Tez de doctorat UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE HORTICULTUR

ING. CALBOREANU (cs. Badea) CARMEN

REZUMAT TEZ DE DOCTORAT SUMMARY

DETERMINAREA VARIABILITATII LA NIVEL FENOTIPIC I LA NIVEL MOLECULAR A LINIILOR DE PORUMB ZAHARAT, COMPONENTE ALE PRINCIPALILOR HIBRIZI COMERCIALI CREAI LA SCDA TURDA, N VEDEREA STABILIRII EFICIENEI SELECIEI ASISTATE DE MARKERI A LINIILOR CONSANGVINIZATE PHENOTYPIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF SWEET CORN INBRED LINES, COMPONENT OF MOST IMPORTANT COMERCIAL HYBRIDS CREATED AT ARDS TURDA, IN ORDER TO ESTABLISH THE EFFICIENTCY OF MARKER ASSISTED SELECTION OF INBRED LINES

Conductor tiinific: Prof. univ. dr. MARIN ARDELEAN

1

Tez de doctorat

INTRODUCEREPorumbul zaharat este o varietate n cadrul speciei Zea mays, i anume var. rugosa (Bonaf), convar. Saccharata (Sturt.), (dup SVULESCU i ZAHARIDI, 1957) i se difereniaz de porumbul normal prin prezena uneia sau mai multor gene mutante, care afecteaz metabolismul glucidelor din endosperm. n ara noastr, cercetrile legate de ameliorarea porumbului zaharat au nceput la I.C.C.P.T. Fundulea, n anul 1957 (MUREAN i colab., 1966). Porumbul zaharat apare menionat n lucrarea Porumbul - Studiu monografic publicat de ctre SVULESCU i ZAHARIDE n 1957. Primul hibrid de porumb zaharat obinut n Romnia, la Fundulea, a fost hibridul simplu Delicios, omologat n anul 1969. n anul 1971, la Staiunea de Cercetri Agricole Turda, s-a iniiat programul de creare a liniilor consangvinizate i a hibrizilor timpurii de porumb zaharat, iar n anul 1988 a fost omologat hibridul triliniar Dulcin (CBULEA i colab., 1994; HA i colab., 1994; HA, 2002a). Linii valoroase sugary se regsesc n prezent ca forme parentale ale hibrizilor omologai Dulcin, Prima, Estival i Deliciul Verii (HA i CBULEA, 1998, HA, V. i colab., 1999). Identificarea polimorfismului liniilor consangvinizate cu ajutorul polimorfismului la nivel de ADN este extrem de util, datorit faptului c rezultatul obinut reflect direct genotipul i nu este influenat de condiiile de mediu (LODHI i colab.1994, POP i colab., 2003). Pe baza celor constatate mai sus, n teza de doctorat prezentat ne-am propus s ducem mai departe cercetrile naionale menionate mai sus, prin evidenierea variabilitii liniilor consangvinizate de porumb zaharat, nu numai la nivel fenotipic ci i la nivel molecular i stabilirea legturilor statistice ntre aceste dou tipuri de manifestare. Astfel de legturi ar putea fi folosite la iniierea unui program de selecie asistat de markeri moleculari ai liniilor componente ale hibrizilor comerciali de porumb zaharat.

2

Tez de doctorat

1. OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA1.1. SCOPUL CERCETRILOR

Orice program de ameliorare i propune crearea unei noi variabiliti genetice care s poat fi folosit ulterior prin selecie pentru obinerea de genotipuri noi mai, performante. Sporul de producie, la porumbul zaharat, reprezint un ctig modest comparativ cu cel realizat la porumbul normal, dup aprecierea fcut de ctre TRACY (1990b), datorit bazei genetice mai nguste a porumbului zaharat, care limiteaz posibilitile ctigului genetic pentru producie. Scopul principal al cercetrilor noastre a constat n caracterizarea i stabilirea relaiilor filogenetice ntre cele 18 linii consangvinizate i cei 49 de hibrizi de porumb zaharat, cu ajutorul metodologiei RAPD, precum i compararea rezultatelor obinute prin formule de hibridare elaborate pe baza testrii liniilor i hibrizilor comerciali prin metode convenionale i prin metode neconvenionale (markeri moleculari). Cercetrile iniiate de noi, constituie, probabil, primele ncercri de identificare a variabilitii la porumbul zaharat prin metoda RAPD, n Romnia.

1.2. OBIECTIVELE URMRITE N CERCETRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT n cercetrile iniiale ne-am propus ca, prin experienele efectuate la 18 linii consangvinizate i 49 de hibrizi de porumb zaharat, s identificm i s selectm un material biologic adecvat pentru obinerea unor combinaii performante, care presupun manifestarea la maxim n cadrul hibrizilor a celor mai valoroase caractere ale liniilor parentale. Avnd ca repere fundamentale cunotiinele privind importana i actualitatea cercetrilor cu privire la difersitatea fenotipic i genetic a liniilor consangvinizate i a hibrizilor simpli, la metodele de analiz, obiectivele urmrite n aceast lucrare sunt prezentate dup cum urmeaz, pe dou categorii de caracterizare a liniilor consangvinizate i a hibrizilor de porumb zaharat studiai: fenotipic i molecular.3

Tez de doctorat La nivel fenotipic s-a urmrit: caracterizarea liniilor consangvinizate de porumb zaharat pe baza valorii per sea lor dar i pe baza indicelui fenotipic de difereniere; evaluarea diversitii genetice a caracterelor cantitative a liniilor consangvinizate de porumb zaharat forme parentale ale hibrizilor studiai pe baza capaciii generale i specifice de combinare. stabilirea gradului de diversitate genetic dintre formele parentale prin nivelul de intensitate al heterozisului hibrizilor de porumb zaharat; precizarea influenei condiiilor de mediu asupra mecanismelor genetice implicate n exprimarea caracterelor la porumbul zaharat. Pentru caracterizarea molecular a liniilor consangvinizate i a hibrizilor de porumb zaharat studiai ne-am ndreptat cercetrile n direcia urmtoarelor aspecte: stabilirea protocolului de extracii de ADN i utilizarea tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) n vederea identificrii polimorfismului genetic in vivo la 18 linii de porumb zaharat i 49 de hibrizi simpli; identificarea primerilor capabili s determine polimorfismul la nivel molecular ntre liniile consangvinizate i ntre hibrizii analizai; depistarea diversitii genetice i a gradului de nrudire ntre cele 18 linii consangvinizate, precum i ntre hibrizii de porumb zaharat studiai, prin amprenta ADN obinut cu ajutorul tehnicii RAPD; De asemenea, urmrim s evideniem tipul de legtur existent ntre capacitatea general i specific de combinare calculat la nivel fenotipic pe de o parte i amprenta genetic a liniilor consangvinizate de porumb zaharat, pe de alt parte

2. MATERIALE I METODE DE LUCRU2.1 MATERIALUL BIOLOGIC Materialul biologic utilizat n cercetrile realizate a fost reprezentat de 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (T152 su, T193A su, T209 su, T339R su, LC153 su , LC154 su, TD101 su, T345R su, T346 su, TA25 su, TA26 su, TA27 su, TA28 su, TA22 su, TA21 su, T233 su, T244 su, TC209 su) forme parentale i 49 hibrizi simpli

4

Tez de doctorat realizai n cadrul unui sistem ciclic (factorial) de ncruciare de tipul mx

n destinat

analizei genetice cantitative, liniile tester fiind liniile T233 su, T244 su i TC209 su. Materialul biologic destinat izolrii ADN-ului a fost reprezentat de embrionii genotipurilor de porumb zaharat mai sus menionate. Pentru completarea grilajului patrat balansat s-au mai introdus n testare nc patru hibrizi simpli de porumb zaharat, trei dintre ei omologai i cuprini n Lista oficial a soiurilor i hibrizilor (Prima, Deliciul verii i Delicios) i nc un hibrid simplu de porumb zaharat, forma matern a hibridului Estival, linia component acestui hibrid simplu SW87 su (a 19 linie), a fost i ea analizat la nivel molecular prin tehnica RAPD. Pentru amplificare s-au utilizat 20 primeri decameri (UBC 281, UBC 241, UBC 245, UBC 561, UBC 286, UBC 599, OPB08, OPB09, OPB10,OPB11OPB17,OPAB 11,OPX O3, AB 11, OPE 14, OPAL 20,OPB03, OPB18, OPC14, OPD19). Proveniena primerilor a fost diferit, astfel 6 primeri decanucleotidici sunt produi de University of British Columbia (UBC), 14 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPB, OPE, OPC, OPD, OPAL, OPX, AB,). 2.2. METODE DE LUCRU 2.2.1.Organizarea experienelor Cercetrile privind determinismul genetic precum i studiul efectelor capacitii generale i specifice de transmitere a unor caractere de interes specific pentru porumbul zaharat s-au realizat utiliznd datele experimentale dintr-o serie de trei sisteme ciclice, cuprinznd 45 de hibrizi. Pe lng acetia s-au mai introdus n studiu patru hibrizi simpli (omologai) de porumb zaharat (Prima, Deliciul verii, Delicios i forma mam a hibridului Estival), pentru a completa sistemul de aranjare (49 variante = 7 x 7 i (7 +1)/2 repetiii) n cmp, dar i pentru utilizarea lor pentru comparare cu restul hibrizilor sistemului n vederea evidenierii unui progres genetic.

5

Tez de doctorat Liniile consangvinizate forme parentale au fost, de asemenea, experimentate n anii 2005 i 2006, ntr-o experien cu blocuri randomizate ntr-o singur localitate (Turda), n patru repetiii. Testarea hibrizilor s-a realizat, i ea, pe parcursul acelorai doi ani: 2005 i 2006. 2.2.2. Observaii i analize Observaiile i analizele realizate, la variantele experimentale n anii 2005 i 2006, au vizat pentru un numr de 25 de caractere. Msurtorile au fost efectuate la maturitatea fiziologic (aproximativ 21 zile de la apariia stigmatelor) la cte 10 plante i 10 tiulei din ficare parcel repetiie, totaliznd 40 de plante i 40 de tiulei / variant (hibrid simplu)/an: caracterele vegetative ale plantei :nlimea plantei, nlimea de inserie a tiuletelui principal, numrul de frunze/plant, numrul de ramificaii la panicul, lungimea frunzei tiuletelui principal, limea frunzei tiuletelui principal, numrul de lstari / plant; caracterele tiuletelui :greutatea tiuletelui, greutatea pnuilor, lungimea tiuletelui, lungimea pnuilor, lungimea bracteelor, numrul de rnduri de boabe/ tiulete, profunzimea, grosimea rahisului, indicele de conicitate; caracteristici fiziologice: vigoarea vegetativ timpurie, suprafaa foliar

2.2.3. Metodologia analizelor RAPD utilizate n evidenierea variabilitii la nivel molecular la porumbul zaharat 2.2.3.1. Metode de extracie a ADN-ului Pentru analiza RAPD a ADN-ului, la porumbul zaharat (bogat n glucide), s-a ncercat extracia acestuia prin dou metode: din embrioni i din endosperm. Au fost testate dou tipuri de protocoale, apoi s-a optimizat protocolul de extracie a ADN-ului ales prin care se obine o puritate ct mai mare. Materialul biologic destinat izolrii

6

Tez de doctorat ADN a fost reprezentat de embrionii boabelor de porumb zaharat a materialului biologic prezentat mai sus. Pentru a obine un ADN de calitate care s poate fi utilizat n tehnica RAPD- lui a fost utilizat protoculul descris de LODHI i colab., 1994, modificat (POP i colab., 2003). 2.2.3.2. Cuantificarea ADN-ului Dup extracia ADN-ului, probele au fost cuantificate spectofotometric cu ajutorul aparatului BioPhotometer Eppendorf. 2.2.3.3. Protocol de amplificare RAPD Amplificarea probelor s-a realizat n aparatul Eppendorf Mastercycler gradient programat astfel: 3 minute la 950C predenaturare, urmat de 45 de cicluri cu urmtorul profil de temperatur : 1 minut la 930C denaturare 1 minut la 340C fixarea primerilor 1 minut la 720C extensie extensia final 10 minute la 720C. 2.2.3.4. Analiza imaginilor Analiza gelurilor s-a fcut cu ajutorul programului Total Lab TL 100, obinndu-se matricea binar. Matricea binar s-a utilizat apoi pentru calcularea distanelor genetice. Pentru calcularea distanelor genetice i realizarea dendrogramei s-a utilizat programul RAPDistance 1.04, utiliznd cu aplicarea coeficientului Nei Li i a metodei UPGMA (Un-weighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) pentru distanele genetice, respectiv metoda Neighbor Joining Tree pentru dendrogram.

7

Tez de doctorat 2.2.4. Metode statistice utilizate n evidenierea variabilitii fenotipice i genetice la porumbul zaharat Pentru a putea evalua diversitatea fenotipic a celor 18 linii consangvinizate implicate n sistemul de ncruciri experimentat la SCDA Turda, s-a calculat indicele de difereniere fenotipic (IDF) dup HERBERT i VINCOURT (1985).

unde Xm, Xn mediile caracterelor liniilor parentale m i n. La nivelul caracterelor cantitative diversitatea genetic s-a estimat pe baza capacitii generale de combinare (CGC) i a capacitii specifice de combinare (CSC) caracteristice fiecrei linii, fiecrei interaciuni dintre linii, i pentru sistem ciclic (factorial) de ncruciare. Estimarea diversitii poligenice s-a realizat: la nivelul locilor homozigoi prin calcularea efectelor genice aditive ( ) , n care

Xm/n = media valorilor printelui m sau n;.

- la nivelul interaciunilor intra i interalelice prin calcularea efectelor geniceneaditive (mn )

), unde mn = efectul genetic al interaciunii genelor celor doi prini;

2.2.5. Metode statistice utilizate n evidenierea variabilitii la nivel molecular Interpretarea gelurilor obinute s-a fcut prin analiza statistic a imaginilor. Markerii moleculari sunt tratai ca variabile binare, n procesarea datelor lundu-se n considerare urmtoarele:

8

Tez de doctorat se folosete analiza mai multor variante, formndu-se matrici de similaritate sau difereniere ntre posibilele perechi de indivizi sau uniti taxonomice operaionale; doi indivizi similari au simultan valoarea minim a distanei i maxim a similitudinii; distana i similitudinea sunt invers proporionale; similaritatea este estimat n funcie de numrul coincidenelor.

3. REZULTATE I DISCUII 3.1. CARACTERIZAREA FENOTIPIC I MOLECULAR A LINIILOR CONSANGVINIZATE DE PORUMB ZAHARAT LUATE N STUDIU 3.1.1. Exprimarea fenotipic a caracteristicilor liniilor consangvinizate de porumb zaharat Valorile medii calculate a caracterelor de interes pentru ameliorarea porumbului zaharat acoper biometrizrile pe o perioad de doi ani (2005 i 2006), perioad pe parcursul creia s-au efectuat experienele. Aceste valori redau valoarea per se a caracterului respectiv la liniile consangvinizate studiate. Caracterizarea fenotipic a liniilor consangvinizate forme parentale de porumb zaharat luate n studiu la SCDA Turda este redat n tabelele 1 prin calcularea valorilor medii a biometrizrilor a ase caractere la plant i a 12 caractere la tiulete. Piaa prezint cerine eseniale legate de aspectul tiuletelui. Astfel, pentru consum proaspt, se prefer porumbul cu cel puin 16 rnduri de boabe mici, profunde, rndurile s fie drepte, tiuletele de 25-30 cm, acoperit cu boabe pn la vrf iar forma tiuletelui s fie cilindric (TRACY, 1994). n tabelul mai sus menionat se poate observa c ntre liniile consangvinizate de porumb zaharat studiate exist diferene asigurate statistic privind fiecare caracter n parte.

9

Tez de doctorat nlimea plantelor s-a exprimat prin valori cuprinse ntre 97,40 cm (TA27su) i 155,53 cm (T244 su). nlimea de inserie a tiuletelui principal a avut valori cuprinse 16,21 cm (TA 27 su) i 53,62 cm (T152 su). Tabelul 1 Caracterele vegetative ale plantei i tiuletelui la liniile consangvinizate parentale de porumb zaharat (valori medii Turda, 2005 i 2006) Agronomic assessments of sweet corn inbred lines studied (average values Turda 2005 and 2006)Linia Line T152su T193Asu T209su T339Rsu LC153su LC154su TD101su T345Rsu T346su TA25su TA26su TA27su nlime plant Plant height (cm)***

143,62 147,26 *** 123,35 137,87 *** 117,39 ooo 120,48 oo 128,68 122,00 o 152,70 *** 106,27 ooo 131,38 * 97,40 ooo 108,11 ooo TA28su 134,51 ** TA22su 104,44 ooo TA21su 110,77 ooo T233su 155,53 *** T244su *** TC209su 141,19 Media 126,83 DL/LSD 5% 4,52 DL/LSD 1% 6,01 DL/LSD 0,1% 7,74

nlime inserie tiulete Height ear insertion (cm) 53,62 *** 50,78 *** 36,49 42,66 44,18 41,23 38,99 41,58 51,59 *** 32,33 o 35,97 16,21 ooo 29,48 ooo 36,99 29,41 ooo 30,86 oo 47,44 ** 41,16 38,94 5,46 7,24 9,34

Numr ramificaii la panicul Branch of tassel no. 5,51 ooo 9,75 oo 8,48 ooo 10,05 o 36,21 *** 17,70 *** 22,56 *** 9,79 oo 10,48 13,97 * 10,73 7,42 ooo 6,16 ooo 8,86 ooo 13,36 9,48 oo 8,84 ooo 9,81 oo 12,18 1,72 2,29 2,95

Greutate tiulete fr pnui Dehusked ear weight (g) 87,93 80,75 87,11 87,95 80,60 71,87o 82,70 89,96 81,69 90,48 78,32 90,06 115,78*** 89,79 61,65ooo 87,27 90,03 91,56 85,86 11,9 15,8 20,36

Lungime tiulete Ear lenght (cm) 15,88*** 12,65 13,50 16,90*** 11,47 ooo 13,40 16,44*** 13,46 16,19*** 12,12 oo 12,04 oo 14,53 11,38 ooo 12,21 oo 11,61 ooo 12,71 13,35 16,07*** 13,66 1,03 1,37 1,76

Numrul de ramificaii la panicul este un caracter cu o amplitudine destul de larg de la 5,51 (T152 su) la 36,21 (LC153 su).

10

Tez de doctorat Greutate tiuletelui fr pnui, caracter de producie deosebit de important, a nregistrat variaii ale valorilor medii ntre 61,65 grame (TA21 su) i 115,78 grame (TA28 su). Mrimea tiuletelui, caracter important att pentru producie ct i pentru aspectul comercial, a prezentat variaii ale valorilor medii calculate pe cei doi ani de studiu, (tabelul 1), de la 11,38 cm (TA28 su) pn la 16,90 cm (T339R su). Porumbul zaharat pentru consum n stare proaspt trebuie s prezinte boabe mici i profunde (TRACY, 1994). Dimensiunea bobului, dup cum se observ n fig.1, variaz n limite de la 0,5 cm (LC153 su) la 0,76 cm (T346 su).

Fig.1. Grosimea boabelor la cele 18 linii consangvinizate de porumb zaharat forme parentale (valori medii anii 2005 i 2006) Porumbul zaharat pentru consum proaspt trebuie s prezinte boabe mici i profunde (TRACY, 1994). La cele 18 linii parentale studiate, se nregistreaz valorii medii pe cei doi ani de la 0,40 cm (T152 su) la 0,89 cm (TA27 su, TA28 su). Prin calaculul indicelui de difereniere fenotipic (IDF) (HERBERT i VINCOURT, 1985 se pot compara valorile medii ale caracterelor fenotipice a dou genotipuri (linii parentale) (fig.2 i 3).

11

Tez de doctorat

Fig.2. Indicii de difereniere fenotipic (IDF) pentru caracterele plantei la 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 i 2006)

Fig.3. Indicii de difereniere fenotipic (IDF) pentru caracterele tiuletelui la 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 i 2006) Valoarea ridicat a acestui indice calculat ne indic gradul de difereniere dintre linii n timp ce valorile mai sczute, gradul de asemnare. Ca urmare, privind caracterele plantei, linia consangvinizat T152su se diferaniaz foarte mult de toate cele trei linii consangvinizate utilizate n sistemul de12

Tez de doctorat ncruciare ca form matern (T233 su, T244 su i TC209 su) prin valorile cele mai mari ale indicelui de difereniere fenotipic (54,9, 82,1 i respectiv 71). Cele mai apropiate din punct de vedere fenotipic s-a constatat c sunt liniile TA28 su cu T233 su (6,8), T346 su cu T244 su (8,1), TA22 su cu TC209 su (9,0). Indicele de difereniere fenotipic calculat pentru caracterele tiuletelui de porumb zaharat la liniile consangvinizate studiate sunt prezentate n figura 4. Astfel, se poate observa pe baza acestui calcul c cel mai mare grad de difereniere fenotipic la nivelul caracterelor tiuletelui s-a nregistrat ntre linia TA21 su i T244 su (62,6) precum i ntre linia T346su i T233su (58,1), i respectiv TC209 su (50,2). Foarte asemntoare din punct de vedere al caracterelor tiuletelui s-au remarcat liniile T345su i TC209 su (6,1), T339R su i T244 su (8,1) precum i LC153 su i T233su (8,4). 3.1.2. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacitii generale de combinare (CGC) Diversitatea genetic la nivelul caracterelor cantitative o putem estima pe baza efectelor capacitii generale de combinare caracteristice liniilor consangvinizate de porumb zaharat. Diferenele existente ntre liniile comparate reflect diferenierile la nivelul locilor homozigoi cu efecte cumulative. Dintre cele trei linii consangvinizate de porumb zaharat utilizate n ncruciri ca forme materne, a rezultat faptul c ele pot fi utilizate ca surse de gene favorabile, av nd capacitatea de a transmite aditiv pozitiv caracterele dup cum urmeaz: capacitatea de producie, reprezentat prin greutatea tiuletelui este transmis aditiv pozitiv cel mai bine de linia su TC209 ( =17,19), n timp ce liniile T244 i T233 transmit negativ aditiv acest caracter; talia plantei este transmis aditiv pozitiv de linia zaharat TC209 (=3,21), n timp ce nlimea mai redus poate fi transmis de linia zaharat T244 (=1,39; Din cadrul liniilor consangvinizate de porumb zaharat, utilizate ca linii paterne putem afirma c:

13

Tez de doctorat talia plantei este transmis aditiv pozitiv de liniile zaharate T339R (16,26), T346 (14,34), T152 (7,09), TA22 (6,12) i T209 (5,30) n timp ce nlimea mai redus poate fi transmis de liniile zaharate LC153, T193A i T345R; liniile consangvinizate TD101su (4,39), LC153su (4,06), LC154su (3,25) au o capacitate general de transmitere a unui panicul cu numr mare de ramificaii n timp ce liniile zaharate TA21, T339R, TA25 i T345R transmit la hibrizi un numr mai redus de ramificaii la panicul; Rezultatele privind efectele genetice aditive pentru caracteristicile tiuletelui de porumb zaharat s-a putut constata c: pentru transmiterea la nivel aditiv a caracterului de producie exprimat prin greutatea tiuletelui, pot fi remarcate liniile zaharate LC153 (18,66), T339R (12,76) i TA25(6,37) n timp ce liniile TA28 (5,51) i T346 (2,53) transmit o greutate mai redus a tiuletelui n descenden; caracterul lungimea tiuletelui este transmis aditiv pozitiv de liniile T209su (2,24), T339Rsu (1,40) i TD101su (1,34), n timp ce liniile zaharate T346 (0,40), LC154 (0,39) i T152 (0,38) transmit un tiulete mai scurt la hibrizi;

3.1.3. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacitii specifice de combinareInteraciunile genice intra i interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele capacitii specifice de combinare (mn) calculate n cadrul sistemului de ncruciri ciclic. Pentru exprimarea cantitativ a nivelului de difereniere genic intra i interalelic, s-a calculat suma acestor efecte specifice pentru caracterele analizate (ij). Astfel s-a reuit identificarea diferenierilor ntre liniile consangvinizate de porumb zaharat la nivel genetic neaditiv, att pentru trasnmiterea caracteristilor plantei ct i ale tiuletelui. Cele mai pronunate diferenieri pentru (ij ), pentru caracteristicile plantei, manifest linia T233su n combinaie cu T193Asu (32,79) ( cea mai pronunat diereniere la nivel genetic neaditiv), TA26su (4,87) i T152su (4,25).

14

Tez de doctorat Linia consangvinizat de porumb zaharat T244 se difereniaz la nivel genetic neaditiv de linia TA27su (11,9), dar i de liniile LC154 su (9,68), TA21 su (9,42), LC153su (8,88), TA22su (8,61), TA28su (8,58), T339Rsu (8,12), TA26su (4,67). Cea mai apropiat, pentru linia zaharat T244, la nivel intra i interalelic pentru caracterele plantei s-a constatat a fi linia T193Asu (-49,30). Fa de linia consangvinizat de porumb zaharat TC209, din punctul de vedere al aciunilor genice intra i interalelice, dup valoarea (ij ), se difereniaz la nivelul de transmitere neaditive a caracterelor plantei, liniile zaharate de tip sugarry: T193A (16,51), T345R (7,85), TD101 (6,52), TA22 (5,21), T209 (3,71). Analiza genetic la nivel neaditiv pentru cele trei linii consangvinizate de porumb zaharat, forme materne din cadrul sistemului factorial de ncruciri, reflect c cele mai pronunate diferenieri pentru valorile sumei efectelor calculate, pentru caracterele tiuletelui l manifest: linia T233su n combinaie cu T193Asu (105,91); linia T244su n combinaie cu liniile T339Rsu (37,64), TA27su (37,07), TA22su (23,85), TA21su (19,35), TA28su (15,14); Linia TC209su n combinaie cu T193Asu (42,84), TA25su (20,62), LC154su (16,21), TA22su (16,72), T345Rsu (9,72). 3.1.4. Exprimarea heterozisului la hibrizii simpli de porumb zaharat aflai n studiu la SCDA Turda Pentru greutatea tiuletelui, n medie pe sistemul experimental, la liniile parentale s-a nregistrat o greutate medie a tiuletelui de 85,86 grame n timp ce la combinaiile hibride aceasta este de 168,45 grame. Amplitudinea valorilor nregistrat la hibrizi este cuprins ntre 92,4 grame (T244su x T193Asu) i 206,69 grame la hibridul (TC209su x LC153su) n timp ce la linii se nregistreaz valori cuprinse ntre 61,65 grame i 115,78 grame. n toate cazurile, combinaiile hibride depesc media formelor parentale. Totui exist i cazuri n care diferenele ntre valoarea medie a prinilor i a hibrizilor este relativ redus (T244su x T193Asu, 85,39 respectiv 92,4). Ca urmare, heterozisul este i el slab manifestat (8,2%).

15

Tez de doctorat O explicaie ar fi aceea c liniile forme parentale ale hibrizilor simpli sunt obinute prin autopolenizare i selecie din hibrizi simpli. Astfel, aceste linii au ncorporate blocuri poligenice aparinnd la grupe heterotice diferite, ceea ce le confer o valoare a caracterului per se dar exist i o probabilitate ridicat de lips de difereniere (HA, 1999). Heterozisul produciei cu cele mai ridicate valori procentuale s-a nregistrat n general la hibrizii a cror mam a fost TC209su: TC209su x LC153su (140,10%), TC209su x TA26su (127,35%), TC209su x TA27su (125,14%), dar i la hibrizii care au avut ca form matern linia sugary T233 (T233su x T346su 118,09%; T233su x LC153su 117,33%, T233su x T3339Rsu 101,34%) sau linia T244su (T244su x LC153su -108,5%; T244su x T339Rsu 106,8%; T244su x TA26su 103,03%). Valori superioare ale heterozisului s-au nregistrat i n cazul profunzimii bobului (14,53% i 138,57%). 3.1.5.Exprimarea unor caractere de producie ale genotipurilor n relaie cu condiiile de mediu la hibrizii simpli de porumb zaharat aflai n studiu la SCDA Turda Datele privind influena hibridului, a anului asupra greutii tiuletelui au fost prelucrate statistic. Din analiza statistic rezult c ambii factori experimentali (an, genotip), precum i interaciunile simple i duble dintre acetia au avut influene semnificative asupra greutii tiuletelui, greutii pnuilor, lungimii tiuletelui, numrului de rnduri de boabe/tiulete. Dup cum se remarc din imaginea de mai sus (fig.4), greutatea pnuilor este mai mult influenat de condiiile pedoclimatice, anul avnd o pondere mai mare n manifestarea acestui caracter. Lungimea tiuletelui este un caracter important n ceea ce privete producia dar i aspectul tiuletelui (foarte important pentru comercializare).

16

Tez de doctorat

Fig.4. Cota de participare (%) a unor factori implicai n exprimarea greutii tiuletelui i a greutii pnuilor la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiai n anii 2005 i 2006 Influena factorilor i a interaciunii simple i duble dintre acetia este semnificativ. Din figura 5 putem observa c ponderea factorului B (genotipul) este ce mai mare (61%), ceea ce denot c anii au avut o influen mai puin pregnant n manifestarea acestui caracter (lungimea tiuletelui).

Fig.5. Cota de participare (%) a unor factori implicai n exprimarea lungimii tiuletelui i a numrului de rnduri de boabe pe tiulete la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiai n anii 2005 i 2006 i n cazul numrului de rnduri de boabe/tiulete (fig.5), genotipul a avut ponderea de influen cea mai mare (84%), fa de an (7%) sau interaciunea acestor doi factori (3%). Ponderea majoritar a contribuiei genotipului n exprimarea caracterelor analizate ne sugereaz faptul c hibrizii de porumb zaharat au o comportare relativ stabil, n condiii diferite de mediu, n privina caracterelor i a genotipurilor analizate (HA, 1999).

17

Tez de doctorat

3.1.6. Caracterizarea liniilor consangvinizate pe baza analizelor RAPD 3.1.6.1. Rezultate privind extracia i cuantificarea ADN-ului Dup extracia ADN-ului s-au fcut cuantificrile la spectofotometru Eppendorf BioPhotometer, la lungimea de und de A260/A280. n cazul liniilor de porumb analizate se constat c cele mai bune rezultate, n ceea ce privete cantitatea i puritatea de ADN se obin din embrioni prin aplicarea protocolului dup metoda Lodhi modificat de extracie. n ceea ce privete cantitatea de ADN obinut, cele mai mari valori s-au nregistrat n cazul utilizrii ca material biologic embrionii, prin utilizarea primului protocol de extracie (Lodhi modificat). Astfel din embrioni s-au obinut cantiti de 7893 12000 ng/l, n timp ce din endosperm valorile au fost mai mici respectiv ntre 3450-4370 ng/ l. n acest caz puritatea a avut valori de 1,5 i 2. Extracia realizat cu protocolul dup metoda Barry Miller, din endosperm, a reuit obinerea unui ADN a crui puritate a avut valori ntre 1,45 - 1,5, iar din extraciile din embrioni puritatea ADN-ului s-a situat ntre valorile 1,2-1,7. Ca urmare, extracia de ADN s-a realizat la toate celelalte genotipuri numai din embrioni i utiliznd protocolului elaborat de LODHI i colab, modificat (POP i colab., 2003). Cantitatea de ADN obinut a fost corespunztoare (1275 ng/l i 10593 ng/l), avnd n vedere c pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de asemenea, corespunztoare fiind cuprins ntre 1,52 i 2,01. Extracia de ADN s-a fcut, la liniile consangvinizate de porumb zaharat, din embrioni, n tabelul 20 fiind prezentate rezultatele numerice privind cantitatea de ADN i puritatea acestuia. 3.1.6.2. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 20 primeri care au dat benzi polimorfice n cazul extracie de ADN doar 6 dintre ei (OPB10, OPAB11, UBC241UBC 286, OPB 17, AB 11).

18

Tez de doctorat Amplificarea probelor s-a fcut n trei repetiii pentru fiecare primer. Interpretarea gelurilor obinute s-a fcut prin analiza statistic a imaginilor. n analiza statistic s-au inclus doar benzile cu o intensitate luminoas mare. ADN-ul standard utilizat const din 40 de fragmente cuprinse ntre 100 i 4000 pb. n urma comparrii cu ADN-ul standard s-a putut stabili mrimea fiecrui fragment amplificat.

Fig. 6. Produii de amplificare obinui cu primerul UBC286, 1T346; 2- TA21; 3 TC209; 4TA25; 5-TA28; 6T339R; 7T193A; 8T209; 9TD101; 10-TA26, 11 SW87; 12-T152; 13T233, 14T345R, 15T244, 16LC153; 17-TA22, 18LC154, 19-TA27. Primerii care au relevat polimorfism ntre genotipuri sunt: OPB 10 cu 7 benzi polimorfice, OPAB 11 cu 9 benzi polimorfice, UBC 241 cu 10 benzi polimorfice, UBC 286 cu 12 benzi polimorfice, OPB 17 cu 8 benzi polimorfice, AB 11 cu 10 benzi polimorfice. Cele mai multe benzi polimorfice s-au obinut cu primerul UBC 286 (figura 6). Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea cuprins ntre 200 i 2000 pb, majoritatea avnd ntre 300 i 1200 pb. Din figurile prezentate reiese n mod clar c, la toate liniile consangvinizate de porumb zaharat analizate, exist diferene notabile de structur genetic, relevate de markeri RAPD. Cu ct valorile distanelor genetice calculate sunt mai mici, cu att liniile consangvinizate sunt mai strns nrudite (mai apropiate genetic). Ca urmare, liniile TA27su i TD101su prezint cel mai mare grad de apropiere genetic, avnd valoarea distanei genetice cea mai mic (0,02), conform analizei moleculare. La fel i liniile zaharate LC153 i TA22 sunt foarte ndeprtate filogenetic, avnd distana genetic calculat, cu ajutorul markerilor moleculari RAPD, cea mai mare (0,32). De asemenea

19

Tez de doctorat distane genetice mari se nregistreaz cu ajutorul acestor markeri moleculari i ntre liniile zaharate LC153 i SW87 (0,3), T233(0,3), TC209 (0,28), T193A (0,27) precum i ntre LC154 i TA22 (0,28), SW87 i T233 (0,26). n cadrul dendrogramei (figura 7) se constat c liniile LC153su i LC154su formeaz un grup separat fa de celelalte linii consangvinizate studiate, cea mai mare deprtare filogenetic fiind nregistrat fa de liniile TA22su, T346su, TC209su. Faptul c liniile TA25su, TA26su i TA27su se gsesc n acelai grup al dendrogramei, iar distanele genetice sunt mici, nu fac dect s confirme acurateea rezultatelor experimentale obinute, aceste linii consangvinizate de porumb zaharat fiind de provenien comun. Mai mult, analiznd originea liniilor, constatm veridicitatea analizelor moleculare, liniile TA26su i TA27su fiind mai apropiate n cadrul aceluiai grup, cu att mai mult cu ct originea lor (genealogia) este mai apropiat. Se poate afirma, pe baza rezultatelor discutate n acest subcapitol c analizele RAPD reprezint un instrument sensibil de identificare, la nivel molecular, a variabilitii ntre liniile consangvinizate de porumb zaharat.

20

Tez de doctoratTA22 T346 TC209 T209 TA28 TA21 TA25 T193A T339R TA27 TA26 TD101 SV87 T152 T345R T233 T244 LC153 LC154 0.1

Fig. 7. Dendrograma obinut la liniile consangvinizate de porumb zaharat studiate

3.1.7. Eficiena seleciei asistate de markeri a liniilor consangvinizate de porumb zaharat n scopul ilustrrii seleciei asistate de merkeri a liniilor consangvinizate de porumb zaharat s-au calculat coeficienii de regresie linear dintre distanele genetice ntre liniile parentale i performanele hibrizilor obinui din liniile respective. S-a pornit de la idea c un coeficient de regresie semnificativ indic o legtur de cretere/descretere real ntre valorile distanelor genetice i performanele hibrizilor pentru caracterele luate n studiu. n cazul testrii capacitii specifice de combinare, selecia asistat de markeri RAPD s-a dovedit eficient pentru caractere ce constituie importante elemente de productivitate la porumbul zaharat (greutatea tiuletelui, lungimea tiuletelui i numrul de boabe/rnd) i mai puin sau total ineficient pentru nlimea plantei,21

Tez de doctorat numrul de rnduri/tiulete i profunzimea bobului. Este clar c, n funcie de testerii folosii, trebuie gsii markerii RAPD a cror eficien n selecia asistat de markeri s fie maxim, pentru toate caracterele de interes n ameliorarea acestei varieti de porumb.

4. CONCLUZIIPe baza rezultatelor obinute s-au putut formula cteva concluzii i recomandri asupra anumitor aspecte, cu privire la variabilitatea liniilor consangvinizate analizate, importante pentru procesul ameliorrii porumbului zaharat. 1. Pentru caracterele vegetative ale plantei (nlimea plantei, nlimea de inserie a tiuletelui, numrul total de frunze pe plant, suprafaa foliar, numrul de ramificaii la panicul, numrul de lstari pe plant) cu efecte genice care pot fi transmise aditiv, pot fi remarcate liniile: T244, TC209, T339R, LC153, LC154, T346 i T345R. 2. Liniile care pot transmite efecte genice aditiv pentru caracterele vegetative ale tiuletelui (greutatea tiuletelui, lungimea tiuletelui, greutatea pnuilor, diametrul tiuletelui, numr rnduri de boabe pe tiulete, profunzimea bobului) sunt: T339R, LC153, T346, TA27 i TA28. 3. Interaciunile genice intra i interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele capacitii specifice de combinare, astfel c cele mai pronunate diferenieri la nivel genetic neaditiv le manifest liniile: T233 n combinaie cu T193A , TA26 i T152; T244 n combinaie cu TA27, LC154, TA21, LC153, TA22, TA28, T339R, TA26; TC209 n combinaie cu T193A, T345R, TD101, TA22, T209. 4. n studiul realizat asupra 49 de hibrizi simpli direci, valorile superioare ale heterozisului s-au nregistrat n cazul greutii tiuletelui la combinaiile hibride: TC209 x LC153 (140,10%), TC209 x TA26 (127,35%), TC209 x TA27 (125,14%) dar i la combinaiile: T244 x LC153 (108,5%); T244 x T339R (106,8%); T244 x TA26 (103,03%)22

Tez de doctorat 5. Alegerea primerilor s-a dovedit destul de dificil, din cei 20 primeri doar 6 au relevat polimorfism ntre genotipuri; 6. Distanele genetice cele mai mari au fost nregistrate ntre liniile consangvinizate de origini diferite (LC153 i TA22), n timp ce distanele genetice mici arat o nrudire mai mult sau mai puin apropiat ntre liniile respective (TA27 cu TD101, LC153 cu LC154 dar i TA26 cu TA27) analiza RAPD fiind n general n concordan cu datele cu privire la originea materialului analizat. 7. Pentru importante elemente de productivitate la porumbul zaharat, precum greutatea tiuletelui, lungimea tiuletelui i numrul de boabe/rnd, selecia asistat de markeri RAPD poate nlocui cu succes testarea capacitii specifice de combinare a liniilor parentale. Aceast afirmaie este susinut prin rezultate pozitive, asigurate statistic, a coeficienilor de regresie liniar dintre distanele genetice ntre liniile parentale i performanele hibrizilor obinui din liniile respective pentru caracterele de interes. 8. Pe baza acestor rezultate se poate conchide c selecia asistat de markeri moleculari nu poate, n mod eficient, s nlocuiasc testarea capacitii generale de combinare. Pe de o parte, testerii au capaciti diferite de a reliefa valoarea liniilor consangvinizate testate, iar pe de alt parte, testarea CGC constituie un mod eficient de a elimina din etapele urmtoare de lucru liniile care, la modul general, au o slab capacitate combinativ.

23