Osaka University

生生体体組組織織のの非非線線形形光光学学効効果果をを

用用いいたたココララーーゲゲンン配配向向測測定定

阪阪大大院院・・基基礎礎工工、、奈奈良良医医大大**))

安安井井武武史史、、佐佐々々木木邦邦彦彦、、荒荒木木勉勉、、東東野野義義之之**))

第30回レーザー顕微鏡研究会シンポジウム 『生体の無染色イメージング』

Osaka University

イントロ

ココララーーゲゲンン配配向向測測定定

従来法）解剖学的手法＠生検組織（電顕観測、X線回折他）

�� �� �� �� �� 非非侵侵襲襲 ・・非非破破 壊壊・・非非 接接触触・・ ３３次次元元 空空間間分分 布布

・超短パルス光との非線形相互作用・コラーゲンから特異的に発生

・コラーゲンの密度や配向に敏感

第第２２高高調調波波発発生生光光 ((生生体体SSHHGG 光光））

ココララーーゲゲンン生体構造タンパク質：生体組織の骨組み� � � � � � � � 並並びび方方 （（ココララ ーーゲゲンン 配配向向）） がが重重要要� � � � � � � � � � 生体組織の形態的及び機能的特性

生生体体ココ ララーー ゲゲンン のの非非線線 形形光光 学学特特性性

ヒヒトト組組織織ココララーーゲゲンン線線維維配配向向のの３３次次元元分分布布�� �� �� �� �� �� �� ＠＠SS HHGG 偏偏光光解解析析&&SSHH GG イイメメーージジンンググ

Presenttalk

T. Yasui et al, Appl. Opt., Vol. 43, pp. 2861-2867 (2004).T. Yasui et al, J. Biomed. Opt., Vol. 9, pp. 259-264 (2004).

ref) S. Roth et al, J. Chem. Phys. 70, pp.1637-1643 (1979).

☞SS HHGG 偏偏光光解解 析析法法

Osaka University

SHG光とは？

   �

(�f�r�e�q�.�  �=�  �f�)� f� 2� f�

フェムト秒��ルスレー�ー�

音

光�

線���� �線����

音�

さ��� ������

CW光�

�中����質� �中����質�

超短��ルス光�

�����光� ���光�

�）��コラーゲン�

Osaka University

生体ＳＨＧ光発生の原理

Coherent enhancement ! Constructive

interference

++

++

++

==･･････

SHG seed(collagen)

1/µs

Biological tissue

Backscattered SHG light

SHG light

SHG phase matching is impossible in tissue!

NNoo--PPMM SSHHGG condition

δ:散乱光路長=1/µs (µs散乱係数)=20~50µm@tissue

lc : コヒーレンス長= lω/[2*(n2ω- nω)] =5~13µm@tissue

ω:角周波数, A:照射エリアP: 入射パワー, n=(nω+n2ω)/2,

d: 平均非線形光学定数

P2ω = 8 µ0ε0

%

& '

(

) *

32ω 2d2δ 2

n3Pω

2

Asin2 πδ / lc( )πδ / lc

(1) lc>δδ

(2) δδ/lc≠≠1, 2, ..., m

@ δδ/lc>1

Ref) B.M. Kim, Appl. Opt., Vol. 38, p.7145 (1999).生生体体SSHHGG

P 22ωω(a.u.)

0 2 4 6 8 100

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

δδ/lc位位相相整整合合SSHHGG

Focus of fs pulse light

Osaka University

コラーゲン線維の組織構造

コラーゲン分子 （ポリペプチド3重らせん構造）

非中心対称性構造 （対称要素は回転軸のみ）

生生体体SSHHGG光光発発生生 線維束

線維

原線維

マイクロ フィブリル

回回転転対対称称軸軸 （（円円柱柱対対称称性性））

光光波波長長オオーーダダーー

規規則則的的配配向向ががSSHHGG光光をを増増強強

Osaka University

入射光偏光とコラーゲン配向の関係

・SHG光はコラーゲン線維配向に敏感 ・偏光解析が有効

Collagenorientation

SHG light

Cross-sectional(Centrosymmetric)

Laserpolarization

Collagen fiberCollagen fiber Collagen fiber

Axial(Non-centrosymmetric)

Parallel Perpendicular

None Strong Weak

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入入射射光光ススポポッットト

ココララーーゲゲンン 線線維維

ＳＳＨＨＧＧ強強度度レレーーダダーーググララフフ

（（配配向向方方位位：：主主軸軸角角度度、、配配向向度度：：形形状状））

SSHHGG光光偏偏光光解解析析（（理理論論値値）） 単一軸配向 直交２軸配向 ランダム配向

00.20.40.60.81

0

90

180

SHG光強度

00.20.40.60.81

0

90

180

00.20.40.60.81

0

90

180

Ref) P. Stoller et al, J. Biomed. Opt., Vol. 7, pp. 205-214 (2002).

予測される コラーゲン配向

Osaka University

実験装置（反射配置）

入射光・SHG光 同期させて回転

サンプル固定 サンプルを光軸回りに回転�（�光固定）�

出力250mW 繰返周波数87MHz 中心波長808nm パルス幅80fs

ML Ti:Sapphire laser

OL(NA=0.42) HS

PL

(rotatory)λ/2Sample

SHG light

scanningstage

F AN

L L

PH(φ50µm)

HS

(rotatory)λ/2

PM

T

Lock-in amplifier

Osaka University

((11))    ヒヒトトアアキキレレスス腱腱�  76歳女性、厚さ約2mm�  ホルマリン固定後、乾燥�  線維と平行方向にスライス�

((22))ヒヒトト皮皮膚膚真真皮皮（（背背中中））�  厚さ約1mm�  ホルマリン固定後、乾燥�  皮膚表面と平行方向スライス�

((33))ヒヒトト歯歯牙牙象象牙牙質質��  20歳男性、厚さ約1mm�  歯牙軸方向にスライス�

((44))    ヒヒトト距距骨骨    ��  厚さ約1mmにスライス�

((55))    ココララーーゲゲンンススポポンンジジ    ((牛牛アアキキレレスス腱腱))��  �����コラーゲン�

�向�

アキレス腱� 歯牙���

サンプル

皮膚真皮� 距骨�

Osaka University

SHG偏光解析vs他の偏光解析

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Refelected light

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Verticalorientation

Horizontalorientation

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Inte

nsity

(nor

mal

ized

)

00.20.40.60.8

1

0

30

6090

120

210

240270

300

330

(H-PL)

(V-PL) Polarization

angle (deg)

Transmitted light TPAF SHG light

＠ヒトアキレス腱（単一軸コラーゲン配向）

複複屈屈折折 異異方方性性吸吸収収

線線形形散散乱乱特特性性 他他ののTPAFのの 分分離離

鋭鋭いい偏偏光光依依存存性性

Osaka University

SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

コラーゲンスポンジ

ラランンダダムム

SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ヒト象牙質

直直交交２２軸軸

SSHHGGレレーーダダーーググララフフ

SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ヒトアキレス腱

単単一一軸軸

SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ヒト網状真皮 ヒト距骨 SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SH

G in

tensity (a.u

.) 0

90

270

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

非非直直交交２２軸軸 不不完完全全 単単一一軸軸

ヒト乳頭真皮（表皮越し）

ラランンダダムム

ココララーーゲゲンン配配向向のの組組織織依依存存性性

Osaka University

コラーゲン配向の面内分布測定

Osaka University

配配向向評評価価パパララメメーータターー

（（１１））配配向向方方位位＠＠主主軸軸方方位位角角：：θθmmaajj

（（２２））配配向向度度＠＠ SSHHGG偏偏光光異異方方性性：：PPAA

Imaj + Imin

Imaj - Imin PA =

PA=1：単一配向（８の字） PA=0 ：完全ランダム配向（円形） 直交２軸配向（ひし形）

SH

G in

t en s

ity

(a.u

.)

0

90

270

0.00.20.40.60.81.0

θmajImaj

Imin

SHGレーダーグラフ

Osaka University

0

25

50

75

100

SH

G in

tens

ity (a

.u.)

2mm

2mm

Polarization // Orientation

0

25

50

75

100

SH

G in

tens

ity (a

.u.)

2mm

2mm

Polarization ⊥ Orientation

2mm

2mm

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

SHG

anisotropy

Orientation degree

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

Polarization-resolved SHG imaging @ human Achilles tendon

2mm

SH

G in

tens

ity (a

.u.)

2mm

2mm

2mm

2mm

2mm

SH

G in

tens

ity (a

.u.) PA value

Uniform distribution of high PA values

PA=0.86±0.06

Collagen orientation arranged with high organization

Osaka University

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

Vertical polarization Horizontal polarization

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Orientation degree

Polarization-resolved SHG imaging @ collagen sponge

2mm

SH

G in

tens

ity (a

.u.)

2mm 2mm

2mm

SH

G in

tens

ity (a

.u.)

PA value

Uniform distribution of low PA values

PA=0.07±0.05

Collagen orientation distributed equally in all directions

Osaka University

Polarization-resolved SHG imaging @ human talus

1mm

光顕像

水水平平 配配向向

垂垂直直 配配向向

骨骨陵陵にに沿沿っったた ココララーーゲゲンン配配向向

Osaka University

Polarization-resolved SHG imaging @ human dentin

PA=0.23±0.11 Vertical polarization Horizontal polarization

100

75

50

25

0

SH

G intensity (a.u.)

Orientation degree

1.00

0.75

0.50

0.25

0

PA

value

Enamel

Dentin

ココララーーゲゲンン配配向向のの部部位位依依存存性性

Osaka University

2D SHG polarimetry @ human dentin

aging

Osaka University

ヒヒトト網網状状真真皮皮のの面面内内配配向向分分布布＠＠離離散散的的ママククロロ 55 mm

40 m

m

10 mm

10 m

m(A) (B)

Osaka University

ヒヒトト網網状状真真皮皮のの配配向向分分布布＠＠連連続続的的ミミククロロ 配向方位：θmaj 配向度：PA

θ maj

(deg

)

Position (mm)

Position (mm)

(A) (B)

reticular dermis

Achilles tendon

collagen sponge

θ maj

(deg

)θ m

aj (d

eg)

reticular dermis

collagen sponge

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Achilles tendon

0

90

180

270

360

0

90

180

270

360

0 2 4 6 8 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2 4 6 8 10

Position (mm)

Position (mm)

PAPA

reticulardermis

Achilles tendon

collagen sponge

Achilles tendon

collagen sponge

reticulardermis

(A) (B)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Osaka University Microscopic 2D distribution of collagen orientation angle 　　@reticular dermis

Polarization-resolved SHG image

2D mapping of orientation angle

Entangled structure of collagen fiber

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.00.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0 500 1000

SHG intensity (a.u.)

0deg

30deg

60deg

90deg

120deg

150deg

測定領域：1mm*1mm　　　　　20µmステップ

0deg

30deg

60deg

90deg

120deg

150deg

Area: 1mm*1mm

Microphotograph of bovine dermis

1mm1mm

Osaka University

コラーゲン配向の断層分布測定

Osaka University

基本特性評価（１）

深深ささ分分解解能能 （（薄薄アアキキレレスス腱腱））

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 100 200 300 400

SHG

inte

nsity

(nor

mal

ized

)

Depth (µm)

22.6µmwithout pinhole

14.3µmwith pinhole

10-1

100

101

102

103

104

105

0 100 200 300 400 500

Human AchillesHuman dermishuman dentin

SHG

inte

nsity

(a.u

.)

Depth (µm)

ダダイイナナミミッッククレレンンジジ

Osaka University

基本特性評価（２）

Osaka University

深さ分解SHG偏光解析

Depth (µm)

Pol

ariz

atio

n an

gle

(deg

)

0

60

120

180

240

300

360

0

0.5

1.0

0 80 160 240 320 400

Depth (µm)

Pol

ariz

atio

n an

gle

(deg

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

60

120

180

240

300

360

0

0.5

1.0

Depth (µm)

Pol

ariz

atio

n an

gle

(deg

)

0 25 50 75 100 125 1500

60

120

180

240

300

360

0

0.5

1.0アキレス腱 象牙質

網状真皮

Osaka University

ココララーーゲゲンン配配向向のの３３次次元元分分布布

面内イメージの深さ分解測定＠ヒト距骨

Depth=0µm Depth=100µm

Osaka University

生生体体SSHHGG光光をを用用いいたた皮皮膚膚真真皮皮計計測測

・・皮皮膚膚診診断断 ・・火火傷傷診診断断 ・・皮皮膚膚美美容容

ココララーーゲゲンン配配向向

生生体体SSHHGG光光

フェムト秒パルスレーザー光

表皮

真真皮皮

皮下組織

深深浸浸透透性性

非非染染色色

３３次次元元ｲｲﾒﾒｰーｼｼﾞ゙ﾝﾝｸｸﾞ゙

非非破破壊壊・・非非接接触触

in situ

BBGG 光光フフリリーー・・表表面面反反射射光光・・拡拡散散反反射射光光・・蛍蛍光光

熱熱ダダメメーージジ小小

表表皮皮越越しし

ココララーーゲゲンン含含有有率率77 00%%

Osaka University

SHGコヒーレンストモグラフィー

ML Ti:Sapphire laser

PMT

HS

HS

BS

BS

Pinhole

time delay

SHG crystal

sample

ココヒヒーーレレンントトななSHG過過程程 低低ココヒヒーーレレンンスス干干渉渉 ヘヘテテロロダダイインン検検出出

微微弱弱SSHHGG光光増増強強、、多多重重散散乱乱光光除除去去 断断層層測測定定

Osaka University

まとめ

・・生生体体SSHHGG光光のの偏偏光光解解析析をを用用いいたた 　　ココララーーゲゲンン配配向向測測定定 ・・ココララーーゲゲンン配配向向のの３３次次元元分分布布測測定定

＠＠SSHHGG偏偏光光分分解解イイメメーージジンンググ