8/13/2019 biochemj00812-0107

1/9

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 8 0 , 3 2 4

S t a t i s t i c a l E s t i m a t i o n s i n Enzyme K i n e t i c sBY G . N . WILKINSOND i v i s i o n o f M a t h e m a t i c a l S t a t i s t i c s , Commonwealth S c i e n t i f i c and I n d u s t r i a l R e s e a r c h O r g a n i z a t i o n ,

U n i v e r s i t y o f A d e l a i d e , S o u t h A u s t r a l i a( R e c e i v e d 1 2 D e c e m b e r 1 9 6 0 )

A l t h o u g h e l e m e n t a r y s t a t i s t i c a l m e t h o d s s u c h a st h e c a l c u l a t i o n o f means and t h e i r s t a n d a r d e r r o r sa r e commonly e m p l o y e d , a p p l i c a t i o n o f t h es t a t i s t i c a l m e t h o d s o f r e g r e s s i o n a n a l y s i s i n enzymek i n e t i c s t u d i e s h a s r e c e i v e d l i t t l e a t t e n t i o n . I ne s t i m a t i n g t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f t h e M i c h a e l i s -Menten e q u a t i o n , f o r i ns t a n c e , g r a p h i c a l m e t h o d ss u c h a s t h e d o u b l e - r e c i p r o c a l p l o t ( L i n e w e a v e r &B u r k , 1 9 3 4 ) a r e g e n e r a l l y u s e d , w i t h o u t s u p p l e -m e n t a r y s t a t i s t i c a l c a l c u l a t i o n s . T h e s e m e t h o d sh a v e b e e n r e v i e w e d by Dixon & Webb ( 1 9 5 8 ) .G r a p h i c a l m e t h o d s , h o w e v e r , d o n o t u s u a l l yp r o v i d e any measure o f t h e p r e c i s i o n o f t h e d e t e r -m i n a t i o n s , a k n o w l e d g e o f w h i c h i s n e c e s s a r y f o r ap r o p e r e v a l u a t i o n o f t h e r e s u l t s i n r e l a t i o n t ot h e o r e t i c a l c o n s i d e r a t i o n s , o r f o r a c o m p a r i s o n o fr e s u l t s o b t a i n e d u n d e r d i f f e r i n g e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s . The ma in p u r p o s e o f a s t a t i s t i c a la n a l y s i s i s t o s u p p l y , n o t o n l y more a c c u r a t ee s t i m a t e s , b u t a l s o t h e n e c e s s a r y m e a s u r e s o fp r e c i s i o n .T h i s p a p e r g i v e s a n a c c o u n t o f t h e w e i g h t e d andn o n - l i n e a r r e g r e s s i o n m e t h o d s a p p l i c a b l e t o g e n e r a lp r o b l e m s i n enzyme k i n e t i c s . A p p l i c a t i o n o f t h eb a s i c p r i n c i p l e s i s i l l u s t r a t e d i n d e t a i l w i t h t h ec o m p u t a t i o n a l m e t h o d s g i v e n f o r e s t i m a t i n g t h ek i n e t i c p a r a m e t e r s Km and V o f t h e M i c h a e l i s -Menten e q u a t i o n , and t h e r e l e v a n t s t a n d a r d e r r o r s .F u r t h e r i l l u s t r a t i o n i s p r o v i d e d b y a d e s c r i p t i o n o ft h e a n a l y s e s a p p l i e d i n e s t i m a t i n g d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s f o r enzyme and s u b s t r a t e ( c f . D i x o n ,1 9 5 3 ) f r o m t h e d a t a o f A t k i n s o n , J a c k s o n &M o r t o n ( 1 9 6 1 ) .The m e t h o d s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r werea p p l i e d i n t h e k i n e t i c s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h ep r e c e d i n g p a p e r b y A t k i n s o n e t a l .

BASIC PRINCIPLES AND METHODSRandom v a r i a t i o n ; t e r m i n o l o g y

Most e x p e r i m e n t a l d e t e r m i n a t i o n s a r e s u b j e c t t of l u c t u a t i o n s o f an u n p r e d i c t a b l e k i n d , u s u a l l y o na c c o u n t o f e x p e r i m e n t a l f a c t o r s w h i c h a r e no tu n d e r r i g i d c o n t r o l and t h e i nh e r e n t m e c h a n i c a ll i m i t a t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t a l a p p a r a t u s , ands o m e t i m e s o n a c c o u n t o f t h e i n h e r e n t v a r i a b i l i t y i nt h e p h e n o m e n a u n d e r i n v e s t i g a t i o n , as w i t h r a d i o -

a c t i v e e m i s s i o n s . I n t h i s s e n s e e x p e r i m e n t a l l yd e t e r m i n e d q u a n t i t i e s c a n b e d e s c r i b e d a s ' r a n d o mv a r i a t e s , ' a n d a s s o c i a t e d w i t h e a c h o b s e r v a t i o n o rd e t e r m i n a t i o n i s a ' c o n c e p t u a l p o pu l a t i o n ' o f a l lp o s s i b l e v a l u e s o f t h e random v a r i a t e t h a t m i g h th a v e a r i s e n i n s i m i l a r c i r c u m s t a n c e s t o t h o s e w h i c hhave p r o d u c e d t h e a c t u a l v a l u e ( s ) . The r e l a t i v ef r e q u e n c i e s w i t h w h i c h d i f f e r e n t v a l u e s o f t h ev a r i a t e o c c u r i n t h i s c o n c e p t u a l p o p u l a t i o n c o n -s t i t u t e t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e v a r i a t e ( w h i c h ma yh a v e more t h a n o n e d i s t r i b u t i o n a c c o r d i n g t o t h ec i r c u m s t a n c e s e n v i s a g e d ) .Th e t r u e m e a n , o r e x p e c t e d v a l u e , o f a randomv a r i a t e y i s t h e a v e r a g e v a l u e o f y i n t h e r e l e v a n tc o n c e p t u a l p o p u l a t i o n , and i s d e n o t e d h e r e byE ( y ) , - , , , o r s i m p l y , . ( T h e t r u e mean i s t o b ed i s t i n g u i s h e d f r o m t h e s a m p l e mean y o f a s e r i e s o fo b s e r v a t i o n s . ) I f t h e e x p e c t e d v a l u e o f a d e t e r m i -n a t i o n d e v i a t e s f r o m a s p e c i f i e d t h e o r e t i c a l v a l u e ,t h e d e t e r m i n a t i o n i s d e s c r i b e d a s b e i n g ' b i a s e d ' i nt h a t r e s p e c t .Th e v a r i a n c e o f y i s t h e a v e r a g e v a l u e , E ( y -o f s q u a r e d d e v i a t i o n s f r o m t h e mean i n t h e c o n -c e p t u a l p o p u l a t i o n , and i s d e n o t e d h e r e by V ( y ) ,a : , o r a 2 . The s q u a r e r o o t a o f t h e v a r i a n c e i sr e f e r r e d t o a l t e r n a t i v e l y a s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n( S . D . ) o r s t a n d a r d e r r o r ( s . E . ) a c c o r d i n g t o c o n t e x t ; s t a n d a r d d e v i a t i o n ' i s u s e d p r i m a r i l y whenr e f e r r i n g t o t h e b a s i c v a r i a b i l i t y i n t h e e x p e r i -m e n t a l d a t a , and ' s t a n d a r d e r r o r ' when r e f e r r i n gt o t h e p r e c i s i o n o f a s t a t i s t i c ( s u c h a s a mean o r ar e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t ) a s an e s t i m a t e o f some p a r a -m e t e r . The c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n , c . v . ( y ) , i s t h es t a n d a r d d e v i a t i o n o f y e x p r e s s e d a s a f r a c t i o n o ft h e mean; c . v . ( y ) = a / , .The c o v a r i a n c e o f tw o random v a r i a t e s Y i and Y 2i s t h e a v e r a g e v a l u e o f t h e p r o d u c t o f c o r r e s p o n d i n gd e v i a t i o n s i n t h e r e l e v a n t p o p u l a t i o n o f a l l p o s s i b l ep a i r s o f v a l u e s ( Y l , Y 2 ) :

C o v . ( Y l I Y 2 ) = E ( y 1 - e 1 ) ( Y 2 - ) PThe c o r r e l a t i o n , p , b e t w e e n Y i and Y 2 i s a n o r m a l i z e df o r m o f t h e c o v a r i a n c e :

C o v . ( Y l , Y 2 )P = a l a 2Tw o v a r i a t e s a r e d e s c r i b e d a s ' s t a t i s t i c a l l y i n d e -p e n d e n t ' i f t h e p r o b a b i l i t y t h a t o n e o f them t a k e s

3 2 4

8/13/2019 biochemj00812-0107

2/9

STATISTICAL ESTIMATIONS IN ENZYME KINETICSany v a l u e o r r a n g e o f v a l u e s i s i n d e p e n d e n t o f t h ev a l u e t a k e n by t h e o t h e r v a r i a t e . I t f o l l o w s t h a tt h e c o v a r i a n c e o r c o r r e l a t i o n o f two s t a t i s t i c a l l yi n d e p e n d e n t v a r i a t e s i s z e r o . ( T h e c o n v e r s e i s t r u eo n l y f o r n o r m a l l y d i s t r i b u t e d v a r i a t e s . )The p a r a m e t e r s o f random v a r i a t i o n d e s c r i b e da b o v e ( a n d g e ne r a l l y t h e p a r a m e t e r s o f a n y p h y s i c a ls y s t e m ) a r e u s u a l l y n o t known w i t h e x a c t i t u d e , b u ta r e , o r h a v e b e e n , a s c e r t a i n e d w i t h an a t t e n d a n td e g r e e o f u n c e r t a i n t y , by e s t i m a t i o n f r o m e x p e r i -m e n t a l d a t a . I t i s d e s i r a b l e i n most c o n t e x t s t h a t as e m a n t i c d i s t i n c t i o n s h o u l d b e e v i d e n t , b e t w e e nt h e p a r a m e t e r s t h e m s e l v e s and t h e c o r r e s p o n d i n ge s t i m a t e s .

C o m b i n a t i o n a n d t r a n s f o r m a t i o n o f v a r i a b i l i t yQ u a n t i t a t i v e s t u d i e s u s u a l l y i n v o l v e a s e q u e n c eo f c a l c u l a t i o n s b a s e d o n t h e e x p e r i m e n t a l d a t a .Th e f o l l o w i n g r u l e s e n a b l e t h e i n f l u e n c e o f e x p e r i -m e n t a l v a r i a b i l i t y t o b e d e t e r m i n e d a t a n y s t a g e o ft h i s p r o c e s s , a t l e a s t t o a f i r s t o r d e r o f a p p r o x i m a -

t i o n :C h a n g e i n s c a l e o f a q u a n t i t y y b y a f a c t o r Ac l e a r l y a f f e c t s i t s mean and s t a n d a r d d e v i a t i o ns i m i l a r l y , s o t h a tE ( A y ) = A E ( y ) ( 1 )

and S . D . ( A Y ) = A S . D . ( y ) , V A y = A 2 V ( y ) . ( 2 )The b a s i c r u l e s f o r t h e a d d i t i o n o f t w o o r mo req u a n t i t i e s a r eE ( y 1 + Y 2 ) = E ( y j ) E ( y 2 ) , ( 3 )

V ( y 1 + Y 2 ) = V ( y 1 ) + V ( y 2 ) + 2 C o v . ( Y l I Y 2 ) , ( 4 )t h e l a t t e r b e i n g d e d u c i b l e f r o m ( 3 ) s i n c eE ( y l + Y2 - u 1 _ P 2 ) 2= E ( y 1 -,1)2+ E ( Y 2 - , 2 ) 2 + 2 E ( y 1 - p l ) ( Y 2 - / - 2 ) .

I f Y i and Y 2 a r e s t a t i s t i c a l l y i n d e p e n d e n t t h ev a r i a n c e s a r e s i m p l y a d d i t i v e . The r u l e s ( 1 ) - ( 4 ) i nc o m b i n a t i o n d e t e r m i n e t h e m e a n and v a r i a n c e( h e n c e s t a n d a r d e r r o r ) o f any l i n e a r c o m b i n a t i o n o fv a r i a t e s a n d , i n p a r t i c u l a r , t h e v a r i a n c e s o f r e -g r e s s i o n s t a t i s t i c s a s g i v e n b e l o w .For n o n - l i n e a r t r a n s f o r m a t i o n s t h e f o l l o w i n gr u l e s a r e o n l y a p p r o x i m a t e s i n c e t h e n o n - l i n e a r i t yi n t r o d u c e s b i a s e s . The b i a s e s w i l l b e v e r y s l i g h t ,h o w e v e r , i f t h e t r a n s f o r m a t i o n f u n c t i o n e x h i b i t sl i t t l e c u r v a t u r e o v e r t h e r a n g e o f e x p e r i m e n t a lv a r i a t i o n , a s i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 .S m a l l d e v i a t i o n s c a n b e r e p r e s e n t e d a p p r o x i -m a t e l y b y t h e l i n e a r p a r t o f a T a y l o r e x p a n s i o n ,w h e r e f ( p , ) i s t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f f ( y ) a t u ,T h i s i s e v i d e n t a l s o f r o m g e o m e t r i c a l c o n s i d e r a -t i o n s ( F i g . 1 ) . S i n c e y - , u , a v e r a g e s t o z e r o i n t h ec o n c e p t u a l p o p u l a t i o n o f y v a l u e s ,

E [ f ( y ) ] t ~ f ( p v ) , 5

and s q u a r i n g and a v e r a g i n g f ( y ) - f ( p v ) g i v eV [ f ( y ) ] ; t ~ f 2 ( t v ) V ( y ) . ( 6 )

B i a s i n t h e l a s t f o r m u l a a r i s e s f r o m b i a s i n t h et r a n s f o r m e d mean a s w e l l a s f r o m n e g l e c t i n g h i g h e r -o r d e r t e r m s o f t h e T a y l o r e x p a n s i o n , b u t a g a i n w i l lb e s m a l l u n d e r t h e c o n d i t i o n s m e n t i o n e d .Use o f t h e f o r m u l a ( 6 ) i s i l l u s t r a t e d by t h e t r a n s -f o r m a t i o n o f a n e s t i m a t e d Km i n t o t h e n e g a t i v el o g a r i t h m pKm:d 1d l o g x = l o g e xdx x

s o t h a tS . E . ( p K n ) l o g e x ( K m )K m

0 - 4 3 4 3 c . v . ( K i ) .The g e n e r a l i z a t i o n o f ( 5 ) and ( 6 ) f o r f u n c t i o n s o ft w o o r more v a r i a t e s i s s t r a i g h t f o r w a r d . F o r af u n c t i o n o f t w o v a r i a t e s ,

E ( f ( y l , Y 2 ) ) f h1 2 ) , ( 7 )V ( f ( Y 1 , Y 2 ) ) I f V ( Y , ) + f V ( Y 2 )+ 2 f ' f ' C o v . ( Y l I Y 2 ) 1 ( 8 )w h e r e f 1 , , f , a r e t h e p a r t i a l d e r i v a t i v e s o f f a t( p l , p 2 ) . The c o v a r i a n c e t e r m v a n i s h e s i f Y i and Y 2a r e s t a t i s t i c a l l y i n d e p e n d e n t . A n i m p o r t a n t s p e c i a lc a s e i s t h a t o f t h e p r o d u c t o r r a t i o o f v a r i a t e s ,Z = Y I Y 2 o r z = Y 1 / Y 2 i n w h i c h c a s e t h e v a r i a n c er u l e ( 8 ) o n d i v i s i o n by p b e c o m e sC . v . 2 ( z ) c . v . 2 ( y 1 ) + C . v . 2 ( y 2 ) + 2 p c . v . ( y l ) c . v . ( Y 2 ) ,

( 9 )t h e m i n u s s i g n a p p l y i n g f o r t h e r a t i o . I f Y i and Y 2a r e s t a t i s t i c a l l y i n d e p e n d e n t , t h e c o r r e l a t i o n p i sz e r o , s o t h a t t h e s q u a r e s o f t h e c o e f f i c i e n t s o fv a r i a t i o n a r e s i m p l y a d d i t i v e .

I t VF i g . 1 . N o n - l i n e a r t r a n s f o r m a t i o n o f an e r r o r d i s t r i b u t i o n .T h e s l o p e o f t h e t a n g e n t i s t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f f ( y ) a t i v , .

V O l . 8 0 3 2 5

8/13/2019 biochemj00812-0107

3/9

G . N . WILKINSONR e g r e s s i o n analyis

T h e r e l e v a n c e o f t h e methods d e s c r i b e d b e l o w , f o r t h ea n a l y s i s o f a s e r i e s o f o b s e r v a t i o n s , d e p e n d s on t h e assump-t i o n s t h a t t h e o b s e r v a t i o n s a r e i n an f f e c t i v e sense s t a t i s t -i c a l l y i n d e p e n d e n t and t h a t t h e i r t r u e d i s t r i b u t i o n s d o no td i f f e r a p p r e c i a b l y f r o m t h e f a m i l i a r G a u s s i a n o r n o r m a lf o r m . With t h e s e a s s u m p t i o n s t h e a p p r o p r i a t e f o r m o fa n a l y s i s i s d e t e r m i n e d b y t h e b e h a v i o u r o f t h e t r u e meansa n d v a r i a n c e s .A r e g r e s s i o n a n a l y s i s i s a p p r o p r i a t e when t h e mean o f av a r i a t e y d e p e n d s on f a c t o r s x , s u c h a s temperature o r pH ,w h i c h h a v e b e e n v a r i e d i n t h e e x p e r i m e n t s . I f a s e r i e s o fo b s e r v a t i o n s y a r e a v a i l a b l e , t o g e t h e r w i t h t h e c o r r e s p o n d -i ng v a l u e s o f d e t e r m i n i n g v a r i a b l e s x , and i f t h e v a r i a n c e o fy i s s e n s i b l y h o m o g e n e o u s over t h e s e r i e s o f o b s e r v a t i o n s ,a r e g r e s s i o n f u n c t i o n Y ( x ) i s f i t t e d t o t h e d a t a so t h a t t h esum o f s q u a r e s o f d e v i a t i o n s o f t h e o b s e r v a t i o n s y f r o m t h ef i t t e d f u n c t i o n , E ( y Y ) 2 , i s as small as p o s s i b l e ( t h em e t h o d o f l e a s t s q u a r e s ) .T h e s e r i e s o f o b s e r v a t i o n s may no t b e h o m o g e n e o u s i nv a r i a n c e , h o w e v e r . I t may b e t h a t a 2 v a r i e s s y s t e m a t i c a l l yw i t h e , , o r t h a t t h e o b s e r v a t i o n s a r e o f i n t r i n s i c a l l y d i f f e r i n ga c c u r a c y on a c c o u n t o f t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e . I t i se v i d e n t t h a t some account m u st b e t a k e n o f t h e d i f f e r i n ga c c u r a c i e s i n f i t t i n g t h e r e g r e s s i o n f u n c t i o n , and t h ea p p r o p r i a t e m e t h o d i s t o f i t t h e f u n c t i o n so t h a t t h ew e i g h t e d sum o f squares o f d e v i a t i o n s , T . w ( y Y ) 2 , i s am i n i m u m , t h e r e l a t i v e w e i g h t s wb e i n g t h e r e l a t i v e am o un tso f ' i n f o r m a t i o n ' a n d i n v e r s e l y p r o p o r t i o n a l , i n t h i s con-t e x t , t o t h e v a r i a n c e s o f t h e y v a l u e s . ( T h e more g e n e r a ld e f i n i t i o n o f ' i n f o r m a t i o n ' i s g i v e n by F i s h e r , 1 9 2 5 . )T h e w e i g h t e d - r e g r e s s i o n p r o c e d u r e i s e q u i v a l e n t t of i t t i n g an u n w e i g h t e d r e g r e s s i o n t o an e n l a r g e d s e t o fp o i n t s , e a c h p o i n t o f t h e o r i g i n a l s e t b e i n g r e p e a t e d t h ea p p r o p r i a t e w t i m e s . The e s s e n t i a l d i f f e r e n c e s , t h e r e f o r e ,a r e t h a t w e i g h t e d r a t h e r t h a n s i m p l e means o f o b s e r v a t i o n sa r e c a l c u l a t e d a n d l i k e w i s e w e i g h t e d sums o f squares andp r o d u c t s . D e t a i l s o f t h e w e i g h t e d a n a l y s e s are s e t o u tb e l o w f o r t h e t w o cases r e l e v a n t t o t h i s paper, i n w h i c h t h et r u e r e g r e s s i o n i s l i n e a r and d e p e n d e n t on e i t h e r one or t w od e t e r m i n i n g v a r i a b l e s :

( i ) U V =a +f x ,( i i ) U V x + x 1 X l+ 2 X 2

C a s e ( i ) . T h e f i t t e d r e g r e s s i o n i s o f t h e f o r m Y =a + b x .T h e w e i g h t e d means a r eN =E w x / E w , y =X w y / E w ,

a n d t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t b a nd t h e c o ns t a ntt e r m a a r e g i v e n by t h e f o r m u l a e :b Y - w ( x x l ) ( y y ) _wxy ( E w x ) ( Y w y ) / Y w

E w ( x X l ) 2 Zwx2 ( E w x ) 2 1 / Wa = b x .

I f t h e v a r i a n c e s o f t h e o b s e r v a t i o n s y a r e a 2 / W , t h e v a r i a n c ef a c t o r a 2 i s e s t i m a t e d b y t h e r e s i d u a l mean squa re,

2 _ W ( y -Y ) 2 _ u y 2 - y z w y - b Z w ( x -) ( y -)n-2 n-2t h e d i v i s o r o f t h e sum o f s q u a r e s o f d e v i a t i o n s ( o r r e s i d u a lsum o f s q u a r e s ) b e i n g t h e number o f d e g r e e s o f f r e e d o m o ft h e e s t i m a t e d v a r i a n c e , t w o l e s s t h a n t h e number o f

o b s e r v a t i o n s i n t h i s i n s t a n c e . T h e v a r i a n c e s o f a a n d b a r eg i v e n by t h e f o r m u l a e :V ( b ) = a ' / E w ( x - i 7 ,V ( a ) = a u [ 1/w+ V l / E w ( X -

t h e l a t t e r f o l l o w i n g f r o m ( 4 ) a b o v e s i n c e i t ma y b e e a s i l ys h o w n t h a t b a n d y a r e s t a t i s t i c a l l y i n d e p e n d e n t . E s t i -m a t e d v a r i a n c e s a r e o b t a i n e d b y s u b s t i t u t i n g 8 2 f o r a 2 .C a s e ( i i ) . T h e f i t t e d r e g r e s s i o n i s o f t h e f o r mY = a + b l x L + b 2 x .

W e i g h t e d means y , i - ,1, a r e c a l c u l a t e d a s i n ( i ) a b o v e . T w oe q u a t i o n s a r e o b t a i n e d f o r t h e r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t s b ,a n d b a , a , , b + a 1 2 b 2 = P Ia 1 2 b , + a 2 2 b 2 = P 2 'w h e r ea , , = Y w ( x l - X 1 ) 2 , a . 2 = E W ( X - 5 i ) ( X 2 - X 2 ) ,a 2 2 = v W ( x 2 - x )

p i = Y 2 W ( x 1 - L ) Y , P a = Y 2 w ( X 2 - x 2 ) yT h e s o l u t i o n s o f t h e e q u a t i o n s a r e

b , = C l l P + C 1 2 P 2 ,b 2 = C 1 2 P I +C22 P 2 ,w h e r e

c l , = a 2 2 / A , C 2 2 = a , , / A , C a H = - a , 2 / Aa n d A = a l l a 2 2 - a hT h e c o n s t a n t t e r m i s

a = b l x l - b 2 x 2S i m i l a r l y , a s i n ( i ) a b o v e , t h e v a r i a n c e f a c t o r a 2 i s e s t i m a t e db y t h e r e s i d u a l mean s q u a r e :

9 2 -_w(y - Y ) 2 - 2 w y 2 - wy - b 2 p 1 - b 2 P 2n-3 n-3T h e v a r i a n c e s a n d c o v a r i a n c e s o f t h e r e g r e s s i o n s t a t i s t i c sa r e

V ( b l ) = C l a 2 , C o v . ( b , , b 2 ) = 1 2 a , C o V . ( b l , y ) = 0 ,V ( b 2 ) =c 2 2 a 2 , C o v . b 2 aV ( a ) =a2 i/IWCXI+ C 2 2 X + 2 C I 2 1x 2 )

O m i s s i o n o f t h e c o n s t a n t t e r m . I f i t i s known t h a t t h et r u e r e g r e s s i o n p a s s e s t h r o u g h t h e o r i g i n ( a = 0 ) , t h ef i t t e d r e g r e s s i o n s h o u l d b e l i k e w i s e c o n s t r a i n e d ( a = 0 ) .T h e e s s e n t i a l m o d i f i c a t i o n o f t h e f o r m u l a e g i v e n a b o v e f o rt h i s c a s e i s t h a t c r u d e sums o f s q u a r e s a n d p r o d u c t s s u c h a sZ w X 2 , Z w x y a r e s u b s t i t u t e d e v e r y w h e r e f o r t h e c o r r e c t e ds u m s o f s q u a r e s a n d p r o d u c t s Z w ( x - x ) 2 e t c . I n t h ef o r m u l a e f o r t h e r e s i d u a l mean s q u a r e s , 8 , t h e c o r r e c t i o nf a c t o r y y u n j i s o m i t t e d a n d t h e d e g r e e s o f f r e e d o m a r ec o r r e s p o n d i n g l y i n c r e a s e d b y u n i t y t o ( i ) n - 1 , ( i i ) n - 2 .U s e o f e s t i m a t e d w e i g h t s . T h e r e l a t i v e w e i g h t s w ma y n o tb e known e x a c t l y , s o t h a t a n a p p r o x i m a t e a n a l y s i s must b ep e r f o r m e d w i t h e s t i m a t e d w e i g h t s . I n some s i t u a t i o n s amore a c c u r a t e a n a l y s i s ma y t h e n b e o b t a i n e d b y r e p e a t i n gt h e p r o c e s s w i t h i m p r o v e d e s t i m a t e s o f t h e w e i g h t ss u p p l i e d b y t h e f i r s t a n a l y s i s . M o r e t h a n a s i n g l e r e p e t i t i o no f t h e p r o c e s s i s s e l d o m n e c e s s a r y , h o w e v e r , e x c e p t a s ac h e c k .N o n - l i n e a r r e g r e s s i o n f u n c t i o n s . T h e s e can b e f i t t e d , w i t hl i t t l e e x t r a c o m p l i c a t i o n , b y l i n e a r - r e g r e s s i o n m e t h o d s ; t h ee s s e n t i a l d i f f e r e n c e i s t h a t p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f c e r t a i n

1 9 6 12 6

8/13/2019 biochemj00812-0107

4/9

STATISTICAL ESTIMATIONS IN ENZYME KINETICSo f t h e u r n k n o w n p a r a m e t e r s a r e r e q u i r e d . I f a f u n c t i o nf ( x , c ) i s n o n - l i n e a r i n a p a r a m e t e r c w h o s e v a l u e i s t o b ee s t i m a t e d , a n d i f a g o o d p r o v i s i o n a l v a l u e c o i s a v a i l a b l e ,t h e f o l l o w i n g l i n e a r a p p r o x i m a t i o n ma y b e u s e d :

f ( X , c ) f ( x , c o ) + ( c - c o ) f c ( x , c o ) ,w h e r e f C i s t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f f w i t h r e s p e c t t o c ,e v a l u a t e d h e r e a t c o , a n d a l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s , i nt e r m s o f t h e p r o v i s i o n a l v a l u e s o f f a n d f C c o r r e s p o n d i n g t ot h e v a l u e s o f x , d e t e r m i n e s c - c o a s a l i n e a r r e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t . I n t h i s s e n s e t h e p r o c e s s ma y b e d e s c r i b e d a s a' f i n e a d j u s t m e n t ' o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e c o . A m o r ea c c u r a t e a n a l y s i s c a n b e o b t a i n e d , i f n e c e s s a r y , b y r e p e a t i n gt h e p r o c e s s w i t h t h e a d j u s t e d e s t i m a t e a s a new p r o v i s i o n a lv a l u e . T h e e x t e n s i o n o f t h e m e t h o d f o r a f u n c t i o n n o n -l i n e a r i n t w o o r m o r e p a r a m e t e r s i s s t r a i g h t f o r w a r d .

A p p l i c a t i o n sE 8 t i m a t i o n o f Km and V . The M i c h a e l i s - M e n t e nr e l a t i o n b e t w e e n v e l o c i t y o f r e a c t i o n ( v ) o f anenzyme w i t h a s u b s t r a t e and t h e s u b s t r a t e c o n c e n -t r a t i o n ( 8 ) ,

v= 8 V ,+ Kc a n b e e x p r e s s e d i n t h e l i n e a r f o r m s

1 1 Km l 8 K m 8 _-+-.-_ or - - -V V V 8 V V VWith t h e u s u a l m e t h o d s o f d e t e r m i n i n g v e l o c i t i e so f r e a c t i o n , a s d e s c r i b e d i n t h e p r e c e d i n g p a p e r( A t k i n s o n e t a l . 1 9 6 1 ) , t h e v e l o c i t y d e t e r m i n a t i o n sw i l l b e r e a s o n a b l y h o m o g e n e o u s i n v a r i a n c e . I f vh a s v a r i a n c e a 2 , t h e v a r i a n c e s o f l / v , 8 / v a r eV ( 1 / v ) = U 2 / p 4 , V ( 8 / v ) = a 2 8 2 / p ( c f . e q u a t i o n 6 ) .I n f i t t i n g t h e a b o v e l i n e a r f o r m s , t h e r e f o r e , t h ec o r r e c t r e l a t i v e w e i g h t s a r e p 4 and 1 4 / 8 2 r e s p e c -t i v e l y f o r t h e t w o t y p e s o f f i t .As t h e t r u e v e l o c i t i e s p t , 8 ) a r e u n k n o w n , p r o -v i s i o n a l f i t s o f t h e l i n e s c a n b e o b t a i n e d b y u s i n go b s e r v e d v e l o c i t i e s v , w h i c h s u p p l y w e i g h t s v 4 a n dv 4 / 8 2 r e s p e c t i v e l y . I n t h e c a s e o f t h e d o u b l e r e -c i p r o c a l p l o t t h e w e i g h t e d means a r e

( l / V ) = X v S / Y V 4 , ( 1 / 8 ) = ( Z V 4 / 8 ) / Z V 4 ,and t h e w e i g h t e d f i t o f t h e s t r a i g h t l i n e

l / v = a + b ( 1 / 8 )a s d e s c r i b e d a b o v e l e a d s , w i t h some s i m p l i f i c a t i o n ,t o t h e f o r m u l a e f o r p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f Km andV g i v e n i n T a b l e 1 . The same f o r m u l a e a r e o b -t a i n e d w h i c h e v e r l i n e a r f o r m i s f i t t e d , t h e w e i g h t e da n a l y s e s b e i n g e q u i v a l e n t .F i n e a d j u s t m e n t o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s ma yb e o b t a i n e d by f i t t i n g t h e M i c h a e l i s - M e n t e nf u n c t i o n d i r e c t l y i n t h e h y p e r b o l i c f o r m , w i t h anu n w e i g h t e d a n a l y s i s . T h i s p r o c e s s i s p r e f e r a b l e t ot h a t o f r e f i t t i n g t h e f u n c t i o n i n o n e o f t h e l i n e a rf o r m s a b o v e w i t h r e v i s e d e s t i m a t e s o f t h e r e l e v a n tw e i g h t s , s i n c e n o t o n l y a r e t h e c a l c u l a t i o n s s i m p l e r

b u t s t a n d a r d e r r o r s f o r t h e e s t i m a t e s a r e d e r i v e dmore d i r e c t l y . I n t e r m s o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i -m a t e s K , V O , t h e M i c h a e l i s - M e n t e n r e l a t i o n canb e e x p r e s s e d i n t h e a p p r o x i m a t e l i n e a r f o r m :V 8 V 0 8 V 0V {-+K(Km-K ) ( 8 + K O ) 2 '

b ,f ( 8 ) + b 2 f ; ( 8 ) ,w h e r e b , = V / V O , b 2 = b1(Km-KO ) , f ( 8 ) i s t h ep r o v i s i o n a l f i t o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n f u n c t i o n ,and f , ( 8 ) i s t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f t h e p r o v i s i o n a lf i t w i t h r e s p e c t t o Km. The p r o b l e m i s t h u s r e d u c e dt o t h a t o f f i t t i n g a b i l i n e a r r e g r e s s i o n ( w i t h o u t ac o n s t a n t t e r m ) a s d e s c r i b e d a b o v e . The c o m p u t a -t i o n a l p r o c e d u r e i s s e t o u t i n T a b l e 2 .The s t a n d a r d e r r o r s f o r V and Km a r e d e r i v e df r o m t h o s e f o r b L and b 2 by a p p l i c a t i o n o f t h e r u l e s( 2 ) and ( 9 ) . I n p a r t i c u l a r ,

S . E . ( K m ) = s . E . ( b 2 ) / b l ,s i n c e t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n o f t h e f a c t o r b , i sn e g l i g i b l e i n c o m p a r i s o n w i t h t h a t f o r Km- K .Use o f t h e p r o v i s i o n a l v a l u e V O i s n o t s t r i c t l yn e c e s s a r y s i n c e i t c a n c e l s b o t h i n b l , f and i n b 2 , f The a d v a n t a g e s a r e , h o w e v e r , t h a t d i r e c t c o m -p a r i s o n o f t h e p r o v i s i o n a l l y d e t e r m i n e d v e l o c i t i e sw i t h t h o s e o b s e r v e d p r o v i d e s a u s e f u l c h e c k f o ra r i t h m e t i c a l e r r o r s , and t h a t b 2 i s a l m o s t e x a c t l yt h e f i n e a d j u s t m e n t f o r Km. With r e p e t i t i o n o f t h ep r o c e s s , b , and b 2 t e n d t o u n i t y and z e r o r e s p e c -t i v e l y .E 8 t i m a t i o n o f d i 8 8 o c i a t i o n c o n s t a n t s . Th e e s t i m a -t i o n o f d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f r o m a s e r i e s o fd e t e r m i n a t i o n s o f Km c o r r e s p o n d i n g t o a r a n g e o fv a l u e s o f s u b s t r a t e pH i s d i s c u s s e d b e l o w . Thea p p r o p r i a t e r e l a t i o n o f Km t o h y d r o g e n - i o n c o n c e n -t r a t i o n H w h i c h must b e f i t t e d i s

Km = Km(1+K-)IH)i n w h i c h k m i s t h e a s y m p t o t i c a l l y minimum v a l u ef o r K i n and K 1 , K2 t h e r e l e v a n t d i s s o c i a t i o n c o n -s t a n t s . E x p r e s s e d e q u i v a l e n t l y a s

Km = a + b H + b 2 ( 1 / H ) ,t h e f u n c t i o n i s i n t h e f o r m o f a l i n e a r r e g r e s s i o n ,t h e d e t e r m i n i n g v a r i a b l e s b e i n g x l = H , X 2 = 1 / H .A w e i g h t e d f i t o f t h e r e g r e s s i o n i s n e c e s s a r y ona c c o u n t o f t h e v a r i a t i o n i n p r e c i s i o n o f t h e d e t e r -m i n a t i o n s o f K m . The e s t i m a t e s o f K1 and K2d e r i v e d f r o m a , b l , and b 2 a r e i n t h i s i n s t a n c er e g a r d e d a s p r o v i s i o n a l s i n c e a r e v i s i o n o f t h er e l a t i v e w e i g h t s i s n e c e s s a r y .F o r f i n e a d j u s t m e n t o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e si t i s a p p r o p r i a t e , i n t h i s c a s e , t o f i t t h e K m ( H )f u n c t i o n i n t h e n e g a t i v e - l o g a r i t h m o r pKm f o r m .I n t e r m s o f t h e p r o v i s i o n a l v a l u e s K c a l c u l a t e df r o m t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f K 1 , K 2 and K i n ,

V o l . 8 0 3 2 7

8/13/2019 biochemj00812-0107

5/9

G . N. WILKINSONt h e f u n c t i o n c a n b e e x p r e s s e d i n t h e a p p r o x i m a t el i n e a r f o r mp ( K m I K . - K / ) K + H

+ p ( K 2 / K H ) 1/Hl / K 2 I K O + I / H 's o t h a t t h e p r o b l e m i s a g a i n r e d u c e d t o t h a t o ff i t t i n g o f a l i n e a r r e g r e s s i o n , t h e c o n s t a n t t e r m andt h e r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t s b e i n g t h e r e q u i r e da d j u s t m e n t s f o r p K , p K l 1 and p K . The d e t e r m i n -i n g v a r i a b l e s a r e t h e p a r t i a l d e r i v a t i v e s o f t h ep r o v i s i o n a l l y f i t t e d pKm f u n c t i o n w i t h r e s p e c t t op K l 1 , p K 2 . The r e g r e s s i o n c a l c u l a t i o n s s u p p l y t h es t a n d a r d e r r o r s o f p K m , p K l and pK2 d i r e c t l y .C o m b i n e d e s t i m a t e s o f v a r i a b i l i t y . I n a s e r i e s o fs i m i l a r e x p e r i m e n t s t h e b a s i c e x p e r i m e n t a l v a r i -a b i l i t y ma y b e s e n s i b l y h o m o g e n e o u s , i n w h i c h c a s ea more a c c u r a t e e s t i m a t e o f v a r i a n c e ma y b e o b -t a i n e d b y c a l c u l a t i n g a w e i g h t e d a v e r a g e o f t h ee s t i m a t e s f r o m i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s . The i n d i -v i d u a l e s t i m a t e s a r e w e i g h t e d a c c o r d i n g t o t h e i rd e g r e e s o f f r e e d o m , s o t h a t t h e w e i g h t e d a v e r a g e i st h e r a t i o o f t h e p o o l e d ( o r a d d e d ) r e s i d u a l sums o fs q u a r e s f r o m t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s t o t h et o t a l number o f d e g r e e s o f f r e e d o m . I n t h e p r e -c e d i n g p a p e r ( A t k i n s o n e t a l . 1 9 6 1 ) a p o o l e d e s t i -mate o f t h e v a r i a n c e o f v e l o c i t y d e t e r m i n a t i o n swa s o b t a i n e d i n t h i s w a y f r o m 1 7 e x p e r i m e n t s ,w i t h a t o t a l o f 6 6 d e g r e e s o f f r e e d o m .

R o u n d i n g - o f f e r r o r sThe a r i t h m e t i c p r o c e s s o f r o u n d i n g o f f t o a g i v e nnumber o f f i g u r e s c a u s e s an a r t i f i c i a l i n c r e a s e i n t h ev a r i a n c e o f c o m p u t e d q u a n t i t i e s , w h i c h must b ek e p t a s s m a l l a s p r a c t i c a b l e t o a v o i d a p p r e c i a b l el o s s o f i n f o r m a t i o n . Th e i n c r e a s e i n v a r i a n c e o f aq u a n t i t y d u e t o r o u n d i n g o f f i s c 2 / 1 2 , w h e r e c i s t h er o u n d i n g - o f f i n t e r v a l . A s i m p l e r u l e i s t o r e t a i n , i nr o u n d i n g o f f , t h e f i r s t t w o f i g u r e s t h a t a r e a f f e c t e dby e x p e r i m e n t a l v a r i a b i l i t y . Thus i f a q u a n t i t y h a st h e v a l u e 0 - 1 2 3 4 5 s a y , a nd t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h eq u a n t i t y i s 0 0 0 3 , t h e s e c o n d d e c i m a l d i g i t ma y b e

i n e r r o r by u n i t y and t h e t h i r d i s a p p r e c i a b l ya f f e c t e d . The v a r i a n c e o f t h e r o u n d e d - o f f q u a n t i t y0 - 1 2 3 i s ( 0 . 0 0 3 ) 2 + ( 0 . 0 0 1 ) 2 / 1 2 , i n w h i c h c a s e t h er e l a t i v e l o s s o f i n f o r m a t i o n i s 1 / 1 0 9 , o r l e s s t h a n1 . I f t h e s t a n d a r d e r r o r had b e e n much l e s s t h a n0 - 0 0 3 , t h e f o u r t h d e c i m a l s h o u l d a l s o h a v e b e e nr e t a i n e d , a n d , i n t h e a b s e n c e o f any p r e c i s e know-l e d g e o f e x p e r i m e n t a l v a r i a b i l i t y , r e t e n t i o n o f a ne x t r a f i g u r e i s a d e s i r a b l e s a f e g u a r d .A number o f a s p e c t s h a v e n o t b e e n m e n t i o n e dh e r e , s u c h a s t h e c a l c u l a t i o n o f p r o b a b i l i t i e s ,s i g n i f i c a n c e t e s t s and f i d u c i a l o r c o n f i d e n c e l i m i t s .A more d e t a i l e d a c c o u n t o f g e n e r a l p r i n c i p l e s andm e t h o d s i s g i v e n by F i s h e r ( 1 9 2 5 ) , and o f r e g r e s s i o nm e t h o d s b y W i l l i a m s ( 1 9 5 9 ) .

ENZYME KINETI C DETERMINATIONSE s t i m a t i o n o f Km a n d V

The p r o c e d u r e s e t o u t b e l o w f o r e s t i m a t i n g t h ek i n e t i c p a r a m e t e r s Km and V o f t h e M i c h a e l i s -Menten e q u a t i o n c o n s i s t s o f t w o s t a g e s , t h e c a l c u -l a t i o n o f p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s , and t h e f i n e a d j u s t -ment o f t h e p r o v i s i o n a l v a l u e s , t h e l a t t e r s t a g e a l s os u p p l y i n g s t a n d a r d e r r o r s f o r t h e e s t i m a t e s . Al o c a l l y d e f i n e d n o t a t i o n i s u s e d t o d e s c r i b e e a c hs t e p o f t h e c o m p u t a t i o n s i n t e r m s o f t h e p r e c e d i n gc o m p u t a t i o n s ; c o n s e q u e n t l y some s y m b o l s , s u c h a sa , f , y , . . . , o c c u r w i t h d i f f e r e n t m e a n i n g s i n e a c hs t a g e . N u m e r i c a l i l l u s t r a t i o n o f t h e c a l c u l a t i o n s i sg i v e n i n p a r a l l e l , w i t h d a t a f r o m A t k i n s o n e t a l .( 1 9 6 1 ) .

P r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f Km a n d V . ( i ) G r a p h i c a l .A number o f g r a p h i c a l m e t h o d s f o r d e t e r m i n i n gKm and V h a v e b e e n s u g g e s t e d , b a s e d on v a r i o u sl i n e a r f o r m s o f t h e M i c h a e l i s - M e n t e n r e l a t i o n( s e e Dixon & Webb, 1 9 5 8 ) . Of t h e two l i n e a r f o r m s :

1 1 Km 1 8 Km 8v V V 8 ' v V V '

t h e d o u b l e r e c i p r o c a l f o r m ( L i n e w e a v e r & B u r k ,1 9 3 4 ) i s t h e more commonly u s e d . H o w e v e r ,s t a t i s t i c a l c o n s i d e r a t i o n s s u g g e s t t h a t more a c c u r -a t e s u bj e c t i v e e s t i m a t e s c a n b e o b t a i n e d by f i t t i n gt h e a l t e r n a t i v e f o r m l i n e a r i n s / v and 8 . A s s u m i n gt h a t v i s r e a s o n a b l y h o m o g e n e o u s i n v a r i a n c e ,t h e r e c i p r o c a l l / v e x h i b i t s much g r e a t e r v a r i a t i o ni n a c c u r a c y o v e r t h e p r a c t i c a l r a n g e s o f s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n t h a n d o e s s / v . T h i s i s i l u s t r a t e di n F i g . 2 , w h i c h s h o w s t h e v a r i a t i o n s i n t h e r e l a t i v ew e i g h t s ( r e c i p r o c a l s o f v a r i a n c e ) o f l / v and s / v .( T h e s c a l e s a r e a r b i t r a r y f o r e a c h w e i g h t f u n c t i o n . )

' 5

06 >

1 1 1 / 3 1 / 2 2 / 3 1 3 / 2 2 38 / K m

F i g . 2 . V a r i a t i o n i n r e l a t i v e w e i g h t s o f l l v a n d s / v o v e r ar a n g e o f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s ( l o g a r i t h m i c s c a l e s ) .

3 2 8 1 9 6 1

8/13/2019 biochemj00812-0107

6/9

STATISTICAL ESTIMATIONS IN ENZYME KINETICSO v e r t h e r a n g e o f s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n fromo n e - t h i r d t o t h r e e t i m e s t h e Ki, t h e r e l a t i v ew e i g h t o f l / v v a r i e s b y a f a c t o r o f 8 0 , w h e r e a s t h er e l a t i v e w e i g h t o f s / v v a r i e s by l e s s t h a n a f a c t o ro f 2 . I f a s t a t i s t i c a l a n a l y s i s w e r e c a r r i e d o u t w i t ht h e c o r r e c t w e i g h t s , i d e n t i c a l a nd h e n c e e q u a l l yp r e c i s e e s t i m a t e s would b e o b t a i n e d w i t h e i t h e r f i t .H o w e v e r , a p p r e c i a b l e d e v i a t i o n s , o f w h a t e v e rk i n d , from c o r r e c t w e i g h t i n g w i l l r e s u l t i n l e s sa c c u r a t e e s t i m a t e s o f Km and V , and w i t h s u b -j e c t i v e f i t t i n g i t would seem m u c h more d i f f i c u l t t ot a k e p r o p e r a c c o u n t o f t h e v a r i a t i o n i n w e i g h tw hen t h i s i s e x t r e m e t h a n when i t i s r e l a t i v e l ys l i g h t , a s w i t h s / v .A t h i r d l i n e a r form d i s c u s s e d by H o f s t e e ( 1 9 5 2 ) ,v = V - K M V I s , s u f f e r s t o a l e s s e x t e n t f r o m t h esame s t a t i s t i c a l d i s a d v a n t a g e a s t h e d o u b l e r e -c i p r o c a l f o r m , w i t h t h e a d d e d c o m p l i c a t i o n t h a tb o t h t h e v a r i a b l e s a r e a f f e c t e d by t h e e x p e r i m e n t a lv a r i a b i l i t y i n v . H o f s t e e s u g g e s t s t h a t a c e r t a i nt y p e o f n o n - l i n e a r i t y i s more r e a d i l y d e t e c t a b l ew i t h t h e t h i r d l i n e a r f o r m , b u t t h i s argument ma yb e q u e s t i o n e d .( i i ) S t a t i s t i c a l . A l t h o u g h i n any c a s e i t ma y b en e c e s s a r y t o d e t e r m i n e a g r a p h i c a l p l o t i n o r d e r t od e t e c t s i g n i f i c a n t e x p e r i m e n t a l a b e r r a t i o n s , s u c ha s i n h i b i t i o n b y an e x c e s s o f s u b s t r a t e ( D i x o n Webb, 1 9 5 8 ) , s t a t i s t i c a l l y - d e t e r m i n e d p r o v i s i o n a le s t i m a t e s t a k e l i t t l e t i m e t o c o m p u t e , and t h e i rg r e a t e r a c c u r a c y i m p r o v e s t h e a c c u r a c y o f t h e f i n e -a d j u s t m e n t p r o c e s s . The c a l c u l a t i o ns a r e s e t o u t i nT a b l e 1 , t h e r e l e v a n t f o r m u l a e b e i n g d e r i v e d by t h ew e i g h t e d f i t o f a l i n e a r r e g r e s s i o n , a s d e s c r i b e d i nan e a r l i e r s e c t i o n .With a s t a n d a r d d e s k c a l c u l a t o r , x = v 2 ma y b el e f t i n t h e m a c h i n e and t h e d i v i s i o n b y s p e r f o r m e da f t e r r e c o r d i n g x . F o r t h e a c c u r a c y w i t h w h i c h v i s

T a b l e 1 . C a l c u l a t i o n o f p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o fKm a n d V

F o r d e t a i l s , s ee t e x t ; i l l u s t r a t i v e v a l u e s are f r o m d a t a o fA t k i n s o n e t a l . ( 1 9 6 1 ) .s (pH 4 9 5 ) * V t

0 - 1 3 8 0 * 1 40 * 2 2 0 0 - 1 70 - 2 9 1 0 - 2 30 - 5 6 0 0 - 3 20 - 7 6 6 0 - 3 91 - 4 6 0 0 4 9a =E v x =0 - 2 3 4 1 8 4

=2 x = 0 * 0 9 7 5 2 8y =I v y =. 3 1 0 3 0 38 =E x y =0 - 1 0 7 9 1 6e =j y 2 =0 . 1 8 0 4 4 0

7 13 43 4'3

x=v2 =2/s0 - 0 2 2 0 - 1 5 90 - 0 2 9 0 - 1 3 30 . 0 5 5 0 - 1 8 80 - 1 0 5 0 - 1 8 70 - 1 5 2 0 * 1 9 90 - 2 4 3 0 - 1 6 6

A=o c L - y S =- 0 0 8 7 6 9 5Km=( f y - o c 8 ) / A =0 - 5 6 9 *V=( 8 E - 8 2 ) / A =0-679t

* C o n e n . o f n i c o t i n a m i d e m o n o n u c l e o t i d e , mm.t j u m o l e s o f n i c o t i n a m i d e - a d e n i n e d i n u c l e o t i d e f o r m e d /

3 m i n . / m g . o f enzyme p r o t e i n .

d e t e r m i n e d by c u r r e n t e x p e r i m e n t a l m e t h o d s ,r e c o r d i n g o f s and v t o 3 s i g n i f i c a n t f i g u r e s ( a n dl i k e w i s e t h e c o l u m n s x a nd y ) i s q u i t e a d e q u a t e .However, t h e sums o f s q u a r e s and p r o d u c t s s h o u l db e r e c o r d e d t o t h e f u l l a c c u r a c y o f 6 o r 7 s i g n i f i c a n tf i g u r e s , s i n c e 2 o r 3 s i g n i f i c a n t f i g u r e s ma y b e l o s t bys u b t r a c t i o n when c o m p u t i n g A a nd t h e n u m e r a t o r so f K m i , V .F i n e a d j u s t m e n t o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s . T h i sp r o c e s s i s b a s e d on f i t t i n g a b i l i n e a r r e g r e s s i o n o f von t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e s o f t h e p r o v i s i o n a l l yf i t t e d M i c h a e l i s - M e n t e n f u n c t i o n a nd i t s f i r s td e r i v a t i v e , a s d e s c r i b e d a b o v e . Th e c a l c u l a t i o n sa r e s e t o u t i n T a b l e 2 , t o g e t h e r w i t h t h e s u p p l e -mentary c a l c u l a t i o n s f o r d e t e r m i n i n g s t a n d a r de r r o r s , t h e n u m e r i c a l i l l u s t r a t i o n c o n t i n u i n g fromT a b l e 1 .The i n s t r u c t i o n s i n r e g a r d t o a c c u r a c y a r e e s s e n t i -a l l y t h e same a s f o r T a b l e 1 . I t i s even m o r ei m p o r t a n t h e r e t o r e c o r d t h e i n t e r m e d i a t e c a l c u l a -t i o n s , and h e n c e b 1 and b 2 , w i t h g r e a t a c c u r a c y ,s i n c e t h e r e s i d u a l s u m o f s q u a r e s i s no t c a l c u l a t e dd i r e c t l y a s a s u m o f s q u a r e s o f d e v i a t i o n s , b u t b yt h e i n d i r e c t p r o c e s s o f s u b t r a c t i o n from E v 2 , i nw h i c h u p t o 3 o r 4 s i g n i f i c a n t f i g u r e s ma y b e l o s t .

E s t i m a t i o n o f d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t sThe k i n d o f s t a t i s t i c a l a n a l y s i s r e q u i r e d i si l l u s t r a t e d h e r e w i t h t h e a n a l y s e s a p p l i e d t o t h ed a t a o f A t k i n s o n e t a l . ( 1 9 6 1 ) . T h e s e a u t h o r sd e t e r m i n e d Km v a l u e s i n a s e r i e s o f e x p e r i m e n t sw i t h s u b s t r a t e pH v a r y i n g f r o m 4 - 9 5 t o 1 0 - 5 5 , and

i n e s t i m a t i n g d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r t h e enzymeand s u b s t r a t e f r o m t h e s e d a t a t h e a p p r o p r i a t ef u n c t i o n t o b e f i t t e d , r e l a t i n g K m t o h y d r o g e n - i o nc o n c e n t r a t i o n H, w a s

KmKm(1+ ) (1+X)K1 and K2 b e i n g t h e r e l e v a n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s( c f . Dixon & Webb, 1 9 5 8 ) . The b a s i c d a t a f o r t h ec a l c u l a t i o n s d e s c r i b e d h e r e a r e p r e s e n t e d i nT a b l e 3 , e x c l u d i n g an a b e r r a n t K m d e t e r m i n a t i o n a tpH 9 7 7 ( s e e b e l o w ) .C o n s i d e r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e( A t k i n s o n e t a l . 1 9 6 1 ) s u g g e s t e d t h a t t h e K md e t e r m i n a t i o n s would b e s u b j e c t i n d i v i d u a l l y t ob i a s e s f l u c t u a t i n g from e x p e r i m e n t t o e x p e r i m e n t ,o r , d i f f e r e n t l y e x p r e s s e d , t h a t t h e i n t e r - e x p e r i -m e n t a l v a r i a b i l i t y o f t h e Km v a l u e s would b eg r e a t e r t h a n i n d i c a t e d by t h e i r i n t r a - e x p e r i m e n t a l ,o r i n t e r n a l v a r i a n c e . T h i s a d d i t i o n a l s o u r c e o fv a r i a t i o n had t o b e t a k e n i n t o a c c o u n t , p a r t i c u -l a r l y i n a s s e s s i n g t h e p r e c i s i o n o f t h e f i n a l e s t i m a t e so f K1 and K2 . I n t h e a c t u a l e s t i m a t e s o f K1 and K 2 ,h o w e v e r , i t w as e x p e c t e d t h a t t h e n e t e f f e c t o fb i a s w o u l d b e v e r y s m a l l , s i n c e t h e d a t a t h e m s e l v e se x h i b i t e d no e v i d e n c e o f a s y s t e m a t i c d e v i a t i o n

V o l . 8 0 3 2 9

8/13/2019 biochemj00812-0107

7/9

G . N . WIL KIN S O Nf r o m t h e t h e o r e t i c a l f o r m o f t h e Km(H) f u n c t i o n a sg i v e n a b o v e , and t h a t any s y s t e m a t i c b i a s w o u l db e m o s t l y a b s o r b e d i n t h e e s t i m a t e o f t h e c o n s t a n tK m .I t wa s a l s o e v i d e n t t h a t t h e b i a s e s would b ee s s e n t i a l l y o f a m u l t i p l i c a t i v e k i n d i n t h e i r e f f e c t ont h e Km v a l u e s , s o t h a t t h e v a r i a n c e o f t h e i n t e r -

e x p e r i m e n t a l f l u c t u a t i o n s i n b i a s w o u l d b e e s s e n t i -a l l y h o m o g e n e o u s o n a l o g a r i t h m i c s c a l e . I t w a st h u s a p p r o p r i a t e t o f i t t h e Km f u n c t i o n above i n t h e n e g a t i v e l o g a r i t h m i c f o r m p K m .P r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f K 1 , K2 and Km w e r ed e r i v e d by f i t t i n g a w e i g h t e d b i l i n e a r r e g r e s s i o no f Km on H and 1 / H . The a p p r o p r i a t e w e i g h t s

T a b l e 2 . F i n e a d j u s t m e n t o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s o f Km and VF o r d e t a i l s , s e e t e x t ; i l l u s t r a t i v e c a l c u l a t i o n s c o n t i n u e f r o m T a b l e 1 . P r o v i s i o n a l e s t i m a t e s : K = 0 - 5 6 9 , *V O = 0 - 6 7 9 t ( Ta b l e 1 ) .

3 *0 - 1 3 80 - 2 2 00 - 2 9 10 - 5 6 00 - 7 6 61 - 4 6 0

V t0 - 1 4 80 - 1 7 10 - 2 3 40 - 3 2 40 - 3 9 00 - 4 9 3

8 + K R 0 - 7 0 70 - 7 8 90 - 8 6 01 - 1 2 91 - 3 3 52 - 0 2 9

f V 0 8 / ( 8 +K) f = - +K t0 - 1 3 2 5 - 0 - 1 8 7 40 - 1 8 9 3 - 0 - 2 4 0 00 - 2 2 9 8 - 0 - 2 6 7 20 - 3 3 6 8 - 0 - 2 9 8 30 - 3 8 9 6 - 0 - 2 9 1 80 - 4 8 8 6 - 0 - 2 4 0 8

X= f 2 = 0 - 6 1 0 1 5 1 1 . y = F 2 f f = - 0 - 4 6 3 4 7 2 7 . 8 = E v f 0 - 6 0 7 7 0 0 5 .p = - f , 2= 0 - 3 9 6 2 2 9 4 . e = E v f = - 0 - 4 6 0 4 6 5 6 .A = c x 8 _ y 2 = 0 - 0 2 6 9 5 2 8 6 .b= ( P 8 - y e ) / A = 1 - 0 1 5 6 8 3 3 . V = b , V O = 0 - 6 9 0 tb 2 = ( O s - y 8 ) / A = 0 - 0 2 5 9 3 4 1 . K_ = K O + b / b 1 =b595*

J v 2 - 0 - 6 0 6 0 2 6 . 8 2 = ( E v 2 - b L 8 - b 2 A ) / ( n - 2 ) = 0 - 0 0 0 7 3 6 54= 0 - 0 0 0 1 8 4 1 ( 4 D . F 4 ) t

S . E . ( K m ) = - 0 - 0 6 4 * S . E . V ) = V O S = 0 - 0 3 6 . t* C o n c n . o f n i c o t i n a m i d e m o n o n u c l e o t i d e , m M .t , u m o l e s o f n i c o t i n a m i d e - a d e n i n e d i n u c l e o t i d e f o r m e d / 3 m i n . / m g . o f e n z y m e p r o t e i n .I T h e s y m b o l S d e n o t e s a s t a n d a r d d e v i a t i o n . S t a n d a r d e r r o r s f o r K m a n d V ma y a l t e r n a t i v e l y b e c a l c u l a t e d b y u s i n g a m o r e a c c u r a t e e s t i m a t e o f e x p e r i m e n t a lv a r i a nc e d e r i v e d f r o m a s e r i e s o f e x p e r i m e nt s .

T a b l e 3 . D a t a f o r t h e e s t i m a t i o n o f d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s K1 a n d K2 d e r i v e d f r o m A t k i n s o n ,J a c k s o n Mo r t on ( 1 9 6 1 )

T h e p r o v i s i o n a l v a l u e s K R , K 0 a n d k R a r e g i v e n i n t h e t e x t .

K m0 - 5 9 40 - 4 5 00 - 1 8 70 - 1 3 90 - 1 0 50 - 1 0 80 - 0 8 7 90 - 0 8 7 70 - 0 7 5 20 - 0 7 9 10 - 0 7 1 90 - 1 1 2 90 - 1 0 60 - 1 8 00 - 2 9 80 - 3 3 6

Km0 - 5 8 6 40 - 3 9 9 20 - 2 1 2 50 - 1 4 3 00 - 1 0 7 00 - 0 8 9 00 - 0 8 2 30 - 0 8 0 50 - 0 8 0 40 - 0 8 1 70 - 0 8 4 20 - 1 0 0 80 - 1 0 9 80 - 1 6 5 50 - 2 7 2 60 - 3 8 5 8

p ( K m / K . O )( y )- 0 - 0 0 5 6- 0 - 0 5 2 00 - 0 5 5 60 - 0 1 2 30 - 0 0 8 2- 0 - 0 8 4 0- 0 - 0 2 8 1- 0 - 0 3 7 20 - 0 2 9 10 - 0 1 3 50 - 0 6 8 1- 0 - 0 4 9 20 - 0 1 5 3- 0 - 0 3 6 5- 0 - 0 3 8 70 - 0 6 0 1

y = 0 - 0 0 2 2y ' = - 0 - 0 0 1 0

HK1 +H( X I )0 - 8 6 5 10 - 8 0 1 90 - 6 2 7 80 - 4 4 6 90 - 2 6 0 80 - 1 1 1 30 - 0 3 8 10 - 0 1 3 20 - 0 0 6 40 - 0 0 2 10 - 0 0 1 00 - 0 0 0 20 - 0 0 0 20 - 0 0 0 100

x l = 0 - 2 2 2 0K = 0 - 2 1 6 7

1 / HI I K O + 1 / H( x 2 )0000 - 0 0 0 10 - 0 0 0 20 - 0 0 0 50 - 0 0 1 60 - 0 0 4 60 - 0 0 9 60 - 0 2 9 20 - 0 5 9 10 - 2 1 5 20 - 2 7 9 40 - 5 2 2 00 - 7 0 9 80 - 7 9 5 0T = 0 - 0 7 7 0 tZ q = 0 - 0 9 9 2 4

w Km)0 - 0 4 50 - 1 2 10 - 6 3 92 - 2 7 54 - 3 2 94 - 2 7 22 - 6 8 92 - 8 9 93 - 4 7 63 - 4 1 16 - 7 7 91 - 7 1 71 - 5 5 20 - 4 3 60 - 0 8 60 - 0 5 2

3 4 - 7 7 8

w(pKm)4 3 65 4 48 0 91 3 0 91 3 9 49 5 25 1 45 2 86 3 26 3 91 3 4 94 9 15 2 63 3 61 7 92 1 7

1 0 8 5 5

w ' ( p K m )3 0 53 5 44 5 05 7 15 8 74 9 13 4 13 4 73 8 93 9 25 7 93 3 13 4 62 5 21 5 21 7 9

6 0 6 6* C o n e n . o f n i c o t i n a m i d e m o n o n u c l e o t i d e , mms.t W e i g h t e d means b a s e d o n t h e w e i g h t s w ( p K m ) .I W e i g h t e d means b a s e d on t h e w e i g h t s w ' ( p K m ) .

pH4 - 9 55 - 1 55 - 5 35 - 8 56 - 2 16 - 6 67 - 1 67 - 6 37 - 9 58 - 4 48 - 7 69 - 4 09 - 5 51 0 - 0 01 0 - 3 51 0 - 5 5

3 3 0 1 9 6 1

8/13/2019 biochemj00812-0107

8/9

STATISTICAL ESTIMATIONS IN ENZYME KINETICSw(Km) f o r t h i s a n a l y s i s a r e shown i n T a b l e 3 ,t h e s e b e i n g t h e r e c i p r o c a l s o f t h e i n t e r n a l v a r i a n c e so f t h e Km v a l u e s , e x c l u d i n g an e s t i m a t e d v a r i a n c ef a c t o r , 0 - 0 0 0 1 8 8 5 . The e s t i m a t e s o b t a i n e d were

K T = 1 7 4 - 9 x 1 0 - 8 , K =0 - 0 1 0 9 2 x 1 0 - 8 ,R m =0 X 0 7 9 1 mM.

To d e t e r m i n e an e s t i m a t e o f t h e i n t e r - e x p e r i -m e n t a l v a r i a n c e component, t h e b i l i n e a r r e g r e s s i o no f t h e n e g a t i v e l o g a r i t h m s p ( K m / K . O ) onx l =H / ( K + H) and x2 =( 1 / H ) / ( 1 / K 2 + 1 / H )

was f i t t e d w i t h t h e w e i g h t s w ( p K m ) shown i nT a b l e 3 , t h e s e b e i n g t h e r e c i p r o c a l s o f t h e e s t i -mated i nt e r na l v a r i a n c e s o f t h e p K . m v a l u e s ;W PKm ( 2 - 3 0 3 ) 2 K 4 / V ( K m ) . The p r o v i s i o n a l l yf i t t e d v a l u e s K , a r e a l s o s h o wn i n T a b l e 3 , t h e s eb e i n g d e r i v e d f r o m t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s a b o v ef o r K 1 , K2 and Km. The a n a l y s i s d e t e r m i n e d ( a sr e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t s ) t h e f i n e a d j u s t m e n t sp ( K 1 / K ) =0 * 0 0 2 , p ( K 2 / K 2 ) =-0-001, w h i c h a r ec o m p a r a t i v e l y n e g l i g i b l e , and y i e l d e d a r e s i d u a lmean squa re, 82 = 1 X 6 7 6 4 , b a s e d on 1 3 d e g r e e s o ff r e e d o m .Th e e x p e c t e d v a l u e o f t h e mean-square 8 2 i su n i t y i f t h e i n t e r - e x p e r i m e n t a l v a r i a n c e com-ponent i s e x c l u d e d . A l t h o u g h t h e o b s e r v e d v a l u ei s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n u n i t y a t o n l y t h e 1 0l e v e l o f s i g n i f i c a n c e ( c f . F i s h e r Y a t e s , 1 9 3 8 ,T a b l e V , e n t e r e d w i t h 1 3 and 6 6 d e g r e e s o f f r e e d o m ) ,t h e r e a l i t y o f t h e a d d i t i o n a l component o f v a r i a n c e ,i n any case, was no t i n q u e s t i o n . A s s u m i n g t h ei n t e r - e x p e r i m e n t a l v a r i a n c e o f e a c h pKm t o b e t h esum o f t h e i n t e r n a l v a r i a n c e and t h e i n t e r - e x p e r i -m e n t a l v a r i a n c e component a ' ,

V(pKTrn) =wpK, +Uab,w pKm)i t may b e s h o w n , by a p p l i c a t i o n o f t h e b a s i c r u l e s ,t h a t t h e e x p e c t e d v a l u e O f 8 2 i sE ( 8 2 ) = 1 + U 2 {Ew- - C l l W 2 ( X 1 - l ) 213 .

-2c12 w2 -i)X 2 X2 )C 2 2 zW2 X2-t h e c o a f f i c i e n t s c i j b e i n g t h o s e w h i c h occur i n t h er e g r e s s i o n c a l c u l a t i o n s . E q u a t i o n o f t h e o b s e r v e da nd e x p e c t e d v a l u e s gave an e s t i m a t e o f t h ev a r i a n c e i n b i a s , 8 b =0 - 0 0 0 9 8 6 , and a d d i t i o n o ft h i s v a l u e t o t h e i n t e r n a l v a r i a n c e s gave t h e e s t i -mated i n t e r - e x p e r i m e n t a l v a r i a n c e s o f t h e pKmv a l u e s , t h e r e c i p r o c a l s w ' ( p K m ) o f w h i c h a r e s h o wni n T a b l e 3 .I n t h e f i n a l a n a l y s i s t h e b i l i n e a r r e g r e s s i o n o fp ( K m / K . , ) on x1 a nd x 2 was r e f i t t e d w i t h t h e w e i g h t s

W ' ( p K m ) , t h e p r o v i s i o n a l v a l u e s K b e i n g a s b e f o r e .The r e g r e s s i o n e q u a t i o n s o b t a i n e d w e r e :5 0 8 * 9 0 7 0 b 1 - 1 3 0 * 1 4 0 9 b 2 = 0 2 1 4 6 9 2 ,

- 1 3 0 * 1 4 0 9 b , + 2 4 3 * 4 5 3 6 b 2 = 0 - 6 7 1 6 2 6 ,( A = 1 0 6 9 5 8 * 5 9 ) ,

w h i c h g a v e t h e f i n e a d j u s t m e n t sp ( K 1 / K ) =-b =-0001,p ( K 2 / K 2 ) = b 2 = 0 0 0 3 ,

and h e n c e p ( K m / k ? n ) = a = - 0 - 0 0 2 .A d j u s t m e n t o f t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s

p K o = 5 . 7 5 7 , p K 2 = 9 * 9 6 2 , pK = 4 - 1 0 2 ,g a v e t h e f i n a l e s t i m a t e s

pKl = 5 X 7 5 6 , S . E . = 0 . 0 4 8 ;P K 2 = 9 - 9 6 5 , S . E . = 0 - 0 6 9 ;pKm = 4 - 1 0 0 , S . E . = 0 . 0 1 9 ;t h e s t a n d a r d e r r o r s b e i n g t h e s q u a r e r o o t s r e -s p e c t i v e l y o f c l l = 2 4 3 . 5 / A , c 2 2 = 5 0 8 . 9 / A , and( 1 / s w ' + c l 1 i l 2 C 1 2 1 3 2 +22X)2The w e i g h t e d means x l , 4 a r e shown i n T a b l e 3 .The f i n a l e s t i m a t e s o b t a i n e d d i f f e r o n l y v e r ys l i g h t l y f r o m t h e p r o v i s i o n a l e s t i m a t e s ; t h e m a j o rf u n c t i o n o f t h e s u b s e q u e n t a n a l y s i s h a s b e e n t od e t e r m i n e t h e r e l e v a n t e s t i m a t e s o f s t a n d a r d e r r o r .A d e t e r m i n a t i o n o f Km a t pH 9 * 7 7 w as o m i t t e df r o m t h e c a l c u l a t i o n s d e s c r i b e d on a c c o u n t o f g r o s sa b e r r a t i o n ( - 0 1 9 o n t h e pKm s c a l e ) f r o m t h e p r o -

v i s i o n a l l y f i t t e d pKm f u n c t i o n . T h i s a b e r r a t i o n wasj u d g e d , on a c c o u n t o f i t s m a g n i t u d e , t o b e a l m o s tc e r t a i n l y d u e t o an a t y p i c a l e x p e r i m e n t a l d e f e c ts u c h a s an a c c i d e n t a l c o n t a m i n a t i o n o f t h e s u b -s t r a t e . O m i s s i o n o f t h e a b e r r a n t d e t e r m i n a t i o ni n c r e a s e d t h e e s t i m a t e o f pK2 by 0 0 5 .I t m i g h t s e e m a b o v e , s i n c e t h e v a r i a t i o n s i n t h ew e i g h t s w ' a r e n o t v e r y m a r k e d , t h a t a s i m p l e r u n -w e i g h t e d a n a l y s i s w o u l d h a v e s u f f i c e d . A l m n o s t t h esame e s t i m a t e s o f K , and K2 a r e o b t a i n e d , b u t t h ee s t i m a t e s o f s t a n d a r d e r r o r a r e a f f e c t e d :

S . E . ( p K A ) =0 . 0 4 4 , S . E . ( p K 2 ) =0 0 5 0 .The main d i f f e r e n c e i s i n t h e s t a n d a r d e r r o r o f p K 2 ,from w h i c h i t i s e v i d e n t t h a t t h e u n w e i g h t e da n a l y s i s h a s r e s u l t e d i n t h e amount o f i n f o r m a t i o nr e g a r d i n g pK2 b e i n g o v e r e s t i m a t e d by n e a r l y 1 0 0 .

D IS C USSIONTh e u t i l i t y o f t h e s t a t i s t i c a l m e t h o d s d e s c r i b e d i s

l a r g e l y s e l f - e v i d e n t i n t h e i l l u s t r a t i o n s g i v e n . Th eb a s i c p r i n c i p l e s c a n b e a p p l i e d , w i t h a n a l o g o u sc o m p u t a t i o n s , t o o t h e r p r o b l e m s i n enzyme k i n e t i c ss u c h a s t h e d e t e r m i n a t i o n o f i n h i b i t o r c o n s t a n t s( c f . D i x o n & Webb, 1 9 5 8 ) , and more g e n e r a l l y a r e

V o l . 8 0 3 3 1

8/13/2019 biochemj00812-0107

9/9

3 3 2 G . N . WILKINSON 1 9 6 1a p p l i c a b l e w h e n e v e r f u n c t i o n s o f known o r a s s u m e df o r m a r e t o b e f i t t e d t o e x p e r i m e n t a l s e r i e s o fv a l u e s . The c a l c u l a t i o n s r e q u i r e d a r e n o t u n d u l yt i m e - c o n s u m i n g , u s u a l l y i n v o l v i n g o n l y a f r a c t i o no f t h e c o r r e s p o n d i n g t i m e s p e n t i n l a b o r a t o r y worka nd p l a n n i n g .The s t a t i s t i c a l methods n o t o n l y s u p p l y morea c c u r a t e e s t i m a t e s and t h e n e c e s s a r y m e a s u r e s o fp r e c i s i o n b u t have a f u r t h e r a d v a n t a g e , i n t h a ts u b j e c t i v e b i a s e s w h i c h m i g h t o t h e r w i s e h a v ea r i s e n a r e t h e r e b y a v o i d e d . I n f i t t i n g by e y e , f o ri n s t a n c e , a s e r i e s o f s t r a i g h t l i n e s t o L i n e w e a v e r -Burk p l o t s c o r r e s p o n d i n g t o a r a n g e o f s u b s t r a t epH v a l u e s , t h e r e ma y b e a s u b j e c t i v e t e n d e n c y t of i t t h e l i n e s e i t h e r s t e e p e r o r f l a t t e r t h a n t h e ys h o u l d b e , g i v i n g r i s e t o d i s t o r t i o n s i n t h e a c t u a lt r e n d o f Km w i t h pH . A n o t h e r k i n d o f b i a s a r i s e s i ft h e r e i s a s u b c o n s c i o u s t e n d e n c y t o make t h e t r e n di n s l o p e o f t h e s e r i e s o f l i n e s r a t h e r more u n i f o r mt h a n i t s h o u l d b e . A p l o t o f t h e K m d e t e r m i n a t i o n sa g a i n s t pH would g i v e , a s a c o n s e q u e n c e o f t h es u b j e c t i v e e l i m i n a t i o n o f v a r i a b i l i t y , a m i s l e a d i n gv i s u a l i m p r e s s i o n o f t h e a c c u r a c y o f t h e e x p e r i -m e n t a l w o r k , and c e r t a i n l y s i g n i f i c a n c e t e s t s b a s e don s u c h d e t e r m i n a t i o n s w o u l d b e i n v a l i d .I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t s t a t i s t i c a l m e a s u r e so f p r e c i s i o n s u p p l y a g a u g e f o r random v a r i a t i o no n l y . A n e x p e r i m e n t ma y s u p p l y , i n t h i s s e n s e , ap r e c i s e d e t e r m i n a t i o n , w h i c h n e v e r t h e l e s s i ss e r i o u s l y b i a s e d by some d e f e c t o r l i m i t a t i o n i nt h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e .

SUMMARY1 . An a c c o u n t i s g i v e n o f t h e w e i g h t e d and n o n -l i n e a r r e g r e s s i o n m e t h o d s r e l e v a n t t o enzyme k i n e t i c

s t u d i e s , w i t h a b r i e f p r e l i m i n a r y o u t l i n e o f s t a t i s t i c a lt e r m i n o l o g y and t h e b a s i c c a l c u l u s o f randomv a r i a t i o n .2 . S t a t i s t i c a l c o n s i d e r a t i o n s i n d i c a t e t h a t , f o rg r a p h i c a l d e t e r m i n a t i o n s o f t h e p a r a m e t e r s Km andV i n t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n , t h e l i n e a rp l o t o f s / v a g a i n s t s i s p r e f e r a b l e t o t h e d o u b l er e c i p r o c a l p l o t .3 . A c o m p u t a t i o n a l p r o c e d u r e i s g i v e n f o re s t i m a t i n g K m n , V and t h e r e l e v a n t s t a n d a r d e r r o r s .4 . The a p p l i c a t i o n o f r e g r e s s i o n methods i sf u r t h e r i l l u s t r a t e d w i t h t h e e s t i m a t i o n o f d i s s o c i a -t i o n c o n s t a n t s f r o m a s e r i e s o f Km d e t e r m i n a -t i o n s .

T h e a u t h o r i s g r a t e f u l t o P r o f e s s o r R . K . M o r t o n , a n d t oD r M . R . A t k i n s o n a n d M r J . F . J a c k s o n , f o r t h e c o l l a b o r a -t i o n w h i c h h a s l e d t o t h e w r i t i n g o f t h i s p a p e r , a n d f o rp e r m i s s i o n t o u s e t h e i r d a t a i n i l l u s t r a t i o n .

REFERENCESA t k i n s o n , M . R . , J a c k s o n , J . F . & M o r t o n , R . K . ( 1 9 6 1 ) .B i o c h e m . J . 8 0 , 3 1 8 .D i x o n , M . ( 1 9 5 3 ) . B i o c h e m . J . 5 5 , 1 6 1 .D i x o n , M . & W e b b , E . C . ( 1 9 5 8 ) . E n z y m e s . L o n d o n :L o n g m a n s , G r e e n a n d C o . L t d .F i s h e r , R . A . ( 1 9 2 5 ) . S t a t i s t i c a l M e t h o d s f o r R e s e a r c hW o r k e r s , 1 3 t h e d . , 1 9 5 8 . E d i n b u r g h : O l i v e r a n d BoydL t d .F i s h e r , R . A . & Y a t e s , F . ( 1 9 3 8 ) . S t a t i s t i c a l T a b l e s f o rB i o l o g i c a l , A g r i c u l t u r a l a n d M e d i c a l R e s e a r c h , 5 t h e d . ,1 9 5 7 . E d i n b u r g h : O l i v e r a n d B o y d L t d .H o f s t e e , B . H . J . ( 1 9 5 2 ) . S c i e n c e , 1 1 6 , 3 2 9 .L i n e w e a v e r , H . & B u r k , D . ( 1 9 3 4 ) . J . A m e r . c h e m . S o c .5 6 , 6 5 8 .W i l l i a m s , E . J . ( 1 9 5 9 ) . R e g r e s s i o n A n a l y s i s . New Y o r k :J o h n W i l e y a n d S o n s I n c .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 1 ) 8 0 , 3 3 2F r e e Amino A c i d s o f t h e H aemolymph o f S c h i s t o c e r c a g r e g a r i a F o r s k .

BY C . A . BENASSI, G . COLOMBO AND G . ALLEGRII 8 t i t u t o d i C h i m i c a F a r m a c e u t i c a e d i Z o o l o g i a , U n i v e r s i t d d i P a d o v a , I t a l y

( R e c e i v e d 5 D e c e m b e r 1 9 6 0 )I n s e c t haemolymph c o n t a i n s f r e e amino a c i d s i nh i g h e r c o n c e n t r a t i o n s t h a n t h e b l o o d o f o t h e ra n i m a l g r o u p s ; d e t a i l e d d a t a h a v e b e e n c o l l e c t e df r o m d i f f e r e n t s p e c i e s o f v a r i o u s o r d e r s o f i n s e c t so n l y i n t h e l a s t t e n y e a r s , m a i n l y a f t e r t h e d e -v e l o p m e n t o f m i c r o b i o l o g i c a l and c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d s o f a n a l y s i s .Some i n v e s t i g a t o r s h a v e r e c e n t l y s t u d i e d t h ev a r i a t i o n s o f a m i n o - a c i d a e m i a d u r i n g d e v e l o p -

m e n t a l s t a g e s o f h o l o m e t a b o l o u s i n s e c t s , i n r e l a t i o n

t o t h e m e t a b o l i c p r o c e s s e s i n v o l v e d ( c f . F l o r k i n ,1 9 5 9 ) .As p a r t o f a r e s e a r c h o n amino a c i d m e t a b o l i s m i nO r t h o p t e r a , w e r e p o r t h e r e t h e q u a n t i t a t i v ep a t t e r n o f t h e f r e e a m i n o a c i d s i n t h e b l o o d o f al o c u s t , S c h i 8 t o c e r c a g r e g a r i a F o r s k . , a t v a r i o u ss t a g e s o f d e v e l o p m e n t . A s i m i l a r i n v e s t i g a t i o n ona g r a s s h o p p e r , A n a c r i d i u m a e g y p t i u m L . , h a sa l r e a d y b e e n p u b l i s h e d ( B e n a s s i , Colombo &P e r e t t i , 1 9 5 9 ) .