informe final 20070239 - instituto politécnico...

Dra. Martha Moreno Lafont 1

CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CTL ESPECÍFICOS PARA LA SUPERÓXIDO DISMUTASA DE Brucella abortus RB51

Clave 20070239 INFORME FINAL

RESUMEN La brucelosis es una de las mayores enfermedades zoonóticas en el mundo, se encuentra ampliamente distribuida en humanos y animales. Al igual que otras enfermedades causadas por bacterias intracelulares como la tuberculosis, la brucelosis es una infección crónica granulomatosa causada por bacterias del genero Brucella. Es originada por bacterias del género Brucella, dentro de las cuales destacan B. melitensis (caprinos y ovinos), B. abortus (bovinos) y B. suis (porcinos) (Pappas, 2005).

En general se establecen dos mecanismos para la citotoxicidad mediada por linfocitos T, la vía que implica la secreción de gránulos (vía secretora) y la vía no secretora basada en la unión de Fas y FasL. En la vía secretora que implica la secreción de gránulos contenidos en el linfocito T citotóxico (CTL), los principales componentes de muerte en estos gránulos son las granzimas, perforinas y granulisinas, las cuales al ingresar activan la cascada de caspasas y con ello la apoptosis de la célula (Lieberman, 2003).

La vía no secretora se basa en la interacción de Fas-L y Fas. Fas-L es una proteína integral de membrana del linfocito T que al unirse con Fas trimerizado inducen la muerte de la célula blanco vía apoptosis por la activación de la cascada de las caspasas que conlleva a la fragmentación del DNA y la formación de cuerpos apoptóticos (Berke, 1991).

Dentro de los mecanismos que tiene esta bacteria para evadir la respuesta inmune se ha observado que B. abortus resiste el ataque de neutrófilos y se replican dentro de los macrófagos y de células fagocíticas no profesionales manteniendo por largo tiempo la interacción con las células hospederas. Se ha reportado que en el humano B. abortus se multiplica dentro del fagosoma de las células fagocíticas, inhibiendo la fusión fagosoma lisosoma. También se conoce que Brucella abortus puede producir las proteínas SOD y catalasa que tienen la propiedad de neutralizar a los radicales libres del oxígeno que son generados por la NADPH oxidasa de los fagotitos. Estas proteínas catalizan la reacción para convertir el radical superóxido (O2 ) en peróxido (H2O2), oxígeno molecular (O2) y H2O, neutralizando así esta vía de ataque a microorganismos patógenos (Oliveira y cols. 2002; Dornand y cols. 2002).

Por otra parte, B. abortus RB51 es una cepa viva atenuada rugosa (desprovista de la cadena O en el lipopolisacárido), resistente a rifampicina que fue obtenida a partir de la cepa virulenta 2308 por medio de múltiples pases in vitro e in vivo y es utilizada como vacuna viva contra la brucelosis en ganado vacuno e induce la protección mediante inmunidad celular (Schurig y cols 2002). B. abortus RB51 no es apta para uso en humanos ya que al ser una vacuna viva existe el riesgo de que retome su virulencia. Por esta razón se han estudiado moléculas (fracciones de proteína y polisacárido, conjugados de proteína y polisacárido) que pueden ser inmunógenos importantes que confieran protección contra Brucella abortus. Entre estas resalta la proteína de membrana conocida como Superóxido dismutasa dependiente de Cu+2 y Zn2+ (SOD Cu/Zn), de la cual existen estudios donde se reporta su papel como molécula protectora (Saldarriaga y Rugeles, 2002).

Apoyando este trabajo, Vemulapalli y cols en el 2000 encuentran que al sobreexpresar en una bacteria transformante de cepa RB51 el antígeno SOD se tiene mayor resistencia a la infección contra la cepa virulenta 2308 en ratones BALB/c, y la


inmunidad es de tipo Th1 con producción significativa de INF-gamma pero no se detectó IL-4.

Para lograr los objetivos, se obtendrá y ultrapurificará la proteína SOD a partir de la cepa recombinante de E. coli. Luego se inocularán ratones para obtener los Lc T CD4+ y CD8+, los cuales se co-cultivarán con macrófagos de la línea celular J774A.1 previamente infectados con la cepa virulenta 2308. Para determinar la citotoxicidad se probarán 3 métodos diferentes: colorimétrico (técnica de rojo neutro y liberación de LDH); microscopía (técnica de TUNEL) y por citometría de flujo (determinación de caspasa 3 activa). INTRODUCCIÓN Generalidades de brucelosis. La brucelosis causada por bacterias del género Brucella es una de las mayores enfermedades zoonóticas en el mundo, se encuentra ampliamente distribuida en humanos y animales, principalmente en países subdesarrollados (Saldarriaga y Rugeles, 2002). Al igual que otras enfermedades causadas por bacterias intracelulares, como la tuberculosis, la brucelosis es una infección crónica (Pappas y cols., 2005; Corbel, 1997).

Esta enfermedad también es conocida como fiebre del Mediterráneo o fiebre de Malta y afecta tanto especies animales de importancia ganadera como a seres humanos. Fue descrita por primera vez por Bruce en 1887 y es causada por bacterias de diferentes especies del género Brucella, dentro de las cuales destacan B. melitensis (caprinos y ovinos), B. abortus (bovinos) y B. suis (porcinos) (Corbel, 1997).

La brucelosis se considera una de las enfermedades de origen bacteriano más importantes y serias en México, debido no solo a su incidencia en humanos, sino también a las pérdidas que causa en el área agrícola y ganadera. Tradicionalmente, México es reconocido como sitio endémico de brucelosis y durante los últimos años se reportan en promedio 3,500 nuevos casos diagnosticados en humanos, y estos están íntimamente relacionados con el consumo de productos contaminados. Las autoridades de salud reportan 28.7 casos de brucelosis por cada millón de habitantes y aproximadamente 20 defunciones por año, directamente relacionadas con la enfermedad (Luna-Martínez y cols., 2002; Pappas y cols. 2006).

La principal forma de contagio en el hombre es el consumo de productos lácteos contaminados, también se puede adquirir por el contacto con secreciones, excreciones, tejidos contaminados o incluso por la inhalación de aerosoles (Covert y cols., 2005). Los grupos de más riesgo son veterinarios, granjeros y todo aquel que consuma productos contaminados (Yingst y Hoover, 2003).

La prevención de la brucelosis en humanos depende de la erradicación y control de la enfermedad en los animales, además de una higiene adecuada para evitar el contacto con productos contaminados ya que hasta el momento no se cuenta con una vacuna 100% eficaz para el ganado y tampoco existe vacuna viable para uso en humanos (Schurig y cols., 2002; Covert y cols., 2005). Genero Brucella. El agente causal de la brucelosis o fiebre de Malta, fiebre ondulante, fiebre recurrente, o fiebre del Mediterráneo, fue aislado por David Bruce en 1886 del bazo de personas muertas por la infección, y lo nombró Micrococcus melitensis (Castañeda 1986). Al género bacteriano actualmente se le denomina Brucella. Las bacterias de este género son bacilos cortos, gram negativos, sin cápsula, flagelos, endosporas ni plásmidos. Las especies de este género son catalasa positivo, con actividad variable de oxidasa y ureasa, y producción variable de ácido sulfhídrico (Young, 1995).


La brucelosis afecta a muchas especies de mamíferos domésticas y silvestres. Provoca aborto epizoótico en la hembra y orquitis en el macho (Dornand et al. 2002). La infección, que puede ser septicémica o en sitios focalizados, se transmite al hombre por la ingestión de lácteos, o por el contacto directo con la sangre o secreciones de animales infectados, o con muestras de laboratorio, a través de las mucosas, piel escoriada o la conjuntiva (Young, 1995). Brucella tiene un marcado tropismo hacia las células del sistema retículo endotelial (Pappas et al., 2005). La enfermedad se manifiesta en al menos dos fases: fase aguda y fase crónica. La fase aguda se caracteriza por presentarse con episodios de fiebre recurrente, pérdida de peso, fatiga, anorexia, sudoración nocturna, linfadenopatia, y ocasionalmente esplenomegalia (http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap7/capitulo.html). Si la enfermedad no es tratada adecuadamente, tiende a ser crónica, presentándose en forma focalizada, con complicaciones osteoarticulares, hepatobiliares, pulmonares, neurológicas y cardiovasculares. La localización y la intensidad de los síntomas determina la evolución de la enfermedad (Jiménez de Bagüés et al., 2004) Respuesta inmune vs. Brucella abortus. Los mecanismos del sistema inmune contra B. abortus involucran la activación de células T antígeno-específicas, CD4+ y CD8+ y la repuesta inmune humoral (Golding y cols. 2001). Al igual que en otras infecciones con bacterias intracelulares (como Mycobacterium tuberculosis o Salmonella typhi) la inmunidad celular juega un papel crítico en la protección contra B. abortus, aunque se ha observado que los anticuerpos específicos para el polisacárido O puede conferir cierto nivel de protección. Los ensayos de transferencia pasiva indican que las células T CD4+ y CD8+ participan en la protección inmunológica, ya sea secretando IFN-γ, que estimula la actividad antimicrobiana de los macrófagos, o promoviendo la lisis de las células infectadas por medio de linfocitos T citotóxicos específicos (He y cols., 2001, Wyckoff, 2002).

En general, se establecen dos mecanismos de citotoxicidad mediada por linfocitos T, la vía que implica la secreción de gránulos (vía secretora) y la vía no secretora, basada en la unión de Fas y FasL o TNF-TNFR (Russell y Ley 2002).

En la vía secretora, que implica la secreción de gránulos contenidos en el linfocito T citotóxico (CTL), los principales componentes de muerte son proteínas serin-proteasas llamadas granzimas y proteínas que provocan daño a la membrana celular conocidas como perforinas, las cuales al ser secretadas inducen la muerte de la célula blanco por un mecanismo que involucra la polimerización e inserción de perforina en la membrana formando canales transmembranales por los cuales ingresan la granulisina y las granzimas que a su vez activan la cascada de caspasas y con ello la apoptosis de la célula (Trapani y Smyth, 2002; Lieberman, 2003a).

La vía no secretora se basa en la interacción de Fas-L y Fas o TNF-TNFR. Fas-L es una proteína integral de membrana del linfocito T que al unirse con Fas trimerizado inducen la muerte de la célula blanco vía apoptosis por la activación del dominio de muerte al cual se une FADD (dominio de muerte asociado a Fas) y esto a su vez da lugar a la unión de procaspasa 8 y su posterior autoactivación que inicia por un lado la cascada de las caspasas efectoras (caspasas 3, 6 y 7) que llevan a la apoptosis de la célula y por el otro la liberación de citocromo c por el aumento de la permeabilidad mitocondrial por la activación de tBID a partir de BID y la consecuente formación del apoptosoma y activación de caspasa 9 que también dan origen a la fragmentación del DNA y la formación de cuerpos apoptóticos (Abbas y Lichtman, 2004; Berke, 1991; Lieberman, 2003b; van de Brink y Burakoff, 2002).


El TNFR es una proteína de membrana, que forman homotrímeros al unirse con su ligando TNF y pueden dar origen a señales que provocan la muerte celular; debido a la formación del dominio de muerte, el cual permite se acople el dominio de muerte asociado al receptor de TNF (TRADD), para unirse con el dominio de muerte asociado con Fas, dando origen como en el caso de Fas-FasL a la activación de la caspasa 8 y por consiguiente a las caspasas efectoras que conllevan a la apoptosis de la célula (Abbas y Lichtman, 2004; Mitsiades y cols. 2003; Lieberman, 2003a; van de Brink y Burakoff, 2002).

Dentro de los mecanismos que tiene Brucella para evadir la respuesta inmune, se ha observado que B. abortus resiste el ataque de neutrófilos y se replica dentro de macrófagos y de células fagocíticas no profesionales, manteniendo por largo tiempo la estancia dentro de las células hospederas (Oliveira y cols. 2002; Dornand y cols. 2002). Se ha reportado que en el individuo infectado con B. abortus, ésta se multiplica dentro del fagosoma de las células fagocíticas (por ejemplo macrófagos), inhibiendo la fusión fagosoma-lisosoma. También se conoce que B. abortus puede producir las proteínas SOD y catalasa, que tienen la propiedad de neutralizar a los radicales libres del oxígeno que son generados por la NADPH oxidasa de los fagocitos. Esta proteína cataliza la reacción para convertir el radical superóxido (O2 ) en peróxido de hidrógeno (H2O2), y posteriormente en oxígeno molecular (O2) y agua (H2O), neutralizando así esta vía de ataque a microorganismos (Beck y cols., 1990).

Fig. 1. Factores de virulencia de Brucella spp. Tomado de Roop et al., (2004)


Fig. 2 Tránsito intracelular de Brucella spp en macrófagos (Celli et al., 2003)

Fig 3. Respuesta inmune hacia Brucella spp. La bacteria entra en el macrófago y sobrevive dentro de un autofagosoma para luego multiplicarse en una vesícula asociada con el retículo endoplásmico. La inhibición del TNF-α por parte de la bacteria impide el efecto bactericida de las células NK y los macrófagos. La producción de IFN-γ activa el efecto bactericida de los macrófagos, la inducción de células T citotóxicas, la activación de las células NK, y la síntesis de anticuerpos. Las flechas rojas indican efecto negativo, las azules efecto positivo y las negras muerte (Pappas et al., 2005)-


Métodos de vacunación. Con la intención de buscar métodos eficaces de inmunización contra B. abortus se han desarrollado vacunas a partir de cepas vivas silvestres y cepas muertas, entre las que destacan, por su eficacia, las cepas 19 y la RB51, que es la vacuna bovina oficial en muchos países (Schurig y cols., 2002).

B. abortus RB51 es una cepa viva atenuada rugosa (desprovista de la cadena O en el lipopolisacárido), resistente a rifampicina, que fue obtenida a partir de la cepa virulenta 2308 por medio de múltiples pases in vitro e in vivo, y es utilizada como vacuna viva contra la brucelosis en ganado vacuno (Saldarriaga y Rugeles, 2002; Schurig y cols., 1991 y 2002). Ésta induce la protección mediada por inmunidad celular. Estudios en ratón demuestran que, tras la vacunación con la cepa RB51, se desarrolla una respuesta citotóxica específica de células T CD8+, mientras que las células T CD4+ muestran cierta actividad lítica contra las células infectadas, además de incrementar la secreción de IFN-γ (He y cols. 2001).

Otro estudio reporta que la inoculación de B. abortus RB51 en ratones BALB/c induce la citotoxicidad específica de linfocitos T contra macrófagos J774.A1 infectados contra la misma cepa vacunal RB51 y contra la cepa virulenta 2308, encontrando también que esta citotoxicidad no se llevó a cabo contra macrófagos infectados con Listeria monocytogenes. Dentro del mismo estudio se encontró que la población CD3+CD4+ secretaba altos niveles de IFN-γ y su actividad se llevó a cabo contra macrófagos J774A.1 infectados y no infectados. En cambio, los linfocitos T CD3+CD8+ que secretaron niveles bajos de IFN-γ tienen una alta especificidad citotóxica contra macrófagos infectados con diferentes cepas de Brucella lo que sugeriría que las poblaciones CD3+CD4+ y CD3+CD8+ tienen un papel sinérgico en la actividad contra la infección con Brucella spp. (He y cols. 2001). Los antígenos recombinantes de Brucella spp como HtrA, GroEL, GroES, YajC, UvrA, L7, L12 y SOD Cu/Zn, inducen la respuesta inmune humoral y celular. La SOD Cu/Zn ha sido capaz de inducir además cierto nivel de protección en infecciones en ratón (Al-Mariri y cols. 2001). Superóxido dismutasa dependiente de Cu+2 y Zn2+. La SOD Cu/Zn es una metaloenzima que convierte los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno, y esto es un factor de virulencia de muchas bacterias patógenas, incluyendo B. abortus (Kim y cols. 2000), ya que a través de esta actividad enzimática la bacteria puede neutralizar los niveles tóxicos de las especies reactivas de oxígeno, porque cataliza la dismutación del ión superóxido a peróxido de hidrógeno que posteriormente es destoxificado por acción de la catalasa (Cox y cols. 2003; Gee y cols. 2005).

SOD Cu/Zn tiene un peso molecular aproximado de 16 kDa, está compuesta por una cadena de 154 aminoácidos, es una proteína básica con un pH de 8.25-8.6 y en B. abortus se encuentra en el espacio periplásmico (Beck y cols., 1990; Kim y cols., 2000).

En 1999, Oñate y cols. reportaron cierta protección contra la cepa virulenta B. abortus 2308 en ratones que fueron inoculados con E. coli recombinante que expresa SOD Cu/Zn de B. abortus RB51, aunque no detectaron niveles de protección similares a los que se alcanza al vacunar con la cepa vacunal RB51.

Apoyando este trabajo, Vemulapalli y cols., en el 2000a encontraron que al sobreexpresar en una bacteria transformada de RB51 el antígeno SOD Cu/Zn se indujo un aumento significativo en la resistencia a la infección contra la cepa virulenta 2308 en ratones BALB/c, comparado con un grupo de ratones inyectados con la cepa vacunal B. abortus RB51 no transformante. Los ratones inoculados con cepas transformantes que contenían plásmidos que expresan antígenos como las proteínas SOD o GroEL de B. abortus se inducía preferentemente una repuesta de tipo Th1 con producción significativa de IFN-γ; sin IL-4 (Vemulapalli y cols., 2000b).


En trabajos posteriores se evaluó la eficacia protectora de un vector de DNA portando el gen que codifica para la SOD Cu/Zn de B. abortus RB51, la cual se administró a ratones BALB/c. Estos ratones desarrollaron respuestas Th1 con alta producción de IFN-γ pero no de IL-10 e IL-4. Así mismo, los ratones inoculados con el plásmido con el gen para la SOD desarrollaron niveles de protección contra la cepa virulenta 2308 y estos niveles fueron similares a los que se obtuvieron vacunando con la cepa RB51 (Oñate y cols., 2003).

Otros trabajos con vacunas de DNA fueron reportados por Cassataro y cols. en el 2005, en donde se encontró actividad protectora contra dos especies diferentes, B. melitensis y B. ovis, al inocular ratones BALB/c con DNA que codifica para la proteína de membrana externa Omp31, la que indujo una repuesta cooperadora de linfocitos T con producción de IFN-γ, además de despertar la respuesta citotóxica por la vía de perforinas (CD3+CD8+) y muerte celular por vía Fas-FasL (CD3+ CD4+).

Muñoz-Montesinos y cols. en el 2004 evaluaron la actividad citotóxica de los linfocitos T inducidos por la vacuna de DNA propuesta por el grupo de Oñate en el 2003, para lo cual inyectaron directamente el plásmido en el bazo de ratones BALB/c, después de 4 semanas, los esplenocitos de estos ratones mostraron producción de IFN-γ y actividad citotóxica por los linfocitos T CD3+CD4+ y CD3+CD8+, respectivamente, después de ser inducidos con la SOD. Sin embargo, no se observó un nivel significativo de protección contra la cepa virulenta 2308. Un trabajo publicado por Oñate y cols. en el 2005, proponen una vacuna contra B. abortus diseñada a base de RNA que codifica para SOD insertado o acarreado en partículas de un virus deficiente en su replicación conocido como virus Semliki Forest (SFV). Este vector fue inyectado por vía intraperitoneal en ratones BALB/c y se evaluó su capacidad de desarrollar respuesta protectora mediada por linfocitos T contra la cepa virulenta 2308. La estimulación in vitro con la superóxido dismutasa de los esplenocitos de los ratones inyectados con el vector mostraron una respuesta de IFN-γ y actividad citotóxica mediada por linfocitos T específicos, por lo que proponen que el vector SFV que acarrea al RNA de SOD funcione como vacuna contra infecciones por B. abortus. Actualmente la prevención de la brucelosis humana depende del control y erradicación de la enfermedad en animales combinado con un adecuado tratamiento de los alimentos de origen animal que pueden ser una potencial fuente de contaminación. Sin embargo, este control no es posible por lo que es necesario desarrollar agentes apropiados para la vacunación contra la brucelosis (Schurig y cols., 2002). OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto citotóxico de linfocitos T de ratones inmunizados con SOD Cu/Zn, sobre macrófagos infectados con las cepas RB51 y 2308 de Brucella abortus. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Producir la proteína SOD Cu/Zn recombinante a partir de la cepa E. coli que contiene el plásmido pBAD SOD Cu/Zn.

2. Purificar la proteína SOD Cu/Zn recombinante por cromatografía de afinidad y exclusión molecular.

3. Evaluar el efecto citotóxico de linfocitos T de ratones inmunizados con SOD Cu/Zn recombinante, sobre macrófagos infectados con las cepas RB51 y 2308 de Brucella abortus.


MÉTODOS Y MATERIALES Cepa Escherichia coli-pBAD SOD Cu/Zn. Esta cepa fue obtenida por Paredes y González (2005), la semilla se mantuvo en caldo LB suplementado con ampicilina (Pentrexil, Bristol-Myers Squibb) a una concentración de 100 μg/ml, haciendo resiembras cada 30 días. Esta cepa E. coli-pBAD-SOD Cu/Zn contiene un plasmado (pBAD) que tiene clonado el gen sodC. Producción de la SOD Cu/Zn recombinante. Una vez que la cepa recombinante de E. coli pBAD SOD Cu/Zn se recuperó, se creció masivamente para purificar la proteína SOD Cu/Zn. Brevemente, se inocularon 200 μl de la semilla de E. coli pBAD SOD Cu/Zn en 5 ml de caldo LB adicionado con ampicilina (100 μg/ml) y se incubó 24 h a 37°C, con agitación rotatoria a 120 rpm en agitador orbital; posteriormente, se tomaron 200 μl y se resembraron en 5 ml de medio LB con ampicilina (100 μg/ml) y se incubó nuevamente 24 h a 37°C, con agitación rotatoria a 120 rpm. Al término, se vertieron los 5 ml de medio LB con E. coli-pBAD SOD Cu/Zn en 100 ml de medio LB con ampicilina (100 μg/ml) y se incubó durante 3 h a 37°C, con agitación rotatoria a 120 rpm. Para inducir la producción de SOD Cu/Zn por la E. coli-pBAD SOD Cu/Zn recombinante se adicionó L-arabinosa al 20% a una concentración final de 0.02% y se dejó incubar por 4 h más a 37°C, 120 rpm. Una vez terminada la inducción, la biomasa se centrifugó a 12,500 g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se desechó y el botón bacteriano se resuspendió en 4 ml de regulador de lisis, se colocó en un baño de hielo y se sonicó (Vibra Cell, Sonic & Material Inc. Danbury Connectucut USA), aplicando de 15 a 20 pulsos durante 42 s, nivel de intensidad 5, dejando entre pulso y pulso 2 minutos de reposo en baño de hielo para evitar la desnaturalización por calentamiento de la proteína. El sonicado se centrifugó a 25,000 g durante 10 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante (SOD Cu/Zn recombinante).

En otros experimentos se utilizó la prensa French (SLM Aminco Spectronic Instruments) para lisar la bacteria. El botón bacteriano se resuspendió en 20 ml de regulador de lisis, se colocó en la prensa French y se aplico una presión de 20,000 lb/pulg2. La suspensión bacteriana se centrifugó a 25,000 g durante 10 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante (SOD Cu/Zn recombinante). Purificación de la SOD Cu/Zn recombinante por resina de níquel-agarosa. La purificación de la proteína se realizó en dos pasos: El primero consistió en una pre-purificación utilizando una columna de afinidad de níquel-agarosa (Ni-NTA, QUIAGEN GMBH, Alemania) ya que la construcción del plásmido pBAD-TOPO-SOD Cu/Zn codifica para la proteína SOD Cu/Zn recombinante con un péptido de 6 histidinas en el extremo carboxi-terminal, que tiene alta afinidad por el níquel.

Antes de que se colocara el sobrenadante del sonicado de la E coli-pBAD-SOD Cu/Zn inducida con L-arabinosa a interactuar con la resina de níquel, ésta última se lavó 2 veces con el doble de volumen de regulador de lavado y se centrifugó a 500 g durante 2 minutos. Para la interacción del sobrenadante del sonicado con la resina (en una proporción de 1.5 ml de resina de níquel agarosa por cada 100 ml de medio LB ó 4 ml de regulador de lisis) se colocó en hielo y agitación constante durante 2 h. Terminado este tiempo, se cargó la resina más el sobrenadante en una jeringa de 10 ml y se montó en un soporte universal, una vez empacada la columna se llevó a cabo el lavado de las proteínas que no interactuaron con la resina, se agregaron 30 ml de regulador de lavado por cada 1.5 ml de resina ocupada. Para eluir la proteína recombinante se agregaron por cada 1.5 ml de resina, 500 μl de regulador de elusión por fracción, recuperando 6 fracciones eluidas de la columna.


Para localizar y analizar la pureza de la proteína SOD Cu/Zn recombinante en las fracciones recuperadas, éstas se corrieron en PAGE-SDS al 12.5 %, de 1.5 mm de grosor. Las fracciones donde se detectó a la proteína se mezclaron y se almacenaron en alícuotas de 500 μl en congelación a -20°C hasta su uso. Cuantificación de proteínas totales por reacción con el ácido bicinconínico (BCA). El método del BCA se basa en la reacción de las proteínas con Cu+2 en un medio alcalino, produciendo Cu+ que es detectado por el ácido bicinconínico (BCA). Este método fotocolorimétrico es altamente sensible (nivel de detección mínimo 5 μg/ml).

El reactivo A se compone de carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, reactivo de detección BCA y tartrato de sodio en hidróxido de sodio 0.2 N. El reactivo B fue sulfato de cobre al 4%. El reactivo C es la mezcla de 1 parte de reactivo B con 50 partes de reactivo A.

Se siguieron las especificaciones de fabricante. Brevemente, se preparó una curva de calibración con una solución madre de BSA de 2 mg/ml con las siguientes concentraciones: 200, 400, 600, 800, 1000 y 1200 μg/ml. En una placa de ELISA de 96 pozos se colocaron, por triplicado, 10 μl de cada una de las concentraciones de la curva de calibración, además de colocar, por triplicado, la SOD Cu/Zn recombinante concentrada y diluida 1:2 y regulador de elusión como blanco. A cada pozo se le adicionaron 200 μl del reactivo C y posteriormente se agitó la placa durante 30 segundos y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Por último, la placa se leyó en un lector de ELISA empleando el filtro de 540 nm. La concentración de proteína total se obtuvo a partir de la interpretación de la curva de calibración. Concentración de la SOD Cu/Zn recombinante por Centricón. Antes de pasar la SOD Cu/Zn recombinante por la columna de FPLC se concentró la muestra utilizando el sistema Centricon Plus-20 (Millipore, Bedfor, MA, USA), centrifugando la muestra durante 20 minutos en intervalos de 4 minutos a 2500 g, a una temperatura de 8°C, de esta forma se obtuvo una fracción negativa con los componentes menores a 10,000 Da y una fracción positiva con los componentes que se encuentren por arriba de los 10,000 Da. Para recuperar la muestra concentrada se centrifugó nuevamente durante 2 minutos a 800 g a 8°C, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para corroborar la concentración de la SOD Cu/Zn recombinante se cuantificó nuevamente la cantidad de proteína por el método del BCA y se corrieron geles de poliacrilamida (12.5%, 1.5 mm). Purificación de la SOD Cu/Zn recombinante por FPLC. Esta se llevó a cabo por el sistema FPLC (Fast-Protein Liquid Cromatography) donde se utilizó una columna de exclusión de peso molecular (PM) Superose 12 10/300, (Amersham Biopharmacy) que fue equilibrada con dos volúmenes de columna de PBS 1x, cargando 100 μl de muestra que consistió en la mezcla de las fracciones que contenían a la proteína SOD Cu/Zn obtenida por interacción de resina de níquel-agarosa. La muestra eluyó a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. y se colectaron fracciones secuenciadas de 500 μl. La elusión fue seguida espectrofotométricamente a una longitud de onda de 280 nm. Todas las soluciones utilizadas fueron previamente filtradas dos veces por membranas de 0.22. μm y desgasificadas en un baño sónico (Ultrasonic Cleaner. Cole Palmer Instruments, Illinois, USA), durante 15 minutos. Cada uno de los lotes se trabajaron por separado y al final se concentraron las fracciones correspondientes a las SOD Cu/Zn recombinante para determinar la concentración de proteína por BCA.

El peso molecular aproximado de las proteínas eluidas por el sistema FPLC en la columna de superosa 12 10/300 GL, se determinó mediante el corrimiento previo de un estándar de peso molecular para filtración en gel (Bio-Rad), para el cual se usó como


regulador de elusión una solución de fosfatos 0.5 M y NaCl 0.15 M, la muestra se eluyó a una velocidad de flujo 0.5 ml/min. A partir del cromatograma que se obtuvo por el registro espectrofotométrico, se calculó el peso molecular aproximado de las proteínas obtenidas mediante la construcción de una gráfica del logaritmo del peso molecular vs. el volumen de elusión de los componentes proteínicos del estándar (Tabla 3).

Tabla 1. Componentes del estándar de peso molecular para filtración en gel Proteína Peso Molecular

(kDa) Tiroglobulina bovina 670.00 γ-globulina bovina 158.00 Ovoalbúmina pollo 44.00 Mioglobina caballo 17.00

Vitamina B12 1.35 Esquema de inmunización en ratones. Para evaluar la respuesta inmune celular hacia la proteína SOD Cu/Zn recombinante, se inocularon ratones hembras BALB/c, de 4 a 6 semanas de edad, adquiridos del bioterio del Instituto Nacional de Nutrición y Ciencias Médicas “Salvador Zubirán”, SSA. El grupo testigo de 6 ratones se inoculó intramuscularmente en el muslo con PBS 1x mezclado con adyuvante TiterMax. Otro grupo de 6 ratones se inoculó intramuscularmente en el muslo aplicando 25 μg de la proteína recombinante (SOD Cu/Zn) por ratón, mezclada con adyuvante TiterMax, bajo las condiciones que especifica el fabricante. Los ratones se inocularon 3 veces con la misma dosis (75 �g totales), las dos primeras con intervalos de 7 días y el tercero de 48 a 72 h antes de sacrificar a los ratones(Al-Mariri y cols 2001; Geluk y cols. 1998). Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se extirparon los bazos en condiciones asépticas para evaluar la respuesta inmune celular. Enriquecimiento de linfocitos T. El bazo de los ratones de ambos grupos, se maceró con 3 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA) suplementado con 5% de suero fetal bovino (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA) sobre una malla de acero inoxidable de poro cerrado para eliminar los restos de tejido. La suspensión se centrifugó a 250 g a 4°C durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y el botón celular se resuspendió en 2 ml de solución de lisis para eritrocitos (NH4Cl 150 mM, KHCO3 1mM, Na2EDTA 0.1 mM, pH 7.4) incubando 10 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se agregaron 2 ml de medio de cultivo, se mezcló la suspensión y se centrifugó durante 5 minutos a 250 g a 4°C.

Para enriquecer la suspensión de bazo en linfocitos T el paquete celular se resuspendió en 2 ml de medio de cultivo para transferir a las columnas de lana de nylon montadas en jeringas desechables cargadas con 1 g de lana de nylon peinada, previamente equilibradas con medio de cultivo durante 1 h a temperatura ambiente. La suspensión celular se cargó por la parte superior y se abrió la llave del conector en el extremo inferior de la columna para dejar que eluyeran aproximadamente 2 ml de medio de cultivo y se dejó reposar la columna durante 15 minutos. Una vez transcurrido el tiempo, se abrió la llave para que eluyeran otros 2 ml de medio y se agregaron a la columna 2 ml más de medio dejando reposar 15 minutos, repitiendo este paso 3 veces, permitiendo así que las células adherentes se queden pegadas a la lana de nylon, y las células no adherentes (linfocitos T) eluyan hacia la parte inferior de la columna. Finalmente se abrió la llave y se adicionaron 45 ml de medio de cultivo para recuperar la


población no adherente. Estas células se lavaron por centrifugación durante 5 minutos a 250 g a 4°C; el botón se resuspendió en un ml de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2mM de L-glutamina y 1% de aminoácidos esenciales, y se determinó la viabilidad y el número de las células enriquecidas en linfocitos T por exclusión de azul tripano.

En los experimentos donde se indique, se purificaron los linfocitos T por selección positiva de las células CD 90+, para lo cual, el paquete celular obtenido a partir de los bazos de los ratones se centrifugaron durante 5 minutos a 250 g a 4°C y se resuspendió en un ml de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado y se determinó la viabilidad y número de las células por exclusión con azul tripano. Nuevamente se centrifugó a 250 g durante 5 minutos a 4°C y se resuspendió en 90 μl de regulador de separación (PBS 1x, pH 7.2, suplementado con 0.5% de SFB) por cada 107células totales, posteriormente se adicionaron 10 μl de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo monoclonal de ratón anti CD90+ (MACS CD90 Thy1.2 MicroBeads, Miltenyi Biotec) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó 250 g durante 5 min. a 4°C y se lavó con 15 veces el volumen de regulador de separación que se utilizó y nuevamente se centrifugó 250 g durante 10 minutos a 4°C. El botón celular fue resuspendido en 500 μl de regulador de separación por cada 108 células. Se colocó una columna para separación magnética LS (Miltenyi Biotec) en el separador magnético VarioMacs (Miltenyi Biotec) y se lavó con 3 ml de regulador de separación, y se adición la suspensión celular, después se agregó 3 veces 3 ml de regulador de separación para lavar las células CD90-, por último, se retiró la columna del magneto y se colectó la suspensión celular enriquecida CD90+ con un lavado con 5 ml de regulador de separación y ayuda del embolo de la columna.

Estas células se centrifugaron durante 5 minutos a 250 g rpm a 4°C; el botón se resuspendió en un ml de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado y se determinó la viabilidad y el número de las células T por exclusión de azul tripano. Preparación de células estimuladoras. Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron masivamente 2 cajas Petri de 12 cm. de diámetro con B. abortus RB51 en agar AST 48 horas antes de su uso. Se utilizaron macrófagos de la línea celular J774A.1 como células estimuladoras; éstas se cultivaron hasta una confluencia del 90% en botellas de 25 cm2 conteniendo 3 ml de medio D-MEM suplementado con 10% de SFB. Se infectaron con una suspensión bacteriana de B. abortus RB51 en PBS 1x a una MOI de 100, durante 60 minutos a 37°C, en atmósfera de humedad y 5 % de CO2. Una vez terminado el tiempo de infección se eliminó el sobrenadante de las botellas de cultivo lavando con PBS 1x estéril y se eliminaron las bacterias extracelulares incubando con 25 μg/ml de gentamicina, durante 1 h, bajo condiciones de cultivo. Posteriormente se lavaron nuevamente con PBS 1X y se desprendieron los macrófagos con un raspador; las células infectadas se transfirieron a tubos de ensayo siliconizados y se lavaron por centrifugación a 250 g durante 5 minutos con 2 ml de medio D-MEM suplementado con 5% de suero de caballo, el botón se resuspendió y se dejó en incubación 1 h a 37 °C en 2 ml de medio D-MEM con 10% de suero de caballo y adicionado con 35 μg/ml de mitomicina C para inhibir la proliferación celular. Las células se lavaron nuevamente por centrifugación a 250 g durante 5 minutos con 2 ml de medio D-MEM suplementado con 5% de CO2 y posteriormente se resuspendió en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, L-glutamina 2mM y 1% de aminoácidos esenciales. Se evaluó la viabilidad y se determinó el número de los macrófagos por exclusión de azul tripano. Inducción de células T. La población enriquecida de células T se sembró en una placa de 24 pozos, a una concentración de 4x106 células viables/pozo, con 1x105 macrófagos


infectados con la cepa RB51 (células estimuladoras), durante 5 días a 37°C y 5% de CO2. La distribución fue la siguiente: Placa 1) Linfocitos T SOD Cu/Zn + macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 Placa 2) Linfocitos T PBS + macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 Preparación de células blanco. Para los ensayos de citotoxicidad, se utilizaron como células blanco macrófagos J774A.1, infectados por separado con B. abortus cepa RB51 y 2308; estas células se prepararon como se describe en el protocolo para la preparación de células estimuladoras con la cepa RB51. Evaluación de la actividad citotóxica. Al quinto día de cultivo se cosecharon las células T inducidas, éstas se cosecharon de cada uno de los pozos y se centrifugaron en Histopaque (densidad de 1.083g/ml) a 120 g durante 10 minutos, para eliminar a las células muertas. Se recuperaron las células de la interfase formada entre el Histopaque y el medio de cultivo y se llevó a un volumen de un ml de medio RPMI 1640, suplementado con 10 % de SFB para cuantificar el número de células y su viabilidad por exclusión de azul tripano.

Se ajustaron las células en distintas relaciones célula efectora a macrófago infectado o no infectado (célula blanco, 200,000 células por pozo) en un volumen total de 200 μl y se colocaron en una microplaca de cultivo celular de 96 pozos. La placa se centrifugó a 120 g durante 5 minutos y se incubó 4 h a 37°C con saturación de humedad y 5% de CO2.

Pasado este tiempo, se colectaron los sobrenadantes y se guardaron a -4°C en tubos para microcentrifuga. Cada pozo de la placa de cultivo celular de 96 pozos se lavó con PBS 1X adicionado con 0.5% de albúmina sérica bovina, después se adicionaron 200 μl de colorante rojo neutro al 0.036% en PBS 1X tibio y se incubó una h. Al término de la incubación, se lavó 2 veces con 200 μl de PBS 1X adicionado con 0.5% de BSA cada uno de los pozos para eliminar el exceso de rojo neutro. Para lisar los macrófagos y solubilizar el colorante se adicionaron 250 μl por pozo de SDS 0.5% en ácido acético 0.05M, para después leer la absorbancia en un lector de ELISA a una longitud de onda de 540 nm. El porcentaje de citotoxicidad se determinó utilizando la siguiente fórmula: A del testigo – A del problema % de citotoxicidad = ______________________________ X 100 A del testigo RESULTADOS Producción de la SOD Cu/Zn recombinante. La SOD Cu/Zn recombinante se produjo a partir del cultivo de la cepa de E. coli-pBAD-SOD Cu/Zn en medio Base Lennox (LB). La proteína recombinante fue pre-purificada en columna de afinidad con resina de níquel-agarosa. Se produjeron 6 lotes de proteína clasificados en Lote A, B, C, D, E y F. De cada uno de estos lotes se obtuvieron de 5 a 8 fracciones de las cuales se colectaron las fracciones que fueron identificadas como positivas en SD-PAGE al 12.5% de poliacrilamida, tomando como referencia la SOD Cu/Zn recombinante obtenida por Paredes, 2005 (Figura 2). En estos geles se observaron, además otras bandas que fueron indicio de la contaminación de la proteína SOD Cu/Zn recombinante con proteínas con pesos moleculares mayores a la SOD Cu/Zn recombinante. Las fracciones positivas, que en general fueron las identificadas como las fracciones 2 a 5, se juntaron y se almacenaron en fracciones de 500 μl a -20°C hasta su uso.


Figura 2. Prepurificación de SOD Cu/Zn recombinante. Pre-purified recombinant SOD Cu/Zn protein. SDS- PAGE 12.5% from one batch of recombinant SOD Cu/Zn protein. The SOD Cu/Zn has a MW of 20KDa. The image is representative of five different batches that were produced of recombinant SOD Cu/Zn protein. Lane 1: Molecular weight marker. Lane 2: Recombinant SOD Cu/Zn.

En la figura 3 se muestra un gel de poliacrilamida al 12.5%, de 1.5 mm con los diferentes lotes de la proteína recombinante SOD Cu/Zn, pre-purificados en la columna de níquel-agarosa, donde se observaron las bandas correspondientes al peso molecular esperado para la SOD Cu/Zn recombinante.

Una vez que se identificaron las fracciones positivas para la SOD Cu/Zn recombinante se juntaron y cuantificaron las proteínas totales, se elaboró una gráfica de calibración con BSA, a partir del cual se calculó la concentración de proteínas totales, obteniendo en total 2.5348 mg/ml de la SOD Cu/Zn recombinante y sus contaminantes (Tabla 4).

Tabla2. Concentraciones de SOD Cu/Zn recombinante de los lotes obtenidos de la columna de níquel-agarosa.

Lote Concentración de la SOD Cu/Zn

Lote A 449 μg/ml Lote B 249.9 μg/ml Lote C 727.5 μg/ml Lote D 631.6 μg/ml Lote E 476.8 μg/ml


Concentración de la SOD Cu/Zn recombinante con CENTRICON plus 20. La mezcla de cada lote de proteínas recuperadas de la columna de afinidad de níquel-agarosa se concentró para correr la muestra en la columna de exclusión molecular del FPLC. Se obtuvieron dos fracciones: una negativa y una fracción positiva que contenía la proteína SOD Cu/Zn recombinante. Para corroborar la pureza de la muestra se corrieron las dos fracciones en geles de poliacrilamida al 12.5%, 1.5 mm (Figura 4), en donde se observó que la fracción negativa no existió presencia de proteínas, las cuales quedaron concentradas en su totalidad en la fracción positiva.

Figura 5. Gel de poliacrilamida para las fracciones positiva y negativa recuperadas de la concentración por centricón de la SOD Cu/Zn recombinante. Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2: Fracción negativa. Carril 3: Fracción positiva Purificación de la SOD Cu/Zn recombinante por FPLC. Para conocer el volumen donde se esperaba que eluyera la SOD Cu/Zn recombinante, se corrió en FPLC un estándar de proteínas en la columna superosa 12 10/300 GL, de donde se obtuvo el cromatograma mostrado en la figura 5.


Figura 6. Cromatograma del estándar de peso molecular para filtración en gel corrido en FPLC en columna Superosa 12 10/300 GL. Regulador de elusión de PBS 1x, Flujo 0.5 ml/min. A: Proteínas agregadas, B: Tiroglobulina bovina 670 kDa, C: �-globulina bovina 158 kDa, D: Ovoalbúmina pollo 44 kDa, E: Mioglobina caballo 17 kDa y F: Vitamina B12 1.35 kDa

La SOD Cu/Zn recombinante obtenida de la columna de níquel agarosa y concentrada en Centricón Plus-20 se cargó en la columna de exclusión de peso molecular Superosa 12 10/300 GL y se corrió en FPLC, utilizando como regulador de elusión PBS 1x, con una velocidad de flujo de 0.5 ml/min., colectando fracciones de 750 μl. En la figura 6 se muestran tres cromatogramas representativos de tres lotes diferentes de proteína, en estos cromatogramas se observó la reproducibilidad del método de purificación y de manera reiterada el pico que se suponía correspondía a la SOD Cu/Zn recombinante eluía alrededor de los 15 ml de volumen de elusión, por lo que se procedió a determinar el peso molecular de las fracciones recuperadas.

mUA (280 nm)

ml


Figura 7. Cromatogramas de dos lotes diferentes de SOD Cu/Zn recombinante corridos por FPLC en la columna Superosa 12 10/300 GL. Regulador de elusión PBS

1x, Flujo 0.5 ml/min. A: Lote A. B: Lote B. C: Lote C

A partir del cromatograma obtenido se calculó el peso molecular de las fracciones colectadas como SOD Cu/Zn recombinante de los diferentes ensayos. Para esto se grafico el logaritmo del peso molecular vs. el volumen de elusión de cada una de las proteínas del estándar (figura 7).

Figura 8. Curva estándar para la determinación del peso molecular.

Con los cromatogramas se realizaron los cálculos para determinar los volúmenes de elusión de tres lotes de SOD Cu/Zn recombinante (tabla 5) y a partir de la ecuación se obtuvo un peso molecular aproximado de 21.88 kDa. Citotoxicidad. Los linfocitos T enriquecidos a través de columnas de lana de nylon o purificados por separación positiva con perlas magnéticas CD90+, de ratones inoculados con SOD Cu/Zn recombinante o PBS 1x se co-cultivaron por separado durante 5 días con macrófagos de línea celular J774A.1 infectados con la cepa vacunal RB51. En la imagen mostrada en la figura 8 (linfocitos de ratones inyectados con PBS) no se observa interacción de los linfocitos T con los macrófagos, mientras que en la figura 9 (linfocitos de ratones infectados con SOD Cu/Zn recombinante), se observaron células linfoides aparentemente activadas, a los 3 días de co-cultivo.


Figura 9. Linfocitos T enriquecidos de ratones inoculados con PBS co-cultivados con macrófagos J774A.1 al tercer día de cultivo. Amplificación 100X

Figura 10. Linfocitos T CD8+ purificados por VarioMACS de ratones inoculados con SOD Cu/Zn recombinante, co-cultivados con macrófagos J774A.1 al tercer día de cultivo.

Amplificación 100X


La evaluación de la actividad citotóxica por ingestión de rojo neutro demostró la

actividad especifica de los linfocitos T enriquecidos de ratones inoculados con la SOD Cu/Zn recombinante contra macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus cepa RB51, con un porcentaje máximo de citotoxicidad de 95.81%, en la relación efector-blanco de 16:1. El porcentaje de citotoxicidad tendió a ir bajando conforme las relaciones efector blanco disminuían, hasta llegar a un porcentaje de 45.38% en la relación 1:1. Estos resultados para el caso de linfocitos T específicos para SOD Cu/Zn recombinante contrastaron con respecto a los datos obtenidos para el control, que consistió en linfocitos T de ratones inoculados con PBS 1x, en los cuales el porcentaje de citotoxicidad promedio contra macrófagos infectados con la cepa RB51 fue de 28.91 (figura 10 y tabla 6).

Figura 11. Efecto citotóxico de las células T enriquecidas de ratones inmunizados con SOD Cu/Zn recombinante o con PBS sobre macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51.


Tabla 4. Porcentajes de citotoxicidad de linfocitos T enriquecidos de ratones inmunizados con SOD Cu/Zn recombinante o con PBS sobre macrófagos J774A.1

infectados con B. abortus RB51 Relación

Efector:Blanco % de Citotoxicidad

LcT SOD vs. Mf RB51 % de Citotoxicidad

LcT PBS vs. Mf RB51 16:1 95.81 30.36 8:1 90.42 19.39 4:1 83.39 24.15 2:1 60.38 32.97 1:1 45.38 37.66

El dato de 95.81 % de citotoxicidad específica, en la relación 16:1 de los linfocitos

T de ratones inmunizados con SOD Cu/Zn recombinante mostrado en la figura 10 y tabla 6, fue resultado de un solo ensayo, por lo que no se desarrolló análisis estadístico, por lo cual se determinó la citotoxicidad específica mediante liberación de lactato deshidrogenasa, con lo que se buscó corroborar los resultados.

Al buscar células en apoptosis por la técnica de Anexina V, se encontró que en los macrófagos sin infectar no se detectan (a) y en los Mf infectados infectados con la cepa 2308 de Brucella abortus y co-cultivados con Lc T CD8+ provenientes de ratones inmunizados con la cepa vacunal RB51, Cuando se trató por la técnica de TUNEL la citotoxicidad, se observaron claramente cambios en la morfología del macrófago y TUNEL positivo en aquel co-cultivo de Lc T CD8+ con Mf infectados con la cepa virulenta 2308, y observados al microscopio de fluorescencia; en donde las flechas indican células evidentemente en apoptosis.


Fig 12. Técnica de TUNEL para co-ultivos de macrófago infectados con B. abortus 2308 y Lc T CD8+. IMPACTO.

La brucelosis provoca importantes pérdidas económicas en áreas endémicas, como México (Corbel, 1997; Pappas y cols. 2006). Actualmente, para la vacunación se emplea la cepa B. abortus RB51, la cual es una mutante rugosa genéticamente estable, obtenida a partir de la cepa 2308, que remplazó a la vacuna a base de B. abortus S19; sin embargo la cepa RB51 no es una vacuna apropiada para ser utilizada en humanos (Ko y Splitter, 2003).

La defensa del sistema inmune contra B. abortus depende de la respuesta inmune celular, los antígenos capaces de generar resistencia contra la infección de B. abortus, son aquellos que inducen la producción de IFN-� y la activación de linfocitos T citotóxicos (Andrews, 2006).

HtrA, YajC y L7/L12 son antígenos recombinantes de Brucella spp que inducen la respuesta inmune humoral y celular, dentro de estos. La SOD Cu/Zn, además es capaz de inducir protección en el modelo murino (Halling, 2002; Vemulapalli y cols. 1998; Oliveira, 1996)

En nuestro grupo se ha establecido la importancia de la SOD Cu/Zn como molécula inductora de la respuesta inmune. En trabajos anteriores se estableció la capacidad de la proteína de ser presentada en macrófagos de línea celular J774A.1 transfectados con el plásmido pcDNAsodC, los cuales fueron reconocidos por linfocitos T de ratones inmunizados con la cepa RB51, y éstos ejercieron su actividad citotóxica de manera específica hasta en un 60% (Estrada, 2004).

Paredes, 2005, en su tesis de maestría clonó el gen sodC de B. abortus en el vector pBAD-TOPO y purificó la proteína recombinante SOD Cu/Zn a partir de E. coli-


pBAD-SOD Cu/Zn. Con esta proteína observó la proliferación celular de los linfocitos T de pacientes con brucelosis aguda ó brucelosis crónica, encontrando la expresión de mRNA para IFN-γ e IL-12, lo que da otro indicio de la capacidad de la SOD Cu/Zn recombinante de inducir la respuesta inmune en el humano.

Por todo lo anterior se planteó evaluar la capacidad de la proteína SOD Cu/Zn recombinante de inducir la formación de linfocitos T citotóxicos específicos per se en ratones BALB/c, y que, éstos fueran capaces de ejercer el efecto citotóxico sobre macrófagos de la línea celular J774A.1 infectados con la cepas de B. abortus RB51 y 2308.

A partir de la cepa E. coli-pBAD SOD Cu/Zn, elaborada por Paredes, 2005, se indujo la producción de la proteína recombinante, la cual se necesitaba purificar para llevar a cabo el presente estudio. Debido a las características del vector utilizado para clonar el gen sodC, la proteína recombinante se expresa con una cola de 6 histidinas en el extremo carboxilo terminal, característica que fue utilizada para llevar a cabo una prepurificación de la SOD Cu/Zn recombinante con una columna de afinidad de níquel-agarosa, que tiene la particularidad de interactuar con 4 y 6 residuos de histidinas con una matriz de ácido nitrilotriacético y níquel (The QIAexpressionist, 2003).

La SOD Cu/Zn recombinante se produjo en seis lotes prepurificados por columna de níquel-agarosa; en todos ellos se comprobó la presencia de la misma utilizando la proteína que Paredes produjo para su estudio; además se confirmó con marcadores de peso molecular la presencia de una proteína de alrededor de 21.88 kDa, resultado que coincidió con lo obtenido por Paredes en su tesis de maestría.

Además de obtener una proteína de aproximadamente 20 kDa en los geles de poliacrilamida se observó la presencia de otras bandas de pesos moleculares mayores y menores a 20 kDa (figura 3), que representaban contaminantes muy posiblemente de proteínas pertenecientes a la E. coli que se utilizó como cepa huésped para la expresión de la SOD Cu/Zn recombinante y éstas proteínas contaminantes deben de tener cuatro, cinco e incluso seis histidinas, razón por la cual interactuaban con la matriz de níquel-agarosa.

Para excluir estos contaminantes y purificar la SOD Cu/Zn recombinante las muestras se pasaron por una columna de exclusión molecular en el sistema de FPLC en columna de superosa 12 10/300 GL, la cual por tener un volumen de columna de 24 ml permite una buena separación (Yang y cols. 2001 y Cohn, 2004).

El pico correspondiente al peso molecular de 20 kDa presentó un volumen de elusión de alrededor de 15 ml, en todos los lotes evaluados (figura 6) y se colecto en dos o tres fracciones de 750 ml, que correspondían a la fracción purificada.

El esquema de inoculación de SOD Cu/Zn a los ratones BALB/c se propuso a partir de lo reportado por Al-Mariri (2001) y Geluk (1998); para potenciar la respuesta hacia la proteína se utilizó un adyuvante sintético.

Con los linfocitos T enriquecidos de los ratones inmunes o no inmunes para la SOD Cu/Zn recombinante, se efectuaron los ensayos de citotoxicidad medida por ingestión de rojo neutro (figura 10 y tabla 6). Estos mostraron una citotoxicidad máxima de 95.81 % con respecto a la relación efector blanco de 16 a 1, con respecto a la citotoxicidad de la misma relación del grupo control, la cual inesperadamente resulto comparable a los resultados obtenidos por Ríos (2004), donde evaluó la citotoxicidad inducida por linfocitos T de ratones inoculados con la cepa vacunal RB51, por lo cual entran en juego para la generación de la respuesta citotóxica todos los componentes antigénicos de la bacteria, sin olvidar que en nuestro caso solo teníamos un componente de el universo bioquímico bacteriano.

Como no fue posible obtener resultados repetitivos en los ensayos de citotoxicidad por la técnica de rojo neutro, además de que se tenia como limitante el número de


linfocitos T obtenidos del enriquecimiento a partir de células de bazo de ratones inmunes y también se necesitaba aumentar las relaciones efector blanco, se propuso evaluar la citotoxicidad por liberación de LDH.

Los resultados obtenidos de los ensayos de citotoxicidad demuestran que los linfocitos T CD8+ purificados a partir del bazo de ratones inmunizados con la proteína SOD Cu/Zn estimulados con macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51, reconocen y llevan a cabo su función citotóxica sobre las células J774A.1 infectadas con B. abortus RB51 ó B. abortus 2308. Los resultados arrojan una citotoxicidad máxima para la relación efector blanco de 32 a 1 de 21.13% para el caso de macrófagos infectados con la cepa RB51 y 22.92% para los macrófagos infectados con la cepa 2308. Por otro lado los linfocitos T de ratones inoculados con PBS y estimulados con macrófagos infectados con la cepa RB51 no ejercieron el efecto citotóxico sobre las células J774A.1 infectadas con la cepa RB51.

Se demostró que la respuesta citotóxica de los linfocitos T generada por la SOD Cu/Zn recombinante es especifica contra células infectadas con la cepa vacunal B. abortus RB51 y contra la cepa virulenta B abortus 2308, siendo esto esperado ya que la cepa RB51 es similar a la cepa 2308.

De tal manera que podemos concluir que la purificación de la proteína recombinante superóxido dismutasa dependiente de Cu+2 y Zn+2, producida a partir de cultivo de E. coli-pBAD SOD Cu/Zn requirió dos etapas: cromatografía de afinidad en columna de níquel-agarosa y cromatografía de exclusión molecular, en FPLC.

La proteína recombinante superóxido dismutasa dependiente de Cu+2 y Zn+2, al ser suministrada a ratones BALB/c, indujo la respuesta citotóxica específica de los linfocitos T de bazo sobre macrófagos J774A.1 infectados con la cepa vacunal Brucella abortus RB51 en ensayos in vitro.

La proteína recombinante superóxido dismutasa dependiente de Cu+2 y Zn+2, al ser suministrada a ratones BALB/c, indujo la respuesta citotóxica específica de los linfocitos T de bazo sobre macrófagos J774A.1 infectados con la cepa virulenta Brucella abortus 2308, en ensayos in vitro. BIBLIOGRAFÍA Abbas, A.K.; Lichtman, A.H. 2004. Inmunología celular y molecular. 5a Edición. Elsevier.

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informe final 20070239 - instituto politécnico...

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