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第十三章

流式细胞分析技术

蔡 蓓

实验医学科临床免疫实验室

2

流式细胞仪改善了细胞学检测技术

传统显微镜镜检

流式细胞仪

3

区别 流式细胞仪 显微镜

光源 激光 自然光、灯光

检测对象细胞、生物粒子

（单细胞）细胞、组织等

承载工具 鞘液及流动室 载玻片

检测信号 光学信号 形态及染色

放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大

统计 计算机，>5000 人工，200

结果 多参数，综合分析 简单，单参数

流式细胞仪与显微镜的比较

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流

式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确、

高通量的对单个微粒（细胞）的特征（理化

特性）或功能进行多参数定性、定量分析和

分选的新技术。

流式细胞仪(flow cytometer)一种先进的微粒（细胞）

定性和定量分析仪器。可对单个细胞大小、胞内颗粒复

杂度、细胞表面分子、内部超微结构、蛋白、染色体、

核酸等进行多参数分析；或按实验设计要求分选出具有

相同特征的细胞群体用于进一步研究或培养。

特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏

经典流式细胞仪（分析型和分选型）

量化成像分析流式细胞仪

质谱流式细胞仪

6

Coulter EPICS XL

单激发光；4个荧光检测通道

双激发光；6个荧光检测通道

经典流式细胞仪

量化成像分析流式细胞仪 美国merck millipore公司

质谱流式细胞仪

美国DVS Sciences公司

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主要内容

• 流式细胞仪的基本原理

• 数据的显示与分析

• 流式细胞免疫分析的技术要求

• 流式细胞分析的临床应用

• 影响流式细胞分析的主要因素

第一节 流式细胞仪的分析及分选原理

经典流式细胞仪的基本结构

主要组成

液流系统

光路系统 (光学检测与光电信号转换系统)

计算机系统（数据采集分析系统）

分选系统

11

一、分析工作原理

ü 应用液流聚焦原理实现单细胞流，保证单细

胞检测的准确性 (液路系统)

ü 采用激光光源、分色反光镜、光电倍增管等，

保证荧光检测的准确性和灵敏性,并将光信

号转化为电信号 (光路系统)

ü 应用计算机系统实现对单个细胞的多参数信

号数据处理分析，保证了检测速度与统计分

析的精确性 (计算机系统)

经典流式细胞仪

12

液流系统-液流聚焦原理

喷嘴

喷 嘴

鞘液(Sheath）

荧光信号或侧向散射光

前向散射光

单个细胞流

样本流

13

液流系统形成单

个细胞流示意图

14

光路系统ü激发光：

常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖激光光源（633nm)；紫外光源

ü各种光学镜片： 分色反光镜

光束成形器；透镜

滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片

ü光电倍增管（PMT）：检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成

电脉 冲信号。

15

滤光片

分色反光镜

16激光聚光系统

荧光和散射光检测系统

滤光片

PMT

分色反光镜

激发光

17

数据处理系统

• 计算机及其软件组成

• 进行实验数据的分析、存储、显示

Photons/Detector (V) time

光信号转化为电脉冲信号

18

单细胞液柱

已标记的单细胞悬液和鞘液

流动室 喷嘴

荧光检测系统和

散射光感受系统收集光信号

荧光染料被激发发光

光电倍增管脉冲信号

计算机系统分析结果

放大

垂直相交

形成稳态 水平激光与之

FCM检测基本过程

废液

特异性荧光抗体标记后的单细胞悬液

19

细胞的理化特性 细胞功能

大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

粒度 细胞活性

DNA, RNA含量 胞内细胞因子

蛋白质含量 激素结合位点

钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

经典流式细胞仪常检测的细胞特性

20

细胞分选原理

目的细胞目的细胞

超声压电晶体

流动室产生高频振动，液流断裂成连续、均匀液滴

液滴充电

图13-1 流式细胞仪基本结构及工作原理示意图

22

第二节 数据的显示与分析

ü参数：

ü散射光

ü荧光（FL）

ü数据显示方式：单参数直方图；双参数散

点图；三参数散点图；多参数分析

ü设门分析技术

前向散射光（FS）

侧向散射光（SS）

经典流式细胞分析仪

23Freq

Fluorescence

Photodiode前向散射光

侧向散射及荧光检测

光路检测系统：前向散射 侧向散射 荧光检测

（<90度方向检测）

（90度方向检测）

荧光检测:不同细胞表面或胞内抗原表达情况

24

细胞在液柱中与激光束相交时向

周围360°立体角方向散射的光线信

号，它的强弱与细胞的大小、形状、

胞内颗粒折射等有关，主要分为前向

散射光和侧向散射光。

散射光的测定

25

前向散射光（FS）

前向散射光（forward

scatter, FS）：激光束照射

细胞时，光以相对轴较小角

度(0.5°-10°)向前方散射

的讯号，又称为小角散射。

用于检测细胞等粒子的表面

属性，信号强弱与细胞体积

大小成正比。

26

侧向散射光（SS）

侧向散射光（side

scatter, SS）：激光束

照射细胞时，光以90°

角散射的讯号，用于检

测细胞内部结构属性。

SS信号的强弱与细胞或

颗粒的粒度呈正比。SS对细胞膜、胞质、核膜的折射率更加敏感

27

根据FS和SS分析得到的基本细胞分群示意图

侧向散射

细胞胞内颗粒性

前向散射

细胞大小

28

测得的FS与SS信号通过

计算机处理，可得到FS-

SS图，由此可仅用散射

光信号对未染色的活细

胞进行分析或分选。

此为血细胞分类的基本

原理，但不能分析表面

分子。

散射光测量最有效用途： 利用细胞物理特性从非均一群体中鉴别出某些亚群

29

u 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。

u 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，

通过波长选择性通透滤光片，将不同波长的散

射光或荧光信号区分开，进入不同的光电倍增

管检测。

u 选择不同的单抗和荧光染料就可同时测定一

个细胞上多个不同特征参数。

荧光测量

30

荧光信号测量与放大器

荧光信号通常使用线性放大器和对数放大器

Ø线性放大器对信号的输出与输入是线性关系，输

入信号放大几倍，输出信号也放大相同倍数

Ø对数放大器对信号的输入与输出是对数关系，当

输入信号比过去增加10倍，其输出信号由1变为2，

若增加100倍，则输出信号由1变为3。

31

不同信号放大器的使用原则

ü线性放大器用于测量信号强度变化范围较小的信

号或具有生物学线性过程的信号。

ü对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且其

光谱信号较复杂的信号，在免疫检测中最常使用。

32

FITC

FI

TC

FITC

FITC

101 104103102

Relative fluorescence intensity

Num

ber o

f Eve

nts

FITC

FITC

FITCFITC

FI

TC

荧光强度反映细胞上特异性抗原的含量

33

荧光补偿

流式细胞分析中要求每种荧光仅被1个检测器检测，不会被其他波长荧光信号干扰，以保证信号的准确性。

34

荧光补偿的原理

FL2真正信号：FL2-FL1

FL1真正信号：FL1-FL2

荧光补偿：可消除各发射光之间的重叠信号，保证检测信号的准确性

35

üFS：反映颗粒的大小

üSS：反映颗粒内部结构复杂程度

üFL：反映颗粒被染上荧光数量多少

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数据显示方式

•单参数直方图

•双参数直方图:点图

二维等高图

假三维等高图

•三参数直方图

•多参数分析

直方图分析

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单参数直方图

• 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计

数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧

光强度的颗粒数量的多少，可用于定

性、定量资料分析。

• 只能表明一个参数与细胞数量

间的关系，由线性门进行测量。

• 最常用的数据表达方式之一

线性门

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双参数直方图

ü双参数直方图是一种细胞数与双测量参数

构成的图形，纵坐标与横坐标分别代表被测

细胞的两个测量参数。图中点颗粒的密度反

应具有同样荧光特性的颗粒数的多少。

39

双参数散点图—点密图

点密图——双参数散点图中最常用的基本表示法

40

二维等高图

十字门

点密图

三参数直方图

假三维等高图

41

多参数分析

ü多参数分析：标记了多色荧光的细胞在流

式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光

信号和散射光信号可以根据分析目的需要

进行组合分析，以获得所需的信息。

ü设门分析技术是多参数分析的基础。

42

任意门

十字门

43

设门分析技术

ü设门（Gating）指在某一张选定参数的直

方图上根据该图细胞群分布选定其中想要

分析的特定细胞群，并要求该样本所有其

它参数组合的直方图只体现这群细胞的分

布情况。即选定目的细胞群，其他参数分

析针对该细胞群进行。

44

ü流式细胞仪的单参数或多参数分析均是基于选

定的细胞群进行，而细胞群的选定和设门密切

相关

ü流式细胞仪分析中的“门”包括：线性门、十

字门、矩形门、圆形门、多边形门和任意门。

45

ü设门的方式分为在线设门、离线设门。

ü单参数直方图——线性门；双参数散点图——十字门或圆形门、矩形门、任意门等。

ü反向设门：设门后相应细胞群可在总分析细

胞群中以不同颜色表示

ü逻辑设门：AND , OR, NOT,通常用于无法直接

设门分析的细胞群体

离线设门，主要用于数据采集后的再分析在线设门，用于数据采集前的方案建立

区域(Region,R)• 区域是与门同时存在的另一个概念。区

域与门并不完全对应。

Gate=Q1+Q2+Q3+Q4

46

Gate=Region

Gate = Q4 and (not Q2)

CD3单阳+CD3+CD8+T淋巴细胞

47

第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求

ü单细胞免疫标本的制备

ü常用荧光染料及标记染色

ü基于免疫微球技术的应用

48

一、单细胞免疫标本的制备

• 流式细胞仪的测定样本必须是单细胞

悬液。不同来源的细胞制备为单细胞

悬液的处理程序不同。

• 标本的采集、运输和保存对实验结果

有很大影响

(一）标本采集、运输、保存和操作

l标本来源l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、淋巴器官或组织等

l抗凝剂选择l肝素钠(首选)lEDTA-Na2

l标本保存

50

ü外周血或骨髓样本

直接使用或制备单个核细胞（参见第十五章）：

裂解红细胞（溶血）；梯度离心

ü体液

• 胸水、腹水、心包积液、脑脊液和脏器灌洗液；

• 细胞浓度很重要

• 室温保存不超过48h

• 肝素钠抗凝

标本制备

51

标本保存

ü最好采用新鲜标本处理染色分析

ü对不能立即分析检测的标本必须适当的保存。

ü新鲜标本室温保存：肝素抗凝外周血保存48h;EDTA抗凝外周血24h；骨髓标本室温12-18小时

ü溶血标本不易于细胞分析

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常用的长期保存处理方法：

v深低温保存法：缓冻速融，-80 ℃保存6个月；液氮冻存至少1年以上

v乙醇或甲醇保存法：75%甲醇或70%乙醇，2-8 ℃保存不超过2周，常用于DNA分析。

v甲醛或多聚甲醛固定法：4%甲醛或多聚甲醛PBS固定后可保存2个月，细胞不在具有生物学活性，但不影响细胞表面染色。

v染色后标本：最好立即上机，或加入叠氮钠等防腐剂， 2-8 ℃保存24h.

标本保存

53

二、常用荧光染料与荧光标记

FCM使用的荧光染料的基本要求：

ü 有较高的量子产额和消光系数

ü 对488nm或633nm的激发光波长有较

强的吸收

ü 发射光波长与激发光波长间有较大

的波长差（stock位移）

ü 易与标记单抗结合而不影响抗体的

特异性

54

名称 染料 激发波长

荧光颜色

溶解性 对PH敏感性

特点

异硫氰酸荧光素

FITC 488 绿

525

易 敏感 易溶于水，与抗体结合不影响特异性

得州红 Texas red

568 红

615

不易 不敏感 稳定，偶联后量子产额低

藻红蛋白 PE 488 橙

575易 不敏感 具较多发光基团，消

光系数和量子产额高藻青蛋白 PC 488 红 670

深红755

别藻青蛋白 APC 633 红

670

能量传递复合染料

PEcy5 488 红

670

易 不敏感 减少交叉，成本高

常用的几类荧光染料

能量复合染料的发光原理

PE-Cy7发光原理示意图

荧光共振能量转移（FRET）：供体荧光素和受体荧光素足够近，供体受激发后的发射光作为激发光激发受体，受体发光，而供体荧光强度衰减。

56

免疫荧光标记方法

ü直接免疫荧光染色法:分析特异性强，干扰少,

但需购买多种单抗

ü间接免疫荧光染色法:步骤多,干扰多,但敏感

性较直标法强。注意：二抗要与一抗匹配。

荧光抗体组合原则

ü双参数或多参数分析时荧光抗体的组合：考

虑免疫荧光染料与激发光源，荧光染料之间

的荧光补偿。

ü根据抗原表达量选择荧光素，抗原表达越弱

则选择荧光强度越强的荧光素标记抗体。

ü常用荧光染料的荧光强弱如下：PE>APC>PE-Cy7>Percy-Cy5.5>FITC> Pacific Blue™> PerCP>APC-Cy7>AmCyan。

不能同时使用PE-Cy5与PerCP；APC荧光素不能用于仅有

488nm激发光的流式细胞仪

荧光素与细胞结合方式

ü蛋白检测：ü抗原-抗体反应，通常为荧光标记抗体ü直接法（常用）、间接法

ü核酸检测：ü静电引力结合：正电荷荧光素与负电荷核酸分子磷酸基团ü共价结合：荧光素分子与DNA分子共价结合ü嵌入结合：荧光分子直接嵌入DNA双链中

结合不牢固，易丢失荧光分子

结合紧密、稳固

染色操作

• 室温反应15-20min• 2ml溶血剂溶解红细胞10-12min（仅用于全血反应）

• 1500rpm离心5min ，弃去上清液（仅用于全血反应）

• 2ml PBS洗涤， 1500rpm离心5min ，弃去上清液

• 加入300ulPBS重悬后上机检测

10ul荧光标记特异性抗体或同型对照抗体

CD3/CD4/CD8或CD3/CD16+CD56

50ul全血细胞或PBMC

60

细胞自发荧光

ü大部分哺乳动物细胞内的吡啶或黄素类

核苷酸存在自发荧光，在紫外光或蓝光

激发下可出现蓝色或绿色荧光。

ü淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞

都有较强的自发荧光。

ü FITC易受自发荧光的干扰。

61

三、基于免疫微球技术的应用

“液相芯片”技术：利用胶乳颗粒的

载体特性，结合荧光标记和FCM检测

技术实现对多种可溶性物质的分析。

（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）

多指标同步分析（xMAP）

流式微球阵列（CBA）

62

“液相芯片”技术的关键

ü以荧光标记的微小胶乳颗粒（或微球）

作为反应载体

ü共价方式结合不同检测物

ü利用抗原抗体反应原理+荧光标记技术实

现对可溶性物质定量分析。

63

x-MAP技术

64

第四节 流式细胞分析的临床应用

ü机体免疫状态检测

ü淋巴细胞及其亚群的分析

ü淋巴细胞功能分析

ü淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型

ü肿瘤耐药相关蛋白分析

ü AIDS检测的应用

ü自身免疫病中的应用

ü移植免疫中的应用

65

• T淋巴细胞亚群

• B淋巴细胞亚群

• NK细胞

• 树突状细胞

（一）淋巴细胞及其亚群分析及其临床意义

66

（一）T淋巴细胞亚群分析

CD3、CD4、CD8表面分子

分为CD3+CD4+T细胞（Th）

和CD3+CD8+T细胞(Tc)

67

• 对机体免疫状况的监测：

– 肝病终末期患者会出现CD4/CD8比值的明显增加，随着

治疗会发现有该比值的降低。

– 自身免疫性疾病：SLE——CD4/CD8比值降低；RA——

CD4/CD8比值升高

– 对AIDS的监测或辅助诊断，一般对于其监测时应由CDC

进行CD3+CD4+T细胞的绝对计数。

T淋巴细胞亚群分析意义：

68

细胞毒性T细胞（Tc细胞）

• CD3+CD4-CD8+T细胞

• 杀伤机制：MHCI限制性的特异性杀伤，颗粒酶，穿孔素。

• 参与抗肿瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反应，自身免疫性疾病

69

(二)B淋巴细胞分析

ü 应用CD5和CD19分子将其分为CD5-

CD19+B细胞(B2)（外周成熟B细胞）

和CD5+CD19+B细胞（B1）

ü B1细胞：产生IgM型自身抗体，参

与免疫调节，与自身免疫病相关。

ü B2细胞：受外来抗原刺激，产生

高亲和特异性抗体，活化B细胞可

表达CD83。

B淋巴细胞分析临床意义B细胞的检测可进行机体体液免疫状况的辅助分析

70

(三)NK细胞分析

应用CD3、CD16、CD56

分子鉴别NK细胞

（CD3-CD16+CD56+）

• NK细胞分析临床意义

– 抗感染、抗肿瘤和移植排斥反应中具有重要作用

– 主要应用于肿瘤患者治疗的监测，肿瘤患者NK细胞的表达会

有所降低，而治疗有效时一般处于正常范围或有所增加

（二）淋巴细胞功能分析

l淋巴细胞增殖试验

l增殖方式：

l有丝分裂原刺激

l特异性抗原刺激

免疫细胞

T、B细胞的特异性免疫应答

常用荧光染料：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE) 是目前用于体内和体外实验中检测细胞增殖情况的理想示踪荧光染料，其激发光为488nm，检测通道与FITC为同一通道。

CD8+T和NK细胞介导细胞毒性试验

（二）淋巴细胞功能分析

ü应用PI进行细胞DNA染色，以鉴定坏死细胞（PI能穿过坏死细胞的细胞膜使坏死细胞DNA着色）üFDA(双醋酸荧光素)染色：FDA可进入活细胞，细胞破裂后FDA进入基质液，通过检测残留FDA阳性细胞比例，反映淋巴细胞的细胞毒活性。

特异性CD8+T细胞功能的检测

Ø采用MHC-抗原肽四聚体技术进行特异性抗原刺激。Ø细胞功能检测：细胞毒性功能、细胞因子分泌功能等

（二）淋巴细胞功能分析

细胞内细胞因子测定

通过对胞内细胞因子的测定进一步分析效应

细胞的亚型（如Th1细胞、Th2细胞）

细胞外细胞因子：CBA等

（二）淋巴细胞功能分析

74

75

二、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型

ü对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型

ü可用于选择化疗方案、判断预后及早期检

出微小残留病变

76

三、肿瘤耐药相关蛋白分析

ü MDRG编码多药耐药蛋白（MRP），导致肿瘤细胞

对化疗药物耐药。

ü 转运蛋白p糖蛋白是由多药耐药基因编码多耐药蛋

白之一，是多种药物和荧光染料的跨膜性排出泵。

ü 淋巴细胞为MDR阳性时，提示患者将出现治疗耐药

性。

同型对照

15%

77

四、AIDS检测的应用

ü FCM是用于AIDS免疫功能检测和监测最重要的

检测手段。

ü 用于监测CD3+CD4+T淋巴细胞百分率；

ü 分析CD3+CD4+T细胞的绝对细胞数，反映AIDS

患者的疾病状态更有意义。

CXCR4、CCR5

78

五、自身免疫性疾病相关

HLA抗原分析ü T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞比例分析。

ü HLA-B27的表达与强直性脊柱炎关系密切。通常

在58%-97%的AS患者可检测到HLA-B27,仅在2%-

7%正常人出现

ü HLA-DR4则与类风湿性关节炎（RA）有较高的相

关性

79

六、移植免疫中的应用

移植前配型和其他检测

ü 用于HLA组织配型：主要包括流式细胞术的交叉配型

（FCXM）和群体反应性抗体（PRA）检测。

ü FCXM:检测受者体内抗HLA的抗体滴度

ü PRA:检测血清标本中多种抗HLA-I/II抗体的强度和特异

性。

ü 阳性FCXM预示移植效果不良，而移植排斥的危险性同HLA特异

性抗体存在有关。

ü FCM对PRA检测可了解移植患者体内的抗体水平，对降低超急性、

急性排斥反应发生，提高移植物存活率。

移植前其他检测Ø造血干细胞/祖细胞计数：CD34计数（尤其是血液系统恶性肿瘤）

Ø淋巴细胞计数与移植物抗宿主排斥病的预防:检测供者T淋巴细胞亚群数量

六、移植免疫中的应用

移植后的实验室监测Ø免疫细胞：NK细胞、T淋巴细胞、B细胞Ø炎性因子：IL-2，IL-6等Ø受体抗HLA抗体

81

第五节 影响流式细胞分析的主要因素

ü 标本采集和单细胞悬液制备的质量控制

ü 荧光染色过程中的质量控制

ü 仪器的质量控制

ü 数据采集和分析过程中的质量控制

ü 免疫检测的质量控制

82

一、标本采集和单细胞悬液制备的质量控制

ü 新鲜样本：标本采集后及时处理

ü 一般亚群分析不易采用PBMC作为样本

ü 疾病对溶血影响和荧光素干扰：RBC脆性降低，胆红素影响

FITC结果

ü 溶血过程中要保证细胞完整性

ü 溶血对细胞表面CD分子表达影响：CD25降低

ü 抗凝剂选择：annexin-V分析不宜用EDTA抗凝

ü 不同标本采用适当的制备方式：实体组织最好采用机械法制

备单细胞悬液

ü 温度与PH值(温度25-37℃，PH7.0-7.2)：如PH<8，FITC荧光

强度降低。Hoechst染料的荧光强度随着溶液pH升高而增强

二、荧光染色过程中的质量控制

•细胞浓度：1×106/ml为宜•对照设置：空白对照、同型对照、阴阳对照、FMO对照等•封闭剂：0.5%牛血清白蛋白、1%新生牛血清或幼年家兔血清封闭细胞表面IgFc受体•避光染色•操作温度：室温或冰浴•洗涤：含5%新生牛血清或1%BSA的PBS洗涤；0.2%叠氮钠防止抗原抗体反应后交联和解离•过滤•结果判定：根据对照设定检测门•细胞表面染色：确定细胞膜完整性，染色后固定•细胞内染色：破膜和固定不影响抗原表达及与抗体结合•胞膜和胞内双染色：表面染色-破膜固定-胞内染色-DNA染色

三、仪器的质量控制

•调整仪器状态至最佳：荧光通道变异系数在最小范围，分辨率在最好状态•控制变异系数：•正确使用补偿：

• 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状

态，减少变异（CV）。

• PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于

最佳灵敏度工作状态。

Flow-check/标准荧光微球

Flow-set

85

ü光路与流路校正---

采用厂家提供标准小珠，如Flowcheck,

Nile red等检测各荧光通道检测信号的

变异（要求CV<5%-10%）,以确保激光光

路与样品流处于正交状态

86

PMT校准---

ü PMT放大功率会随时间延长而降低，通过

电压补偿以保证PMT的放大功率。

ü对流式细胞仪光电倍增管（PMT）校准，

以确保仪器处于最佳灵敏度工作状态。

87

• 绝对计数校准: 保证计数的准确性。

• 流式细胞仪进行绝对计数时，要采用绝对计数

校准品，如Flow count，或BD True Count绝对

计数管建立绝对计数标准。

Flow-count绝对计数校准品或BD True Count绝对计数管分析

三、仪器操作的质控

四、数据采集和分析过程中的质量控制

ü数据采集：细胞数目应在1-2×104以上ü数据分析：根据检测项目确定对细胞数目等要求

89

• 同型对照（isotype control）：用于排除细胞

标记过程中的非特异性染色，选用与检测荧

光抗体相同源性及IgG亚型,相同荧光素标记

的非特异性单抗，用于调整和设置电压，以

保证抗原检测的特异性。

• 全程质量控制：质控物Immuno-Trol Cells与待

测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示

本次实验结果可靠。

五、免疫检测的质量控制

90

同型对照抗体的重要性：排除非特异性染色的干扰，尤其是针对低表达的抗原分子。

第六节 流式细胞术新进展

量化成像分析流式细胞仪

质谱流式细胞仪

量化成像分析流式细胞仪

荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪的结合体，完成传统流式细胞分析仪功能同时提供每个细胞的图像，可准确将量化数据与图像联系起来。

Flowsight

基本结构

l 液流系统：ü 注射泵、流动室、鞘液流、细胞流

l 光源ü LED:明场细胞显微图像

ü 全固态激光器（荧光信号）

l 检测系统ü TDI CCD（基于时间延迟积分技术的高

速时间延迟电荷耦合器件）

荧光显微系统

流式细胞仪检测

检测原理

结果分析

Ø 流式细胞仪分析散点图Ø 细胞荧光图像Ø 细胞形态

质谱流式细胞仪

质谱流式细胞仪（mass cytometer）整合了经典的流式技术和质谱技术，采用金属元素偶联技术，解决了由于不同荧光光谱间重叠带来的串色问题，实现了几十个参数的同时测量。

cyTOF

基本结构

l进样雾化系统：细胞雾化为单细胞液滴

l离子源

ü加热气化室：将雾化的单细胞液滴气化

ü电感耦合等离子体焰炬：将气化后细胞中的标记金属元素电离

形成离子云

l离子传递和过滤系统：将电离离子传递到

ICP-TOP中检测

lICP-TOF装置：检测气化的金属元素离子

l计算机及数据处理分析系统

质谱流式细胞仪结构示意图

金属标签

质谱流式细胞仪与传统荧光流式细胞仪比较

三种流式细胞仪的基本原理，图像显示及应用比较

经典FCM 量化成像FCM 质谱FCM

单细胞流形成 液流系统液流聚焦原理

液流系统液流聚焦原理

进样雾化系统加热气化电感耦合等离子体焰炬

检测系统 光路系统激发光、多种透镜和反光镜、光电倍增管

LED:明场细胞显微图像全固态激光器（荧光信号）

•离子传递和过滤系统：将电离离子传递到ICP-TOP中检测•ICP-TOF装置：检测气化的金属元素离子

检测信号 光信号 光信号，图像信号 质谱信号，荷质比

检测特点 单细胞、多参数、流式直方图

单细胞、多参数、流式直方图图像信号（荧光图像及细胞形态）

单细胞、多参数、流式直方图信号更多，无需荧光补偿

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ü液流系统—形成单细胞流

ü光学系统及检测系统—高激发效率的激发光源，多种发射光的同步检测

ü信号处理及放大的计算机系统—将光信号转换为电信号，以图示方式显示

ü荧光标记抗体、抗原抗体的特异性反应—实现检测的特异性和敏感性

流式细胞仪基本

工作原理

小 结

Flow cytometry is a technology that is used to analyse the physical and chemical characteristics of particles in a fluid as it passes through at least one laser. Cell components are fluorescently labelled and then excited by the laser to emit light at varying wavelengths.The fluorescence can be measured to determine various properties of single particles. Examples of the properties measured include the particle’s relative granularity, size and fluorescence intensity as well as its internal complexity. Although cells (mammalian, plant, algae, yeast, bacteria) are usually analysed, other particles, such as nuclei, chromosomes or small beads, can also be studied. Three main systems make up the flow cytometer instrument and these are the fluidics, the optics and the electronics. The purpose of the fluidics system is to transport the particles in a stream of fluid to the laser beam where they are interrogated. Any cell or particle that is 0.2 to 150 μms in size can be analyzed. If the cells are from solid tissue, they require disaggregation before they can be analyzed.

What is flow cytometry?

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