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i

MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE ALPISTE (PHALARIS

CANARIENSIS L.) E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES E

HIPOGLICEMIANTES.

CAMPINAS

2015

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia de Alimentos

MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE ALPISTE (PHALARIS

CANARIENSIS L.) E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES E

HIPOGLICEMIANTES.

Dissertação apresentada à Faculdade

de Engenharia de Alimentos da

Universidade Estadual de Campinas

como parte dos requisitos exigidos

para obtenção do título de Mestra em

Ciência de Alimentos.

Orientador: PROF. DOUTOR MARCELO ALEXANDRE PRADO

Co-orientadora: DOUTORA DÉBORA BARBOSA VENDRAMINI COSTA

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL

DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA

MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA E

ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCELO ALEXANDRE PRADO

ASSINATURA DO ORIENTADOR

_________________________

CAMPINAS

2015

iv

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos

Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816

Oliveira, Michele Christine Machado de, 1984-

OL4c Caracterização do extrato aquoso de alpiste (Phalaris canariensis L.) e

avaliação dos efeitos antioxidantes e hipoglicemiantes. / Michele Christine

Machado de Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.

Orientador: Marcelo Alexandre Prado.

Coorientador: Débora Barbosa Vendramini Costa.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Engenharia de Alimentos.

1. Phalaris canariensis L.. 2. Atividade antioxidante. 3. Diabetes. 4.

Estreptozotocina. I. Prado, Marcelo Alexandre. II. Costa, Débora Barbosa

Vendramini. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de

Alimentos. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Characterization of aqueous extract of canary seed (Phalaris

canariensis L.) and evaluation of antioxidant and hypoglycemic effects.

Palavras-chave em inglês:

Phalaris canariensis L.

Antioxidant activity

Diabetes

Streptozotocin

Área de concentração: Ciência de Alimentos

Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos

Banca examinadora:

Marcelo Alexandre Prado [Orientador]

Mary Ann Foglio

Severino Matias de Alencar

Data de defesa: 02-07-2015

Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos

v

BANCA EXAMINADORA

____________________________

Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado

FEA/UNICAMP

Presidente

____________________________

Dra. Mary Ann Foglio

CPQBA

Membro

____________________________

Prof. Dr. Severino Matias de Alencar

ESALQ/USP

Membro

____________________________

Dra. Cínthia Baú Betim Cazarin

POSDOC- DEPAN – FEA

Membro

____________________________

Dr. João Ernesto de Carvalho

CPQBA/UNICAMP

Membro

vii

ABSTRACT

Studies concerning the application of antioxidant compounds from food in the prevention

or control of non-transmissible diseases attracted attention of the scientific community and

population in general, as theses studies open new possibilities for the discovery of new

bioactive compounds. Among foods that contain natural antioxidants, the seeds are an

important source of dietary supply. Among the seeds used by the population for medicinal

purposes is the canary seed (Phalaris canariensis L.), traditionally used as an alternative

treatment of diabetes, however there are only few studies concerning the biological actions

of this specie. Thus, the aim of this study was to evaluate the chemical composition and the

antioxidant and hypoglycemic activities of the aqueous extract from canary seed. The

chemical composition of the extract and seeds was performed according to the

methodology and standards of AOAC and Adolfo Lutz Institute. The used to evaluate the

antioxidant activity were ABTS (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico),

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity).

For the evaluation of the hypoglycemic activity, the streptozotocin-induced diabetes model

was conducted (STZ, single dose of 60 mg/kg, intraperitoneal route) in male Wistar rats,

which were randomly divided into groups of 10 animals, such as: sham (healthy animals,

non-diabetic), negative control (diabetic, untreated), treated with aqueous extract from

canary seeds (250, 500 and 1000 mg/kg, oral route, daily) and non-diabetic treated with

1000 mg/kg of the extract. Two protocols were performed: treatments for 28 days and for

87 days. In both experiments, the animals were weekly monitored for body weight,

glycemia and consumption of food and water. In the end of the experiments, organs were

removed and weighted and blood and urine were collected for biochemical, electrolytic and

histopathological evaluations, in order to evaluate the action of the aqueous extract of

canary seeds in diabetes. Results obtained for seeds obtained from two different lots and for

the extract were: humidity and dry residue (10.31%; 9.50%; 78.21%), ash (6%; 5.30%;

1.74%), proteins content (14.88%; 15.12%; 18.26%), lipid content (5.38%; 5.17%; 2.07%),

starch content (50.54g/100g; 48.04g/100g; 3.79g/100g) and total fibers (18.88g/100g;

17.29g/100g; 0.70g/100g). Fatty acids were predominantly: palmitic acid (12%) and

polyunsaturated: linoleic (53%), oleic (28%), linolenic (3%). Total phenolic compounds

(280.15 ± 3.05 µg EAG/g) and antioxidant activity: ABTS (228.93 ± 2.25µg eqtrolox/g),

DPPH (106.17 ± 6.69 µg eqtrolox/g) and ORAC (1177.37 ± 5.32 µM/g in the hydro

fraction and 147.79 ± 0.48 µM/g in the lipidic fraction). In sum, the aqueous extract from

canary seeds showed a nutritional potential and presented intermediate antioxidant activity.

Treatments with the extract in the experimental doses did not control the glycemic levels,

as wells as had no effects in the body weight, consumption of food and water and in any of

the biochemical and hematological evaluations, thus evidencing that the aqueous extract

from canary seeds does not have antidiabetogenic effects.

Keywords: Phalaris canariensis L., Canary seed, Diabetes, Antioxidants, Phenolic

Compounds, Biological Activity.

ix

RESUMO

Estudos envolvendo compostos antioxidantes presentes em alimentos e a prevenção ou

controle de algumas doenças não transmissíveis têm chamado a atenção da comunidade

científica e da população em geral, considerando que esses estudos abrem novas

possibilidades para a descoberta de novas substâncias bioativas. Entre os alimentos que

contém antioxidantes naturais, as sementes constituem uma importante fonte de suprimento

dietético. Dentre as sementes utilizadas pela população para fins medicinais está o alpiste

(Phalaris canariensis L.), tradicionalmente usado como tratamento alternativo para o

diabetes, porém são escassos os estudos científicos conduzidos com essa espécie. Dessa

forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a composição química e a atividade antioxidante

e hipoglicemiante do extrato aquoso de alpiste. A composição das sementes e do extrato

aquoso foram realizados segundo as normas e metodologias da AOAC e Instituto Adolfo

Lutz. Os métodos empregados para a avaliação da atividade antioxidante foram o ABTS

(2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico), DPPH radical (2,2-difenil-1-

picrilhidrazil) e o ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). A avaliação da atividade

hipoglicemiante foi realizada por meio do modelo de diabetes induzida por estreptozotocina

(STZ, dose única de 60 mg/kg, via intraperitoneal) em ratos Wistar machos, que foram

aleatoriamente distribuídos em grupos de 10 animais, sendo: sham (animais sadios não-

diabético); controle negativo (diabéticos não tratados), tratados com extrato aquoso de

alpiste (doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, via oral) e não diabéticos tratados com a dose de

1000 mg/kg. Dois protocolos foram realizados: tratamentos por 28 dias e de longa duração

por 87 dias. Em ambos protocolos os animais foram monitorados semanalmente quanto a

massa corporal, glicemia e consumo de água e ração. No final dos experimentos os órgãos

foram removidos e pesados e sangue e urina foram coletados para avaliações bioquímicas,

hematológicas, eletrolíticas e histopatológicas, afim de constatar a ação do extrato aquoso

de alpiste no diabetes. Os resultados obtidos nas sementes de dois lotes e do extrato aquoso

foram respectivamente: umidade e resíduo seco (10,31%; 9,50%; 78,21%), cinzas (6%;

5,30%; 1,74%), proteínas (14,88%; 15,12%; 18,26%), lipídeos (5,38%; 5,17%; 2,07%),

amido (50,54g/100g; 48,04g/100g; 3,79g/100g) e fibras totais (18,88g/100g; 17,29g/100g;

0,70g/100g). Os ácidos graxos encontrados predominantes foram: ácido palmítico (12%) e

poli-insaturados: linoleico (53%), oleico (28%) e linolênico (3%). Compostos fenólicos

totais (280,15 ± 3,05 µg EAG/g) e Atividade Antioxidante: ABTS (228,93 ± 2,25µg

eqtrolox/g), DPPH (106,17 ± 6,69 µg eqtrolox/g) e ORAC (1177,37 ± 5,32 µM/g na fração

hidro e 147,79 ± 0,48 µM/g na lipo). O alpiste e seu extrato mostraram potencial nutritivo,

e o extrato apresentou atividade antioxidante intermediária. O tratamento com extrato

aquoso de alpiste nas doses experimentais não controlou os níveis glicêmicos, bem como

não apresentou efeitos sobre a massa corporal, consumo de água e ração e em nenhum dos

parâmetros bioquímicos e hematológicos avaliados, evidenciando que este extrato não

apresenta efeitos antiabetogênicos.

Palavras-chave: Phalaris canariensis L., Alpiste, Diabetes, Antioxidantes, Compostos

Fenólicos, Atividade Biológica.

xi

SUMÁRIO

BANCA EXAMINADORA ................................................................................................................ v

ABSTRACT ..................................................................................................................................... vii

RESUMO .......................................................................................................................................... ix

SUMÁRIO ........................................................................................................................................ xi

DEDICATÓRIA ............................................................................................................................ xvii

AGRADECIMENTOS .................................................................................................................... xix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................................... xxi

LISTA DE TABELAS .................................................................................................................... xxv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................................. xxvii

INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................................... 1

Capítulo I ............................................................................................................................................. 5

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 7

1.1 Alpiste (Phalaris canarienses L.) ................................................................................................... 7

1.1.1 Descrição Botânica ................................................................................................................... 11

1.1.2 Classificação Científica ............................................................................................................ 12

1.2 Alimento com Alegação Funcional ............................................................................................. 13

1.3 Radicias Livres e Estresse Oxidativo .......................................................................................... 14

1.4 Compostos Fenólicos .................................................................................................................. 17

1.5 Atividade Antioxidante ............................................................................................................... 23

1.5.1 Metodologias Antioxidantes in vitro ........................................................................................ 29

1.6 Diabetes Mellitus ........................................................................................................................ 30

1.6.1 Estresse Oxidativo e Diabetes Mellitus .................................................................................... 33

1.6.2 Estatísticas e Incidência ........................................................................................................... 35

1.6.3 Insulina ..................................................................................................................................... 38

1.6.4 Características e Estágios da Doença ....................................................................................... 39

1.6.5 Causas ...................................................................................................................................... 41

1.6.6 Sintomas e Diagnóstico ............................................................................................................ 45

1.6.7 Tratamento, Prevenção e Cura ................................................................................................. 49

2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................................... 55

3. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................... 55

3.1 Objetivos Específicos .................................................................................................................. 55

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 56

xii

Capítulo II ......................................................................................................................................... 85

Resumo .............................................................................................................................................. 87

Abstract ............................................................................................................................................. 88

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 89

2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 90

2.1 Reagentes e Equipamentos .......................................................................................................... 90

2.2 Obtenção da Matéria-Prima ........................................................................................................ 90

2.3 Preparação do Extrato de P. canariensis L. ................................................................................. 91

2.4 Caracterização das Sementes de Alpiste e Extrato Aquoso de Alpiste ....................................... 91

2.4.1 Determinação do Teor de Umidade.......................................................................................... 91

2.4.2 Determinação do Resíduo Seco ................................................................................................ 92

2.4.3 Determinação de Resíduo Mineral Fixo ................................................................................... 92

2.4.4 Determinação de Proteínas ....................................................................................................... 92

2.4.5 Determinação de Lipídeos ........................................................................................................ 93

2.4.6 Fibras ........................................................................................................................................ 94

2.4.7 Amido ....................................................................................................................................... 94

2.4.8 Determinação de Carboidratos ................................................................................................. 94

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 94

4. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 106

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 107

Capítulo III ...................................................................................................................................... 115

Resumo ............................................................................................................................................ 117

Abstract ........................................................................................................................................... 118

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 119

1.1 Mecanismos de Ação dos Antioxidantes................................................................................... 120

1.2 Métodos Utilizados na Avaliação da Capacidade Antioxidante ............................................... 121

1.2.1 Quantificação de Compostos Fenólicos Totais ...................................................................... 123

1.2.2 Método ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido sulfônico) .............................. 123

1.2.3 Método DPPH ........................................................................................................................ 125

1.2.4 Método ORAC (Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio) .......................................... 127

2. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 129

2.1 Reagentes e Equipamentos ........................................................................................................ 129

2.2 Preparo do Extrato ..................................................................................................................... 130

2.3 Determinação de Compostos Fenólicos Totais ......................................................................... 130

2.4 ABTS......................................................................................................................................... 131

xiii

2.5 DPPH......................................................................................................................................... 131

2.6 ORAC ........................................................................................................................................ 132

2.6.1 Fração Hidrofílica .................................................................................................................. 132

2.6.2 Fração Lipofílica .................................................................................................................... 133

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 134

3.1 Teor de Fenólicos Totais ........................................................................................................... 134

3.2 ABTS......................................................................................................................................... 140

3.3 DPPH......................................................................................................................................... 141

3.4 ORAC ........................................................................................................................................ 141

4. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 148


Capítulo IV ...................................................................................................................................... 163

Resumo ............................................................................................................................................ 165

Abstract ........................................................................................................................................... 166

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 167

2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 172

2.1 Reagentes e Equipamentos ........................................................................................................ 172

2.2 Preparo do Extrato Aquoso de Sementes de P. canariensis L. .................................................. 173

2.3 Animais ..................................................................................................................................... 173

2.4 Análise de Toxicidade Dose Única ........................................................................................... 174

2.5 Indução de Diabetes Experimental por Estreptozotocina .......................................................... 175

2.6 Experimento I: 28 dias - Delineamento Experimental .............................................................. 176

2.7 Tratamentos ............................................................................................................................... 177

3. AVALIAÇÕES ........................................................................................................................... 177

3.1 Glicemia .................................................................................................................................... 178

3.2 Consumo Alimentar, de Água e Controle de Massa Corporal .................................................. 178

3.3 Eutanásia dos Animais e Coleta de Sangue............................................................................... 179

3.3.1 Análises Bioquímicas ............................................................................................................. 181

3.3.2 Hemoglobina Glicada ............................................................................................................. 183

3.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue ............................................................................. 184

3.3.4 Avaliação Histopatológica ..................................................................................................... 185

4. EXPERIMENTO II: 87 dias ....................................................................................................... 186

4.1 Delineamento Experimental ...................................................................................................... 186

4.2 Tratamentos ............................................................................................................................... 186

4.3 Avaliações ................................................................................................................................. 186

xiv


4.3.2 Hemoglobina Glicada ............................................................................................................. 187

4.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue e Avaliação Histopatológica ............................... 187

4.4 Análise Estatística ..................................................................................................................... 187

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 188

5.1 Análise de Toxicidade Aguda ................................................................................................... 188

5.2 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo Experimental de Diabetes

Induzida por Estreptozotocina – Teste de 28 dias ........................................................................... 188

5.2.1 Massa Corporal ...................................................................................................................... 189

5.2.2 Glicemia ................................................................................................................................. 191

5.2.3 Consumos de Ração, Água e Poliúria .................................................................................... 193


5.2.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada ..................................................................................... 202

5.2.6 Análise de Eletrólitos ............................................................................................................. 206

5.2.7 Peso Relativo dos Órgãos ....................................................................................................... 211

5.2.8 Histopatologia ........................................................................................................................ 212

5.3 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo Experimental de Diabetes

Induzida por Estreptozotocina – Teste de 87 dias. .......................................................................... 217

5.3.1 Massa Corporal ...................................................................................................................... 219

5.3.2 Glicemia ................................................................................................................................. 220

5.3.3 Consumo de Ração e Água .................................................................................................... 221


5.3.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada ..................................................................................... 224

5.3.6 Análise de Eletrólitos ............................................................................................................. 225

5.3.7 Peso Relativo dos Órgãos ....................................................................................................... 227

5.3.8 Histopatologia ........................................................................................................................ 228

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 230


CONCLUSÃO GERAL .................................................................................................................. 247

SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................................ 249

APÊNDICE ..................................................................................................................................... 251

ANEXO 1 ........................................................................................................................................ 253

ANEXO 2 ........................................................................................................................................ 254

ANEXO 3 ........................................................................................................................................ 255

ANEXO 4 ........................................................................................................................................ 256

xv

"O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos"

Eleonor Roosevelt

"Que seu remédio seja seu alimento, e que seu alimento seja seu remédio"

Hipócrates

“Ao se propor buscar novos conhecimentos e desvendar caminhos

alternativos tem-se a certeza de descobertas reveladoras”

RIEDER; GUARIM NETO, 2012.

http://pensador.uol.com.br/autor/hipocrates/

xvii

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus familiares em especial aos

meus pais Eliana e Marco, que sempre me incentivaram

em estudar mais e mais, minha querida mãe pelo amor,

dedicação e apoio incondicional ao longo de toda a minha

vida; ao meu namorado Matheus que soube respeitar e

entender minha ausência para conclusão desse trabalho, a

minha avó Filomena in memória que demonstrava muito

orgulho de sua netinha e deixa enormes saudades, sei que

estará sempre torcendo por mim, também dedico as

pessoas da minha família que adquiriram ao longo da

vida Diabetes, por vocês e para todos aqueles que sofrem

com ela, pequenos passos curiosos pensando na busca de

uma vida melhor...

xix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por não me deixar desistir de meus objetivos nos momentos

difíceis e de desanimo, pela força, benção e principalmente pelo dom da vida.

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), instituição na qual, lutei muito

para fazer parte, onde tive o privilégio de cursar a pós graduação.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado e minha co-

orientadora Dra. Débora Barbosa Vendramini Costa pela atenção, paciência e

conhecimentos transmitidos.

Ao CPQBA – Centro Pluridisciplicar de Pesquisas Químicas, Biológicas e

Agrícolas e a pessoa incrível do prof. Dr. João Ernesto de Carvalho em abrir as portas de

suas instalações e ceder materiais para desenvolvimento desse trabalho.

Ao pessoal do CPQBA da divisão de Farmacologia e Toxicologia, a qual levarei em

meu coração, pelas amizades e ajudas: Sirlene, Karin, Ana Lúcia, Vanessa, Lucas, Thais,

Janderson, principalmente à Michelle Pedroza Jorge que me ensinou e auxiliou muito neste

trabalho.

Agradeço aos professores e seus auxiliares João Ernesto de Carvalho, Juliana

Azevedo Lima Pallone, Daniel Barrera Arellano, Glaucia Maria Pastore, Sirlene Valerio

Tinti, Renato Grimaldi, Marcella Ap. Stahl, Iramaia Angelica Neri-Numa pelos auxílios

técnicos, fatores essenciais no sucesso desta dissertação.

Agradeço aos meus amigos do laboratório: Sheila, Janclei, Danilo, Pollyane,

Allisson, Gustavo, Alane e o sempre, sempre Seu Dirceu, a todos obrigada pela atenção,

carinho, pelos momentos de risadas que pude compartilhar com todos vocês e é claro a

imensa ajuda e conhecimentos transmitidos durante todo desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço à minha família, em especial a minha mãe, meu pai e meu namorado,

Matheus, pela compreensão em momentos que precisei estar ausente para que o meu

trabalho fosse feito com sucesso e, principalmente, por me encorajar a seguir meus sonhos.

Aos membros da banca examinadora, pelas contribuições, sugestões e atenção

dedicadas ao aperfeiçoamento deste trabalho.

À FUNCAMP pelo auxílio financeiro na compra de materiais.

À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.

Em geral, a todos que aqui não citei, mas que de certa forma colaboraram e

estiveram presentes ao longo deste trabalho com os quais vivi momentos maravilhosos

durante o decorrer de todo o curso, em fim a todos o meu sincero, MUITO

OBRIGADA!!!!!!

xxi

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Principais países exportadores de alpiste...........................................................................10

Figura 2. Principais países importadores...........................................................................................10

Figura 3. Aspectos gerais do alpiste A e B; C, D e F Phalaris canariensis. E Representação do

tamanho do grão de alpiste.................................................................................................................13

Figura 4. Processo de formação dos EROs.......................................................................................15

Figura 5. Esquema ilustrativo demonstrando os alvos das espécies reativas de oxigênio (EROs): as

proteínas, os lipídeos e o DNA...........................................................................................................16

Figura 6. Principais causas e consequências da ação dos radicais livres..........................................16

Figura 7. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários................................................................18

Figura 8. Estruturas químicas do ácido ferúlico, cafeico e p-cumárico............................................23

Figura 9. Fontes de espécies reativas e mecanismos de defesa.........................................................24

Figura 10. Maiores vias de produção de radicais livres e defesas antioxidantes enzimáticas e não-

enzimáticas. NOS: óxido nítrico sintase; ERNs: espécies reativas de nitrogênio; SOD: superóxido

dismutase; CAT: catalase; GPx: glutationa peroxidase; GR: glutationa redutase; GSH: glutationa;

GSSH: glutationa oxidada; NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato...........................26

Figura 11. Esquemas dos principais mecanismos de reação dos ensaios de capacidade antioxidante

total. A: Mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio (HAT); B: Mecanismo de

transferência de um elétron (SET)......................................................................................................27

Figura 12. Eventos metabólicos que levam a hiperlgicemia, num estado pós absortivo no diabetes

mellitus não controlada.......................................................................................................................31

Figura 13. Estresse oxidativo a partir do sobrepeso e o sedentarismo..............................................35

Figura 14. Classificação Etiológica do Diabetes Melittus.................................................................41

Figura 15. Extrato aquoso de sementes de alpiste após centrifugação...........................................100

Figura 16. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (A) de

alpiste (Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico

(C16:0): 24.448 min.; ácido oleico (C18:1): 28.129 min.; ácido linoleico (C18:2): 29.090 min.....102

Figura 17. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (B) de

alpiste (Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico

(C16:0): 24.432 min.; ácido oleico (C18: 1): 28,113 min. ácido linoleico (C18:2): 29.071............102

Figura 18. Reações com cátion radical ABTS.................................................................................124

Figura 19. Reações com DPPH.......................................................................................................126

Figura 20. Reação ORAC................................................................................................................127

xxii

Figura 21. Curva padrão de ácido gálico para quantificação de compostos fenólicos totais..........135

Figura 22. Curva padrão de trolox % Desativação ABTS em 6 minutos........................................140

Figura 23. Curva padrão de trolox para quatificação da atividade antioxidante por DPPH (% de

Desativação).....................................................................................................................................141

Figura 24. Curva Trolox Hidrofilico - tampão fosfato de potássio 75mM pH 7.4......................... 142

Figura 25. Curva Trolox Lipofílico - RMCD 7%............................................................................142

Figura 26. Estrutura química da Estreptozotocina..........................................................................169

Figura 27. Esquema ilustrativo da ação da estreptozotocina na célula β do pâncreas....................170

Figura 28. Sequência do preparo do extrato aquoso de alpiste.......................................................173

Figura 29. Condições ambientais dos grupos do estudo: A. Estantes com as gaiolas experimentais.

B. Gaiola experimental com cama de maravalha e animais em estudo............................................174

Figura 30. Análise de toxicidade aguda em ratos Wistar macho tratados com extrato aquoso de

sementes de alpiste...........................................................................................................................175

Figura 31. A. Gaiola do jejum. B. Administração intraperitoneal de estreptozotocina para indução

de diabetes........................................................................................................................................175

Figura 32. Disposição dos grupos, bebedouros e rações controlados.............................................176

Figura 33. A. Animal imobilizado. B. Gavagem do extrato aquoso de sementes de alpiste...........177

Figura 34. Coleta de sangue através da cauda do animal e leitura em glicosímetro...................... 178

Figura 35. Controle do consumo alimentar e massa corporal dos animais.....................................179

Figura 36. Analisador hematológico pocH-100 iν Diff...................................................................180

Figura 37. Centrifugação do sangue para obtenção do soro e Reflotron analisador automatizado

para análises bioquímicas.................................................................................................................180

Figura 38. Animais em jejum, necropsia e pesagem dos órgãos.....................................................181

Figura 39. Etapas para dosagem de hemoglobina glicada...............................................................184

Figura 40. Coleta de urina e o Aparelho 9180 Electrolyte Analyser...............................................185

Figura 41. Remoção do pâncreas e análise histopatológica dos órgãos (fígado, rins e pâncreas)..185

Figura 42. Variação da massa corporal durante o estudo de 28 dias...............................................190

Figura 43. Pesagem dos animais.....................................................................................................190

Figura 44. Consumo de ração durante as 4 semanas de experimento (28 dias)..............................194

Figura 45. Consumo de água durante as 4 semanas de experimento (28 dias)...............................195

Figura 46. Comparação das camas de maravalha quanto à poliúria................................................196

Figura 47. Principais alterações encontradas nas análises histopatológicas do Pâncreas, Fígado e

Rins. A: Pâncreas: hiperplasia da ilhota pancreática (400x); B: Pâncreas: microcistos (400x); C:

Pâncreas: necrose, apoptose e fibrose (200x); D: Diminuição do tamanho das ilhotas pancreáticas;

xxiii

E: Fígado: ectasia ductal (100x); F: Figado: fibrose portal leve (400x); G: Figado: infiltrado leve

sinusoidal (400x); H: Rim: leves alteraçoes degenerativas do epitélio tubular (400x)....................216

Figura 48. Comparação entre os tamanhos dos ratos diabéticos (menores) e não diabéticos

(maiores)...........................................................................................................................................217

Figura 49. Avaliação oftalmoscópica e comparação dos animais sem alterações e com cataratas.219

Figura 50. Variação de massa corporal durante o estudo de 87 dias...............................................220

Figura 51. Consumo de ração pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).............................221

Figura 52. Consumo de água pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias)..............................222

xxv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição centesimal de sementes de Phalaris canariensis e seu extrato aquoso (%).95

Tabela 2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica do extrato aquoso de Phalaris

canariensis – semente A e B............................................................................................................101

Tabela 3. Resultados obtidos do conteúdo de fenólicos totais........................................................135

Tabela 4. Resultados do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical ABTS•....140

Tabela 5. Habilidade do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical DPPH•....141

Tabela 6. Resultados ORAC............................................................................................................142

Tabela 7. Resultados do potencial antioxidante de padrões de referência......................................143

Tabela 8. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis de glicose

no sangue em animais diabéticos e controle, durante 28 dias de experimento................................192

Tabela 9. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos................197

Tabela 10. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos...........203

Tabela 11. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.............................207

Tabela 12. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos

animais induzidos ou não com STZ.................................................................................................211

Tabela 13. Avaliação das alterações nos olhos dos animais do experimento de 87 dias................219

Tabela 14. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis de

glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 87 dias de experimento....................221

Tabela 15. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos..............222

Tabela 16. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos...........224

Tabela 17. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.............................225

Tabela 18. Efeito do extrato de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos animais do

experimento de 87 dias.....................................................................................................................227

xxvii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA – Atividade Antioxidante

AAPH – [2,2’-azobis(2’-metilproprionamidine) dihidrocloreto]

AAT – Atividade Antioxidante Total

Abs – Absorbância

ABTS – (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico)

AGE – Produtos Finais de Glicação Avançada (Advanced Glycation End-

Products)

ALP – fosfatase alcalina

ALT (TGP) – alanina aminotransferase (transaminase glutâmico-pirúvica)

AOAC – Association of Official Analytical Chemists

AST (TGO) – aspartato aminotransferase (transaminase glutâmico-oxalacética)

ATP – Adenosina Trifosfato

AUC – Area Under the Fluorescence Decay Curve

B-PE – proteínas B-ficoeritrina

BU – Base Úmida

CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

CG – Cromatografia Gasosa

CHCM – Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

DACNT – Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis

DCNT – Doenças Crônicas Não-Transmissíveis

DM – Diabetes Mellitus

DM1 – Diabetes Mellitus tipo 1

DM2 – Diabetes Mellitus tipo 2

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

DPPH – radical 2,2 difenil-1-pricril-hidrazil

EA – Extrato Aquoso

EAG – Equivalente de ácido gálico

EDTA – Ácido etilenodiamina tetracético

ERNs – Espécies Reativas de Nitrogênio

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio

FDA – Food and Drug Administration

FEA – Faculdade de Engenharia de Alimentos

FEC – Fluido Extracelular

GA – glicolaldeído

GAE – Equivalente de ácido gálico

GGT – Gama-Glutamil Transferade, Gama-Glutamil transferase

GHb – Ácido Gama hidroxibutírico

GLUT2 – Transportador de Glicose tipo 2

GSH – glutationa reduzida

HAD – Hormônio Anti Diurético

HAT – Tranferência de Átomos de Hidrogênio (Hydrogen Atom Transfer)

Hb – hemoglobina

xxviii

HbA – Hemoglobina A

HbA1 – Hemoglobina glicada

Hb-G – Hemoglobina G

Hb-rápida – Hemoglobina rápida

Hb total – Hemoglobina total

HCM – Hemoglobina Corpuscular Média

HDL – lipoproteína de alta densidade

HHA – hipotálamo-hipofisário-adrenal

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

Ip – intraperitoneal

LDL – lipoproteína de baixa densidade

LEC – Líquido Extracelular

LIC – Líquido Intracelular

NAD – Nicotinamida Adenina Dinucleotideo

NADPH - adenina dinucleotídeo fosfato reduzida

OH· – Hidroxila

OMS – Organização Mundial de Saúde

ORAC – Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (Oxygen Radical Absor-

bance Capacity)

PLT- plaquetas

PTH – paratormônio

RBC – contagem de glóbulos vermelhos / hemácias

RMCD – Ciclodextrina Metilada Randomizada a 7%

R-PE – proteínas R-ficoeritrina

RPM – rotações por minuto

SBD – Sociedade Brasileira de Diabetes

SET – Transferência de Um Elétron (Single Electron Transfer)

STZ – Estreptozotocina

TE – Trolox Equivalente (Trolox Equivalent)

TEAC – Atividade Antioxidante Total Equivalente ao Trolox

TPC – Conteúdo Total de Fenólicos

UI/L – Unidades Internacionais por Litro

UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas

UV – Ultravioleta

VCM – Volume Corpuscular Médio

VLDL - lipoproteína de muito baixa densidade

V.O. – Via Oral

ω – ômega

1

INTRODUÇÃO GERAL

Desde 1996 tem-se observou-se a ocorrência em muitos países, inclusive no Brasil,

de um processo denominado transição epidemiológica, ou seja, uma significativa redução

nas doenças infecciosas e um grande aumento nas chamadas enfermidades crônico-

degenerativas (obesidade, diabetes, cardiovasculares, entre outras) não transmissíveis. Toda

essa mudança foi atribuída, principalmente, à modificação no padrão alimentar e no estilo

de vida (FRIAS, 1996).

As Doenças Crônicas Não-Transmissíveis (DCNT) são um dos maiores problemas

de saúde pública da atualidade. Estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS)

mostram que as DCNT são responsáveis por 63% dos 36 milhões de óbitos ocorridas no

mundo em 2008 (WHO, 2011a; BRASIL, 2011). No Brasil, as DCNT são igualmente

importantes, sendo responsáveis, em 2007, por 72% do total de mortes, com destaque para

as doenças do aparelho circulatório (31,3% dos óbitos), neoplasias (16,3%) e diabetes

(5,2%) (SCHMIDT et al., 2011; BRASIL, 2011).

De acordo com a OMS, um pequeno conjunto de fatores de risco responde pela

grande maioria das mortes por DCNT e por fração substancial da carga de doenças devido a

essas enfermidades. Dentre esses fatores, destacam-se o tabagismo, o consumo excessivo

de bebidas alcoólicas, dietas inadequadas e a inatividade física (WHO, 2011a; BRASIL

2011).

As alterações na estrutura da dieta, associadas a mudanças econômicas, sociais e

demográficas e suas repercussões na saúde populacional, vêm sendo observadas em

diversos países em desenvolvimento (POPKIN, 2001).

Em países em que anos atrás, verificava-se o consumo de dietas ricas em cereais,

leguminosas, frutas e verduras (ricas em fibras), com a modernização e o alto grau de

urbanização, favoreceu o aumento do consumo de dietas ricas em alimentos de origem

animal, assim como alimentos processados (ricos em gorduras e pobre em fibras). Como

consequência, houve aumento de moléstias tidas como típicas de sociedades desenvolvidas,

tais como: obesidade, constipação, hemorróidas, diverticulites, síndromes isquêmicas

miocárdicas, colesterolemia, diabetes, entre outras (FRIAS, 1996).

A tendência da falta de tempo do homem tem encurtado aquele dedicado às

refeições, o que tem implicações sobre o tipo de alimento a ser consumido. O consumo de

2

alimentos in natura é cada vez menor e vem sendo substituído pelos processados, com alto

teor energético (FERREIRA, 2010). Sobretudo, percebe-se que o Brasil enfrenta uma

transição nutricional negativa: o arroz com feijão, a alimentação diária do brasileiro, vem

sendo substituída por alimentos processados, industrializados, com excesso de gorduras, e

não saudáveis (BRAUNER; FURLAN, 2014).

Ao longo dos anos, as observações populares conduziram ao acúmulo de

informações relevantes sobre a eficácia e os efeitos medicinais das plantas. Todo este

conhecimento continua sendo válido para estimular o uso dos vegetais como

medicamentos, além de despertar grande interesse por pesquisas que conduzam à

identificação de substâncias naturais bioativas. Estima-se que cerca de 75% dos compostos

puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo

recomendações da medicina popular (YUNES; PEDROSA e CECHINEL FILHO, 2001;

BERTOLDI, 2006).

Muitos destes estudos visam a extração e identificação de antioxidantes naturais de

fontes vegetais, avaliação de suas propriedades biológicas, determinação de sua atividade

antioxidante in vitro e in vivo, estudo de sua aplicabilidade em produtos processados e

determinação de como o seu conteúdo e atividade são influenciados pelo cultivar,

maturidade, sazonalidade, práticas e período de colheita, procedimentos pós-colheita,

tecnologias de processamento e condições de processamento (ARABBI; GENOVESE e

LAJOLO, 2004; ALASALVAR et al., 2005; BERTOLDI, 2006).

As vantagens do consumo de grãos integrais e a crescente demanda por alimentos

com alegações funcionais têm levado pesquisadores a estudar outros grãos que possam

conferir benefícios semelhantes, e que ainda não foram explorados. Este é o caso do alpiste,

um pequeno grão elíptico que cresce em condições semelhantes às do trigo, e que desde

1997 tem sido avaliado como alimento humano e como ingrediente funcional na indústria

de alimentos (HUCL, 2001 apud GRAJEDA, et al., 2012; ABDEL-AAL et al., 1997).

Dentre os responsáveis pelos efeitos benéficos das sementes estão os compostos

fenólicos, que tem sido amplamente estudados, quanto às suas propriedades e seu potencial

antioxidante, atuando na prevenção de doenças degenerativas (VERMA et al., 2008;

DIMBERG et al., 1993; apud GRAJEDA, et al., 2012; DYKES; ROONEY, 2006; DE LA

PARRA et al., 2007; LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2011), tais como as doenças

3

cardiovasculares, doença de Alzheimer e diabetes (ZHAO & MOGHADASIAN, 2008;

GRAJEDA, et al., 2012).

Os níveis aumentados de glicose circulante no diabetes resultam no aumento da

produção de espécies reativas de oxigênio, que impõe uma situação patológica de estresse

celular, aumentando a necessidade do equilíbrio entre os componentes pró e antioxidantes

(BROWNLEE, 2005). Nesse sentido, por ser uma fonte de substâncias nutritivas e

antioxidantes as sementes de alpiste poderiam contribuir no controle desse desequilíbrio

oxidativo. De fato, existem diversos relatos informais sobre o uso do extrato aquoso de

alpiste, popularmente conhecido como “leite de alpiste” no controle da glicemia em

indivíduos diabéticos, porém não existem estudos científicos que comprovem tais efeitos.

Dessa forma, considerando a escassez de informações científicas acerca do uso do

alpiste como grão para consumo humano e a importância da busca por novas alternativas no

tratamento de moléstias incidentes não apenas na população brasileira, mas também na

maioria dos países industrializados propõem-se a realização do presente estudo, tendo por

objetivos fornecer informações científicas sobre o uso do extrato aquoso de alpiste (P.

canariensis L.) no controle da glicemia em modelo experimental de diabetes em ratos, além

da avaliação de suas propriedades antioxidantes e do conteúdo de compostos fenólicos

totais.

5

Capítulo I

UMA REVISÃO SOBRE ALPISTE (PHALARIS CANARIENSIS

L.), ALIMENTO COM ALEGAÇÕES FUNCIONAIS,

RADICAIS LIVRES, ESTRESSE OXIDATIVO, COMPOSTOS

FENÓLICOS, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E DIABETES

MELLITUS

Michele Christine Machado de Oliveira1, Débora Barbosa Vendramini Costa2,

Marcelo Alexandre Prado1

1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862, Campinas,

SP, Brasil. 2Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade

Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brasil.

7

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Alpiste (Phalaris canarienses L.)

Durante séculos, as diferentes culturas do mundo têm utilizado produtos naturais

como parte do acervo da medicina tradicional. Frente a isso, o uso de plantas medicinais,

seus extratos e princípios ativos vêm crescendo na assistência à saúde (VARANDA, 2006;

COSTA, 2011) em função de sua fácil aceitabilidade e disponibilidade. Dessa forma, os

interesses neste campo de pesquisa têm aumentado afim de reconhecer os reais benefícios

que possam proporcionar à saúde (VARANDA, 2006; BALUNAS et al., 2006; COSTA,

2011).

Diversos registros da OMS revelam que aproximadamente 80% da população

mundial já fez uso de algum tipo de planta com finalidade terapêutica. Dentro desses 80%,

pelo menos 30% das pessoas utilizam plantas medicinais por indicação médica (MARTINS

et al., 1992 apud BALBI, 2008). Estudos mostraram que 50 % dos medicamentos

aprovados entre 1981 e 2006, pelo Food and Drug Administration (FDA) dos Estados

Unidos, são direta ou indiretamente derivados de produtos naturais (FERREIRA e PINTO,

2010)

O uso de substâncias naturais para curar doenças tem sido uma prática antiga.

Comparado com compostos sintéticos, produtos naturais contém de forma inerente uma

ampla diversidade estrutural e desempenham um papel chave na descoberta de compostos

para novas pesquisas de drogas (NEWMAN, 2012).

A necessidade de desenvolvimento de novos fármacos para tratamento de doenças é

urgente e demanda uma vasta investigação e exploração das possibilidades, sendo a

natureza parte fundamental neste processo de busca, no qual os produtos naturais são fonte

importante de novos agentes farmacêuticos e moléculas bioativas (CRAGG; NEWMAN,

2013).

P. canariensis, ou alpiste, é citado como agente diurético e hipotensor, havendo

relatos etnofarmacológicos do seu uso como agente redutor da pressão arterial, sendo as

sementes utilizadas na medicina popular em forma de chá como um coadjuvante no

tratamento da hipertensão, diabetes mellitus e hipercolesterolemia (NOVAS et al., 2004),

associado ou não a outras formas de terapia tradicional (MERZOUKI et al., 2003 apud

GUTIERREZ, 2014).

8

Esse efeito também foi verificado por Ribeiro et al., (1985), que observou um

aumento significativo da diurese em ratas após a administração do extrato alcoólico das

sementes de alpiste (P. canariensis), que pode estar relacionado a um possível efeito

vasodilatador (BALBI; CAMPOS; ALVES, 2008). O alpiste é considerado pelas

comunidades tradicionais como uma planta medicinal. Suas sementes têm sido utilizadas

para o tratamento e prevenção de doença renal e de hipercolesterolemia (RIBEIRO et al.,

1986; ALBUQUERQUE et al., 2007; WRIGHT et al., 2007; COGLIATTI, 2012). No

entanto, mais informações científicas são necessárias para corroborar estas propriedades.

Além disso, o consumo de grandes quantidades de alimentos com propriedades

diuréticas, como alpiste, pode resultar em redução dos níveis de sódio e de potássio no

organismo devido ao aumento da taxa de excreção desses íons. A menor quantidade de

potássio no organismo poderia causar situações como aumento da fraqueza muscular e

sensação de exaustão (ANNUAL CANARY GRASS PHALARIS-CANARIENSIS

CULTIVA, 2011 apud ORTIZ, 2012).

Popularmente usado como hipolipemiante, nas Ilhas Canárias é consumido como

aperitivo e também é considerado ótimo remédio para os males da urina, rins e bexiga, e

refrescante para as ondas de calor da menopausa (MARAVILLAS Y PROPIEDADES DEL

ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012), arteriosclerose, distúrbios do aparelho geniturinário

(cistite), hiperazotemia (abundância de substâncias nitrogenadas no sangue), hiperuricemia,

gota, hipertensão arterial, edema, excesso de massa corporal acompanhado por retenção de

líquidos, gastrites e úlcera (especialmente úlceras do estômago). Relata-se o uso externo

para tratamento de eczema (USOS MEDICINALES Y APLICACIONES CURATIVAS

DEL ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012).

Tradicionalmente, as sementes de alpiste, ou “canário” são também utilizadas como

remédio popular no tratamento do diabetes e hipertensão; no entanto, não existe nenhuma

informação científica sobre os possíveis responsáveis bioativos para tais efeitos

(CAMPBELL, 2009; ESTRADA-SALAS et al., 2014).

O alpiste é originalmente nativo do Mediterrâneo, mas é cultivado em várias partes

do mundo que possuam clima temperado, sendo predominante em campos de cultivos e

regiões de zonas ribeirinhas (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012). Esta planta é

introduzida como fornecedora de sementes para a alimentação de pássaros, sozinha ou

misturada com outros grãos, como milho, semente de girassol, linhaça e outros cereais

9

(COSCIA; CASTEDO, 1967; MIRAVALLES et al., 2002 apud COGLIATTI, 2012) além

de ornamental. Também é usada em sopas, doces, na produção de cola em indústrias têxteis

(REIZ, 1982 apud BALBI; CAMPOS; ALVES, 2008) e farinha em pão (REQUISITOS

PARA LA SOLICITUD DE INSCRIPCION, RENOVACION Y MODIFICACION EN EL

REGISTRO DE MEDICAMENTOS DE ORIGEN NATURAL DE USO HUMANO, 2012

apud ORTIZ, 2012). P. canariensis é a única espécie de seu gênero cultivado para

produção de grãos, os outros são utilizados principalmente como forrageiras. Ele é

considerado um cereal menor, com as práticas de produção e um ciclo de vida semelhante

ao de outras culturas de grãos de inverno, como o trigo de primavera (Triticum aestivum L.)

(ROBINSON, 1979 apud COGLIATTI, 2012).

O Canadá é o líder mundial na produção e exportação anual de alpiste, sendo a

semente o componente mais importante de misturas de alimentos em gaiolas e ração de

pássaros silvestres, devido a sua composição única aliado as características que fazem deste

um cereal promissor para alimentos e usos industriais (ABDEL-AAL & HUCL, 2005 apud

ABDEL-AAL et al., 2011; ABDEL-AAL; HUCL & SOSULSKI, 1997a); (ABDEL-AAL;

HUCL & SOSULSKI, 1997b apud ABDEL-AAL et al., 2011), podendo ser transformadas

em farinha e farelo, para uso humano (GRAY, 1997 apud SMALL, 1999). Grajeda et al.,

(2012) avaliou a composição química da farinha de alpiste, e constatou semelhança no teor

de proteínas entre gãos comuns, tais como a cevada, aveia e trigo e o tratamento alcalino

para grãos de alpiste, mostrou efeitos positivos sobre a farinha obtida, uma vez que mostrou

um teor mais elevado de proteína, uma baixa proporção de lisina/arginina

(hipocolesterolêmico) e uma quantidade de espículas consideravelmente menor.

Investigações nos últimos anos sobre a composição dos grãos de alpiste foram

intensificados a fim de buscar novas utilizações industriais e alimentares, proporcionando

novos mercados. Possíveis usos para o consumo humano são de substituição da semente de

gergelim, amido e macarrão vermicelli (AGRICULTURE..., 2013). A seguir as Figuras 1 e

2 mostram os principais países exportadores e importadores de alpiste.

10

Figura 1. Principais países exportadores de alpiste.

Fonte: FAO, 2011.

Figura 2. Principais países importadores.

Fonte: FAO, 2011.

Mundialmente, alpiste é considerado uma cultura menor, em comparação com

outras espécies produtoras de grãos. Por exemplo, ao longo da década 2000 - 2009, a

produção mundial foi 242.621 toneladas por ano, em comparação com 142.930.946 e

615.415.472 toneladas para cevada e de trigo, respectivamente (FAO, 2011; COGLIATTI,

2012).

11

As sementes de alpiste não podem ser consideradas inócuas, pois possuem cascos

cobertos de pequenos pêlos ou espículas siliciosas (ABDEL-AAL et al., 1997;

COGLIATTI, 2012), que podem ser muito irritantes para a pele durante a colheita e

manuseio. Além disso, suas dimensões, composição e estrutura são semelhantes ao de

fibras que foram associadas com o desenvolvimento de câncer de esôfago em humanos

durante a ingestão (O'NEILL et al., 1980; COGLIATTI, 2012) e câncer de pele em ratos de

laboratório (MATUS-CÁDIZ; HUCL & VANDENBERG, 2003 apud LI, 2011).

A razão pela qual as aves sobrevivem ao consumo de alpiste apesar da toxicidade do

seu casco, é que elas retiram as sementes antes do consumo dos grumos (ABDEL-AAL;

HUCL e SOSULSKI, 1997; LI, 2011). Portanto, são necessários mais estudos sobre os

efeitos toxicológicos de espículas de alpiste, bem como viabilizar sua remoção por técnicas

genéticas ou de processamento (HOLT, 1988; PUTNAM et al., 1996; ROBINSON, 1978

apud ABDEL-AAL et al., 1997).

De acordo com a Universidade Nacional Autônoma do México o alpiste é

considerado como uma planta introduzida, detectada sem histórico de uso medicinal e

estudos para apoiar a sua eficácia química ou farmacológica (BIBLIOTECA DIGITAL DE

MEDICINA TRADICIONAL MEXICANA. UNAM. ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012).

1.1.1 Descrição Botânica

O alpiste é um tipo de grão proveniente da Família das Graminae Poaceae, do

Gênero Phalaris e da espécie canarienses, vulgarmente conhecidos como: canaryseed,

canarygrass anual, canário grama, alpista, alpiste, capim alpista e milho alpista. É do tipo

herbáceo atinge altura de aproximadamente 1 m, cujos talos são ocos e cilíndricos e

providos de nós, semelhantes ao bambu ou cana da Índia, com vários perfilhos e hábito de

crescimento ereto (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012). Isto coloca canarygrass

anual na mesma subfamília, mas diferente tribo, de trigo, cevada (Hordeum vulgare L.) e

centeio (Secale cereale L.) da tribo Triticale, ou aveia (Avena sativa L.) da tribo Aveneae

(PUTNAM et al., 1996 apud COGLIATTI, 2012). Suas folhas, flores e frutos, dispostos em

pequenas espigas, assemelhando-se às do trigo. O fruto tem aspecto brilhoso, de várias

cores envoltas com delicada casca lisa (PERIS; STÜBING; FIGUEIROLA, 1996). Sua

semente é pequena e elíptica e tem um comprimento de cerca de 3,9 - 5,1 mm e a sua

largura média situa-se entre 1,6 e 2,0 mm (HUCL et al., 2001 apud ALVARADO, 2013).

12

Alpiste tem um casco intacto, brilhante e amarela dourada, já o alpiste descascado é

de cor marrom escuro (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012; AGRICULTURE...,

2013).

Alpiste é uma cultura bem adaptada a dias longos quentes e noites frias.

Normalmente ele é cultivado com sucesso onde o trigo é cultivado (NORTON e FORD,

2002 apud COGLIATTI, 2012). Ele amadurece em aproximadamente 105 dias, sendo

enraizado, mais sensível ao calor e menos tolerante à seca, mantendo-se melhor em solos de

umidade abundantes e fértis (AGRICULTURE..., 2013).

1.1.2 Classificação Científica

Reino: Plantae

Sub-reino: Tracheobionta

Super-divisão: Spermatophyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Liliopsida

Subclasse: Commelinidae

Ordem: Cyperales

Família: Poaceae

Sexo: Phalaris L.

Espécie: Phalaris canariensis L. (REQUISITOS PARA LA SOLICITUD DE

INSCRIPCION, RENOVACION Y MODIFICACION EN EL REGISTRO DE

MEDICAMENTOS DE ORIGEN NATURAL DE USO HUMANO, 2012 apud ORTIZ,

2012).

Nomes comuns em inglês: Canarygrass Anual, canarygrass comum.

Na Figura 3 é apresentado os aspectos gerais do alpiste.

13

Figura 3. Aspectos gerais do alpiste A e B FONTE: www.sito.regione.campania.it (ADAM; DUNCAN,

1999); C, D e F Phalaris canariensis. FONTE: PERIS; STÜBING; FIGUEIROLA, (1996); ADAM;

DUNCAN, (1999); E Representação do tamanho do grão de alpiste FONTE: USDA-NRCS PLANTAS

Database; ADAM, DUNCAN, (1999).

1.2 Alimento com Alegação Funcional

Lajolo (2005); Pereira (2009) relatam que alimentos funcionais, ou alimentos com

alegações de propriedades funcionais, ou de saúde, podem ser descritos como alimento

semelhante em aparência ao alimento convencional, consumidos como parte da dieta usual,

capazes de produzir efeitos metabólicos ou fisiológicos úteis na manutenção de uma boa

saúde física e mental, podendo auxiliar na redução do risco de doenças crônico-

degenerativas, além de suas funções nutricionais básicas. Complementando a definição, o

autor salienta ainda que pode-se falar em ingrediente funcional, que seria o composto

responsável pela ação biológica contida no alimento. Para estes ingredientes ativos os

termos mais adequados são fitoquímicos ou compostos bioativos.

Alimentos antioxidantes que, além de fornecerem benefícios à saúde, auxiliam na

redução do risco de doenças, são conhecidos como alimentos com alegações funcionais

(PENNINGTON, 2002).

Grãos contêm uma série de importantes compostos fitoquímicos, entre eles

compostos fenólicos, fitatos e lignanas. A adstringência dos taninos (característica química)

http://www.sito.regione.campania.it/

14

de muitos destes compostos pode proteger as plantas dos insetos e animais, mas em

alimentos, contribue com um gosto amargo indesejável (NACZK et al., 1998; LIU, 2007;

ABDEL-AAL, 2011). Os taninos também podem complexar com proteínas e aminoácidos

essenciais reduzindo o valor nutricional dos cereais (NACZK et al., 1998; ABDEL-AAL,

2011). Muitos compostos fenólicos têm potentes propriedades antioxidantes, que protegem

as plantas contra radicais destrutivos (LIU, 2007; ABDEL-AAL, 2011). Há evidências de

que o consumo de grãos integrais reduz substancialmente os riscos para doenças

aterosclerótica, cardiovascular e diabetes, sendo tal ação atribuída não somente às fibras,

mas também aos compostos fenólicos presentes no grão (JACOBS e GALLAHER, 2004;

BETIM, 2008).

Diversas pesquisas vêm sendo realizadas nos diferentes segmentos visando a

descoberta de novas fontes nutricionais. A importância funcional desses compostos na

saúde humana tem levado inúmeros pesquisadores a realizarem estudos buscando

determinar as concentrações destes compostos nos alimentos mais consumidos (PEREIRA,

2009).

1.3 Radicias Livres e Estresse Oxidativo

O termo radical livre pode ser definido como um átomo ou conjunto de moléculas

orgânicas e inorgânicas que contêm em sua estrutura um ou mais elétrons não pareados,

independentes na sua existência. Ou seja, são átomos ou moléculas altamente reativos, que

contém número ímpar de elétrons em sua camada eletrônica (HALLIWELL, 1994;

COSTA, 2011). Tal configuração eletrônica faz dos radicais livres moléculas muito

instáveis, com meia-vida muito reduzida e muito reativas quimicamente. A presença desses

radicais no organismo humano torna crítica a manutenção de muitas funções fisiológicas

normais (POMPELLA, 1997 apud COSTA, 2011). A origem desses radicais se deve à

transferência de elétrons (BRIAN et al., 2012).

Os radicais livres se formam em um gama de reações de óxido-redução, podendo

ceder o elétron solitário, oxidando-se, ou receber outro elétron, reduzindo-se, como o que

ocorre com o radical superóxido (O2), que apresenta uma baixa capacidade de oxidação.

Portanto, os radicais livres podem provocar ou serem resultados dessas reações de óxido

redução. O radical OH· apresenta uma alta capacidade de difusão e por isso, é o mais

reativo na indução de danos celulares (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).

15

As espécies pró-oxidantes são produzidas naturalmente e exercem funções

biológicas fundamentais. As espécies reativas de oxigênio (EROs), como o próprio nome

indica, são derivadas do oxigênio molecular com atividade redox e maior reatividade

enquanto as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) são derivadas do óxido nítrico

(GOMES et al., 2005; GOMES et al., 2006; CHISTÉ, 2011).

Figura 4. Processo de formação dos EROs.

Fonte: RENZ, 2003.

O esquema acima (Figura 4) mostra o ânion radical superóxido (O2-·), o primeiro

intermediário monovalente do oxigênio até água, a partir dele, são formados os demais

EROs (RENZ, 2003).

As EROs e ERNs respectivamente são produzidas durante o metabolismo basal das

células, sendo exemplos dessas espécies o ânion superóxido, a radical hidroxila e o

peróxido de hidrogênio. Sob condições normais, nosso organismo possui enzimas

protetoras ou antioxidantes que reparam 99% dos danos causados pelas EROs e/ou ERNs

(HALLIWELL, 2001).

No organismo, as EROs e ERNs encontram-se envolvidas na produção de energia,

regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias

biológicas importantes. Por outro lado, se por alguma razão forem produzidas em excesso,

ou se as defesas antioxidantes endógenas funcionarem de forma deficiente, podem provocar

oxidações de macromoléculas, como os lípidos, carboidratos, proteínas ou DNA (estresse

oxidativo), (Figura 5) e as consequentes disfunções biológicas e doenças associadas

(HALLIWELL & GUTERIDGE 1999; BABIOR, 2004; QUINN et al., 2004; VALKO et

al., 2007; CHISTÉ, 2011). Isso acabará por levar a disfunção celular e, em última instância

a morte das células. Portanto o estresse oxidativo tem sido proposto para desempenhar um

importante papel na patogênese de muitas doenças (HALLIWELL & GUTTERIDGE,

1989; VALKO et al., 2007; DASTMALCHI, 2008). Vários estudos têm encontrado uma

forte ligação entre diabetes e estresse oxidativo (WEST, 2000; SINGH et al., 2005).

16

Figura 5. Esquema ilustrativo demonstrando os alvos das espécies reativas de oxigênio (EROs): as proteínas,

os lipídeos e o DNA.

Fonte: PALMA, 2013.

As EROs e ERNs são geradas dentro das células pela exposição a agentes

endógenos e exógenos. As fontes endógenas podem ser várias, tais como: (1) a cadeia

respiratória cuja redução monovalente de uma molécula de oxigênio dá origem a distintas

espécies reativas; (2) as células fagocitárias (monócitos, neutrófilos, e macrófagos) que

utilizam o sistema NADPH oxidase, resultando primeiramente na formação do radical

ânion superóxido, que é um dos principais responsáveis por desencadear a formação das

demais espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio; (3) a autoxidação de compostos de

carbono reduzidos, como aminoácidos, proteínas, lipídeos, glicídios e ácidos nucléicos; e

(4) a ativação catalítica de diversas enzimas do metabolismo intermediário como a xantina

oxidase, aldeído oxidase, monoamino oxidase, ciclo-oxigenase ou lipoxigenase

(HALLIWELL & GUTERIDGE 1999; BABIOR, 2004; QUINN et al., 2004; CHISTÉ,

2011). As fontes exógenas de EROs e ERNs englobam a exposição a radiações

(eletromagnéticas, luz solar, ozônio), a componentes dos cigarros, entre outros (CHOE &

MIN, 2006 apud CHISTÉ, 2011), conforme Figura 6.

Figura 6. Principais causas e consequências da ação dos radicais livres.

Fonte: FERREIRA et al., 2009.

17

A formação de EROs e ERNs tem sido amplamente estudada na deterioração

oxidativa de produtos alimentícios, bem como na patogênese de várias doenças humanas,

como aterosclerose, diabetes mellitus, inflamações crônicas, doenças neurodegenerativas,

envelhecimento, isquemias e certos tipos de câncer (FRANKEL, 1996; FRANKEL &

GERMAN, 2006; SURVESWARAN, 2007; VALKO et al., 2007; CHISTÉ, 2011). Devido

ao envolvimento em diversas patologias, o interesse no estudo de espécies reativas se

intensificou nos últimos anos, com enfoque principal na busca por novas substâncias

capazes de prevenir ou minimizar os danos oxidativos às células vivas (ALVES et al.,

2010).

Para combater os radicais livres os organismos produzem substâncias que são

capazes de regenerar ou prevenir os danos oxidativos, exercendo seu papel como

antioxidante. Além destas, substâncias com habilidade de sequestrar radicais livres podem

ser obtidas de fontes externas, como alimentos e bebidas (ALVES et al., 2010).

Inúmeros estudos clínicos e epidemiológicos têm demonstrado que o consumo de

frutas e vegetais está associda a menor risco de desenvolvimento de doenças crônicas, tais

como, o câncer, doenças cardiovasculares e diabetes (DASTMALCHI, 2008), que pode ser

devido à ação dos antioxidantes (DASTMALCHI et al., 2007; DASTMALCHI, 2008).

1.4 Compostos Fenólicos

Os vegetais possuem dois tipos de metabólitos: primários e secundários. Enquanto

os metabólitos primários respondem pela sobrevivência do vegetal, exercendo função ativa

nos processos de fotossíntese, respiração e assimilação de nutrientes; os metabólitos

secundários estão intimamente associados às estratégias de defesa das plantas (NASS, 2007

apud SILVA et al., 2010). Eles variam em qualidade e quantidade de espécie para espécie,

até mesmo na quantidade do metabólito de um local de ocorrência ou ciclo de cultivo para

outro, pois muitos deles têm sua síntese desencadeada por eventuais alterações a que as

plantas estão expostas (FERREIRA et al., 2000 apud MARTÃO, 2013). Além disso,

apresentam atividade biológica contra herbívoros e microrganismos, muitos desses

metabólitos são utilizados como inseticidas, fungicidas, proteção contra os raios UV, a

atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes (WINK, 1990 apud

MARTÃO, 2013). Os principais metabólitos secundários são distribuídos em três grupos de

18

acordo com sua rota biossintética: terpenos, compostos fenólicos e compostos contendo

nitrogênio (TAYZ; ZEIGER, 2004 apud SILVA et al., 2010).

A presença de moléculas bioativas tem sido amplamente estudada nos últimos anos,

devido à crescente popularidade dos medicamentos fitoterápicos (DINIZ et al., 2007). Os

compostos com ação bioativa de importância na farmacologia são produzidos através da

biossíntese dos metabólitos secundários (MARIOT e BARBIERI, 2007).

A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do

metabolismo da glicose, via dois intermediários, o ácido chiquímico e o acetil-CoA (Figura

7) (SANTOS, 2003 apud MONTAGNER, 2007).

Figura 7. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários.

Fonte: SANTOS, 2003 apud MONTAGNER, 2007.

Os compostos fenólicos são substâncias distribuídas no reino vegetal, sobretudo em

frutas e outros vegetais (BRAVO, 1998; SALES, 2011), que diferem em estrutura química

e reatividade (SHAHIDI e NACZK, 1995 apud BERTOLDI, 2006) e englobam desde

moléculas simples até outras com alto grau de polimerização (SALDANHA, 2005;

PORT’S, 2011). Vários estudos correlacionam propriedades antioxidantes de plantas

19

medicinais e alimentos com o alto teor de compostos fenólicos (RIBEIRO et al., 2008; SU,

2009).

Estes compostos possuem várias funções, tais como: crescimento da planta,

propriedades sensoriais tais como adstringência, cor, aroma e estabilidade oxidativa

(FARAH e DONANGELO, 2006; NACZK e SHAHIDI, 2004; COSTA, 2011), processos

germinativos da semente, defesa contra pragas/patógenos, danos oxidativos, reprodução, e

contribuem também para a pigmentação das plantas (ROBARDS et al., 1999; ÂNGELO e

JORGE, 2007). Em animais e humanos, estudos têm apontado que os compostos fenólicos

são capazes de bloquear as estruturas radicalares, devendo-se isto à estrutura química

(BRAVO, 1998; LIU, 2007; COSTA, 2011).

Compostos fenólicos são encontrados praticamente em todas as partes dos vegetais,

mas distribuídos em quantidades diferentes em cada uma delas, podendo variar em

diferentes populações de uma mesma espécie. O tipo e variedade de polifenóis variam com

o estágio de desenvolvimento da planta, grau de maturação, condições ambientais, solo,

manejo, processamento e armazenamento da matéria-prima (YEN e DUH, 1994; YEN e

DUH, 1995; SATO et al., 1996; MARKUS et al.,1999; CHAVAN; SHAHIDI e NACZK,

2001; SILVA, 2003). Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupo carboxílico

e um, ou mais, grupos hidroxila e/ou metoxila na molécula, conferindo propriedades

antioxidantes, tanto para os alimentos, como para o organismo (SOARES, 2002).

Esta classe de compostos apresenta uma grande diversidade e divide-se em

flavonóides (polifenóis) e não-flavonóides (fenóis simples ou ácidos). Os átomos de

hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes (orto-difenóis), localizados em várias posições

dos anéis A, B e C, as duplas ligações dos anéis benzênicos e a dupla ligação da função oxo

(-C=O) de algumas moléculas de flavonóides garantem a esses compostos sua alta atividade

antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996). Dentre os mais de cinco mil

fenólicos descritos destacam-se os flavonóides, cumarinas, taninos, ligninas, tocoferóis e

ácidos fenólicos (ROBARDS et al., 1999; ÂNGELO e JORGE, 2007).

O grupo de compostos fenólicos mais relevante nos alimentos é o dos flavonóides.

A este grupo pertence um número alargado de famílias de compostos como seja, os

flavanóis, os flavonóis, as flavanonas, as flavonas, as antocianinas e os taninos que diferem

no seu padrão de oxidação (GONÇALVES, 2007). Os compostos não-flavonóides são um

grupo vasto de compostos de onde se destacam os ácidos benzóicos, os ácidos cinâmicos,

20

os estilbenos e as isoflavonas. Os ácidos benzóicos e cinâmicos, frequentemente

denominados ácidos fenólicos, encontram-se nos frutos na forma livre em baixas

concentrações quando comparados com as suas formas conjugadas. Estes compostos

aparecem sobretudo sobre a forma de ésteres com ácido tartárico ou ligados a açúcares

(GONÇALVES, 2007).

Os compostos fenólicos estão disponíveis nos alimentos como ácidos fenólicos

(ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) (SOARES, 2002; COSTA, 2011),

flavonóides, lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos. Podem se apresentar em cadeias de

moléculas simples (fenóis simples, ácidos fenólicos, fenil-propanóides e flavonóides) ou

compostos altamente polimerizados (ligninas, lignanas, taninos) (ESPIN et al., 2007;

VADIVEL; BIESALSKI, 2011). Os fenóis mais comuns são polímeros e ligninas

insolúveis, e dentre os flavonóides mais encontrados estão a quercetina e a rutina, presentes

em café, chá e grãos (RICE-EVANS; MILLER e PAGANGA, 1997; BENAVENTE-

GARCIA et al., 2000; BERTOLDI, 2006). Os efeitos bioquímicos e farmacológicos dos

flavonóides são muito vastos, dentre estes destacam-se as ações antioxidante, anti-

inflamatória e antiplaquetária, além de efeitos antialergênicos. Quando em alimentos, os

flavonóides agem de forma a poupar o consumo de vitamina C, evitando a formação de

radicais livres (KOO & SUHAILA, 2001).

Quimicamente, compostos fenólicos são definidos como um grupo de substâncias

bastante diversificadas, que possuem pelo menos um anel aromático ligado a um ou mais

grupos hidroxila ou a outros grupos funcionais, como ésteres e glicosídeos, entre outros, em

que os mais importantes são os ácidos fenólicos (cafeico, clorogênico, ferúlico, gálico, ρ-

cumárico), os flavonóides (antocianinas, flavanas, flavonas, flavanonas, flavonóis,

isoflavonas) e os taninos (NACZK e SHAHIDI 2004; OLIVEIRA, 2010). A maior parte

dos compostos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza, mas sob a forma de

ésteres ou de heterosídeos, sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos

polares. Dentre os compostos fenólicos são encontradas estruturas tão variadas quanto as

dos ácidos fenólicos, dos derivados da cumarina, dos pigmentos hidrossolúveis das flores,

dos frutos e das folhas. Além disso, essa classe de compostos abrange as ligninas e os

taninos, polímeros com importantes funções nos vegetais (SIMÕES, 2000 apud ZICKER,

2011). São encontrados principalmente no pericarpo de grãos de cereais, assim, as frações

21

de farelo deve conter elevados níveis destes compostos (DYKES & ROONEY, 2007;

ABDEL-AAL, 2011).

A pesquisa tem mostrado que dietas ricas em frutas, legumes, grãos integrais e

outras fontes de compostos fenólicos podem levar a um aumento da quantidade de

antioxidantes no corpo humano (CAO et al., 1998; BRIAN et al., 2012). Além de fornecer

possíveis benefícios para a saúde, os ingrediente ricos em compostos fenólicos são

empregados como antioxidantes em uma variedade de sistemas alimentares (BREWER

2011; BRIAN et al., 2012).

Considerando que o hábito alimentar é um dos fatores determinantes para o estado

de saúde ou doença de um indivíduo, investigar os mecanismos de ação antioxidante pode

gerar resultados importantes para o incentivo do consumo de alimentos que propiciem a

diminuição do dano oxidativo, atuando, desse modo, na promoção da saúde humana

(SOUSA, 2013).

O mecanismo de ação dos antioxidantes é bem variado, desde a remoção do

oxigênio do meio, varredura dos EROs, sequestro dos metais catalizadores da formação de

radicais livres, aumento da geração de antioxidantes endógenos ou mesmo a interação de

mais de um mecanismo (RENZ, 2003).

Em geral os compostos fenólicos são multifuncionais como antioxidantes, pois

atuam de várias formas: combatendo os radicais livres por meio da doação de um átomo de

hidrogênio de um grupo hidroxila (OH) da sua estrutura aromática, que possui a capacidade

de suportar um elétron desemparelhado por meio do deslocamento deste ao redor de todo o

sistema de elétrons da molécula; quelando metais de transição, como o Fe2+ e o Cu+;

interrompendo a reação de propagação dos radicais livres na oxidação lipídica;

modificando o potencial redox do meio; reparando a lesão a moléculas atacadas por

radicais livres (PODSEDEK, 2007; KYUNGMI et al., 2008; SUCUPIRA et al., 2012).

Os antioxidantes atuam em diferentes níveis na proteção dos organismos: o primeiro

mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir a sua formação, principalmente

pela inibição das reações em cadeia com o ferro e o cobre; interceptando os radicais livres

gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os

lipídeos, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poli-insaturados e

as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular. Os

antioxidantes obtidos da dieta, tais como as vitaminas C, E e A, os flavonóides e

22

carotenóides são extremamente importantes na intercepção dos radicais livres. Outro

mecanismo de proteção é o reparo das lesões causadas pelos radicais. Esse processo está

relacionado com a remoção de danos da molécula de DNA e a reconstituição das

membranas celulares danificadas. Em algumas situações pode ocorrer uma adaptação do

organismo em resposta a geração desses radicais com o aumento da síntese de enzimas

antioxidantes (BIANCHI & ANTUNES, 1999).

Os compostos fenólicos agem tanto na etapa de iniciação, como na de propagação

do processo oxidativo. Isto leva a produção de produtos intermediários, relativamente

estáveis devido à ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias (COSTA,

2011). O grau de hidroxilação e a posição dos grupos hidroxila na molécula dos compostos

fenólicos são os mais importantes fatores que determinam a atividade antioxidante nesses

compostos. O tipo de estrutura pode afetar na solubilidade e nos efeitos estéricos de cada

molécula, como ocorre nos derivados glicosilados, que podem aumentar ou diminuir a

atividade antioxidante (RICE-EVANS et al., 1996; COSTA, 2011).

Diferentes solventes podem ser utilizados para a extração dos compostos

antioxidantes, tais como: metanol, etanol, acetona, água, acetato de etila, propanol,

dimetilformaldeído e suas combinações (ANDREO & JORGE, 2006; ÂNGELO & JORGE,

2007; ZICKER, 2011). A água é comumente utilizada, pois apresenta maior abundância e

facilidade de obtenção, além de proporcionar uma extração eficiente devido à sua

polaridade (ANDREO & JORGE, 2006; ZICKER, 2011).

Sementes são fontes de compostos bioativos com atividade antioxidante e podem

conter variedades de moléculas capazes de sequestrar radicais livres, dentre estes estão os

compostos fenólicos (ácidos fenólicos, flavonóides, quinonas, cumarinas, lignanas,

estilbenos, taninos), vitaminas, terpenóides (incluindo carotenóides), e alguns outros

metabolitos endógenos (CAI et al., 2004; PORT’S, 2011). Li et al., (2011) e Cogliatti,

(2012) realizaram a quantificação e identificação dos componentes fenólicos em sementes

de alpiste, tendo sido encontrado três principais ácidos fenólicos: ferúlico, cafeico e p-

cumárico (Figura 8). Esses compostos fenólicos são amplamente estudados por suas ações

em câncer, doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas (ABDEL-

WAHAB et al., 2003; ZHAO & MOGHADASIAN, 2008; LI et al., 2011).

23

Figura 8. Estruturas químicas do ácido ferúlico, cafeico e p-cumárico.

Fonte: www.fciencias.com, (2014).

Os ácidos fenólicos em alpiste estão presentes em concentrações relativamente

elevadas, expresso em equivalente de ácido ferúlico, variou 174-209 mg/100 g para a

farinha integral de alpiste, 360-450 mg/100 g para o farelo e 124-138 mg/100 g para a

farinha, em particular a fração ligada insolúvel. Semelhante a outros grãos de cereais estão

concentrados principalmente na fração de farelo do alpiste (ABDEL-AAL et al., 2011),

dados apenas para informação, pois neste estudo foi utilizado equivalente em ácido gálico.

Os compostos fenólicos naturalmente encontrados nos alimentos são potentes

antioxidantes. Os antioxidantes da dieta e entre eles os compostos fenólicos, poderiam

prevenir os efeitos da hiperglicemia, que levam a disfunção celular e finalmente as

complicações tardias do diabetes (GIADA; MANCINI-FILHO, 2006).

1.5 Atividade Antioxidante

Os antioxidantes são substâncias que podem protelar ou impedir a oxidação de um

substrato agindo na prevenção, interceptação e/ou no reparo contra a formação de

substâncias nocivas as células ou tecidos (ROHENKOHL et al., 2011). Estas substâncias

podem reduzir os danos adversos, desintegrando os oxidantes antes que estes reajam com

os alvos biológicos, impedindo assim as reações em cadeia ou a ativação do oxigênio a

produtos altamente reativos (MALTA, 2011).

Várias reações oxidativas que ocorrem no organismo provoca a formação de

radicais livres, essas formas reativas de oxigênio causam danos às células contribuindo para

muitas doenças (SIKORA et al., 2008; SILVA et al., 2010). Por isso, as células humanas

dependem de certa capacidade antioxidante para fornecer proteção contra os efeitos

prejudiciais de radicais livres e espécies reativas do oxigênio, que são consequências

inevitáveis da vida aeróbica. Para alcançar uma proteção eficiente, os tecidos dispõem de

um sistema antioxidante integrado, que consiste de um arranjo de diversos componentes

lipossolúveis (vitamina E; carotenóides), hidrossolúveis (ácido ascórbico; glutatinona) e

http://www.fciencias.com/

24

enzimáticos (glutatinona peroxidase; superóxido dismutase; catalase) (SIES, 1993;

McLEAN et al., 2005; VALKO et al., 2007; SILVA et al., 2010; COSTA, 2011).

Outras micromoléculas antioxidantes podem ser adquiridas através da dieta, como

carotenóides e os compostos fenólicos presentes principalmente nos alimentos de origem

vegetal (BARREIROS et al., 2006; COSTA, 2011).

Observa-se que mesmo a nível fisiológico, não há uma total prevenção na

formação/atuação das EROs. A eficácia do sistema antioxidante depende da molécula

geradora do estresse oxidativo e da sua localização, intra ou extracelular (CAMINI, 2014).

Na Figura 9 demonstra os mecanimos de defesa.

Figura 9. Fontes de espécies reativas e mecanismos de defesa.

Fonte: GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007.

Evidências têm sugerido que a incidência de doenças crônico-degenerativas

causadas pelo estresse oxidativo em sistemas biológicos pode ser retardada pela ingestão de

antioxidantes naturais encontradas na dieta, principalmente compostos fenólicos (SIMÕES,

2000 apud ZICKER, 2011; MOREIRA & MANCINI-FILHO, 2004).

A definição de um bom antioxidante se dá pelas suas características químicas, como

a presença de doadores de elétrons ou de hidrogênio; capacidade de deslocamento do

radical formado em sua estrutura; potencial de quelar metais de transição envolvidos no

processo oxidativo e facilidade de acesso ao local de ação (MANACH e DONOVAN,

2004; COSTA, 2011), dependendo de sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de

partição (MANACH et al., 2004; SUCUPIRA et al., 2012).

25

As substâncias antioxidantes podem apresentar diferentes propriedades protetivas e

agir em diversas etapas do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos e

sendo portanto, classificadas em duas categorias principais: antioxidantes primários e

secundários. São considerados primários os compostos de ação antioxidante capazes de

inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres graças à doação de átomos de

hidrogênio ou de elétrons, o que transforma os radicais em substâncias estáveis. Os

antioxidantes secundários apresentam uma grande variedade de modos de ação: ligação de

íons metálicos (alteração de valência); inativação de EROs, conversão de hidroperóxidos

em espécies não-radicalares ou absorção de radiação UV (MAISUTHISAKUL;

SUTTAJIT; PONGSAWATMANIT, 2007; SILVA et al., 2010).

O equilíbrio entre agentes redutores e o sistema antioxidante é essencial. Portanto,

quantidades adequadas de antioxidantes no meio intracelular são de grande importância

para maior segurança contra os ataques dessas espécies reativas, prevenindo o aparecimento

de doenças e evitando suas complicações, principalmente no diabetes mellitus (VALKO, et

al., 2007; OLIVEIRA, 2010).

Os antioxidantes agem nas três linhas de defesa orgânica contra as EROs. A

primeira, é a de prevenção, caracterizando-se pela proteção contra a formação de

substâncias agressoras. A segunda, é a interceptação, os antioxidantes interceptam os

radicais livres, que uma vez formados iniciam suas atividades destrutivas. E a última, é o

reparo que ocorre quando as duas primeiras linhas não foram completamente efetivas e os

produtos de destruição pelos EROs estão sendo continuamente formados e podem se

acumular no organismo (KONG; LILLEI, 1998; ROHENKOHL et al., 2011).

Segundo Santos et al., (2010) existe uma correlação forte e positiva entre a presença

de compostos fenólicos e atividade antioxidante. Entretanto, o teor individual de cada

composto fenólico não está relacionado à presença de atividade antioxidante, e essa apenas

ocorre pelo sinergismo entre os compostos fenólicos e, provavelmente, pela presença de

outras substâncias ainda não identificadas e quantificadas (REYNERTSON et al., 2008;

ZICKER, 2011).

É fato estabelecido que além dos antioxidantes endógenos, é necessária a

participação dos antioxidantes dietéticos (Figura 10), pois são indispensáveis para a defesa

apropriada contra a oxidação e, por isso, têm importante papel na manutenção da saúde. Os

26

benefícios provenientes de frutas, hortaliças e demais vegetais deve-se em grande parte à

presença de antioxidantes nestes alimentos (LAMPE, 1999; COSTA, 2011).

Figura 10. Maiores vias de produção de radicais livres e defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas.

NOS: óxido nítrico sintase; ERNs: espécies reativas de nitrogênio; SOD: superóxido dismutase; CAT:

catalase; GPx: glutationa peroxidase; GR: glutationa redutase; GSH: glutationa; GSSH: glutationa oxidada;

NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.

Fonte: HOVATTA et al., 2010.

Entre as inúmeras fontes de antioxidantes naturais estão incluídos grãos e sementes

de oleaginosas (NAGEM; ALBUQUERQUE; MIRANDA, 1992), de cereais (TIAN;

WHITE, 1994), sementes de frutas, frutas (DAWES; KEENE, 1999), legumes

(GANTHAVORN; HUGHES, 1997) e especiarias (CHIPAULT et al., 1952; MADSEN;

BERTELSEN, 1995; MELO et al., 2003 apud ÂNGELO e JORGE, 2008).

A busca por antioxidantes naturais para produtos alimentícios, cosméticos e

farmacêuticos vem representando um importante desafio para a pesquisa industrial

(LAGUERRE; LECOMTE; VILLENEUVE, 2007; SILVA et al., 2010), sendo que os

consumidores vêm apresentando rejeição pelo uso de antioxidantes sintéticos, gerando um

crescente interesse na obtenção de antioxidantes provenientes de produtos vegetais (SILVA

et al., 2010).

O efeito do sequestro de radicais é determinado não somente pela reatividade do

antioxidante com o radical, mas também pela sua concentração. Embora muitos

27

antioxidantes reajam rapidamente com o radical hidroxil, muitas moléculas biológicas, que

são mais abundantes que os antioxidantes, reagem também rapidamente com esse radical.

Por isso é praticamente impossível para algum antioxidante sequestrar o radical hidroxil

efetivamente. Outro ponto importante é saber onde os radicais livres são produzidos, e se o

antioxidante é capaz de alcançá-los (NIKI, 2002 apud ALVES et al., 2010).

Estudos epidemiológicos têm mostrado que muitos destes compostos antioxidantes

atuam como anti-inflamatórios, antiateroscleróticos, antitumorais, antimutagênicos,

anticarcinogênicos, antibacterianos ou antivirais (SALA et al., 2002; OWEN et al., 2000).

Os mecanismos por meio dos quais os antioxidantes em alimentos exercem sua ação

podem ser divididos em duas possíveis vias: reações de transferência de um átomo de

hidrogênio ou de transferência de um elétron. O conhecimento destas duas reações é muito

importante para a compreensão e seleção dos métodos utilizados para medir a capacidade

antioxidante de compostos bioativos, observado na Figura 11 (PRIOR et al., 2005).

Figura 11. Esquemas dos principais mecanismos de reação dos ensaios de capacidade antioxidante total. A:

Mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio (HAT); B: Mecanismo de transferência de um elétron

(SET).

Fonte: CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011.

Métodos baseados no mecanismo de HAT investigam a capacidade dos

antioxidantes em bloquear a ação dos radicais peroxila (ROO) através da doação de

hidrogênio. Esses ensaios são compostos por um gerador sintético de radicais, responsável

pela manutenção do fluxo constante de ROO, pelos antioxidantes (da amostra ou do

padrão) e por uma sonda molecular (substrato oxidável) que, quando oxidada pela espécie

reativa, apresenta sinal mensurável. O antioxidante inibe, por competição, a oxidação do

28

substrato pela espécie reativa de oxigênio. Consequentemente ocorrerá uma mudança no

sinal medido, e a capacidade antioxidante da amostra pode ser quantificada. A presença dos

ROO no sistema como iniciadores da oxidação e a reação de competição, ocorrida

naturalmente nos alimentos, tornam os ensaios com mecanismo de HAT representativos de

um sistema alimentar em condições reais. Nesses ensaios a concentração do substrato

oxidável (sonda molecular) é frequentemente menor do que a do antioxidante (HUANG et

al.; PRIOR et al., 2005).

Os métodos baseados no mecanismo de SET envolvem apenas dois componentes:

os antioxidantes e o agente oxidante, que também será a sonda molecular, responsável pelo

sinal mensurável da reação. A sonda oxidante abstrai um elétron do antioxidante, causando

uma mudança na sua própria absorbância, permitindo o acompanhamento da reação e a

determinação da capacidade antioxidante da amostra. Dessa forma, os ensaios com

mecanismo de SET detectam a capacidade da amostra em reduzir o oxidante, que não

precisa ser estritamente um radical livre, ao contrário dos ensaios com mecanismo de HAT.

Os ensaios de SET apresentam mecanismos não competitivos e não se utilizam de espécies

reativas de oxigênio e, por isso, são considerados menos representativos das condições reais

em um alimento, quando comparados aos ensaios com mecanismo de HAT (HUANG et

al.; PRIOR et al., 2005).

Os mecanismos de SET e HAT, na maioria das vezes, ocorrem simultaneamente nos

alimentos, e seu equilíbrio é determinado principalmente pelas propriedades químicas dos

antioxidantes e pelas características físico-químicas do alimento. Portanto, para que a

determinação da capacidade antioxidante seja mais completa e representativa, recomenda-

se o uso de mais de um ensaio, de modo a contemplar ambos os mecanismos de reação

(CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).

Devido aos diferentes tipos de radicais livres e as suas diferentes formas de atuação

nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a

atividade antioxidante possa ser medida precisa e quantitativamente. Assim, a busca por

testes mais rápidos e eficientes tem gerado um grande número de métodos para avaliar a

atividade de antioxidantes naturais pelo uso de uma grande variedade de sistemas geradores

de radicais livres (ALVES et al., 2010).

29

1.5.1 Metodologias Antioxidantes in vitro

O problema em se determinar a atividade antioxidante dos compostos envolve dois

lados. Primeiro, em avaliar o potencial antioxidante, que é determinado pela composição de

antioxidantes e propriedades oxidativas de seus constituintes. Segundo, determinar seus

efeitos biológicos, que dependem, dentre outros, da biodisponibilidade dos antioxidantes

(ROGINSKY e LISSI, 2004; BERTOLDI, 2006).

Os métodos in vitro são avaliações potenciais da atividade antioxidante de um

determinado composto puro ou extrato, já que a interação fisiológica entre o organismo e o

antioxidante não é estudada, como ocorre nos métodos in vivo. Para a utilização de

antioxidantes em alimentos, para fins tecnológicos, a avaliação in vitro, se bem conduzida,

fornece uma estimativa importante do potencial antioxidativo do composto em análise

(BERTOLDI, 2006).

Não existe um único método que consiga avaliar satisfatoriamente a atividade

antioxidante de uma amostra, visto que ela depende da técnica utilizada, do tipo e

concentração do substrato, dos constituintes presentes no extrato avaliado, parâmetros

metodológicos como tempo e temperatura do ensaio, fenômeno de partição, fatores

interferentes, dentre outros. Os métodos utilizados para avaliação da ação antioxidante

deveriam ser baseados na identificação dos diferentes mecanismos antioxidativos sob

condições variadas, refletindo as propriedades multifuncionais dos antioxidantes nos

processos oxidativos encontrados nos alimentos e nos processos fisiológicos (BECKER;

NISSEN e SKIBSTED, 2004; BERTOLDI, 2006). Atualmente preconiza-se a utilização de

duas ou mais técnicas, já que nenhum ensaio usado isoladamente para determinar a

capacidade antioxidante irá refletir exatamente a “capacidade antioxidante total” de uma

amostra (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012).

Diversos métodos têm sido utilizados para determinar a atividade antioxidante in

vitro, de forma a permitir uma rápida seleção de substâncias e/ou misturas potencialmente

interessantes, na prevenção de doenças crônico-degenerativas (DUARTE-ALMEIDA et al.,

2006 apud SILVEIRA, 2008). Estes ensaios envolvem diferentes mecanismos do sistema

de defesa antioxidante, desde a quelação de íons metálicos até a medida da prevenção do

dano oxidativo a biomoléculas (GIADA; MANCINI-FILHO, 2004 apud SILVEIRA, 2008).

Estes métodos podem ser baseados na captura do radical peroxila (ORAC - oxygen

radical absorbance capacity, TRAP - total reactive antioxidant potential), poder de redução

30

do metal (FRAP - ferric reducing antioxidant power, CUPRAC - cupric ion reducing

antioxidant capacity), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do

radical orgânico (ABTS - 2,20-azino-bis (ácido 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfônico, DPPH -

peroxidação do 2,2-difenil-1-picrylhydrazil), quantificação de produtos formados durante a

peroxidação de lipídeos (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do -caroteno)

(FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003), etc.

Dentre estes métodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos mais usados

atualmente para determinar a capacidade antioxidante in vitro (PÉREZ-JIMÉNEZ e

SAURA-CALIXTO, 2006; BENZIE & STRAIN, 1996; CAO; ALESSIO e BUETTNER,

1993; SURVESWARAN, 2007). O método de branqueamento de β-caroteno, que avalia o

nível de inibição dos radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico,

também é bastante conhecido (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006 apud SUCUPIRA et al.,

2012).

1.6 Diabetes Mellitus

O conhecimento sobre diabetes mellitus já existia no antigo Egito e na Grécia. A

palavra “diabetes” é derivado da palavra grega “Diab” (ou seja, a passagem, referindo-se ao

ciclo de sede pesado e micção frequente, ou sifão), “mellitus” é a palavra latina para “leite e

mel” (refere-se à presença do açúcar na urina) (WARJEET, 2011 apud PATEL et al.,

2012). A denominação mellitus deriva do latim que significa como se fosse mel ou com

sabor de mel (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).

A primeira descrição do diabetes foi encontrada no papiro do médico egípcio

EBERS (1500 a.C.). Mas a poliúria (anomalia que se caracteriza pelo aumento da produção

de urina), típica de diabéticos, já aparece descrita 3000 a.C. pelo também egípicio

IMHOTEP (destacado personagem ligado ao Faraó ZOSSER). Dados históricos posteriores

indicam que dois médicos gregos, faziam seus acometidos beberem líquidos com bastante

frequência por terem intermitente sede e, por outro lado, urinarem também como muita

frequência. A ideia era então caracterizar esta anomalia como “um entra e sai” de líquido

no organismo (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).

Acreditava que a doença também liquefazia a carne e os ossos em urina, em face do

emagrecimento. A urina dos acometidos pela síndrome diabética apresentava sabor de mel.

31

Expelindo açúcar na urina, que ao ser evaporada fica um resíduo cristalino, assemelhado ao

sabor açúcar mascavo (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).

O diabetes mellitus é uma doença metabólica, lenta, progressiva e crônica (altera a

homeostase do organismo) que ocorre quando o pâncreas não produz níveis suficiente do

hormônio insulina ou quando o organismo não pode utilizar de forma eficaz a insulina que

produz (GROSS et al., 2002; ALMEIDA, 2011), resultando em um aumento da

concentração de glicose no sangue. A falta desse hormônio atinge, sobretudo, o

metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídeos, e é diagnosticada pela ocorrência de

hiperglicemia Figura 12 (NAZIROGLU; BUTTERWORTH, 2005; FERNANDES et al.,

2010). A hiperglicemia é característica comum da complicação, em que ocorre dificuldade

na utilização da glicose em consequência da resposta defeituosa ou deficiente à secreção de

insulina, havendo, portanto, aumento dos níveis de glicose no sangue (NEGRI, 2005).

A hiperglicemia sustentada leva a uma maior diminuição da produção de insulina

pela células-β das ilhotas de Langerhans, a chamada de toxicidade da glicose

(PALANISAMY et al., 2011; SUBRAMANI et al., 2014). Hiperglicemia crônica é o

iniciador de uma série de reações em cascata que culminam no desenvolvimento de

complicações diabéticas, tais como a cegueira, doenças cardíaca e renal, podendo atingir

nervos e vasos sanguíneos (BÓRTOLI et al., 1997; PARI; SATHEESH, 2006).

Figura 12. Eventos metabólicos que levam a hiperglicemia, num estado pós absortivo no diabetes mellitus

não controlada.

Fonte: McCOWEN; SMITH, 2005 apud BETTENCOURT, 2010.

32

Em condições fisiológicas a regulação da glicemia é mantida através de um delicado

balanço entre a secreção de insulina e a sensibilidade à insulina. Assim, um sinal inicial de

intolerância à glicose e/ou uma diminuição na sensibilidade da insulina nos tecidos

periféricos resulta no aumento compensatório da secreção da insulina para a manutenção da

normoglicemia (TFAYLI; ARSLANIAN, 2009; SALES, 2011). Por outro lado, em alguns

indivíduos, a relação hiperbólica que governa esse balanço está prejudicada e tem reflexos

diretos nas células β-pancreáticas, as quais não respondem às elevadas concentrações de

insulina com uma diminuição da secreção desse hormônio, aumentando assim a resistência

insulínica (TFAYLI; ARSLANIAN, 2009; SALES, 2011).

A resistência à insulina é definida como uma alteração em que uma quantidade

normal de insulina excretada produz uma resposta anormal, não só prejudica a absorção da

glicose por parte das células sensíveis à insulina, mas também provoca a mudança da

glicólise para a gliconeogênese nas células hepáticas, aumentando, assim, ainda mais os

níveis de glicose no sangue. Esta resistência é inicialmente compensada por um aumento da

secreção da insulina. Contudo, uma exposição prolongada a níveis elevados de glicose no

sangue causa exaustão das células-β e toxicidade da glicose. Quando o pâncreas não

consegue segregar insulina suficiente para se atingir um nível de normal, atinge-se um

estado de hiperglicemia persistente que leva a DM (RIOS & WARD, 2008 apud RAMOS,

2011), acarretando também hipertrigliceridemia e elevações das frações do colesterol

(FERREIRA; OLIVEIRA; FRANCA, 2007).

Se, por um lado, a descoberta da insulina e de seu uso terapêutico possibilitaram

uma diminuição significativa das complicações agudas do diabetes, particularmente a

cetoacidose, por outro, a evolução crônica do diabetes tem se apresentado com uma

prevalência crescente de complicações macro e microvasculares. Estas complicações

degenerativas na síndrome diabética, notadamente a retinopatia, a nefropatia e a neuropatia,

vêm se colocando como um sério problema, pois compromete a qualidade de vida do

diabético, incapacitando e diminuindo sua sobrevida (FOSS, 1989).

Mudanças no estilo de vida, como hábitos alimentares mais saudáveis e prática de

atividade física, são determinantes para melhora da doença (SILVA; MURA, 2007).

Alguns estudos demonstram que o controle de massa corporal e aumento da

atividade física diminuem a resistência à insulina, diminuindo as chances de se desenvolver

o diabetes mellitus (PAN et al., 1997). A prática de atividades físicas regulares promove

33

um aumento do turnover da insulina por maior captação hepática e melhor sensibilidade

dos receptores periféricos (OSHIDA et al., 1989 apud SARTORELLI; FRANCO, 2003),

diminuindo a glicose sanguínea aumentando a captação de glicose pelos músculos do corpo

(LUCENA, 2007), associada à dieta, melhora o perfil lipídico de indivíduos em risco de

desenvolvimento de doenças cardiovasculares (STEFANICK et al., 1998).

Em contrapartida, um padrão alimentar mais saudável, rico em frutas, verduras,

legumes e peixes, demonstrou ser um fator protetor para o desenvolvimento de tolerância à

glicose diminuída e da síndrome metabólica (WILLIAMS et al., 2000).

1.6.1 Estresse Oxidativo e Diabetes Mellitus

Nos organismos vivos, o estresse oxidativo leva à formação de compostos

potencialmente tóxicos e danosos ao organismo, como os radicais livres, que podem

prejudicar a saúde humana, aumentando o risco de doenças cardíacas e degenerativas, além

de contribuir para o envelhecimento (BERTOLDI, 2006).

Radicais livres de oxigênio e estresse oxidativo parece ser um elemento importante

da produção de complicações secundárias em diabetes (THOMSON e MCNEIL, 1993;

THORNALLEY et al., 1996 apud KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).

Diabetes mellitus, é uma doença metabólica crônica que tem efeito profundo na

qualidade de vida em termos de saúde física, bem como o bem-estar social e psicológico.

Os efeitos prejudiciais das complicações do diabetes são principalmente mediados pelo

estresse oxidativo (KOYA; KING, 1998; DUTTA, 2013). O diabetes está associado com o

aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (PITOZZI et al., 2003;

CERIELLO, 2000; BAYNES, 1991; BAYNES; THORPE, 1999 apud DUTTA, 2013) e a

hiperglicemia é o fator central na geração do estresse oxidativo, pois nessas condições há

desequilíbrio no balanço entre produção de EROs e o sistema antioxidante intracelular, que

envolve diminuição da disponibilidade da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

reduzida (NADPH) e da glutationa reduzida (WOLFF; DEAN, 1987 apud Research

Communications, 1999; DÍAZ-FLORES et al., 2004 apud SALES, 2011). Tal condição é

desencadeada pela reação não enzimática da glicose com os grupos amino terminais de

proteínas por meio de uma reação denominada glicação. A glicação das proteínas, seguida

da formação de radicais livres, tem sido proposta como um dos mais importantes processos

na patogênese do diabetes (NOVELLI, 2005 apud OLIVEIRA, 2010). Como consequência

34

há também peroxidação lipídica e danos em membranas (HUNT et al., 1988;

KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).

O papel do estresse oxidativo como determinante principal no início e progressão

das complicações do diabetes mellitus (DM) tem despertado grande interesse em razão de

que o desequilíbrio entre a produção de EROs e a capacidade antioxidante endógena

ocasiona o aumento da atividade da aldose redutase, formando produtos avançados da

glicosilação não-enzimática e promovendo a via das hexosaminas (TANIYAMA;

GRIENDLING, 2003; REIS et al., 2008; SALES, 2011).

Um dos principais mecanismos patogênicos responsáveis pelos danos celulares e

teciduais relacionados ao estresse oxidativo no diabetes envolve a formação de produtos

finais de glicação avançada, os quais são lipídeos ou proteínas que se tornam glicados após

a exposição a açúcares oxidados e que atuam modificando proteínas intracelulares

relacionadas com a regulação gênica, interferindo na sinalização celular e ainda

estimulando a produção de citocinas inflamatórias (BARBOSA; OLIVEIRA; SEARA,

2009; SALES, 2011). Além disso, o estresse oxidativo induzido por hiperglicemia crônica

tem sido associados com a disfunção e a apoptose de vários tipos de células, incluindo as

células pancreáticas (WU et al., 2004; DE et al., 2010), neurônios e células gliais (RUSSEL

et al., 2002, VINCENT et al., 2004; DE et al., 2010).

Níveis elevados de peróxidos lipídicos circulantes têm sido registrado em pacientes

diabéticos e animais experimentalmente diabéticos (SRINIVASAN et al., 1997; STANELY

e MENON, 1998; KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003). Peróxidos lipídicos circulantes

são capazes de iniciar a aterosclerose e também estão relacionados com as doenças

coronarianas (HESSLER et al., 1983 apud KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).

Considerando o envolvimento do estresse oxidativo (Figura 13) na patogênese do

DM e de outras Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis (DACNT), a busca por

agentes antioxidantes naturais tem fundamental importância (HUBER; RODRIGUEZ-

AMAYA, 2008; SALES, 2011).

35

Figura 13. Estresse oxidativo a partir do sobrepeso e o sedentarismo.

Fonte: McLELLAN et al., 2007.

1.6.2 Estatísticas e Incidência

Segundo estimativas da OMS, mais de 60% dos óbitos mundiais são devidos às

DCNT (WHO, 2005). O aumento da carga dessas doenças é consequência direta dos

processos de transição demográfica, da urbanização acelerada, progressiva expectativa de

vida, mudança no padrão alimentar, crescimento econômico e social, tabagismo e

sedentarismo, entre outros fatores (WHO, 2011b; SCHMIDT et al., 2011). Dentre as

doenças, o diabetes mostra-se como umas das mais importantes e diretamente relacionada

com a industrialização e as subsequentes mudanças nos hábitos das sociedades modernas

(AREAS, 1994). A incidência de diabetes mellitus está em ascensão em todo o mundo

(GUPTA et al., 2005).

Diabetes mellitus é uma doença tão antiga quanto a humanidade e sua inicidência é

considerada alta (4-5%) em todo o mundo (PICKUP; WILLIAMS, 1997 apud

KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).

De acordo com Foss (1989) a síndrome diabética é uma importante causa de

morbidade e mortalidade em diferentes grupos etários da população. Tal situação é

36

concordante com os mais importantes problemas de saúde a nível mundial, quando se

verifica que o diabetes, juntamente com as doenças cardiovasculares, tumores malignos e

traumatismos são as mais prevalentes doenças não-transmissíveis das populações de países

em diferentes estágios de desenvolvimento.

Afetando o corpo humano, em termos de saúde física, psicológica e social. Está se

tornando o terceiro "assassino" da saúde da humanidade, juntamente com o câncer, doenças

cardiovasculares e cerebrovasculares (CHAUHAN et al., 2010 apud PATEL et al., 2012).

Segundo a Federação Internacional do Diabetes, 2012; Hwang et al., 2012;

Subramani et al., 2014 estima-se que existam mais de 371 milhões de pessoas portadoras de

DM, mais ainda, esse número passaria para 552 milhões de pessoas até o ano de 2030.

Desses 371 milhões de pessoas com DM, apenas 185 milhões de pessoas são

diagnosticadas e tratadas. De acordo com Zhang et al., (2010), o DM gera altos custos para

o sistema de saúde devido as suas complicações micro e macrovasculares, tais como:

nefropatias, retinopatias, cardiopatias entre outras complicações crônicas e serevas como a

demência e transtornos do humor (depressão).

Os países líderes de prevalência de DM são a Índia, a China e os Estados Unidos.

No Brasil quatro milhões de casos foram notificados em 2000 (OMS, 2009). De acordo

com projeções da OMS, a prevalência de diabetes é susceptível de aumentar em 35%.

Atualmente, existem mais de 150 milhões de diabéticos em todo o mundo e outros 314

milhões com intolerância à glicose, um estado pré-diabético (EL-HILALY et al., 2006;

BERA et al., 2012).

A Organização Mundial de Saúde assinala sinais de prevalência aumentada de casos

de diabetes em todo o mundo, principalmente nas áreas de população com maior poder

aquisitivo, devido a maior capacidade de aquisição de alimentos industrializados,

principalmente os ricos em carboidratos simples. Esse aumento deve-se também à atuação

de diversos fatores que intervêm em sua gênese como a hereditariedade, a obesidade em

pessoas acima de 40 anos, vida sedentária, estados patológicos crônicos, condições

estressantes, certos medicamentos que podem fazer com que o diabete surja em indivíduos

predispostos (FRANCO; CHALOUB, 1985).

Na América Latina, o diabetes apresenta uma incidência que chega a ser um desafio

para a saúde pública afetando uma entre quarenta e até mesmo uma entre vinte pessoas da

população adulta, segundo dados da OMS (JOHNSON, 1991 apud AREAS 1994).

37

Em relação a América do Sul e a América Central, o Brasil possui cerca de 12,4

milhões de pessoas com a doença, seguido por Colombia, Venezuela e Argentina

(FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DO DIABETES, 2012).

No Brasil, o estudo Multicêntrico Sobre Prevalência de Diabetes Mellitus encontrou

uma prevalência geral da doença de 7,6% em pessoas de 30 aos 69 anos. Destas, metade

não sabem que possuem a doença e, das já diagnosticadas, 22% não fazem tratamento

(SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2003 apud GARCÍA et al., 2009;

MALERBI; FRANCO, 1992; ANDRADES, 2010). A maior prevalência de diabetes no

país está nas regiões mais desenvolvidas, o sul e o sudeste (SARTORELLI; FRANCO,

2003; ALMEIDA, 2011), sendo o DM tipo 2 o mais prevalente, englobando cerca de 90 a

95% dos casos (WILD et al., 2004; SILVA; MURA, 2007; BALARAMAN et al., 2010;

PATEL et al., 2012). Esse número vem crescendo devido ao aumento da expectativa de

vida, ao crescimento populacional, aos hábitos de vida menos saudáveis e a maior

sobrevida desses pacientes (LYRA; CAVALCANTI, 2006 apud ALMEIDA, 2011;

DABLA, 2010; KAMBLE; BODHANKAR, 2013).

O diabetes ocorre em todas as faixas etárias, indo desde a infância até a velhice,

assinalando-se a grande maioria tendo atingido os 40 anos de idade ou mais (FRANCO;

CHALOUB, 1985). A idade constitui fator a ser considerado, pois com o aumento da idade

a tolerância à glicose sofre redução, ocasionada pela perda da sensibilidade dos tecidos à

insulina e não à insuficiência de sua secreção (FRANCO; CHALOUB, 1985).

Quanto ao sexo, ocorre maior incidência entre as mulheres, sendo ainda maior em

mulheres acima dos 45 anos que tiveram filhos, o que pode, em parte, refletir a ação de

fatores ligados à gravidez (FRANCO; CHALOUB, 1985).

O grau de tolerância à glicose sofre a influência de diversos fatores como: idade,

vida sedentária, obesidade, regime alimentar, ação de diversos fármacos e substâncias,

certas afecções endócrinas, insuficiência renal, acidente vascular encefálico, infarto do

miocárdio e gravidez (FRANCO; CHALOUB, 1985).

Os cálculos aproximados afirmam a existência de grande número de diabéticos a

serem diagnosticados, por pertencerem às classes denominadas de pré-diabete, diabete

subclínico e diabete latente ou químico (FRANCO; CHALOUB, 1985).

38

1.6.3 Insulina

Insulina é um hormônio polipeptídico formado a partir de 52 aminoácidos,

produzido e secretado pelas células β das ilhotas de Langerhans do pâncreas (KATZUNG,

2007; PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ, 2012), controlando o

armazenamento e o metabolismo dos carboidratos, proteínas e lipídeos dos alimentos

ingeridos. O indivíduo normal, quando da ingestão de dieta com carboidratos ou mista,

secreta insulina no sangue em teor necessário para promover a captação, utilização e

armazenamento de glicose e gorduras para as diversas funções que esses elementos

nutritivos exercem (FRANCO; CHALOUB, 1985).

As funções da insulina são variadas. Embora a mais conhecida esteja relacionada

com o metabolismo de carboidratos, tem efeito também sobre o metabolismo de lípideos ou

de proteínas. Em geral, a insulina é um hormônio anabólico que estimula e inibe os

processos catabólicos. A curto prazo aumenta o fornecimento de substratos dentro da célula

e os resultados a médio prazo resultam em um aumento na atividade das enzimas

relacionadas com a formação de reservas energéticas (ORTIZ, 2012).

Sua ação mais imediata envolve a captação de glicose no sangue e seu metabolismo,

nos tecidos muscular e adiposo, e a inibição da neoglicogênese no tecido hepático (WHITE

& KAHN, 1994; BEZERRA, 1999). Além de seus efeitos primários no controle da

homeostase de glicose, a insulina participa em numerosos outros eventos celulares

incluindo controle da expressão gênica, além de mudanças na taxa de tradução, síntese de

DNA, síntese e degradação de proteínas e regulação do transporte de íons e aminoácidos

em praticamente todas as células (CHEATHAM & KAHN, 1995 apud BEZERRA, 1999).

Os efeitos específicos da insulina se desenvolvem em três órgãos-alvo: o fígado, o

tecido adiposo e os músculos esqueléticos através de efeitos anticatabólicos nesses três

alvos (FRANCO; CHALOUB, 1985).

No fígado, a insulina estimula o armazenamento de glicogênio ou inibe a

gliconeogênese e a glicogenólise. Nos tecidos periféricos (muscular e adiposo), a insulina

estimula a captação, armazenamento e utilização da glicose (FELIG & BERGMAN, 1990

apud UENO, 1998). Somando-se a estes efeitos principais, a insulina também estimula o

metabolismo de glicose em outros tecidos que têm pequeno ou nenhum papel na

homeostase da glicose como um todo. A insulina modifica ou aumenta a função de outros

reguladores do metabolismo destas células (KAHN et al., 1993 apud UENO, 1998). Por

39

conseguinte, é um hormônio hipoglicemiante (HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012;

PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ, 2012).

Como consequência à produção insuficiente de insulina ocorre produção excessiva

de glicose pelo fígado, diminuição da captação da glicose pelos músculos e células adiposas

(FRANCO; CHALOUB, 1985). A diminuição no conteúdo de glicogênio hepático e

muscular em ratos diabéticos é relatada em diferentes estudos (GROVER et al., 2002 apud

MAITI, 2004).

A importância do entendimento da ação da insulina justifica-se pelos quadros de

menor efeito biológico do hormônio, isto é, resistência à insulina, que tem importante papel

na patogênese de muitas doenças, incluindo diabetes mellitus, obesidade, hipertensão, e na

intolerância a glicose associada a muitas outras doenças endócrinas (DeFRONZO, 1988;

REAVEN, 1988; MOLLER & FLIER, 1991; UENO, 1998).

1.6.4 Características e Estágios da Doença

O DM1 representa cerca de 5 a 10% de todos os casos de DM e é caracterizada por

uma deficiência na produção de insulina. Esta deficiência resulta de um processo complexo

em que fatores genéticos e ambientais conduzem a uma resposta autoimune levando a

destruição das células β-pancreáticas produtoras de insulina (DAVIES et al., 1994;

BEARDSALL et al., 2006). Em relação ainda ao DM1, há aquele tipo no qual a causa da

destruição das células β não é conhecida, sendo denominada como forma idiopática do

DM1 (GROOP et al., 1986; IMAGAWA et al., 2000). Geralmente o DM1 inicia antes dos

30 anos de idade, mas pode acometer indivíduos de qualquer faixa etaria (VEHIK et al.,

2007; BARAT et al., 2008).

O diabetes tipo II aparece em geral em idades mais avançadas. Suas causas ainda

não foram esclarecidas em detalhes, porém é o tipo mais frequente na população,

representando cerca de 90% dos casos (ROSAK, 2002; KOOLMAN; RÖHM, 2005;

BEARDSALL et al., 2006; CAMPBELL et al., 2011; KARAGIANNIS et al., 2012). Esse

tipo de DM está altamente relacionado com um estilo de vida sedentário e com um alto

consumo calórico, motivo pelo qual é mais encontrado em adultos com sobrepeso e

obesidade. O aumento da gordura corporal causa um impacto negativo sobre a sensibilidade

à insulina. Em longo prazo, o DM2 aumenta os riscos do desenvolvimento de complicações

que são causa substancial de morbidade e mortalidade: doença macrovascular, nefropatia,

40

retinopatia e neuropatia (CALCUTT et al., 2009; MARIGLIANI, 2012). As complicações

do diabetes ainda incluem isquemia de membros levando a amputações, problemas

dentários e distúrbios da gravidez (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND

PREVENTION, 2011). A hiperglicemia nesses pacientes não só agrava a resistência, como

compromete a secreção da insulina (LYRA; CAVALCANTI, 2006 apud ALMEIDA,

2011). Diante disso, os tecidos perdem a sensibilidade a ação da insulina e,

consequentemente, a concentração de glicose sanguinea aumenta (CAMPBELL et al.,

2011; KARAGIANNIS et al., 2012; BEARDSALL et al., 2006; ROSAK, 2002).

O diabetes costuma ser dividido em quatro estágios, segundo a Associação de

Diabetes:

1 – Pré-diabetes ou diabetes potencial: desde a concepção até o aparecimento de

qualquer anormalia no metabolismo dos carboidratos.

2 – Diabetes subclínico, suspeito ou latente: as provas usuais de laboratório para

caracterizar a perturbação do metabolismo dos carboidratos são normais. As provas de

tolerância à glicose sensibilizada pela cortisona são positivas. Esta fase seria reversível,

uma vez que deixasse de atuar o fator diabetogênico desencadeante.

3 – Diabetes latente ou químico ou assintomático: sem apresentar os clássicos

sintomas do diabetes, apenas evidenciável pelas provas usuais de laboratório.

4 – Diabetes manifesto ou clínico: com o aparecimento dos sintomas típicos do

diabetes (FRANCO; CHALOUB, 1985).

De acordo com a Sociedade Brasileira de Diabetes, (2009), a classificação do DM é

baseada na etiologia da doença e não mais no tratamento do DM. Assim, sugere-se que os

termos insulinoindependente e insulinodependentes não sejam mais utilizados. O DM é

classificado em três tipos básicos: DM Tipo 1 (DM1), DM Tipo 2 (DM2) e DM

Gestacional (MARASCHIN et al., 2010; DIRETRIZES SBD, 2009).

Segundo Report os the Expert Commitee on the Diagnosis and Classification of

Diabetes melito, (2008), segue a Classificação Etiológica do Diabetes Melito, Figura 14.

41

Figura 14. Classificação Etiológica do Diabetes Melittus.

Fonte: ADA, 2008.

1.6.5 Causas

O processo de transição demográfica e epidemiológica, marcado pelo aumento da

prevalência de Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis (DACNT), traz consigo

implicações para o perfil nutricional e alimentar da população brasileira. Ao mesmo tempo,

como resultado da adoção do estilo de vida sedentário e do consumo de dietas

desbalanceadas houve redução da prevalência de desnutrição e aumento da prevalência de

sobrepeso e obesidade (BATISTA FILHO; RISSIN, 2003). Como consequência das

alterações metabólicas decorrentes dos hábitos de vida inadequados, as DACNT são

atualmente problemas de saúde pública que atingem proporções epidêmicas (AMERICAN

DIABETES ASSOCIATION, 2004). Dentre as DACNT, o diabetes mellitus, merece

destaque (WILD et al., 2004).

42

Durante o processo de digestão normal, o organismo transforma os carboidratos em

glicose, que é utilizada pelo tecido na presença de insulina (WARJEET, 2011 apud PATEL

et al., 2012). Conforme os níveis de glicose sobem, o pâncreas responde pela liberação do

hormônio insulina, que permite que a glicose deixe a corrente sanguínea e entre nas várias

células onde ela é um combustível para as atividades corporais. A glicose também é

capturada pelo fígado e é armazenada como glicogênio para o uso posterior. Quando as

concentrações de glicose da última refeição diminuem, o organismo vai de um estado de

alimentado para o de jejum. Os níveis de insulina reduzem, o que impede que os níveis de

glicose sanguínea diminuam. Além disso, a glicose armazenada é liberada do fígado de

volta para a corrente sanguínea com a ajuda do glucagon, um hormônio que também é

liberado pelo pâncreas. Normalmente, a capacidade do organismo de equilibrar a glicose, a

insulina e o glucagon (e outros hormônios contra-reguladores) mantêm os níveis

circulatórios de glicose dentro da variação normal.

O glucagon é um hormônio polipeptídico constituído por 29 aminoácidos

(HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012; PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ,

2012), produzido e secretado pelas células α das ilhotas de Langerhans no pâncreas. Ele

estimula a glicogenólise nos hepatócitos e gliconeogênese, sendo, portanto, um hormônio

hiperglicemiante (HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012; PANCREAS ENDOCRINO,

2012 apud ORTIZ, 2012). A insulina sérica varia diretamente com o teor de carboidrato na

dieta enquanto o glucagon sérico tende a decrescer quando o conteúdo de carboidrato

aumenta (UNGER & ORCI, 1976 apud JONG, 1996). A atividade simpática é mais

influenciada pela quantidade de proteína da dieta do que pelo lipídeo ou carboidrato (VAN

DER TUIG & ROMSOS, 1984; JONG, 1996).

A insulina promove baixa taxa de glicose no sangue e aumenta a utilização e o

armazenamento do glicogênio hepático e muscular. O excesso de carboidratos é

armazenado como gordura, para prevenir períodos de deficiência calórica e para fornecer

energia. A lipogênese converte o excesso de glicose e de intermediários, tais como o

piruvato, o lactato e a acetil-CoA à gordura, participando da fase anabólica do ciclo

alimentar (MURRAY et al., 2006). As fontes de ácidos graxos de cadeia longa são os

lipídeos da dieta a partir do acetil-CoA proveniente de carboidratos. Quase todos os

processos da digestão de carboidratos, proteínas e lipídeos são metabolizados, produzindo

43

um metabólito comum a acetilCoA, que é então oxidada no ciclo do ácido cítrico

(MURRAY et al., 2006).

Os ácidos graxos podem ser oxidados a acetil-CoA (β-oxidação) ou esterificados

com o glicerol, dando triacilgliceróis que são as principais reservas calóricas do organismo.

Embora os ácidos graxos sejam tanto oxidados quanto sintetizados a partir de acetil-CoA, a

oxidação dos ácidos graxos não é uma simples reversão da sua biossíntese. A separação

entre a oxidação e a biossíntese permite que cada processo seja individualmente controlado

e integrado às necessidades do tecido. O aumento da oxidação dos ácidos graxos é

característico dos estados de inanição e do diabetes, conduzindo a produção de corpos

cetônicos pelo fígado (MURRAY et al., 2006).

A acetil-CoA formada na β-oxidação tem vários destinos, um destes destinos é no

fígado, formando os corpos cetônicos (acetona, acetoacetato e 3-hidroxibutirato) que são

importantes combustíveis no jejum prolongado (MURRAY et al., 2006). Há perda de

corpos cetônicos pela urina, mas é apenas uma parcela do total de corpos cetônicos

produzidos e utilizados pelo organismo. Excreções contínuas e em grandes quantidades

esgotam a reserva alcalina provocando cetoacidose. Esse padrão geral do metabolismo pode

estar exagerado, determinando os estados patológicos encontrados na doença (MURRAY et

al., 2006).

No fígado a gliconeogênese está aumentada, entre outros, através da proteólise. Se a

capacidade dos rins de reabsorver a glicose é ultrapassada, ocorre a remoção crescente de

glicose pela urina (KOOLMAN; RÖHM, 2005). No fígado, os efeitos anticatabólicos

constituem na redução da glicogenólise (transformação do glicogênio em glicose), na

neoglicogênese (formação de glicose a partir de outras substâncias que não os carboidratos:

proteínas e lipídeos), havendo diminuição da cetogênese (formação de corpos cetônicos),

enquanto os efeitos catabólicos referem-se ao aumento da síntese do glicogênio e dos

ácidos graxos. No músculo, os efeitos anticatabólicos são representados pela redução do

catabolismo protéico e na redução da mobilização dos aminoácidos, e os efeitos anabólicos

residem na captação aumentada de aminoácidos, aumento da síntese protéica e do

glicogênio (FRANCO; CHALOUB, 1985).

Durante o diabetes a hiperglicemia é considerada a principal fonte de geração de

Produtos Finais de Glicação Avançada (AGE), mas a participação de outros aldeídos

reativos, como o metilglioxal e o glicolaldeído (GA) também são de grande importância. O

44

processo de glicação pode levar a duas situações no organismo: a) alteração na estrutura da

proteína com consequente alteração da sua função; b) a geração de moléculas sinalizadoras

(AGE) com potencial pró-inflamatório e pró-trombótico (ANDRADES, 2010).

A geração de Produtos Finais de Glicação Avançada (do inglês Advanced Glycation

End-Products – AGE) nesses indivíduos tem sido frequentemente relatada como importante

fator de complicação da doença devido a hiperglicemia e estresse oxidativo. Os AGE são

modificações pós traducionais encontradas em proteínas e têm origem em uma reação não

enzimática entre uma proteína e um açúcar redutor, ou com um aldeído reativo

(ANDRADES, 2010).

Devido ao elevado nível glicêmico, proteínas são modificadas e convertidas em

glicoproteínas. Modificações de proteínas presentes nas lentes, na parede vascular e as

membranas basais são associadas com o desenvolvimento de complicações do diabetes, tais

como cataratas, microangiopatia, aterosclerose e nefropatia. No diabetes mellitus, há

também várias anormalidades na lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL),

lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de alta densidade (HDL). A

peroxidação lipídica e os AGEs são formados por glicosilação não-enzimática de proteínas

(PATEL et al., 2012).

Em alguns pacientes portadores de diabetes, principalmente do tipo 1, as proteínas

podem ser convertidas em glicose muito facilmente, gerando efeitos negativos sobre o

índice glicêmico, especialmente quando este consumo é elevado. Em pessoas com o

diabetes controlado, tanto do tipo 1 quanto do 2, com adequado consumo alimentar, esses

efeitos adversos da proteína dificilmente são apresentados (SEYFFARTH, 2007).

As proteínas e os lipídeos não elevam a glicemia tanto quanto os carboidratos, seu

efeito vai depender das quantidades consumidas e do equilibro entre os nutrientes. Contudo,

muitos alimentos essencialmente referidos como fontes de proteína ou lipídeos também

contêm carboidrato (SEYFFARTH, 2007).

O nível de lipídeos séricos é geralmente elevado em diabetes mellitus e tal elevação

representa um fator de risco para doença cardíaca coronária. Este nível anormalmente

elevado de lipídeos se deve principalmente às ações desinibidas de hormônios lipolíticos

sobre os depósitos de gordura, principalmente devido à ação da insulina. Sob circunstâncias

normais, a insulina ativa a enzima lipase lipoproteíca, que hidrolisa triglicérides. No

entanto, no estado diabético, a lipase lipoproteíca não é ativada devido a deficiência de

45

insulina, resultando em hipertrigliceridemia (PUSHPARAJ et al., 2007; SAH, et al., 2011).

A deficiência de insulina está também associada a hipercolesterolemia devido às

anormalidades metabólicas (MURALI et al., 2002; SAH, et al., 2011). Os ácidos graxos

aumentados causam diminuição adicional na sensibilidade à insulina no nível celular,

prejudicando a secreção pancreática de insulina e aumentando a produção de glicose

hepática (lipotoxicidade) (BERGMAN e ADLER, 2000 apud MAHAN e ESCOTT-

STUMP, 2005).

1.6.6 Sintomas e Diagnóstico

Diabetes mellitus é uma síndrome, associada com hiperglicemia, hiperlipidemia,

estresse oxidativo, poliúria, podipsia, polifagia, cetose, neuropatia, nefropatia e desordens

cardiovasculares (GEORG; LUDVIK, 2000 apud BERA et al., 2012; SOUZA; MBATCHI;

HERCHUELZ, 2011). O organismo perde, parcialmente, a capacidade de utilizar os

açúcares dos alimentos ingeridos, ocasionando o acúmulo de glicose no sangue que não se

transforma em energia, tendo como consequência fraqueza, perda de massa corporal e

hiperglicemia, a qual é uma complicação gerada pela resposta defeituosa ou deficiente da

secreção do hormônio insulina (NEGRI, 2005).

A poliúria (aumento exagerado da diurese) é, talvez, a manifestação clínica mais

frequente e precoce. Quando o limiar renal para a glicose (≈ 180 mg/dL) é excedido

(glicosúria), a glicose é perdida através da urina (CARRILLO, 2011 apud ORTIZ, 2012),

havendo diurese osmótica, o que acarreta em polidipsia (FRANCO; CHALOUB, 1985). A

polidipsia é o aumento da sede, sendo um mecanismo para combater e prevenir a poliúria e

a desidratação. Pode ser que a intensidade da poliúria e polidipsia varie a relação com o

nível de glicose no sangue resultante de variações no limiar renal para a glicose, o que

tende a aumentar com a idade. Isso contribui para que estes sintomas passem despercebidos

(CARRILLO, 2011; SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012).

A polifagia é o apetite excessivo em indivíduos diabéticos, já que há penetração

insuficiente de glicose em diferentes tecidos. Além disso, a glicosúria implica uma perda de

glicose na urina, contribuindo para a redução da captação intracelular de glicose

(CARRILLO, 2011; SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012). Dessa

forma, no estado diabético há predileção para alimentos ricos em açúcar (FRANCO;

CHALOUB, 1985).

46

A fadiga é um resultado da alteração do metabolismo da glicose, a nível da célula

muscular. Em adição a este déficit de "energia de glicose" no tecido muscular há a má

utilização de proteínas e de lipídeos, bem como a diminuição de glicogênio no fígado e

músculo, o que contribui progressivamente para a exaustão e sonolência do indivíduo

(SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012; FRANCO; CHALOUB,

1985).

O emagrecimento, característico do diabetes tipo I é também um resultado da

glicosúria. Mas também a falta de outras manifestações de efeito anabólico da insulina nos

tecidos, tais como a diminuição da lipogênese e aumento da lipólise no tecido adiposo,

também o aumento da proteólise e diminuição da síntese de proteínas, colaboram

significativamente para a perda de massa corporal no diabético (CARRILLO, 2011;

SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012). O paciente constata o

paradoxo: come muito e emagrece (FRANCO; CHALOUB, 1985). Consequência do

emagrecimento e da desidratação pode ocasionar a pele seca e áspera do diabético

(FRANCO; CHALOUB, 1985). Também pode ser queixar de visão enfraquecida ao

realizar algumas atividades (FRANCO; CHALOUB, 1985) e dores principalmente nos

membros inferiores, além de cãibras em repouso ou pelo esforço (FRANCO; CHALOUB,

1985).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, os danos causados pelo DM

incluem danos a longo prazo como disfunção de vários órgãos (LYRA; CAVALCANTI,

2006 apud ALMEIDA, 2011; GROSS et al., 2002).

Essas alterações podem ser: de origem microvascular (devido a danos aos pequenos

vasos sanguíneos) e macrovascular (devido a danos em vasos de grande calibre). As

principais complicações microvasculares incluem a nefropatia, a retinopatia, a neuropatia,

os efeitos mais evidentes são: na retina, rins e nervos periféricos (NOBRE; SERRANO,

2005 apud SALES, 2011). As complicações macrovasculares incluem doenças

cardiovasculares, acidente encefálico vascular, doença vascular periférica (MELENDEZ-

RAMIREZ et al., 2010), aterosclerose grave e acelerada, anormalidades do metabolismo

lipídico, elevados níveis de lipídeos e lipoproteínas (KEENOY; VERTOMMEN; LEEUW,

2005 apud FERNANDES et al., 2010; RAANAN et al., 2008), aumento no risco de infarto

do miocárdio, acidente vascular cerebral (NOBRE; SERRANO, 2005 apud SALES, 2011),

hipertensão arterial, alterações no sistema nervoso periférico, disfunções sexuais e

47

artropatias, dentre outras complicações que podem evoluir para cegueira, falência renal,

doenças coronarianas e vasculares cerebrais de forma sucessiva (FRANCO, 2004;

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2006; SOCIEDADE BRASILEIRA DE

DIABETES, 2006 apud SALES, 2011), amputação de membros, perda de função e

comprometimento da qualidade de vida sendo responsáveis por expressiva morbidade e

mortalidade (SCHAAN; HARZHEIM; GUS, 2004; BRASIL, 2006; SALES, 2011).

Diversas são as repercussões sistêmicas causadas pelo diabetes, podemos citar ainda

fragilidade capilar, alterações osteomioarticulares, além da susceptibilidade as lesões

cutâneas por fungos e aos problemas cardiovasculares (BOELTER, et al., 2003; SCHAAN;

HARZHEIM; GUS, 2004; HALFOUN, et al., 2003; GONÇALVES; SALGADO, 2003).

Deve-se salientar que nem todos os portadores de diabetes podem apresentar os

clássicos sintomas da doença, sendo muitas vezes diagnosticados após exame laboratorial

(FRANCO; CHALOUB, 1985). Além disso, nem todas as pessoas com diabetes têm os

mesmos sintomas de hiperglicemia. Em algumas pessoas os sintomas podem não ser tão

óbvio. Geralmente, os sintomas não aparecem no início da doença e, portanto, o diabetes

somente é diagnosticado quando exames de rotina mostram níveis glicêmicos (acima de

200 mg/dL) (hiperglicemia) (AREAS, 1994) resultando em excreção da glicose pela urina

(glicosúria) (NEGRI, 2005).

Três métodos podem ser utilizados para diagnosticar o diabetes: sintomas clínicos,

valores de glicemia de jejum, e valores de glicemia pós-prandial (ADA, 2007 apud

ALMEIDA, 2011). Para glicemia de jejum, valores acima de 126mg/dl podem ser

indicativos de DM, sendo necessário realizar novo exame para a confirmação. Enquanto a

glicemia pós-prandial acima de 200mg/dl medida 2 horas após a ingestão de 75g de

carboidrato é considerado diagnóstico para DM (SBD, 2011 apud ALMEIDA, 2011;

GROSS et al., 2002).

No diagnóstico, as pessoas com diabetes tipo 1 são normalmente magras e têm sede

excessiva, micção frequente e perda de massa corporal significante. O defeito primário é a

destruição de célula β-pancreática, normalmente levando à deficiência absoluta de insulina

e resultando em hiperglicemia, poliúria (micção excessiva), polidipsia (sede excessiva),

perda de massa corporal, desidratação, distúrbio de eletrólitos e cetoacidose. A taxa de

destruição de células β é bastante variável, ocorrendo rapidamente em algumas pessoas

48

(lactentes e crianças) e lentamente em outras (adultos) (MAHAN e ESCOTT-STUMP,

2005).

O diabetes tipo 2 pode ser responsável por 90 a 95% de todos os casos de diabetes

diagnosticados e é uma doença progressiva que, na maioria dos casos, está presente muito

antes de ser diagnosticada. A hiperglicemia se desenvolve gradualmente e com frequência

não é grave o suficiente nos estados iniciais para o paciente observar qualquer um dos

sintomas clássicos do diabetes. Apesar de não diagnosticados, estes indivíduos estão em

risco maior de desenvolver complicações macro e microvasculares (MAHAN e ESCOTT-

STUMP, 2005).

Na prática, a anamnese do paciente sobre a existência de diabéticos na família e os

sintomas apresentados, constituem dados importantes para a possibilidade de ocorrência de

diabetes (FRANCO; CHALOUB, 1985).

Outro parâmetro importante a ser avaliado é a hemoglobina glicada (HbA1)

utilizada como parâmetro de referência para avaliar o grau de hiperglicemia crônica entre

os pacientes diabéticos (SACKS, 2003; SAUDEK et al., 2006; CAVAGNOLLI, 2011).

Hemoglobina glicada (HbA1) tem servido como um indicador do controle

glicêmico, há relato do aumento do nível de HbA1 em pacientes internados com diabetes

mellitus (BASHA; SUBRAMANIAN, 2011 apud KAMBLE e BODHANKAR, 2013). O

excesso de glicose presente no sangue reage com a hemoglobina formando a HbA1. Assim,

estimativa de hemoglobina glicada é um parâmetro bioquímico bem aceito e útil para o

diagnóstico e tratamento da doença (ADARAMOYE, 2012 apud KAMBLE e

BODHANKAR, 2013). As dosagens de glicose e HbA1 são complementares para avaliação

do controle do DM, pois fornecem informações distintas e complementares acerca dos

níveis de glicemia sanguínea. Enquanto que os resultados de HbA1 refletem a glicemia

média no intervalo de dois a três meses antecedentes a coleta, complementando as

medições mais tradicionais de controle glicêmico como medição da glicose em plasma ou

urina (INFOTEC LABTEST), os resultados de glicemia refletem a avaliação pontual, ou

seja, no momento da coleta da amostra de sangue (SBD, 2002 e 2006 apud SUMITA e

ANDRIOLO, 2008; SACKS, 2003; SAUDEK et al., 2006).

Os valores de HbA1 entre 4% e 6% são considerados normais e níveis acima de 7%

estão associados a um risco maior de complicações crônicas (CAVAGNOLLI, 2011). Por

esta propriedade, a determinação da HbA1 para avaliação da glicemia nos diabéticos é de

49

grande utilidade porque avalia o real quadro glicêmico dos últimos meses. Em pacientes

diabéticos, quando o controle glicêmico não é feito de forma rigorosa, a porcentagem de

Hb1A glicada aumenta e sua determinação laboratorial é usada para avaliar o controle

glicêmico retroativo nestes pacientes (ORTIZ, 2004; GARCÍA et al., 2009). O aumento

exponencial no desenvolvimento de complicações da doença está relacionado com o

aumento dos níveis de HbA1 (CAMARGO e GROSS, 2004).

1.6.7 Tratamento, Prevenção e Cura

O diabetes mellitus contribui para um aumento considerável nas taxas de morbidade

e mortalidade, que podem ser reduzidas por diagnóstico e tratamentos precoces (MAHAN e

ESCOTT-STUMP, 2005).

O objetivo do tratamento do diabetes consiste em reduzir o nível de glicose no

sangue, utilizando drogas anti-diabéticas que podem agir de maneiras diferentes, tais como

a estimulação de células β das ilhotas do pâncreas para libertar insulina, aumento do

número e sensibilidade de receptores de insulina, aumento do conteúdo de glicogênio,

promoção da utilização de glicose no tecido, eliminação dos radicais livres, resistência a

peroxidação lipídica, combate ao distúrbio metabólico de lípideos e proteínas (LI et al.,

2004; PATEL et al., 2012).

No diabetes mellitus, a dieta constitui um elemento fundamental no controle dessa

afecção, além de outras medidas como exercício adequado, hábitos higiênicos e do

emprego de reguladores do açúcar sanguíneo, como as insulinas e os hipoglicemiantes

orais, quando necessário (FRANCO; CHALOUB, 1985).

O regime alimentar é necessário para manter o paciente com DM2 compensado

metabolicamente, com peso adequado e com boa disposição física e mental, livre de

complicações (FRANCO; CHALOUB, 1985). A elaboração da dieta do diabético deve ser

feita para cada paciente isoladamente e determinada pelo médico ou nutricionista.

Infelizmente, é comum ver-se diabéticos seguirem conselhos de leigos, abandonando os

alimentos prescritos na dieta e substituindo ou incluindo outros que não foram

determinados, sob a alegação de que aqueles são “quentes”, “ácidos”, “que fazem mal ao

fígado” etc (FRANCO; CHALOUB, 1985).

A inclusão na dieta de grãos integrais, fibras, frutas e hortaliças são fatores que

podem retardar ou prevenir o diabetes tipo 2 (WING, 1999 apud MAHAN e ESCOTT-

50

STUMP, 2005). As fibras são classificadas em solúveis e insolúveis, tendo as primeiras

importante função no controle glicêmico (especialmente as pectinas e as β-glucanas) e as

insolúveis atuam na fisiologia intestinal (SEYFFARTH, 2007). As fibras solúveis

representadas pela pectina (frutas) e pelas gomas (aveia, cevada e leguminosas: feijão,

grão-de-bico, lentilha e ervilha) reduzem o tempo de trânsito intestinal e ajudam na

eliminação do colesterol. As fibras insolúveis são representadas pela celulose (trigo),

hemicelulose (grãos) e lignina (hortaliças).

O consumo de fibras na dieta está envolvido com melhorias no perfil lipídico, na

pressão arterial e na sensibilidade à insulina (BURTON, 2000; ALMEIDA, 2011). As

fibras reduzem a taxa de esvaziamento gástrico, digestão e absorção da glicose

(ALMEIDA, 2011). Estudos mostram que as fibras alimentares têm uma boa resposta na

prevenção do DM, porém apenas as solúveis teriam um papel positivo sobre a glicemia e a

resposta insulínica pós-prandial (MELLO; LAAKSONEN, 2009; ALMEIDA, 2011), pois

podem interferir na absorção da glicose alimentar, sendo os picos glicêmicos diminuídos

após as refeições contendo elevados teores de fibras (SBD, 2009 apud ALMEIDA, 2011).

A atuação da fibra solúvel na resposta glicêmica resulta do aumento da resposta da

colecistoquinina durante a refeição, o que provoca o retardo do esvaziamento gástrico que

associado à viscosidade que as fibras conferem ao bolo alimentar diminui a superfície de

contato com a mucosa do intestino delgado, levando a uma menor absorção dos nutrientes

(SACHS, 2006 apud SALES, 2011). Outros mecanismos que podem explicar o efeito da

fibra solúvel na redução dos níveis séricos de glicose e insulina incluem a complexação da

glicose com a fibra solúvel, reduzindo sua absorção, bem como a inibição da alfa-amilase

diminuindo a digestão do amido (SACHS, 2006 apud SALES, 2011; LLANO; FERRER,

2006; WÜRSCH; PI-SUNYER, 1987).

O consumo de gorduras saturadas, encontradas principalmente em alimentos de

origem animal, deve ser realizado com moderação, pois pode causar elevação dos níveis de

colesterol e triglicérides. Uma dieta com menor teor de gordura (até 25% das calorias) pode

auxiliar na melhora dos lipídeos sanguíneos, como o colesterol total e a lipoproteína LDL-

colesterol. Resultados ainda melhores podem ser conquistados se a gordura adicionada for

monoinsaturada, como o azeite de oliva, canola, girassol ou amendoim. As gorduras poli-

insaturadas encontradas em peixes, semente de linhaça e óleo de soja são importantes

51

componentes alimentares que também auxiliam na manutenção de um adequado perfil

lipídico sanguíneo (SEYFFARTH, 2007).

A ingestão de gordura é inversamente associada à sensibilidade insulínica, visto que

o consumo exagerado aumenta o risco de desenvolvimento de problemas cardíacos, além

de serem marcadores inflamatórios, bem como diminuírem a sensibilidade à insulina

(ALMEIDA, 2011). Tendo em vista que os carboidratos estão diretamente ligados com o

aumento da glicemia, é importante considerar, principalmente, o tipo de carboidrato que

está sendo ingerido, sendo preferível o consumo de açúcares complexos aos açúcares

simples, já que estes apresentam alto índice glicêmico (ADA, 2008 apud ALMEIDA,

2011).

A redução de triglicérides e do colesterol LDL, o aumento do colesterol HDL, a

diminuição da frequência cardíaca em repouso e em atividade, a redução da pressão arterial

são algumas das melhoras nas medidas fisiológicas decorrentes de um estilo de vida

fisicamente ativo que é ainda mais importante nos portadores de diabetes mellitus, já que o

risco de mortalidade por doenças coronarianas é quatro a cinco vezes maiores nesses

indivíduos quando comparados com aqueles que não apresentam diabetes mellitus

(FECHIO; MALERBI, 2004).

Indivíduos com DM1 encontra-se em situação diferente no que se relaciona ao

metabolismo dos alimentos ingeridos, pois quando tratado com insulina recebe uma dose

fixa, devendo adequar a ingestão de alimentos, principalmente dos carboidratos, à atividade

da insulina, que por sua vez também varia quando do início de sua atuação e a duração de

sua ação (FRANCO; CHALOUB, 1985).

No caso dos indivíduos com DM2, se a dieta e o exercício não funcionam

corretamente, então a medicação anti-diabética oral deve ser prescrita. Com base no

mecanismo de ação, as drogas anti-diabéticas podem ser essencialmente divididas em

insulina, secretagogos da insulina (sulfoniluréias e meglitinidas), promotores do aumento

da sensibilidade à insulina (tiazolidinedionas, biguanidas), fator de crescimento semelhante

à insulina, inibidores da aldose redutase, inibidores da alfa-glicosidase e inibidor da

glicação de proteínas (LI et al., 2004; PATEL et al., 2012). Eles podem ser usados sob a

forma de monoterapia ou em combinação com outras drogas para obter melhores resultados

(LI et al., 2004; PATEL et al., 2012).

52

Embora estas drogas sejam eficazes na redução da glicemia, eles podem causar

efeitos secundários indesejáveis e graves (tais como o ganho de massa corporal e

hipoglicemia, edema, disturbios gastrointestinais e resistência à insulina) o que pode

desencorajar a adesão do paciente (VASCONCELOS, 2011), anorexia nervosa, atrofia do

cérebro e do fígado gorduroso após tratamento (PIEDROLA et al., 2001 apud MAITI,

2004), estresse oxidativo, resultante da superprodução de espécies reativas de oxigênio

juntamente com a insuficiente capacidade antioxidante, induzido pela crônica hiperglicemia

tem sido associada com a disfunção e apoptose de vários tipos de células, incluindo as

células pancreáticas e neurônios (JANA et al., 2010 apud BERA et al., 2010; VINCENT et

al., 2004).

Um tratamento ideal para o diabetes seria uma droga que não somente controlasse o

nível de açúcar no sangue, mas também impedisse o desenvolvimento de arteriosclerose e

outras complicações de diabetes (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985 apud SAH, et al.,

2011). O controle efetivo de glicose no sangue é a chave para a prevenção ou inversão de

complicações diabéticas e melhora da qualidade de vida de pacientes com diabetes. Assim,

redução sustentada na hiperglicemia vai diminuir o risco de desenvolver complicações

microvasculares e provavelmente reduzir o risco de complicações macrovasculares

(LATHA et al., 2004 apud SAH, et al., 2011).

Apesar de progressos consideráveis no tratamento do diabetes com a insulina e

hipoglicemiantes orais, a busca de novas drogas continua devido as várias limitações das

drogas sintéticas existentes (KNOWLER et al., 2002 apud DUTTA, 2013; FONTEBONNE

et al., 1996). Portanto, procurar agentes seguros e mais eficazes continua sendo uma

importante área ativa da pesquisa, pois até o momento nenhum dos fármacos antidiabéticos

é capaz de produzir controle glicêmico a longo prazo, sem causar quaisquer efeitos

secundários adversos (SINGH et al., 2007; OYEDEMI et al., 2011).

O diabetes não possui tratamento curativo definitivo e, em geral, quando detectado e

controlado tardiamente, causa danos orgânicos e funcionais importantes. Entre os danos

derivados ou intensificados pelo diabetes está a progressão para a cegueira, aparecimento

de doenças cardiovasculares, comprometimento funcional dos rins, da circulação periférica

e microcirculação, induzindo casos de amputação de membros e podendo levar até a morte

(RIEDER; GUARIM NETO, 2012). Assim, o tratamento e a cura do diabetes sem qualquer

efeito colateral ainda é um desafio (NEERAJ VERMA et al., 2012). Nesse contexto,

53

informações do uso de plantas medicinais e no controle dessa patologia têm grande valor

(RIEDER; GUARIM NETO, 2012).

Avanços para o tratamento do diabetes podem ser encontrados em recursos do reino

vegetal, e o saber popular é importante para dar indícios (RIEDER; GUARIM NETO,

2012). Plantas medicinais, desde tempos imemoriais, têm sido utilizados em praticamente

todas as culturas como uma fonte de medicamento. Os efeitos hipoglicemiantes de alguns

extratos de plantas medicinais foram confirmados em modelos humanos e animais de

diabetes tipo 2 (PATEL et al., 2012). A maioria das plantas/produtos naturais contêm

glicosídios, alcalóides, terpenos, flavonóides, carotenóides, terpenóides, compostos

fenólicos, e algumas outras categorias que têm mostrado potencial anti-diabético

(MALVIYA; JAIN; MALVIYA, 2010 apud PATEL et al., 2012).

Quantidades adequadas de antioxidantes no meio intracelular são de grande

importância para maior segurança contra os ataques dessas espécies reativas, prevenindo o

aparecimento de complicações no diabetes (VALKO, et al., 2007; OLIVEIRA, 2010).

Dessa forma, extratos de plantas que possuam um perfil antioxidante podem ter papel

importante na redução da oxidação lipídica em tecidos (ÂNGELO & JORGE, 2007).

O etnoconhecimento ou o saber popular jamais pode ser desprezado, não só pelo seu

valor próprio, mas pelos caminhos que pode indicar e encurtar para o desenvolvimento da

ciência; de descobertas promissoras e inovação, estimulando o desenvolvimento

tecnológico (RIEDER; GUARIM NETO, 2012). Se há ou não eficácia no controle das

enfermidades é uma questão que deve ser respondida pela comunidade científica (RIEDER;

GUARIM NETO, 2012).

O potencial para novas descobertas de componentes terapêuticos é grande diante de

muitas ainda insuficientemente estudadas. Estas podem propiciar grandes avanços em

tratamentos mais eficazes e até cura de enfermidades que desafiam a competência das

sociedades atuais e futuras (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).

Nesse sentido, relatos informais encontrados em sites de buscas da internet apontam

o “leite de alpiste” como um potencial hipoglicemiante. O “leite de alpiste” é um produto

derivado, conforme algumas descrições contêm substâncias anti-inflamatórias, que é rico

em vitaminas E, complexo B e em antioxidantes que evitam o envelhecimento precoce das

células, mostrando eficácia no tratamento de várias patologias (GALVÃO, 2013). Por

possuir uma alta quantidade de enzimas, proteína vegetal, antioxidantes e aminoácidos,

54

ajuda a reduzir inflamações de órgãos internos como fígado, rins e pâncreas, o que pode ser

de grande ajuda para pessoas com diabetes e cirrose (BITTAR, 2013). Também utilizado

no tratamento do colesterol, auxiliando o emagrecimento e o ganho de massa muscular.

Age eliminando o excesso de líquidos no organismo, recarregando os rins com enzimas

importantes ao seu correto funcionamento. Em algumas partes do mundo, ele é usado para

tratar pedras nos rins, vesículas, infecções urinárias e bexiga (BENEFÍCIOS DO

ALPISTE..., 2013), funciona como diurético, elimina toxinas ingeridas durante o dia

(GALVÃO, 2013).

A grande quantidade de fibras contidas nas sementes ajuda também no processo de

digestão, combatendo a prisão de ventre (BITTAR, 2013). O consumo do “leite de alpiste”

é recomendado para auxiliar nos tratamentos de combate a várias doenças, entre elas,

úlceras, hiperuricemia, edema, gota, gastrite, hipertensão e cirrose (GALVÃO, 2013).

É indicado para quem tem diabetes, pois suas propriedades também incluem aliviar

ou sanar edemas e tratar a retenção de líquidos. Alguns estudos ainda trazem informações

de que o alpiste pode ajudar no controle da pressão arterial, da acne e ainda promove o

crescimento de unhas e cabelos (ALPISTE..., 2013).

O alpiste passou por profunda pesquisa na Universidade Nacional do México em

função do alto valor protéico e dos seus aminoácidos. O resultado da pesquisa revelou que

o alpiste tem a capacidade de recarregar e curar o organismo humano. Por ser emoliente

relaxa e abranda as partes inflamadas, além de refrescante se usado externamente em

eczemas (LEITE DE ALPISTE..., 2013). Com base em inúmeros benefícios relatados, as

pessoas estão se deixando levar pelas dietas da moda, onde preparam o “leite de alpiste”.

Contudo, não existe qualquer registro na literatura científica sobre o assunto até o

momento.

Nesse contexto este estudo foi desenvolvido para avaliar os efeitos desse suposto

alimento.

http://www.remedio-caseiro.com/beneficios-do-alpiste/


55

2. JUSTIFICATIVA

O alpiste apresenta importância econômica para o país em termos de alimentação de

pássaros, porém apesar dos relatos acerca de seu uso pelo homem como componente

dietético e até mesmo como hipoglicemiante, estudos científicos que comprovem seus

efeitos biológicos e que o caracterizem quimicamente são escassos ou ausentes. Dessa

forma, a análise dos compostos químicos e fenólicos totais e da possível atividade

antioxidante e hipogliceminate de sementes de alpiste e de seu respectivo extrato aquoso

poderão fornecer informações importantes a respeito dos benefícios à saúde decorrentes da

sua ingestão, já que o seu consumo vem sendo registrado no dia a dia de pessoas diabéticas.

3. OBJETIVO GERAL

Realizar a caracterização físico-química de sementes de alpiste (Phalaris

canariensis L.) e de seu extrato aquoso, avaliar seu potencial antioxidante e atividade

hipoglicemiante do extrato aquoso de sementes de alpiste em modelo experimental de

diabetes induzida por estreptozotocina em ratos Wistar machos.

3.1 Objetivos Específicos

Identificar e caracterizar físico-quimicamente a semente e o extrato aquoso

de sementes de alpiste (Phalaris canariensis L.);

Quantificar o teor de compostos fenólicos totais;

Determinar e comparar a atividade antioxidante in vitro do extrato aquoso de

sementes de alpiste utilizando diferentes métodos (ABTS, DPPH e ORAC);

Avaliar a toxicidade aguda in vivo do extrato aquoso de sementes de alpiste

em ratos Wistar machos;

Analisar os efeitos do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre a

glicemia, parâmetros hematológicos, bioquímicos e histopatológicos em modelo

experimental de diabetes em ratos Wistar machos;

Avaliar a relação da composição do alpiste, atividade antioxidante e

evolução do diabetes.

56

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Dissertação de Mestrado - Universidade Federal de Minas Gerais, Programa de Pós-

Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia, Belo Horizonte,

2011.

Disponível em: <http://www.fciencias.com> Acesso:03/05/2015.

http://www.fciencias.com/

85

Capítulo II

COMPOSIÇÃO CENTESIMAL E ÁCIDOS GRAXOS D

SEMENTES DE PHALARIS CANARIENSIS L. E SEU

EXTRATO AQUOSO.

Michele Christine Machado de Oliveira1, Marcelo Alexandre Prado1, Daniel Barrera2

Arellano, Renato Grimaldi2, Marcella Ap. Stahl2



SP, Brasil. 2Departamento de Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de

Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862,

Campinas, SP, Brasil.

Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Food Research International

87

Resumo

O alpiste (Phalaris canariensis L.), predominantemente usado como alimento para aves,

tem sido consumido pela população por ser um produto natural, de fácil aquisição e por ter

diferentes propriedades medicinais relatadas, tais como controle do diabetes e “melhora do

fluxo sanguíneo” em pessoas, porém existe pouca informação científica disponível sobre a

composição e estrutura do alpiste e seu potencial biológico para aplicações alimentares. O

interesse nesse alimento tem aumentado devido às propriedades atribuídas à sua

composição, como proteínas e fibras, que podem facilitar o processo digestivo. Este estudo

teve como objetivo determinar a composição química da semente de alpiste (Phalaris

canariensis L.) assim como a composição centesimal e perfil de ácidos graxos do extrato

aquoso de sementes de alpiste, visando a análise de seu potencial nutritivo. Dois lotes

foram utilizados e os extratos de semente de alpiste foram preparados diariamente de forma

padronizada e posteriormente analisados quanto aos teores de umidade, resíduo seco,

cinzas, proteínas, lipídeos totais, fibras totais, amido e determinação de carboidratos,

utilizando metodologias reconhecidas. Os resultados obtidos nas sementes dos lotes 1, 2 e

do extrato aquoso foram respectivamente: umidade e resíduo seco (10,31%; 9,50%;

78,21%), cinzas (6%; 5,30%; 1,74%), proteínas (14,88%; 15,12%; 18,26%), lipídeos

(5,38%; 5,17%; 2,07%), amido (50,54g/100g; 48,04g/100g; 3,79g/100g) e fibras totais

(18,88g/100g; 17,29g/100g; 0,70g/100g). Foram detectadas 16 variedades de ácidos graxos

no extrato aquoso de semente de alpiste, sendo o mais frequente o ácido palmítico-16:0

(12%). Entre os ácidos graxos poli-insaturados, os mais encontrados foram linoleico (53%),

oleico (28%) e linolênico (3%), ou seja 84% de ácidos graxos benéficos a saúde. Os valores

dos lotes 1 e 2 não apresentaram diferença significativa. Todos os parâmetros observados

indicaram que a semente de alpiste apresenta potencial nutritivo, sugerindo uma possível

aplicação nutricional.

Palavras-chave: Composição Centesimal, Ácidos Graxos, Alpiste, Extrato Aquoso de

sementes de alpiste, Phalaris canariensis L.

88

Abstract

The canary seeds (Phalaris canariensis L.), predominantly used as a nutritional source to

feed birds, have been consumed by the population because it is a natural product of easy

access and for the reported medicinal benefits, such as control of diabetes and improvement

of blood flow, but there are still few scientific studies concerning its composition, structure

and its biological potential for dietary applications. The interest in the canary seeds has

increased, due to the properties attributed to its composition, such as protein and fiber,

which may improve the digestive process. This study aimed to determine the chemical

composition of canary seed (Phalaris canariensis L.) as well as the proximate composition

and fatty acid profile of the aqueous extract of canary seed, aiming to evaluate its

nutritional potential. Two lots were used and canary seed extracts were prepared daily in a

standardized manner and subsequently analyzed for moisture content, dry matter, ash,

protein, total lipid, total fiber, starch and determination of carbohydrates using recognized

methodologies. The results in seed lots 1, 2 and aqueous extract were, respectively: dry and

moisture (10.31%; 9.50%; 78.21%), fly ash (6%, 5.30%, 1 74%) and protein (14.88%;

15.12%; 18.26%), lipids (5.38%; 5.17%; 2.07%), starch (50,54g / 100g; 48 04G / 100g;

3,79g / 100g) and total fiber (18,88g / 100g; 17,29g / 100g; 0.70g / 100g). Sixteen varieties

of fatty acids were detected in the aqueous extract of canary seed, the most frequent being

palmitic acid-16: 0 (12%). Among the polyunsaturated fatty acids, the most frequent were

linoleic (53%), oleic (28%) and linolenic (3%), which means 84% of the fatty acids are

beneficial to health. No significant differences were found between lots 1 and 2. All of the

parameters evaluated indicated that the aqueous extract of canary seeds have a nutritional

potential, suggesting a possible nutritional application.

Keywords: Proximate composition, Fatty Acids, Canary seed, Aqueous Extract of canary

seeds, Phalaris canariensis L.

89

1. INTRODUÇÃO

Alpiste é um verdadeiro cereal com uma composição única que sugere seu potencial

para utilização na alimentação humana (COGLIATTI, 2012). Devido ao seu valor nutritivo,

o interesse pelo alpiste tem aumentado (BOYE et al., 2013; ESTRADA-SALAS et al.,

2014).

Segundo Portaria nº 65 do MAPA (1993), o alpiste é definido como um grão

proveniente da espécie Phalaris canariensis L.

Putnam et al., (1996) apud Abdel-Aal et al., (1997) revisaram as características

agronômicas, genéticas e nutricionais de alpiste e novos potenciais de usos para a cultura. O

alpiste é um cereal que contém 61% de amido na semente e 67% na farinha. A umidade

deve ser controlada até 12% em peso, para garantir as suas propriedades (PORTARIA Nº

65 DO MAPA).

Abdel-Aal et al., (2011a); Cogliatti (2012), mostraram que, através da microscopia

de luz e de fluorescência nas sementes de alpiste, a sua microestrutura é semelhante à de

outras gramíneas (trigo, aveia, a cevada e o arroz). O alpiste tem uma média de 55,8g/100g

de amido, 23,7g/100g de proteína, 7,9g/100g de gordura bruta, 7,3g/100g de fibra dietética

total, 1,8g/100g de açúcar solúvel e 2,3g/100g de cinzas totais em todo o grão. As

investigações sobre o alpiste como cultura para o consumo humano, concordam em defini-

lo como um cereal que tem vantagens sobre outros grãos, com base na sua composição

química (GRAJEDA et. al., 2012).

O alpiste (Phalaris canariensis) contém níveis relativamente elevados de proteína

(até 18,7%) e óleo (até 8,7%) em comparação com outros cereais (GÁMEZ et al., 2010

apud ALVARADO, 2013), sendo altamente insaturado, contendo 55% linoleico ou ω-6,

29% oleico ou ω-9, 11% de ácido palmítico e 2,5% de ácido linolênico ou ômega ω-3

(MALIK; WILLIAMS, 1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014, GÁMEZ et al., 2010

apud ALVARADO, 2013; ABDEL-AAL et al., 1997; LI et al., 2011). O óleo bruto de

alpiste também mostrou excelente atividade antioxidante (TAKAGI & IIDA, 1980; LI et

al., 2011).

Estudos sobre a composição química dos grãos feitos por Robinson (1979) apud

Cogliatti (2012) sugerem que ele tem alto valor nutritivo, propriedades funcionais e

nutricionais únicas (ABDEL-AAL et al., 1997; COGLIATTI, 2012). O perfil de

90

aminoácidos que possui este grão destaca a estrutura única de suas proteínas,

principalmente por causa de seu alto teor de triptofano (ROBINSON, 1978 apud

GRAJEDA, et al., 2012; ABDEL-AAL, et al.,1997).

O alpiste tem funções metabólicas importantes, e pode ajudar na perda de massa

corporal (outro benefício muito importante para os diabéticos), redução dos níveis de

açúcar no sangue e o controle glicêmico (ANDRADE e VACA, 2012).

2. MATERIAL E MÉTODOS

A elaboração do extrato aquoso de alpiste, bem como as análises físico-químicas

foram realizadas no laboratório de Análise de Alimentos do Departamento de Ciência de

Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP).

2.1 Reagentes e Equipamentos

Os reagentes ácido clorídrico e metanol foram adquiridos da Chemco, ácido

sulfúrico concentrado, mistura catalítica, hidróxido de sódio da Dinâmica, ácido bórico,

carbonato de sódio, clorofórmio da Synth, sulfato de potássio anidro, sulfato de cobre II,

sulfato de sódio anidro são da Êxodo Científica.

Os equipamentos utilizados foram: balança analítica (Marca – UHT HR-200 máx

210g), estufa (Marca – UHT Nova Técnica NT513 sem circulação de ar), mufla (Marca –

Quimis), digestor de nitrogênio (Marca - Marconi, modelo MA4025), destilador (Marca -

Quimis, modelo Q341-25), agitador de tubos (Marca - Labnet, modelo S0200),

cromatógrafo gasoso capilar (Marca - CGC AGILENT 68650 SERIES GC SYSTEM, com

detector de ionização de chama), banho-maria (Marca – Marconi BTC-9090 Digimec) e

pHmetro (Marca – Mettler Toledo 320).

2.2 Obtenção da Matéria-Prima

As amostras de sementes de alpiste (Phalaris canariensis L.), foram obtidas no

período de safra 2012/2013, oriundas do comércio da cidade de Campinas/SP. Após a

aquisição das amostras as mesmas foram enviadas para o Laboratório de Análises de

91

Alimentos do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de

Alimentos – UNICAMP.

2.3 Preparação do Extrato de P. canariensis L.

O preparo do extrato aquoso de sementes de alpiste, Phalaris canariensis L. foi

realizado conforme dados descritos popularmente. Para a obtenção do extrato, foram

utilizados uma proporção de 150 g de alpiste em 200 mL de água destilada. Após deixar de

molho em água por 12 horas, a água do molho foi desprezada, e as sementes trituradas com

200 mL de água destilada por 5 minutos em liquidificador comercial com potência de

350W até a obtenção de um “leite”. Em seguida, este extrato foi peneirado para a separação

dos sólidos insolúveis (resíduo) e filtrado em filtro de nylon para separação das cascas do

alpiste. Este preparo foi realizado diariamente para realização das análises.

2.4 Caracterização das Sementes de Alpiste e Extrato Aquoso de

Alpiste

As análises das sementes e do extrato aquoso de sementes de alpiste foram

realizadas em triplicata, segundo as normas e metodologias da Association of Official

Analytical Chemists (AOAC, 2010) e Instituto Adolfo Lutz (2008).

Foram realizadas as seguintes análises:

2.4.1 Determinação do Teor de Umidade

A percentagem de umidade foi determinada pelo método de aquecimento direto em

estufa (UHT Nova Técnica, modelo NT513 sem circulação de ar) a 105ºC, conforme

descrito pelo manual do Instituto Adolfo Lutz, (2008). Baseando-se na determinação da

perda de peso do produto submetido ao aquecimento até peso constante.

Para isto, amostras de aproximadamente 3 g foram homogeneizadas, trituradas e

submetidas à secagem em estufa a 105ºC seguida de resfriamento. A operação de

aquecimento e resfriamento foi repetida até obtenção de peso constante. O teor de umidade

(%) foi obtido pela fórmula:

Teor de umidade = 100 x N/ P, onde:

N = n° de gramas de umidade

92

P = n° de gramas de amostra

2.4.2 Determinação do Resíduo Seco

Para o extrato aquoso de sementes de alpiste, produto de alto teor de umidade, foi

determinado o resíduo seco (sólidos totais), onde pipetou-se 10 ml da amostra em uma

cápsula previamente tarada, a qual foi aquecido em estufa a 70ºC até peso constante. O teor

de resíduo seco (%) foi obtido pela fórmula:

Resíduo seco por cento m/v = 100 x N/A, onde:

N = nº de g de resíduo seco

A = nº de ml da amostra

2.4.3 Determinação de Resíduo Mineral Fixo

A determinação de cinzas foi realizada pela incineração da amostra em método

gravimétrico. O material (2 a 5 g) foi submetido a aquecimento em mufla (Quimis) a 650°C

até a formação de um resíduo branco ou cinza, segundo metodologia descrita pelo manual

do Instituto Adolfo Lutz (2008) com adaptações.

O teor de cinzas (%) foi obtido pela fórmula:

Teor de cinzas = 100 x N/ P, onde:

N = n° de gramas de cinzas

P = n° de gramas de amostra

2.4.4 Determinação de Proteínas

O teor de proteínas foi determinado segundo o método de semimicro Kjeldahl, para

a quantificação de nitrogênio total. O qual se baseia na destruição da matéria orgânica

seguida de destilação, sendo o nitrogênio dosado por volumetria (AOAC, 2010). No cálculo

da conversão de nitrogênio em proteínas, foram utilizadas as constantes 6,25 e 5,7 (definida

como padrão para cereais). O digestor de nitrogênio utilizado foi Marconi, modelo

MA4025, destilador Quimis, modelo Q341-25.

O processo de digestão foi realizado com algumas modificações. A digestão de

aproximadamente 1 g de amostra foi realizada em bloco com aquecimento controlado até

temperatura máxima de 300ºC, elevando gradativamente a temperatura, para evitar perdas

93

das amostras, após adição de 5 mL de ácido sulfúrico concentrado e mistura catalítica. Em

seguida, as amostras foram destiladas e tituladas para determinação de nitrogênio e

posterior cálculo do conteúdo de proteínas, utilizando a fórmula apresentada a seguir. Teor

de proteína bruta (%) = v x fc x 0,00028 x f / P x (100), onde:

v = nº de ml da solução de HCl 0,02 M gasto na titulação

fc = fator de correção da solução de HCl 0,02 M

f = fator de conversão = 6,25 ou 5,7

P = peso da amostra (g)

2.4.5 Determinação de Lipídeos

A extração lipídica foi realizada segundo método de BLIGH & DYER (1959) à frio,

utilizando agitador de tubos Labnet, modelo S0200.

A composição dos ácidos graxos presentes na fração lipídica foram determinados

por cromatografia gasosa. Para determinação da composição em ácidos graxos, seguiu-se

AOCS/2009. Inicialmente realizou-se a esterificação convertendo óleos e gorduras em

ésteres metílicos de ácidos graxos de acordo com o método proposto por AOCS Official

Method, (1973) para posterior análise em cromatografia gasosa (CG).

2.4.5.1 Análise Cromatográfica

Os ésteres metílicos foram analisados em cromatógrafo gasoso capilar, marca CGC

AGILENT 68650 SERIES GC SYSTEM, com detector de ionização de chama. Os

componentes foram separados em coluna capilar de sílica fundida DB-23 AGILENT (50%

cyanopropil) – methylpolysiloxane, com dimensões de 60 m com diâmetro interno de 0,25

mm e espessura do filme de 0,25 µm. As condições de operação foram: fluxo da coluna de

1,00 mL/min, temperatura programada do detector: 280ºC, temperatura do injetor: 250ºC,

temperatura do forno: 110ºC - 5 min.; 110 - 215ºC (5ºC/min), 215ºC - 24 min., gás de

arraste: hélio; velocidade linear do gás de arraste de 24 cm/s, volume injetado: 1,0 µL.

A identificação dos ácidos graxos foi realizada através da comparação do tempo de

retenção dos ácidos graxos da amostra e dos padrões.

94

2.4.6 Fibras

O teor de fibra alimentar total foi determinada segundo o método descrito por

Horwitz; Latimer; George, (2005), (AOAC, 2010).

2.4.7 Amido

A determinação de amido foi feita seguindo Diemair, (1963).

2.4.8 Determinação de Carboidratos

O teor de carboidratos foi determinado por meio do cálculo da diferença, subtraindo

de 100% do valor de proteínas, lipídeos, fibra alimentar, cinzas e umidade. Este

procedimento está previsto pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 360, de 23 de

dezembro de 2003 (BRASIL, 2003).

Também foi realizado através de métodos de redução, glicídios redutores e totais,

segundo Instituto Adolfo Lutz (2008). Este método baseia-se na oxirredução da solução de

Fehling, através da utilização de glicose para a padronização dessa solução.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O alpiste tem em sua composição amido, proteína e lipídeo, sendo que cada

componente possue características únicas (ABDEL-AAL; HUCL, 2005 apud ABDEL-AAL

et al., 2010).

Os resultados são apresentados com média ± desvio padrão (SD), na Tabela 1.

95

Tabela 1. Composição centesimal de sementes de Phalaris canariensis L. e seu extrato

aquoso (%).

Componentes Semente A a

Semente B a

Extrato Aquoso (BU) a

Umidade 10,31 ± 0,03 9,50 ± 0,06 78,21 ± 0,07

Cinzas 6,00 ± 0,28 5,30 ± 0,08 1,74 ± 0,03

Proteínas (N=6,25)c 16,98 ± 0,59 17,24 ± 0,72 16,28 ± 0,05

Proteínas (N=5,7)c 14,88 ± 0,52 15,12 ± 0,63 18,26 ± 0,06

Lipídeos 5,38 ± 0,09 5,17 ± 0,13 2,07 ± 0,03

Fibras (g/100g) 18,88 ± 0,01 17,29 ± 0,25 0,70 ± 0,02

Amido (g/100 g) 50,54 ± 0,60 48,04 ± 0,00 3,79 ± 0,08

Carboidratos b 61,33 62,8 58,13

a Os dados são expressos como valores médios ± desvio padrão (N=3). b Por diferença. cFator de conversão N=6,25 (uso geral); N=5,7 (específico- cereais)

A tabela 1 mostra que as porcentagens de umidade presente nas sementes de alpiste,

entre os dois lotes, variaram de 9,50 a 10,31%, estando dentro dos limites estabelecidos

pela Embrapa (2011) (<14%), segundo Pimentel e Fonseca, evitando assim a ação

enzimática, e proliferação de microrganismos durante o processo de armazenamento. De

acordo com estudos de Alvarado (2013) os resultados de percentagem de umidade

apresentados em diferentes marcas foram 7,33% e a mais elevada foi a com 9,10%.

A semente de alpiste contém um pouco mais de cinzas, mas substancialmente

menos açúcar, fibras alimentar solúvel e insolúvel em relação ao trigo (ABDEL-AAL et al.,

1997). Segundo dados de Alvarado (2013), a percentagem de cinzas encontrado em

sementes de alpiste (Phalaris canariensis), variou de 5,60% a 3,91%. Os valores obtidos

neste estudo foram próximos nos dois lotes, conforme tabela 1. Os valores encontrados

estão dentro do esperado para estas sementes, conforme visto na literatura.

Para determinação de proteínas foram utilizados dois fatores de conversão de

nitrogênio de 5,7 e 6,25 onde obteve-se 14,88 e 15,12% e 16,98 e 17,24% respectivamente,

em alguns estudos à maioria ainda é calculada com o fator de 6,25 considerado padrão, no

entanto geralmente em cereais, o fator de 6,25 não é usado, uma vez que foi relatado que o

96

fator de conversão de nitrogênio para proteína de cereais variou 5,61 a 5,93 e o fator de 5,7

é o recomendado (SOSULSKI; IMAFIDON, 1990; ABDEL-AAL et al., 2010).

Em comparação com os cereais comuns, o alpiste contêm altos níveis de proteína,

cerca de 21% (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010;

ESTRADA-SALAS et al., 2014).

Os dados de Alvarado (2013), mostraram variação entre 12,82% e 19,84% no teor

de proteínas.

Quando analisou-se lipídeos os lotes apresentaram valores muito próximos de 5,38 e

5,17%. Abdell-Aal et al., (1997) encontraram níveis de lipídeos entre 8,4-8,9%,

considerados muito elevados para um grão de cereal.

Os resultados em relação ao amido e fibras foram de 48,04–50,54g/100g e 17,29 –

18,88g/100g respectivamente. Quando comparado com a literatura a relação de fibras está

dentro do esperado em relação aos outros cereais em comum tais como: aveia 11-25%,

trigo 13-21% e cevada com 16-27% (WARD et al., 2008; SILVA; CIOCCA, 2005;

ABDEL-AAL et al., 2010).

O alpiste apresenta em média cerca de 60% de amido, 20% de proteína, e 8% de

lipídeos (ABDEL-AAL; HUCL, 2005 apud ABDEL-AAL et al., 2010), 7% de fibra

dietética total (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010). De

acordo com alguns estudos a proteína de alpiste tem 18,7% comparado com 15,0% no trigo

(MALIK; WILLIAMS, 1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014; ABDEL-AAL et al.,

1997; LI, 2011). De acordo com Abdell-Aal et al., (1997) a média da concentração de

proteína no alpiste é de 18,7% (N=5.7) ou 20,5% (N= 6,25), que é superior à do trigo em

25%. Os níveis de gordura bruta foram quase quatro vezes maiores do que o trigo. O amido

foi o principal constituinte das sementes de alpiste, com média de 61,0% da matéria seca,

bastante comparável ao trigo.

No trigo o teor de proteínas é 12,3%, 1,8% lipídeos e 2,3% fibras (EARLY e

EARLY, 1987 apud BOTELHO, 2006). Segundo pesquisas de Fujita e Figueroa (2003),

variedades de trigo apresentaram 12,02 a 12,67 de umidade, 1,47 a 1,60 de cinzas, 10,60 a

14,67 de proteínas, 1,56 a 2,15 de lipídeos, 13,94 a 15,03 de fibra alimentar total e 54,28 a

58,72 de carboidratos.

Comparação da composição de nutrientes de farinhas produzidas de alpiste glabro,

alpiste cabeludo e trigo, os resultados foram os seguintes: 65,5%, 67,5% e 73,9% para

97

amido, 21,5%, 20,8% e 17,0% para proteínas, e 6,3%, 6,0% e 1,3% para gordura bruta,

respectivamente (ABDEL-AAL et al., 2011).

A composição da aveia com casca foi 14,92% de proteínas, 6,82% de lipídeos,

2,23% de cinzas, 13,52% de umidade e 62,51% de carboidratos. O teor de proteínas foi

similar ao encontrado por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), ao caracterizar

quatro cultivares de aveia. A proteína bruta em grãos de aveia variou consideravelmente

entre cultivares e quando exposta a diferentes locais de cultivo (RUPOLLO et al., 2006).

Grãos de aveia de 25 genótipos cultivados em diferentes ambientes no sul do Brasil

apresentaram teores de proteínas entre 12,7% e 16,9% (MILACH et al., 2000 apud

RUPOLLO et al., 2006). O teor de lipídeos da aveia foi de 6,82%, estando abaixo dos

resultados obtidos por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), que obtiveram

valores entre 7,18% e 7,50%, provavelmente por ter sido determinada a composição

centesimal em grãos de aveia com casca. O teor de cinzas encontrado ficou acima dos 2,0%

verificados por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), pelo fato da aveia ter sido

analisada com casca (EARLY e EARLY, 1987 apud BOTELHO, 2006). A concentração de

proteínas nos grãos de aveia descascados variou entre 13,95 e 16,52%, bem próximo aos

15,9% obtidos por Asp et al., (1992) apud Pedó e Sgarbieri, (1997). O teor de lipídeos

variou entre 6,33 e 7,5%, estando de acordo com os encontrados por Pedó e Sgarbieri,

(1997). Variedades de aveia apresentaram também 10,88 a 11,15% de umidade, 1,62 a

2,06% de cinzas, 13,29 a 14,55% de proteínas, 4,97 a 5,57% de lipídeos, 13,12 a 15,02% de

fibra alimentar total e 52,25 a 55,52% de carboidratos (FUJITA; FIGUEROA, 2003).

Segundo Morrison (1978) apud Pedó e Sgarbieri, (1997), a aveia apresenta alta

concentração de lipídeo quando comparada aos demais cereais, com teores variando entre

5,0 e 9,0%. Em trigo, arroz, milho, cevada e centeio os valores encontrados foram 2,1-

3,8%, 1,0-2,5%, 3,9 – 5,8%, 3,3-4,6% e 2,0-3,5% respectivamente.

Quanto aos açúcares totais observa-se que variaram entre 0,9 e 1,37%. A

concentração de açúcares totais livres na aveia foi relativamente inferior ao verificado em

cevada, trigo e centeio, mas similar ao milho. Contudo, foi maior que os teores encontrados

no arroz (HENRY, 1985 apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997).

Frutose e glicose estão presentes em pequenas concentrações em alimentos

(ASOCIACION ORNITOLOGICA NATURALISTA CULTURAL DE GRANADA.

ALIMENTACION, 2012 apud ORTIZ, 2012). As concentrações de frutose e glicose nas

98

amostras de alpiste apresentaram-se baixas, impossibilitando sua quantificação pelo método

de oxirredução de Fehling.

Na aveia, assim como nos demais cereais, o amido é o componente químico

presente em maior quantidade, com teores médios entre 43,7 e 61,0% (PATON, 1977 apud

PEDÓ e SGARBIERI, 1997). Porém, esses teores estão abaixo das concentrações

encontradas nos grãos de centeio, cevada e trigo, cujos valores estão entre 63,2 e 69,0%

(AMAN & HESSELMAN, 1984 apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997).

Segundo Barroso (2014), as sementes de linhaça marrom e dourada apresentam na

sua composição centesimal respectivamente: umidade: 7,06 ± 0,41, 7,77 ± 0,37; cinzas:

2,89 ± 0,14, 3,01 ± 0,11; lipídeos: 33,7 ± 0,56, 34,8 ± 0,07; proteínas: 19,1 ± 1,15, 21,6 ±

0,12; fibras: 28,0 ± 4,24, 22,5 ± 4,95 e carboidratos: 9,22 ±4,75, 10,4 ±4,55. A composição

centesimal do grão de linhaça se estabelece em 4-8% de umidade, 30-40% de lipídeos, 20-

25% de proteínas, 20-28% de fibra alimentar, 3-4% de cinzas (OOMAH; MAZZA, 1998;

AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE, 1999; MORRIS, 2007) e 43,3 e 9,8 de

carboidratos (ALVARENGA, 2012). A linhaça por apresentar de 28-33,5% de fibra

alimentar pode ser considerada uma fonte de fibra alimentar (MORRIS, 2001; HUTCHINS

et al., 2001; TACO, 2006 apud CUPERSMID et al.,2012).

Podemos observar a composição centesimal do grão de amaranto feita por

Kalinowski (1982) apud Botelho (2006), onde o conteúdo de proteínas é de 14,5%, lipídeos

7,2% e fibras 8,4%. O amido representa 50% a 60% do total do grão (SAUNDERS e

BECKER, 1984 apud BOTELHO, 2006).

Variedades de cevada apresentam 10,28 a 14,02% de umidade, 1,42 a 1,85% de

cinzas, 7,48 a 10,75% de proteínas, 1,84 a 2,71% de lipídeos, 10,72 a 17,94% de fibra

alimentar total e 56,56 a 65,60% de carboidratos (FUJITA; FIGUEROA, 2003).

Os teores médios de proteína bruta, nos grãos integrais e nos grãos sem casca de

cevada, foram de 13,01 e 12,21%, respectivamente. Os valores médios de matéria mineral

(cinzas), nos grãos integral e descascado, foram 2,45 e 1,44%, respectivamente (EVERS et

al.,1999 apud MAYER et al., 2007). Os valores de fibra alimentar variaram de 24,58 a

19,81%, com média de 22,06%, nos grãos integrais. Entretanto, nos grãos sem casca, o

valor máximo foi de 13,73% e o mínimo de 8,25%, com média de 11,10%. Teores

semelhantes foram observados por Xue et al., (1997) apud Mayer et al., (2007), em grãos

na forma integral e sem casca, e por Fujita & Figueroa (2003) e Yalçin et al., (2007);

99

Mayer et al., (2007), em grãos descascados. O amido é o principal componente dessa

fração, o qual representa de 40 a 80% do valor energético total da alimentação diária dos

seres humanos (FREITAS, 2002 apud MAYER et al., 2007). Xue et al., (1997) apud Mayer

et al., (2007) e Molina-Cano et al., (1997) verificaram valores de amido, em grãos de

cevada, entre 52,7 e 59,6%.

A chia apresenta resultados de 32,25% de lipídeos, 5,89% de umidade e 4,40% de

cinzas (CUNNIFF, 1997). Namiki (1995) observou teor de proteínas de 17,7%. Na Tabela

brasileira de composição de alimentos (TACO) (LIMA et al., 2006), está disponível apenas

o valor de fibra alimentar total 11,9% (SILVA et al., 2011).

A composição química de grãos integrais de gergelim creme e preto, são: proteínas:

18,83±0,25, 19,46±1,73; lipídeos: 56,45±1,07, 48,92±0,58; carboidratos: 7,06±0,68, 0,0;

umidade: 3,03±0,68, 3,24±0,74; cinzas: 3,76±0,31, 4,28±0,49 e fibra alimetar total:

10,87±0,58, 24,10±1,02 (SILVA et al., 2011).

Composição centesimal média (% na matéria seca) de arroz integral, branco polido

e parboilizado polido é respectivamente: amido total: 74,12; 87,58; 85,08; proteínas (N x

5,95): 10,46; 8,94; 9,44; lipídeos: 2,52; 0,36; 0,69; cinzas: 1,15; 0,30; 0,67 e fibra total:

11,76; 2,87; 4,15 (STORCK, 2004; WALTER, 2009). O arroz, assim como outros cereais,

é rico em carboidratos, principalmente amido, sendo por isso utilizado como fonte de

energia na alimentação (WALTER, 2009).

A comparação do alpiste com alguns grãos se deu a partir de sua semelhança em

relação a microestrutura de outras gramíneas (trigo, aveia, cevada e o arroz) e também

pelos usos potenciais de outros tipos de grãos.

Quando comparamos o alpiste com o trigo pode-se dizer que é nutricionalmente

superior em cinzas, proteínas, lipídeos e fibras totais, já o amido pode ser similar ou menor

que o trigo. Em relação ao alpiste e a linhaça apresentam conteúdo similar de proteínas, o

alpiste possue menor quantidade de lipídeos e fibras que a linhaça, sendo maior em cinzas e

carboidratos. O alpiste possue maior quantidade de proteínas e fibras que o amaranto,

menor quantidade de lipídeos e amido semelhantes. A cevada apresenta menor quantidade

de cinzas, proteínas e lipídeos comparado ao alpiste, já fibras totais, carboidratos e amido

estão próximos ente si dos valores encontrados. Quando compara-se com a chia são

similares nas proteínas, no entanto possue menos lipídeos e maior cinzas e fibras totais. Já o

gergelim é parecido com alpiste em relação ao teor de proteínas e fibras totais, possue mais

100

lipídeos e menos carboidratos e cinzas. Em comparação ao arroz o alpiste apresenta menor

quantidade de amido, no entanto maiores quantidades em proteínas, lipídeos, cinzas e

fibras.

De acordo com Putnam et al., (1990) apud Cogliatti, (2012) as sementes de alpiste

são semelhantes a aveia na composição, sendo apenas maior em cinzas, mas inferior em

fibras. A aveia é nutricionalmente superior quando comparada com os demais cereais, não

só pela composição química, ou seja, apresenta superiores teores de proteínas, lipídeos e

fibra alimentar total, e também pela sua forma de consumo (COCHRAN & COX, 1964

apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997) utilizada em diversas preparações.

Segundo o Ministério da Saúde (2001), um alimento sólido pode ser considerado

fonte de fibra, quando possui um mínimo de fibras 3,0 g/100 g, e como de alto teor de

fibras, quando contém, no mínimo, 6 g/100 g. E para alimentos líquidos é considerado fonte

de fibras possuindo 1,5 g/100 mL e alto teor de fibras de 3 g/ 100mL.

A elevada quantidade de cinzas e fibras no alpiste se deve à presença de cascas na

amostra. Já quando ocorre a retirada das mesmas, no caso do extrato aquoso de sementes de

alpiste as quantidades de cinzas e fibras caem consideravelmente. E a diminuição de

lipídeos e amido ocorre por serem moléculas maiores, ficando muitas vezes retidas nas

sucessivas peneiradas e filtrações. Diferentes lotes de sementes de Phalaris canariensis não

apresentaram diferenças nos teores de umidade, cinzas, lipídeos, fibras, amido e proteína.

É importante dizer que durante a realização das análises para determinação da

composição centesimal e também atividade antioxidante notou-se algumas dificuldades na

preparação da amostra (elevada turbidez), devido a alta concentração de amido no extrato

de alpiste, como pode ser visto na Figura 15.

Figura 15. Extrato aquoso de sementes de alpiste após centrifugação.

Fonte: Laboratório DCA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).

101

Os ácidos graxos, ésteres metílicos dos ácidos graxos e as suas proporções

encontradas na análise dos cromatogramas encontram-se (resultados apresentados como %

da soma das áreas dos picos), nas Tabela 2 e Figuras 16 e 17. Os ácidos graxos que se

apresentaram em maiores quantidades no extrato aquoso foram: linoleico, oleico e

palmítico respectivamente.

Tabela 2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica do extrato aquoso de Phalaris

canariensis – semente A e B.

Ácidos Graxos% Amostra Extrato de Alpiste

(Semente A)

% Amostra Extrato de Alpiste

(Semente B)

- C12:0 láurico 0,05653 0,05565

- C14:0 mirístico 0,18266 0,18334

- C15:0 pentadecanóico 0,03228 0,03975

- C16:0 palmítico 11,91668 11,92208

- C16:1 palmitoléico 0,11778 0,11668

- C17:0 margárico 0,08237 0,06005

- C17:1 cis-10-heptadecenóico 0,04224 0,06007

- C18:0 esteárico 1,43942 1,41523

- C18:1 oléico 29,41601 29,28222

- C18:2 linoléico 52,8178 52,9786

- C18:3 linolênico 2,61031 2,60776

- C20:0 araquídico 0,23478 0,20223

- C20:1 eicosenóico 0,838 0,83982

- C22:0 behênico 0,13107 0,14609

- C24:0 lignocérico 0,08209 0,09042

102

Figura 16. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (A) de alpiste

(Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico (C16:0): 24.448

min.; ácido oleico (C18:1): 28.129 min.; ácido linoleico (C18:2): 29.090 min.

Figura 17. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (B) de alpiste

(Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico (C16:0): 24.432

min.; ácido oleico (C18: 1): 28,113 min. ácido linoleico (C18:2): 29.071.

103

Abdel-Aal; Hucl; Sosulski, (1997); Abdel-Aal et al., (2010) ao analisar sementes de

alpiste observou conteúdo de 9% de óleo. O alpiste possue ácidos graxos insaturados

(ASOCIACION ORNITOLOGICA NATURALISTA CULTURAL DE GRANADA.

ALIMENTACION, 2012 apud ORTIZ, 2012), contendo 55% de ácido linoleico, 29% de

ácido oleico, 11% de ácido palmítico e 2,5% de ácido linolênico (MALIK; WILLIAMS,

1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014; ABDEL-AAL et al., 1997; LI, 2011) e 1%

esteárico (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010);

corroborando com os resultados obtidos neste estudo (53% de ácido linoleico, 28% de

ácido oleico, 12% de ácido palmítico e 2,6% de ácido linolênico).

Comparando com outros grãos, o conteúdo de óleo no grão de linhaça se apresenta

entre 35 e 45% sendo que desse total, 73% tratam-se de ácidos graxos poli-insaturados,

destes 45 a 60% de α- linolênico e 15 a 18% de linoleico e 18% de monoinsaturados e 9%

saturados (TARPILA; WENNBERG; TARPILA, 2005 apud ALVARENGA, 2012). O teor

de ácido α-linolênico no óleo de canola é de 9,1% e no de soja 6,8% e teores menores são

encontrados nos óleos de milho, algodão e de girassol, porém, esses óleos citados têm

conteúdos de ácido linoleico variando entre 35 e 37% (TARPILA; WENNBERG;

TARPILA, 2005 apud ALVARENGA, 2012).

O ácido graxo ω-6 (ácido linoleico) atua auxiliando na prevenção e no controle do

diabetes mellitus tipo 2 e na modulação do sistema imunológico, prevenindo uma série de

doenças (BRAGA e MENDONÇA, 2010).

Segundo Barroso (2014), as sementes de linhaça marrom e dourada apresenta

respectivamente teores de ácidos graxos: (saturados) ácido mirístico 0,03 ± 0,08; 0,03 ±

0,08; ácido palmítico 4,90 ± 0,12; 4,28 ± 0,14; ácido esteárico 2,61 ± 0,09; 0,91 ± 0,14;

ácido miristoleico 0,01 ± 0,02; 0,01 ± 0,09; ácido palmitoleico n.d.; 0,02 ± 0,01; ácido

erúcico 0,09 ± 0,01; n.d e (insaturados) ácido oleico 20,4 ± 0,22; 23,0 ± 0,30; ácido

linoleico 13,3 ± 0,17; 13,4 ± 0,26 e ácido linolênico 58,4 ± 0,14; 58,3 ± 0,10.

Composição em ácidos graxos dos lipídeos da aveia: palmítico (13,3%); esteárico

(1,70%); araquídico (1,30%); oleico (43,8%); linoleico (37,5%); linolênico (2,3%)

(RUPOLLO et al., 2006). Os valores médios, encontrados para os ácidos graxos totais,

insaturados e saturados, nos óleos de aveia foram de 81,05 e 18,96% respectivamente. Os

ácidos graxos: palmítico (17,61%), oleico (39,66%) e linoleico (43,13%) foram

encontrados em maiores quantidades, somando cerca de 96% do total, enquanto que

104

mirístico (0,23%), esteárico (2,45%) e linolênico (2,31%) contribuíram com o restante

(cerca de 4%) (PEDÓ e SGARBIERI, 1997). A composição de lipídeos na aveia é

favorecida pelo alto teor de ácidos graxos insaturados, dentre eles o linoleico que é

considerado essencial para a nutrição humana, sendo também o mais abundante

(ZADERNOWSKI et al., 1999; RUPOLLO et al., 2006).

Em relação a fração lipídica do grão de amaranto variou entre 6% a 8%,

considerando 70% de ácido oleico (C18:1) e linoleico (C18:2) e 20% de ácido esteárico

(C18:0). (TEUTONICO e KNORR, 1985 apud BOTELHO, 2006). De acordo com Botelho

(2006) a composição de ácidos graxos do óleo de amaranto foi: ác. mirístico - 0,19; ác.

palmítico - 4,31; ác. esteárico - 18,06; ác. oleico 29,04; ác. linoleico - 45,27; ác. linolênico -

0,82; ác. araquidônico - 0,88; ác. araquídico - 0,23; ác. dodecanoato - 0,31.

Os lipídeos do sorgo correspondem a cerca de 3% do cereal (USDA, 2010).

Mehmood et al., (2008) identificaram teor de lipídeo de 5 a 8,4%, em dez cultivares. A

maioria das cultivares apresentou maior teor de ácidos graxos poli-insaturados do que

monoinsaturados. As concentrações dos principais ácidos graxos variaram de 31,1 a 48,9%,

para o ácido oleico; 0,4 a 0,6% de palmitoleico; 27,6 a 50,7% de linoleico; 1,7 a 3,9% de

linolênico; 1,0 a 2,6% de esteárico e 11,7 a 20,2% de palmítico (QUEIROZ et al., 2011).

O conteúdo total dos ácidos graxos do farelo de arroz corresponde a cerca de 18%

de ácidos graxos saturados, 45% de ácidos graxos monoinsaturados e 37% de ácidos graxos

poli-insaturados. Os principais ácidos graxos saturados são os ácidos palmítico (14-17%) e

esteárico (2,0-2,5%) e os principais insaturados são os ácidos oleico (40-45%), linoleico

(35-37%) e linolênico (1-2%) (ZAMBIAZI, 1997).

De acordo com Yermanos et al., (1972) a composição do óleo de gergelim constitui-

se de 45,3-49,4 de ácido oleico, 37,7-41,2 de ácido linoleico, 7,8-9,1 de ácido palmítico,

3,6-4,7 de ácido esteárico, 0,4-1,1 de ácido araquídico, 0,5 de ácido hexadecenóico e 0,1 de

ácido mirístico.

Os ácidos graxos majoritários encontrados em diferentes lotes da semente de Salvia

hispânica (chia), foram o ácido palmítico 68,76 mg/g e 63,30 mg/g respectivamente, oleico

59,44 mg/g e 51,38 mg/g, linoleico 175,74 mg/g e 165,83mg/g e o α-linolênico 564,77mg/g

e 595,39mg/g. As sementes de chia são ricas em ácidos graxos poli-insaturados,

particularmente ácido linolênico (54-67%) e ácido linoleico (12-21%) (GANZAROLI et

al., 2014). Segundo Martínez et al., (2012) o perfil de ácidos graxos da semente da chia é

105

de 7,3% de ácido palmítico, 2,8% de ácido esteárico, 7,4% de ácido oleico, 22% de ácido

linoleico e 60,5% de ácido linolênico. Os teores de ácidos graxos determinados para ω-3 e

ω-6 da chia de acordo com Picinin (2014) foram de 565,08 mg/g e 175,14 mg/g

respectivamente.

A composição de ácidos graxos da aveia também é muito similar ao do alpiste em

ácido palmítico e no linolênico, no entanto apresenta maiores quantidades em ácido

esteárico, araquídico, oleico e mirístico. Com relação ao linoleico o alpiste possue maiores

proporções. Enquanto o alpiste apresenta aproximadamente 14% de ácidos graxos

saturados e 85% de insaturados, a aveia possue 16-20% saturados e 85% de insaturados.

Comparando com a linhaça, o alpiste possue menor quantidade do linolênico e

esteárico, mas apresenta maiores concentrações em linoleico, oleico, palmítico, mirístico e

palmitoleico. Sendo a linhaça cerca de 7% saturados e 92% insaturados. A canola e a soja

apresentam maiores quantidades em linolênico, mas o alpiste possue mais linoleico. Já

comparando com o amaranto são similares no ácido mirístico, araquídico e oleico, no

entanto o alpiste se destaca no palmítico, linoleico e linolênico, o amaranto possue maior

quantidade do esteárico, sendo no total aproximado 24% de saturados e 75% insaturados.

No sorgo a quantidade de ácido oleico é próximo ao alpiste que possue quantidades

de linoleico maiores. Com relação aos demais ácidos graxos o alpiste encontra-se dentro da

faixa definida pelo grão de sorgo, sendo 23% de saturados e 60% insaturados

aproximadamente.

Quando faz-se o mesmo comparativo com o arroz, este se mostra em porcentagens

superiores no alpiste de ácido palmítico e oleico, e inferiores de linoleico e dos demais em

quantidades próximas. Ácidos graxos saturados 16 -19,5% e 76-84% insaturados.

Ao se comparar o alpiste com o gergelim, este é superior em ácido oleico, esteárico

e araquídico e inferior em linoleico. Portanto 12% de saturados e 83% insaturados. Já com

relação a chia valores inferiores são encontrados em todos os ácidos graxos com exceção do

linolênico e esteárico. E muito semelhante o linoléico. Correspondendo 10% saturados e

90% insaturados.

Baseado em todas estas informações pode-se dizer que o alpiste é quantitativamente

e qualitativamente superior em porcentagem de ácidos graxos benéficos ao amaranto e ao

sorgo, sendo inferior em relação a linhaça e a chia e semelhantes com relação à aveia,

gergelim e arroz.

106

4. CONCLUSÃO

As sementes de alpiste são importantes fontes de proteínas, lipídeos, fibras e amido,

apresentando composição semelhantes a alguns grãos como a aveia e o trigo. O alpiste

destaca-se entre os grãos em relação a alta carga proteica, fonte de energia, devido alta

proporção de amido, possuindo na sua composição fibras e ácidos graxos poli-insaturados

extremamente benéficos à saúde e principalmente a grande quantidade de ácido linoleico

(ω-6), importante na prevenção do diabetes. No extrato aquoso as proporções foram

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Capítulo III

COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

DO EXTRATO AQUOSO DE SEMENTES DE PHALARIS

CANARIENSIS L.

Michele Christine Machado de Oliveira1, Marcelo Alexandre Prado1, Glaucia Maria

Pastore1, Iramaia Angelica Neri-Numa1



SP, Brasil.

Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Journal of Food Science and

Tecnology

117

Resumo

Os mecanismos fisiopatológicos que relacionam o diabetes à síndrome metabólica não

estão completamente elucidados, embora evidências apontem que o estresse oxidativo e

aumento da produção de radicais livres sejam mecanismos importantes nessa relação.

Alguns relatos apontam o uso popular do alpiste no controle do diabetes, devido ao seu

potencial antioxidante, com efeitos benéficos à saúde. No entanto, ainda são escassos os

estudos científicos sobre o teor de compostos fenólicos e a comprovação da atividade

antioxidante do alpiste. A fim de identificar novas fontes de antioxidantes naturais e de

esclarecer lacunas acerca das reais propriedades benéficas atribuídas ao alpiste (Phalaris

canarienses L.), o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização química e avaliação

da atividade antioxidante do extrato aquoso de sementes de alpiste. Os compostos bioativos

(fenólicos totais) e a atividade in vitro foram avaliados pelos métodos de captura de radicais

ABTS, DPPH e ORAC por espectrofotometria. Foram obtidos os seguintes resultados:

compostos fenólicos totais (280,15 ± 3,05 µg EAG/g) e Atividade Antioxidante ABTS

(228,93 ± 2,25µg TE/g), DPPH (106,17 ± 6,69 µg TE/g) e ORAC (1177,37 ± 5,32 µM/g na

fração hidro e 147,79 ± 0,48 µM/g na lipo). Observou-se que as frações hidrofílicas

apresentaram valores superiores às lipofílicas. Apesar dos relatos anteriores da literatura

destacar o elevado poder antioxidante e de compostos fenólicos, neste estudo o extrato

aquoso de alpiste mostrou-se inferior quando comparado com outros alimentos e também

com compostos fenólicos de sementes. Os resultados obtidos nesta pesquisa contribuem

significativamente com novos dados para a literatura atual sobre o potencial biológico do

alpiste.

Palavras-chave: Alpiste, Compostos Bioativos, Atividade Antioxidante, Compostos

Fenólicos.

118

Abstract

The pathophysiological mechanisms linking diabetes to the metabolic syndrome are not

fully elucidated, although evidences show that oxidative stress and increased production of

free radicals are important mechanisms in this connection. Some reports indicate the

popular use of canary seeds in the control of diabetes due to its antioxidant potential, with

beneficial effects to the health. However, there are still few scientific studies on the content

of phenolic compounds and the comproved antioxidant activity of canary seeds. In order to

identifying new sources of natural antioxidants and clarify gaps about the real beneficial

properties attributed to the canary seed (Phalaris canarienses L.), the objective of this work

was to perform the chemical characterization and evaluation of the antioxidant activity the

aqueous extract of canary seeds. The bioactive compounds (phenolics) and the in vitro

activity were evaluated by spectrophotometer through capture methods such as ABTS

radical, DPPH and ORAC. The following results were obtained: total phenolic compounds

(280.15 ± 3.05 μg GAE / g) and Antioxidant Activity ABTS (228.93 ± 2,25μg eqtrolox / g),

DPPH (106.17 ± 6.69 μg eqtrolox / g ) and ORAC (1177.37 ± 5.32 uM / g in the fraction

hydro and 147.79 ± 0.48 uM / g in lipo). It was observed that the hydrophilic fractions

showed values higher than the lipophilic ones. Despite previous reports in the literature

highlight the high antioxidant power and phenolic compounds, in this study the aqueous

extract of canary seed proved to be less eficient when compared to other foods and also

with phenolic compounds from other seeds. The results obtained in this research

significantly contribute to new data to the current literature on the biological potential of

canary seed.

Keywords: Canary seed, Bioactive Compounds, Antioxidant Activity, Phenolic

Compounds.

119

1. INTRODUÇÃO

Pesquisas demostram que todo grão consumido ajuda a diminuir o risco de doença

cardiovascular, acidente vascular cerebral isquêmico, diabetes tipo II, síndrome metabólica

e cânceres gastrointestinais (JONES, 2006; JONES et al., 2002 apud DYKES, ROONEY,

2007). Além da fibra dietética, os cereais integrais contêm muitos componentes

responsáveis pela promoção da saúde, tais como vitaminas, minerais e fitoquímicos, que

incluem os compostos fenólicos.

Os compostos fenólicos apresentam propriedades antioxidantes e proteção contra

doenças degenerativas em que as espécies reativas de oxigênio (ou seja, ânion superóxido,

radicais hidroxila, e radicais peróxidos) estão envolvidos (RHODES; PRICE, 1997 apud

DYKES; ROONEY, 2007; HARBORNE; WILLIAMS, 2000). A definição geral de um

composto fenólico é um composto que contenha um anel de benzeno com um ou mais

grupos hidroxilas. Dentre eles podemos citar os ácidos fenólicos, flavonóides, taninos e

cumarinas, por exemplo (DYKES; ROONEY, 2007).

Os ácidos fenólicos constituem um grupo importante de compostos caracterizado

por um amplo espectro de atividade farmacológica. Eles são responsáveis pela eliminação

de radicais livres, quelação de íons metálicos e alteração da atividade enzimática (WANG,

2001; ROBBINS; BEAN, 2004; ATOUI et al., 2005; ZHENG; ARCEUSZ et al., 2013). Os

ácidos fenólicos participam na regeneração e processos de adaptação em humanos e são

usados na prevenção contra muitas doenças (SLAVIN; MARQUART; JACOBS, 2000

apud ARCEUSZ et al., 2013; WENG; YEN, 2012). Eles impedem o desenvolvimento de

doenças coronárias, a inflamação observada no diabetes tipo 2, bem como auxiliam no

tratamento de câncer (ARCEUSZ et al., 2013).

Os principais ácidos fenólicos em cereais são: os ácidos ferúlico e p-cumárico,

podendo variar seus níveis entre os cereais (SOSULSKI; KRZYSZTOF; HOGGE, 1982;

HAHN; FAUBION; ROONEY, 1983; ZHOU et al., 2004; MATTILA; PIHLAVA;

HELLSTRÖM, 2005; HOLTEKJOLEN; KINITZ; KNUTSEN, 2006; DYKES, ROONEY,

2007). Muita atenção tem sido dada ao ácido gálico, vanílico, salicílico, caféico e p-

cumárico, que são componentes ativos de muitas plantas (KAEFER; MILNER, 2008;

INBARAJ, et al., 2010; ARCEUSZ et al., 2013).

120

Existem vários métodos para a quantificação de compostos fenólicos. Essas

substâncias possuem, em geral, características ácidas, podendo ser isoladas em razão de sua

solubilidade em soluções fracamente básicas como, por exemplo, em solução de carbonato

de sódio. Os métodos utilizados para a quantificação dos compostos fenólicos, em geral,

utilizam reações de oxi-redução entre o reagente e as hidroxilas fenólicas gerando

complexos coloridos, que são quantificados por espectrofotometria. Nesses métodos todas

as substâncias fenólicas presentes na amostra são quantificadas (SIMÕES, 2000 apud

ZICKER, 2011).

1.1 Mecanismos de Ação dos Antioxidantes

Os antioxidantes podem atuar sobre diferentes níveis na proteção dos organismos.

Podem agir como captadores de radicais e supressores de estados excitados, como sistemas

catalíticos que neutralizam ou eliminam EROs/ ERNs ou fazendo a ligação de íons

metálicos às proteínas, tornando-os indisponíveis para a produção de espécies oxidantes

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999 apud COSTA, 2011).

O primeiro mecanismo de proteção contra os radicais livres é impedir sua formação,

inibindo principalmente reações em cadeia com o ferro e o cobre. Outro mecanismo

importante de defesa é o fato dos antioxidantes serem capazes de interceptar os radicais

gerados pelo metabolismo das células ou por fontes exógenas, evitando o prejuízo aos

lipídeos, aos aminoácidos, às duplas ligações dos ácidos graxos poli-insaturados e às bases

de DNA, impedindo a lesão e perda de integridade celular (BIANCHI e ANTUNES, 1999;

COSTA, 2011).

As pesquisas em relação aos antioxidantes têm focado principalmente, o uso de

nutrientes isolados no tratamento e prevenção de doenças, além do que, nos alimentos são

encontrados uma variedade de substâncias que podem atuar em sinergismo na proteção das

células e tecidos (HERCBERG et al., 1998 apud COSTA, 2011; JACOB, 1995; NIKI et al.,

1995).

O consumo de alimentos contendo uma significativa quantidade de antioxidantes

pode ajudar o organismo a reduzir os danos oxidativos relacionados ao envelhecimento e

doenças como arteriosclerose, diabetes, úlcera e câncer (REPETTO; LLESUY, 2002;

SACHIDANANDAM; FAGAN; ERGUL, 2005; HALLIWELL, 2007; SHAH et al., 2007;

BIERHALS et al., 2009).

121

Quanto ao desempenho dos antioxidantes in vivo, este depende de fatores como:

tipo de radical formado, local e como são gerados, análise e métodos para a identificação

dos danos e as doses ideais para se obter proteção. Nesse sentido, é possível que um

determinado antioxidante atue como protetor em determinado sistema mas falhe na

proteção de outro, ou então, aumente as lesões induzida em outros sistemas ou tecidos

(HALLIWELL et al., 1995 apud COSTA, 2011).

Há várias lacunas no que se refere aos antioxidantes, como por exemplo, a

inexistência de uma recomendação específica para cada antioxidante, a falta de

padronização dos valores de antioxidantes nos alimentos e os efeitos tóxicos que venham a

existir pela administração de doses excessivas de antioxidantes (LIMA, 2008; COSTA,

2011).

1.2 Métodos Utilizados na Avaliação da Capacidade Antioxidante

Os testes in vitro têm se tornado importantes ferramentas que auxiliam na busca por

substâncias bioativas, bem como na seleção de matéria-prima para estudo. Estes testes têm

demonstrado a importância de dietas ricas em frutas e vegetais, alimentos ricos em

substâncias antioxidantes, as quais auxiliam no combate aos radicais livres. Devido à

crescente busca por substâncias bioativas que substituam os produtos sintéticos e diminuam

os efeitos colaterais, um grande número de testes in vitro tem sido desenvolvido para

avaliar a atividade antioxidante, porém muitos desses métodos não têm demonstrado

correlação com a habilidade dos compostos em inibir a deterioração oxidativa in vivo. Isto

se deve ao fato de que a atividade antioxidante depende não somente da reatividade

química do antioxidante, mas também de fatores como localização física, interação com

outros componentes e condições ambientais. Devido aos diversos tipos de radicais e aos

diferentes alvos de oxidação, dificilmente haverá um único método capaz de representar de

forma segura e precisa a real atividade antioxidante de um composto. Para uma avaliação

correta desta atividade em alimentos e sistemas biológicos, modelos individuais devem ser

desenvolvidos desde que representem as mesmas condições químicas, físicas e ambientais

esperadas para o sistema em análise (ALVES et al., 2010).

Entre os métodos disponíveis para avaliação da atividade antioxidante estão os

métodos baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de redução do

metal (FRAP, CUPRAC), captura da radical hidroxila (método de desoxirribose), captura

122

do radical orgânico (ABTS, DPPH) e quantificação de produtos formados durante a

peroxidação de lipídeos (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do β-caroteno)

(ARUOMA, 2003 apud COSTA, 2011; FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-

MORENO, 2002;) e etc.

Dentre estes métodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos mais usados

atualmente (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006; COSTA, 2011).

Embora existam várias metodologias para a determinação da capacidade

antioxidante, deve-se observar os possíveis interferentes e adequação da matriz à

metodologia. Dessa forma, levando-se em conta os pontos fortes, pontos fracos e

aplicabilidade de cada tipo de ensaio (SUCUPIRA et al., 2012), atualmente preconiza-se a

utilização de duas ou mais técnicas, já que nenhum ensaio usado isoladamente para

determinar a capacidade antioxidante irá refletir exatamente a “capacidade antioxidante

total” de uma amostra (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012). Esses métodos são

necessários, pois existe uma grande dificuldade em medir cada composto que tenha ação

antioxidante, separadamente, além das interações existentes entre os diferentes

antioxidantes do sistema. Todos os métodos utilizados na mensuração da capacidade

antioxidante têm em comum a presença de um agente antioxidante e um substrato

específico. Esses métodos possuem duas classificações: os que agem na captura de radicais

livres e os que atuam na determinação de uma molécula alvo (LIMA, 2008; COSTA,

2011).

Os métodos in vitro são avaliações potenciais da atividade antioxidante de um

determinado composto puro ou extrato. Porém, estes métodos não fornecem informações

sobre a biodisponibilidade ou metabolismo destes compostos em sistemas biológicos, mas

são úteis para comparar os níveis de atividade antioxidante entre uma larga variedade de

amostras (DYKES; ROONEY, 2007). Para a utilização de antioxidantes em alimentos, para

fins tecnológicos, a avaliação in vitro, se bem conduzida, fornece uma estimativa

importante do potencial antioxidativo do composto em análise (BERTOLDI, 2006). É

comumente compreendido que para combater a oxidação é preciso aumentar as defesas

naturais do organismo com antioxidantes provenientes de outras fontes. Assim, medir a

capacidade antioxidante de várias fontes torna-se importante (BANK e SCHAUSS, 2004).

A capacidade antioxidante é definida como a habilidade de um componente em

reduzir os pró-oxidantes. Os radicias livres são produzidos in situ (no organismo) e são

123

úteis para importantes funções biológicas. Os alimentos ingeridos fornecem um diverso e

complexo estoque de antioxidantes para combater a atividade excessiva de radicais livres.

Aparentemente existem combinações ilimitadas de antioxidantes internos e externos, e de

radicais que eles combatem. Isto explicaria porque nenhum status de medida de

antioxidantes fornece uma quantidade suficiente de dados para avaliar em um único

experimento a atividade de eliminação dos radicais livres de um alimento ou o potencial de

sua atividade antioxidante in vitro (BANK e SCHAUSS, 2004).

1.2.1 Quantificação de Compostos Fenólicos Totais

Conteúdo Total de Fenólicos ou ensaio TPC com o Folin Ciocalteu, é um ensaio de

relevância pois, quantifica o conteúdo fenólico total de uma amostra. Além de fornecer o

óbvio benefício da avaliação das quantidades dentro de fontes de alimentos, este método

também pode ser usado em conjunto com a avaliação antioxidante, ensaios para determinar

potencial relativo antioxidante à quantidade e/ou concentração.

Esse método foi descrito por Singleton e Rossi, em 1965 (LIMA, 2008; SUCUPIRA

et al., 2012). O método que usa o reagente de Folin-Ciocalteu utiliza a redução pelos

fenóis, ou outras substâncias redutoras, na presença do catalisador cobre (II), e produz um

composto com absorção máxima de 760 nm (SINGLETON et al., 1999), em meio alcalino,

do fosfomolibdato-fosfotungstato, a molibdênio, cuja coloração é azul determinada

espectrofotometricamente.

A determinação dos compostos fenólicos totais pode ser avaliada pelo método

colorimétrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão (SINGLETON et

al., 1999). A utilização do método de Folin-Ciocalteau permite quantificar o teor de

flavonóides, antocianinas e compostos fenólicos presentes nas amostras.

1.2.2 Método ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido

sulfônico)

O ensaio da Atividade Antioxidante Total Equivalente ao Trolox (TEAC) foi

originalmente desenvolvido por Miller et al., (1993) apud Costa, (2011) para a medição da

capacidade antioxidante do plasma humano em crianças. Re et al., (1999) modificaram o

ensaio para a direta geração de ABTS•+ sem radicais intermediários.

124

A metodologia que tem sido bastante aplicada pelos pesquisadores e utiliza o radical

ABTS•+, que apresenta com principais vantagens em relação aos demais, ser capaz de reagir

com extratos hidrofílicos e lipofílicos, além da forma de expressão dos resultados como

valor TEAC, facilitando assim comparações entre diversos alimentos. O radical ABTS•+ é

produzido a partir de um precursor, o ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-sulfônico,

pode ser gerado por meio de uma reação química, eletroquímica ou enzimática,

normalmente se utiliza o persulfato de potássio (Figura 18). O radical formado é um

cromóforo estável quimicamente (MILLER et al., 1993 apud COSTA, 2011; RE et al.,

1999), podendo ser solubilizado em meios orgânicos e aquosos nos quais a atividade

antioxidante pode ser determinada, dependendo da natureza dos compostos antioxidantes

(ARNAO, 2000; SUCUPIRA et al., 2012).

Figura 18. Reações com cátion radical ABTS

•+.

Fonte: PANNALA et al., 2001.

O método do ABTS avalia espectrofotometricamente a habilidade relativa das

substâncias antioxidantes em capturar a longo prazo o cátion radical ABTS•+, quando

comparada com uma quantidade padrão do antioxidante sintético Trolox (ácido 2-

carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano), um análogo da vitamina E (PEREIRA,

2009). Esta captura provoca um decréscimo na absorbância, que é lida a partir da mistura

do radical com o antioxidante em diferentes tempos, sendo representadas graficamente

(PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-CALIXTO, 2006; SUCUPIRA et al., 2012). Consiste em

verificar como os antioxidantes são capazes de degradar os radicais livres presentes no

meio. Por esse método, inicialmente, gera-se o radical colorido; em seguida, adiciona-se o

antioxidante para posteriormente, medir o decréscimo na absorbância. Sendo que, quanto

maior a atividade antioxidante do composto testado, maior será o decréscimo na

125

absorbância. Inicialmente apresenta cor azul esverdeado, por meio da reação do ABTS com

persulfato de potássio que possui absorção máxima em 645, 734 e 815 nm. Com a adição

de um antioxidante, ocorre a redução do ABTS•+ promovendo a perda da coloração do meio

reacional. Com a perda de cor, a porcentagem de inibição do ABTS•+ é determinada em

função do Trolox, um padrão submetido às mesmas condições de análise do antioxidante. A

curva gerada pela inibição da absorbância é calculada, sendo que os resultados são

interpolados na curva de calibração e expressos em capacidade antioxidante equivalente de

Trolox expressos como TEAC (ALVES; BRITO; RUFINO, 2006 apud SILVEIRA, 2008).

Dentre as vantagens apresentadas pelo método ABTS destaca-se a alta sensibilidade

(ABREU, 2007; SILVEIRA, 2008), avaliando compostos puros e extratos vegetais

(SUCUPIRA et al., 2012). É um método bastante rápido, no qual o tempo de reação é de

apenas seis minutos, quando comparados com métodos que também têm sido

frequentemente utilizados, como o DPPH, que necessita de 30 minutos para que a reação

seja totalmente realizada, e que oferece resultados reprodutíveis, além de oferecer vários

máximos de absorção e uma boa solubilidade e estabilidade (KUSKOSKI et al., 2005 apud

SUCUPIRA et al., 2012). Sendo assim, o ABTS pode ser usado também em grande escala,

devido a essa rapidez de execução (ABREU, 2007; SILVEIRA, 2008).

1.2.3 Método DPPH

O DPPH é um método químico, aplicado para determinar a capacidade antioxidante

de um composto em sequestrar radicais livres (SUCUPIRA et al., 2012). O DPPH (2,2-

difenil-1-picrilidrazil) é um radical de nitrogênio orgânico, estável, de cor violeta, que

possui absorção na faixa de 515-520 nm (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012).

Essa metodologia foi realizada segundo Blois (1958) adaptado por Brand-Willians;

Cuvelier; Berset (1995) apud Silveira, (2008) e Lima (2008), a qual se baseia na captura do

radical DPPH por antioxidantes, ou seja, na redução do radical [2,2 difenil-1-pricril-hidrazil

(DPPH)], que ao fixar um H+ (removido do antioxidante em estudo), leva a uma

diminuição da absorbância a 515 nm, permitindo calcular, após o estabelecimento do

equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do radical DPPH.

Na presença de um doador de hidrogênio ou elétron a intensidade de absorção

diminui e a solução com o radical perde cor, tornando-se amarela, de acordo com o número

de elétrons capturados, ou seja, quando o elétron desemparelhado do átomo de nitrogênio

126

no DPPH recebe um átomo de hidrogênio proveniente de compostos antioxidantes, ocorre a

mudança de cor (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012). Quando uma solução de DPPH

é misturada com uma substância que pode doar um átomo de hidrogênio, a forma reduzida

do radical gerado é acompanhada de perda de cor (BERNARDES et al., 2011), conforme

Figura 19.

Figura 19. Reações com DPPH.

Fonte: CHENG et al., 2003.

O radical estável (DPPH•) (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER e BERSET, 1995

apud SILVEIRA, 2008) tem sido amplamente utilizado para avaliar a capacidade de

antioxidantes naturais em sequestrar radicais livres (ROESLER et al., 2007; SILVEIRA,

2008). A atividade do antiradical expressa pelo parâmetro EC50 é definida como a

quantidade do antioxidante necessário para diminuir 50% da concentração do DPPH• inicial

(ALVES; BRITO; RUFINO, 2006 apud SILVEIRA, 2008). Também utilizado para avaliar

a atividade antioxidante de compostos específicos ou de um extrato em curto período de

tempo (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012).

O ensaio do DPPH é um teste rápido e simples, com boa reprodutibilidade dos

resultados, que não envolve condições drásticas de temperatura e oxigenação. Entretanto,

algumas precauções devem ser tomadas quanto à utilização do método e interpretação dos

resultados, dentre eles, o tipo e concentração do composto analisado (composto puro ou

mistura de compostos), cinética de reação do antioxidante, características do meio reacional

(pH, tipo de solvente), presença de interferentes, sinergismo, afinidade solvente-substrato e

maneira de expressar os resultados (BRAND-WILLIAMS, CUVELIER e BERSET, 1995

apud SILVEIRA, 2008; BONDET; BRAND-WILLIAMS e BERSET, 1997; ARNAO,

127

2000; LLESUY et al., 2001; MOLYNEUX, 2004; BERTOLDI, 2006), é considerado um

método prático e com boa estabilidade (SUCUPIRA et al., 2012).

O método DPPH tem sido muito utilizado pela facilidade de execução e baixo custo,

além de obtenção de resultados confiáveis. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido

diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico. A vantagem desse método se dá

pela disponibilidade em se obter comercialmente o radical DPPH, o que evita sua geração

por formas distintas, facilitando seu uso, porém, por ser um método que utiliza metanol

para gerar a reação, seu uso se torna inapropriado para amostras biológicas, devido à

ocorrência de precipitação das proteínas em meio alcoólico (BRAND-WILLIAMS et al.,

1995 apud SILVEIRA, 2008).

1.2.4 Método ORAC (Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio)

O ensaio ORAC foi desenvolvido pelo Dr. Alexander N. Glazer no início da década

de 1990 para a determinação de EROs em sistemas biológicos, através de degradação

térmica de AAPH seguido por uma reação de tranferência de átomos de hidrogênio (HAT)

competitiva entre as amostras antioxidantes (ou padrão Trolox) e os radicais peroxil

gerados com o fluorescente. Fluorescência emite um sinal em tempo real registrado pelo

leitor de placas a um par de comprimento de onda de excitação/emissão de 493/515 nm e

diminui rapidamente, uma vez que sofre uma reação HAT com os radicais peroxil gerados

por nitrogênio (Figura 20).

Figura 20. Reação ORAC.

Fonte: DÁVALOS et al., 2004.

O método Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) é um método que se baseia

na propriedade fluorescente das proteínas B-ficoeritrina (B-PE) e R-ficoeritrina (R-PE),

128

sendo medida a partir do seu decréscimo, como consequência da perda de sua

conformidade ao sofrer dano oxidativo (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012). O

radical peroxil é um oxidante comumente encontrado em substratos biológicos. É menos

reativo que o •OH possuindo um tempo de meia-vida de segundos a nanossegundos

(HALLIWELL et al., 1995 apud ALVES et al., 2010). Estas proteínas são usadas como

indicador fluorescente e foram primeiramente isoladas de Porphyridium cruentum e algas

vermelhas, respectivamente (ALVES et al., 2010).

Neste ensaio a oxidação ocorre pela exposição do flouróforo à presença de radicais.

Com a oxidação, ocorre à diminuição da emissão de fluorescência, a capacidade

antioxidante é então medida com o passar do tempo, sendo que, quando o ensaio é

realizado na presença de algum composto antioxidante, a fluorescência leva um tempo

maior para diminuir. É baseado no ataque de radicais livres, usa-se a peroxila, espécie

reativa de oxigênio biologicamente mais importante, por sua abundância e por ser

responsável pelo dano oxidativo (ANTOLOVICH et al., 2002; PEREIRA, 2009). Como

fonte desses radicais utiliza-se o AAPH, que os gera depois de sofrer decomposição

térmica. Os radicais livres vão degradar a estrutura química da fluoresceína sódica, levando

a perda de sua conformação inicial com o consequente decréscimo da emissão de

fluorescência (OU et al., 2001; PEREIRA, 2009). O antioxidante adicionado reage

rapidamente com os radicais, doando átomos de hidrogênio e inibindo a perda da

intensidade da fluorescência. Essa inibição é proporcional a atividade antioxidante (WU et

al., 2004; PEREIRA, 2009). Permitindo uma medição direta da capacidade antioxidante de

compostos hidrofílicos e lipofílicos versus radicais peroxila (OU et al., 2001).

A reação é medida por espectrofotometria com máxima emissão de fluorescência

em 575 nm (B-PE) e 578 nm (R-PE) (ALVES et al., 2010). Este ensaio avalia a atividade

antioxidante por meio da inibição da oxidação, induzida pelo radical peroxil, por

transferência de átomos de hidrogênio. A atividade antioxidante de uma dada substância é

determinada por meio da diferença entre a área da amostra subtraída pela área do branco,

medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da substância antioxidante no

decorrer do tempo (ALVES et al., 2010).

O teste hidro-ORAC reflete a capacidade antioxidante de compostos com

solubilidade na água, enquanto o teste lipo-ORAC mede a capacidade antioxidante de

compostos com solubilidade em lipídeos. A importância destes dois testes é aditiva. Trolox

129

um tipo de vitamina E solúvel em água é utilizada como parâmetro de calibração, a partir

de concentrações conhecidas de Trolox, uma curva padrão é gerada e a atividade ORAC da

amostra é calculada (CAO et al., 1993; ALVES et al., 2010). Embora o teste não mensure a

capacidade de eliminação dos radicais livres, pode ser uma representação válida e

significativa da capacidade antioxidante (BANK e SCHAUSS, 2004).

O método ORAC possui uma vantagem muito importante com relação aos outros

métodos de determinação da capacidade antioxidante que usam a absorbância, que é o uso

da fluorescência como medida do dano oxidativo, pois, assim, ocorre menor interferência

dos compostos coloridos presentes nas amostras. Fator importante a se considerar quando

se analisam alimentos que possuem cor. Outra vantagem é o uso de radicais peroxila ou

hidroxila como pró-oxidantes, conferindo maior significado biológico em relação aos

métodos que usam oxidantes que não são necessariamente pró-oxidantes fisiológicos

(LIMA, 2008; SUCUPIRA et al., 2012), representando um método sensível e confiável que

quantifica a capacidade de absorção de radicais de oxigênio dos antioxidantes (CAO et al.,

1993; BANK e SCHAUSS, 2004).

Quando se refere a antioxidantes o interesse não é apenas na quantidade de

antioxidantes presentes no alimento, mas também na qualidade do antioxidante. O método

ORAC é um ensaio in vitro que mede a força antioxidante de alimentos e de compostos

químicos. Existe uma tendência mundial de adotar o ORAC como método padrão para a

avaliação da capacidade antioxidante total em alimentos (DUXBURY, 2005 apud

PEREIRA, 2009). Esse método é muito utilizado em indústrias, universidades e controles

de qualidade (DÁVALOS et al., 2004).

2. MATERIAIS E MÉTODOS


Metanol, grau cromatográfico, foi adquirido da Chemco, etanol absoluto p.a. da

Quemis e o carbonato de sódio, persulfato de potássio da Synth. O reagente Folin

Ciocalteau, foi adquirido da Dinâmica® e os reagentes DPPH· (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl), ABTS· (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido sulfônico), Trolox e

os reagentes utilizados no teste de ORAC foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis,

130

USA). Os padrões de ácido gálico monohidratado puríssimo da Vetec. Os equipamentos

utilizados foram espectrofotômetro – DU 640 (Marca – Beackman Coulter), banho-maria

(Marca – Marconi BTC-9090 Digimec), balança analítica (Marca – UHT HR-200 máx

210g) e fluorímetro NovoSTAR - BMG Labtech.

2.2 Preparo do Extrato

Para a extração dos compostos das sementes de alpiste foram utilizados 150 g de

sementes, as quais foram homogeneizadas com 200 mL de água destilada e deixadas em

repouso por 12 horas, desprezou-se essa água e adicionou-se novamente 200 mL de água

destilada, sob trituração de cinco minutos, peneirou-se quatro vezes em peneira comum,

filtrou-se dez vezes em filtro de nylon, em seguida foram realizadas centrifugações

sucessivamente (quatro vezes a 4000 rpm/4 minutos, uma vez a 5000 rpm/5 minutos, uma

vez a 5000 rpm/10 minutos), sendo recolhido o sobrenadante por meio de filtração a vácuo

com papel de filtro. Ao extrato, houve acréscimo de água realizando três diluições e

novamente filtração à vácuo com papel 0,45 µm, 47 mm (membrana de esteres de celulose

branca). E por fim uma última filtração de todo o conteúdo com filtro milex de 0,22 µm

com auxílio de seringa. Os extratos obtidos foram utilizados para determinação de TPC e

das atividades antioxidantes.

2.3 Determinação de Compostos Fenólicos Totais

O método de Folin-Ciocalteu foi usado para medir o teor de fenólicos totais com

espectrofotômetro DU 640 (Marca – Beackman Coulter).

Para a reação colorimétrica, a alíquota de 500 µL de amostra (amostra do extrato

filtrada) diluída em água destilada, foi adicionado 2,5 mL de solução aquosa do reativo de

Folin-Ciocalteau. Após homogeneização procedeu-se repouso de 5 minutos no escuro. Em

seguida foram adicionados 2,0 mL de solução de carbonato de sódio 7,5%. A solução

permaneceu por 2 horas em repouso ao abrigo da luz, à temperatura ambiente.

A solução “branco” foi preparada nas mesmas condiçoes do extrato, substituindo-se

o volume de extrato fenólico pelo volume dos solventes contidos no extrato fenólico. As

leituras das absorbâncias foram realizadas no comprimento de onda de 760 nm em

espectrofotômetro.

131

Os resultados foram calculados e comparados com base na curva-padrão de

calibração de ácido gálico em concentrações variando de 10 a 100 µg/mL. O total de

fenólicos foram determinados como equivalentes de ácido gálico (GAE). A determinação

foi realizada em triplicata.

2.4 ABTS

A determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS•+ foi realizada de

acordo com o método descrito por Re et al., (1999).

O ensaio com o radical livre ABTS, foi obtido pela reação de 5 mL de ABTS (7

Mm) com 88 µL de persulfato de potássio (2,45 µM, concentração final). O sistema foi

mantido em repouso, a temperatura ambiente (±25ºC), durante 16 horas em ausência de luz.

Uma vez formado o radical ABTS•+, o mesmo foi diluído com água destilada até obtenção

de absorbância de 0,7000 ± 0,02 à 734 nm. A amostra foi preparada em água destilada e

posteriormente, foram diluídas em diferentes concentrações. A leitura da absorbância

ocorreu com a mistura da reação contendo 750 µL de amostra e 3750 µL de solução ABTS,

contra o branco, realizada exatamente após 6 minutos, a partir da mistura do radical com o

extrato em um comprimento de onda de 734 nm.

O branco da reação foi preparado conforme o procedimento descrito acima, sem

adição da amostra, onde a água é utilizada para corrigir a linha de base. O percentual do

decréscimo na absorbância foi medido pela concentração e a capacidade de capturar o

ABTS•+ foi calculado com base no decréscimo da absorbância observada.

A curva gerada a partir dos valores das absorbâncias e das concentrações das

amostras foi calculada (RUFINO et al., 2006). A porcentagem de desativação do radical

ABTS foi calculada de acordo com a fórmula:

% de inibição = (Abs controle – Abs amostra) / Abs controle

2.5 DPPH

A atividade antioxidante do extrato aquoso de alpiste foi avaliada pelo ensaio DPPH

segundo Roesler et al., (2007).

Misturou-se 200 µL de amostra com 1000 µL de solução DPPH, após 30 minutos de

incubação, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, realizou-se a medida de absorbância

132

da amostra e da curva. O mesmo procedimento foi adotado para a curva padrão de Trolox.

O branco da reação foi preparado conforme procedimento descrito acima, sem adição da

amostra. O solvente extrator é utilizado para corrigir a linha de base. O percentual do

decréscimo na absorbância é medido pela concentração e a capacidade de sequestrar

radicais livres e é calculado com base no decréscimo da absorbância observada. A leitura

da absorbância foi feita a 517 nm em espectrofotômetro.

Todas as leituras foram feitas em triplicata e acompanhadas de um controle (sem o

antioxidante). A queda na leitura da densidade ótica das amostras foi correlacionada com o

controle, estabelecendo-se a porcentagem de descoloração do radical DPPH. A

porcentagem de descoloração do radical DPPH foi calculada de acordo com a Equação 1:

Equação 1. % de inibição = (Abs controle – Abs amostra) / Abs controle

2.6 ORAC

O ensaio foi realizado de acordo com o método proposto por Dávalos et al., (2004).

Todos os reagentes e diluições das frações hidrofílicas e lipofílicas das amostras

foram preparados diariamente.

As reações ocorreram em microplacas de poliestireno, específicas para reações de

fluorescência, contendo 96 compartimentos. Para cada leitura foi preparada uma curva

padrão de Trolox específica para a avaliação da fração hidrofílica e/ou lipofílica, seguida de

diluições apropriadas. Todas as leituras foram realizadas em leitor de microplacas

NOVOstar (BMG Labtech ®, Offenburg, Germany), acompanhado com o software de

análise de dados MARS Data Analysis versão 1.3 (BMG Labtech ®, Offenburg, Germany).

2.6.1 Fração Hidrofílica

Foram preparadas diluiçoes estoque denominadas “mãe” de cada amostra na

concentração de 10 mg/mL (p/v) com tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4. As

soluçoes “mães” foram misturadas em agitador vórtex por 30 segundos, seguido de

ultrassonicação a 10ºC durante 30 minutos.

O padrão Trolox 1500 µM foi diluído em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4

em diferentes concentrações, para a confecção da curva padrão do ensaio.

A solução de fluoresceína foi preparada em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH

133

7,4, na concentração de 0,00378 mg/mL e mantida ao abrigo da luz até o momento de uso.

O AAPH [2,2’-azobis(2’-metilproprionamidine) dihidrocloreto] foi ressuspendido

em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4, momentos antes do início da leitura da

microplaca.

O sistema de reação em cada poço da microplca continha: 20 µL de amostra, 120

µL de solução de fluoresceína e 60 µL de AAPH a uma temperatura constante de 37ºC,

durante 80 minutos. A intensidade de fluorescência (485 nmEx/520 nmEm) foi verificada a

cada ciclo de 60 segundos, durante 80 ciclos em leitor de microplacas. O mesmo

procedimento foi adotado para os padrões de referência. O branco da reação foi preparado

conforme procedimento descrito acima, sem adição de amostra.

2.6.2 Fração Lipofílica

A amostra foi preparada na concentração de 10 mg/mL (p/v) com solução de

ciclodextrina metilada randomizada a 7% (RMCD) em solução acetona: água (1:1). Estas

soluçoes denominadas “mães” foram misturadas em agitador vórtex por 30 segundos,

seguido de ultrassonicação a 10ºC durante 30 minutos. O padrão Trolox 1500 µM foi

diluído em solução de RMCD 7% em diferentes concentrações, para confecção da curva

padrão do ensaio.

As soluções de fluoresceína e AAPH foram preparadas do mesmo modo que no

ensaio hidrofílico e mantidas ao abrigo da luz até o momento de uso.

O sistema de reação em cada poço da microplaca foi composto de: 20 µL de

amostra, 120 µL de solução de fluoresceína e 120 µL de AAPH, agitou-se suavemente a

placa sob a superfície de uma bancada, para a mistura dos compostos e monitorada a uma

temperatura constante de 37ºC, durante 80 minutos. A intensidade de fluoresceína (485

nmEx/520 nmEm) foi verificada a cada ciclo de 60 segundos, durante 80 ciclos em leitor de

microplacas. O mesmo procedimento foi adotado para os padrões de referência e o branco

da reação foi preparado conforme o procedimento descrito acima, com tampão no lugar da

amostra.

O cálculo da curva de decaimento da fluorescência ou AUC foi realizado com o

auxílio da seguinte fórmula:

AUC = 1+fi/f0+... fi/ f0 + ...f80/f0

134

Onde, o f0 é representado pela fluorescência obtida no tempo 0 e fi a fluorescência

obtida nos tempos intermediários entre 0 e 80 minutos.

As leituras foram realizadas em triplicata e os valores expressos em µmolar

equivalente de Trolox/g de amostra, utilizando-se a curva padrão, realizada em cada ensaio.

A área da perda de fluorescência de uma amostra foi calculada subtraindo a área

correspondente à do controle (branco).


Além de considerar as características nutricionais do alpiste, é também importante

avaliar os antioxidantes e componentes bioativos presentes no mesmo com potencial

benéfico à saúde humana. Li et al., (2011); Li, (2012) relata, conteúdo de fenólicos totais

(TPC) entre 174-209 mg/kg, estando os ácidos fenólicos do alpiste em concentrações

relativamente elevadas, em particular na fração ligada insolúvel. Estes compostos são

conhecidos por proteger as plantas contra predadores e por fornecer propriedades de

prevenção de doenças, devido as suas propriedades antioxidantes. Semelhante a outros

grãos de cereais, os ácidos fenólicos estão concentrados principalmente na fração do farelo

do alpiste.

Evidências epidemiológicas reforçam que os antioxidantes presentes na dieta podem

desempenhar papel importante na prevenção de diversas doenças crônicas, como doenças

cardiovasculares, câncer e diabetes (WILLCOX; ASH e CATIGNANI, 2004 apud LI,

2012).

3.1 Teor de Fenólicos Totais

Para os resultados do teor de fenólicos totais, uma curva padrão de ácido gálico foi

constrúida, conforme mostra a Figura 21. Todas as determinações foram realizadas em

triplicata e os resultados obtidos nos experimentos foram analisados estatisticamente com

média, desvio padrão e coeficiente de variação.

O conteúdo total de fenólicos calculado para quantidade de sementes de alpiste

utilizada foi de 280,15 µgEAG/g ou 28,02 mg EAG/100g amostra.

135

Figura 21. Curva padrão de ácido gálico para quantificação de compostos fenólicos totais.

Os valores obtidos de TPC para o extrato aquoso de sementes de alpiste, assim

como os valores de desvio padrão relativo, que mostra a dispersão entre os resultados das

replicatas das análises está demonstrado na Tabela 3.

Tabela 3. Resultados obtidos do conteúdo de fenólicos totais.

Fenólicos Totais

( µg EAG/g)Média DP CV

Fenólicos Totais

(mg/100g)Média DP CV

270,54 27,05

283,01 28,30

286,91 28,69

3,05280,15 8,55 3,05 28,02 0,85

Valores elevados de TPC implicam em elevada capacidade antioxidante in vitro. Os

compostos fenólicos em grãos incluem derivados dos ácidos benzóico e cinâmico,

antocianidinas, quininas, flavonóides, flavonas, flavanonas (MADHUJITH & SHAHIDI,

2006; LI, 2011), que são os principais contribuintes para a capacidade antioxidante total in

vitro. Variações em TPC são evidentes para diferentes tipos de grãos por causa de suas

variações naturais nos tipos e níveis de compostos fenólicos (LI, 2011).

O TPC é afetada pela variedade, localização de crescimento e uso mínimo de

fertilizantes (DVORAKOVA, et al., 2008; LI, 2011) e por solventes utilizados na extração

(ZHOU & YU, 2004; LI, 2011). Algumas amostras de alpiste mostraram TPC elevado,

136

expresso como equivalente de ácido ferúlico, variando de 174-209 mg/100g para o integral,

360-450 mg/100g para o farelo e 124-138 mg/100g para a farinha. A remoção do farelo na

produção da farinha, resultou em TPC significativamente menor do que aquele encontrado

em amostras integrais. Assim, o TPC de alpiste diminui na ordem: Farelo> integrais>

farinha. Semelhante a outros relatórios sobre grãos de cereais, compostos fenólicos foram

mais abundantes no farelo (camada externa do grão) do que no endosperma dos grãos

(BETA et al., 2005 apud LI et al., 2011).

Takagi e Iida (1980); Li (2011), também relataram que o antioxidante lipossolúvel,

o qual consiste de esterol e triterpeno, ésteres de álcool de ácido caféico, foi encontrado em

alpiste e o extrato etéreo de alpiste mostraram uma maior atividade antioxidante do que as

sementes de cânhamo, painço italiano e milho comum.

A diferença observada em relação ao TPC das amostras e as encontradas nas

literaturas acima mencionadas, pode ser devido: a época de colheita (safra), bem como a

variação existente tanto entre os lotes (para algumas das espécies) como entre as

localidades de cultivo, estágio de crescimento da planta, dentre outros vários fatores

metabólicos de cada planta envolvida e principalmente como as amostras foram

processadas antes da extração dos fenólicos (solventes, retirada de cascas, etc) (BARROSO

et al., 2014), quantidade de grão para o volume de água utilizada, temperatura da água,

entre outros (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). É importante destacar que as análises no

presente estudo, foram realizadas com o extrato aquoso de alpiste, o qual passou por

diversas filtragens e centrifugações, além de ter sido desprezado a água de molho durante o

preparo, fato este que pode ter contruido com os valores inferiores encontrados.

Embora o interesse em estudar os compostos fenólicos e os fitatos nos alimentos

tenha sido estimulado em virtude de seu efeito antinutricional, capaz de complexar

proteínas (KUMAR et al., 2010; SILVA et al., 2011) e quelar minerais (FREDLUND et al.,

2006; SILVA et al., 2011), esses compostos têm recebido atenção especial principalmente

por suas propriedades funcionais (NORAZALINA et al., 2010 apud SILVA et al., 2011;

KIM et al., 2010), tais como efeito hipocolesterolêmico e antioxidante (MORO et al.,

2004).

De acordo com Abdel-Aal; Hucl (2005) apud Abdel-Aal et al., (2010) o alpiste

também contêm fitoquímicos, incluindo fitatos, fenóis, taninos e inibidores de enzima.

Contudo neste trabalho, é possível que esses fitatos foram removidos na água do molho.

137

Comparando com o sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) um cereal da mesma

família do alpiste, Poaceae (U.S. GRAINS COUNCIL, 2004 apud MARTINO, 2014).

Dicko et al., (2002); Silva et al., (2011), ao avaliar o teor de fenólicos solúveis totais em 50

variedades de sorgo, encontraram valor médio de 0,6 mg/g de EAG. De forma geral, no

pericarpo do sorgo (revestimento externo) e na testa encontram-se os compostos fenólicos

(3-deoxiantocianidinas, taninos condensados, ácidos fenólicos, entre outros) e ainda os

carotenóides (FOOD SECURITY DEPARTMENT, 1999; WANISKA; ROONEY, 2000;

EARP et al., 2004; SLAVIN, 2004 apud MARTINO, 2014). Os resultados de estudos

científicos demonstram que compostos isolados do sorgo, principalmente os fenólicos,

modulam parâmetros relacionados às doenças crônicas não transmissíveis como a

obesidade, o diabetes, as dislipidemias, as doenças cardiovasculares, o câncer e a

hipertensão (MURIU et al., 2002; KAMATH et al., 2007; SHIH et al., 2007a; SHIH et al.,

2007b; FARRAR et al., 2008; AWIKA et al., 2009; YANG et al., 2009; KIM; PARK,

2012; MORAES et al., 2012; WOO et al., 2012; MARTINO, 2014). Relatos que

demonstram que a quantidade de fenólicos está mais concentrada nas frações externas dos

grãos, sendo que no extrato aquoso de alpiste na sua preparação, toda fração externa foi

removida, o que de certa forma foi constatado no ensaio biológico do diabetes não tendo

ação esperada, inclusive nas consequências da evolução da doença.

Segundo Dlamini et al., (2009) e Martino, (2014) os resultados demonstraram que a

presença de taninos nos grãos aumentou significativamente a AA, contrariamente ao

processo de descorticação. Desta forma, a utilização do sorgo descorticado reduz a AA do

cereal e os benefícios que seriam vinculados ao uso do grão integral. Também é relatado

por Farrar et al., (2008) e Martino, (2014) a redução das concentrações dos compostos

fenólicos por lixiviação da água do molho removida. De acordo com as citações acima, os

resultados obtidos do sorgo assemelham-se com os resultados deste trabalho em relação a

atividade antioxidante reduzida do extrato aquoso de alpiste.

Na análise de sorgo comparando os diferentes grãos, notou-se o conteúdo médio de

fenólicos solúveis totais mais elevado nos grãos vermelhos com 1,39 mg/g de EAG, em

comparação aos brancos com 0,40 mg/g de EAG (DICKO et al., 2002). De fato, Tian et al.,

(2004) observaram que a cor do arroz está relacionada ao conteúdo de compostos fenólicos

solúveis totais, e grãos com coloração mais escura apresentam teor consideravelmente mais

elevado desses compostos. Em arroz (Oryza sativa L.), os maiores teores de fenólicos

138

solúveis totais são encontrados nos grãos com pericarpo preto e vermelho, em detrimento

do marrom-claro. De acordo com Walter (2009), essas variações podem ser atribuídas,

principalmente, à cor dos grãos.

O extrato de arroz polido cru apresentou a menor média de compostos fenólicos de

31,73 mg EAG/100g, em comparação ao integral marrom-claro de 278,54 mg EAG/100g,

preto de 427,51 mg EAG/100g e vermelho de 546,95 mg EAG/100g (GOFFMAN &

BERGMAN, 2004). O extrato aquoso de arroz vermelho cru apresentou 17 vezes mais

compostos fenólicos em comparação ao extrato aquoso de arroz branco polido, e o extrato

aquoso de arroz preto cru apresentou aproximadamente 14 vezes mais compostos fenólicos

em relação ao de arroz branco polido cru (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). A literatura

relata uma grande variação nos teores desses compostos em grãos de arroz. Alguns autores

identificaram que nos grãos de pericarpo vermelho as concentrações de polifenois variaram

de 34 a 424 mg EAG/100g (GOFFMAN; BERGMAN, 2004), de 478,72 a 972,99 mg

EAG/100g (WALTER et al., 2013) e de 69,6 a 74,80 mg EAG/100g (SHAO et al., 2014a;

SHAO et al., 2014b), o que sugere uma grande variação dentro de um mesmo grupo.

Goffman & Bergman (2004); Walter (2009), avaliando diferentes genótipos de arroz,

obtiveram conteúdo de fenólicos totais entre 1,90 e 50,32mg EAG/g farelo, e entre 0,25 e

5,35mg EAG/g grão, observando os menores valores para aqueles genótipos com pericarpo

marrom-claro.

Analisando antioxidantes em grão de trigo, encontraram teor médio de fenólicos

totais de 53,1±2,8 mg EAG/100 g de trigo (CRUZ et al., 2011; CÓRDOVA et al., 2012).

Em linhaça (Linum usitatissimum L.), Kähkönen et al., (1999); Silva et al., (2011)

relataram teor de fenólicos solúveis totais de 0,80 mg/g de EAG. Velioglu et al., (1998) e

Bozan & Temelli (2008) apud Barroso et al., (2014) analisaram fenóis totais em sementes

de linhaça e reportaram, respectivamente, 509 e 1670 mg de EAG/100g na semente.

Segundo Dykes e Rooney (2007) o conteúdo de compostos fenólicos na aveia é 472

µg/g e no sorgo 385-746 µg/g.

De acordo com Brindzová et al., (2008) a quantidades de compostos fenólicos totais

em aveia utilizados foram semelhantes aos cinco cultivares de aveia de 238 a 278 mg

GAE/g testadas por Emmons e Peterson (1999).

Queiroz et al., (2009) relataram que compostos fenólicos totais do grão do amaranto

foi de 31,7 mg EAG/g.

139

Semente de chia de duas regiões diferentes em México apresentaram valores entre

0,88 e 0,92 mg GAE/g, que é similar ao encontrado para as amostras do Chile de 0,94 mg

GAE/g (MARINELI et al., 2014). De acordo com Picinin (2014) o teor de compostos

fenólicos, nos grãos de chia, foi de 488,8 mg/100g.

O gergelim preto apresentou teor de compostos fenólicos solúveis totais de

261,9±7,5 mg EAG/100g de farinha, aproximadamente duas vezes superior ao do gergelim

creme de 147,5±31,7 mg/100g de EAG. O teor de fitatos do gergelim creme foi duas vezes

inferior ao do gergelim preto. Os grãos de gergelim analisados apresentaram teores de

compostos fenólicos solúveis totais maiores do que os descritos para alguns grãos (SILVA

et al., 2011).

Segundo Bezerra (2012) cultivares de cevada do Rio Grande do Sul demonstrou

conteúdo de compostos fenólicos totais no extrato aquoso de cevada 0,71 – 1,67 mg

EAG/g.

Os valores obtidos para o conteúdo de fenólicos totais para semente jenipapo

192mg/100g em extrato aquoso da amostra seca do fruto (PORTO et al., 2014).

De acordo com Silva et al., (2014) a noz apresenta maior conteúdo de fenólicos

totais em 1759,8 mg/100g seguida pela castanha-do-pará 428,2 mg/100g, amendoim 477,6

mg/100g, amêndoa de baru 301,8 mg/100g e castanha-de-caju 306,9 mg/100g.

O teor de compostos fenólicos no chá de hibisco foi de 672,97 mg EAG/100g de

chá. Oh et al., (2013) trabalhando com diferentes tipos de chás em infusão encontraram um

total de fenólicos de 82,21 mg EAG/100g para infusão de chá verde (NUNES et al., 2014).

De acordo com Sales (2011), teores de compostos fenólicos (em equivalente de

ácido gálico) de extratos aquosos da ração suplementada com aveia, linhaça, gergelim,

semente de girassol e jatobá, foi de 28,8 mg/100g de amostra úmida.

Nestas comparações pode-se ressaltar que o extrato aquoso de sementes de alpiste,

“leite de alpiste”, possue menor quantidade de compostos fenólicos totais em relação ao

sorgo, trigo, linhaça, aveia, amaranto, chia, gergelim, cevada, jenipapo, noz, castanha-do-

pará, amendoim, amêndoa de baru, castanha-de-caju, chá de hibisco e verde. Relacionando

com o extrato aquoso de arroz polido cru, aveia, algumas variedades de sorgo o teor de

TPC fica bem próximo em determinados genótipos. E valores encontrados na literatura na

variação de genótipos de grão de arroz, extratos aquosos da ração suplementada com aveia,

140

linhaça, gergelim, semente de girassol e jatobá comparando com o extrato do alpiste, este

se apresenta superior ou igual respectivamente.

A variação dos compostos fenólicos existentes faz com que diversas amostras em

metodologias diversificadas tenham diferentes habilidades em sequestrar radicais.

3.2 ABTS

Para a determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS, foi realizado

uma curva em escala linear para o extrato, com seis pontos distintos e lineares, com r² >

0,99. Os resultados obtidos e a curva estão apresentados abaixo, Figura 22 e Tabela 4.

Figura 22. Curva padrão de trolox % Desativação ABTS em 6 minutos.

Tabela 4. Resultados do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical

ABTS•.

µg eq trolox/g Média DP CV

226,76

228,78

231,25

228,93 2,25 0,98

141

3.3 DPPH

Para a determinação de inibição do DPPH•, é muito importante que seja realizado

uma curva em escala linear para o extrato. Portanto, foi realizada uma curva com doze

pontos distintos, onde a concentração variou e obteve-se um r² > 0,97, com intuito de

avaliar a linearidade de cada ponto da curva. Os resultados obtidos nas análises de atividade

antioxidante DPPH e a curva estão apresentados abaixo, Figura 23 e Tabela 5.

Figura 23. Curva padrão de trolox para quatificação da atividade antioxidante por DPPH (% de Desativação).

Tabela 5. Habilidade do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical

DPPH•.

µg eq trolox/g Média DP CV

112,62

106,64

99,26

106,17 6,69 6,30

3.4 ORAC

Os ensaios antioxidantes para determinação da atividade antioxidante do extrato

aquoso de sementes de alpiste pelo método ORAC, determinou o potencial hidrofílico e

lipofílico da amostra em questão. A análise foi feita em triplicata e repetida em três dias

diferentes.

142

Nas Figuras abaixo 24 e 25 estão as curvas de Trolox Hidrofílico e Lipofílico. E as

Tabelas 6 e 7 resultados das análises e padrões de referências utilizados.

Figura 24. Curva Trolox Hidrofilico - tampão fosfato de potássio 75mM pH 7.4.

Figura 25. Curva Trolox Lipofílico - RMCD 7%.

Tabela 6. Resultados ORAC.

ORAC Hidro ORAC Lipo ORAC Total

1177,37 ± 5,32 147,79 ± 0,48 1325,16

µMTE*/g (± desvio padrão)

* µmolar de trolox equivalente.

143

Tabela 7. Resultados do potencial antioxidante de padrões de referência.

Compostos µmol TE*/mol de padrão

Ácido cafeico 95,52 ± 2,34

Acido ferrúlico 107,89 ± 2,08

Acido P -coumarico 110,30 ± 5,43

Apigenina 89,25 ± 5,68

* µmolar de trolox equivalente

Nas análises antioxidantes pode-se perceber valores superiores no método ABTS em

relação ao DPPH, o que é esperado, pois a metodologia do ABTS, medi a atividade de

compostos de natureza hidrofílica e lipofílica, enquanto que o DPPH só pode ser dissolvido

em meio orgânico, portanto medindo as frações lipofílicas.

Até o momento das consultas em bancos de dados conhecidos, foram poucos os

trabalhos científicos relacionados a semente estudada neste trabalho o que dificultou a

comparação com a literatura. Não há muitos estudos sobre o potencial antioxidante, das

sementes de alpiste na forma de extrato aquoso, chamado popularmente como “leite de

alpiste”, a literatura apenas aborda a identificação dos principais ácidos fenólicos e

comparação de fenólicos totais das diversas variedades de sementes, não existindo até o

prezado momento dados científicos do que normalmente se consome, podendo apresentar

resultados discrepantes aos analisados na presente pesquisa.

Alguns autores avaliando outros alimentos através da técnica de ABTS encontraram

as concentrações variando entre o arroz branco de 0,012 a 0,413 mM de TEAC, enquanto

que entre o arroz vermelho, variando de 0,291 a 2,963 mM TEAC e o arroz preto teve a

capacidade antioxidante da média TEAC 4,484 mM, em torno de três de vezes que o de

arroz vermelho (SHEN et al., 2009). Goffman & Bergman (2004); Walter (2009),

avaliando genótipos com diferente cor de pericarpo, observaram valores de atividade

antioxidante entre 10,0 e 13,1µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo marrom-claro,

entre 119,9 e 312,3µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo vermelho e entre 56,3 e

345,3µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo preto. Estudos de Massaretto (2013),

envolvendo arroz preto, vermelho e selvagem crus mostraram valores para DPPH de 2,2;

1,7 e 0,9 mmol TE/100g e para ORAC de 19,1; 8 e 6,8 mmol TE/100g.

Assim como na concentração de compostos fenólicos solúveis totais, também foi

observada diferença na atividade antioxidante usando a técnica ABTS em grãos com a

144

mesma cor do pericarpo, variando de 37,19 a 68,83 mmol TE/g naqueles com pericarpo

vermelho, demonstrando variabilidade nessa característica dentro do grupo (WALTER,

2009). Atividade antioxidante de grãos de arroz integral 4,70 ± 0,38 a 66,58 ± 1,35 mmol

de TE (WALTER, 2009).

Segundo Cunha (2014) extratos metanólicos de semente de trigo apresentaram de

86,42 a 425,6 mg Trolox/g no teste ABTS e 15,33 a 112,3 mg Trolox/g em DPPH, após 10

dias de germinação.

Honermeier (2011) avaliou a capacidade antioxidante da farinha de trigo integral

pelo teste ORAC e observou atividade de 15,1 a 25,2 mmol TE/g, que foi menor do que na

maioria das outras investigações de trigo relatadas na literatura. Por exemplo, ORAC

valores de cultivares de trigo mole investigados pela MOORE et al., (2005);

HONERMEIER (2011) variou 32,9-47,7 TE µmol/g. Cultivares de trigo mole foram

analisados por ZHOU et al., (2004) variou entre 15,5 e 24,5 µmol TE/g.

Extratos metanólicos de semente de cevada variou de 181,5 a 363,5 mg Trolox/g em

ABTS e 54,71 a 83,38 mg Trolox/g no DPPH em 10 dias de germinação (CUNHA, 2014).

Atividade antioxidante de cultivares de cevada do Rio Grande do Sul pelo método DPPH

apresentaram atividade de 86,62 a 96,47% (BEZERRA, 2012).

Os valores de ORAC determinados para grãos de cevada exibiram valores variando

entre 2034 à 3829 μmol TE/g (ROSA, 2007).

Barroso et al., (2014) determinou a capacidade antioxidante total mmol TEAC/kg

para linhaça marrom e dourada respectivamente, encontrando na fração hidrofílica de 3,76

e 3,41 e na fração lipofílica 5,15 e 3,54. No ensaio de DPPH a amostra de linhaça

apresentou valor de IC50 de 0,226 mg/ml (PILAR, 2014).

Comparativamente, as amostras de amaranto mostraram 2133,16 μmoles TE/g,

seguido de 1800,71 μmoles TE/g, 751,49 μmoles TE/g e 342,25 μmoles TE/g (CARLOS et

al., 2013).

Na aveia segundo os testes de DPPH 3,5 mg Trolox/g e 17,8 mg de Trolox/g e

ABTS 0,83 a 3,5 mg Trolox/g em um peso seco (BRINDZOVÁ et al., 2008).

Os valores ORAC de sete comumente consumidos, variedades de aveia

geneticamente independentes, são relatados resultados variando de 11 µmol TE/g a 28

µmol TE/g (CHU et al., 2013).

145

Atividade antioxidante do sorgo pela técnica de ABTS apresentou atividade de 427

µmol TE/g, e atividade antioxidante por DPPH de 305 µmol TE/g (DLAMINI et al., 2007).

De acordo do Dykes e Rooney (2006) a atividade do grão do sorgo por meio da técnica

ORAC variou entre 868 – 3124 µmol TE/g de sorgo com taninos; 219-1008 µmol TE/g de

grão de sorgo preto; 140-710 µmol TE/g de grão de sorgo vermelho e 22-64 µmol TE/g de

grão de sorgo branco. Em geral, os sorgos pigmentados tiveram valores de ORAC de 140-

870 mg TE/g nos grãos e 710-3100 mg TE/g nos farelos (MOYER et al., 2002; AWIKA et

al., 2003).

Dicko et al., (2002); Silva et al., (2011) relataram que os extratos metanólicos

obtidos do gergelim creme e preto apresentaram 27,45 e 52,98 respectivamente de

capacidade de eliminar o radical DPPH.

Segundo Othman et al., (2015) valores de ORAC hidro de sementes de gergelim

branco e dourado foram 34.720 e 21.700 mols TE/100g. Os resultados mostraram que o

extrato bruto polar de sementes de gergelim tinha um valor mais alto que o encontrado para

sementes de soja (5409 mmol TE/100g) e para de farelo de arroz (8817 µmol TE/100g).

Ishiyama et al., (2006) relataram valores de ORAC para extrato metanólico de duas

variedades de sementes de gergelim do Japão de 658,3 e 827 mg TE/100g.

O potencial do grão de chia em sequestrar radicais livres foi expresso como

concentração final do extrato, necessária para inibir a oxidação do radical DPPH em 50%

(EC50), com resultados de 0,75 a 0,94 mg/mL (PICININ, 2014).

Dados relatados por Marineli et al., (2014) para sementes de chia foram de TEAC

523,78 mmol TE/g, DPPH 436,61 mmol TE/g, ORAC hidro 517,30 mmol TE/g, ORAC

lipo 6,48 mmol TE/g. As amostras também apresentaram maior atividade antioxidante em

relação ao encontrado em farinha de trigo, cevada e sorgo (cereais integrais) (8,3, 14,9 e

51,7 TEAC, mmol/g) e foram semelhantes ao do farelo de sorgo com alto teor de tanino

(512,0 TEAC, mmol/g) (MARINELI et al., 2014).

A noz também apresenta maior capacidade antioxidante comparado com o extrato

de alpiste (290,6 ± 0,60 µmol TE/100g) seguida pelas demais nozes e sementes

comestíveis, que apresentaram capacidade antioxidante semelhante entre si, tais como:

castanha-do-pará 69,1 µmol TE/ 100g; castanha-de-caju 63,6 µmol TE/ 100g; amêndoa de

baru 65,1 µmol TE/ 100g e amendoim 62,7 µmol TE/ 100g (SILVA et al., 2014).

146

Dados relacionados a erva-mate na atividade antioxidante hidrofílica variou de

0,1336 a 0,5583 mM TE, variando meses (épocas de ano) e regiões do sul do Brasil,

atividade antioxidante pelo método DPPH 4,0221 a 11,1393 mM TE (CANTERLE, 2005).

Para elaboração do extrato do fruto noni, acetona 80% foi utilizado como solvente,

por apresentar um melhor poder de extração. Os resultados da atividade antioxidante foram

507,27 μmol TEAC/100g pelo método ABTS, 367,54 μmol TEAC/100g pelo método

DPPH no fruto in natura e 7593,04 μmol TEAC/100g pelo método ABTS, 5184,51 μmol

TEAC/100g pelo método DPPH no fruto do noni pré-seco (SILVA et al., 2014).

A atividade antioxidante da semente de jenipapo expressa em EC50, quantidade de

antioxidante necessária para reduzir a 50% a concentração inicial de DPPH, são 5747,12

μg/mL do extrato ou mg/100g de semente (PORTO et al.,2014).

De acordo Pugliese (2010) a atividade ORAC na semente de cacau é de 1087 ± 56

µmoles TE/g de amostra.

Conforme Cazarin et al., (2014) a casca de maracujá apresenta pelo teste do ORAC

hidrofílico 40,83 ± 1,75 μmol TE/ g de amostra.

Avaliando 40 cultivares de mirtilo, Wang; Chen e Ehlenfeldt (2011) encontraram

valores ORAC que variaram de 196 a 528 µmol TE/g em base seca. Já em goiabas foi de

86,97 µmol TE/g (PATTHAMAKANOKPORN et al., 2008). Em outro estudo, Wu et al.,

(2004) encontraram para manga 54,75 µmol TE/g, uva 64,28 µmol TE/g, cereja 169,75

µmol TE/g, maçãs entre 164 a 294 µmol TE/g e morango 401,91 µmol TE/g.

Estudo realizado com extratos com água e acetona de sementes de uva (V. vinífera)

demonstrou que a atividade antioxidante determinada por ORAC, variou no intervalo de

1425,9 a 3009,2 µmolTE/g. Avaliou a atividade antioxidante por ORAC das sementes de

romã (P. granatum) obtendo valores de 12.202,06 µmolTE/g (SCHAUSS et al., 2006;

BOZAN et al., 2008; MÜLLER et al., 2010). Segundo Xia et al., (2010) vinho de uva

apresenta 10.724 µmol/L.

Dados da literatura demonstraram que extratos aquosos de erva-mate, menta e chá

verde avaliados pela metodologia ORAC, apresentaram atividade antioxidante de 5092,

1409 e 4704 µmolTE/g, respectivamente (DUDONNÉ et al., 2009; KRATCHANOVA et

al., 2010; MACEDO et al., 2011).

Hudnall, 2007, demonstrou que um extrato de própolis preparado com água e

acetona apresentou atividade antioxidante, determinada por ORAC, de 2459 µmolTE/g.

147

Fazendo um comparativo global, apesar de algumas unidades e os solventes

extratores não serem correspondentes, pode-se afirmar que a atividade antioxidante do

extrato aquoso de sementes de alpiste é inferior ao trigo, cevada, linhaça, aveia, sorgo,

gergelim, jenipapo, cacau, uva, romã, erva-mate, menta, chá verde e própolis, ficando

acima apenas da casca de maracujá, mirtilo, manga, cereja, maçã e morango. Muito

próximo de alguns genótipos de arroz integral marrom-claro e da aveia, provavelmente

devido a similaridade entre as amostras.

Segundo Awika et al., (2003) valores de ORAC geralmente são 3 a 4 vezes mais

elevados do que o ABTS ou valores DPPH.

O método ORAC é considerado preferencial devido a sua relevância biológica

através da eficácia in vivo, contudo apesar dos resultados superiores aos métodos ABTS e

DPPH, a comparação com outros alimentos demonstrou baixos resultados do extrato

aquoso de sementes de alpiste.

Diferentes métodos são descritos na literatura científica para a extração de

compostos fenólicos solúveis totais em alimentos de origem vegetal. O metanol, etanol e

acetona são os solventes mais utilizados na obtenção dessas substâncias (JU; HOWARD,

2003 apud GOFFMAN & BERGMAN, 2004). Porém, poucos autores relatam a utilização

somente de água como solvente no isolamento dos compostos fenólicos solúveis totais de

diversas matrizes alimentares (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). Para a determinação da

capacidade antioxidante o tipo de solvente e a polaridade podem afetar a transferência de

elétrons e de átomos de hidrogênio. A presença de compostos não antioxidantes nas

soluções testadas também pode afetar os resultados (PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-

CALIXTO, 2006). O rendimento da extração depende tanto do solvente utilizado (OU;

HAMPSCH-WOODILL; PRIOR, 2001; GRAY et al., 2002; YU et al., 2002; SUN; HO,

2005; YILMAZ; TOLEDO, 2006) como do método aplicado, que pode ser baseado em

mecanismos químicos diferentes. Além do rendimento, há grande variação na composição

do extrato em função do sistema solvente utilizado (MOURE et al., 2001). Segundo os

resultados de Goffman & Bergman (2004) observa-se que o extrato metanólico de grão de

arroz preto foi capaz de extrair um valor médio 1,7 vezes maior em relação ao extrato

aquoso. Esses dados sugerem uma maior solubilidade dos compostos fenólicos totais de

grãos de arroz preto em meio hidrofóbico.

148

Em algumas pesquisas pode se notar que quando utilizados outros solventes como

metanol, etanol ou acetona a atividade antioxidante pode se apresentar mais elevada, neste

experimento o solvente de extração utilizado foi a água, solvente usado no uso popular e

todos os ensaios deste projeto teve essa alegação principal, o que de certa forma resultou

em números inferiores. Extrações com outros solventes poderia melhorar as características

e a biodisponibilidade de seus componentes. Além de parte dos compostos fitoquímicos

terem sido descartados na água do molho, de acordo como feito no popular, sendo muitas

vezes esses fitatos os responsáveis pelos compostos fenólicos e antioxidantes. Sabe-se que

a atividade antioxidante está relacionada com a quantidade de compostos fenólicos o que

também se mostrou inferior.

É válido ressaltar que a extração realizada com água na matriz de alpiste não foi

eficiente, contudo a partir deste trabalho é possível definir outras pesquisas para verificação

com diferentes solventes orgânicos. A extração foi realizada apenas com água, pois a

investigação foi determinada pelo consumo das pessoas ao “leite de alpiste”, um extrato

aquoso.

4. CONCLUSÃO

Os resultados deste trabalho demonstraram que o extrato aquoso de alpiste

apresentou teor de compostos fenólicos compatíveis com matrizes similares como arroz e

cevada.

Entre os métodos aplicados o que demonstrou valores maiores para a atividade

antioxidante foi o ORAC, em seguida o teste ABTS, sendo uma análise que permite a

avaliação de compostos de natureza hidrofílica e lipofílica e com menor atividade

antioxidante foi o ensaio DPPH, uma vez que cada metodologia mede compostos diferentes

e sendo o extrato analisado aquoso, parte dos compostos que poderiam reagir em cada

método pode não ter sido extraído. O sistema solvente utilizado na extração foi a água o

que influenciou diretamente os conteúdos de fenólicos totais e atividade antioxidante. O

extrato aquoso de alpiste pode ser considerado como fonte intermediária de atividade

antioxidante comparada a outros alimentos, segundo dados obtidos por comparação com

outros alimentos. Para obtenção de dados ainda mais conclusivos, devem ser realizados

trabalhos posteriores com outros solventes indicados na literatura.

149


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163

Capítulo IV

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO

EXTRATO AQUOSO DE SEMENTES DE ALPISTE EM

MODELO DE DIABETES INDUZIDA POR

ESTREPTOZOTOCINA

Michele Christine Machado de Oliveira1, Débora Barbosa Vendramini Costa2,

Michelle Pedroza Jorge3, João Ernesto de Carvalho3, Karin Maia Monteiro3, Sirlene

Valerio Tinti3, Marcelo Alexandre Prado1



SP, Brasil. 2Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade

Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6154, 13083-970, Campinas,

SP, Brasil. 3Divisão de Farmacologia e Toxicologia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas

Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP), C.P. 6171, 13081-970, Campinas,

SP, Brasil.

Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Food Research International

165

Resumo

A espécie vegetal Phalaris canariensis - (alpiste) é usado como ração de animais e

atualmente também utilizado na culinária. Relatos etnofarmacológicos indicam o uso das

sementes em forma de chá no tratamento da hipertensão e hipercolesterolemia

acompanhado ou não de outras formas de terapia. Recentemente surgiram relatos sobre o

uso do extrato aquoso de sementes de alpiste ou “leite de alpiste” como coadjuvante no

tratamento do diabetes mellitus, porém estudos abordando as ações farmacológicas dessa

espécie são escassos, havendo a necessidade de mais informações científicas acerca dessas

propriedades. Dessa forma, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do extrato

aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis glicêmicos, aspectos gerais de toxicidade e

alterações bioquímicas e histopatológicas em modelo de diabetes induzida por

estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar machos. Os animais foram distribuídos em grupos

(n=10), sendo: sham (controle não-diabético), controle negativo diabético e diabéticos

tratados por via oral, diariamente, com 250, 500 e 1000 mg/kg de extrato aquoso de

sementes de alpiste por 28 dias. Um outro experimento mais longo (87 dias) foi realizado a

fim de avaliar o desenvolvimento do processo diabético e a ação do extrato (1000 mg/kg)

nesse processo. O diabetes foi induzido por administração intraperitoneal de STZ (60

mg/kg), sendo considerados os animais com glicemia de jejum ≥ 250 mg/dL. Após 5 dias

da indução do diabetes os tratamentos foram iniciados e durante os experimentos os

animais foram avaliados quanto ao ganho de massa corporal, glicemia e ingestão de água e

ração. No final do experimento (28 ou 87 dias) os animais foram eutanasiados e os

seguintes parâmetros avaliados: perfil hematológico (hemograma), perfil de enzimas

hepáticas e renais, colesterol total, triglicerídeos, eletrólitos na urina e sangue e alterações

histológicas em órgãos que são afetados pela condição diabética (pâncreas, fígado e rins),

tendo como valores de referência para os parâmetros hematológicos e bioquímicos dos

animais não-diabéticos (sham). O diabetes foi caracterizado por queda progressiva da

massa corporal, elevação substancial da ingestão hídrica, alimentar, da diurese e aumento

dos índices glicêmicos (acima de 250 mg/dl), além de aumento expressivo na atividade das

enzimas hepáticas TGO e TGP. O tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste

não foi capaz de reverter a condição diabética em nenhuma das doses avaliadas. Por outro

lado, animais não-diabéticos e tratados com 1000 mg/kg de extrato não apresentaram sinais

de toxicidade nas condições e tempos avaliados nesse estudo. Dessa forma, apesar dos

relatos populares acerca dos benefícios do extrato aquoso de sementes de alpiste, o “leite de

alpiste”, no tratamento do diabetes mellitus, nas condiçoes experimentadas nesse estudo

não foi observado o efeito hipoglicemiante.

Palavras-chave: Phalaris canariensis, “leite de alpiste”, Diabetes, Glicemia,

Estreptozotocina, Ratos Wistar.

166

Abstract

The vegetal specie Phalaris canariensis – (canary seed) is largely used as food for animals

and currently has been used in culinary. Ethnopharmacological reports indicate the use of

canary seeds tea in the treatment of hypertension and hypercholesterolemia, accompained

or not by other forms of therapy. Recently the use of the aqueous extract of canary seeds or

the "canary seed milk" as an adjunct in the treatment of diabetes mellitus was reported, but

studies addressing the pharmacological actions of this specie are scarce, thus there is a need

for more scientific information concerning these properties. Thus, this study aimed to

evaluate the effects of the aqueous extract of canary seeds in blood glucose levels, general

aspects of toxicity and biochemical and histopathological changes in a model of diabetes

induced by streptozotocin (STZ) in male Wistar rats. The animals were distributed into

groups (n = 10), as follows: sham (non-diabetic control group), negative control (diabetic)

and diabetic animals treated orally, daily, with 250, 500 and 1000 mg/kg of aqueous extract

of canary seeds for 28 days. A long-term experiment (87 days) was performed to assess the

development of the diabetic process and the action of the extract (1000 mg/kg) in this

process. Diabetes was induced by an intraperitoneal administration of STZ (60 mg / kg),

and animals presenting fasting glycemia ≥ 250 mg/dL were considered diabetic. After 5

days of the diabetes induction, treatments were initiated and during the experiment the

animals were evaluated for body weight gain, glucose and water and food intake. At the

end of the experiments (28 or 87 days) the animals were euthanized and the following

parameters were evaluated: hematological profile, hepatic and kidney enzymes levels, total

cholesterol, triglycerides, electrolytes in the urine and blood and histological changes in

organs that are affected by diabetic condition (pancreas, liver and kidneys), taking as

reference values for haematological and biochemical parameters from the non-diabetic

animals (sham). Diabetes was characterized by progressive loss of body weight,

significative intake of water and food, diuresis, increased blood glucose levels (above 250

mg / dl) and significant increase in the activity of hepatic enzymes AST and ALT. Any of

the treatments with aqueous extract of canary seed seed was able to reverse the diabetic

condition. On the other hand, non-diabetic rats treated with 1000 mg / kg extract showed no

signs of toxicity under the conditions and times evaluated in this study. Thus, despite the

popular reports about the benefits of the aqueous extract of the seeds of canary seed

"canary seed milk" in the treatment of diabetes, the hypoglycemic effect was not observed

in the conditions applied in this study.

Keywords: Phalaris canariensis, "canary seeds milk," Diabetes, Glucose, Streptozotocin,

Wistar rats.

167

1. INTRODUÇÃO

O Diabetes mellitus é uma desordem metabólica crônica caracterizada por

hiperglicemia decorrente de defeitos na secreção e/ou uso da insulina pelo organismo.

Existem dois tipos de diabetes: a do tipo I (cerca de 3-5% dos casos de diabetes) e a do tipo

II (90% dos casos de diabetes) (YU et al., 2014). O diabetes tipo I decorre da falta de

produção de insulina e a do tipo II pela ineficiência na utilização de insulina, sendo este

último tipo também relacionado à obesidade e inatividade física (OMS, 2015). De acordo

com a Organização Mundial de Saúde, até 2025 existirão cerca de 300 milhões de novos

casos de diabetes no mundo, dobrando o número de casos existentes hoje (OMS, 2015).

O aumento do estresse oxidativo, defeitos no sistema de defesa antioxidante e a

peroxidação lipídica são os principais fatores no desenvolvimento e progressão do diabetes

mellitus (DM) e suas complicações (RUDGE et al., 2007). Dentre as complicações mais

frequentes estão as relacionadas às redes microvascular (retinopatias, nefropatias,

neuropatias) e macrovascular (doenças cardiovasculares) (OMS, 2015).

Estudos anteriores mostraram que compostos fenólicos possue propriedades de

eliminação de radicais livres e redução do estresse oxidativo associado com diabetes

mellitus (KUSIRISIN et al., 2009; GANDHI, 2011). Vários estudos têm mostrado que o

tratamento antioxidante reduz complicações diabéticas (WOHAIB; GODIN, 1987;

CAMERON, 1993; SINGH et al., 2005). A propriedade mais recentemente identificada nos

polifenóis é o seu efeito nas complicações a longo prazo do diabetes, incluindo retinopatia,

nefropatia e neuropatia (BAHADORAN et al., 2013).

Os polifenóis, antioxidantes bem conhecidos, também demonstraram função

antidiabética reduzindo os níveis de glicemia (MATSUMOTO et al., 1993; GOMES et al.,

1995; ANDERSON; PALANSKY, 2002; SINGH et al., 2005). Os ácidos fenólicos são

metabólitos secundários que são comumente encontrados em muitos componentes de

alimentos e frutas. Muitos estudos epidemiológicos descobriram que o consumo de

alimentos e bebidas com alto teor de fenólicos é associado com a prevenção de diabetes

(KARTHIKESAN; PARI; MENON, 2010). Ao longo dos últimos anos, a investigação tem

associado o consumo elevado de alimentos ricos em compostos fenólicos com benefícios

para a saúde, como a prevenção de doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes

168

e câncer (VISIOLI & DAVALOS, 2011; EBRAHIMI & SCHLUESENER, 2012; MURSU;

VIRTANEN; TUOMAINEN; NURMI E VOUTILAINEN, 2014).

As terapias disponíveis para o tratamento do DM tipo II incluem antidiabéticos orais

como sulfoniluréias, biguanidas, inibidores da α-glicosidade, tiazolidinedionas, inibidores

de dipeptidil peptidase-4, que podem ser usados como monoterapias ou em combinação

com outras terapias. Novos alvos têm sido buscados atualmente, a fim de minimizar efeitos

adversos e aumentar a eficiência do tratamento (HUNG et al., 2012).

Um dos mecanismos que está sendo explorado atualmente é o estresse de retículo

endoplasmático, pois sabe-se que grande parte das células β-pancreáticas morrem via

estresse reticular (HUNG et al., 2012).

Na busca por novas terapias, modelos experimentais de indução de diabetes

possuem um papel importante na triagem de novos compostos. Tais modelos podem

envolver manipulação farmacológica, cirúrgica ou genética, utilizando-se roedores ou

animais de grande porte. Atualmente modelos murinos são os mais utilizados, devido a

disponibilidade de tecnologias relacionados à condição ou controle do diabetes (FRÖDE e

MEDEIROS, 2008). Têm sido usados na explicação de fenômenos que afetam condições

humanas. Tal fato se observa em pesquisas para o desenvolvimento científico, na área de

análises de produtos químicos e contaminantes ambientais, controle e desenvolvimento

farmacológico, área biomédica e estudo de alimentos (MENENDEZ, 1985 apud JONG,

1996).

Estudos têm sido realizados com ratos albinos da linhagem Wistar, espécie de fácil

manuseio, a qual possibilita o trabalho com vários grupos experimentais simultâneos, os

animais apresentam elevada resistência a infecções, e permite, com facilidade, a retirada de

órgãos para estudo (LERCO et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2009).

A utilização de animais de laboratório é de suma importância nas pesquisas

científicas contribuindo sobremaneira para o desenvolvimento da ciência e tecnologia

(CHORILLI et al., 2007; MELO, 2012). É por meio destas pesquisas que o avanço sobre o

conhecimento dos mecanismos vitais como também o aperfeiçoamento dos métodos de

prevenção, diagnóstico e tratamento de diversas doenças vêm se desenvolvendo ao longo

dos anos (ALMEIDA et al., 2008; MELO, 2012).

169

Muitos estudos para avaliação de diabetes em animais têm sido realizados a partir

da indução química com fármacos β-citotóxicos, sendo a estreptozotocina (STZ) um dos

compostos químicos mais utilizados (LERCO et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2009).

Embora o mecanismo de ação citotóxica da STZ nas células β não seja totalmente

compreendido, várias linhas de evidências indicam que a STZ estimula a geração dos

radicais livres, os quais levam à destruição e disfunção das células β das ilhotas de

Langerhans do pâncreas, que pode ser uma das causas mais importantes de danos celulares

e efeito diabetogênico da STZ (OHKUWA et al., 1995 apud SEFI, 2011; SZKULDESKI,

2001).

A STZ é uma glicosaminanitrosureia (Fígura 26) com propriedades tóxicas ao

DNA e que foi inicialmente isolada e caracterizada como um antimicrobiano de largo

espectro a partir de colônias de Streptomyces achromogenes (DELFINO et al., 2002 apud

BERA et al., 2012; SZKULDESKI, 2001; MALLICK et al., 2010; XIANG et al., 2010). A

STZ apresenta semelhança estrutural com a molécula de glicose e é igualmente

internalizada nas células via transportadores de glicose do tipo GLUT2, altamente

expressos na superficie das células β-pancreáticas (KARUNANAYAKE et al., 1976;

SZKULDESKI, 2001). Isso explica sua toxicidade seletiva para as células β-pancreáticas,

uma vez que essas células expressam elevados níveis desse transportador.

Figura 26. Estrutura química da Estreptozotocina.

Fonte: www.medicinescomplete.com, (2015).

A ação tóxica da STZ se dá pelo aumento dos níveis de espécies reativas de

oxigênio molecular intracelular, ocasionando alquilações das bases nitrogenadas que

compõem o DNA (Figura 27) (LEDOUX et al., 1986; ELSNER et al., 2000;

SZKULDESKI, 2001; LENZEN, 2008). Tais danos oxidativos causam alterações no

metabolismo das células β por acarretarem diminuição dos níveis de nicotinamida adenina

http://www.medicinescomplete.com/

170

dinucleotideo (NAD) e consequentemente de adenosina trifosfato (ATP). Assim, este

esgotamento da energia celular resulta, em última análise, em necrose das células β-

pancreáticas (DELFINO et al., 2002 apud BERA, 2012; SANDLER e SWENNE, 1983;

BOLZAN e BIANCHI, 2002). O quadro resultante é o surgimento de diabetes após 2-4 dias

(WEISS, 1982 apud AKBARZADEH et al., 2007).

Figura 27. Esquema ilustrativo da ação da estreptozotocina na célula β do pâncreas.

Fonte: Adaptado a partir de Murata et al., (1999).

Além da alteração no metabolismo de carboidratos e lipídeos, os animais tratados

com STZ também exibem níveis reduzidos de proteína total e de glicogênio no fígado

(HUANG et al., 2000; GUTIERREZ et al., 2014). A administração de uma dose menor de

STZ (40 mg/kg) leva à destruição parcial de células β, levando à secreção insuficiente de

insulina e a um quadro semelhante ao de diabetes do tipo 2 (MURALI, 2013). Além disso,

apresentam hiperglicemia, permanecendo viáveis sem suplementação insulínica (FRICKER

et al., 2008 apud GUIMARÃES et al., 2009).

Similarmente ao que ocorre em pacientes diabéticos, esses animais apresentam

poliúria (aumento do fluxo e frequência de urina), polifagia (aumento do consumo de

alimento) e hiperglicemia (GOYARY e SHARMA, 2010). Além de evidências clínicas, os

estudos pré-clínicos mostram um aumento no comportamento do tipo depressivo em

animais com diabetes induzida quimicamente pela injeção de STZ (GOMEZ e BARROS,

2000; WAYHS et al., 2010; CALETTI et al., 2012; HO et al., 2012).

A incidência de efeitos adversos ainda constitui um desafio na terapia do DM e

nesse contexto plantas medicinais constituem uma alternativa para o tratamento e

171

prevenção dessa doença, podendo apresentar menor toxicidade e consequentemente menos

efeitos adversos (YASSA e TOHAMY, 2014).

Na medicina popular, a semente de alpiste (Phalaris canariensis L.) está sendo

empregada para o tratamento de diabetes (MERZOUKI et al., 2003 apud GUTIERREZ, 2014).

Seu uso mais conhecido é como alimento para pássaros, sozinho ou misturado com outros

grãos, porém, devido ao alto valor nutricional, o interesse no uso da semente de alpiste

como alimento alternativo na alimentação livre de glúten aumentou substancialmente nos

últimos tempos (ESTRADA-SALAS et al., 2014).

Apesar de seu uso popular no tratamento de diabetes, são escassos os estudos

científicos que objetivaram a comprovação da atividade do alpiste nesta patologia.

Gutierrez et al., (2014) avaliaram os efeitos do extrato hexânico de sementes de alpiste em

modelo de diabetes induzido por STZ em camundongos. Nesse estudo, os animais tratados

por via oral com 400 mg/kg do extrato por 30 dias não apresentaram os sinais típicos do

diabetes, tais como perda de massa corporal, hiperglicemia, polifagia e poliúria. Além

disso, os níveis das enzimas hepáticas transaminase glutâmico-oxalacética (TGO),

transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) e fosfatase alcalina (ALP) se mantiveram normais

em comparação com os animais do grupo controle negativo, que apresentaram aumento

significativo dessas enzimas. Os níveis de insulina e atividade de enzimas antioxidantes

também se mantiveram próximos aos dos animais não-diabéticos, demonstrando um efeito

antidiabético nesse modelo (GUTIERREZ et al., 2014).

Os resultados com o extrato hexânico, apesar de serem positivos, não traduzem a

forma como a semente de alpiste tem sido usada pela população. Fontes informais tais

como páginas de internet, programas de televisão relatam o uso da semente de alpiste na

forma de um extrato aquoso, denominado “leite de alpiste”. Tais fontes informais clamam

que o “leite de alpiste” seja rico em vitaminas E, complexo B e em antioxidantes, que

evitam o envelhecimento precoce e atuam como anti-inflamatórios, podendo ser eficaz

como terapia complementar de pacientes com diabetes e cirrose hepática (GALVÃO, 2013;

BITTAR, 2013). Relata-se também seu uso como diurético, emagrecedor, removedor de

gordura, combate à prisão de ventre, úlceras, hiperuricemia, edema, gota, gastrite,

hipotensivo e antiacne (GALVÃO, 2013; ALPISTE..., 2013).

Estudo recente avaliou a ação dos peptídeos isolados do “leite” de semente de

alpiste (extrato aquoso das sementes) sobre a enzima dipeptidil peptidase IV, um alvo

172

importante na terapia antidiabética pois é responsável pela inativação das incretinas

(substâncias que atuam no controle do metabolismo da glicose) (ESTRADA-SALAS et al.,

2014). Nesse estudo, peptídeos isolados do “leite” de semente de alpiste apresentaram in

vitro uma ação inibitória sobre a dipeptidil peptidase IV e também sobre a enzima

conversora de angiotensina, demonstrando potencial ação em diabetes e hipertensão

(ESTRADA-SALAS et al., 2014). Apesar de abordar um importante alvo terapêutico do

diabetes, não relata a ação in vivo do extrato aquoso de sementes de alpiste.

Dessa forma, diante do potencial nutricional da semente de alpiste e dos relatos

sobre seu uso popular no tratamento de diabetes, o objetivo do presente estudo foi avaliar

os possíveis efeitos hipoglicemiantes do extrato aquoso de sementes de alpiste em modelo

de diabetes induzida quimicamente por estreptozotocina em ratos Wistar machos, avaliando

também os efeitos sobre os principais parâmetros relacionados ao diabetes, tais como

alteração de massa corporal, perfil de enzimas hepáticas e renais e hemograma total.

Com esse estudo, pretende-se fornecer maiores informações sobre o uso das

sementes de alpiste no diabetes, já que baseada em grande quantidade de relatos informais,

a população se deixa levar pelas “dietas da moda”, que muitas vezes são ineficazes e podem

até mesmo oferecer riscos à saúde.

2. MATERIAL E MÉTODOS


Estreptozotocina foi adquirida da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA),

glicosímetro (Accu-Chek, da Roche Diagnostics, EUA), balança semi-analítica (Marca

BEL), analisador hematológico (pocH-100 iν Diff), microcentrífuga para eppendorf

(5415C), centrífuga refrigerada, Reflotron plus (Roche), 9180 Electrolyte Analyser (Roche)

e espectrofotômetro VersaMax (Marca Molecular Devices). Os experimentos e análises

foram realizados na Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de

Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP).

173

2.2 Preparo do Extrato Aquoso de Sementes de P. canariensis L.

Para a determinação da toxicidade do extrato e da atividade hipoglicemiante, o

mesmo era preparado diariamente e monitorado quanto ao seu extrato seco (20% de resíduo

seco), garantindo a mesma composição. A matéria-prima foi obtida do comércio de

Campinas – SP e realizada sua composição centesimal como descrito no capítulo anterior.

Para a obtenção do extrato aquoso das sementes de alpiste Phalaris canariensis L.,

foi utilizada uma proporção de 150 g de alpiste em 200 mL de água destilada. Após deixar

de molho em água por 12 horas, a água de resíduo foi desprezada, e as sementes trituradas

com 200 mL de água destilada por 5 minutos em liquidificador comercial até a obtenção de

um “leite” (Fig. 28 A). Em seguida peneirou-se quatro vezes, para a separação dos sólidos

insolúveis (resíduo) (Fig. 28 B e C), seguida de filtração em filtro de nylon dez vezes para

posterior gavagem nos animais do estudo (Fig. 28 D).

Figura 28. Sequência do preparo do extrato aquoso de alpiste.

Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).

2.3 Animais

Foram utilizados 86 ratos albinos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus),

com dois meses de idade, adultos, normais e saudáveis, com peso médio de 164g,

provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em

Animais de Laboratório – CEMIB da Universidade Estadual de Campinas. Os animais

foram mantidos no biotério de manutenção de animais da Divisão de Farmacologia e

Toxicologia – CPQBA – UNICAMP, onde permaneceram em condições ambientais

controladas, em gaiolas coletivas de polipropileno com cama de maravalha, com

temperatura média de 24 ± 2ºC e umidade relativa de 50 a 60% ± 5%, com ciclo

claro/escuro de 12/12 horas e com fornecimento de água e ração em forma de pellet padrão

(Biobase) (Anexo 3) ad libitum. A identificação dos animais foi realizada por meio de

174

marcação permanente nos pêlos e cauda de cada animal e brincos com identificação

numérica (Fig. 29).

Os cuidados dos animais bem como os protocolos de pesquisa estavam de acordo

com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA) e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa animal do Instituto de Biologia –

UNICAMP (n°3177-1 e 3178-1) Anexos 1 e 2.

Figura 29. Condições ambientais dos grupos do estudo: A. Estantes com as gaiolas experimentais. B. Gaiola

experimental com cama de maravalha e animais em estudo.


2.4 Análise de Toxicidade Dose Única

A avaliação da toxicidade aguda foi realizada com o objetivo de verificar o efeito da

administração única de extrato aquoso de alpiste por via oral (gavagem). Testes que

avaliam a toxicidade sistêmica de dose única são utilizados para classificar e

apropriadamente rotular substâncias de acordo com o seu potencial de letalidade ou

toxicidade como estabelecido pela legislação (VALADARES, 2006).

Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 6), de ratos Wistar

machos, que foram tratados por via oral (v.o.) com diferentes doses (500 mg/kg, 1000

mg/kg e 2000 mg/kg) de extrato aquoso de sementes de alpiste. Os grupos foram

observados continuamente por um período de 4 horas e então diariamente, por 15 dias, para

avaliação de sinais gerais de toxicidade, tais como efeitos na locomoção, comportamento

(agitação, atividade reduzida, sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose

de extremidades e mortalidade, além da massa corporal e glicemia de cada animal (Fig. 30)

(OECD 2002). A partir desse experimento foram selecionadas as doses de extrato de alpiste

a serem avaliadas no teste de diabetes.

175

Figura 30. Análise de toxicidade aguda em ratos Wistar macho tratados com extrato aquoso de sementes de

alpiste.


2.5 Indução de Diabetes Experimental por Estreptozotocina

Os animais foram previamente deixados em jejum de 12 horas com acesso livre à

água potável. Após serem pesados, o diabetes foi induzido através da administração

intraperitoneal (ip.) de estreptozotocina (STZ), (PM=265.22), a uma dose de 60 mg/kg de

massa corporal (Sigma-Aldrich Chemical, USA) dissolvida em tampão citrato de sódio

10mM e pH 4,5 (PATEL et al., 2011). Os ratos dos grupos controle receberam volume

equivalente de tampão citrato de sódio 10mM e pH 4,5 (Fig. 31).

Figura 31. A. Gaiola do jejum. B. Administração intraperitoneal de estreptozotocina para indução de

diabetes.


Devido à similiaridade entre as moléculas de glicose e STZ e a sua competição pelo

transportador de glicose tipo 2 (GLUT2), os animais permaneceram em jejum 90 minutos

após a administração da droga, evitando assim a internalização da glicose ao invés da droga

diabetogênica (SZKULDESKI, 2001). No quinto dia após a indução, a confirmação do

diabetes foi realizada por meio da determinação da glicemia de jejum utilizando tiras

A B

176

reagentes Accu-Chek. Foram considerados diabéticos somente animais apresentando

glicemia maior ou igual a 250 mg/dL (LERCO et al., 2003).

2.6 Experimento I: 28 dias - Delineamento Experimental

Foram utilizados diferentes grupos experimentais para estudar o efeito

hipoglicemiante do extrato aquoso de sementes de Phalaris canariensis. Os ratos foram

aleatoriamente divididos em seis grupos (Fig. 32 - A) e receberam os seguintes tratamentos

por via oral:

Grupo I: Sham - Ratos normoglicêmicos sem tratamento;

Grupo II: Controle Negativo - Ratos com diabetes sem tratamento;

Grupo III: Controle Positivo Maior Dose - Ratos normoglicêmicos tratados com

1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes de alpiste;

Grupo IV: Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de extrato aquoso de sementes

de alpiste;

Grupo V: Ratos diabéticos tratados com 500 mg/kg de extrato aquoso de sementes

de alpiste;

Grupo VI: Ratos diabéticos tratados com 1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes

de alpiste.

Figura 32. Disposição dos grupos, bebedouros e rações controlados.


177

2.7 Tratamentos

Antes do início dos procedimentos, todos os animais passaram por uma semana de

adaptação ao biotério (alimentação e gaiolas).

Os animais foram alimentados diariamente com ração comum (Biobase) e tratados

com as doses pré-selecionadas de extrato aquoso de sementes de alpiste, v.o. (gavagem),

por 28 dias após a indução do diabetes. Os grupos sham (Grupo I) e controle negativo

(Grupo II) receberam água potável, v.o. (veículo). A administração foi realizada por

gavagem com o animal imobilizado, por meio de tração manual da pele da região dorsal e

utilizando cânula de plástico flexível (Fig. 33).

O extrato aquoso, em temperatura ambiente, foi oferecido aos animais durante 4

semanas, nas doses estimadas de 250 mg/kg, 500 mg/kg e 1000 mg/kg de massa corporal.

As doses foram ajustadas três vezes por semana de acordo com a massa corporal do animal

e com a concentração do extrato (mg/mL), obtida a partir da divisão da massa do extrato

em mg (correspondente às doses) pela média do consumo líquido em mL de cada animal,

para manter a mesma dose por kg de massa corporal durante todo o período de estudo para

cada grupo.

Figura 33. A. Animal imobilizado. B. Gavagem do extrato aquoso de sementes de alpiste.


3. AVALIAÇÕES

Os animais foram avaliados semanalmente quanto ao ganho de massa corporal e a

glicemia. Além disso, foi avaliado diariamente o consumo de água e ração.

Após 28 dias, os animais foram eutanasiados (aprofundamento de anestesia) e

avaliados o perfil hematológico e as funções hepática e renal, por meio de análise

B A

178

bioquímica dos níveis séricos das enzimas aspartato aminotransferase e alanina

aminotransferase, gama-glutamil transferase, análise de uréia, fosfatase alcalina, creatinina,

ácido úrico, colesterol e triglicérides. Também foram avaliados os perfis de hemoglobina

glicada e eletrólitos. Os órgãos relacionados à condição diabética (fígado, rins e pâncreas)

foram pesados e analisados quanto às alterações histopatológicas. Os demais órgãos

(coração, baço e adrenais) foram apenas pesados.

3.1 Glicemia

As dosagens glicêmicas foram realizadas em glicosímetro Accu-Chek Performa®

com a utilização da tira-teste, com amostras de sangue obtidas por punção da veia caudal

dos animais (Fig. 34 A e B). As amostras de sangue foram coletadas antes do início do

tratamento (t=0) e então uma vez por semana.

Figura 34. Coleta de sangue através da cauda do animal e leitura em glicosímetro.


3.2 Consumo Alimentar, de Água e Controle de Massa Corporal

A quantidade de ração consumida foi avaliada por meio do registro diário de

ingestão alimentar pelos animais (variação entre a oferta e as sobras da dieta deixadas nas

gaiolas) durante os 28 dias de ensaio, para obtenção da ingesta nos diferentes grupos

experimentais (Fig. 35 A). O volume de água consumido pelos diferentes grupos também

foi registrado diariamente, através da diferença entre a oferta e a sobra de água nas garrafas.

Durante todo período experimental, os animais foram submetidos, semanalmente, a

três avaliações da massa corpórea, de forma a minimizar a manipulação e estresse dos

animais e também realizar o controle das doses de extrato (Fig. 35 B).

179

Figura 35. Controle do consumo alimentar e massa corporal dos animais.


3.3 Eutanásia dos Animais e Coleta de Sangue

No final do período experimental, após jejum de 12 horas, todos os animais foram

pesados, anestesiados com barbitúrico (pentobarbital). Em seguida o sangue foi coletado

por punção cardíaca e os animais foram submetidos a eutanásia por aprofundamento de

anestesia.

O sangue foi distribuído em microtubos de 0.5 mL contendo 10 μL de

anticoagulante EDTA sódico a 10% para realização dos parâmetros hematológicos,

microtubos de 1.5 mL contendo 30 μL de anticoagulante EDTA sódico a 10% para

hemoglobina glicada, tubos com heparina para medição de eletrólitos séricos, dois

microtubos de 1.5 mL sem EDTA para centrifugação do soro e posterior realização das

análises bioquímicas e tubos secos para coleta da urina para posterior análise de eletrólitos.

Para a obtenção do soro, após a coagulação do sangue os microtubos foram centrifugados

durante 15 minutos a 3500 rpm (rotações por minuto) e o sobrenadante (soro) foi coletado.

Os parâmetros hematológicos foram verificados através do analisador hematológico

(pocH-100 iν Diff) (Fig. 36). Já os parâmetros bioquímicos foram dosados através do

analisador automatizado Reflotron plus (Roche) (Fig. 37) e os eletrólitos do sangue e urina

avaliados através do 9180 Electrolyte Analyser (Roche). Para a determinação bioquímica,

foi empregado o método cinético UV, utilizando-se kits comerciais de reagentes padrão

(Roche).

A B

180

Figura 36. Analisador hematológico pocH-100 iν Diff.


Figura 37. Centrifugação do sangue para obtenção do soro e Reflotron analisador automatizado para análises

bioquímicas.


Foram analisados os seguintes parâmetros:

(1) hematológicos: leucócitos totais, hemácias, hemoglobina, hematócrito, volume

corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração da

hemoglobina corpuscular média (CHCM) e plaquetas (PLT);

(2) bioquímicos: aspartato aminotransferase (AST ou TGO), alanina

aminotransferase (ALT ou TGP), fosfatase alcalina (ALP), gama-glutamil transferase

(GGT), creatinina, uréia, colesterol total, triglicérides e ácido úrico. Para as análises, foram

utilizados kits comerciais e seguidas as orientações recomendadas pelo fabricante. A

atividade das aminotransferases foram expressas em unidades internacionais por litro

(UI/L) e as demais medidas expressas em mg/dL;

(3) eletrólitos: sangue (Na, K, Ca) e urina (Na e K).

Após eutanásia, de cada animal foram excisados os seguintes órgãos: coração,

fígado, rins, baço, pâncreas e adrenais, que foram pesados em balança analítica sendo o

fígado, rins e pâncreas separados em frascos identificados com solução de formaldeído

10% para análises histopatológicas (Fig. 38). Desta forma foi possível calcular a média de

181

peso dos órgãos dos animais para cada grupo e avaliar com testes estatísticos a existência

de possíveis diferenças de resultados entre os diferentes grupos (LOPES, 2011).

Figura 38. Animais em jejum, necropsia e pesagem dos órgãos.


3.3.1 Análises Bioquímicas

A função hepática foi avaliada por meio das determinações dos níveis séricos de

transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e transaminase glutâmico-pirúvica (TGP). Em

tais determinações, assim como nas demais análises bioquímicas (ácido úrico, uréia,

creatinina, GGT, fosfatase alcalina, colesterol e triglicérides) foram utilizados kits reagentes

da Roche®, conforme especificações do fabricante. Todas as medidas de atividade

enzimática foram visualizadas para a temperatura 37ºC (selecionada no aparelho). Uma

alíquota de 30µL de soro de cada animal foi inserida no centro da zona vermelha reativa da

tira, removendo anteriormente a banda protetora. Após 15 segundos foi introduzida

horizontalmente a tira no aparelho e o aparecimento no visor confirma que a leitura do

código magnético específico do teste foi corretamente lida pelo aparelho. O tempo foi

indicado em segundos, até surgimento do resultado.

De acordo com o manual de instruções do kit Reflotron (GOT-AST) (2010), níveis

elevados de TGO podem indicar infarto do miocárdio, doenças do fígado, distrofia

muscular e lesões nos órgãos. Quando a atividade da TGO medida foi superior ao intervalo

de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa

medida de 1+4. A normalização de TGO foi calculada a partir da fórmula A= 5.A dil.

Segundo o manual de instruções do kit Reflotron (GPT-ALT) (2010), níveis

elevados de TGP podem indicar infarto do miocárdio, doença hepática, distrofia muscular

ou lesões dos órgãos. A atividade aumentada de TGP (ALT) é bastante específica para a

doença parenquimal do fígado, enquanto que a TGO (AST) não é uma enzima específica do

182

fígado. Quando a atividade TGP medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron,

a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A

normalização de TGP foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil.

A determinação de ácido úrico é usada para o diagnóstico e monitorização de vários

distúrbios renais e metabólitos como a insuficiência renal, gota, leucemia, psoríase,

situações de jejum ou outras doenças com distúrbios nutricionais. A uma temperatura de

37ºC foi formado o corante e medido a 642 nm e a concentração de ácido úrico visualizada

depois de 200 segundos, em mg/dL. Quando o valor de ácido úrico medido foi superior ao

intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina

fisiológica numa medida de 1+1. A concentração de ácido úrico foi calculada a partir da

fórmula C= 2.C dil, conforme detalhado no manual de instruções do kit Reflotron (Uric

Acid) (2010).

A uréia é determinada para a avaliação da função renal. A reação provoca a

alteração parcial da cor de um indicador tamponizado em verde/azul, sendo a sua

intensidade proporcional à concentração de uréia na amostra. Quando o valor de uréia

medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída

com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A normalização da concentração de

uréia foi feita a partir da fórmula C= 2.C dil, de acordo com o manual de instruções do kit

Reflotron (Urea) (2010).

Creatinina é usada para diagnóstico e monitorização de distúrbios renais crônicos e

agudos e para monitorizar a diálise, conforme manual de instruções do kit Reflotron

(Creatinine) (2010). Quando o valor de creatinina medida foi superior ao intervalo de

medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa

medida de 1+1. A normalização da concentração de creatinina foi feita a partir da fórmula

C= 2.C dil.

De acordo com o manual de instruções do kit Reflotron (GGT) (2010), GGT é usada

para diagnóstico e monitorização de doenças do fígado e do trato biliar. A atividade elevada

desta enzima, é um dos indicadores mais sensível da doença hepato-biliar. Quando a

atividade GGT medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro

foi diluída com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A normalização de GGT

foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil.

183

Segundo o manual de instruções do kit Reflotron (Alkalina Phosphatase) (2010), a

causa mais frequente do aumento total da atividade de Fosfatase Alcalina (ALP) no soro é a

doença do fígado e/ou trato biliar. Quando a atividade ALP medida foi superior ao intervalo

de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa

medida de 1+1. A normalização de ALP foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil. – A0

A determinação do colesterol é utilizada para alertar sobre o risco aterogênico e no

diagnóstico e tratamento de doenças com níveis de colesterol elevados e distúrbios do

metabolismo lipídico e das lipoproteínas, detalhado no manual de instruções do kit

Reflotron (Cholesterol) (2010). Quando o valor de colesterol medido foi superior ao

intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina

fisiológica numa medida de 1+1. O valor real de colesterol foi calculado a partir da fórmula

C= 2.C dil. – C0.

Os triglicérides são determinados para detecção precoce do risco de aterosclerose,

classificação da hiperlipoproteinemia e para a monitorização da dieta ou terapia

farmacológica com o objetivo de diminuir os lipídeos, definido pelo manual de instruções

do kit Reflotron (Triglycerides) (2010). Quando o valor de triglicérides medido foi superior

ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina

fisiológica numa medida de 1+1. A verdadeira concentração de triglicérides foi calculada a

partir da fórmula C= 2.C dil.

3.3.2 Hemoglobina Glicada

No final do tratamento, amostras de sangue foram obtidas para determinação da

porcentagem de hemoglobina glicada, avaliando os níveis glicêmicos retroativos durante as

semanas de estudo. A hemoglobina glicada foi dosada por meio de cromatografia de troca

iônica em microcolunas.

Em relação a avaliação do percentual de hemoglobina glicada, é importante destacar

que tal mensuração e a de glicemia são complementares, revelando aspectos diferentes,

uma vez que a primeira reflete o controle glicêmico nos últimos dois a três meses, enquanto

a segunda refere-se a glicemia unicamente do dia (SUMITA; ANDRIOLO, 2008; Revista

Interdisciplinar NOVAFAPI, 2010).

As determinações foram realizadas pelo método enzimático colorimétrico,

utilizando-se kits e reagentes LABTEST, seguindo as recomendações do fabricante. Uma

184

alíquota de sangue foi acondicionada em tubo com anticoagulante (EDTA) para

determinação de hemoglobina glicada (HbA1). A percentagem de HbA1 em relação a

hemoglobina total foi calculada com base nos valores da leitura da absorbância em 415 nm.

Em um tubo adicionou-se o hemolisante juntamente com a amostra de sangue e

agitou-se por alguns minutos até a hemólise completa. Realizou-se a cromatografia em

coluna, assegurando a temperatura uniforme, a penetração de todo hemolisado sobre a

resina e a adição do tampão Hb-rápida. Aguardou-se a eluição completa da Hb-G.

Homogeneizou-se o conteúdo do tubo Hb-G e este foi aplicado em placas de 96 poços para

análise colorimétrica em leitor de microplacas. Para determinação de Hb-Total, pipetou-se

em cada poço uma alíquota de água deionizada, adicionou-se o hemolisado e homogenizou-

se. Logo em seguida determinaram-se as absorbâncias de todas as amostras. Calculou-se

corrigindo com valores de temperaturas, de acordo com as intruções do kit (LABTEST)

(Fig. 39).

Figura 39. Etapas para dosagem de hemoglobina glicada.


3.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue

No final do tratamento, amostras de urina e sangue foram coletadas para análise de

eletrólitos. Para coleta de sangue utilizou-se o anticoagulante heparina.

As amostras de sangue foram submetidas ao aparelho 9180 Electrolyte Analyser

(Roche) (Fig. 40), já nas amostras de urina, quando os valores de Na+ e K+ apareceram

muito elevados, procedeu-se a diluição com diluente de urina e água destilada.

185

Figura 40. Coleta de urina e o Aparelho 9180 Electrolyte Analyser.


3.3.4 Avaliação Histopatológica

Quando ocorre a toxicidade em um órgão, a maior parte do diagnóstico inicial

depende do reconhecimento da mudança na estrutura do órgão, peso relativo e morfologia,

o que pode ser avaliado por meio de análises histopatológicas. Alternativamente, as

evidências de exames de histopatologia pode ser correlacionados com dosagens hormonais

em estudos onde existem efeitos marcados no órgão alvo e hormônios relevantes.

Normalmente, uma alteração dos resultados dos testes são apoiados por outras provas,

recolhidas principalmente pela histopatologia e tais observações permitem a confirmação

sobre se um efeito é devido à toxicologia, farmacologia, ou é uma variação biológica

(EVANS, 2008 cap. 11).

Foram avaliadas possíveis alterações histológicas de órgãos que são afetados pela

condição diabética (fígado, rins e pâncreas). A avaliação histológica dos pâncreas objetivou

a análise da morfologia das ilhotas de Langerhans.

Os órgãos foram limpos e armazenados em solução de formol tamponada neutra a

10% (Fig. 41). As peças foram então desidratadas com gradiente crescente de etanol e

embebidas em parafina. Após a desparafinização e hidratação das lâminas, estas foram

coradas com hematoxilina de Harris e eosina para o exame histopatológico.

Figura 41. Remoção do pâncreas e análise histopatológica dos órgãos (fígado, rins e pâncreas).


186

4. EXPERIMENTO II: 87 dias

A fim de avaliar qual seria o efeito da indução de diabetes por STZ sobre a

sobrevida dos animais, bem como os efeitos do tratamento prolongado com a maior dose de

extrato aquoso de sementes de alpiste (1000 mg/kg) um segundo experimento foi realizado

por 87 dias. A indução de diabetes foi realizada conforme relatado anteriormente (página

175).

4.1 Delineamento Experimental

Foram utilizados dois grupos experimentais para o estudo da sobrevida em relação

ao efeito anti-diabético do extrato aquoso das sementes de Phalaris canariensis .

Grupo I: Controle Diabético Maior Dose - Ratos diabéticos tratados com 1000

mg/kg de extrato de sementes de alpiste;

Grupo II: Controle Negativo - Ratos diabéticos sem tratamento.

4.2 Tratamentos

Os animais foram alimentados diariamente com ração comum (Biobase) e tratados

pela via oral com 1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes de alpiste, v.o. (gavagem), por

87 dias após a indução do diabetes. O grupo controle negativo (Grupo II) recebeu água

destilada por v.o. (veículo). A administração foi realizada da mesma forma que no teste de

28 dias.

4.3 Avaliações

As avaliações em relação ao ganho de massa corporal, glicemia, consumo de água e

ração foram realizados da mesma maneira que no teste de 28 dias.

Após 87 dias, os animais foram eutanasiados devido a cegueira aparente (cataratas)

e avaliados o perfil hematológico, análises bioquímicas, perfil de hemoglobina glicada e

eletrólitos. Os órgãos relacionados à condição diabética (fígado, rins e pâncreas) foram

pesados e analisados quanto a alterações histopatológicas. Os demais órgãos (coração, baço

e adrenais) foram apenas pesados.

187


Os animais de sobrevida foram avaliados quanto as suas funções hepática e renal

por meio de análise bioquímica dos níveis séricos das enzimas aspartato aminotransferase

(TGO) e alanina aminotransferase (TGP), e análises de uréia, creatinina, fosfatase alcalina,

GGT, ácido úrico, colesterol e triglicérides.

4.3.2 Hemoglobina Glicada

A hemoglobina total foi determinada por método enzimático colorimétrico,

utilizando-se kit comercial (Hemoglobina - Laborclin). Para a análise, foram seguidas as

orientações descritas no protocolo do fabricante. A hemoglobina glicada foi determinada

por método de troca iônica. Após as reações, a leitura de absorbância foi realizada em

espectrofotômetro VersaMax em 415 nm. A concentração de HbA1 foi expressa em % de

Hb total.

Resumidamente, as amostras de sangue foram misturadas com reagente de lise para

preparar o hemolisado, durante 5 minutos. Após centrifugação 3000 rpm/5 minutos, a

hemoglobina glicada foi determinada no sobrenadante.

4.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue e Avaliação

Histopatológica

As análises de eletrólitos e a avaliação histopatológica foram realizadas igualmente

ao teste de 28 dias.

4.4 Análise Estatística

Os resultados foram descritos de forma quantitativa e analisados estatisticamente

pelo teste One-Way Anova (não paramétrico) seguido de Tukey multicomparison test para

análise de variância entre os grupos e Two Way seguido de teste de Bonferroni para

comparação pós teste em diferentes tempos. A análise estatística foi realizada com auxílio

do programa GraphPad Prisma 5.0 ® software, utilizando-se como nível de significância,

p<0.05, p<0.01 e p<0.001. As médias e valores de erro padrão foram determinados para

todos os parâmetros estudados.

188


No presente estudo utilizamos ratos (Rattus novergicus) da linhagem Wistar como

animais de experimentação, por apresentarem inúmeras vantagens em relação aos outros

animais de maior porte: fácil manuseio (alimentação, higiene, acomodação); possibilidade

de trabalhar simultaneamente com vários grupos experimentais, sem a ocupação de grandes

espaços; elevada resistência à infecção; facilidade para remoção dos diversos órgãos

(SPADELLA, 1989; SCHELLINI, 1992 apud LERCO et al., 2003; JUNOD et al., 1969;

ORLOFF et al., 1975).

Linhagens de animais de experimentação, quando padronizadas, atuam como

ferramentas capazes de simular as complexas interações de órgãos e sistemas,

possibilitando a compreensão in vivo dos eventos relacionados ao desenvolvimento da

doença (PASSOS, 2003 apud MELO, 2012).

5.1 Análise de Toxicidade Aguda

As doses adequadas das substâncias para serem utilizadas em um estudo/ensaio são

escolhidas após a realização de testes de toxicidade aguda, nos quais são observados sinais

clínicos de toxicidade, dor, comportamento e ocorrência de morte (OECD, 2002). Neste

trabalho realizou-se o teste de toxicidade aguda com doses crescentes do extrato aquoso de

sementes de alpiste e durante o período de estudo e observação de 15 dias, não houve

registro de mortes ou de quaisquer variações na aparência geral ou sinais de toxicidade.

Dessa forma, as doses selecionadas para o estudo da atividade hipoglicemiante foram 250,

500 e 1000 mg/kg.

5.2 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo

Experimental de Diabetes Induzida por Estreptozotocina – Teste de 28 dias

No presente estudo uma dose única de 60 mg/kg de STZ foi administrada para a

indução do diabetes nos animais. O diabetes induzido por STZ foi selecionado como um

modelo experimental por ser uns dos modelos de diabetes que mais se assemelha à

patologia humana (SARKHAIL et al., 2007; FERNANDES et al., 2010). Sinais como

hiperglicemia, hipoinsulinemia, polifagia, poliúria e polidipsia acompanhada de perda de

189

massa corporal são observados em animais que desenvolvem diabetes induzida por STZ, o

que também ocorre em seres humanos (HOLEMANS et al., 1997; THULESEN et al.,

1997; AKBARZADEH et al., 2007).

5.2.1 Massa Corporal

A indução de diabetes por STZ leva à perda severa na massa corporal, devido ao

aumento da perda de massa muscular, perda de proteínas teciduais e alteração do

metabolismo de carboidratos (CHEN; IANUZZO, 1982 apud GANDHI, 2011). Neste

estudo, a variação de massa corporal entre os animais diabéticos e não diabéticos pode ser

notada após 15 dias da indução do diabetes, quando a diferença foi estatisticamente

significativa entre os grupos (p < 0.001). A massa corporal do grupo sham e do grupo não

diabético tratado com a maior dose aumentou significativamente (cerca de 120g ao final de

28 dias de experimento). Já os ratos diabéticos mostraram redução acentuada do ganho da

massa corporal em comparação com ratos saudáveis (diferença de 76g entre controle

negativo diabético e grupo sham no final do experimento) (Fig. 42).

O tratamento dos animais diabéticos com o extrato aquoso de sementes de alpiste

não resultou em uma recuperação significativa da massa corporal, ficando muito próximo

do controle negativo (todos os animais diabéticos ganharam cerca de 52g até o fim do

experimento) (Fig. 43). Isto pode ser explicado devido à indisponibilidade de carboidratos

para o metabolismo energético, redução do tecido adiposo e a perda ou degradação de

proteínas estruturais (BALAMURUGAN; DURAIPANDIYAN; IGNACIMUTHU, 2011

apud MURALI, 2013; SARAVANAN et al., 2009; SUBRAMANI et al., 2014). Além

disso, o excesso de catabolismo de proteínas para proporcionar aminoácidos para

gliconeogênese durante a deficiência de insulina, resulta em perda de massa muscular e

perda de massa em pacientes diabéticos, neste caso ratos induzidos com STZ

(SUBRAMANI et al., 2014).

190

Variação da Massa Corporal

D0

D1

D3

D5

D8

D10

D12

D15

D17

D19

D22

0

50

100

150Controle Negativo com STZ

Dose 250 mg/kg com STZ



Dose 1000 mg/kg sem STZ

SHAM

***

Dias

Va

ria

ção

da

ma

ssa

co

rpo

ral

(g)

Figura 42. Variação da massa corporal durante o estudo de 28 dias.

Variação da massa corporal dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos,

tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg,

por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de teste de

Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. *** p<0.001.

Figura 43. Pesagem dos animais.


A perda de massa corporal dos animais doentes corrobora com a constatação de

Oyedemi et al., (2011a), que observou efeito semelhante em animais diabéticos induzidos

com estreptozotocina. No entanto, a administração oral de extrato aquoso da casca do caule

de Afzelia africana (Smith) foi capaz de manter o ganho de massa corporal dos animais. O

resultado indicou que o extrato possui a capacidade de gerir o nível de glicose, bem como

controlar a perda muscular e adipogênese induzida pelo modelo experimental (SHENOY;

RAMESH, 2002; OYEDEMI et al., 2011). O aumento da massa corporal em animais

191

tratados apoiam o efeito antidiabético de extratos, pois a condição diabética está associada a

perda de massa corporal (MAITI, 2004). No entanto, isso não pode ser observado para os

tratamentos com o extrato aquoso das sementes de alpiste.

Além disso, visualmente ratos saudáveis e diabéticos são distintos: as caudas dos

ratos saudáveis são rosa e recobertas por um veludo branco (AKBARZADEH et al., 2007).

Devido a indução de diabetes, a cauda torna-se de cor escura e manchada e sua pelagem

muda de branco aveludado para rosa ou cinza por trás da cabeça e na parte inferior do

corpo (AKBARZADEH et al., 2007). Se o ambiente dos ratos é mantido limpo, haverá uma

mudança de cor de branco para cor de rosa. Caso contrário a mudança será do branco ao

cinza (HOLEMANS et al., 1997; AKBARZADEH et al., 2007). Neste ensaio os ratos

diabéticos se apresentaram mais frágeis, raquíticos, com perda de pêlos, pelagem eriçada e

sem brilho, características bem diferentes dos animais saudáveis.

Gutierrez et al., (2014) avaliaram a ação do extrato hexânico de sementes de alpiste

em modelo de diabetes induzida por STZ em camundongos. Neste estudo, o tratamento oral

com a dose de 400 mg/kg, por 30 dias, inibiu a perda de massa corporal causada pela STZ.

Porém, não é possível fazer uma relação direta entre a composição química do extrato

hexânico e aquoso, o que sugere que na semente existem compostos de baixa polaridade

que poderiam apresentar efeito sobre as manifestações clínicas do diabetes e que

possivelmente foram concentrados após a extração com hexano.

5.2.2 Glicemia

A STZ é usada como um agente para induzir diabetes por efeito de citotoxicidade

seletiva em células β pancreáticas (NASTARAN, 2011 apud OYEDEMI et al., 2011). Sua

administração ocasiona destruição seletiva da célula β em várias espécies animais. A

produção se dá a partir da glicose da sua molécula como responsável pela incorporação da

metilnitrosuréia na célula β, a qual seria a indutora de citotoxicidade (BEDOYA et al.,

1996)

O inóculo de STZ foi eficiente em induzir aumento de glicemia, como pode ser

observado a partir da leitura D1, quando todos os grupos que foram inoculados com STZ

possuiam valores de glicemia maiores que os grupos que não foram expostos (sham e maior

dose sem STZ). Descartou-se uma possível ação do extrato sobre o aumento da glicemia

192

com os valores obtidos para o grupo tratado com 1000 mg/kg porém não induzido com

STZ, o que comprovou que o extrato por si só não elevou esse parâmetro (Tabela 8).

Em relação ao controle negativo, as doses maior e intermediária apresentaram

valores de glicemia menores nas leituras D7 (ambos) e D14 (dose intermediária), porém os

valores se igualam a partir da leitura D18. De maneira interessante, na leitura D28 o grupo

tratado com a menor dose do extrato apresentou valor de glicemia estatisticamente menor

que o grupo controle negativo, podendo ser uma tendência de manutenção dos índices

glicêmicos (Tabela 8).

A partir desses resultados pode-se inferir que o tratamento diário com extrato

aquoso de sementes de alpiste por via oral nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg não reduziu

os índices glicêmicos ou preveniu a hiperglicemia em ratos Wistar expostos à

estreptozotocina (60 mg/kg), durante 28 dias de experimento.

Tabela 8. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis

de glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 28 dias de experimento.

Grupos/Dias DO D1 D7 D14 D18 D24 D28

Sham 120 ± 0 120,0 ± 0 116,3 ± 4,5 128,0 ± 2,0 144,2 ± 13,5 129,2 ± 4,5 113,7 ± 4,0

Controle Negativo com STZ 120 ± 0 346,4 ± 13,3

***

529,3 ± 26,1

***

492,8 ± 26,1

***

543,1 ± 21,8

***

521,1 ± 27,3

***

546,8 ± 14,9

***

Dose 250 mg/kg com STZ 120 ± 0 391,4 ± 25,9

***

519,1 ± 31,1

***

420,6 ± 26,4

***

532,3 ± 28,2

***

457,2 ± 24,1

***

456,6 ± 21,2

***##

Dose 500 mg/kg com STZ 120 ± 0 398,5 ± 18,6

***

443,0 ± 22,5

***#

417,9 ± 15,7

***#

505,7 ± 19,0

***

494,6 ± 23,2

***

477,5 ± 21,5

***

Dose 1000 mg/kg com STZ 120 ± 0 378,6 ± 17,6

***

452,7 ± 24,5

***#

436,9 ± 24,7

***

508,9 ± 27,9

***

520,1 ± 26,6

***

498,6 ± 22,2

***

Dose 1000 mg/kg sem STZ 120 ± 0 120,0 ± 0

###

142,8 ± 16,5

###

122,0 ± 5,4

###

135,5 ± 15,1

###

125,0 ± 2,0

###

111,8 ± 3,2

###

Níveis de glicose sanguínea após jejum em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não

diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e

1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two-way ANOVA, seguido

de teste de Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. #

Diferente em relação ao grupo controle negativo *** p<0.001, ### p<0.001.

Diferente do que foi observado nesse estudo, Gutierrez et al., (2014) mostraram que

o tratamento com extrato hexânico de sementes de alpiste inibiu o aumento glicêmico

induzido pela STZ em modelo de diabetes severa e não-severa. Comparando com outros

dados da literatura que relatam a ação de produtos naturais, animais tratados com extrato

aquoso de sementes de Tamarindus apresentam redução significativa da glicemia em jejum

após 7 dias da indução do diabetes em ratos machos diabéticos induzidos com STZ

193

(MAITI, 2004). No estudo de Sales (2011) os níveis séricos de glicose foram maiores nos

ratos diabéticos ao final do período experimental quando comparados com os ratos não

diabéticos. A suplementação da ração com aveia, linhaça, gergelim e semente de girassol

não alterou a glicemia dos animais tratados em comparação com o grupo diabético sem

suplementação.

Tensão oxidativa no diabetes coexiste com uma redução na atividade antioxidante,

que pode aumentar ainda mais os efeitos deletérios dos radicais livres (COLLIER et al.,

1990 apud SINGH et al., 2005). Modelos diabéticos em animais experimentais

supostamente apresentam alto estresse oxidativo, devido à hiperglicemia persistente e

crônica (SINGH et al., 2005). A hiperglicemia, o principal sintoma do diabetes, não só

aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), mas também afeta os

antioxidantes. Com base nisso pode-se notar que as doses utilizadas de extrato aquoso de

sementes de alpiste não foram ideais para combater a hiperglicemia, portanto a produção de

EROs e o estresse oxidativo geralmente formados na doença podem estar presentes.

5.2.3 Consumos de Ração, Água e Poliúria

Antes e durante o experimento, os animais foram alimentados com dieta padrão de

laboratório (Biobase), com livre acesso à água. Como esperado para animais diabéticos

induzidos com STZ, foi observado aumento significativo no consumo de ração e água pelos

ratos diabéticos, em comparação com os grupos não-diabéticos (Fig. 44 e 45). Este fato é

resultado de uma redução crônica da captação de glicose e sua utilização pelas células,

além da perda considerável na urina, o que gera um estímulo persistente para comer e

beber.

194

1ª 2ª 3ª 4ª0

100

200

300

400


250 mg/kg com STZ

500 mg/kg com STZ

1000 mg/kg com STZ

1000 mg/kg sem STZ

SHAM

****** ******

Consumo de Ração

Semanas

Co

nsu

mo

(g

)

Figura 44. Consumo de ração durante as 4 semanas de experimento (28 dias).

Consumo de ração por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou

não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias.

Os resultados são expressos como média do grupo experimental.

O tecido hepático é sensível à insulina e desempenha um papel importante no

metabolismo da glicose, regulando a interação entre a utilização da glicose e a

gliconeogênese (SUBRAMANI et al., 2014). Estes processos são marcadores do diabetes

tipo 2 em humanos e animais, pois são consequência direta da deficiência de insulina

(SWANTSON-FLATT et al., 1990; OYEDEMI et al., 2011). De acordo com Wei (2003);

Murali (2013), animais diabéticos apresentam um estado de poliúria, aumento da ingestão

hídrica, desidratação, perda de massa corporal e muscular, perda excessiva de pêlos e

aumento da ingestão de alimentos.

De acordo com Sales (2011) o consumo alimentar, a ingestão hídrica e a diurese

apresentaram-se significativamente aumentados nos grupos de animais diabéticos quando

comparados com os animais saudáveis. Todos os grupos diabéticos tiveram o consumo

alimentar elevado quando comparado com o controle sadio.

As fibras, sobretudo as solúveis, aumentam o bolo fecal, a motilidade

gastrointestinal e a saciedade, reduzem a glicemia e a insulinemia pós-prandial (SILVA et

al., 2003), e melhoram a tolerância à glicose e o perfil lipídico (LOCK et al., 2005), o que

favorece o controle do DM por meio do controle do peso corporal, reduzindo o risco de

complicações do DM (LIU et al., 2003). Apesar de alguns estudos relatarem um aumento

da saciedade e redução do apetite após o consumo de dietas ricas em fibras. Os resultados

do presente estudo não evidenciaram tal efeito, o que pode ser explicado pelo fato do

extrato possuir uma quantidade baixa de fibras e também em relação a ausência de insulina

195

para promover a captação de glicose pelas células dependentes, sua ação contribuiu para a

manutenção de níveis elevados de glicemia e de estado de catabolismo aumentado, o que

resultou na perda de massa corporal e manutenção de polifagia, sintomas de DM

descompensado. As fibras têm reconhecidas propriedades antidiabéticas, sobretudo por

reduzir a absorção intestinal de colesterol e carboidratos sendo, por isso, amplamente

utilizadas no controle do DM (LINDSTRÖM et al., 2006).

1ª 2ª 3ª 4ª0

500

1000

1500


250 mg/kg com STZ

500 mg/kg com STZ

1000 mg/kg com STZ

1000 mg/kg sem STZ

SHAM

*** ****** ***

Consumo de Água

Semanas

Co

nsu

mo

(m

L)

Figura 45. Consumo de água durante as 4 semanas de experimento (28 dias).

Consumo de água por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não

com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os

resultados são expressos como média do grupo experimental.

A falta ou resistência de insulina provoca hiperglicemia, elevando a quantidade de

açúcar na urina, e para eliminar o excesso de glicose há a necessidade de urinar mais,

eliminando muita água, necessária para a diluição dessa glicose, ocasionando uma

desidratação. Para compensar a perda urinária de líquidos, o animal consome mais água

(polidipsia compensatória) (MOTTA, 2003). Poliúria e polidpsia são sinais típicos do

diabetes, que sobrecarrega a função dos rins acarretando em disfunção renal (TANG et al.,

2011).

De fato, logo na primeira semana de experimento observou-se que as caixas dos

animais que receberam STZ estavam mais úmidas, principalmente a dos animais diabéticos

que não receberam o extrato aquoso de sementes de alpiste, indicando poliúria (Fig. 46), o

que está diretamente relacionado com o aumento de ingestão de água apresentado na (Fig.

45).

196

Figura 46. Comparação das camas de maravalha quanto à poliúria.

A. Comparação das camas de maravalha na caixa sem uso, de animais sham e diabéticos. B. Comparação do

estado da maravalha 1 dia após a troca das caixas de animais diabéticos e não diabéticos.


Novamente os dados obtidos com o extrato aquoso de sementes de alpiste diferem

dos obtidos por Gutierrez et al., (2014) com o extrato hexânico das sementes, no tratamento

com 400 mg/kg por 30 dias, observou-se diminuição na incidência de poliúria e polifagia.


As análises bioquímicas são uma parte importante, que ajuda na identificação dos

órgãos-alvo e efeitos adversos (EVANS, 2009 cap. 14).

Os resultados foram analisados e comparados em relação ao grupo Sham (não-

diabético) e ao grupo controle negativo com STZ. Os valores de referência hematológicos e

bioquímicos em ratos não-tratados são dados de grande valor como ponto de partida para

diversos estudos, tais como as avaliações de efeitos farmacológicos e toxicológicos sobre

estes parâmetros (MELO, 2012). A administração de STZ em animais afeta não somente as

células β-pancreáticas, mas também pode levar à injúria renal, estresse oxidativo

inflamatório e disfunção do endotélio, portanto é de se esperar que existam alterações nos

perfis hematológico e bioquímico nos animais que receberam STZ (FRÖDE e MEDEIROS,

2008).

As enzimas são proteínas com propriedades catalisadoras sobre as reações que

ocorrem nos sistemas biológicos. Elas têm um elevado grau de especificidade sobre seus

substratos acelerando reações específicas sem serem alteradas ou consumidas durante o

processo. Os níveis de enzimas no plasma são normalmente avaliados como suporte na

detecção de hepato, cardio, neuro e miotoxicidade e toxicidade pancreática, enquanto que

197

na avaliação da nefrotoxicidade, usa-se medidas de enzimas urinárias. Em alguns casos, o

foco está na redução da atividade da enzima (EVANS, 2009 cap. 2).

A distribuição de enzimas varia entre os diferentes órgãos e tecidos corporais e pode

variar em diferentes tipos de células dentro de um órgão (CLAMPITT e HART, 1978;

BRAUN et al., 1983; LINDENA et al., 1986; MILNE e DOXEY 1986; DAVY et al., 1988;

EVANS, 2009 cap. 2).

A exposição a STZ com consequente aumento dos índices glicêmicos eleva também

os níveis das enzimas hepáticas TGO e TGP. Esse aumento não é prevenido pelo

tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, por 28 dias. Pode-se

observar uma tendência de aumento nos níveis da enzima ALP e também dos níveis de

triglicérides. O tratamento com a maior dose sem exposição de STZ não alterou nenhum

parâmetro bioquímico plasmático, sugerindo que as alterações são decorrentes da elevação

dos níveis glicêmicos e instalação da doença (Tabela 9).

Tabela 9. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos.

Análises/Grupos ShamControle Negativo

com STZ

Dose 250 mg/kg

com STZ

Dose 500 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

sem STZ

TGO 115,3 ± 11,4 402,0 ± 60,1 552,2 ± 105,6 * 494,6 ± 167,0 497,2 ± 97,9 * 150,6 ± 17,0

TGP 22,5 ± 0,8 213,7 ± 61,5 * 241,1 ± 41,8 * 211,6 ± 35,3 * 153,0 ± 23,1 28,4 ± 2,1

ALP 146,3 ± 10,5 286,5 ± 75,1 307,7 ± 85,7 323,0 ± 112,5 339,6 ± 119,7 132,0 ± 23,9

Uréia 86,6 ± 42,8 72,7 ± 6,3 76,2 ± 7,3 79,4 ± 5,0 81,8 ± 6,0 43,0 ± 1,5

Creatinina 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0

GGT 5,0 ± 0 7,4 ± 1,7 5,0 ± 0 5,0 ± 0 5,0 ± 0 5,0 ± 0

Colesterol 100,0 ± 0 101,8 ± 1,8 100,0 ± 0 100,5 ± 0,5 100,0 ± 0 100,0 ± 0

Triglicérides 90,9 ± 8,0 133,2 ± 15,5 117,6 ± 10,1 129,5 ± 15,0 149,5 ± 11,7 87,1 ± 8,9

Ácido Úrico 2,9 ± 0,7 2,1 ± 0,1 2,1 ± 0,1 2,3 ± 0,2 2,1 ± 0,1 2,3 ± 0,3

Níveis das diferentes enzimas, colesterol, triglicérides e ácido úrico em animais diabéticos (induzidos com

STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral,

nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One

way ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao

grupo Sham. * p<0.05.

As reações catalisadas pelas aminotransferases (transaminases) exercem papéis

centrais tanto na síntese como na degradação de aminoácidos, atuando como uma ponte

entre o metabolismo dos aminoácidos e carboidratos (MOTTA, 1998). Estas enzimas estão

amplamente distribuídas nos tecidos humanos. As atividades mais elevadas de TGO

encontram- se no miocárdio, fígado, músculo esquelético, com pequenas quantidades nos

rins, pâncreas, baço, cérebro, pulmões e eritrócitos (MOTTA, 1998). Da mesma forma a

198

enzima TGP, está largamente distribuída nos tecidos cardíaco, incluindo, tecidos

esqueléticos, hepáticos e renais (EVANS, 2009 cap. 2).

Apesar das enzimas transaminases TGO e TGP serem igualmente abundantes no

tecido hepático, a TGO apresenta concentração 20 vezes maior que a TGP no músculo

cardíaco. A TGP é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80%

da TGO está presente na mitocôndria. Porém, TGP é mais hepato-específica do que TGO,

sendo que o TGO pode ser normal ou estar discretamente alterada em doenças hepáticas

crônicas graves (THRALL, 2007 apud ESPESCHIT, 2010). Lesões ou destruição das

células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação e esta diferença tem auxiliado no

diagnóstico e prognóstico de doenças hepáticas. Em dano hepatocelular a forma

predominante no soro é a citoplasmática TGP, enquanto em lesões graves há liberação da

enzima mitocondrial TGO, elevando a relação TGO/TGP (MOTTA, 1998).

O estado de diabetes aumenta os níveis de quantidade sérica das enzimas hepáticas

TGO e TGP. Atividades elevadas de transaminases pode ser um sinal de alterações

hepáticas e doenças cardiovasculares e sendo observadas com maior fequência entre

pessoas com diabetes do que na população em geral (ARKKILA et al., 2001;

FERNANDES et al., 2010). Tais alterações são explicáveis por que essas enzimas são

requeridas quando há aumento do metabolismo energético, uma vez que desempenham um

importante papel na gliconeogênese (MORI et al., 2003 apud FERNANDES et al., 2010).

No estudo de Sales (2011) a avaliação de marcadores bioquímicos de metabolismo e

função hepática não revelou diferenças estatisticamente significativas nos níveis séricos de

TGO entre os grupos, exceto no grupo diabético com ração suplementada com aveia,

linhaça, gergelim, semente de girassol que apresentou aumento significativo nos níveis

séricos de TGO quando comparado com o grupo de animais normais. Quanto aos níveis de

TGP observou-se que, com exceção do grupo diabético tratado com ração suplementada

combinada com administração de concentrado de jatobá, os grupos de animais diabéticos

tratados e não tratados apresentaram níveis de TGP significativamente maiores em relação

aos animais normais. Este fato esta relacionado com a presença de antioxidantes que inibem

o aumento dos níveis séricos de TGO e TGP em ratos tratados com STZ (IMAEDA et al.,

2002; FERNANDES et al., 2010).

No estudo desenvolvido por Gutierrez et al., (2014), o extrato hexânico de sementes

de alpiste previniu o aumento da atividade dessas enzimas, o que pode estar correlacionado

199

ao menor dano hepático. Neste estudo com o extrato aquoso de alpiste os níveis de TGO e

TGP aumentaram, sendo que concentração utilizada de antioxidantes não garantiu a

prevenção.

O extrato aquoso de sementes de P. canariensis, como mostrado nesse estudo, não

exibe um efeito hepatoprotetor in vivo, estando os níveis de fosfatase alcalina (ALP)

também aumentados em todos os grupo tratados. ALP está amplamente distribuída nos

tecidos humanos, notadamente na mucosa intestinal, fígado (canalículos biliares), túbulos

renais, baço, ossos (osteoblastos) e placenta (MOTTA, 1998).

É bem sabido que ratos diabéticos mostram um aumento significativo na atividade

da ALP (SKILLEN et al., 1987; RAO; MORGHOM, 1986; WEISS; REDDI, 1980 apud

FERNANDES, et al., 1999; STEPAN et al., 1980). A ALP é uma enzima hidrolítica

intracelular que age sobre os fosfoglicerídios ou ésteres fosfóricos, completando sua

degradação com a liberação de fosfato. Alterações na atividade da fosfatase alcalina do soro

sanguíneo pode indicar, pelo menos em parte, incapacidade de excreção biliar ou lesão das

células hepáticas (SHERLOCK, 1985 apud apud JONG, 1996). Este aumento também pode

estar relacionado ao aumento de atividade nos osteoblastos, onde encontra-se em maior

concentração. Deve-se entretanto verificar a idade dos animais pois o aumento fisiológico

de atividade desta enzima ocorre no soro de ratos em crescimento. Valores normais de

atividade da fosfatase alcalina demonstrados por Ringler & Dabich (1979), oscilam entre o

máximo de 480 U/L, para ratos machos com 8 semanas de idade a 220 U/L para animais do

mesmo sexo com 7 meses (JONG, 1996).

O diabetes mellitus também está estritamente relacionada com outras anormalidades

metabólicas, tais como o perfil de lipídeos, caracterizada principalmente por níveis

elevados de colesterol total e triglicérides (VERGES, 1991; MERZOUK et al., 2000; SEFI,

2011), estando este útimo também elevado nos ratos diabéticos induzidos por STZ.

Associado a alterações profundas há um aumento também na uréia, creatinina e LDL, com

diminuição nos níveis de HDL, o que contribui para as doenças coronárias (ARVIND et

al., 2002 apud MARSLIN et al., 2014; CULLEN et al., 1999; FERNANDES et al., 2010).

Segundo Sales (2011) a análise do efeito do diabetes revelou níveis de uréia

significativamente maiores nos grupos de animais diabéticos controle e tratados quando

comparados com o grupo controle sadio. O tratamento com ração suplementada de aveia,

linhaça, gergelim, semente de girassol, com administração de concentrado de jatobá ou

200

administração de insulina não resultaram em redução na concentração sérica de uréia e

creatinina. A uréia sanguínea encontra-se elevada proporcionalmente ao nível de

desidratação. Entretanto, o grupo diabético tratado com insulina e o grupo com ração

suplementada combinada com o concentrado de jatobá apresentaram níveis

significativamente maiores de creatinina quando comparados com o grupo diabético

controle.

Uma elevação da creatinina, geralmente, ocorre simultaneamente com o aumento de

uréia no plasma, sendo muitas vezes mensurada não apenas para avaliar o

comprometimento dos rins, mas também como ponto final clínico de detecção de

tratamento relacionado a efeitos tóxicos de compostos no rim em modelo experimental de

diabetes com animais (TRAVLOS et al., 1996; SALES, 2011). Nenhum dos parâmetros

acima descritos (uréia, creatinina e colesterol total) encontraram-se alterados após 28 dias

da indução de diabetes, o que pode sugerir o desenvolvimento de uma forma mais branda

da doença (Tabela 9).

Diabetes induzida por STZ leva ao aumento dos níveis plasmáticos de colesterol,

triglicérides, ácidos graxos livres e fosfolipídeos. A deficiência ou resistência à insulina

pode ser o fator responsável por dislipidemias porque a insulina aumenta os índices de

ácidos graxos, bem como a síntese de triglicérides no tecido adiposo e fígado. Atua ainda

inibindo a lipólise, via desfosforilação (e, por conseguinte, a inativação) de lipases (GOHIL

et al., 2010 apud GUTIERREZ et al., 2014). Em ratos diabéticos, a utilização prejudicada

de carboidratos leva a lipólise acelerada, resultando em hiperlipidemia (MOREL;

CHISOLM, 1989; SAH, et al., 2011) e contribuindo para o desenvolvimento de

aterosclerose (STOUT, 1993; FERNANDES et al., 2010). A ação ineficiente da insulina

leva a um metabolismo celular deficiente, o que resulta em um aumento dos níveis

circulantes de triglicérides e uma diminuição na concentração de lipoproteína de alta

densidade (HDL). Prolongada hiperglicemia causa danos aos nervos, olhos, rins, coração e

os vasos sanguíneos. Cetoacidose pode ocorrer nestes doentes, como resultado do estresse,

tais como uma infecção, a administração de certos fármacos tais como corticosteróides e

desidratação (SARAVIA, 2005; DIAGNOSTICO, CLASIFICACION Y PATOGENIA DE

LA DIABETES MELLITUS, 2011 apud ORTIZ, 2012).

O aumento dos níveis de triglicérides séricos no presente estudo indica desarranjo

do metabolismo de lipídeos, o que pode contribuir com o aumento da incidência de

201

disfunção cardíaca nos ratos diabéticos. Elevação de lipídeos séricos indica tanto o defeito

na remoção ou superprodução de uma ou mais lipoproteínas (AKULA; KOTA;

GOPISETTY, 2003; FERNANDES et al., 2010). Apesar do extrato aquoso de sementes de

alpiste possuir em sua composição ácido graxo ômega 3, que pode contruibuir com a

redução dos níveis de triglicérides e LDL, o extrato aquoso de sementes de alpiste não

previniu o aumento desse parâmetro nos animais diabéticos, pois a porção encontrada foi

baixa 2,6%.

Schrijver & Privett (1982), estudando o efeito dos ácidos graxos de cadeia longa na

biossíntese de ácidos graxos insaturados em ratos, encontraram dados indicativos de que o

ácido eicosapentaenóico (20:5 n-3) e docosahexaenóico (22:6 n-3) diminuiram o

requerimento de ácido linoléico na dieta. A interação destes interfere no tipo e quantidade

de ácidos graxos de cadeia longa depositados no tecido animal e na regulação da

biossíntese de ácidos graxos poli-insaturados. Banerjee et al., (1992), concluiram que o

efeito hipolipidêmico depende da composição dos ácidos graxos poli-insaturados (n-3)

ingeridos (JONG, 1996).

A gama glutamil transpeptidase ou transferase (GGT) é uma enzima responsável

pelo catabolismo extracelular da glutationa (EMDIN et al., 2005). Pode ser produzida por

diferentes tecidos, porém a maior parte da GGT presente no soro provém do fígado

(EMDIN et al., 2005). Por mecanismo ainda não muito bem esclarecido, pacientes com

diabetes mellitus, hipertireoidismo, artrite reumatóide e doença pulmonar obstrutiva crônica

frequentemente apresentam valores aumentados de GGT. Pode-se inferir que os níveis

aumentados de GGT nesses pacientes está diretamente relacionado ao aumento do estresse

oxidativo, já que a glutationa é uma das principais enzimas antioxidantes (HAGHIGHI et

al., 2011). A avaliação dos níveis de GGT pode ser útil na determinação do risco para

desenvolvimento de diabetes tipo II em pacientes, havendo correlação direta entre aumento

de GGT e hemoglobina glicada, LDL e triglicérides (HAGHIGHI et al., 2011). Apesar da

direta correlação com o desenvolvimento do diabetes, em nosso estudo não foram

observadas alterações significativas nos níveis de GGT, havendo tendência de aumento no

grupo diabético não tratado (Tabela 9). Podendo o extrato aquoso apresentar um aumento

na capacidade antioxidantes dos animais.

O ácido úrico é um dos principais produtos do catabolismo de proteínas oriundas da

dieta e de fontes endógenas, concentrando-se principalmente no fígado. É principalmente

202

excretado pelo rim (urina) e os níveis séricos são determinados pela relação entre a dieta, a

produção endógena e os mecanismos de reabsorção e de excreção renal (DEL-FABRO,

2007). O aumento nos níveis de ácido úrico é decorrente do desequilíbrio entre sua

absorção e a excreção, podendo estar associado com patologias como diabetes mellitus e

distúrbios lipídicos. Em nosso estudo não foram observadas alterações nos níveis de ácido

úrico (Tabela 9).

5.2.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada

A avaliação de possíveis alterações de parâmetros hematológicos pode ser utilizada

para revelar o efeito tóxico de xenobióticos, incluindo extratos vegetais, sobre os

constituintes do sangue. Tais avaliações também são úteis na determinação de possíveis

alterações nos níveis de biomoléculas, tais como enzimas, produtos metabólicos,

hematologia, funcionamento dos órgãos (MAGALHÃES et al., 2008; OYEDEMI et al.,

2011).

Os exames hematológicos fornecem o perfil dos elementos celulares do sangue,

mostrando os valores quantitativos dos eritrócitos (hemácias), leucócitos e plaquetas, bem

como a concentração de hemoglobina, hematócrito (porcentagem de hemácias no sangue),

volume corpuscular médio (VCM - tamanho das hemácias), hemoglobina corpuscular

média (HCM - peso da hemoglobina dentro da hemácia) e concentração de hemoglobina

corpuscular média (CHCM – concentração de hemoglobina dentro da hemácia). No

presente estudo, após 28 dias de experimento o sangue foi coletado e processado para

avaliação dos principais parâmetros hematológicos (Tabela 10).

203

Tabela 10. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos.


com STZ

Dose 250 mg/kg

com STZ

Dose 500 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

sem STZ

Leucócitos Totais 6,1 ± 1,3 2,9 ± 0,4

***

3,9 ± 0,5 3,1 ± 0,4

*

2,6 ± 0,6

**

8,2 ± 0,5

###

Hemoglobina 16,2 ± 0,3 17,2 ± 0,2 17,6 ± 0,5

*

17,9 ± 0,2

**

17,4 ± 0,1 15,8 ± 0,2

#

Plaquetas 890,8 ± 34,4 696,6 ± 29,9 610,4 ± 86,8

*

640,7 ± 26,1

*

625,2 ± 63,0

*

889,7 ± 16,0

Hemácias RBC 8,4 ± 0,1 9,4 ± 0,1

**

9,5 ± 0,3

**

9,8 ± 0,1

***

9,6 ± 0,1

***

8,3 ± 0,1

##

Hematócritos HCT 45,5 ± 0,6 51,0 ± 0,5

***

51,8 ± 1,5

***

53,0 ± 0,5

***

51,9 ± 0,4

***

45,1 ± 0,4

###

VCM 54,2 ± 0,5 54,2 ± 0,5 54,7 ± 0,3 53,9 ± 0,3 54,1 ± 0,4 54,2 ± 0,2

HCM 19,3 ± 0,3 18,3 ± 0,2

**

18,6 ± 0,1 18,2 ± 0,2

**

18,2 ± 0,1

**

19,0 ± 0,1

CHCM 35,6 ± 0,2 33,8 ± 0,2

***

33,9 ± 0,2

***

33,7 ± 0,2

***

33,6 ± 0,1

***

35,0 ± 0,1

###

Hemoglobina Glicada 3,6 ± 0,1 4,9 ± 0,1

***

4,7 ± 0,1

***

3,9 ± 0,1

###

3,9 ± 0,1

###

4,3 ± 0,3

**

Hemograma de sangue total e perfil de hemoglobina glicada em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60

mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses

de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way

ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo

Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ### p<0.001.

O tratamento com STZ levou ao aumento da contagem de hemácias (RBC) e

hematócrito em todos os grupos, tratados ou não com alpiste, o que pode estar relacionado

com aumento dos níveis de glicemia ou a possível toxicidade da STZ. O aumento da

contagem de hemácias também pode ocorrer em casos de desidratação (perda de líquido),

pois há aumento da concentração do sangue ou quando ocorre produção excessiva

(policitemia) (HEMOGRAMA..., 2013).

Em nosso estudo todos os grupos foram manipulados da mesma forma a fim de

evitar a interferência do estresse como possível variável, visto que o estresse e anestesia

pode alterar significativamente alguns parâmetros hematológicos e bioquímicos. A tensão

causada pela manipulação e imobilização resulta frequentemente numa elevação de

hematócrito e alterações na contagem de glóbulos brancos, assim como as variações dos

níveis de glicose no sangue e certos hormônios (TECNICAS DE INOCULACION Y

SANGRIA DE ANIMALES, 2011 apud ORTIZ, 2012).

Ao contrário do que ocorreu com a contagem de hemácias e hematócrito, o

tratamento com STZ diminuiu a contagem de leucócitos totais, plaquetas, HCM e CHCM

em todos os grupos diabéticos, o que também pode estar relacionado com o aumento dos

níveis de glicemia ou a possível toxicidade da STZ.

http://www.labtestsonline.org.br/glossary/polycythemia

204

A STZ suprime o sistema imunitário e pode levar a danos em certos órgãos do corpo

(PAUL, 2011 apud OYEDEMI et al., 2011). Em nosso estudo a injeção intraperitoneal de

STZ nos ratos reduziu significativamente o número de leucócitos, sendo que tal redução

pode estar ligada a efeitos sobre o sistema imunológico (TORELL et al., 1986; OYEDEMI

et al., 2011). A contagem de glóbulos brancos e de seus índices relacionados não foram

restaurados ao normal após a administração do extrato de alpiste nas doses testadas.

As plaquetas, também conhecidas como trombócitos ajudam a mediar a coagulação

do sangue, o qual é uma malha de fibras de fibrina. As fibras aderem a qualquer abertura

vascular e assim, evitam o agravamento do coágulo de sangue. Ela desempenha um papel

crucial na redução da perda de sangue e reparação de lesão vascular (OYEDEMI et al.,

2010 apud OYEDEMI et al., 2011). A redução dos níveis de plaquetas em ratos diabéticos

induzidos com STZ foi confirmado neste estudo em relação à ratos controle não-diabéticos.

Redução a longo prazo deste parâmetro pode resultar em hemorragia interna e externa

(ADEBAYO et al., 2005; OYEDEMI et al., 2011).

De maneira geral o tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste não foi

eficaz em prevenir alterações no perfil de hemograma, já que os grupos tratados apresentam

as mesmas alterações do grupo controle negativo. Com relação ao tratamento com o extrato

em animais saudáveis não foi observada alteração nos parâmetros sanguíneos, como pode

ser observado no grupo tratado com maior dose e não exposto a STZ (Tabela 10).

De acordo com Espeschit, (2010), a faixa de variação de Hb sérica para rato é 11 a

19 g/dL. Sendo assim os resultados apresentados neste estudo estão dentro da faixa de

normalidade.

Os níveis de hemoglobina glicada (HbA1) são significativamente aumentados em

animais diabéticos, e este aumento é encontrado diretamente proporcional ao nível de

glicose no sangue em jejum (KOENIG et al., 1976 apud PARI; SATHEESH, 2006).

Durante o diabetes, o excesso de glicose presente no sangue reage com a hemoglobina.

Portanto, o nível total de hemoglobina é diminúida em ratos diabéticos (SHEELA;

AUGUSTI, 1992 apud PARI; SATHEESH, 2006).

A indução com STZ eleva os níveis de hemoglobina glicada, como pode ser

observado no grupo controle negativo e menor dose de extrato aquoso de sementes de

alpiste (Tabela 10). A hemoglobina glicada é um marcador do controle de glicose no

sangue, sendo um parâmetro de análise indireta da média dos níveis de glicose no sangue

205

ao longo dos últimos 120 dias em humanos, o que coincide com o tempo de meia-vida dos

eritrócitos. A glicação ocorrerá em maior ou menor grau, conforme o nível de glicemia

(ANDRIOLO e VIEIRA, 2008; GRUPO INTERDISCIPLINAR 2004; SACKS, 2006 apud

SUMITA e ANDRIOLO, 2008; SUMITA e ANDRIOLO, 2006). A hemoglobina glicada

permanece dentro das hemácias, e sua glicação não-enzimática é determinada

principalmente por três fatores: concentração média da glicose plasmática, tempo de meia-

vida da hemácia e permeabilidade da membrana do eritrócito à glicose (HIGGINS et al.,

1982; CAMARGO e GROSS, 2004).

A formação da hemoglobina glicada ocorre via uma reação de glicação não-

enzimática entre o grupo aldeído livre da glicose, ou outros açúcares, e um grupo amino

livre na molécula da hemoglobina. Esta reação é conhecida como reação de Maillard. A

reação envolve a formação de um composto intermediário instável (base de Schiff,

aldimina ou fração lábil), que se forma rapidamente e é proporcional à concentração de

glicose momentânea (BUNN et al., 1976; CAMARGO e GROSS, 2004). Este composto

sofre, lentamente, o rearranjo de Amadori e forma uma cetoamina estável e irreversível

(proteína glicada/GHb) (CAMARGO e GROSS, 2004).

Nos grupos tratados com as doses intermediária e maior não houve aumento dos

níveis de hemoglobina glicada, sugerindo uma ação protetora do extrato. Porém, o grupo

tratado com maior dose não exposto à indução com STZ também apresenta aumento nos

níveis de hemoglobina glicada.

Os resultados hematológicos demonstraram que os valores de referência dos ratos

da linhagem Wistar foram similares aos valores de referência para humanos, com exceção

da quantidade de hemácias e de plaquetas. Os ratos possuem uma quantidade maior destes

dois parâmetros hematológicos, o que confere maior viscosidade ao sangue e rápida

coagulação.

Assim os índices hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) que são calculados a

partir das hemácias, hemoglobina e hematócrito sofrem também uma pequena alteração

quando comparados aos valores de referência para humanos. Já em relação aos parâmetros

bioquímicos, o TGO ou AST, apresenta-se mais elevada, possivelmente pela influência da

anestesia e estresse muscular os quais os ratos são submetidos para a coleta de sangue.

206

5.2.6 Análise de Eletrólitos

O balanço iônico do líquido extracelular é principalmente regulado pelos rins. Para

melhor apreciar a importância destas regulações renais, basta fazer uma listagem parcial

das substâncias inorgânicas simples mais importantes que constituem o meio interno e

quais são reguladas pelo rim: água, sódio, potássio, cloreto, magnésio, sulfato, fosfato e íon

hodrogênio (VANDER et al., 1981 apud JAHN, 2004).

Sódio, potássio e cloro são íons monovalentes e exercem forte efeito iônico no

equilíbrio ácido-básico, sendo denominados de “íons fortes”. Esses íons são utilizados no

cálculo devido a sua importante participação no metabolismo animal, principalmente no

balanço osmótico, balanço ácido-básico, mecanismos de transporte em membrana e

integridade das membranas celulares (BLOCK, 1984).

O balanço dos eletrólitos, especialmente sódio e potássio, realizada pelos rins é

importante na regulação corpórea. Para manter esse balanço normal, a velocidade de

excreção do sódio e do potássio deve ser cuidadosamente controlada, de modo a

corresponder exatamente à sua ingestão diária. Outros eletrólitos também são encontrados

na urina, entre os quais figuram cálcio, magnésio e cloretos (CARNEIRO, 2012).

Entre as várias funções dos eletrólitos se destacam: manter a pressão osmótica e a

distribuição de água nos vários compartimentos do organismo, manter o pH fisiológico,

regular a função apropriada do coração e músculos, envolvimento nas reações de oxidação-

redução (transferência de elétrons) e participar da catálise como cofatores para as enzimas.

Assim sendo, torna-se óbvio que níveis elevados de eletrólitos e oligoelementos podem ser

a causa ou a consequência de várias desordens (MOTTA, 2003).

A urina é uma solução complexa e um meio eficiente para a eliminação de produtos

de excreção do organismo. É a principal rota pela qual se eliminam produtos metabólicos

(uréia e creatinina), minerais (cálcio, fósforo e magnésio), eletrólitos (sódio e potássio) e

água. Desempenha papel importante na regulação do balanço de líquidos e no equilíbrio

entre ácidos e bases. A urina é composta aproximadamente por 95% de água e 2% de uréia.

Nos 3% restantes, encontram-se fosfato, sulfato, amônia, magnésio, cálcio, ácido úrico,

creatina, sódio, potássio e outros elementos. O pH urinário varia como consequência da

manutenção homeostática do equilíbrio acidobásico (DIBARTOLA, 2006).

O transporte de vários solutos através do epitélio renal pode ser feito por mecanismo

passivos a favor de um gradiente eletroquímico ou por processos ativos específicos

207

localizados na membrana da célula tubular. Os vários sistemas de transporte são

independentes e um importante mecanismo como a reabsorção ativa de sódio, que utiliza

uma fração do suprimento energético total do rim, exerce uma significativa influência no

gradiente eletroquímico através do epitélio tubular renal, que passa afetar o transporte

passivo de água e demais solutos, promovendo a energia necessária para a reabsorção de

várias substâncias, como glicose e aminoácidos (MALNIC & MARCONDES, 1986 apud

JAHN, 2004).

Perdas perceptíveis de água corporal são aquelas que são facilmente detectadas,

mensuradas e podem ocorrer por meio do trato urinário e gastrointestinal. Tais perdas de

água normalmente são acompanhadas de perda de eletrólitos, sendo considerada perda

isotônica. A poliúria resulta em aumento das perdas perceptíveis. Um animal normal tem

em torno de 20 a 30 ml/kg/dia de perdas perceptíveis e imperceptíveis. Perdas urinárias e

gastrointestinais resultam em perda de eletrólitos e água, incluindo sódio, potássio, cloreto

e bicarbonato (FLUIDOTERAPIA... 2014). A associação entre a perda de água e eletrólitos

e a ausência de ingestão hídrica adequada pode resultar em desidratação e, por conseguinte,

insuficiência circulatória periférica (PITANGA, 2004 apud SALES, 2011). A poliúria,

aumento gerado no volume urinário, acompanhada da excreção renal de sódio e água, torna

o animal desidratado, desencadeando consequentemente a polidpisia no animal (ÉVORA et

al., 1999 apud SILVA, 2011).

Devido à relação existente entre diabetes e o aumento do fluxo urinário (poliúria),

avaliou-se o perfil de eletrólitos na urina dos animais (Tabela 11).

Tabela 11. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.

Eletrólitos/Grupos ShamControle Negativo

com STZ

Dose 250 mg/kg

com STZ

Dose 500 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

sem STZ

Na Urina 68,5 ± 12,5 80,6 ± 17,5 85,0 ± 12,7 55,0 ± 11,9 79,1 ± 10,2 40,5 ± 15,0

K Urina 42,3 ± 13,4 62,9 ± 10,2 54,1 ± 11,5 80,4 ± 5,9 55,2 ± 6,6 36,8 ± 1,0

Na Sangue 136,8 ± 0,5 128,8 ± 0,7

***

127,7 ± 0,8

***

127,2 ± 1,1

***

127,5 ± 1,0

***

137,0 ± 0,9

###

K Sangue 4,0 ± 0,1 5,6 ± 0,3 5,6 ± 0,4 5,9 ± 0,5

*

6,1 ± 0,4

*

4,4 ± 0,2

Ca Sangue 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,2 ± 0 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,3 ± 0

Perfil de eletrólitos no sangue e urina dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não

diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e

1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido

de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. # Diferente

em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ### p<0.001.

208

Alterações da ingestão de líquidos afetam o equilíbrio de eletrólitos no plasma

(CLAUSING e GOTTSCHALK 1989; BOEMKE et al., 1990 apud EVANS, 2009 cap. 12;

HAMMOND et al., 1998).

A glicosúria aumenta o volume urinário excretado (poliúria) e osmolaridade

urinária, levando ao aumento da excreção de água e eletrólitos, como cloreto, sódio e

potássio, processo denominado diurese osmótica (BAILEY, 2011). Além de reduzir a

volemia e causar desidratação, a diurese osmótica acarreta alterações nos túbulos

contorcidos proximais renais, bem como lesão glomerular como consequente prejuízo na

filtração (BAILEY, 2011).

Em geral os animais expostos à STZ apresentam tendência de aumento de sódio e

potássio na urina, o que pode ter relação direta com o aumento do fluxo urinário, já que

grande parte dos processos de reabsorção e excreção de eletrólitos ocorre no rim.

O sódio sob forma ionizada é um dos principais fatores de regulação osmótica do

sangue, plasma, fluidos intercelulares e do equilíbrio ácido-base é essencial à motilidade e à

excitabilidade muscular e na distribuição orgânica de água e volume sangüíneo.

A hipernatremia (excesso de sódio no sangue) ocorre na desidratação hipertônica, no

diabetes insipidus e em comas hiperosmolares, entre outras situações. A hiponatremia pode

se manifestar na síndrome nefrótica, na insuficiência cardíaca, na desidratação hipotônica,

na secreção inapropriada de hormônio antidiurético e em nefropatias com perda de sódio

(FLUIDOTERAPIA... 2014).

As mudanças no equilíbrio hídrico são as principais responsáveis pelas mudanças na

concentração de sódio. A hipernatremia está quase sempre associada à elevação da

osmolaridade no plasma. Ocorre em animais desidratados quando as perdas de água

excedem as perdas de eletrólitos. Observa-se hipernatremia em estágios iniciais de vômito,

diarréia e doença renal, queimaduras cutâneas, causas iatrogênicas (ex. nutrição parenteral,

uso exagerado de diuréticos), respiração ofegante por calor ou exercício físico intenso,

diabetes insipidus, diabetes mellitus, hiperaldosteronismo por tumor adrenal

(FLUIDOTERAPIA... 2014).

A hipocalemia pode ser sequela de doença ou tratamento. Baixos níveis de potássio

estão relacionados com perdas gastrointestinais por vômito ou diarreia, perdas renais por

alteração da função tubular renal, deficiência de potássio na dieta, movimento de potássio

do líquido extracelular (LEC) para o líquido intracelular (LIC) em alcalose aguda, uso

209

exagerado de diuréticos, hiperadrenocorticismo, tratamento inadequado de insulina em

diabéticos. Pode ocorrer pseudohipocalemia em casos de hiperlipidemia, hiperproteinemia,

hiperglicemia e azotemia. Sinais clínicos incluem debilidade muscular, arritmias cardíacas,

poliúria e câimbras. As causas mais comuns de hipercalemia são a translocação de potássio

entre espaços, comprometimento da excreção renal (ex. insuficiência renal crônica,

hipoadrenocorticismo), iatrogênica devido a fluidoterapia com potássio em excesso, uso de

digitálicos ou diuréticos poupadores de potássio (FLUIDOTERAPIA... 2014).

O teste tem utilidade na avaliação do equilíbrio hidroeletrolítico e acidobásico. A

monitorização do potássio sérico auxilia o acompanhamento de indivíduos em terapia com

diuréticos, de nefropatias, principalmente com insuficiência renal, de cetoacetose diabética

e de insuficiência hepática. O exame ajuda a avaliar quadros de hiperaldosteronismo

primário ou secundário e de hipoaldosteronismo.

Os animais induzidos com STZ apresentam diminuição significativa de Na+ no

sangue quando comparados ao controle sem tratamento e sadio. Não houve diferença entre

os grupos diabéticos. Os animais saudáveis tratados com maior dose não apresentaram

diminuição de Na+, havendo diferença em relação ao controle negativo induzido.

O sódio (Na+) é encontrado principalmente no fluido extracelular (FEC), tendo

grande participação na regulação de seu volume e da pressão osmótica (osmolalidade). O

volume do FEC é determinado pela quantidade total corpórea de sódio, ao passo que a

osmolalidade e a concentração de sódio no FEC são determinadas pelo balanço hídrico. Na

regulação do sódio e da água corpórea é de suma importância a influência da aldosterona,

hormômio anti-diurético, angiotensina, catecolaminas e peptídeo atrial natriurético nos rins

(MANUAL ... 2012).

O aumento da concentração plasmática de sódio (hipernatremia) é resultante do

aumento de sua ingestão, ou diminuição do consumo e perda excessiva de água. Ao

contrário, a diminuição da concentração plasmática de sódio (hiponatremia) resulta do

aumento de sua perda ou hiperidratação (MANUAL ... 2012).

Outras causas são: hiperadrenocorticismo (doença de Cushing), restrição ao

consumo de água, intoxicação por sal, perda excessiva de água pura (hiperventilação ou

diabetes insípido), perda de fluidos hipotônicos (insuficiência renal, diurese pós-obstrutiva,

diabetes mellitus) e administração exagerada de soluções hipertônicas e de bicarbonato de

sódio. Os sinais clínicos da hipernatremia podem aparecer quando os níveis plasmáticos

210

estão acima de 170 mmol/L e compreendem em fraqueza, sede extrema, irritabilidade,

depressão, ataxia, mioclonias e coma (MANUAL ... 2012).

Os animais diabéticos tratados com 500 e 1000 mg/kg apresentaram aumento

significativo de K+ no sangue comparados ao controle. Não houve diferença entre os grupos

diabéticos. Os animais saudáveis tratados com menor dose não apresentaram aumento de

K+.

O potássio (K+) é encontrado quase que em sua totalidade no meio intracelular,

sendo que somente 5% estão presentes no FEC. Esse cátion é responsável pelas

manutenções do volume intracelular e do potencial de membrana, e as concentrações

intracelular de potássio e extracelular de sódio são mantidas ativamente pela bomba de

sódio-potássio-ATPase, cuja função é levar o potássio para o interior da célula e o sódio

para o exterior. As alterações nas funções das células eletricamente excitáveis (tecido

nervoso e muscular) iniciam-se em concentrações superiores a 6,5 mmol/L ou abaixo de

2,5mmol/L, quando ocorrem desequilíbrios entre as concentrações intra e extracelulares

desse íon. A regulação da concentração plasmática do potássio é feita principalmente pelos

rins; 90% a 95% é excretado pela urina e 5% a 10% pelas fezes, suor e saliva, sendo que a

aldosterona é o hormônio que participa dessa regulação. A diminuição da concentração

sérica do potássio (hipocalemia, hipopotassemia) é uma das alterações eletrolíticas mais

comuns em pequenos animais, e é devido à ingestão insuficiente, perda excessiva ou

redistribuição do potássio extracelular. Diabetes mellitus (falta de insulina) e uso de ß-

bloqueadores podem elevar os níveis plasmáticos de potássio (MANUAL ... 2012).

O cálcio (Ca) é um mineral que tem importância na manutenção da homeostase,

tendo funções na contração muscular, coagulação sanguínea, atividade enzimática,

excitabilidade neuronal e secreção hormonal, além de ser o componente principal estrutural

do tecido ósseo. O cálcio é regulado pelo paratormônio (PTH), calcitonina e vitamina D,

portanto, alterações nesses hormônios causam o aumento (hipercalcemia) ou a diminuição

(hipocalcemia) do cálcio plasmático. A maior parte do cálcio corpóreo se localiza na matriz

óssea inorgânica (99%), e o restante encontra-se na membrana plasmática e retículo

endoplasmático celular (0,9%) e no FEC (0,1%). Desse total de cálcio extracelular, cerca de

56% correspondem à forma biologicamente ativa desse mineral (cálcio ionizado – Ca2+). O

restante (34%) pode ser dividido em cálcio ligado à proteína albumina e cálcio quelado com

ânions, como por exemplo, citrato, fosfato, bicarbonato e lactato (10%). Essas duas últimas

211

frações, por serem biologicamente inativas, podem sofrer reduções quantitativas, com

diminuição da quantidade total de cálcio, sem que ocorram alterações clínicas

significativas, portanto, faz-se importante a mensuração do Ca2+ (MANUAL ... 2012).

5.2.7 Peso Relativo dos Órgãos

Tabela 12. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos

dos animais induzidos ou não com STZ.

Órgãos/Grupos ShamControle Negativo

com STZ

Dose 250 mg/kg

com STZ

Dose 500 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Dose 1000 mg/kg

sem STZ

Coração 0,292 ± 0,010 0,378 ± 0,007

***

0,367 ± 0,007

***

0,373 ± 0,007

***

0,376 ± 0,007

***

0,312 ± 0,009

###

Fígado 3,158 ± 0,124 3,910 ± 0,104 3,949 ± 0,065 3,995 ± 0,052 5,438 ± 1,515 3,257 ± 0,099

Rins 0,592 ± 0,008 0,986 ± 0,026

***

0,998 ± 0,024

***

0,997 ± 0,017

***

0,988 ± 0,029

***

0,595 ± 0,016

###

Baço 0,230 ± 0,009 0,220 ± 0,004 0,221 ± 0,007 0,228 ± 0,012 0,223 ± 0,007 0,236 ± 0,010

Adrenais 0,013 ± 0,002 0,020 ± 0,007

**

0,020 ± 0,001

**

0,019 ± 0,001

*

0,018 ± 0,001 0,012 ± 0,002

###

Peso relativo dos órgãos dos animais normais e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou

não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da relação peso do órgão/100 g de peso do animal.

One way ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação

ao grupo Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ###

p<0.001.

Em geral existe aumento do peso relativo do coração, rins e adrenais nos animais

expostos a STZ (Tabela 12). Não foram observadas alterações hepáticas ou esplênicas,

conforme confirmado pelas análises histopatológicas. O tratamento com a maior dose de

alpiste também não levou a alterações de peso de órgãos.

O coração apresenta um esqueleto de tecido conjuntivo que sustenta e dá inserção a

musculatura. Seu aumento, no conteúdo total, tem sido evidenciado com o avanço da idade

e em determinados estados patológicos, tal como o diabetes mellitus. Uma das principais

causas de morte em diabéticos é a isquemia cardíaca devida a lesões das coronárias. Neles

as plaquetas tendem a agregar-se mais facilmente por causa da glicolisação do colágeno, já

que produzem um fator de crescimento que estimula a proliferação das células musculares

dos vasos. Além disso, a glicolisação do colágeno aumenta a espessura da membrana basal,

estreitando os vasos (DINIZ et al., 2011).

Segundo Ortolan et al., (2010) ao pesquisar o rim de ratos induzidos ao diabetes por

STZ evidenciou, após 50 dias da indução, aumento no peso dos rins, no comprimento dos

212

túbulos contorcidos proximais e no comprimento dos túbulos contorcidos distais, os quais

se mostraram anormais no córtex e na faixa externa da medula.

Reinckle et al., (1996), sugerem que talvez a própria hiperinsulinemia, encontrada

com maior acúmulo de gordura visceral, e a hiperatividade do hipotálamo-hipofisário-

adrenal (HHA), estimulariam o aumento do volume das adrenais o que culminaria num

ciclo vicioso: hiperatividade HHA - aumento das adrenais - aumento da gordura visceral -

resistência à insulina - hiperinsulinemia - maior aumento das adrenais.

5.2.8 Histopatologia

O diabetes é uma doença resultante de uma interação variável de fatores hereditários

e ambientais, e é caracterizada por secreção anormal de insulina ou receptor de insulina ou

eventos pós-receptores que afetam o metabolismo, envolvendo carboidratos, proteínas e

lipídeos, além de danificar o fígado, rim e células do pâncreas (BAYNES, 1991; SINGH et

al., 2005).

A STZ por meio da ação de radicais livres produz efeitos tóxicos no pâncreas, rins e

fígado, sendo muitas vezes difícil determinar se a hepatotoxicidade observada é ocasionada

pela hiperglicemia, pelos efeitos tóxicos e específicos da STZ sobre o tecido hepático ou

pela combinação desses dois fatores (OKAWA; DOI, 1983 apud SALES, 2011).

O pâncreas endócrino pode ser avaliado por meio do exame histológico das ilhotas

pancreáticas. As alterações observadas nos cortes histológicos corados por

hematoxilina/eosina são sutis e a avaliação quantitativa, tecnicamente difícil. A porção

endócrina do pâncreas (ilhotas de Langerhans) compreende entre 1% e 2% das células

medindo entre 100 e 200 μm de diâmetro, das quais, no pâncreas normal, 80% são células

β, 15% células α e 4% células δ. As alteraçoes regenerativas das ilhotas podem ser

observadas em animais tratados com químicos diabetógenos, podendo ser observadas em

neonatos, após agressão tóxica. A hiperplasia das ilhotas pode ser observada tanto em

animais com idade avançada (espontaneamente) como em animais tratados com químicos.

Apoptose é um evento comum em animais diabéticos insulino dependentes após tratamento

com múltiplas doses subdiabetogênicas de estreptozotocina. Na administração de

estreptozotocina em dose única e elevada (200mg/kg), esperam-se alterações morfológicas

com destruição completa das células β-pancreáticas, entretanto na administração de 40

mg/kg diariamente, espera-se insulinite por linfócitos. A administração da estreptozotocina

213

provoca lesão grave do pâncreas, tal como uma diminuição do diâmetro das ilhotas do

pâncreas, provavelmente devido a redução do número β células (SEFI, 2011). De acordo

com Chávez et al. (2007), a aplicação de estreptozotocina em ratos produz uma diminuição

no número de ilhotas no pâncreas.

A fim de avaliar possíveis alterações nos animais induzidos com STZ e tratados

com extrato aquoso de sementes de alpiste, os rins, pâncreas e fígados dos animais foram

submetidos à análise histopatológica (Fig. 47). A avaliação foi feita por patologista e de

maneira cega, ou seja, sem identificação dos grupos no momento da análise.

Grupo: Sham (controle)

Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas

radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve

fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.

Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes multinucleadas em polpa

vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada. Glomérulos normocelulares.

Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos

mostram tecido pancreático dentro dos limites da normalidade, com distintos componentes

exócrinos e endócrinos. O componente exócrino, é composto por células epiteliais com

formato piramidal e orientadas radialmente em torno de um lúmem central e o componente

endócrino exibe pequenos aglomerados de células de Langerhans. Várias ilhotas com

grande tamanho, sugerindo hiperplasia. Alguns apresentaram poucas ilhotas de Langerhans,

sugerindo diminuição numérica. Microcistos intra-insulares.

Grupo: Controle Negativo com STZ (sem tratamento)


radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Alguns

apresentando leve fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve

portal e sinusoidal. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes

multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.

Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular.

Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da

normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,

é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno

214

de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de

Langerhans. Alguns com poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.

Microcistos intra-insulares. Fibrose focal e focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans.

Alteração de tamanho nas ilhotas, sugerindo hiperplasia.

Grupo: Menor dose com STZ (250mg/kg extrato aquoso de sementes de alpiste)




Alguns com leve alteração vacuolar hepatocítica Baço: Congestão discreta com frequentes

células gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular

preservada. Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio

tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da




Langerhans. Alguns com poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.

Outros com linfonodos. Microcistos intra-insulares. Necrose focal nas ilhotas de

Langerhans.

Grupo: Dose intermediária com STZ (500 mg/kg extrato aquoso de sementes de

alpiste)




Alguns com infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal. Moderada alteração vacuolar

hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes multinucleadas em

polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada. Glomérulos

normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes

histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da normalidade, com distintos

componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino, é composto por células

epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno de um lúmem central e

o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de Langerhans. Alguns

215

com focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Microcistos intra-insulares. Outros com

linfonodos. Poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.

Grupo: Maior dose com STZ (1000 mg/kg extrato aquoso de sementes de alpiste)




Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células

gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.






Langerhans. Linfonodos. Microcistos intra-insulares. Necrose focal nas ilhotas de

Langerhans. Alguns apresentam poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição

numérica. Outras com focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Necrose focal nas

ilhotas de Langerhans.

Grupo: Maior dose sem STZ (não diabéticos tratados com 1000 mg/kg extrato

aquoso de sementes de alpiste)




Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células

gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.






Langerhans. Alguns apresentaram várias ilhotas com grande tamanho, sugerindo

hiperplasia. Outras poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.

216

Figura 47. Principais alterações encontradas nas análises histopatológicas do Pâncreas, Fígado e Rins. A:

Pâncreas: hiperplasia da ilhota pancreática (400x); B: Pâncreas: microcistos (400x); C: Pâncreas: necrose,

apoptose e fibrose (200x); D: Diminuição do tamanho das ilhotas pancreáticas; E: Fígado: ectasia ductal

(100x); F: Figado: fibrose portal leve (400x); G: Figado: infiltrado leve sinusoidal (400x); H: Rim: leves

alteraçoes degenerativas do epitélio tubular (400x).

Fonte: CITOCAMP, 2014.

A análise histopatológica mostra que não existem diferenças significativas entre os

grupos induzidos com STZ. Em geral todos os fígados e rins têm algum tipo de lesão, as

quais provavelmente ocorreram na retirada e manipulação do órgão. Esses dados estão de

acordo com os resultados da análise bioquímica, onde também são observadas poucas

alterações significativas nos níveis das enzimas relacionadas à atividade hepática e renal.

Apesar de haver aumento no peso dos rins de grupos que receberam STZ, não existem

alterações morfológicas relacionadas.

Quanto o pâncreas, em geral os animais expostos à STZ apresentam focos de

necrose e apoptose, diminuição numérica de ilhotas de Langerhans, hiperplasia das ilhotas e

microcistos intra-insulares, porém pode-se concluir que a administração de dose única de

STZ (60 mg/kg) não foi suficiente para causar grandes alterações nesse órgão, já que o

laudo final das análises considera o pâncreas morfologicamente normal.

A partir dos dados do experimento de 28 dias após indução de diabetes com dose

única de 60 mg/kg de estreptozotocina pode-se concluir que o tratamento diário com o

extrato aquoso de sementes de alpiste o “leite de alpiste” nas doses de 250, 500 e 1000

mg/kg, por via oral, não preveniu o aumento da glicemia, perda de massa corporal ou

alterações hematológicas e bioquímicas induzidas pela estreptozotocina. Por outro lado, o

tratamento dos animais normais com 1000 mg/kg de “leite de alpiste” por 28 dias não

G

A B C D

E F H

217

promoveu perda de massa corporal ou alterações hematológicas e bioquímicas, o que

sugere ausência de toxicidade.

Como não foi possível ver alterações expressivas além do aumento de glicemia e

perda de massa corporal após 28 dias de experimento, realizou-se um segundo experimento

a longo prazo, por 87 dias, onde comparou-se animais diabéticos não tratados com animais

diabéticos tratados com 1000 mg/kg do extrato, diariamente.

5.3 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo

Experimental de Diabetes Induzida por Estreptozotocina – Teste de 87 dias.

O teste de longa duração foi realizado com intuito de observar as possíveis

complicações decorrentes da indução do diabetes e se o tratamento com a maior dose do

extrato exerceria alguma ação protetora.

Ao longo dos 87 dias de experimento os animais induzidos com STZ tratados ou

não com extrato aquoso de sementes de alpiste, apresentaram-se apáticos, com perda

excessiva de massa corporal, pêlos arrepiados e sem brilho, agressividade, odor forte da

urina, poliúria, polidipsia, polifagia, além da perda gradativa da visão (formação de

cataratas) (Fig. 48).

No entanto, estes animais sobreviveram até o final do experimento. Já no grupo não

diabético (Sham) os animais apresentaram-se ativos, com apetite normal, tônus e reflexos

conservados, ganho progressivo de peso e manutenção da ingestão hídrica, ingestão

alimentar e diurese, dentro dos padrões de normalidade para a espécie e em conformidade

com outros trabalhos (BREKKE et al., 1981 apud LERCO et al., 2003).

Figura 48. Comparação entre os tamanhos dos ratos diabéticos (menores) e não diabéticos (maiores).


218

A poliúria, uma das características do estado hiperglicêmico, ocorreu devido ao

aumento elevado da concentração de glicose no filtrado glomerular, excedendo a

capacidade das células tubulares em reabsorvê-la e dando origem à diurese osmótica. Esse

mecanismo tem sido o responsável pela produção de grande volume de urina com elevada

osmolaridade (LERCO et al., 2003). Foi detectada pela presença da cama de maravalha

sempre molhada necessitando a troca diária e redistribuição de menor número de animais

por caixas.

A polidipsia presente nos animais diabéticos deve-se à hiper-osmolaridade

sanguínea, em razão de altos níveis de glicose circulante, que faz a água passar do meio

intracelular para o extracelular, a fim de manter o equilíbrio osmótico. A desidratação

intracelular é percebida pelos osmorreceptores cerebrais, desencadeando sede intensa.

Essas alterações estiveram associadas, ainda, à debilidade geral, pouca atividade, queda de

pêlos, distensão abdominal, catarata bilateral. Esses quadros foram relatados por Lee et al.,

(1972); Ueda et al., (1979); Brekke et al., (1981); Calderon, (1988); Spadella, (1989) e

Breim, (1990) apud Lerco et al., (2003), em estudos com o diabetes induzido por aloxana

ou pela estreptozocina.

Condições hiperglicêmicas em condições experimentais são conhecidas por

causarem alterações lenticulares (KONOSHITA, 1986 apud SINGH et al., 2005). No

diabetes, ocorre aumento das concentrações tanto da frutose quanto do sorbitol, o que pode

acarretar em catarata do diabético. A via do sorbitol, ausente no fígado, é responsável pela

formação de frutose a partir de glicose, e aumenta sua atividade quando aumenta a

concentração de glicose no diabetes, naqueles tecidos que são insensíveis à insulina, isto é,

o cristalino, os nervos periféricos e os glomérulos renais. O sorbitol não se difunde

facilmente através da membrana celular o que ocasiona prejuízo osmótico (MURRAY et

al., 2006). Estas alterações, incluindo o aumento dos níveis de sorbitol, permeabilidade

alterada da membrana, perda de GSH, diminuição dos níveis de aminoácidos e síntese de

proteína diminuída, eventualmente, levam à formação de catarata (POLLOCK et al., 1999;

SINGH et al., 2005). Nos animais deste experimento o surgimento de catarata foi evidente

(Fig. 49).

219

Figura 49. Avaliação oftalmoscópica e comparação dos animais sem alterações e com cataratas.


No experimento de 28 dias os animais não apresentaram alterações nos olhos, já no

teste de 87 dias a maioria apresentou alterações, as quais foram identificadas através do

aparelho oftalmoscópio (Tabela 13). A pontuação e análise da incidência de catarata foram

realizadas com auxílio da médica veterinária Msc. Karin Maia Monteiro.

Tabela 13. Avaliação das alterações nos olhos dos animais do experimento de 87 dias.

Animal Olho Esquerdo Olho Direito Animal Olho Esquerdo Olho Direito

383 +++ opacidade sem alteração 390 sem alteração sem alteração

378 sem alteração ++ opacidade 321 +++ opacidade +++ opacidade

376 + opacidade sem alteração 387 + opacidade aumento de vascularização

323 sem alteração sem alteração 391 + opacidade sem alteração

364 + opacidade + opacidade 397 ++ opacidade +++ opacidade

393 + opacidade + opacidade 320 sem alteração sem alteração

386 + opacidade +++ opacidade 367 + opacidade + opacidade

374 +++ opacidade +++ opacidade 337 aumento de vascularização aumento de vascularização

Animais diabéticos sem tratamento Animais diabéticos tratados com dose 1000 mg/kg

Estudos anteriores demonstraram que os antioxidantes podem retardar

significativamente o desenvolvimento de catarata (POLLOCK et al., 1999; ORHAN et al.,

1999; SINGH et al., 2005), neste estudo não foi observado este efeito.

5.3.1 Massa Corporal

No gráfico abaixo podemos perceber uma pequena variação positiva no grupo de

animais diabéticos que receberam o extrato aquoso de sementes de alpiste na dose de 1000

mg/kg ao longo de 87 dias, porém essa diferença não teve significância estatística nos

tempos avaliados. Ao final de 87 dias a média de massa corporal dos animais não tratados

foi de 288,8 ± 9,5 enquanto que no grupo que recebeu tratamento foi de 307,5 ± 36, valores

que são inferiores ao de animais normais com mesma idade, que é de 513,9 ± 13. Portanto,

pode-se dizer que o menor ganho de massa corporal nos grupos controle negativo e tratados

220

com o extrato está relacionado com a administração de STZ. É de se esperar que os ratos

conforme vão ficando mais velhos, tendem a aumentar sua massa, devido ao metabolismo,

muito parecido com o que ocorre com seres humanos, mas quando induzidos ao diabetes

pela STZ isso acaba gerando efeito contrário, devido a ação tóxica dessa substância (Fig.

50).

D0

D1

D8

D15

D24

D31

D38

D44

D51

D62

D70

D76

D85

0

50

100

150

Controle Negativo com STZ


Variação de Massa Corporal

Dias

Vari

açã

o d

a m

ass

a c

orp

ora

l (g

)

Figura 50. Variação de massa corporal durante o estudo de 87 dias.

Variação da massa corporal dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos,

tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two way ANOVA, seguido de teste de Bonferroni

para comparação dos diferentes grupos.

5.3.2 Glicemia

É notável que ambos os grupos apresentaram níveis glicêmicos elevados ao longo

das semanas de experimento. A administração oral do extrato aquoso de sementes de alpiste

nesta dosagem não alterou os picos glicêmicos, o que sugere que não houve melhoria do

controle da glicemia, ou seja, o extrato não apresentou efeito hipoglicêmico em ratos

diabéticos (Tabela 14). Em ratos Wistar machos normais (sham), após 90 dias de

experimento no biotério, a glicemia aferida é de 92,9 ± 6,6, ou seja, bem abaixo dos valores

obtidos na avaliação do 87º dia de experimento, o que comprova a ação da STZ sobre a

glicemia. Mesmo não tendo sido observada diferença estatística os animais tratados

mostraram uma tendência em diminuir a glicemia comparado ao grupo não tratado.

221

Tabela 14. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis

de glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 87 dias de experimento.

Grupos/Dias DO D1 D6 D10 D16 D20 D27 D38

Controle Negativo com STZ 120 ± 0 600,0 ± 0 477,5 ± 20,8 576,5 ± 13,4 506,8 ± 34,0 575,1 ± 16,1 576,0 ± 15,4 573,8 ± 15,4

Dose 1000 mg/kg com STZ 120 ± 0 551,2 ± 48,0 393,2 ± 44,7 427,5 ± 50,2 406,0 ± 43,7 434,0 ± 35,3 489,4 ± 49,6 524,2 ± 52,6

Grupos/Dias D45 D52 D57 D66 D71 D79 D86

Controle Negativo com STZ 599,1 ± 0,9 574,6 ± 14,9 531,1 ± 45,2 573,4 ± 17,3 571,0 ± 14,8 539,4 ± 18,8 600,0 ± 0

Dose 1000 mg/kg com STZ 531,4 ± 48,4 473,0 ± 48,4 485,6 ± 53,0 520,0 ± 44,5 495,9 ± 58,3 515,4 ± 52,0 533,5 ± 61,0

Níveis de glicose sanguínea após jejum em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não

diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg,

por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two-way ANOVA, seguido de teste de

Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham.

5.3.3 Consumo de Ração e Água

Com relação ao consumo de ração a diferença entre os grupos é pequena ao longo

das semanas de experimento, havendo uma tendência à diminuição do consumo pelo grupo

tratado a partir da quarta semana. Porém, na 12ª semana os níveis de consumo se igualam

(Fig. 51). Já o consumo de água é muito semelhante entre os grupos, indicando que não há

diferenças significativas nesses dois parâmetros entre os animais não tratados e tratados

com extrato aquoso de sementes de alpiste (Fig. 52). Em ratos Wistar machos normais

(sham), após 90 dias de experimento no biotério, o consumo de ração foi de 200,87g e de

água foi de 260,14mL, valores inferiores aos observados pelos ratos diabéticos.

Consumo de Ração

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

100

200

300



Semanas

Co

nsu

mo

(g

)

Figura 51. Consumo de ração pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).

Consumo de ração por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato

aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos

como média do grupo experimental.

222

Consumo de Água

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

500

1000

1500



Semanas

Co

nsu

mo

(m

L)

Figura 52. Consumo de água pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).

Consumo de água por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato

aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos

como média do grupo experimental.


A exposição a STZ com consequente aumento dos índices glicêmicos eleva também

os níveis das enzimas hepáticas TGO, TGP e ALP. Esse aumento não foi prevenido pelo

tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nos 87 dias, apesar de os

valores para TGO, TGP e ALP terem sido menores nesse grupo. Pode-se observar também

tendência de aumento nos níveis de triglicérides como no teste de 28 dias (Tabela 15).

Tabela 15. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos.


com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

TGO 115,3 ± 11,4 529,7 ± 92,7** 384,1 ± 73,0*

TGP 22,5 ± 0,8 162,6 ± 28,5** 127,2 ± 32,3*

ALP 146,3 ± 10,5 616,7 ± 135,5* 507,7 ± 131,8

Uréia 86,6 ± 42,8 83,7 ± 9,5 88,7 ± 9,5

Creatinina 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0

GGT 5,0 ± 0 6,0 ± 1,0 6,2 ± 1,2

Colesterol 100,0 ± 0 100,6 ± 0,6 100,4 ± 0,4

Triglicérides 90,9 ± 8,0 159,6 ± 15,7* 141,7 ± 16,4

Ácido Úrico 2,9 ± 0,7 2,3 ± 0,2 2,3 ± 0,2

Níveis das diferentes enzimas, colesterol, triglicérides e ácido úrico em animais controle e diabéticos

(induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral,

na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way


Sham. * p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.

223

TGO, TGP, ALP e enzimas biomarcadoras são usadas como índices dos danos no

fígado (SUBRAMANI et al., 2014). No modelo de diabetes induzido por STZ, o aumento

de TGO e TGP no soro está correlacionado com a diminuição de insulina no sangue, sendo

uma indicação sobre o efeito hepatotóxico de STZ (BARBORA et al., 2002; SUBRAMANI

et al., 2014). A deficiência de insulina leva ao aumento do catabolismo de aminoácidos e,

portanto, fornecimento de substratos para a gliconeogênese. Os níveis destas enzimas

hepáticas não foram reduzidas, mas mostram uma tendência em diminuir em ratos

diabéticos tratados, portanto o tratamento com o “leite de alpiste” nestas doses não pode

proteger os danos do tecido hepático causada por meio de diabetes induzida por STZ.

De acordo com Vasconcelos (2011), a redução no catabolismo de proteína diminui a

captação hepática de aminoácidos e, consequentemente, os níveis séricos de ácido úrico,

uréia, bem como TGO, TGP e ALP (Tabela 15).

Creatinina plasmática é um bom marcador da função glomerular de uréia, e estas

duas medidas nem sempre são simultaneamente aumentadas ou normais (PRAUSE e

GRAUER 1998; MEDAILLE et al., 2004; EVANS, 2009 cap. 4). Além de creatinina

plasmática e uréia nas medições de plasma, as medições de eletrólitos e as proteínas

plasmáticas podem ser indicativos de disfunção renal (EVANS, 2009 cap. 4).

Os resultados de Gutierrez et al., (2014) indicam que o tratamento apenas com o

extrato hexânico de sementes de alpiste reduziu a atividade das enzimas, sugerindo que o

extrato foi eficaz na redução dos efeitos tóxicos da STZ e exerceu papel hepatoprotetor.

Estes resultados sugerem P. canariensis apresenta compostos que impedem o estresse

oxidativo, atuando como um supressor de danos nas células do fígado e inibindo a

progressão da disfunção do fígado pela hiperglicemia induzida crônica. O extrato hexânico

de sementes de alpiste teve um potente efeito sobre a atividade de enzimas antioxidantes no

tecido pancreático, controlando o diabetes. P. canariensis melhorou o metabolismo da

glicose por meio da redução da resistência à insulina e proteção das células β-pancreáticas

do estresse oxidativo, além de exercer atividade hipoglicemiante e regulação lipídica. Além

disso, foi observado efeito hipolipemiantes em camundongos obesos, além de controlar o

ganho excessivo de massa corporal (GUTIERREZ et al., 2014).

224

5.3.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada

Diferente do que ocorreu no experimento de 28 dias, aqui pode-se observar um

aumento no número de leucócitos em relação ao grupo não diabético (sham) (Tabela 16).

A leucocitose (aumento de leucócitos por volume de sangue) pode estar relacionada a um

processo inflamatório e é um evento comum no diabetes. Nesses animais também houve

diminuição no número de plaquetas (trombocitopenia), o que pode levar a problemas de

coagulação.

O tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste por 87 dias não

promoveu modificações em nenhum dos parâmetros relacionados ao hemograma dos

animais, mostrando mais uma vez que não houve ação do extrato contra os efeitos da STZ

(Tabela 16).

Tabela 16. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos.


com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Leucócitos Totais 4,9 ± 1,0 7,4 ± 0,5 7,6 ± 1,2*

Hemoglobina 16,8 ± 0,1 16,9 ± 0,2 16,9 ± 0,3

Plaquetas 910,7 ± 21,4 516,7 ± 131,4* 470,6 ± 140,6*

Hemácias RBC 9,2 ± 0,1 9,5 ± 0,2 9,5 ± 0,2

Hematócritos HCT 49,3 ± 0,5 50,2 ± 1,0 50,4 ± 1,1

MCV 54,2 ± 0,5 52,7 ± 0,5 53,1 ± 0,5

MCH 18,4 ± 0,1 17,8 ± 0,2 17,8 ± 0,2

MCHC 34,1 ± 0,1 33,7 ± 0,4 33,5 ± 0,4

Hemoglobina Glicada 8,0 ± 1,9* 3,7 ± 0,9--

Hemograma de sangue total e perfil de hemoglobina glicada em animais controle e diabéticos (induzidos com

STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000

mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de

teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. * p<0.05;

**p<0.01; ***p<0.001.

Os níveis de hemoglobina glicada (HbA1) foram significativamente aumentados em

animais diabéticos não tratados, como também observado no teste de 28 dias. Como a

doença progride nestes animais diabéticos sem tratamento, os níveis observados de HbA1

são maiores. No grupo tratado não houve aumento dos níveis de hemoglobina glicada,

sugerindo uma ação do extrato, o valor encontrado ficou muito próximo dos animais

controle não diabéticos (sham) no teste de 28 dias.

225

A grande vantagem do monitoramento da HbA1 está no fato de não sofrer grandes

flutuações, como na dosagem da glicose plasmática, bem como estar diretamente

relacionada ao risco de complicações em pacientes com diabetes tipos 1 e 2. A

determinação dos níveis da HbA1 é a melhor opção para a avaliação do controle glicêmico

em médio e longos prazos (BEM; KUNDE, 2006; LOPES, 2011).

5.3.6 Análise de Eletrólitos

Tabela 17. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.

Eletrólitos/Grupos ShamControle Negativo

com STZ

Dose 1000 mg/kg

com STZ

Na Urina 68,5 ± 12,5 170,7 ± 12,3 ** 197,0 ± 18,6 ***

K Urina 42,3 ± 13,4 110,3 ± 20,7 110,8 ± 21,1

Na Sangue 136,8 ± 0,5 129,2 ± 0,9 ** 132,0 ± 1,8

K Sangue 4,0 ± 0,1 4,9 ± 0,6 4,1 ± 0,4

Ca Sangue 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,2 ± 0

Análise dos eletrólitos da urina e sangue em animais controle e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg

i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87

dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de teste de Tukey

para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. * p<0.05; **p<0.01;

***p<0.001.

Neste experimento, nos animais expostos a STZ (Tabela 17) mostraram aumento da

excreção de sódio na urina e os diabéticos sem tratamento diminuição dos níveis de sódio

no sangue. O aumento da excreção de sódio e potássio está diretamente relacionado com o

aumento do fluxo urinário causado pela administração de STZ.

Quando esse balanço natural de água e eletrólitos, realizado pelos rins, sofre

alterações e passa a ser insuficiente para manter o organismo em homeostasia, levando a

retenção de líquidos, acúmulo de sódio ou potássio, aumento de pressão arterial, entre

outras disfunções, pode ser necessário o uso de diuréticos (GALLAGHER et al., 2006).

Os diuréticos são substâncias que aumentam a velocidade de eliminação da urina. A

maioria dos diuréticos age ao reduzir a intensidade da reabsorção de líquidos nos túbulos. A

principal função dos diuréticos é reduzir a quantidade total de líquido do organismo

(CARNEIRO, 2012). Os diuréticos são especialmente importantes no tratamento de edemas

e da hipertensão arterial sistêmica. Após o uso de um diurético, geralmente a velocidade de

226

perda de sódio na urina aumenta, bem como a velocidade de perda de água. De forma geral,

os diuréticos causam perda acentuada de sódio e potássio pela urina, bem como, aumento

da diurese (KESTER et al., 2008 apud CARNEIRO, 2012; GALLAGHER et al., 2006).

A glicose é filtrada e reabsorvida nos rins, por co-transportadores de sódio; com a

hiperglicemia há uma saturação da capacidade de reabsorção renal e a glicose excedente é

eliminada do organismo através da urina, configurando o quadro de glicosúria

(GANNONG, 2006 apud GUTIERRES, 2011).

A alta ingestão de líquidos (polidipsia) verificada no diabetes pode ser explicada

através do seguinte mecanismo: a desidratação provoca uma redução moderada no volume

do líquido extracelular, porém nos casos de acidose grave, há também uma grande perda de

sódio, levando a redução acentuada do líquido extracelular. A perda de líquidos leva a um

aumento na pressão osmótica e redução no líquido extracelular, que regula a ingestão de

líquidos. A pressão osmótica age via osmorreceptores, localizados no hipotálamo anterior

estimulando a sede. Reduções no volume do líquido extracelular também estimulam a sede

por uma via independente daquela mediada em resposta ao aumento da osmolaridade

plasmática (GUYTON & HALL, 1996 apud GUTIERRES, 2011).

A concentração de sódio no sangue diminui em demasia quando o sódio se diluiu

em excesso por uma quantidade aumentada de água no corpo. O sódio pode diluir-se

excessivamente em indivíduos que bebem enormes quantidades de água, como acontece

algumas vezes em certas perturbações. De qualquer modo, a quantidade de líquido ingerido

ultrapassa a capacidade dos rins para eliminar o excesso. É associada com diferentes

doenças, e quase sempre é resultado de retenção hídrica. Na maioria das vezes, esse

problema é devido à secreção inapropriada do Hormônio Anti diurético (HAD), embora a

excreção de água livre possa estar limitada em algumas situações, como a insuficiência

renal crônica, independente, e do HAD (VIEIRA NETO e MOYSÉS NETO, 2003). A

desidratação produz-se quando a eliminação de água do corpo é maior que o volume

ingerido. A deficiência de água, em geral, provoca um aumento da concentração de sódio

no sangue. Algumas doenças, como o diabetes mellitus, podem ocasionar desidratação

devido às excessivas perdas de água que as caracterizam.

As concentrações de sódio na urina devem ser avaliadas juntamente com os níveis

de sódio no sangue. Os níveis também se podem encontrar elevados na urina quando o

organismo perde demasiado sódio. Neste caso, o nível de sódio no sangue seria normal ou

227

baixo. Níveis de sódio na urina elevados podem indicar consumo de diuréticos (LABTEST,

2010). O extrato de alpiste demonstrou um efeito diurético nos animais tratados.

5.3.7 Peso Relativo dos Órgãos

No experimento de longa duração (87 dias), pode-se notar aumento no peso relativo

do coração, fígado, rins e adrenais, o que está diretamente correlacionado com a evolução

da doença induzida pela STZ. Em geral os grupos diabéticos tratados ou não se comportam

da mesma maneira, sugerindo a não ação do extrato no parâmetro peso dos órgãos (Tabela

18).

Tabela 18. Efeito do extrato de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos

animais do experimento de 87 dias.

Órgãos/Grupos ShamControle Negativo

com STZ

Dose 1000 mg/kg

sem STZ

Coração 0,292 ± 0,010 0,356 ± 0,018

*

0,328 ± 0,015

Fígado 2,658 ± 0,124 3,774 ± 0,010

***

3,854 ± 0,169

***

Rins 0,542 ± 0,008 0,970 ± 0,026

***

0,899 ± 0,098

***

Baço 0,210 ± 0,004 0,220 ± 0,015 0,187 ± 0,007

#

Adrenais 0,012 ± 0,001 0,027 ± 0,003

**

0,031 ± 0,004

***

Peso relativo dos órgãos dos animais normais e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou

não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados

são expressos como média ± erro padrão da relação peso do órgão/100 g de peso do animal. One way


Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** p<0.01; ***p<0.001.

O peso relativo do fígado é superior em ratos diabéticos por conta da

hepatotoxicidade induzida por STZ (SUGIURA et al., 2006; FERNANDES et al., 2010).

Esses dados estão de acordo com os observados na avaliação dos parâmetros bioquímicos,

onde houve também aumento dos níveis de enzimas hepáticas no soro (Tabela 15).

O aumento de peso dos rins, bem como das adrenais, também pode ser relacionado

ao aumento de eletrólitos, podendo ser sinal de insuficiência renal, embora os níveis de

creatinina e uréia não estejam alterados. De acordo com os dados de hemograma, onde

houve diminuição da contagem de plaquetas no grupo tratado com o extrato, o baço nesse

228

grupo também está diminuído em relação ao grupo diabético sem tratamento, excluindo-se

a possibilidade de aumento de captura de plaquetas por esse órgão, o que levaria à

esplenomegalia.

5.3.8 Histopatologia

A fim de avaliar possíveis alterações nos animais induzidos com STZ e tratados

com extrato aquoso de sementes de alpiste, os rins, pâncreas e fígados dos animais foram

submetidos à análise histopatológica. A avaliação foi feita por patologista e de maneira

cega, ou seja, sem identificação dos grupos no momento da análise.

Grupo: 87 dias Controle Negativo com STZ (sem tratamento)


radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Ectasia de

veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal. Alguns tiveram leve

fibrose portal. Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com

frequentes células gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-

medular preservada. Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do

epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos

limites da normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente

exócrino, é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente

em torno de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de

células de Langerhans. Focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Alguns apresentaram

linfonodos. Fibrose focal nas ilhotas de Langerhans. Necrose focal nas ilhotas de

Langerhans.

Grupo: 87 dias Maior dose com STZ (1000 mg/kg extrato aquoso de sementes de

alpiste)



fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Alguns tiveram infiltrado linfocítico leve

portal e sinusoidal. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes

multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.


229





Langerhans. Alguns apresentaram linfonodos.

Hiperglicemia e o estresse oxidativo induzido também podem causar danos às

células do fígado. No estudo de Gutierrez et al., (2014) o extrato hexânico de alpiste P.

canariensis impediu o estresse oxidativo, atuou como um inibidor e eliminador de danos

nas células do fígado relacionadas pela hiperglicemia crônica.

Apesar de alguns estudos demonstrarem que as sementes de alpiste possuem vários

compostos fenólicos importantes à saúde, não significa que eles possam proteger todas as

células e tecidos de todos os tipos de danos oxidativos. Quanto ao desempenho dos

antioxidantes in vivo, este depende de fatores como: tipo de radical formado, local e como

são gerados, análise e métodos para a identificação dos danos e as doses ideais para obter

proteção.

No teste de 87 dias não foram observadas alterações histopatológicas relacionadas

com a administração de STZ, apesar de haver aumento dos níveis de enzimas hepáticas,

uréia, eletrólitos e aumento do peso relativo do fígado e rins, o que poderia sugerir um

comprometimento desses órgãos em decorrência da administração da STZ. Porém, a

alteração nos níveis glicêmicos e a alta incidência de catarata mostra a ocorrência da

doença, permitindo concluir que o extrato aquoso de sementes de alpiste não atuou como

agente hipoglicemiante nas condições avaliadas (tempo, doses, modelo experimental). Por

outro lado, o tratamento com “leite de alpiste” por 87 dias não apresentou sinais de

toxicidade, sendo um potencial material a ser avaliado em outros modelos farmacológicos,

já que não existem dados científicos acerca das propriedades farmacológicas do extrato

aquoso de sementes de P. canarienses.

230

6. CONCLUSÃO

Esperava-se que o tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste controlasse

os níveis glicêmicos, sendo uma alternativa no controle do diabetes, principalmente por

apresentar em sua composição substâncias antioxidantes naturais com atividade captadora

de radicais livres. Porém, a partir dos resultados obtidos nesse estudo conclui-se que o

“leite de alpiste” não controlou os níveis glicêmicos ou efeitos colaterais relacionados ao

diabetes, tais como alterações do perfil de hemograma, bioquímico e de eletrólitos, além de

perda de massa corporal e aumento de ingestão de água e ração. No entanto a avaliação de

hemoglobina glicada mostra-se alterada positivamente nos animais diabéticos tratados com

a maior dose no teste de 87 dias. Por outro lado, pode-se concluir que o tratamento diário

com o “leite de alpiste” não promoveu sinais de toxicidade, o que aponta o extrato aquoso

de sementes de alpiste como um potencial a ser explorado, avaliando-se outras atividades

farmacológicas.

Esse estudo foi de extrema importância, já que existem diversos relatos populares

sobre os benefícios do consumo do “leite de alpiste” e a diminuição da glicemia em pessoas

diabéticas, porém há pouca bibliografia científica relacionada com essas ações ou até

mesmo com a composição nutricional desse material.

Frente a essa análise, pode-se dizer que ingerir unicamente o “leite de alpiste” a fim

de reduzir os índices glicêmicos parece ser um mito. Estudos complementares deverão ser

realizados para suportar essa hipótese.

231


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CONCLUSÃO GERAL

Por meio desse estudo pode-se dizer que o alpiste e seu extrato aquoso apresentam:

Elevados teores de proteínas;

Semente com elevados teores de fibras totais;

Alta quantidade de amido nas sementes;

Fonte rica de ω – 6;

Com base na avaliação da composição centesimal pode ser um

possível substituto de outros grãos nas formulações, como gergelim, aveia e trigo;

Possui atividade antioxidante intermediária, comparada com outros

alimentos, podendo ser considerada fonte moderada de acordo com ensaios físicos-

químicos;

Não apresentou toxicidade aguda no ensaio in vivo em ratos Wistar;

Nos ensaios de 28 e 87 dias o extrato não apresentou melhora em

animais diabéticos tratados em relação: ao ganho de massa corporal, redução do

índice glicêmico;

Houve constante aumento no consumo de ração e água, além do

aumento da poliúria dos animais diabéticos tratados com o extrato comparados aos

animais diabéticos;

Nas análises bioquímicas, hemograma, hemoglobina e eletrólitos os

animais diabéticos tratados com o extrato apresentaram valores próximos aos

animais diabéticos;

Aumento do peso relativo dos principais órgãos afetados pela doença;

Não foram observadas alterações histopatológicas oriunda da STZ,

porém os animais do teste de 87 dias apresentaram perda visual (cataratas);

O extrato aquoso de sementes de alpiste não demonstrou atividade

antioxidante relevante e consequentemente não eficiente para combater o diabetes

induzido por estreptozotocina em ratos Wistar machos nas doses aplicadas.

249

SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS

Este grupo de pesquisa sentiu-se motivado a investigar uma matriz vegetal pouco

estudada como é a semente de alpiste. Porém, em uma pesquisa científica coerente, é

necessário delimitar os objetivos do trabalho de modo a torná-lo executável dentro de um

determinado prazo. Sendo assim, esta dissertação, se torna o primeiro passo de muitos

trabalhos futuros, como os apontados a seguir:

Identificar os compostos fenólicos presentes nas sementes e extrato

do alpiste por HPLC e LC-MS/MS;

Analisar a presença de compostos fitoquímicos (fitatos) na água do

molho;

Realizar a extração com outros tipos de solventes e avaliar sua

atividade antioxidante;

Analisar o perfil de aminoácidos;

Identificar os principais minerais e vitaminas;

Identificar o conteúdo de fibras totais, quais são solúveis e insolúveis;

Analisar amidos modificados;

Realizar ensaios biológicos mais abrangentes sobre a

biodisponibilidade e bioacessibilidade desses compostos, enfatizando outras

doenças, tais como câncer, hipertensão, obesidade, infecções e benefícios dessa

semente, assim como trabalhar com outras concentrações;

Avaliar a questão da toxicidade da casca do alpiste;

Avaliar a utilização de alpiste para confecção de farinhas e alimentos

que requerem alta quantidade de amido na sua formulação;

Testar a substituição em formulações com o uso de gergelim para

alpiste.

251

APÊNDICE

Abaixo apresenta-se a composição centesimal da ração comercial utilizada na

alimentação dos animais no ensaio biológico.

Tabela A.1. Composição centesimal da ração comercial.

Componentes Ração Comercial

Umidade 9,71 ± 0,002

Cinzas 8,13 ± 0,17

Proteínas (N=6,25) 17,00 ± 0,92

Lipídeos 6,45 ± 0,15

Carboidratos 58,64 ± 0,07

Tabela A.2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica da ração comercial.

Ácidos Graxos % Amostra Ração Comercial

- C12:0 láurico 0,0657

- C14:0 mirístico 0,19451

- C15:0 pentadecanóico 0,05239

- C16:0 palmítico 16,3928

- C16:1 palmitoléico 0,15577

- C17:0 margárico 0,08375

- C17:1 cis-10-heptadecenóico 0,04775

- C18:0 esteárico 2,60609

- C18:1 oléico 28,09833

- C18:2 linoléico 46,53609

- C18:3 trans t-linolênico 4,16835

- C20:0 araquídico 0,5021

- C20:1 eicosenóico 0,38986

- C22:0 behênico 0,33733

- C24:0 lignocérico 0,36917

Em relação ao perfil da ração comercial os resultados obtidos neste estudo que se

destacam são: 46% ácido linoleico, 27% de oleico, 16% palmítico e 4,2% trans linolênico,

próximos ao do alpiste.

253

ANEXO 1

254

ANEXO 2

255

ANEXO 3

Composição centesimal observada na embalagem da ração comercial utilizada na

alimentação dos animais no ensaio biológico.

Nutriente Nível de Garantia (g/kg)

Proteína bruta (min) 220

Cálcio (min) 10

Cálcio (máx) 14

Fósforo (min) 8.000

Extrato etéreo (min) 40

Matéria fibrosa (máx) 80

Matéria mineral (máx) 100

Umidade (máx) 120

Composição centesimal da ração comercial.

256

ANEXO 4

Alguns Parâmetros de Ratos Wistar

As faixas para ratos (Wistar) de 7 a 14 semanas

Dados eritrocítico

Contagem de eritrócitos (RBC) (1012 / L) 6 a 9

A hemoglobina (g / dl) 11 a 17

Hematócrito (razão) 0,38-0,50

Volume celular médio (VCM) (fl) 50-62

Hemoglobina corpuscular média (HCM) (pg) 17 a 22

Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) (g / dl) 31 a 36

Dados leucocitária

Contagem de leucócitos total (WBC) (10 9 / L) 4 a 17

Dados de plaquetas

A contagem de plaquetas (109 / L) 800 de 1400

As faixas para ratos (Wistar, com idades 6-12 semanas)

Teste Unidade SI Variam em Unidades SI Unidade não-SI Variam em

Unidades não-SI

Colesterol, o total mmol / L 0,51-2,85 mg / dL 20-110

Creatinina mol / l 9-70 mg / dL 0,1-0,8

Glicose mmol / L 7,77-12,21 mg / dL 140-220

Potássio mmol / L 4,0-6,0 meq / L 4,0-6,0

Triglicérides mmol / L 0,56-2,23 mg / dL 50-200

Sódio mmol / L 138-152 meq / L 138-152

Uréia mmol / L 4,28-8,57 mg / dL 12-24

Enzimas

ALT UI / L 10-80

AST UI / L 20-100

ALP UI / L 70-450

GGT UI / L 0-4

caracterizaÇÃo do extrato aquoso de alpiste (phalaris · 2018-08-27 · alpiste (doses de 250,...

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