31

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dan

metode yang digunakan adalah post test only control group design yaitu

rancangan penelitian yang hasil penelitiannya diamati setelah perlakuan

selesai.

4.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu

selama 3 minggu di Bulan Desember 2018-Januari 2019.

4.3 Populasi dan Sampel

4.3.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus

norvegicus) strain wistar.

4.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan adalah tikus putih jantan diambil dari

populasi yang sesuai kriteria inklusi.

4.3.3 Besar Sampel

Terdapat 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negatif

(-), kelompok kontrol positif (+), dan 3 kelompok perlakuan. Penentuan

besar replikasi sampel dalam penelitian ditentukan menggunakan

32

rumus pada Sample Size Calculation in Animal Studies tahun 2017,

yakni sebagai berikut:

Tabel 4.1 Rumus penentuan jumlah sampel Annova Design

Application Minimum n/grup

Maximum n/grup

One-way Annova

Group Comparasion 10/k +1 20/k+1

(Ari, 2017)

Keterangan:

n : Jumlah subjek tiap kelompok

k : Jumlah kelompok

Sesuai dengan rumus tersebut maka untuk mendapat sampel atau

jumlah subjek tiap kelompoknya dapat dikalkulasikan sebagai

berikut :

Jumlah sampel minimum

N = 10/k +1

n = 10/5 +1

n = 2 +1

n = 3

Jumlah sampel maksimum

n = 20/k +1

n = 20/5 +1

n = 4 + 1

n = 5

33

Sehingga dalam penelitian ini jumlah sampel tiap kelompoknya

adalah 3. Sehingga, jika dijumlahkan pada peneliatian ini digunakan

kurang lebih 15 sampel.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Sampel penelitian diambil dengan teknik simple random

sampling dari populasi tikus putih jantan strain wistar.

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

a. Kriteria Inklusi :

1. Tikus jantan Strain Wistar

2. Umur 2-3 bulan

3. Berat badan 180-200gram

4. Sehat, ditandai dengan gerakan aktif, bulu berwarna putih,

dan mata jernih

b. Kriteria Ekslusi :

1. Tikus yang pernah menjadi sampel penelitian lain

2. Tikus sakit yang ditandai dengan tidak adanya gerakan atau

gerakan pasif, dan matanya tidak jernih.

c. Kriteria Drop Out :

1. Tikus yang mati ketika perlakuan

4.3.6 Variabel Penelitian

a. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian dosis

ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape).

34

b. Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar

malondialdehid pada tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar)

model dislipidemia.

4.3.7 Definisi Operasional

a. Daun kecapi yang digunakan yaitu daun kecapi dengan kondisi

sehat yang ditandai dengan warna hijau tua, bersih, dan tidak

kering. Daun kecapi ini didapatkan dari perkebunan kecapi di

Madura sebanyak 3 kg. Determinasi daun kecapi dilakukan di

Materia Medika. Daun kecapi yang didapatkan kemudian

dikeringkan dan diekstrak dengan metode maserasi dimana

masing-masing dosis ekstrak 1,33mg/200grBB;

2,66mg/200grBB; 5,32mg/200grBB (diperoleh dari hasil

perhitungan konversi tabel 4.1). Variabel ini termasuk dalam

skala kategorik (ordinal).

b. Induksi dislipidemia dengan pemberian diet tinggi lemak yang

mengandung minyak jelantah (Suwandi, 2012). Minyak jelantah

dalam penelitian ini diambil dari pedagang gorengan di Kota

Malang dan diberikan dengan metode sonde per oral sebanyak 2,5

ml minyak jelantah dengan penggorengan lebih dari 20 kali

ditambah dengan pakan standar BR-1 (Ulilalbab, et al., 2012).

Perlakuan tersebut diberikan 1x/hari selama 14 hari. Bahan untuk

induksi dislipidemia ini didapatkan dari pedagang pasar setempat

serta toko pakan ternak di kota Malang.

35

c. Kadar malondialdehid (MDA) diukur dalam mg/dL dengan

metode TBARS (2-Thiobarbituric Acid Reactive Substance) dari

darah setiap tikus sebanyak 3 ml yang diambil dari spuit (Septiana

& Ardiaria, 2016). Variabel ini menggunakan skala data numerik

(ratio).

4.4 Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1 Alat Pemilaharaan Tikus

a. Kandang tikus dan penutup

b. Tempat makan dan minum

c. Timbangan analitik Ohaus dengan ketelitian 0,0001 %

d. Sekam

4.4.2 Perlakuan dan pembedahan

a. Handscoon

b. Masker

c. Tisu

d. Sonde modifikasi

e. Spuit 5cc

f. Neraca berat badan

g. Label

h. Toples klorofom

i. Spons untuk pengambilan klorofom

j. Minor set dan papan bedah

36

4.4.2 Alat pengabilan sampel darah tikus

a. Jarum

b. Pipet mikro 50µi

c. Tabung evendoff 3cc dan 1,5cc

d. Sentrifuge

4.4.3 Alat lain

a. Rak dan tabung reaksi

b. Erlenmeyer

c. Gelas ukur

d. Vaccum fezer dyer

e. Kamera digital

4.4.4 Bahan

a. Daun kecapi sebanyak 3 kg

b. Etanol

c. Minyak jelantah

d. Pakan standar BR-1

e. Klorofom (Dewi, Iskandarsyah & Octarina, 2014)

4.5 Prosedur Penelitian

4.5.1 Proses Adaptasi

Tikus diadaptasikan selama 7 hari dan dilakukan pengelompokan

secara acak menjadi 5 kelompok. Tiap kelompok terdiri atas 3 ekor

tikus yang diletakkan di dalam kandang. Masing-masing kandang berisi

1 sampai 2 tikus. Bahan pakan normal BR-1 diberikan 1x/hari dengan

37

pemberian minum aquades secukupnya pada masing-masing

kelompok. Sebelum dan sesudah proses adaptasi, tikus ditimbang berat

badannya. Adaptasi bertujuan agar tikus menyesuaikan dulu dengan

lingkungan baru.

4.5.2 Pengelompokan Tikus

Pengelompokan tikus ini berdasarkan perlakuan yang dilakukan

dalam penelitian. Perlakuan dan pengelompokan tikus dalam penelitian

ini ada 5, yaitu:

a. Kelompok I kontrol negatif : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak

40 g/hari/tikus serta minum ad libitum selama 14 hari, tanpa

pemberian minyak jelantah dan ekstrak daun kecapi.

b. Kelompok II kontrol positif : Diberi pakan standar BR-1

sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum ad libitum ditambah diet

tinggi lemak berupa minyak jelantah yang diberikan dengan

metode sonde lambung sebanyak 2,5 ml/hari selama 14 hari,

tanpa pemberian ekstrak daun kecapi.

c. Kelompok III: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus

serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa

minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi

(Sandoricum koetjape) dengan dosis 1,33 mg/200grBB/hari

dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14

hari.

d. Kelompok IV: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus

serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa

38

minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi

(Sandoricum koetjape) dengan dosis 2,66 mg/200grBB/hari

dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14

hari.

e. Kelompok V: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hr/tikus

serta minum ad libitum ditambah diet tinggi lemak berupa

minyak jelantah sebanyak 2,5 ml/hari dan ekstrak daun kecapi

(Sandoricum koetjape) dengan dosis 5,32 mg/kgBB/hari dengan

metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 14 hari.

4.5.3 Pembuatan Ekstrak Daun Kecapi

Daun yang sudah diambil sebanyak 3 kg, kemudian dicuci

menggunakan air dan dibilas dengan aquades steril kemudian daun

dikeringkan dalam oven suhu 400○C. Daun yang sudah kering

kemudian di blender hingga halus. Setelah itu serbuk tersebut kemudian

diekstrak menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 80%

sebanyak 1000 ml hingga serbuk benar-benar terendam seluruhnya.

Perendaman dilakukan pada suhu kamar hingga 3 hari dan setiap hari

dilakukan pengadukan selama 5 menit. Setelah 3 hari, hasil maserasi

disaring dengan corong buchner yang dialasi kertas saring. Hasil

ekstraksi selanjutnya dipekatkan dengan menggunakan water bath

sampai dihasilkan ekstrak daun kecapi (Asiani, Sulaiman &

Kurniawan, 2012).

39

4.5.4 Dasar Penentuan Dosis Ekstrak Daun Kecapi

Penentuan dosis ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape)

didasarkan pada penelitian sebelumnya oleh Kartika pada tahun 2016

yang melakukan penelitian tentang ekstrak daun kecapi terhadap kadar

kolesterol, didapatkan dosis yang berpengaruh terhadap penurunan

kadar kolesterol sebesar 19mg/kgBB yang menggunakan hewan coba

mencit (Mus musculus) dengan dosis 0,38mg/20gram mencit. Sehingga

dosis harus di konversi terlebih dahulu karena dalam penelitian ini

peneliti menggunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus strain

wistar). Konversi tersebut berdasarkan tabel dengan perhitungan

sebagai berikut:

n’ = n x 7

keterangan :

n’ = dosis ekstrak daun kecapi (Sandoricum koetjape) tikus putih

n = dosis ekstak daun kecapi (Sandoricum koetjape) mencit jantan

7 = ketetapan konversi untuk mencit ke tikus

Tabel 4.2 Konversi Dosis Antar Spesies

Mencit 20 g

Tikus 200 g

Marmot 400 g

Kelinci 1,5 kg

Anjing 12 kg

Manusia 70 kg

Mencit 20 g

1,0 7,0 12,25 27,8 124,2 387,9

Tikus 200 g

0,14 1,0 1,74 3,9 17,8 56,0

Marmot 400 g

0,08 0,57 1,0 2,25 10,2 31,5

Kelinci 1,5 kg

0,04 0,25 0,44 1,0 4,5 14,2

Anjing 12 kg

0,08 0,06 0,1 0,22 1,0 3,1

40

Manusia 70 kg

0,0026 0,018 1,031 0,7 0,32 1,0

(Laurance DR & Bacharah AL, 1964)

Dosis yang diberikan adalah 1/2n’, n’, dan 2n’. Berdasarkan tabel

konversi diatas maka diperoleh perhitungan dosis berikut:

Dosis I = 1/2n’ = ½ (0,38 x 7) = 1,33 mg/200 grBB (dosis rendah)

Dosis II = n’ = 0,38 x 7 = 2,66 mg/200 grBB (dosis sedang)

Dosis III = 2n’ = 2(0,38 x 7) = 5,32 mg/200 grBB (dosis tinggi)

Dosis diubah dalam satuan berat menjadi satuan volume

menggunakan piknometer dengan memperhatikan berat jenis dari suatu

benda. Adapun cara dalam penggunaan piknometer, sebagai berikut.

1. Timbang piknometer kosong yang bersih dan kering dengan

seksama.

2. Isi piknometer dengan ekstrak daun kecapi hingga penuh, tutup

piknometer, lalu masukkan ke dalam lemari pendingin hingga

suhu 20°.

3. Biarkan tabung piknometer terbuka dan suhu air naik sampai

mencapai suhu percobaan, lalu tutup tabung piknometer.

4. Biarkan suhu air dalam piknometer mencapai suhu kamar. Air

yang menempel diusap dengan tisu, timbang dengan seksama.

5. Catat hasilnya.

6. Cara perhitungan :

ρ = mv

41

keterangan :

ρ = berat jenis (gr/ml)

m = massa (gr)

v = volume (ml) (Aziz, Yuanita & Susanti, 2010).

4.5.5 Diet Tinggi Lemak

Induksi dislipidemia dilakukan dengan pemberian diet tinggi

lemak yang mengandung minyak jelantah (Suwandi, 2012). Pada

kelompok perlakuan, dilakukan penyondean 2,5 ml minyak jelantah

yang diambil dari pedagang gorengan di Kota Malang dengan

penggorengan lebih dari 20 kali, diberikan dengan metode sonde per

oral ditambah dengan pakan standar BR-1 (Ulilalbab, et al., 2012).

Perlakuan tersebut diberikan 1x/hari selama 14 hari.

4.5.6 Pengambilan Sampel Darah dan Pemusnahan Hewan Coba

Tahap ini dilakukan dengan memasukkan hewan coba ke dalam

toples kaca atau akuarium yang sebelumnya sudah diberi kapas

mengandung kloroform. Pembiusan dilakukan satu persatu secara

inhalasi dengan dosis eter 0,67ml/hewan coba selama 28 detik yang

dihitung menggunakan stopwatch. Tikus yang teranastesi ditandai

dengan tidak adanya respon nyeri. Tikus yang teranastesi diletakkan

pada meja paraffin dan keempat nya difiksasi menggunakan jarum

pentul, kemudian dibedah menggunakan gunting dari abdomen hingga

setinggi leher. Darah diambil pada ventikel kiri sebanyak ±3 cc

42

kemudian dipindah ke test tube lalu disentrifuge dengan kecepatan

3000 rpm selama ±15 menit.

Tikus yang telah diambil darah yang akan diteliti dipastikan mati,

bangkai tikus diletakkan dalam wadah baskom. Bangkai tikus

percobaan dikubur di tanah dengan kedalaman minimal 50 cm dan luas

lubang 0,25m². Setiap lubang hanya digunakan untuk mengubur 10

tikus secara bersama, hal ini untuk mencegah bangkai tikus digali oleh

hewan lain seperti kucing. Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu

lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari bangkai tikus tersebut.

4.5.7 Pemeriksaan Kadar Malondialdehid

Pemeriksaan kadar malondialdehid dengan metode TBARS (2-

Thiobarbituric Acid Reactive Substance) menggunakan TBARS reagen

kits yang sesuai dengan protap Laboratorium Biomedik Universitas

Muhammadiyah Malang. Analisis dilakukan dengan cara memasukkan

750 µl asam fosfat dimasukkan dengan pipet ke dalam polypropilen

tube 13 mL kemudian ditambahkan sebanyak 250 µl TBA

(Thiobarturic Acid) dan ditambahkan 50 µl standar/sampel dan digojog.

Campur sampai homogen kemudian ditambahkan aquades sebanyak

450 µl ke dalam tabung dan tabung di tutup rapat. Campuran

dipanaskan selama 60 menit, setelah pemanasan tabung ditempatkan

dalam ice bath untuk mendinginkan sampel. Sampel yang sudah dingin

diaplikasikan ke dalam kolom Set-Pak C18. Absorbansi diukur

43

menggunakan Spektofotometer dengan panjang gelombang 532 nm

(Septiana & Ardiaria, 2016).

4.6 Analisis Data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan

uji one way ANOVA, uji normalitas, uji homogenitas, dan uji regresi dengan

menggunakan program komputasi statistik SPSS 23.

a. Uji one way ANOVA digunakan untuk mengetahui perbedaan kadar

MDA pada setiap perlakuan. Hasil uji ANOVA dikatakan terdapat

pengaruh yang sangat bermakna jika nilai signifikansi (sig) < P=0,05.

Sebelum dilakukannya uji ANOVA perlu dilakukan uji normalitas

menggunakan uji Saphiro Wilk yang bertujuan untuk mengetahui

kenormalan data (data bersifat normal apabila sig > 0,05) dan uji

homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui homogenitas

varian dari data-data yang diperoleh (data bersifat homogen jika sig >

0,05). Apabila persebaran data tidak normal (sig

44

c. Uji regresi linier sederhana digunakan untuk mengetahui seberapa kuat

pengaruh antara dosis ekstrak daun kecapi dengan penurunan kadar

MDA tikus.

45

4.7 Alur Penelitian

Adaptasi Hewan Coba selama 7 hari

Setiap tikus dianastesi dengan 0,67 ml kloroform pekat secara inhalasi

Pengambilan darah dari ventrikel kiri jantung hewan coba sebanyak 3ml

menggunakan spuit 5 ml

Setelah tikus dibedah kemudian tikus dikubur dengan setiap

lubang terdapat 10 tikus

Kelompok I (Kontrol Positif)

Pemberian makan BR-1 dan induksi dislipidemia

selama 14 hari

Kelompok II Pemberian

makan BR-1, induksi

dislipidemia, dan ekstrak daun

kecapi dosis 1,33 mg/200grBB

selama 14 hari

Kelompok III Pemberian

makan BR-1, induksi

dislipidemia, dan ekstrak daun

kecapi dosis 2,66 mg/200grBB

selama 14 hari

Kelompok IV Pemberian

makan BR-1, induksi

dislipidemia, dan ekstrak daun

kecapi dosis 5,32 mg/200grBB

selama 14 hari

Analisa Data Menggunakan uji normalitas, homogenitas, ANOVA, post

hoc test, dan regresi

Pemeriksaan Kadar MDA

Kelompok I (Kontrol Negatif)

Pemberian makan BR-1

selama 14 hari

46

4.8 Jadwal Penelitian

Tabel 4.3 Jadwal Penelitian

No. Jenis Kegiatan Minggu 1 2 3 4 1. Adaptasi tikus X 2. Induksi diet tinggi lemak X X 3. Pemberian ekstrak daun kecapi X X 4. Pengecekan parameter X 5 Analisa data X 6. Konsultasi dan revisi X X