjnych (0,07·105 –

– 59,46·105) świadczą o dobrej czułości opracowanych metod.

LOD i LOQ obliczone dla metod chromatograficznych (Metody HPLC I – III) wynoszą odpowiednio: 0,018 – 7,9

i 0,053 – 24 µg/mL. Uwzglęniając procedurę SPE, wartości obliczonych MDL i MQL wynoszą odpowiednio:

0,071 – 7,9 i 0,21 – 24 µg/L.

Miarą precyzji i powtarzalności jest odchylenie standardowe (SD), względne odchylenie standardowe (RSD) lub

współczynnik zmienności (CV). Wielkością najwygodniejszą w ocenie jest CV, dla którego kryterium akceptacji

wynosi od 3% (składniki główne) nawet do 20% (anality na poziomie śladowym); kryteria te są zróżnicowane

w zależności od źródeł literaturowych (3 – 15%, 5 – 20%). Na ich wartość wpływ ma specyfika prowadzonych

oznaczeń (zastosowane techniki/metody, różnorodność składu matrycowego próbek). W niniejszej pracy

przyjęto (zgodnie z wytycznymi dotyczącymi walidacji metod analitycznych), że średnia wartość precyzji

powinna wynosić maksymalnie ±15% w stosunku do wartości rzeczywistej dla wysokiego i średniego poziomu

stężeń analitów w próbce, oraz maksymalnie ±20% dla najniższego z badanych poziomów stężeń.

15

W ramach walidacji metody wyznaczono powtarzalność i precyzję pośrednią. Wartości obliczonych CV są

mniejsze niż 6,0% dla roztworów wzorcowych oraz mniejsze niż 11% dla matrycy wody, co potwierdza

powtarzalność i dobrą precyzję opracowanych metod.

Poprawność (dokładność) metody wyznaczono na podstawie obliczonych błędów względnych, których wartości

maksymalne wynoszą odpowiednio -9,4% oraz 13% dla wzorców rozpuszczonych w metanolu oraz wzorców

dodanych do matrycy wody.

Odzysk jest ilościowym wyrazem obciążenia metody, pozwala na wykrycie i eliminację pewnych błędów

systematycznych występujących w trakcie wykonywanych pomiarów. Dla opracowanych metod odzyski

wynoszą 91 – 109% dla roztworów metanolowych oraz 93 – 113% dla matrycy wody środowiskowej.

Ich wartości są akceptowalne.

Stabilność roztworów wzorcowych w metanolu wynosi > 80% (krótkoterminowa: po 7 dniach; za wyjątkiem

stabilności SB równej 65%) i > 44% (długoterminowa: po 12 miesiącach).

Stabilność krótko- i długoterminowa (7 dni i 24 miesiące) wzorców w próbkach wody powierzchniowej wynosi

odpowiednio > 90% oraz > 19%. Nie uwzględniono tu stabilności ChT, gdyż według danych literaturowych

związek ten w wodzie ulega szybkiej biodegradacji (do 10% w ciągu 28 dni), co potwierdziły przeprowadzone

badania.

Stabilność konserwantów w produktach handlowych wyznaczono dla czterech podstawowych matryc

kosmetyków. W zależności od matrycy i sposobu przechowywania próbki, stabilność analitów była różna,

zaobserwowano spadek zawartości nawet do 0% w stosunku do ilości wprowadzonego wzorca (CMI, BA).

Opracowane metody są selektywne, wyznaczone współczynniki selektywności wynoszą ponad 0,89 dla

wzorców rozpuszczonych w MeOH i ponad 0,91 dla wzorców w matrycy próbki.

Prezentowane chromatogramy pokazują, że rozdzielenie analizowanych mieszanin związków jest

dobre, a piki są symetryczne. W przypadku pojawiania się pewnych zakłóceń (podwyższenie linii bazowej,

dodatkowe piki na chromatogramie) nie mają one wpływu na analizę jakościową i ilościową.

W ramach badań przeprowadzono także analizy, mające na celu weryfikację selektywności

opracowanych metod i procedur w stosunku do danej grupy związków. I tak według Procedury I (SPE) i Metody

I (RP-HPLC-DAD) – dedykowanej do analiz substancji dezynfekujących – przeprowadzono ekstrakcję

substancji konserwujących, a następnie analizę chromatograficzną otrzymanego ekstraktu. Podobnie dla

Procedury II i Metody II – dedykowanej do analizy konserwantów – przeprowadzono ekstrakcję i analizę

substancji dezynfekujących. Otrzymane wyniki potwierdziły selektywność opracowanych metod, bowiem nie

następowała koelucja tych związków.

4.4. PROCEDURY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO BADAŃ

Procedury analityczne, zastosowane do przygotowania próbek do badań wykorzystują technikę

ekstrakcji do fazy stałej (SPE) do przygotowania próbek wód powierzchniowych, pozwalającą na zatężenie

analitów (zarówno substancji konserwujących jak i dezynfekujących) oraz technikę ekstrakcji rozpuszczalnikiem

wspomaganej promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE) do wydzielania konserwantów z próbek kosmetyków,

farmaceutyków i środków czystości.

16

Opis postępowania przy przygotowaniu próbek wód środowiskowych oraz odzyski dla oznaczanych

związków (wyznaczone w matrycy wody rzecznej przy zawartości analitów na niskim poziomie stężeń)

przedstawiono w Tabeli 4. Opracowane warunki SPE są warunkami optymalnymi, pozwalającymi na uzyskanie

zadowalających odzysków analitów.

W ramach przeprowadzonych badań nad izolacją analitów techniką SPE, wyznaczono odzyski poszczególnych

analitów w różnych matrycach wód (woda destylowana, wodociągowa i rzeczna) i dla różnych poziomów

dodatków analitów (95%, 50% i 5% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych).

W przypadku Procedury I (SPE – Bakerbond Speedisk Octadecyl) uzyskano odzyski rzędu: 12,8 – 15,4%

(dla ChT), 77,6 – 89,8% (dla 4C3MPh), 91,2 – 99,3% (dla 2PP), 77,7 – 89,6% (dla TCS) oraz 99,3 – 106,4%

(dla TCC).

Dla Procedury II (Oasis HLB) uzyskano odzyski rzędu 65,4 -89,7% (dla MI), 102,7 – 103,2% (dla CMI),

77,2 – 82,4% (dla BA), 101,5 – 105,6% (dla PS), 72,3 – 86,6% (dla SB) i 73,6 – 82,3% (dla MP).

Natomiast dla Procedury III (Bond Elut PPL) odzyski analitów przyjmują następujące wartości: 71,9 – 85,4%

(dla MI), 93,6 – 101,5% (dla CMI), 98,0 – 98,7% (dla BA), 13,5 – 14,6% (dla ChT), 96,4 – 101,9% (dla PS),

88,5 – 98,4% (dla SB), 93,8 – 102,5% (dla MP), 89,5 – 92,9% (dla 4C3MPh), 90,8 – 97,6% (dla 2PP),

65,8 – 73,5% (dla TCS) oraz 62,1 – 65,4% (dla TCC).

Jak wynika z przedstawionych wartości – minimalny odzysk wynosi 65,4% a maksymalny 106,4%,

co potwierdza ilościowe wydzielenie analitów z próbek wód. Wyjątek stanowi ChT dla której odzysk rzędu

kilkunastu % spowodowane są brakiem jej stabilności w wodzie (na co wskazuje nawet karta charakterystyki tej

substancji). Różnice w odzyskach dla danego analitu (ale w różnych matrycach wód i dla różnych poziomów

dodatków wzorca) wynikać mogą z wpływów matrycowych i stopnia zanieczyszczenia wód.

Opis postępowania przy przygotowaniu próbek kosmetyków przedstawiono poniżej.

Preparaty ciekłe oraz klarowne analizowano bezpośrednio lub, jeśli było to konieczne, po odpowiednim

rozcieńczeniu wodą destylowaną.

Anality z preparatów stałych oraz półpłynnych ekstrahowano za pomocą metanolu. Ekstrakcję wspomagano

promieniowaniem ultradźwiękowym (UAE). W celu ekstrakcji odważano ok. 1 g próbki (pasty do zębów, kremu,

żelu itp.), dodawano 6 mL metanolu, poddawano działaniu promieniowania ultradźwiękowego w łaźni

ultradźwiękowej przez 15 minut, przeniesiono ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10,0 mL i uzupełniono

metanolem do kreski. Następnie roztwory przesączono przez filtr nylonowy o średnicy porów 0,20 µm,

a otrzymane przesącze poddawano analizie chromatograficznej (jeżeli było to konieczne – przefiltrowane

ekstrakty rozcieńczano).

W przypadku ekstrakcji konserwantów z kosmetyków za pomocą rozpuszczalnika (metanolu), wspomaganej

promieniowaniem ultradźwiękowym, wyznaczono również odzyski dla trzech matryc produktów kosmetycznych

(pasta, krem, żel), a w każdej z nich dla trzech poziomów dodatków analitów (95%, 50% i 5% z zakresów

liniowości wyznaczonych krzywych kalibracyjnych). Uzyskano odzyski rzędu 77,3 – 100,8% (dla MI),

62,7 – 95,5% (dla CMI), 46,1 – 118,7% (dla BA), 74,3 – 105,9% (dla PS), 56,3 – 93,3% (dla SB) oraz

76,0 – 111,1% (dla MP). Uzyskane wyniki są powtarzalne. Rozbieżności w odzyskach dla jednego związku

wynikają niewątpliwie z silnych wpływów matrycowych, bowiem skład jakościowy poszczególnych kategorii

produktów kosmetycznych jest zróżnicowany.

17

Tabela 4. Procedury przygotowania próbek wód do analiz chromatograficznych na zawartość pozostałości substancji dezynfekujących lub/i konserwujących.

Proce-dura SPE

Oznaczane związki (metoda chromato-

graficzna)

Kolumienka ekstrakcyjna

Próbka/ przygotowanie

SPE Zatężenie

próbki Analit

R* [%]

SD [%]

CV [%]

I substancje

dezynfekujące (Metoda I)

Bakerbond Speedisk

Octadecyl C18 (50 mm)

woda powierzchniowa:

sączenie

kondycjonowanie: MeOH, 10 mL; H2Odest

zakwaszona do pH 5 (2 M H2SO4), 10 mL; 2 mL/min próbka: 3 L; 10-15 mL/min

suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: MeOH, 10 mL; 1 mL/min

300-krotne

ChT 13,0 0,2 1,4

4C3MPh 77,6 6,1 7,9

2PP 91,2 2,2 2,4

TCS 77,7 1,9 2,4

TCC 101,9 3,4 3,3

II substancje

konserwujące (Metoda II)

Oasis HLB (500 mg,

6 mL)

woda powierzchniowa:

sączenie, zakwaszenie do pH 2

(2 M H2SO4)

kondycjonowanie: MeOH, 5 mL; H2Odest

zakwaszona do pH 2 (2 M H2SO4), 5 mL; 1 mL/min próbka: 3 L; 5-10 mL/min

suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: mieszanina ACN:0,1% HCOOH

(25:75; v/v), 2,5 mL; ACN, 2,5 mL; 1 mL/min

600-krotne

MI 65,4 2,0 3,0

CMI 103,2 4,6 4,5

BA 77,2 5,6 7,2

PS 105,6 7,6 7,2

SB 72,3 3,0 4,1

MP 73,6 4,5 6,2

III

substancje dezynfekujące i konserwujące

(Metoda III)

BOND ELUT PPL

(500 mg, 6 mL)

woda powierzchniowa:

sączenie, zakwaszenie do pH 2

(2 M H2SO4)

kondycjonowanie: MeOH, 5 mL; H2Odest

zakwaszona do pH 2 (2 M H2SO4), 5 mL; 1 mL/min próbka: 5 L; 10 mL/min

suszenie złoża: próżnia, 2 min elucja: ACN, 5 mL; 1 mL/min

1000-krotne

MI 71,9 2,3 3,2

CMI 94,5 3,4 3,6

BA 98,0 4,7 4,8

ChT 13,6 0,7 5,4

PS 96,4 4,1 4,2

SB 80,4 2,4 3,0

MP 93,8 2,7 2,8

4C3MPh 89,6 3,5 4,0

2PP 90,8 3,7 4,1

TCS 65,8 3,7 5,6

TCC 62,1 3,2 5,2

R* – prezentowane w Tabeli 18 odzyski, ich odchylenia standardowe (SD) i współczynniki zmienności (CV) dotyczą odzysków wyznaczonych dla próbek wody rzecznej z dodatkiem wzorców na niskim poziomie stężeń (ok. 5% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych).

18

4.5. APLIKACJA OPRACOWANYCH PROCEDUR ANALITYCZNYCH DO BADAŃ PRÓBEK

RZECZYWISTYCH

Po opracowaniu procedur wydzielania i oznaczania badanych związków przeprowadzono ich aplikację do

próbek rzeczywistych.

Identyfikacji oznaczanych analitów w próbkach rzeczywistych dokonano na podstawie porównania ich

czasów retencji z czasami retencji wzorców, porównania ich widm absorpcyjnych, a także metodą dodatku

wzorca do ekstraktu uzyskanego po SPE lub UAE i sprawdzeniu odpowiedzi układu (wzrostu sygnału).

Prezentowane wartości są wynikami końcowymi analiz – uwzględniają odzyski dla zastosowanych

procedur SPE i UAE.

4.5.1. Badanie próbek wód środowiskowych

Wyniki badań próbek wód powierzchniowych przedstawiono w Tabeli 5, dla każdego z opracowanych

układów chromatograficznych i odpowiadającej mu procedury SPE.

Na Rysunkach 3 – 5 przedstawiono przykładowe chromatogramy zarejestrowane dla badanych próbek

wód.

Rysunek 3. Chromatogram ekstraktu z wody

rzecznej (rzeka Wisła, Skoczów) uzyskany po

procedurze SPE, zarejestrowany przy długości fali

światła λ=227 nm (0 – 5 min) oraz λ=280 nm

(5 – 10 min), techniką RP-HPLC-DAD (Metoda I).

Rysunek 4. Chromatogram ekstraktu ze ścieków

oczyszczonych (Polska południowa) po procedurze

SPE, zarejestrowany przy długości fali światła

λ=245 nm, techniką RP-HPLC-DAD (Metoda I).

19

a) b)

Rysunek 5. (a) Chromatogram ekstraktu z wody rzecznej (rzeka Biała, Czechowice-Dziedzice) po procedurze

SPE, zarejestrowane przy długości fali światła λ=280 nm (0 – 24 min), λ=227 nm (24 – 30 min), λ=237 nm

(30 – 33 min), λ=280 nm (33 – 40 min), techniką RP-HPLC-DAD (Metoda III); (b) powiększenie części

zaznaczonej na chromatogramie (a).

20

Tabela 5. Wyniki badań próbek wód powierzchniowych.

Meto

da

HP

LC

Pro

ced

ura

SP

E

Próbka (pochodzenie)

Stężenie analitów [µg/L] (CV, [%])

substancje dezynfekujące substancje konserwujące

ChT 4C3MPh 2PP TCS TCC MI CMI BA PS SB MP

I I

rzeka Bierawka (Czerwionka) – – – 7,9 (3,1) –

nie oznaczano

rzeka Krzywa (Bielsko-Biała) – – – 30,4 (5,0) –

rzeka Warta (Zawiercie) – – – – 5,1 (6,4)

rzeka Wisła (Skoczów) – – – 17,9 (5,1) –

ścieki (Polska płd.) – – 5,1 (2,8) – –

II II

rzeka Bytomka (Zabrze)

nie oznaczano

– 11,6 (5,3) 35,1 (5,5) – 3,0 (6,5) –

rzeka Drama (Dzierżno) – – – – 3,1 (6,4) –

rzeka Drama (Kamieniec) – – – – 2,7 (3,4) –

rzeka Jesionka (Jaworze) – – – – 2,6 (4,8) –

rzeka Kłodnica (Gliwice) – 7,9 (4,0) – – 3,1 (5,7) –

rzeka Krzywa (Bielsko-Biała) – – – – 2,7 (4,9) –

Jezioro Dzierżno Duże (Dzierżno) – 5,7 (5,0) – – – –

III III

rzeka Biała (Czechowice-Dziedzice)

2,1 (3,1) 12,6 (2,1) 4,9 (0,7) 8,2 (7,0) 3,6 (1,7) – – – – 6,8 (1,8) –

rzeka Bierawka (Nieborowice) 2,3 (3,3) 5,4 (5,6) – 2,1 (4,3) 1,5 (3,6) – – – – 2,6 (3,9) –

rzeka Bytomka (Zabrze) 5,0 (6,6) – – 0,9 (9,9) 0,3 (6,0) – 10,3 (7,3) 36,1 (4,5) – – – rzeka Drama (Dzierżno) – – – 0,5 (8,3) – – – – – – –

rzeka Drama (Kamieniec) – – – 4,8 (3,5) 2,2 (2,7) – – – – – – rzeka Gostynia (Bieruń) 3,6 (0,7) 5,4 (2,1) 2,7 (6,2) – 3,7 (3,1) – – – – 2,5 (2,6) – rzeka Kłodnica (Gliwice) 5,2 (4,5) – – – – – 9,0 (4,1) – – 2,3 (5,8) –

rzeka Mała Panew (Krupski Młyn) – 5,6 (3,3) – 6,5 (7,3) 1,5 (3,3) – – – – – – rzeka Nacyna (Rybnik) – – – – – – – 74,4 (2,5) – – –

rzeka Potok Chudowski (Borowa Wieś/Bujaków)

2,8 (3,3) – 3,0 (7,6) – – – 7,8 (3,2) – – – –

rzeka Potok Dokawa (Jankowice) – – – 4,8 (3,5) 2,2 (2,7) – – – – – – rzeka Pszczynka (Pszczyna) – – – 41,3 (1,6) – – – – – – –

rzeka Ruda (Rybnik) 3,9 (3,4) – – 5,2 (8,8) 3,1 (5,5) – – – – – – rzeka Warta (Zawiercie) – – – 1,6 (3,5) 3,1 (3,7) – – – – – –

Jezioro Dzierżno Duże (Dzierżno) – – – – 0,8 (3,6) – – – – – – Jezioro Dzierżno Małe (Dzierżno) – – – 1,1 (5,7) 0,5 (6,5) – – – – – –

Jezioro Goczałkowickie Goczałkowice Zdrój)

– – 2,5 (0,4) – – – – – – – –

Jezioro Pławniowice (Pławniowice)

– – – 0,9 (8,9) 0,8 (6,7) – – – – – –

Jezioro Rybnickie (Rybnik) – – – 64,2 (2,9) – – – – – – – Jezioro Żywieckie (Zarzecze) – – – 1,3 (4,2) 0,6 (5,6) – – – – – –

21

Oznaczanie pozostałości substancji dezynfekujących przeprowadzono dla 8 próbek wód

powierzchniowych i 1 próbki ścieków oczyszczonych; substancji konserwujących dla 12 próbek wód;

oraz wszystkich analitów (obu grup związków) w 20 próbkach wód. W sumie przebadano 40 próbek wód

(głównie z rzek i jezior) na obecność pozostałości substancji dezynfekujących lub/i konserwujących.

W 30 próbkach zidentyfikowano oznaczane związki. W 10 próbkach nie oznaczono żadnego z analitów.

W próbkach wód oznaczono następujące anality: CMI (5,7 – 11,6 µg/L), BA (35,1 – 74,4 µg/L),

ChT (2,1 – 5,2 µg/L), SB (2,3 – 6,8 µg/L), 4C3MPh (5,4 – 12,6 µg/L), 2PP (3,0 – 5,2 µg/L),

TCS (0,5 – 64,2 µg/L) i TCC (0,3 – 5,1 µg/L). MI, PS i MP to trzy związki (spośród 11 oznaczanych), których nie

oznaczono w żadnej z badanych próbek.

Badania te pokazują, że problem zanieczyszczenia wód środowiskowych pozostałościami substancji

dezynfekujących i konserwujących występuje również w Polsce. Problem zanieczyszczenia środowiska różnymi

ksenobiotykami, ich oznaczanie i monitoring – to tematyka realizowana przez liczne grupy badaczy.

Opracowane w rozprawie metody równoczesnego oznaczania substancji dezynfekujących i konserwujących

stanowić mogą dodatkowe narzędzie do realizacji tych zadań.

4.5.2. Badanie kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości

Badaniom na obecność i zawartość substancji konserwujących poddano także produkty handlowe:

kosmetyki, środki higieny osobistej, farmaceutyki i środki czystości. Badane próbki różniły się między sobą

składem i postacią fizyczną. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 6.

Tabela 6. Wyniki badań kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości na zawartość konserwantów.

Kategoria produktów

Matryca * Stężenie/zawartość [µg/mL lub** µg/g]

MI CMI BA PS SB MP

Kosmetyki

ciekła min 0,8 1,4 54,8 786,0 529,4 0,5

max 2,4 4,0 2633,1 1021,3 4541,3 2298,2

półpłynna min 0,3 1,6 84,6 0,5 7,3 0,9

max 36,6 79,3 9371,2 1242,4 10500,4 3274,3

stała min 0,8 1,6 172,7 5,7 23,8 0,5

max 78,7 1,7 21387,3 2159,1 7213,2 8375,4

Farmaceutyki

ciekła min 0,4 1,2 23,4 – 2,7 2,1

max 46,8 4,9 167,4 – 20,1 10,0

półpłynna min 0,3 1,5 – – – –

max 4,6 6,6 – – – –

Środki czystości

ciekła min – – 5637,4

769,1 – 389,1

max – – 25307,2 – 1103,1

półpłynna min – – – 218,1 259,1 713,7

max – – – 1553,2 8512,1 1546,2

stała min – –

61,9 –

341,4 15,7

max – – – 1541,3 * stężenia i zawartości podano w przedziałach: od najniższej oznaczonej wartości (min) do najwyższej (max); ** dla matrycy o postaci płynnej wynik podano jako stężenie wyrażone w [µg/mL], dla matryc o postaci półpłynnej i stałej wynik podano jako zawartość wyrażoną w [µg/g].

Oznaczanie konserwantów w produktach handlowych przeprowadzono dla 275 próbek (222 próbek

kosmetyków i środków higieny osobistej, 31 próbek farmaceutyków i 22 próbek środków czystości). Zawartości

poszczególnych konserwantów w badanych produktach są zróżnicowane i zależą od postaci fizycznej produktu.

22

Badania te miały na celu weryfikację opracowanej metody do zastosowań w produktach o zróżnicowanym

składzie i postaci fizycznej. Pozwoliły również na porównanie otrzymanych zawartości do ilości dopuszczalnych

przez odpowiednie przepisy. W żadnej z badanych próbek nie oznaczono większej ilości konserwantu niż jest to

dozwolone.

Opracowana metoda szybkiego, równoczesnego oznaczania substancji konserwujących może być przydatna

w rutynowych analizach prowadzonych w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym w celu kontroli

wytwarzanych produktów.

Rysunek 6 przedstawia chromatogramy zarejestrowane dla próbek, w których oznaczanie substancji

konserwujących wykonano Metodą II (RP-HPLC-DAD).

a) b)

Rysunek 6. Chromatogramy próbek kosmetyków zarejestrowane techniką RP-HPLC-DAD (Metoda II),

przy długości fali światła λ=237 nm (0 – 19 min) oraz λ=257 nm (19 – 22 min): (a) próbka toniku, (b) ekstrakt

z próbki kremu po procedurze ekstrakcji techniką UAE.

Rysunek 7 przedstawia chromatogramy zarejestrowane dla próbek, w których oznaczanie substancji

konserwujących wykonano Metodą IV (RP-UHPLC-UV).

a) b)

Rysunek 7. Chromatogramy zarejestrowane techniką RP-UHPLC-UV (Metoda IV), przy długości fali światła:

λ=274 nm (0 – 1,0 min) i λ=257 nm (1,1 – 3,0 min) dla próbki toniku (a) oraz dla ekstraktu uzyskanego z syropu

po procedurze UAE (b).

23

4.6. BADANIA STABILNOŚCI ANALITÓW

4.6.1. Stabilność metanolowych roztworów wzorcowych

Stabilność krótko- i długoterminową wyznaczono dla metanolowych roztworów wzorcowych mieszanin

analitów odpowiednio po 7 dniach i przez 12 kolejnych miesięcy. Badano próbki zawierające oznaczane związki

na trzech poziomach stężeń i dla różnych warunków przechowywania roztworów (lodówka: T=4°C, temperatura

pokojowa: Tp: 20°C – 35°C z dostępem światła i bez dostępu światła).

Maksymalne ubytki analitów przy określeniu stabilności krótkoterminowej (7 dni) wynoszą: 8% dla ChT,

20% dla 4C3MPh, 10% dla 2PP, 15% dla TCS, 2% dla TCC, 0,5% dla MI, 5% dla CMI, 3% dla BA, 1% dla PS,

35% dla SB oraz 0,1% dla MP.

Stabilność krótkoterminowa (badana po 7 dniach) większości oznaczanych analitów wynosi więc ponad 80%

(ubytki maksymalne rzędu 20%). Wyjątek stanowi SB, dla którego stabilność jest zależna od sposobu

przechowywania próbki i poziomu zawartości analitu w mieszaninie wzorców i wynosi 65 – 100% (ubytki rzędu

0 – 35%).

Maksymalne ubytki analitów przy określeniu stabilności długoterminowej (12 miesięcy) wynoszą: 38%

dla ChT, 41% dla 4C3MPh, 29% dla 2PP, 56% dla TCS, 29% dla TCC, 2% dla MI, 19% dla CMI, 18% dla BA,

15% dla PS, 52% dla SB oraz 19% dla MP.

Wyniki badań stabilności długoterminowej, uzyskane po 12 miesiącach pokazują spadek zawartości analitów,

w zależności od rodzaju związku i sposobu przechowywania próbki.

Z otrzymanych danych wynika, że w przypadku przechowywania roztworów w temperaturze pokojowej

(Tp: 20°C – 35°C) z dostępem światła ich stabilność jest w większości przypadków najmniejsza, większą

stabilność wykazują przy braku dostępu światła i największą w przypadku przechowywania w lodówce (T=4°C).

Maksymalny odnotowany ubytek po 12 miesiącach wynosi 56% i dotyczy TCS. Najbardziej stabilnym

konserwantem jest MI, dla którego ubytki są niewielkie – rzędu kilku procent (zawartość po 12 miesiącach min.

98% biorąc pod uwagę wszystkie poziomy stężeń i sposoby przechowywania roztworów).

4.6.2. Stabilność wzorców w wodzie rzecznej

W ramach przeprowadzonych badań wyznaczono także stabilność oznaczanych związków w wodzie

w długim okresie czasu (24 miesiące). W celu przeprowadzenia badań stabilności analitów do próbki wody

rzecznej (nie zawierającej oznaczanych związków) dodano wzorce. Badane próbki zawierały anality na dwóch

poziomach stężeń – odpowiadających ok. 90 i 10% zakresów roboczych krzywych kalibracyjnych. Badania te

przeprowadzono dla różnych warunków otoczenia – część próbek przechowywano w lodówce (T=4°C), drugą

część przechowywano w temperaturze pokojowej (Tp: 20°C – 35°C – w zależności od pory roku) z dostępem

światła. Matrycą wody rzecznej, na której przeprowadzono badanie stabilności konserwantów i substancji

dezynfekujących była woda pobrana z rzeki Wapienica (Bielsko-Biała, Polska).

Wyniki badań przestawiono poniżej, jako maksymalny odnotowany ubytek, wyrażony w % w stosunku do ilości

wzorca oznaczonego w pierwszym dniu analizy:

stabilność krótkoterminowa (maksymalne ubytki po 7 dniach): 67% dla ChT, 10% dla 4C3MPh,

0,8% dla 2PP, 8% dla TCS, 6% dla TCC, MI i PS, 7% dla CMI, BA i SB i 4% dla MP;

24

stabilność długoterminowa (maksymalne ubytki po 24 miesiącach): 91% dla ChT, 63% dla 4C3MPh,

88% dla 2PP, 57% dla TCS, 36% dla TCC, 12% dla MI, 81% dla CMI, 10% dla BA, 50% dla PS,

30% dla SB i 71% dla MP.

Stabilność krótkoterminowa 10 spośród 11 oznaczanych analitów w wodzie jest wysoka (ubytki < 10%), wyjątek

stanowi ChT, dla której już w pierwszych dniach odnotowano duży spadek zawartości (ubytek rzędu 60%).

Ponadto zaobserwowano duży spadek zawartości 2PP po 24 miesiącach przechowywania próbek,

na obu z badanych poziomów stężeń (spadek zawartości do 12 – 25%).

Wyniki badań stabilności długoterminowej, uzyskane po 24 miesiącach, wskazują na zasadność

prowadzonych badań, ponieważ większość oznaczanych związków (wyjątek: ChT) jest stabilna w wodach.

Nawet przy znacznym spadku zawartości, po 24 miesiącach, pozostałości oznaczanych związków są wciąż

obecne w wodach.

Uzyskane wyniki pokazują, że w temperaturze pokojowej (Tp: 20°C – 35°C) stabilność oznaczanych związków

jest mniejsza niż w przypadku przechowywania w lodówce (T=4°C).

Największy spadek zawartości (do ok. 9% zawartości początkowej = ubytek rzędu 91%) zaobserwowano dla

ChT. Najbardziej stabilnymi związkami okazały się MI i BA (ubytki rzędu 10 – 13%, bez względu na warunki

przechowywania próbki), a także CMI (ubytek < 10%) i PS (ubytek < 13%) w przypadku przechowywania próbki

wody w niskich temperaturach (T=4°C).

4.6.3. Stabilność konserwantów w kosmetykach

Stabilność substancji konserwujących, zarówno w kosmetykach jak i farmaceutykach, jest bardzo

ważnym zagadnieniem. Aby zachować czystość mikrobiologiczną tych preparatów, substancje konserwujące

muszą być w nich zawarte w odpowiednim stężeniu i w określonej formie. Istnieją jednak czyniki sprzyjające

degradacji konserwantów do innych związków, stanowiących potencjalne niebezpieczeństwo dla konsumentów.

Może to wynikać z jednej strony z braku ich działania przeciwdrobnoustrojowego, z drugiej – z ich toksyczności.

Spośród oznaczanych substancji konserwujących degradacji mogą ulegać m.in.: BA, SB, PS, MP. Na temat

pozostałych konserwantów (MI, CMI) nie znaleziono informacji dotyczących ich degradacji i metabolizmu.

W ramach przeprowadzonych badań wyznaczono stabilność oznaczanych konserwantów

w czterech wybranych matrycach kosmetyków i środków higieny osobistej (pasta do zębów, krem, żel oraz płyn

do płukania jamy ustnej). Badania prowadzono przez 12 miesięcy. W celu przeprowadzenia badań stabilności

analitów, do matryc produktów kosmetycznych (nie zawierających oznaczanych związków) dodano

odpowiednie ilości wzorców. Próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, część próbek pozostawiono

otwarte, drugą część zamknięto. Warunki w jakich wykonywano badania dobrano odpowiednio do potencjalnych

warunków przechowywnia kosmetyków w życiu codziennym.

Wyniki uzyskane po 12 miesiącach pokazują nawet do 100% ubytku analitów. Zgodnie z tym co

przewidywano, dla próbek pozostawionych jako otwarte obserwuje się większe zmiany niż dla próbek

zamkniętych. Zmiany te są zróżnicowane także w obrębie testowanych matryc kosmetyków – zależą od składu

próbek i ich postaci fizycznej.

Największy spadek zawartości (do 0%) zaobserwowano dla CMI (próbki otwarte: pasta, płyn) i BA (próbki

otwarte: pasta, żel, płyn).

25

Badania wykazały, że dla próbek otwartych najbardziej stabilnym konserwantem (ubytki < 20%) jest MP (krem).

Natomiast dla próbek zamkniętych najbardziej stabilne związki to MI (pasta, krem, płyn), SB (pasta),

MP (pasta, płyn).

Najmniej stabilnymi konserwantami są CMI i BA. Bardziej stabilnymi związkami są PS i SB, a najstabilniejsze

substancje konserwujące spośród badanych sześciu substancji to MI i MP.

Badania stabilności prowadzone na próbkach handlowych potwierdziły wyniki uzyskane dla badanych

matryc z dodatkami wzorców.

Przeprowadzone badania stabilności konserwantów w kosmetykach, środkach higieny osobistej

i farmaceutykach pokazują spadek zawartości analitów w czasie, co może być związane zarówno z brakiem ich

stabilności (degradacją) i/lub aktywnym działaniem na mikroorganizmy.

Duże spadki zawartości konserwantów w produktach handlowych mogą świadczyć o niekorzystnych zmianach

zachodzących w danym wyrobie, ale także o jego nieprawidłowym przechowywaniu. Nieprawidłowości

związane z przechowywaniem produktu wynikać mogą z niewłaściwego przechowywania produktu przez

konsumentów (naświetlanie, niedomknięcie opakowania), niewłaściwego doboru opakowania przez producenta

lub niewłaściwego doboru konserwantu do matrycy. Niewłaściwy sposób przechowywania kosmetyków lub

farmaceutyków może powodować: reakcje składników tych produktów (w tym także konserwantów) z tlenem

z powietrza lub z mikroorganizmami, adsorpcję konserwantu na ściankach opakowań, rozkład konserwantu.

26

5. PODSUMOWANIE I WNIOSKI

W ramach prezentowanej rozprawy doktorskiej opracowano procedury analityczne do równoczesnego

oznaczania substancji dezynfekujących lub/i konserwujących. Metody te nie były wcześniej opisane

w literaturze dla badanych 11 analitów będących przedmiotem niniejszej pracy. Opracowane metody

wykorzystują techniki chromatografii wysokosprawnej (HPLC) i ultrasprawnej (UHPLC) z detekcją DAD lub UV,

oraz metody ekstrakcyjne (SPE, UAE) do przygotowania próbek do badań.

Opracowano cztery układy chromatograficzne, które zastosowano do oznaczania:

pozostałości pięciu substancji dezynfekujących (ChT, 4C3MPh, 2PP, TCS, TCC) w wodach

powierzchniowych (Metoda I: RP-HPLC-DAD, kolumna ze złożem typu C30, elucja gradientowa za

pomocą H2O i MeOH),

sześciu substancji konserwujących (MI, CMI, BA, PS, SB, MP) w kosmetykach, farmaceutykach

i środkach czystości oraz ich pozostałości w wodach powierzchniowych (Metoda II: RP-HPLC-DAD,

kolumna ze złożem typu C30, elucja gradientowa za pomocą 0,1% wodnego roztworu HCOOH i ACN),

równoczesne oznaczanie pozostałości pięciu substancji dezynfekujących (ChT, 4C3MPh, 2PP, TCS,

TCC) i sześciu konserwantów (MI, CMI, BA, PS, SB, MP) w wodach powierzchniowych (Metoda III:

RP-HPLC-DAD, kolumna za złożem typu C30, elucja gradientowa za pomocą 0,1% wodnego roztworu

HCOOH i ACN).

pięciu substancji konserwujących (MI, CMI, BA, PS lub SB, MP) w kosmetykach, farmaceutykach

i środkach czystości (Metoda IV: RP-UHPLC-UV, kolumna monolityczna ze złożem typu C18, elucja

gradientowa za pomocą 0,1% wodnego roztworu HCOOH i ACN).

W celu przygotowania próbek wód powierzchniowych do analiz chromatograficznych wykorzystano

technikę ekstrakcji do fazy stałej (SPE). W przypadku próbek kosmetyków, farmaceutyków i środków czystości

techniką stosowaną do ich przygotowania była ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana promieniowaniem

ultradźwiękowym (UAE).

Opracowane metody poddano walidacji i zastosowano do wykrywania oraz oznaczania pozostałości

konserwantów i substancji dezynfekujących w próbkach wód powierzchniowych oraz konserwantów

w kosmetykach, środkach higieny osobistej, środkach czystości i farmaceutykach.

Opracowane procedury SPE i metody chromatograficzne zastosowane do badań próbek wód

powierzchniowych potwierdziły obecność niektórych analitów w środowisku (CMI, BA, ChT, SB, 4C3MPh, 2PP,

TCS i TCC) w stężeniach od 0,3 µg/L do 74,4 µg/L. Niektóre z badanych wód poddano analizie

z zastosowaniem dwóch metod chromatograficznych (Metoda II i Metoda III), uzyskując podobne wyniki,

co dodatkowo potwierdziło zawartości oznaczanych związków w próbkach.

Analiza licznych próbek produktów handlowych – kosmetyków, środków higieny osobistej, środków

czystości i farmaceutyków – o zróżnicowanej postaci fizycznej i składzie, wykazała przydatność opracowanych

metod (UAE do przygotowania próbek i LC do ich analizy) do badań substancji konserwujących w tych

produktach. Uzyskane wyniki potwierdziły obecność i dopuszczalną zawartość zadeklarowanych konserwantów

w badanych produktach.

27

Opracowane metody zastosowano także do badań stabilności analitów w różnych matrycach próbek –

– wodzie powierzchniowej, kosmetykach (pasta do zębów, krem, żel, płyn do płukania jamy ustnej)

i wyrobach przemysłu farmaceutycznego. Anality wykazywały zróżnicowaną stabilność, zależną od ilości

dodanego związku, sposobu przechowywania próbek i ich składu matrycowego.

Zaprezentowane metody mogą znaleźć zastosowanie w laboratoriach związanych z ochroną

środowiska (do monitoringu badanych w niniejszej pracy zanieczyszczeń środowiska w wodach) oraz

w laboratoriach przemysłowych (do badań stabilności konserwantów w produktach kosmetycznych

i farmaceutycznych).

Z przeprowadzonych badań wynikają następujące wnioski:

Spośród opracowanych czterech metod chromatograficznych najbardziej przydatną do oznaczania

pozostałości substancji dezynfekujących i konserwujących w wodach środowiskowych jest Metoda III,

pozwalająca na równoczesną analizę wszystkich 11 analitów (po wcześniejszej ich ekstrakcji techniką

SPE zgodnie z Procedurą III). Na podstawie przeprowadzonych badań zaproponowano schemat

postępowania dla oznaczeń prowadzonych zgodnie z tą procedurą analityczną, który przedstawiono na

Rysunku 8.

W przypadku analiz produktów handlowych (kosmetyki, środki higieny osobistej, środki czystości

i farmaceutyki) najbardziej przydatną metodą jest Metoda IV. Metoda ta wykorzystuje technikę UHPLC,

która jest szybsza i tańsza w stosunku do chromatografii wysokosprawnej, dlatego też jest często

dedykowana do analiz rutynowych. Na podstawie przeprowadzonych badań zaproponowano schemat

postępowania przy oznaczaniu konserwantów w wyrobach przemysłu kosmetycznego,

farmaceutycznego i chemii gospodarczej, który przedstawiono na Rysunku 9.

Zastosowanie ultradźwięków pozwoliło na skuteczne wydzielenie analitów do roztworu, z wysokimi

odzyskami. Zastosowanie operacji rozpuszczania, mieszania, wytrząsania czy wirowania, nie było tak

efektywne w wydzielaniu środków konserwujących z kosmetyków, szczególnie z matryc półpłynnych

i stałych.

Wyniki analiz próbek wód powierzchniowych wskazują na obecność oznaczanych związków.

Ze względu na ich stabilność, można spodziewać się ich akumulacji, co nie pozostanie obojętne dla

środowiska naturalnego. Nie ulegają one szybkiej biodegradacji i po 24 miesiącach są wciąż obecne

w wodzie. Dodatkowo należy zdawać sobie sprawę z tego, że niektóre z tych związków mogą ulegać

transformacjom (pod wpływem światła, temperatury lub innych składników obecnych w środowisku)

do znacznie bardziej niebezpiecznych związków.

Badania stabilności konserwantów w kosmetykach (wykonane na wzorcach dodanych do produktów

handlowych) wskazują, że z punktu widzenia ich stabilności w poszczególnych matrycach, nie zawsze

producenci dobierają najbardziej stabilny konserwant dla danego produktu (o określonym składzie

i postaci fizycznej).

28

SPE kolumienka

BOND ELUT PPL (600 mg, 5 mL)

Kondycjonowanie: 5 mL MeOH;

5 mL H2Odest zakwaszonej do pH 2 (2 M H2SO4); 1 mL/min

Próbka: 5 L wody powierzchniowej

(przesączonej, zakwaszonej do pH 2 (2 M H2SO4)); 10 mL/min

Suszenie złoża: pod zmniejszonym ciśnieniem, 2 min

Elucja: 5 mL ACN; 1 mL/min

Analiza chromatograficzna – HPLC

Faza stacjonarna:

Develosil RP Aqueous AR-5 RP-30 (250ᵡ4,6 mm, 5 µm) (Nomura Chemical)

Faza ruchoma: elucja gradientowa; ACN, 0,1% HCOOHaq

natężenie przepływu: 0,6 – 1,2 mL/min

Temperatura pokojowa Objętość dozowanej próbki: 20 µL

Czas analizy: 40 min

Rysunek 8. Schemat postępowania w analizie pozostałości substancji dezynfekujących i konserwujących

w wodach powierzchniowych.

29

UAE:

1 g próbki + 6 mL MeOH

Łaźnia ultradźwiękowa: 15 min

+ MeOH, do 10,0 mL

Filtracja

(Rozcieńczenie)

Analiza chromatograficzna – UHPLC

Faza stacjonarna:

Chromolith® Fast Gradient RP 18e (50ᵡ2 mm) (Merck)

Faza ruchoma: elucja gradientowa; ACN, 0,1% HCOOHaq

natężenie przepływu: 0,7 mL/min

Temperatura kolumny: 12°C Objętość dozowanej próbki: 2 µL

Czas analizy: < 3 min

Rysunek 9. Schemat postępowania w analizie substancji konserwujących w wyrobach przemysłu

kosmetycznego, farmaceutycznego i chemii gospodarczej.

30

6. LITERATURA

[1] V.K. Dawson, R.A. Davis; Journal of AOAC International 80/2 (1997) 316–318.

[2] M. Castillo, D. Puig, D. Barcelo; Journal of Chromatography A 778 (1997) 301–311.

[3] M.J. Martínez Bueno, A. Agüera, M. José Gómez, M. Dolores Hernando, J.F. García-Reyes, A.R. Fernández-Alba; Analytical Chemistry 79 (2007) 9372–9384.

[4] A.R.M. Silva, J.M.F. Nogueira; Talanta 74 (2008) 1498–1504.

[5] A. Sapkota, J. Heidler, R.U. Halden; Environmental Research 103 (2007) 21–29.

[6] D. Bratkowska, R.M. Marcé, P.A.G. Cormack, F. Borrull, N. Fontanals; Analytica Chimica Acta 706 (2011) 135–142.

[7] B. Kasprzyk-Hordern, R.M. Dinsdale, A.J. Guwy; Talanta 74 (2008) 1299–1312.

[8] O.T. Fahmy, M.A. Korany, H.M. Maher; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 34 (2004) 1099–1107.

[9] M. Zečević, Ž. Stanković, Lj. Živanović, B. Jocić; Journal of Chromatography A 1119 (2006) 251–256.

[10] J. Breitkreutz, M. Bornhöft, F. Wöll, P. Kleinebudde; European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 56 (2003) 247–253.

[11] B. Gruvberger, M. Bruze, M. Tammela; Acta Dermato-Venereologica (Stockh) 78 (1998) 52–56.

[12] M. Pedrouzo, F. Borrull, R.M. Marcé, E. Pocurull; Journal of Chromatography A 1216 (2009) 6994–7000.

[13] I. González-Mariño, J.B. Quintana, I. Rodríguez, R. Cela; Rapid Communications in Mass Spectrometry 23 (2009) 1756–1766.

[14] C. Boukarim, S.A. Jaoudé, R. Bahnam, R. Barada, S. Kyriacos; The Journal of Applied Research 9/1/2 (2009) 14–17.

[15] Y. Yu, Q. Huang, Z. Wang, K. Zhang, C. Tang, J. Cui, J. Feng, X. Peng; Journal of Environmental Monitoring 13 (2011) 871–878.

[16] E. Marengo, V. Gianotti, S. Angioi, M.C. Gennaro; Journal of Chromatography A 1029 (2004) 57–65.

[17] A. Rafoth, S. Gabriel, F. Sacher, H.J. Brauch; Journal of Chromatography A 1164 (2007) 74–81.

[18] K. Urakami, A. Higashi, K. Umemoto, M. Godo; Journal of Chromatography A 1057 (2004) 203–210.

[19] R.A. Trenholm, B.J. Vanderford, J.E. Drewes, S.A. Snyder; Journal of Chromatography A 1190 (2008) 253–262.

[20] J.T. Yu, E.J. Bouwer, M. Coelhan; Agricultural Water Management 86 (2006) 72–80.

[21] M.J. Gómez, S. Herrera, D. Solé, E. García-Calvo, A.R. Fernández-Alba; Science of the Total Environment 420 (2012) 134–145.

[22] J. Ghasemi, A. Niazi, S. Ghobadi; Pharmaceutical Chemistry Journal 39/12 (2005) 671–675.

[23] A. Myint, Q. Zhang, L. Liu, H. Cui; Analytica Chimica Acta 517 (2004) 119–124.

[24] A.G. Kazemifard, D.E. Moore, A. Mohammadi; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30 (2002) 257–262.

[25] J. Song, H. Fu, W. Guo; Journal of Electroanalytical Chemistry 511 (2001) 31–38.

[26] R.M. O’Donnell, X. Sun, P.B. Harrington; Trends in Analytical Chemistry 37/1 (2008) 44–53.

[27] R. Rodrıguez, Y. Pico, G. Font, J. Manes; Journal of Chromatography A 924 (2001) 387–396.

[28] M. Jaworska , G. Szulinska, M. Wilk, J. Tautt; Journal of Chromatography A 853 (1999) 479–485.

31

7. DOROBEK NAUKOWY

7.1. PUBLIKACJE

I. Baranowska, I. Wojciechowska; Development of SPE/HPLC-DAD to Determine Residues of Selected Disinfectant Agents in Surface Water; Polish Journal of Environmental Studies 21/2 (2012) 267–275. 5-letni IF: 0,819; punkty MNiSW: 15. I. Baranowska, I. Wojciechowska; The Determination of Preservatives in Cosmetics and Environmental Waters by HPLC; Polish Journal of Environmental Studies 22/6 (2013) 1609–1625. 5-letni IF: 0,819; punkty MNiSW: 15 I. Baranowska, I. Wojciechowska, N. Solarz, E. Krutysza; Determination of preservatives in cosmetics, cleaning agents and pharmaceuticals using fast liquid chromatography; Journal of Chromatographic Science 52 (2014) 88–94 (DOI: 10.1093/chromsci/bms210). 5-letni IF: 0,945; punkty MNiSW: 20.

7.2. ZJAZDY PTCHEM – SITPCHEM I SEMINARIA NAUKOWE

I. Baranowska, I. Wojciechowska; Badania nad chromatograficznym rozdzielaniem i oznaczaniem wybranych konserwantów w wyrobach przemysłu kosmetycznego i farmaceutycznego; 55. Zjazd PTChem – SITPChem, 16-20.09.2012r., Białystok (komunikat sekcyjny). I. Baranowska, I. Wojciechowska; Nowe metody analityczne w badaniach pozostałości środków dezynfekujących w ekosystemach wodnych (New analytical methods for the determination of disinfectant residues in water ecosystems); IV SEMINARIUM NAUKOWE „Aktualne problemy chemii analitycznej”, 2.06.2010r., Katowice (poster). I. Baranowska, I. Wojciechowska; HPLC w analizie wybranych związków dezynfekujących w próbkach wód powierzchniowych; 53. Zjazd PTChem – SITPChem, 14-18.09.2010r., Gliwice (poster). I. Baranowska, I. Wojciechowska; Zastosowanie metody UPLC do oznaczania wybranych środków konserwujących w kosmetykach; V SEMINARIUM NAUKOWE „Aktualne problemy chemii analitycznej”, 13.05.2011r., Katowice (poster). I. Baranowska, I. Wojciechowska; Oznaczanie wybranych konserwantów w farmaceutykach i kosmetykach techniką ultraszybkiej chromatografii cieczowej; VI SEMINARIUM NAUKOWE „Aktualne problemy chemii analitycznej”, 18.05.2012r., Katowice (poster).