caspasas - instituto de investigaciones biotecnológicas ... · fosfatidilserine (ps) y otras...
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Caspasas
(Clan CD, Familia C14)
Las caspasas son una familia de CPs específicas para cortar proteínas
blanco en uniones peptídicas en las que el Asp aporta el carbonilo. Su
nombre viene de C (CPs), Asp (por el sitio de corte) y asas como
enzimas.
La acción concertada de caspasas es responsable de la apoptosis, una
forma de muerte celular programada esencial para el desarrollo
embrionario, entre otros procesos. Además de la apoptosis, un
subgrupo de la familia C14 está involucrado en la inflamación, como
activadoras de pro-citoquinas.
La actividad no regulada de caspasas sería letal, y para prevenirla la
célula las mantiene en un estado latente como zimógenos, cuya
activación se hace por un mecanismo conservado sujeto a una
regulación estricta.
Las caspasas apoptóticas se clasifican en iniciadoras y ejecutoras,
dependiendo de su punto de entrada en la cascada apoptótica. Las
iniciadoras son las primeras en ser activadas en una vía particular de
muerte celular, y constituyen el primer paso en una mínima cascada de
dos pasos por activar a las caspasas ejecutoras.
Una vez activadas por un estímulo específico, las caspasas ejecutoras
llevan a cabo una proteolisis de ciertos sustratos, lo que gatilla una
cascada de eventos que culmina en una muerte celular ordenada, que,
a diferencia de la necrosis, no causa inflamación.
(A) Caspase organization: a prodomain precedes the catalytic domain,
composed of two covalently linked subunits. Sites for (auto)proteolysis at
Asp residues are indicated. (B) activation mechanisms. Initiators are
monomers that activate by prodomain-mediated dimerization.
Executioners are dimers that activate by cleavage of intersubunit
linkers. Following activation, additional proteolytic events mature the
caspases to more stable forms, prone to regulation.
Caspasa 3 (ejecutora) Caspasa 8 (iniciadora)
En ambos casos después de su activación (proteólisis en 3,
dimerización, que la activa, y proteólisis ulterior en 8)
Vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis:
La vía intrínseca
En respuesta a diversos stresses
celulares, como daño al DNA, o stress del
retículo endoplásmico, la vía intrínseca
se transduce por miembros de la familia
Bcl-2. Bcl-2 homology 3 (BH3)-only
activa directamente a otros dos
miembros de la familia Bcl-2, BAX y BAC,
que se homo-oligomerizarían para formar
poros en la membrana externa de la
mitocondria. Esto permitiría que
proteínas pro-apoptóticas, como el
citocromo c y el segundo activador
mitocondrial de caspasas (Smac o
DIABLO), salgan del espacio
intermembrana al citosol. El citocromo c
activará otra proteína adaptadora,
llamada apoptotic protease-activating
factor-I (Apaf-I), que llevará a la
formación del apoptosoma.
a) Apaf-1 functional units: CARD, N-terminal caspase-recruitment domain which is responsible for recruiting caspase-9; NOD or
NB-ARC: a nucleotide-binding and oligomerization domain responsible for (d)ATP-dependent oligomerization, and WD40 region,
responsible for binding of cytochrome c. b) Apoptosome formation: In the absence of an apoptotic signal, Apaf-1 exists in a locked
autoinhibited form (WD40 region binds back to the remainder of the protein). Following an apoptotic signal, the binding of
cytochrome c to the WD40 region releases the lock leading to a semi-open, still autoinhibited, form of Apaf-1. This rearrangement is
concurrent with the hydrolysis of the bound nucleotide to (d)ADP. Neither oligomerization nor caspase-9 binding to the CARD
domain of Apaf-1 is possible in this conformation. (d)ATP nucleotide exchange leads to oligomerization and apoptosome formation.
The apoptosome adopts a wheel-like structure with the cytochrome-c-bound WD40 regions sticking out like spokes, whereas the NB-
ARC regions and CARDs form the central part of the wheel.
ACTIVACIÓN DE LA CASPASA-9 : EL
APOPTOSOMA
VIA APOPTÓTICA EXTRÍNSECA : ACTIVACIÓN DE LA
CASPASA-8: DISC (Death-Induced Signaling Complex)
-La vía extrínseca es responsable de la
eliminación de células no deseadas durante
el desarrollo, la educación del sistema
inmune y la eliminación mediada por el
sistema inmune de células de tumores.
-Se inicia por la unión de su ligando a un
receptor de muerte trans-membrana de la
superfamilia del receptor de factor de
necrosis type I; un miembro particular de
esta familia, Fas (también conocido como
CD95 or APO-1), se ha transformado en el
paradigma para el estudio de la vía
extrínseca.
- Al unirse al ligando, el receptor Fas forma
microagregados en la superficie celular,
permitiendo que la molécula adaptadora
FADD (Fas-associated protein with death
domain) sea reclutada por su cola a través
de un mecanismo de varios pasos.
-El FADD recluta los zimógenos de la
caspasa-8 a través de la interacción entre
sus N-terminal death effector domains
(DEDs).
- Es dentro de este death-inducing
signaling complex (DISC) que la caspasa-8
iniciadora se activa.
La proteólisis de la quinasa MST1 de mamífero resulta
en la translocación de un fragmento catalíticamente
activo de esta quinasa al núcleo, donde fosforila a la
histona H2B y provoca la condensación de la cromatina.
-El clivaje de ICAD (inhibitor of caspase-activated
DNase) libera CAD (caspase-activated DNase), la cual
cataliza el clivaje inter-nucleosomal del DNA.
- El clivaje mediado por caspasas de la lamin nuclear
debilita la lamina permitiendo la fragmentación nuclear,
y proteínas de la membrana nuclear son también
proteolizadas.
- La proteolisis de proteínas en sitios focales de adhesión
y sitios de adhesión célula-célula permite la liberación y
retracción celular.
-La actividad de caspasas lleva a la exposición de
fosfatidilserine (PS) y otras señales fagocíticas en la
superficie celular.
- La proteólisis del efector Rho ROCK1 lleva a la
contracción del citoesqueleto de actina y causa blebbing
de la membrana plasmática y fragmentación nuclear.
-Las caspasas también clivan proteínas del Golgi
causando la fragmentación del aparato de Golgi.
-Finalmente, funciones celulares importantes como la
traducción son afectadas a través de la proteólisis
mediada por caspasas de múltiples factores de iniciación
de la traduccción (eIFs).
Las caspasas efectoras desmantelan diversas estructuras celulares a través del clivaje de
sustratos específicos. Colectivamente, estos eventos proteolíticos producen los cambios fenotípicos
de la célula que son característicos de la apoptosis.
TREONIN PROTEINASAS:
EL PROTEASOMA
- El proteasoma, inicialmente llamado “proteasa multicatalítica” por tener (los eucarióticos)
tres actividades, denominadas “trypsin-like”, “chymotrypsin-like” y “peptidylglutamyl peptide
hydrolase”(tambien llamada “caspase-like”), en tanto que el de Thermoplasma acidophilum
tiene sólo una, la “chymotrypsin-like”, fué descubierto por microscopía electrónica mucho
antes de demostrarse su actividad proteolítica.
- Visto de costado da una imagen rectangular, y de frente una imagen circular. Tiene la forma
de un barrilito, que consta de cuatro anillos formados por siete subunidades cada uno, de MW
entre 22 y 34 kDa, los externos por las subunidades a y los internos por las subunidades b.
Los sitios activos están en las subunidades b. El proteasoma de T. acidophilum tiene 7
subunidades b con sitio activo; el eucariotico tiene solo 3 subunidades b activas, cada una con
una especificidad. El MW del proteasoma 20S es 700 kDa; cuando se le agregan las “tapas” de
19S para formar el proteasoma 26S (eucariótico) el MW aumenta a alrededor de 2000 kDa.
Los proteasomas se localizan en el citoplasma (algunos asociados a la cara externa del retículo
endoplásmico) y en el núcleo.
- El mecanismo catalítico involucra a un residuo de Thr N-terminal, que en algunos casos
puede ser reemplazado por Ser, conservando actividad, pero Thr se requiere para el
procesamiento de la prosubunidad. El residuo N-terminal de la proteína madura es catalítico,
siendo tanto el nucleófilo como la base general (el grupo amino). El pro-dominio de las
subunidades puede variar en longitud entre unos pocos residuos (8 en T. acidophilum) hasta
mas de 60. En la síntesis, se ensamblan primero los anillos a y luego sobre ellos se agregan y
procesan las subunidades b.
- El proteasoma es inhibido por diversos inhibidores; algunos inhiben tambien otras
proteinasas, como el Z-leucinyl-leucinyl-leucinal y el inhibidor I de calpaína, y otros son mas
específicos, como la lactacistina.
Funciones: degradación de proteínas mal plegadas, de proteínas de vida corta, de factores de
transcripción y proteínas involucradas en el ciclo celular. El inmunoproteasoma participa en
la presentación de peptidos antígenicos al MHC I.
Proteasoma 20 S de Thermoplasma acidophilum.
Subunidad b del proteasoma de Thermoplasma acidophilum.
Arqueas Eucariotes Bacterias
ESTRUCTURA DEL PROTEASOMA 26S
El proteasoma 20 S es activado por particulas
regulatorias o tapas, que se unen a sus extremos e
inducen un cambio conformacional que abre el canal
interno del proteasoma, de las cuales se conocen 4.
La mejor estudiada es la particula 19S, que consiste
de 19 subunidades que agregan un peso de unos
900 kDa. El complejo de una o dos de estas tapas
con el 20S se denomina proteasoma 26 S. Las
subunidades de 19S reconocen a los sustratos, los
despliegan y los translocan al interior de la particula
20S para su degradacion en peptidos cortos. La
mayor parte de esta tapa consiste de 6 subunidades
de ATPasa AAA, con un dominio ATPasa y un
dominio OB, y de 7 subunidades de andamiaje, que
van desde el extremo del proteasoma hasta el anillo
de subunidades a. A estas subunidades se les
agregan dos grandes subunidades que sirven de
plataformas de interaccion, Rpn1 y Rpn2. Rpn1 liga
Ubl-UBA proteinas, que son receptores adicionales
de Ub, en tanto que Rpn2 organiza los dos
receptores de Ub, Rpn10 y Rpn13, La tapa contiene
tambien un par de subunidades de metalopeptidasa,
Rpn11 (enzimaticamente activa) y Rpn8; la primera
cliva las cadenas de poliubiquitina a medida que el
sustrato va entrando al canal de 20S.
Proteínas adaptadoras UbL-UBA: UbL
(ubiquitin-like, como Rad23) se une al
proteasoma, y UBA (ubiquitin-
associated) a proteínas ubiquitinadas.
Schematic representation of the degradation cycle of the ubiquitin proteasome system. Proteins are
targeted to the proteasome by a two-part degradation signal or degron. It consists of a disordered
region within the substrate and a reversibly attached polyubiquitin tag (Ubn). Polyubiquitin tag is
attached by a E1–E2–E3 ubiquitination cascade and this process can be reversed by DUBs (top left).
The proteasome recognizes its substrates at the ubiquitin tag through ubiquitin receptors (Rpn10 and
Rpn13; green) (top) and initiates degradation at the unstructured region (right). Once the proteasome
has engaged its substrate, it unravels the protein by translocating it into a central cavity in the core
particle, where the protein is proteolysed (bottom). The polyubiquitin tag is cleaved off by the intrinsic
DUB Rpn11 (skyblue) as unfolding and degradation begins
En presencia de citokinas inflamatorias como el IFNg o el TNFa, se sintetiza una
variante del proteasoma, el inmunoproteasoma, que tiene reemplazadas 3
subunidades b, por subunidades b específicas, resultando en una actividad caspase-
like muy disminuída y en una chymotrypsin-like aumentada. Además, el complejo
19S es reemplazado por el complejo 11S, el cual permite la apertura del canal del 20S
sin necesidad de ubiquitinación de la proteína a degradar. Puede haber
inmunoproteasomas híbridos, con ambas caps, 19S y 11S, una en cada extremo.
El inmunoproteasoma se ensambla de novo, y lleva a un incremento considerable de
la formación de péptidos inmunogénicos, que serán presentados por el MHC clase I.
ASPARTIL
PROTEINASAS
ASPARTIL PEPTIDASAS
Las proteasas aspárticas son una familia de proteasas que usa dos
residues de Asp altamente conservados en el sitio activo para catalizar
el clivaje de sus sustratos.
El mecanismo de acción generalmente aceptado es un mecanismo general
ácido-base que involucra la coordinación de una molécula de agua entre
los dos residuos de Asp altamente conservados. Un aspartato activa el
agua quitándole un protón, permitiendo que el agua ataque el carbono
del carbonilo de la unión a romper en el sustrato, generando un
intermediario tetraédrico oxianion. El rearreglo de este intermediario
lleva a la protonación de la amida a cortar.
PEPSINA (CLAN AA, FLIA A1)
La pepsina es la principal proteasa ácida
del estómago. Se la reconoce generalmente
como la primera enzima descubierta (en el
Siglo XVIII) y recibió su nombre de T.
Schwann en 1825. La pepsina fué la
segunda enzima cristalizada
(Northrop,1930), después de la ureasa
(Sumner, 1926).
La secreción de la pepsina por la mucosa
gástrica es estimulada por la gastrina.
La pepsina es sintetizada en la mucosa
gástrica y secretada a la luz del estómago
como un zimógeno, el pepsinógeno, que
contiene un propéptido extra de 44
residuos en el N-terminal.
Al llegar al medio ácido del estómago, el
pepsinógeno es convertido en pepsina por
la remoción del propéptido.
La pepsina es una endopeptidasa con
especificidad amplia. El rango de pH para la
hidrólisis de péptidos es desde menos de 1
hasta alrededor de 6, con un óptimo kcat / Km
cerca de pH 3.5
PEPSINA – Complejo con pepstatina
PEPSINOGENO
RETROPEPSINA (HIV)
INHIBIDORES DE APS
Casi todas las aspartil proteasas son inhibidas por la pepstatina, un
hexa-péptido natural que contiene el aminoácido inusual estatina
(Sta, ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico).
METALOPEPTIDASAS
Mecanismo catalítico generalmente aceptado para MPs monometálicas. La
molécula de solvente catalítica se une primero al ión metálico catalítico (esfera
blanca) y al catalizador general ácido/base en el sitio activo, en ausencia de un
sustrato peptídico (I). Cuando el sustrato se ha acomodado en el surco y el
complejo de Michaelis se ha formado (II), la molécula de solvente polarizada
ataca al grupo carbonilo, formándose el intermediario tetraédrico (III). Este último
se resuelve en la ruptura de la unión labilizada y la doble transferencia de protón
al nuevo grupo a-amino para dar un doble complejo con productos (IV).
Metalopeptidasas: Mecanismo de reacción.
Matrilisina (Matriz metalopeptidasa-7) humana
El zinc catalítico se muestra como una esfera gris clara. Los iones de Calcio estructurales se
muestran como esferas amarillas. Los ligandos del zinc se muestran en representación de
bolitas y palitos: His214, His218 y His224 en púrpura. El Glu215 catalítico se muestra en azul. El
inhibidor unido se muestra en gris en representación de bolitas y palitos.
LEISHMANOLISINA - Leishmania major
OTRAS CLASES CATALÍTICAS:
GLUTAMIL PEPTIDASAS Y
ASPARAGINIL PEPTIDASAS.
Familia N8: Asparaginil peptidasas.
Incluye a la proteína de cápside de tipo VPO autoclivable del
poliovirus.
En la figura, se muestra la proteína similar del rhinovirus 14.
La Asn 68 es la catalítica.
Hay 5 clanes de asparaginil peptidasas; la mostrada pertenece al
Clan NA.
Familia N4: El dominio autoclivable asociado a Tsh de E. coli.
Los autotransportadores son factores de virulencia secretados por bacterias patógenas. El
propéptido C-terminal forma un poro en la membrana externa a través del cual la peptidasa
(el dominio pasajero) puede pasar. El autoclivage en Asn 1100 libera la peptidasa.
PROBLEMAS QUE PRESENTAN LAS
PROTEINASAS EN LA
PURIFICACIÓN DE OTRAS
PROTEÍNAS.
APLICACIONES DE LAS
PROTEINASAS EN BIOQUÍMICA,
BIOLOGÍA CELULAR Y BIOLOGÍA
MOLECULAR.
LAS PROTEINASAS COMO UN PROBLEMA EN PURIFICACION DE
PROTEÍNAS.
SINTOMAS QUE SUGIEREN UN PROBLEMA PROTEOLITICO:
1) Ausencia de una proteína específica (por actividad o
inmunorreactividad).
2) Bajos rendimientos en la purificación o pérdida de actividad,
por ejemplo durante el almacenamiento de las muestras.
3) Cambios en la actividad de la proteína. P.ej.: especificidad,
dependencia del pH, etc. Puede deberse a proteólisis limitada.
P.ej.: la tirosina aminotransferasa (TAT) de hígado de mamífero
cuya región N-terminal se conoció sólo al secuenciar el cDNA,
pues se proteoliza al romper los hepatocitos.
4) Discrepancias en las propiedades de la misma proteína
purificada en distintos laboratorios o por métodos alternativos
(patrón de isoformas, datos de secuencia N-terminal).
SINTOMAS EN SDS-PAGE QUE SUGIEREN UN PROBLEMA
PROTEOLITICO.
1) Pobre resolución de bandas y alto background de tinción.
2) Pérdida de bandas de alto peso molecular y aumento del material de bajo
peso molecular.
3) Discrepancias en el valor de peso molecular informado por diversos
laboratorios, o de la misma proteína obtenida por métodos alternativos.
4) Disminución del peso molecular aparente durante el almacenamiento.
5) Aparición de dos bandas con peso molecular menor, con pérdida de una
única banda con peso molecular igual a su suma.
6) Número variable de “subunidades” en preparaciones de proteínas
multifuncionales.
PROBLEMAS PROTEOLITICOS QUE PUEDEN SUCEDER DURANTE
LA SDS-PAGE.
1) Las condiciones desnaturalizantes empleadas en SDS-PAGE despliegan
a las proteínas y las hacen mas vulnerables a la proteólisis.
2) Algunas proteinasas no se inactivan completamente en condiciones
desnaturalizantes standard, sobre todo si no se hierve la muestra a
sembrar.
3) Los complejos proteinasa-inhibidor se disocian.
4) Los agentes reductores, como el b-mercaptoetanol, activan a las
cisteina proteinasas.
FORMAS DE EVITAR (O MINIMIZAR) LA PROTEOLISIS DURANTE LA
PURIFICACION DE UNA PROTEINA.
1) pH y buffers: Buscar un buffer y un valor de pH que no sea el óptimo
para las proteinasas conocidas en el material de partida.
2) Temperatura: Trabajar en frío y guardar las muestras congeladas (a -
70oC de ser posible), salvo que la proteína no lo soporte.
3) Tiempo: Trabajar tan rápido como sea posible. Usar inhibidores de
proteinasas durante las etapas que insumen mucho tiempo (p. ej.: una
diálisis de toda la noche).
4) Agentes estabilizadores: P. ej.: glicerol, al 15 - 35 %, o DMSO, al 10 %
5) Agregado de proteínas exógenas: P. ej.: 1 - 5 mg de seroalbúmina bovina
por ml.
6) Agregado de efectores: Sustratos, análogos de sustratos, cofactores,
efectores alostéricos, si el complejo de la proteína y el efector es mas
estable que la proteína sola.
7) Uso de “cócteles” de inhibidores de proteinasas.
USO DE PROTEINASAS EN SECUENCIACION DE
PROTEINAS
Para la digestión parcial de las proteínas previa a su secuenciación por
Edman o MS, se utilizan distintas proteinasas con diferentes
especificidades.
Serin proteinasas: Tripsina - Quimotripsina - Subtilisina - Glu-C - Lys-C -
Arg-C.
Cistein proteinasas: Papaína.
Metaloproteinasas: Termolisina.
Aspartil proteinasas. Pepsina.
Actualmente lo mas frecuente es efectuar la digestión en el fragmento
de gel de proliacrilamida, y luego extraer los péptidos para efectuar RP-
HPLC o MS.
USO DE PROTEASAS PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE
PROTEÍNAS DE MEMBRANA.
La parte hidrosoluble de proteínas integrales de membrana que
presenten dos dominios ligados por una a-hélice
transmembrana, u otras ligadas a la membrana por anclas
lipídicas, pueden ser purificadas solubilizando la parte exterior
por proteólisis limitada.
ALGUNAS PROTEINAS SE HAN ESTUDIADO POR PROTEOLISIS
LIMITADA.
Un ejemplo importante en Biotecnología es la DNA Polimerasa I:
Clivaje con subtilisina, en presencia de DNA. Detenido con
PMSF. Separa el fragmento N-terminal de 35 kDa del fragmento
C-terminal de 68 kDa. Este último es el fragmento Klenow, con
actividad de polimerasa y 3´- 5´-exonucleasa.
USO DE
PROTEINASAS
PARA
DETERMINAR LA
TOPOLOGIA DE
PROTEINAS DE
MEMBRANA
USO DE PROTEINASAS PARA DETERMINAR LA
TRANSLOCACIÓN DE PROTEINAS A ORGANELAS.
USO DE
PROTEINASAS
PARA
PROCESAR
PROTEINAS
EXPRESADAS
COMO
PROTEINAS DE
FUSION.
Urogastrona (human epidermic growth factor). La proteína intacta es
rápidamente degradada por E. coli, pero se la estabiliza fusionando la
proteína TrpE al N-terminal y se facilita su purificación fusionando poli-Arg al
C-terminal. Va a cuerpos de inclusión. Se solubiliza con urea y se purifica
por intercambio iónico aprovechando la poli-Arg. Se digiere con tripsina
para eliminar las fusiones, pero debe controlarse muy bien la digestión.
Purificación de aspartato aminotransferasa fusionada a 7 residuos de Arg en
el C-terminal, que se eliminan usando la carboxipeptidasa B, específica para
aminoácidos básicos en el C-terminal.