Chapter 26 Introduction to chromatographic separations

• There are very few, if any, methods for chemical analysis that are specific for a single chemical species. At best, analytical methods are selective for a few species or a class of species.

• Until the middle of the twentieth century, analytical separations were largely carried out by such classical methods as precipitation, distillation, and extraction.

• Today, however, analytical separations are most commonly carried out by chromatography and electrophoresis, particularly with samples that are multicomponent and complex.

層析分析法簡介

層析分析法 (chromatography，簡稱層析法 ) 最早稱為色層分析法，係蘇俄植物學家茲偉特 (Michael Tswett) 於1906年利用已填充了細顆粒碳酸鈣的玻璃管柱，來分離植物葉汁中的色素。將植物葉汁的色素混合汁液通過該玻璃管柱時，由於各種色素分子大小不同及對碳酸鈣顆粒之吸附力不同，使其由管柱流下的速率不同，結果在玻璃管柱不同高度呈現不同顏色之層帶。因此他將此種分離法命名為色層分析法，

Greek Chroma=color

Separation of leaf carotenes and leaf xanthophylls by chromatographic adsorption, obtained in 1938 by Harold Strain is illustrated above. I. Separation of a carotene from b carotene by adsorption of petroleum ether extracts of leaves on a magnesia column. II. Separation of leaf xanthophylls by adsorption of a dichloroethane solution of these pigments on a magnesium column; note the separation of violaxanthin, zeaxanthin and lutein, mentioned in the text. The figure is taken from Strain (1938, p. ii, frontpiece). http://www.life.illinois.edu/govindjee/papers/CarFin1.html

1941年英國二位化學家馬丁 (A. J. P. Martin) 與欣革 (R. L.

M. Synge) 發展出液相 - 液相層析分析法 (liquid-liquid -

chromatography, LLC)，使用靜相或稱固定相 (stationary phase)

液體分散在吸附劑表面上代替上述的固體吸附劑，它與流動相 (mobile phase，簡稱動相 ) 不互溶。根據樣品中之各成分在此二液相間的溶解度不同，而達到分離的目的，進而可做定性及定量分析。

他們二人於1952年又發展出氣相層分析法 (gas -

chromatography, GC)，由於他們在此領域的研究成果，二人同時獲得1952年諾貝爾化學獎，而發展出今日許多類型的層析分析法，用來有效率地鑑定及分離許多複雜的混合物。

層析分析法 ( 簡稱層析法 ) 是一種有效的物理分離分析方法，它根據試樣混合物中各成分在不互溶的兩相 ( 固定相與流動相 ) 中的吸附能力、分配係數、或其他親和作用之性能的差異，使其流速不同，作為分離的依據。

層析法可解決用一般之分離方法 ( 如蒸餾、分餾、萃取、再結晶等 ) 所不易分離的混合物 ( 如化學性質相近之同系物、異構物、物理性質相近之多成分混合物 ) 的分離及分析。

使用高靈敏度的偵測器，將被分離之成分的濃度變化轉換成電子信號，由信號處理器產生輸出信號，由記錄器繪製成層析圖 (chromatogram，又稱色譜圖 )。根據層析圖中，各層析峰 (chromatographic peak) 的面積及峰高，來計算出每成分的含量。

由於層析法的分離效率 ( 解析度 ) 高、分析速度快、靈敏度高、準確度高等特點，目前廣泛應用於有機合成、石油加工、環境保護、醫葯、食品工業及冶金工業等之分析。

Column chromatography and planar chromatography

層析分析法的基本理論

層析分析法是將樣品混合物經由流動相 ( 氣體或液體 )

的攜帶而流經固定相 ( 固體或固定在固體表面上的液體 )，由於混合物中的各成分有不同的移動速率，而將樣品中的成分分離。如圖26-1所示，樣品混合物含A及B二成分，注入固定相管柱頂端，藉著流動相的移動，將樣品混合物分配成二相A及B的層帶 (band)。

Fig. 26-1

elute

partition: mobile phase stationary phase sample

由於二成分A及B對於流動相及固定相之吸附、溶解及其他作用力不同，使A及B之移動速率不同，即在固定相中之滯留時間不同。由偵測器可將其通過管柱下端的信號傳出，在記錄器上顯示出來 ( 圖26-1(b))，稱為層析圖

(chromatogram)。由層析圖上尖峰的位置可用來鑑定樣品的成分 ( 定性分析 )，由尖峰下的面積可提供每一成分的定量分析。

圖26-2顯示樣品成分A及B在層析管柱中不同時間的濃度分佈圖。由於A在管柱的固定相中較強滯留，因此流動速率較慢。在時間時，A及B二成分濃度的層帶部分重疊，但隨時間延長，在時間時二成分充分分離，其濃度層帶不再重疊，但層帶之寬度變寬。只要固定相的管柱長度足夠長，樣品中的成分可以清楚分離。

Fig. 26-2

“partition”

26B-1 Distribution constant, partition ratio, partition coefficient

層析管柱的分離效率部分取決於二成分物種在流動相中流動的相對速率，而此相對速率由物種在流動相與固定相間之distribution constant (分配係數) K的大小所決定。物種A在動相與固定相間形成分配平衡：

(26-1)

stationarymobile AA

MA

SA

Ca

aK

For the solute species A:

SAa : is the activity of solute A in the stationary phase

MAa : is the activity of solute A in the mobile phase

when concentrations are low or when nonionic species are

involved, activity coefficients are nearly unity.

Ideally, the distribution constant is constant over a wide range of

solute concentrations. Chromatography in which Eq. 26-2

applies is termed linear chromatography and results in such

characteristics as symmetric Gaussian-type peaks and retention

times independent of the amount of analyte injected.

Kc is the fundamental quantity affecting distribution of

components between phases and thus separations.

(26-2)

M

M

S

S

M

SC

V

n

V

n

C

CK

26B-2 retention time We can measure a quantity called the retention time that is a

function of Kc.

當樣品注入管柱之後至分析物種的波峰到達偵測器所需的時間，稱為滯留時間 (retention time) 以符號表示。圖2-3說明二成分混合物的典型層析圖。左方的小波峰代表管柱對物種不會有任何滯留力的波峰，其到達偵測器的時間大約等於一流動相分子流經管柱所需的時間，稱為無感時間或靜止時間 [dead (or void) time]。與之差稱為調整滯留時間

(adjusted retention time)，以符號表示：

Fig. 26-4

MSR ttt

The average linear rate of solute migration through the column

The average linear rate of mobile phase molecules through the

column 分析物種的移動平均速率也可用流動相平均速率的分率表示，即與分析物種在動相滯留時間的分率乘積，此滯留時間分率等於分析物種在流動相中，在各時間之莫耳分率，即

R

L

t (26-4)

M

Lu

t (26-5)

u

u (fraction of time solute spends in mobile phase) (moles of solute in mobile phase/total moles of solute)

流動相中分析物種的莫耳數等於其莫耳濃度與其體積之乘積。固定相中分析物種的莫耳數等於其莫耳濃度與其體積之乘積。分析物種的總莫耳數為在流動相與固定相中之莫耳數總和，即。則上式變成

由式 (26-2) 的分配係數代入上式，可得

式中的 及 可由製備管柱時的數據求得。或由流動相之體積流動速率 求得：

SV MV

M M

M M S S

S S M M

C Vu

C V C V

1u

1 (C V / C V )

S M

1u

1 (KV / V )

(26-8)

0F (mL/ min)M M 0 S R 0V t F , V t F

26B-5 retention factor

在層析法中，retention factor為相當重要的參數，可用來表示分析物種在管柱中的移動速率。對於分析物種A而言，retention factor可定義為

式中 為分析物種A的分配係數。將上述關係代入式

(26-8) 可得分析物種A的移動平均速率：

AK

(26-9)

(26-10)

M

SAA

V

VKk

Akuv

1

1

將式 (26-4) 及式 (62-5) 的關係代入式 (26-10)，可得

整理式 (2-11) 可得

其中 及 可由圖26-4的層析圖求得。理想上，分離混合物的retention factor其值介於1至10之間。

Optimization of separations is then done by optimizing k

values for the components of interest.

Rt Mt

AMR kt

L

t

L

1

1(26-11)

(26-12)

M

AR

M

MAR

At

t

t

ttk

'

26B-6 relative migration rates: the selectivity factor

在層析法中，一分析物種A及B在管柱中的分離效果由選擇性因子 (selectivity factor)來決定。選擇因子可定義為

為較強滯留物種B之分配係數，而為較弱滯留物種A ( 即移動速率較快的物種 ) 之分配係數。則選擇性因子永遠大於1。選擇因子也稱為相對滯留 (relative-

retention) 或分離因子 (separation factor)。

B

A

K

K (26-13)

由式 (26-9) 對分析物種A之retention factor的定義，同理對分析物種B而言，其retention factor為 ，二者代入式 (26-13) 可得選擇性因子與retention factor及之關係式：

由式 (26-12) 的關係式，對二分析物種A及B而言，代入式

(26-14) 可得

稍後再說明如何利用 及 kA 、 kB來計算管柱之解析度 。

(26-14)

R B M

R A M

(t ) t

(t ) t

(26-15)

SR

A

B

k

k

管柱效率與平板高度

馬丁 (Martin) 和欣革 (Synge) 將層析管柱視為由無數個不連續，但相鄰的理論平板的薄層所組成，在每一平板上，假設分析物種在流動相和固定相間發生平衡。層析峰的形狀為對稱的高斯曲線 (Gaussian curve)。層析峰的寬度W與測量中的變異值

(Variance)或標準偏差 (Standard -deviation)成正比。因此可使用每單位管柱長度的變異值來定義管柱效率，而管柱效率通常用平板高度表示。平板高度 (plate height) H可定義為

其中L為管柱填充之長度 ( 單位為厘米，cm)。平板高度一般稱為理論平板相當高度 HETP (height equivalent of theoretical

plate) 簡稱平板高度。

2

HL

(26-17)

管柱的理論板數 (number of theoretical plate) N，可用平板高度H及管柱填充之長度L來表示：

假若L管柱填充之長度增加，則滯留時間 也增加。一般的層析管柱效率隨平板數N的增加及平板高度H的減少而增加。由於管柱型式、流動相及固定相之不同，層析管柱的效率有很大的差異。以平板數表示的效率值，可由數百至數十萬不等。平板高度範圍由數十分之一至數千分之一厘米。

Rt

LN

H (26-17)

H與N的實驗評估

由實驗的層析圖，其層析峰的寬度W及滯留時間 ，可用來評估層析管柱的平板高度H及理論平板數N。圖26-7

為實驗所得的層析圖，其橫軸為時間單位，為了區別上述橫軸為管柱填充長度之單位，其標準偏差用 表示，而變異值為 。以長度表示的標準偏差 和以時間表示的標準偏差 ，二者之關係式為

其中 為分析物種的平均移動速率 。

Rt

2

RL / t

(26-18)

RL/ t (cm/s)

由層析峰兩側作切線，與底部形成三角形，三角形的面積約為峰下總面積的96%，包含在最大值加減二個標準偏差 ，故峰寬度W即三角形底部為 ，如圖26-7所示。

將 代入式 (26-18) 可得

將 代入式 (26-17) 可得平板高度H為

( 2 ) W 4

W 4

(26-19)

R

LW

4t

2

2R

LWH

16t (26-20)

Fig. 26-7由層析峰測定標準偏差 。此處， ； 為滯留在管柱填充物內的溶質滯留時間，而 為不滯留在管柱內的溶質之滯留時間，因此 約等於流動相的分子通過管柱的時間。

W = 4 Rt

Mt

Mt

由式 (26-17) 及式 (26-20) 可得理論板數N為

另一個求N值的近似法是決定最大值一半高度處的峰寬，即半高峰寬。則理論板數N為

2

RtN 16W

(26-21)

2

R

1/ 2

tN 5.545

W

(26-22)

26C-1 rate theory of chromatography

The rate theory of chromatography describes the shapes and breadths of elution bands in quantitative terms based on a random-walk mechanism for the migration of molecules through a column.

Plate theory successfully accounts for the Gaussian shape of chromatographic peaks and their rate of movement down a column. The theory was ultimately abandoned in favor of the rate theory, however, because it fails to account for peak broadening in a mechanistic way.

Nevertheless, the original terms for efficiency have been carried over to the rate theory.

The plate count N and the plate height H are widely used in the literature and by instrument manufacturers. They can be quite useful quantities in comparing separating power and efficiencies among columns. However, for these numbers to be meaningful in comparing columns, it is essential that they be determined with the same compound.

2-3-8 影響層析峰帶加寬的三個因素

根據研究層析峰帶加寬的因素是由下列三個程序所造成：(1) 渦流擴散 (eddy diffusion)，(2) 縱向擴散 (longitudinal

diffusion)，(3) 非平衡質量傳遞 (nonequilibrium mass-

transfer)。這三個程序的效應由下列控制變數來決定：流動速率，填充物粒子大小、擴散速率、及固定相厚度。

1950年由荷蘭化學工程師凡迪姆特 (van Deemter) 導出這三個程序造成峰帶加寬對平板高度H的影響，將流動相的流動速率對H的關係式稱為凡迪姆特方程式 (van Deemter

equation)：

Band broadening reflects a loss of column efficiency, where the column efficiency can be evaluated by the plate height, H.

式中 A 為與渦流擴散有關的量，它與流動速率無關，但與粒子大小、幾何形狀、及固定相填充之緊密度有關。

B 為與縱向擴散有關的量，它對H的影響與流動相的流動速率成反比。當擴散隨時間增加時，流動速率減低，造成帶加寬的程度增加。

C 為與非平衡質量傳遞有關的量，流動相的流動速率太快時，無法達到平衡而造成帶加寬，它的影響與流動速率成正比。若流動速率減少時，此項因素的影響就變小。

BH A Cu

u

凡迪姆特方程式只提供一個近似平板高度，有若干更精確的修正式已被提出。例如1983年胡克斯 (S.J.

Hawkes) 提出流動相濃度 及固定相濃度 對平板高度之影響的修正式：

MC SC

M S M S

B BH A C u C u A (C C )u

u u (26-23)

圖26-10顯示凡迪姆特方程式中各項對H的貢獻 ( 用虛線表示 ) 及對H的淨效應 ( 用實線表示 )。欲得到最佳效率

( 即最小平板高度H) 可由圖26-10中，當H的實線最小值時即為最佳流動速率而得到。

由此實驗曲線可估計在某一流動率時，A, B及C的影響。由此數據可提供改進某一填充管柱之操作的參考。

FIGURE 26-10 Contribution of various mass-transfer terms to plate height. Csu arises from the rate of mass transfer to and from the stationary phase, CMu comes from a limitation in the rate of mass transfer in the mobile phase, and B/u is associated with longitudinal diffusion.

Fig. 26-8

Overall column efficiency is usually superior with GC columns because a typical GC column is much longer than a common LC column.

Total number of plates of a GC column is greater than a LC column.

26D-1 Column resolution管柱解析度

管柱的解析度 (resolution，亦稱為分離度、鑑別率 )

說明管柱對於分離二分析物種之能力的定量衡量。 SR

FIGURE 26-12

Separation at three resolution values: Rs =2ΔZ/(WA + WB). The peak heights have been adjusted to be approximately the same in each case.

R B R A R B R AS

A B A B A B

(t ) (t ) 2[(t ) (t ) ] 2 ZR

W W W W W W

2

(26-24)

任一管柱的解析度 可定義為二成分的滯留時間的差值

與其平均峰寬度的比值：

假設A及B二成分的滯留時間非常接近，二個峰寬度接近相等，即 ，代入式 (26-24) 可得

由式 (26-21)，W以N及 表示，

SR

A BW W

Z

R B R A R B R AS

A B A B A B

(t ) (t ) 2[(t ) (t ) ] 2 ZR

W W W W W W

2

(26-24)

R B(t )

R B R AS

(t ) (t )R

W

R B4(t )W

N

(A)

4

N

t

ttR

BR

ARBR

S

由式(26-12)

代入上式 (A) 化簡可得用A及B之retention factor kA及kB 表示的解析度 ：

由式 (26-14) 選擇性因子 ，代入上式並重組以消除kA

項後，可得

(26-25)

M

AR

M

MAR

At

t

t

ttk

'

41

N

k

kkR

B

ABS

A

B

k

k

B

BS

k

kNR

1

1

4

由式 (26-25) 平方，整理可得欲達到解離度 時，所需的平板數目N：

當被分離之二成分A及B之分配係數相近時，即KA≈KB時，由式 (26-9) retention factor的定義，可得kA≈kB ，則由式 (26-

13) 選擇性因子的定義知 。在此情況下，由式 (26-25)

及 (26-26)，可簡化為

其中 。

SR

(26-26)

1

(2-32)

(2-33)

2

2 1

116

B

BS

k

kRN

k

kNRS

14

2

2 1

1

116

k

kRN S

2

BA kkk

欲確認管柱的性能，即由完全分離二成分A及B所需的分離時間來決定。最理想的層析分析是以最短的分離時間而達到最高解析度。假設欲完全分離A及B所需的時間，可由移動較慢的成分來決定，假設成分B之移動平均速率較慢，即滯留時間 較長。由式 (2-4) 知

將式 (B)、式 (26-10) 及式 (26-16) 合併整理後，可得

將式 (26-26) N代入式 (C) 可得

R B(t )

B

R B

L

(t ) (B)

(C)

(26-29)

u

kNHt B

BR

1

2

322 1

1

16

B

BS

BRk

k

u

HRt

Example 26-1

Substances A and B have retention times of 16.40 and 17.63 min, respectively, on a 30.0-cm column. An unretained species passes through the column in 1.30 min. The peak widths (at base) for A and B are 1.11 and 1.21 min, respectively. Calculate

(a) the column resolution, (b) the average number of plates in the column, (c) the plate height, (d) the length of column required to achieve a resolution of 1.5, (e) The time required to elute substance B on the column that gives

an Rs value of 1.5, (f) The plate height required for a resolution of 1.5 on the original 30-

cm column and in the original time.

26D-4 Variables that affect column performance

In seeking optimal conditions for achieving a desired separation, it must be kept in mind that the fundamental parameters α, k, and N (or H) can be adjusted more or less independently.

For example, α and k can be varied most easily by varying temperature or the composition of the mobile phase.

Variation in H

Variation in the selectivity factor

Optimizing k and increasing N are not sufficient to give a satisfactory separation of two solutes in a reasonable time when α approaches unity.

A means must be sought to increase α while maintaining k in the range of 1 to 10.

The options are

1. Changing the composition of the mobile phase

2. Changing the column temperature

3. Changing the composition of the stationary phase

4. Using special chemical effects (derivatization).

26D-5 the general elution problem

Fig. 26-15

optimal

Solution: LC: Solvent programming GC: temperature programming

TABLE 26-4 Important Chromatographic Quantities and Relationships

TABLE 26-5 Important Derived Quantities and Relationships

層析分析法的定性分析

層析分析法之應用有四項，可同時進行試料之分離以製備純成分、鑑定試料之純度、定性分析、及定量分析。由於層析法之靈敏度極高，試料中含微量雜質亦可在層析圖上顯示。每一純成分應顯示單一尖峰，如主峰上有分岐的小峰，則表示有性質相近 ( 如同系物 ) 之雜質存在。

因此由層析峰可鑑定試料之純度，由峰的數目及位置，可定性分析，由峰的高度及峰下之面積可進行定量分析。由試料中各成分的滯留時間不同，可用來定性分析及製備純成分。

層析法之定性分析可依下列方法之一來進行。

對照滯留時間法

在相同操作條件 ( 管柱的種類、直徑、長度、操作溫度、流動相流動速率等 ) 下，滯留時間為物質的特性值，不受含量多寡的影響。故未知物與已知標準物在相同操作條件下，對照其滯留時間，可判斷未知物所含物質的種類。如圖2-7所示。

由實驗發現同系物之調整滯留時間 的對數值與同系物的碳數N成線性關係：

式中 為實驗常數。圖2-8為正烷類、正烯類、酮類、正醇類同系物的線性關係，將未知物之 對數值與圖2-8比較，可鑑定含有何種成分。

Rt

log t mN bR(d)

m , b

Rt

圖2-7

標準物對照法定性分析

酮類

正烷

類

正烯

類

正醇

類

碳原子數

滯留

時間

對數

值

10

5

1.0

0.5

0.10 1 2 3 4 5 6 7

110刻度

圖2-8 若干同系物之滯留時間對數值與碳數的線性關係

標準加入法

標準加入法 (standard addition method) 係在未知樣品中加入已知成分之標準物，在相同層析條件下操作，所得的層析峰若比原來未知樣品的層析峰更高，表示含有該已知成分，如圖2-9所示。

圖2-9 用標準加入法之定性

Retention index 滯留指數

滯留指數 (retention index) I係Kovats於1958年所提出，可用滯留時間 或滯留體積來定義：

R M R n M

R n 1 M R n M

log [t t ] log [(t ) t ]I 100 100 n

log [(t ) t ] log [(t ) t ]

R M R n M

R n 1 M R n M

log [V V ] log [(V ) V ]I 100 100 n

log [(V ) V ] log [(V ) V ]

s , n

n 1, n

logI 100 100 n

log

(2-39)

(2-40)

(2-41)

其中 為樣品的滯留時間

為流動相的滯留時間

為含 n 個碳之飽和烴它在樣品之前溶析分離的滯

留時間

為含 n+1 個碳之飽和烴它在樣品之後溶析分離的滯

留時間

為樣品對於含 n 個碳飽和烴之相對滯留或稱選擇

性因子，為分配係數之比值

為含(n+1)個碳飽和烴對於含 n 個碳飽和烴之相對滯留或選擇性因子 n 個碳飽和烴的滯留指數 I=100n。定溫時操作層析管柱，同系物中滯留時間對數值或滯留體積對數值與碳數成線性關係，故I對 或I 對 作圖呈線性關係。因此可由內插法求出樣品的滯留指數I，再由文獻的I值可進行對照來定性分析。

Rt

Mt

R n(t )

R n 1(t )

s , n

n 1, n

R Mlog(t t ) R Mlog(V t )

如果管柱操作是使用程式溫度操作 (programmed-

temperature operation) 則滯留指數I，式 (2-39)、式 (2-40)

將修正為

R R n

R n 1 R n

t (t )I 100 100 n

(t ) (t )

R R n

R n 1 R n

V (V )I 100 100 n

(V ) (V )

(2-42)

(2-43)

Fig. 27-18

結合其他儀器來定性分析

雖然層析法之特點是分離能力強，分離效率高，但對於複雜的樣品混合物的定性鑑定很困難。利用質譜 (MS)、紅外線譜 (IR)、核磁共振 (NMR) 等的高解析度，適合與層析法連結來進行複雜混合物的定性分析。

例如將自GC層析柱之流出物進入MS之離子化室，樣品各成分依流出之先後順序被分裂為碎片，通過磁場達成分析，每一成分由其碎片的質譜辨認。目前有GC-MS, LC-MS, GC-

IR, LC-IR, HPLC-MS連結來進行分析複雜未知物樣品，而成為最有效的分析方法。

層析分析法的定量分析

利用層析峰的面積作為定量分析的依據。測量峰面積的準確度直接影響定量結果。在一定操作條件下被分析成分的量m與偵測器上產生的響應信號 ( 峰高或峰面積 ) 成正比，即

m fA

m f h

(2-44)

(2-45)

其中 m = 被分析成分之量 (g)

f = 定量校正因子

h = 峰高

A = 峰面積

定量計算方法

層析法的定量計算有下列四種方法，各有其特點及適用範圍。

(一) 標準化法

標準化法 (normalization method) 又稱歸一化法，當樣品中的n個成分均能被層析柱分離，並被偵測器檢出而在層析圖上顯示各自的層析峰時，可使用標準化法。

將測量的全部峰面積，經相應的校正因子校正並標準化 ( 或稱歸一化 ) (normalization)，計算每個成分的百分含量P% 的定量分析，稱為標準化法：

i i i ii n n

i i i

i 1 i 1

m m f AP % 100% 100% 100%

mm f A

(2-51)

其中 為樣品中成分i之質量

為樣品總質量

為樣品中含成分i之百分含量

為樣品中成分i的峰面積

為樣品中成分i的相對校正因子

im

m

iP %

iA

if

i in

i i

i 1

f hP% 100%

f h

如果所得層析峰狹窄且對稱，而其半峰寬度變化不大時，也可使用峰高代替峰面積進行定量測定，這樣更快速簡便。計算式變成

(2-52)

如果樣品中各成分為同分異構物或同系物時，其 值相似則式 (2-51) 及 (2-52) 可簡化為

f

in

i

i 1

AP% 100%

A

in

i

i 1

hP% 100%

h

(2-53) (2-54)

標準化法之優點是簡便、準確、受到操作條件 ( 如注入量、流動相流速 ) 之影響很小。可適合工廠的快速控制分析。

(二) 內標準法

內標準法 (internal standard method) 簡稱內標法，係稱取一定重量且物質與樣品相似的某純物質作為內標準物，加入至已知重量的樣品中，混合均勻後注入管柱中進行分析。根據樣品及內標準物的重量和峰面積，可求出待測定成分之含量。

由式 (2-44) 知 ，故 i i i s s sm f A , m f A

i ii s

s s

A fm m

A f

i i i s

s s

m A f mP% 100% 100%

m A f m

(2-55)

(2-56)

其中m為樣品重量 ( 不包含內標準物 )。

由於絕對校正因子不易測得。故使用內標準法時，以內標準物作為基準；即令 ，測出被測定成分的相對重量校正因子，則式 (2-56) 以相對重量校正因子表示，變成

sf 1

i i s

s

A f mP% 100%

A m

(2-57)

內標準法的優點是對於操作條件變化所造成的誤差；例如所注入量多寡的誤差，同時反映在內標準物及樣品上，因此可以抵消而可得到較準確的定量分析結果。

當樣品成分不能全部出現層析峰，或偵測器對各成分不能產生響應值 (response)，或只需測定樣品中某幾個成分的含量時，適合使用內標準法。

1. 它應該是樣品中不存在的純物質，否則會使層析峰重疊而無法準確測量其峰面積。

2. 內標準物必頇可完全溶於樣品中，且不能發生化學反應。

3. 加入的量應接近被測定成分的含量。

4. 內標準物的層析峰應接近被測定成分之層析峰附近，或

位於全部樣品成分層析峰的中間位置，又能完全分開。

5. 內標準物的性質最好與被測定成分接近，這樣當操作條件變化時，更有利於內標準物及被測定成分作勻稱的變化。

6. 需要準確稱重。

但內標準法每次分析都要準確稱量樣品及內標準物，而不適宜作快速的控制分析。內標準物的選擇很重要，需符合下列要求：

(三) 外標準法

外標準法 (external standard method) 又稱標準曲線法

(standard curve method)，係在相同條件下，用欲測定成分的純物質配成不同含量的標準液，取固定量標準液進行分析，從所得層析圖上測出響應信號 ( 峰高或峰面積 )，然後繪製響應信號 ( 為縱坐標 ) 對於標準液濃度 ( 為橫坐標 ) 的標準線 ( 檢量線 )，如圖2-11。

將樣品在相同操作條件下，取與標準液相同量進行層析，由所得層析圖的響應信號 ( 峰高或峰面積 )，在圖2-11的縱坐標之值 ( 或 )，可得標準線上相對應的濃度值 ，即為被測成分之濃度 ( 圖中‧點即為相對應之濃度 )。

iAih

iP %iP %

i iA h或

iP %

標準線 ( 檢量線 )

標準液含量 Ps%

圖2-11 外標準法標準線之製作

當配製的標準液含量與樣品之含量接近時，可使用單點校正法，係將二者在相同條件下進行層析，由層析峰的峰高比或峰面積比，乘以標準液的百分率含量 即得樣品之百分率含量 ：

sP %

iP %

外標準法的優點是簡便、快速、不必使用校正因子，不必加內標準物。常用於工廠的控制分析。但需嚴格控制操作條件的穩定性。

i ii s s

s s

A hP % P % P %

A h (2-58)

(四) 標準加入法 (standard addition method)

當找不到合適的標準物時，也可選擇樣品中的某成分為標準物，通過比較加入該成分後之峰面積的改變，來計算被測定成分的含量。在一定操作條件下進行層析，先記錄原樣品的層析圖。

然後在 原樣品中，加入 克某成分j ( 作內標準物 )，混合均勻後在相同操作條件下進行層析，並記錄其層析圖。測量這二個層析圖中，欲測成分及加入內標準物後的峰面積 及 ，來計算原樣品中之含量。

對原樣品中的成分j而言

gm sm

jAjA

j j jm f A (2-59)

加入克成分j後，對成分j而言

由二式可得

由式 (2-56) 的內標準法分式，以 代替 可得樣品中任一成分i的百分組成

在輕質油品的層析分析，不易找到標準物，此時可使用標準加入法來測定。

j s j j s j jm m f (A A ) f A (2-60)

j s

j

j j

A mm

A A

j j s

j

j j

m A mP % 100% 100%

m (A A )m

式(2-61) 式(2-62)

j j(A A ) sA

i i si

j j s

A f mP % 100%

(A A )f m

(2-63)