熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title 胃癌におけるmicroRNA-200bによる上皮間葉転換の制御機

構の解析

Author(s) 藏重, 淳二

Citation

Issue date 2012-03-23

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/25202

Right

学位論文

Doctoral Thesis

胃癌におけるmicroRNA-200bによる上皮間葉転換の制御機構の解析

(MicroRNA-200b regulates epithelial-mesenchymal transition

by targeting ZEB2 in gastric carcinoma)

藏重 淳二

Junji Kurashige

熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学

指導教員

馬場 秀夫 教授

熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学

2012 年 3 月

1

目次

目次.……………………………………………………………………………………………..1 1. 要旨…………………………………………………………………………………………..2 2. 発表論文リスト…………………………………………………………………………......5 3. 謝辞…………………………………………………………………………………………..8 4. 略語一覧……………………………………………………………………………………..9 5. 研究の背景と目的………………………………………………………………………....10

5-1) 胃癌と胃癌における転移機構……………………………………………………10 5-2) 癌浸潤転移と上皮間葉転換……………………………………………………....13 5-3) microRNA による遺伝子発現制御機構……………………………………….…13 5-4) microNA の生合成…………………………………………………………………14 5-5) 癌の発症と進展に関わる microRNA の異常…………………………………...16 5-6) 本研究の目的……………………………………………………………………....19

6. 実験方法……………………………………………………………………......................20 6-1) 解析対象症例について……………………………………………........................20 6-2) 細胞株……………………………………….........................……........................20 6-3) 定量的 real-time PCR…………………….........................…….........................20 6-4) 免疫組織化学的解析…………………….........................……............................22 6-5) pre-miR-200b を用いた miR-200b の機能解析.............……............................22 6-6) 培養細胞の蛍光免疫染色........…………….........................…….......................22 6-7) Western blot 法........…………….........................……......................................23 6-8) Reporter assay…….........................……..........................................................23 6-9) Cell proliferation, invasion, migration assay.................................................24 6-10) 統計学的解析...................................................................................................25

7. 実験結果...................................................................................................................26 7-1) 胃癌凍結新鮮標本におけるmiR-200b, cの発現...............................................26

7-2) 胃癌におけるmiR-200b,cとZEB1、ZEB2、E-cadherinの発現 ......................27 7-3) 胃癌パラフィン包埋組織における miR-200b の発現.......................................28 7-4) 胃癌における ZEB2、E-cadherin の発現意義と miR-200b との関係.............31 7-5) 胃癌細胞株における miR-200b の発現と miR-200b 導入による

細胞株の形態変化............................................................................................34 7-6) miR-200導入によるZEB2,E-cadherinの発現変化..........................................35 7-7) miR-200 導入による miR-200b の機能解析......................................................37 8. 考察..........................................................................................................................39 9. 結語..........................................................................................................................43 10. 参考文献.................................................................................................................44

2

1．要旨

【目的】MicroRNAs は、約 22 塩基からなるタンパク質にコードされない non-cording RNA

であり、標的遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制する。また、microRNA の発現異常は癌を含

む様々な疾患と関連することが報告されている。今回、我々は癌の上皮間葉転換に関連す

る転写因子 ZEB1,2 を制御する miR-200 family に注目し、胃癌の浸潤、転移における

microRNA-200 family の機能を解明することを目的とした。

【方法】胃癌新鮮凍結標本 40 例の microRNA-200b, c の microRNA 量、および ZEB1, ZEB2,

E-cadherin の RNA 量を定量し、その相関関係を調べ、さらに胃癌パラフィン包埋標本 127

例の miR-200b の microRNA 量と ZEB2, E-cadherin のタンパク発現との関係を解析した。さ

らに microRNA の機能を解析するために、胃癌細胞株に microRNA-200b を過剰発現させ、

標的遺伝子、タンパクの発現の変化、ならびに増殖能、浸潤能、遊走能を解析した。

【結果】新鮮凍結標本 40 例における解析では、microRNA-200b の発現は ZEB2 と逆相関関

係に、E-cadherin と相関関係にあった。パラフィン包埋標本 127 例の検討では、

microRNA-200b 低発現症例では高発現症例に比べ、diffuse type、リンパ節転移陽性、リンパ

管浸潤が多く、また壁深達度が深く、ステージが進行しており、腹膜再発が有意に多かっ

た。また、microRNA-200b 低発現症例は有意に予後不良であった。胃癌細胞株に、

microRNA-200b を高発現させると、細胞形態は紡錘形から多角形に変化し、ZEB2 の発現は

有意に抑制され、E-cadherin の発現が増加した。また、細胞増殖能、浸潤能、遊走能が低下

した。

【結論】胃癌において microRNA-200b は、ZEB2 の発現を制御しており、胃癌の浸潤転移に

関わると考えられた。

3

Summary

Objectives: MicroRNAs (miRs) are ~22 nucleotide non-coding RNA molecules that

regulate gene expression post-transcriptionally. Recent researches showed the miR-200

family (miR141, miR-200a, b, c, 429) induces epithelial differentiation, thereby

suppressing epithelial-mesenchymal transition (EMT) by inhibiting translational of

mRNA for zinc finger E-box-binding homeobox (ZEB) 1/2. However, to the best of our

knowledge, no studies have determined the role of the miR-200 family in the regulation

of EMT in gastric cancer. In the present investigation, we have revealed that miR-200b

regulated EMT as well as promoting proliferation and invasion in gastric cancer.

Methods: We investigated the relationship among the miR-200b, c, ZEB1/2 and

E-cadherin by analyzing the expression by qRT-PCR in frozen tissue samples from the

40 gastric cancer patients who underwent gastrectomy. Moreover the expression levels

of miR-200b and the expression of ZEB2, E-cadherin protein was examined using 127 in

resected gastric cancer specimens to determine the clinicopathological significance.

Moreover, we also analyzed the effects of miR-200b on proliferation, invasion and

migration in gastric cancer cells.

Results: There was a significant inverse relationship between the expression levels of

miR-200b and ZEB2/E-cadherin. Moreover, patients with low miR-200b expression

4

demonstrated a significantly poorer prognosis than those with high expression. There is

significant change of ZEB2, E-cadherin expression in gastric cells with over-expression

miR-200b and gastric cells and up-regulated miR-200b showed a significant reduction

in the cellular proliferation and inhibited cellular migration and invasion.

Conclusions: Our data suggests that miR-200b regulates the ZEB2 in gastric cancer and

thus controls EMT in gastric cancer. Restoration of miR-200b expression therefore

represents a potential candidate for miRNA-based therapy against gastric cancer.

5

2．発表論文リスト

①関連論文

1. Junji Kurashige,M.D., Hidenobu Kamohara, M.D., Ph.D., Masayuki Watanabe, M.D., Ph.D., Yukiharu Hiyoshi, M.D. , Ph.D., Masaaki Iwatsuki, M.D., Ph.D., Youhei Tanaka, M.D., Koichi Kinoshita, M.D., Seiya Saito, M.D., Yoshifumi Baba, M.D., Hideo Baba, M.D., Ph.D., FACS : MicroRNA-200b regulates cell proliferation, invasion and migration by directly targeting ZEB2 in gastric carcinoma: Ann Surg Oncol. (in press)

②その他の論文

(英文)

1. Kurashige J., Watanabe M., Iwatsuki M., Kinoshita K., Saito S., Hiyoshi Y.,

Kamohara H., Baba Y., Baba H.: Overexpression of microRNA-223 regulates the ubiquitin ligase FBXW7 in esophageal squamous cell carcinoma: Br J Caner. (in press)

2. Sato N, Hayashi N, Imamura Y, Tanaka Y, Kinoshita K, Kurashige J, Saito S,

Karashima R, Hirashima K, Nagai Y, Miyamoto Y, Iwatsuki M, Baba Y, Watanabe M,

Baba H.: Usefulness of Transcription-Reverse Transcription Concerted Reaction

Method for Detecting Circulating Tumor Cells in Patients With Colorectal Cancer.: Ann

Surg Oncol. 2011 Jul 6.

3. Nagai Y, Watanabe M, Ishikawa S, Karashima R, Kurashige J, Iwagami S, Iwatsuki

M, Baba Y, Imamura Y, Hayashi N, Baba H.: Clinical significance of Wnt-induced

secreted protein-1 (WISP-1/CCN4) in esophageal squamous cell carcinoma.: Anticancer Res. 2011 Mar;31(3):991-7.

4. Watanabe M, Nagai Y, Kinoshita K, Saito S, Kurashige J, Karashima R, Hirashima K,

Sato N, Imamura Y, Hiyoshi Y, Baba Y, Iwagami S, Miyamoto Y, Iwatsuki M, Hayashi

N, Baba H.: Induction chemotherapy with docetaxel/cisplatin/5-fluorouracil for patients

with node-positive esophageal cancer. : Digestion. 2011;83(3):146-52.

6

5. Imamura Y, Hayashi N, Sato N, Kinoshita K, Kurashige J, Saito S, Hirashima K,

Karashima R, Hiyoshi Y, Nagai Y, Watanabe M, Baba H: Extensive lymphatic spread of

cancer cells in patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma: Detection of

CEA-mRNA in the 3-field lymph nodes. J Surg Oncol 102:509-15, 2010 （和文） 1. 藏重 淳二、馬場 秀夫：GIST の術後補助療法の適応は？また、その投与期間は？

EBM 癌化学療法・分子標的治療法 2011-2012、2010

2. 蔵重淳二、渡邊雅之、池田 貯、林 尚子、馬場秀夫：経過・予後．第 4 章 管理・治

療 最新医学別冊新しい診断と治療のＡＢＣ14 胃癌(改訂第 2 版）消化器

2:227-235,2010

3. 蔵重淳二、馬場秀夫: 4 GIST 消化器外科学レビュー2010- 最新主要文献と解説- 総合医

学社:171-175, 2010

4. 木下浩一、渡邊雅之、蔵重淳二、齋藤誠哉、辛島龍一、平島浩太郎、長井洋平、池田 貯、

林 尚子、別府 透、馬場秀夫：消化器癌と分子標的治療-分子標的治療の概念，現状，将

来展望. 消化器外科 33:95-102,2010

5. 宮本裕士、林 尚子、日吉幸晴、今村 裕、蔵重淳二、木下浩一、馬場祥史、長井洋平、

尾崎宣之、岩上志朗、岩槻政晃、渡邊雅之、馬場秀夫：臨床医から見る分子標的薬のメデ

ィカルニーズ～大腸がん～. PHAMSTAGE 10:29-31,2010

6. 馬場秀夫、蔵重淳二、木下浩一、齋藤誠哉、辛島龍一、佐藤伸隆、平島浩太郎、岩槻

政晃、林 尚子、渡邊雅之：食道癌に対する集学的治療 最近の動向 切除可能食道

癌に対する術前化学放射線療法.消化器外科 2010-7 へるす出版:1297-1303,2010

7. 平島浩太郎、渡邊雅之、齋藤誠哉、木下浩一、藏重淳二、佐藤伸隆、辛島龍一、今村

裕、長井洋平、岩槻政晃、岩上志朗、宮本祐士、林 尚子、別府 透、馬場秀夫：術

前・術後に要注意 併存疾患の手術リスクと対策 Ⅰ.基礎疾患併存例の手術 5．慢性

肝疾患 外科 72:935-939,2010

8. 岩槻政晃、渡邊雅之、岩上志朗、木下浩一、蔵重淳二、馬場秀夫：臨床医から見る分子標

的薬のメディカルニーズ～胃がん～. PHAMSTAGE 10:32-34,2010

7

9. 木下浩一、 渡邊雅之、藏重淳二、 齊藤誠哉、 辛島龍一、 佐藤伸隆、 今村裕、 長

井洋平、 岩上志朗、 池田貯、 林尚子、 馬場秀夫：胃癌手術の流れと手術助手の心

得─幽門側胃切除における助手の役割、臨床外科、第 65 巻、第 3 号、348-352、2010

10. 辛島 龍一、渡邊 雅之、長井 洋平、木下 浩一、藏重 淳二、馬場 秀夫：十二指

腸断端の手縫いによる縫合閉鎖、臨床外科、第 64 巻、第 11 号、169-172、2009

8

3．謝辞

本研究の遂行ならびに本論文の作成にあたり、終始ご指導、ご鞭撻を賜わりました熊

本大学大学院医学薬学研究部 消化器外科学 馬場秀夫教授に謹んで厚く御礼申し上

げます。

また、本研究の研究方針ならびに実験手技、論文作成等に一貫して熱心な御指導をい

ただきました蒲原英伸講師に心より御礼申し上げます。さらに、渡邊雅之講師、岩槻政

晃助教には、胃癌の診断、治療における本研究の役割に関して貴重なご意見を頂くとと

もに、本研究の研究方針、論文作成に御指導いただきました。深く感謝いたします。組

織の免疫染色や細胞実験などに御協力いただきました谷口裕子実験補佐員、三宅慧輔実

験補佐員、横山奈穂美実験補佐員に深く感謝します。

さらに本研究の遂行にあたり検体の提供に御協力いただきました患者様に深く感謝

いたします。

最後に多くの御協力と御指導いただきました消化器外科学教室の教室員の皆様に心

よりの感謝を述べて、私の謝辞と代えさせていただきます。

9

4．略語一覧

AGO; argonaute

BMI1; B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1

CTC; circulating tumor cell

DNA; deoxyribonucleic acid

dsRNA; double-stranded RNA

EB; Epstein-Barr

EF1; Elongation Factor 1

EMT; epithelial-to-mesenchymal transition

FBS; fetal bovine serum

FFPE; Formalin-Fixed Paraffin-Embedded

HOXD10; homeobox D 10

ITC; isolated tumor cell

MET; mesenchymal -to-epithelial transition

miRNA, miR; microRNA

mRNA; messenger RNA

MMP; matrix metalloprotease

PCR; polymerase chain reaction

RISC; RNA-induced silencing complex

RNAi; RNA interference

RT; revere transcription

SUZ1; suppressor of zeste 1

pre-miRNA; precursor microRNA

pri-miRNA; primary microRNA

SIP1; smad-interacting protein 1

UTR; untranslated region

VGEF; vascular endothelial growth factor

ZEB; Zinc finger E-box-binding homeobox

(アルファベット順)

10

5．研究の背景と目的

5-1) 胃癌と胃癌における転移機構

胃癌は世界で4番目に頻度の高い癌であり、2番目の癌関連死因である。中でも東アジア、

東欧、中南米に有病率が高く、年間 70 万人が胃癌で死亡している[1]。特に我が国では、従

来最も頻度の高い癌とされてきた。2003 年の全国推計では、年間約 117,000 人（男 79,000

人、女 37,000 人）が胃癌に罹患している。年齢調整死亡率は 1985 年の人口分布を標準人

口として年齢階級別死亡率から推定した人口 10万人あたりの死亡率であるが、肺癌、肝癌、

大腸癌、膵癌が 2000 年まで増加傾向であったのに対して、胃癌は 1970 年代初頭より男女

共に着実に低下している（図１A）。これは、近年の消化管内視鏡検査に代表される診断学

の進歩、および外科治療をはじめ内視鏡治療や化学療法などの治療学の進歩によるものと

推測される。しかし、胃癌の総死亡者数自体は低下しておらず、依然として頻度の高い悪

性腫瘍のひとつである（図１B）。

図 1

図 1. 本邦における胃癌死亡率、死亡総数の推移

A：胃癌の年齢調整死亡率は着実に低下している。B：しかし胃癌総死亡者数自体は低下し

ておらず、依然として頻度の高い悪性腫瘍である。（出典：国立がん研究センターがん対策

情報センター）

11

癌の転移は、腫瘍発育進展の最終段階であり、胃癌に限らず癌患者の予後を規定する因

子の一つである。癌の転移の過程は Liotta らが提唱したように①癌細胞の原発巣からの離

脱、②癌細胞の間質への浸潤、③癌細胞の脈管内での生存と標的転移臓器への移動、④標

的臓器血管内皮への遊走、⑤標的臓器への生着と増殖という多段階からなると言われてい

る（図 2）[2-3]。

①癌細胞の原発巣からの離脱 細胞-細胞間は接着分子を介して情報伝達が行われ、細胞

の極性を保つことで秩序が維持される。転移において、原発巣からの癌細胞が離脱する際

に細胞間接着が失われるが、ここで重要な分子は、上皮細胞の接着結合を形成する

E-cadherin である。

②癌細胞の間質への浸潤 癌が粘膜、間質さらに血管内へ浸潤するには基底膜を破壊し、

間質の細胞外マトリックスを分解する必要がある。その代表的なタンパク分解酵素がマト

リックスメタロプロテアーゼ（MMP）であり、胃癌において MMP1 や MMP2 の発現に

より浸潤転移が促進されると報告された[4]。

③癌細胞の脈管内での生存と標的転移臓器への移動 癌細胞が原発巣から脈管へ浸潤し、

循環血液中に遊離する。近年、この遊離癌細胞（ITC; isolated tumor cell or CTC; circulating

tumor cell）の検出が各種癌で試みられている。通常は末梢血中に存在しない上皮系マーカ

ーを用いて免疫染色法や PCR 法で遊離癌細胞を検出することが可能となり、予後や抗癌剤

感受性のマーカーとして臨床応用が期待されている[5-6]。

④標的臓器血管内皮への遊走 循環した癌細胞は転移巣の血管内皮細胞と接着する。癌

細胞の細胞膜に存在する糖鎖と血管内皮細胞に発現するセクレチンが接着に関与する。胃

癌細胞膜の sialyl Lewis a/x の発現が転移能と関連することが報告されている[7]。

⑤標的臓器への生着と増殖 転移巣へ生着した、原発巣と同様にさまざまな増殖因子に

より増殖する。また癌細胞は血管内皮増殖因子（VEGF; vascular endothelial growth factor）

12

を産生し、新生血管の誘導を行う。胃癌においては、未分化型に比べ高分化型で VEGF の

発現が高く、血管新生も高度であり、肝転移の頻度が高くなると報告がある[8]。

図 2

図 2. 癌転移の過程（文献 3 より抜粋 一部改変）

癌の転移の過程は、①癌細胞の原発巣からの離脱、②癌細胞の間質への浸潤、③癌細胞の脈

管内での生存と標的転移臓器への移動、④標的臓器血管内皮への遊走、⑤標的臓器への生着

と増殖という多段階からなる。

胃癌の転移ルートは主に血行性、リンパ行性、播種性の 3 つがある。胃癌ではその解剖

学的・生物学的な特徴から腹膜播種が多く見られ、胃癌による死亡の 20-40％は腹膜播種に

よる。また、胃癌の分化度によって転移形式が異なることも特徴であり、高分化型は肝な

どへの血行性転移が多いのに対して腺管構造を形成せず、間質の増生を伴い、間質へ浸潤

する低分化型はリンパ行性、播種性転移が多い。

13

5-2) 癌浸潤転移と上皮間葉転換

上皮間葉転換（EMT ; epithelial-to-mesenchymal transition）は胚形成や創傷の治癒過

程で観察される重要な生理学的現象である。可動性が低く、極性を持ちカドヘリンを介し

て細胞と細胞が接着することによって組織を構築する上皮系細胞が、可動性の高い間葉系

細胞に変化し、組織をリモデリングする現象が EMT である。逆に、間葉系細胞が上皮系細

胞へ転換する過程は、MET（mesenchymal -to-epithelialtransition）と呼ばれる。癌の転

移は、これまで遺伝子不安定性に基づく特定の遺伝子変異によって誘発されると考えられ

てきたが、最近になって、EMT が誘因・維持されることによる細胞の移動と MET による

転移巣への着床と増殖がその一因になっていることが明らかになってきた[9]。EMT は転写

因子をはじめとして多くの分子が連携して働くことによって生じる現象であり、癌化や炎

症において活性化される細胞内シグナルと密接に関係している。前述のとおり E-cadherin

は上皮細胞における代表的な接着分子であり、E-cadherin の消失は EMT 現象の重要なス

テップと見なされており[10-11]、その発現は、EMT 関連転写因子である Snail1、Slung、

ZEB1（δEF1）や ZEB2（SIP1）、および Twist などによって制御されている[12-13]。こ

れらの EMT 関連転写因子発現と癌の様々な形質との関連も調べられており、胃癌では、

E-cadherin 遺伝子の変異[14]、タンパクの発現低下[15]、promoter 領域の methylation[16]

は悪性度と関連があることが報告され、また EMT 関連転写因子ファミリーでは、Snail[17]、

Twist[18]、ZEB1/2[19]、vimentin[20]が胃癌における悪性度・転移との関連について報告

されている。

ZEB1、ZEB2 は δEF1(delta-crystallin/E2-box factor 1)ファミリーに属する zinc finger

型転写因子で、ヒルシュスプリング病の原因遺伝子の１つでもある。ZEB1、ZEB2 は

E-cadherin のプロモーター上の 2 か所の E-box に結合することによって、その発現を制御

している[12]。ZEB1/2 の癌における悪性度・転移・予後との関連については胃癌の他にも、

大腸癌[21]、膵臓癌[22]、子宮体癌[23]など様々な癌種で報告されている。

14

5-3) microRNA による遺伝子発現制御機構

1995 年にスタートしたゲノムプロジェクトによりゲノムの情報の全体像が明らかとなり、

タンパク質をコードする遺伝子の数は、他の多くの真核生物と同程度で、わずか 21,000

程度であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子配列は、ヒトゲノム全体の 2％を占め

るのみである。したがってタンパク質をコードする遺伝子だけでは高等真核生物の複雑さ

は説明できず、タンパク質をコードしない(non- cording)領域に生物学的な複雑さを決める

活性が隠されているのではと推測されるようになった。1998 年に Fire と Mello によって、

線虫で RNA 干渉 (RNAi; RNA interference) という現象が報告され[24]、その分子機構が

解明されて以降、non-cording RNA のなかでも 18～25 塩基からなる microRNA(miRNA)

は、その発現異常がヒトの様々な疾患の発症に関与することが確認され、急速に注目を集

めるようになった。miRNA は 1993 年に線虫で発見され、その後ヒトを含む様々な生物で

保存されていることが分かった[25-27]。現在では、Sanger 社のデータベースである

miRBase (http://www.mirbase.org/)には、ヒトの miRNA は 1500 種類以上（2011 年 11 月

現在、Ver.18）が登録されており、ヒト遺伝子のうち 6 割程度が、miRNA によりなんらか

の制御を受けていると推測されている。

5-4) microRNA の生合成

miRNA の生合成と分子メカニズムを図に示した（図 3）[28]。動物における miRNA の生

合成は以下のステップから成る。はじめに、miRNA は、ゲノムから RNA ポリメラーゼⅡ

によって転写されることによって数百～数千塩基程度の primary miRNA(pri-miRNA)とし

て転写される。次に、この長い pri-miRNA は、核内で RNaseⅢ型の酵素である Drosha と

その補因子である二本鎖 RNA 結合タンパク質（ヒトでは DGCR8、ショウジョウバエでは

Pasha）を含む複合体によって切断され、ヘアピン構造を持った 70 塩基程度の precursor

miRNA (pre-miRNA) となる。pre-miRNA は、不完全に対合する領域を含んだ特徴のある

15

構造を取り、1 つ、ないし複数の miRNA となる。続いて pre-miRNA は、Exportin-5 レセ

プターとRAN-GTPによって核から細胞質へと輸送される。細胞質で pre-miRNAはRNase

Ⅲ型の酵素である Dicer よって 18-23 塩基長の mature miRNA に変換される。Dicer によ

って切り出された二本鎖 miRNA のうち、片方だけが miRNA となる。もう一方の鎖は

miRNA*と呼ばれる。

成熟した miRNA は RISC (RNA-Induced Silencing Complex)に取り込まれる。RISC と

は、dsRNA に導入することによって誘導される、配列特異的に標的 RNA を分解する活性

を持った複合体のことである。RISC の中核となる Argonaute（AGO）タンパク質が、RISC

に捕えられた mRNA の切断や翻訳抑制を引き起こすエンドヌクレアーゼとして働く。標的

mRNA（多くの場合は 3’-非翻訳領域）と miRNA との対合性が部分的な場合は標的 mRNA

の翻訳部分を抑制し、標的 mRNA と miRNA の対合性が完全であれば、siRNA と同様に

miRNA も標的 mRNA の切断（分解）を導く。 標的 mRNA 選別に重要な役割をするのは

miRNA の全長のうち 5’末端から数えて 2 番目から 8 番目までのシード配列と呼ばれる 7

塩基であることが明らかとなっている。このため 1 種類の miRNA が複数の mRNA 翻訳を

制御し、逆に 1 種類の mRNA は複数の miRNA によって制御を受けることになる。すなわ

ち miRNA と mRNA は「多対多」の対応であり、きわめて複雑なネットワークが細胞内に

存在することになる。

16

図 3

図 3. miRNA の生合成と分子メカニズム（文献 25 より抜粋）

はじめに、miRNA は、ゲノムから RNA ポリメラーゼⅡによって数百～数千塩基程度の

pre-miRNA に転写される。次に、この長い pri-miR は、Drosha によって切断され、70 塩

基程度の pre-miRNA となる。続いて pre-miRNA は、Exportin-5 レセプターと RAN-GTP

によって核から細胞質へと輸送される。pre-miRNA は Dicer よって 18-23 塩基長の mature

miRNA に変換される。成熟した miRNA は RISC に取り込まれる。標的 mRNA と miRNA

との対合性が部分的な場合は標的 mRNA の翻訳部分を抑制し、標的 mRNA と miRNA の

対合性が完全であれば、siRNA と同様に miRNA も標的 mRNA の切断を導く。

17

5-5) 癌の発症と進展に関わる microRNA の異常

近年、miRNA の研究の進歩により、マイクロアレイの手技を用いた網羅的な miRNA 発

現解析が可能となり、癌を中心とした様々な疾患と miRNA の関係が明らかとなってきた

[29-30]。癌特異的に発現する miRNA には正常組織と比較して発現が上昇するものと、発

現が低下するものがある、また一つの癌種の中でもその両者が混在していることが分かる。

上述したように、miRNA は標的とする mRNA の翻訳を抑制することでその遺伝子発現を

抑制することから癌における miRNA の働きは次のように推測される（図 4）。

癌で過剰発現している miRNA

Tumor suppresser gene を抑制していた microRNA の異常（過剰シグナル伝達、

転写因子の活性化など）により、miRNA の発現が増加し、tumor suppresser gene

が抑制され、癌の進展につながる。

癌で発現が低下している miRNA

Oncogene の発現を抑制していた miRNA の異常（遺伝子変異、promoter の過剰

メチル化など）により、miRNA の発現が抑制され Oncogene の発現が亢進し、癌

の進展につながる。

18

図 4

図 4. miRNA と標的癌遺伝子、癌抑制遺伝子の関係

癌特異的に発現する miRNA には、正常組織と比べて発現が上昇するもの、発現が低下する

ものがある。癌抑制遺伝子を抑制していた miRNA の上昇（過剰シグナル伝達、転写因子の

活性化など）により癌の進展につながる。癌遺伝子の発現を抑制していた miRNA の発現抑

制（遺伝子変異、promoter の過剰メチル化など）により、癌の進展につながる。

最近になって、miRNA の発現異常は、癌の発生、進展以外にも、癌の転移にも大きく関

わると報告されている（表 1）[31]。Weinberg らは乳癌において、miR-10b の antagonist

を投与することによって、その標的遺伝子である HOXD10 の発現が上昇し、遠隔転移を抑

制することを明らかとした[32]。また、miR-34a は、前立腺癌において細胞間接着因子であ

る CD44 を制御することによって転移に関与していることが報告された[33]。miR-200

family（miR-141, 200a, 200b, 200c, 429 ）は、miRNA の中でも特に転移に関与している

miRNA として有名であり、EMT 関連転写因である ZEB1、ZEB2 を制御することによっ

て癌の転移に大きく関わっていることが、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵癌など多くの癌で報告

されている[34-37]。しかし、胃癌においては miRNA の発現、予後に関する報告は散見さ

れるが、転移を制御する miRNA の発現や機能解析などの基礎研究の報告はなされていない

19

[38-39]。[33, 38, 40-46]

表 1

表 1． 転移機構に関与する miRNA（文献 28 より抜粋、一部改変）

5-6) 本研究の目的

本研究は、胃癌臨床検体を用いて、胃癌正常上皮と胃癌部における miR-200 family

の発現を解析し、その臨床病理学的な意義を検討する。胃癌における miR-200 family

の発現と EMT 関連分子である E-cadherin、ZEB1、ZEB2 の発現の相関関係を解析す

る。また、miR-200 の発現上昇が、腫瘍の進展・浸潤にどのような影響を及ぼすかに

ついて、胃癌細胞株を用いて検討する。

20

6．実験方法

6-1）解析対象症例について

患者検体を用いた研究に関しては、熊本大学医学薬学研究部の倫理委員会の承認を経た

後に実施した。2008 年から 2010 年までに熊本大学医学部附属病院消化器外科で手術を受

けた胃癌患者にインフォームドコンセントを行い、切除検体から正常上皮と癌部それぞれ

の組織を採取した。そのうち、術前治療が行われていない 40 症例を本研究の対象とし、実

験時まで-80℃で保管した。これらの症例とは別に、2000 年から 2007 年までにまでに熊本

大学医学部附属病院消化器外科で手術を受けた胃癌患者 127 例を対象とし、ホルマリン固

定パラフィン包埋ブロック（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded: FFPE）正常上皮と癌部

それぞれの組織を研究に使用した。

6-2）細胞株

ヒト胃癌細胞株（AGS ,MKN7, MKN45, NUGC3, NUGC4）を理研バイオリソースセン

ターから供与頂いた。すべての細胞株は 10％fetal bovine serum (FBS)を含む RPMI1640

（Cambrex）を用いて 37℃、5％CO2 条件下で培養した。

6-3）定量的 real-time PCR

新鮮凍結組織、細胞株から RNA を抽出する際には、mirVana microRNA isolation kit

（Ambion）を用い、FFPE から RNA を抽出する際には、RecoverAll™ Total Nucleic Acid

Isolation Kit （Ambion）を用い、protocol に従って total RNA を抽出した。すべての RNA

サンプルは-80℃で保存した。

miRNA の定量 real-time PCR には、Taqman microRNA assay ( Applied Biosystems)

を用いた。Total RNA 10ng で reverse transcription(RT)を行った後に、LigtCycler 480

System II ( Roche Diagnostics, USA )を用いて PCR を行った。PCR 反応は、95℃10 分間

21

ののち、95℃30 秒間、58℃30 秒間で 40 サイクル行った。RNU6B を内在性コントロール

として 2-△△CT法で比較定量した。

E-cadherin、ZEB1、ZEB2 mRNA の定量 real-time PCR は Syber Green 法で行った。

各 1µg の total RNA から cDNA を合成し、PCR の各遺伝子特異的プライマーを作成し、

LigtCycler 480 System II にて PCR を行った。PCR 反応は 95℃10 分間ののち、95℃1 分、

58℃1 分で 40 サイクル行った。GAPDH を内在性コントロールとして 2-△△CT法で比較定量

した。

図 5. Taqman assay を用いた microRNA の定量 real-time PCR

このアッセイでは、RT の過程で、ループ構造を持つ miRNA 特異的なプライマーを用い

て、PCR の行程で miRNA 特異的な Taqman プローブを用いることで感度と特異度を高め

るように設計されている。

図 5

22

6-4）免疫組織化学的解析

ZEB2 の一次抗体にはラビット抗 ZEB2（SIP1）抗体（L-20; 1:200, Santa Cruz

Biotechnology, USA ）、 E-cadherin の一次抗体にはマウス抗 E-cadherin 抗体（1:100,

BD Transduction Laboratories, USA ）を用いた。FFPE 切片よりパラフィンを除去

して、10mM クエン酸バッファー（pH9.0）中で 15 分間マイクロウェーブにかけ抗原

賦活化を行った後、内因性ペルオキシダーゼを除去するために 3％過酸化水素水で 5 分

間処理した。上記の一次抗体を、4℃ overnight で抗原抗体反応をおこなった。

phosphate-buffered saline(PBS)で洗浄した後、二次抗体（EnvisionTM+ kit、Dako

Cytomation, Denmark）を用いて、室温で 1 時間反応させた後、PBS で洗浄した。

diaminobenzideined で発色させた後、対比染色としてヘマトキシリン染色を行った。

6-5）pre-miR-200b を用いた miR-200b の機能解析

胃癌細胞において miR-200b の機能解析を行うために、Pre-miRTM miRNA Precursor

Molecule pre-200b(pre-miR-200b)(Applied Biosystems)を用いて miR-200b の活性を亢進

させた。コントロールとして Pre-miRTM miRNA Precursor Molecule Negative Control #1

(pre-miR-n.c.) (Applied Biosystems)を用いた。Lipofectamin2000（Invitrogene, USA） を

用い、50nM の濃度でトランスフェクションを行い、48 時間、37℃、5％CO2 の条件下で

培養した。トランスフェクション後は、mirVana microRNA isolation kit を用いて total

RNA を抽出し、上述の real-time PCR を行った。

6-6）培養細胞の蛍光免疫染色

NUGC3 細胞をカバーガラスの上に播き、24 時間後上述のとおり pre-miR-200b または

23

pre- negative control でトランスフェクトを行い、さらに 48 時間インキュベーションの後

に 4％PFA にて 15 分間固定した。3％BSA-TBS にて 15 分間のブロッキングを行い、マウ

ス抗 E-cadherin 抗体（1:50, BD Transduction Laboratories）にて 1 時間室温にて反応後、

暗室で二次抗体 Hylite Fluor555-labeled (1:50; AnaSpec, CA, USA)と反応させスライドガ

ラスに封入した。核の染色は、4’-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen, USA)

にて行った。観察は・撮影は FV300 蛍光顕微鏡（Olympus, Japan）を用いた。

6-7）Western blot 法

6well plate に培養した細胞を PBS で 2 回洗浄し、溶解バッファー[ 25nM Tris-HCl ( pH

7.4) , 100 mM NaCl, 2mM EDTA, 1% Triton X with 10µg/ml aprotinin, 10µg/ml

leupeptin, 1mM Na3VO4, 1mM phenylmethylsulfonylfuoride]を用いて細胞を溶解した。

その上清サンプルを 10％アクリルアミドゲルで SDS-PAGE を行い、ニトロセルロースメ

ンブレン（BIO-Rad）に転写した。5％スキムミルクを加えた 0.1％Tween 20-TBS 溶液を

用いて 4�で 12 時間ブロッキングした。一次抗体はマウス抗 E-cadherin 抗体（1:2000, BD

Transduction Laboratories, USA ）およびラビット β-actin 抗体（1:2000, Sigma-Aldrich,

USA ）を用い、二次抗体は HRP 標的抗マウス IgG 抗体、ラビット IgG 抗体（Amersham

Bioscience）を用いた。抗体希釈には Can Get Signal (TOYOBO, Japan)を使用し、検出に

は ECL Detection System（GE Healthcare）で行った。

6-8）Reporter assay

miR-200b による ZEB2 発現制御機構を明らかにするために、ルシフェラーゼを含むレポ

ーターベクターを用いて reporter assay を行った。ベクターはルシフェラーゼの翻訳配列

の下流に ZEB2の 3’UTR領域を挿入してある transfection-ready ルシフェラーゼレポータ

24

ー（LightSwitch 3'UTR reporter GoClone、SweachGear）を用いた。コントロールには、

empty-reporter（SweachGear）を用いた。胃癌細胞株にベクターをトランスフェクトする

際には、それぞれ 50nM の pre-miR-200b、pre-negative control を加え、Lipofectamin2000

( Invitrogen )を用いた。トランスフェクションの 24 時間後に LightSwitch Assay Reagent

（SweachGear）を使用して、reporter assay を行った。実験は triplicate で行った。

6-9）Cell proliferation, invasion, migration assay

Cell proliferation assay は、96well plate に細胞を培養し、Cell Counting Kit (Dojin

Laboratories, Japan)を用いた WST-8 assay で行った。細胞を 3×103/well 個散布し、24 時

間後に pre-miR-200b または pre- negative control でトランスフェクトを行い、トランス

フェクト後 24，48，72 時間毎に、10 µl の Cell Counting Kit を各 well に添加し、添加 2

時間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーにて 450nmの波長で測定した。

Cell invasion assay は Matrigel Invasion Chamber 24 well ( BD bioscience, USA )

を用い、トリプリケートで行った。下の well には化学誘引物質としての 10％FBS を含

んだ RPMI1640 を加えて、チャンバー内には FBS を含まない RPMI1640 と 48 時間

pre-miR-200b または pre- negative control でトランスフェクトした細胞 1.0×105 個

/well を添加した。プレートを、37℃、5％CO2 の条件下、24 時間で培養し、非浸潤細胞を

免棒で除去し浸潤細胞を 100％メタノールで固定し、1％トルイジンブルーで染色した。そ

の後に浸潤細胞数を測定した。

Cell migration は、scratch assay を用いて wound healing activity として評価した。

12well plate に 48 時間 pre-miR-200b または pre- negative control でトランスフェクト

した細胞を 1.0×105個を加え、24 時間後にコンフルエント状態であることを確認し、pipet

tip の先端で細胞を直線状に剥離（scrach）し、それより 24 時間培養を行い scratch 幅から

25

の回復面積を image J にて測定し、細胞回復面積を wound healing activity として評価し

た。

6-10) 統計学的解析

統計学的解析には SPSS v. 13.0 software (SPSS, Inc. USA) を用いた。群間比較には

Student’s t 検定または χ2 検定を用い、p

26

7．実験結果

7-1）胃癌凍結新鮮標本における miR-200b、c の発現

miR-200 family は、1 番染色体から転写される miR-200a、miR-200b、miR-429 と、12

番染色体から転写される miR-141、miR-200c に大別できる（図 6）。今回、我々は、miR-200

family の中で、他の癌種で報告の多い、miR-200b と miR-200c にて関して、胃癌凍結新鮮

標本 40 例において発現を解析した。miR-200b、miR-200c ともに癌部、正常粘膜部で有意

差はなかったが（ 図 7A ）、胃癌を intestinal type (tubular adenocarcinoma, papillary

adenocarcinoma）と diffuse type（poorly differentiated adenocarcinoma, signet-ring cell

adenocarcinoma ）に分けると、diffuse type において miR-200b,c ともに発現が有意に低

かった（図 7 B ; P

27

miR-200c について胃癌凍結新鮮標本 40 例において発現を解析した。

図 7A

B

図 7. 胃癌凍結新鮮標本における miR-200b、c の発現

A. miR-200b、miR-200c ともに癌部、正常粘膜部で有意差はなかったが、B. diffuse typeの胃癌において miR-200b, c ともに発現が有意に低かった（P

28

図 8 A ZEB1 B ZEB2 C E-cadherin

図 8．胃癌新鮮凍結標本の miR-200b と

ZEB1、ZEB2、E-cadherin mRNA の相関関係

miR-200b との発現を比較すると、A. miR-200b と ZEB1 に関しては有意な関係はなかった

が、B. ZEB2 とは逆相関関係(P < 0.05, r = -0.32)、C. E-cadherin とは相関関係であった( P <

0.05, r = -0.38)。

7-3）胃癌パラフィン包埋組織における miR-200b の発現

次に胃癌パラフィン包埋組織 127 例において miR-200b の発現解析を行った。

癌部、非癌部での miR-200b の発現を比（T/N ratio）で表し、T/N ratio >1 を、miR-200b

高発現群、T/N ratio

29

図 9 A Disease free survival B Overall survival

図 9. 胃癌における miR-200b の発現と予後との相関

miR-200b の発現を T/N ratio ≧1.0 or

30

表 2. 胃癌 127 例における miR-200b の発現と臨床病理学的因子との関係

31

7-4）胃癌における ZEB2, E-cadherin の発現意義と miR-200b との関係

胃癌パラフィン包埋組織 127 例において免疫染色にて、ZEB2、E-cadherin の発現解析

を行い、ZEB2、E-cadherin と予後との関係、miR-200b の発現との相関を検討した。

ZEB2はdiffuse typeで高発現しており、対称的にE-cadherinはintestinal typeで発現を認

めた（図10）。過去の論文よりそれぞれの評価の方法を参照して[47-48]、ZEB2の発現は、

発現強度を0 (negative)、1 (weak)、 2 (medium) 、 3 (strong)、発現範囲を0 (0%)、1 (1%-25% )、

2(26% -50% )、 3 (51% -75% ) 、4 (76% -100% )にスコア分類し、発現強度+発現範囲≧3を

陽性症例とすると、66例（51.9％）が陽性、61例（48.0％）が陰性であった。E-cadherinの発

現は、癌部と癌周囲の組織の染色強度を比較して、癌部の染色強度が強い場合を陽性例と

すると、72例（56.7％）が陽性、55例が（43.3%）陰性であった。ZEB2とE-cadherinの関係

をχ2検定で検討すると、逆相関関係であった（表3、P

32

図 10

図 10. 胃癌における ZEB2、E-cadherin の免疫染色

A.B. ZEB2 は、diffuse type で高発現しており、intestinal type では低発現している。C.D.

対称的に E-cadherin は diffuse type で低発現しており、intestinal type では高発現してい

た。

表 3. ZEB2 と E-cadherin の相関関係

33

図 11 A ZEB2 expression B E-cadherin expression

図 11．胃癌における ZEB2 と E-cadherin の発現と予後との相関 A. overall survivalにおいて、ZEB2陽性例は、陰性例と比較して、予後不良の傾向であり

(P=0.089) 、対称的にE-cadherin陰性例は、陽性例と比較して有意に予後不良であった

(P

34

7-5）胃癌細胞株における miR-200b の発現と

miR-200b 導入による細胞株の形態変化

胃癌細胞株（AGS ,MKN7, MKN45, NUGC3, NUGC4）にて miR-200b の発現を解析す

ると、well differentiated adenocarcinoma である MKN7 でその発現が高く、poorly

differentiated adenocarcinoma である AGS,MKN7,MKN45,NUGC3,NUGC4 では発現が

低かった（図 12）。以下の in vitro の実験は特に発現の低かった AGS、NUGC3 を中心に

進めた。

NUGC3 に pre-miR-200b をトランスフェクトすると miR-200b の発現は、約 19 倍に増

加し（図 13 A）、細胞の形態変化をみると、紡錘形の細胞が、多角形へと変化し、細胞接着

が増強した（図 13 B）。

図 12

図 12．胃癌細胞株における miR-200b の発現 miR-200b は well differentiated adenocarcinoma である MKN7 でその発現が高く、poorly

differentiated adenocarcinoma である AGS,MKN7,MKN45,NUGC3,NUGC4 では発現が

低かった。

35

図 13

A B

図 13．pre-miR-200b 導入よる NUGC3 の形態変化 poorly differentiated adenocarcinoma である NUGC3 に pre-miR-200b を導入すると A.

miR-200b の発現は約 19 倍になり、 B. 紡錘形であった細胞は多角形になり、細胞間の接

着がより強固になった。

7-6）miR-200 導入による ZEB2,E-cadherin の発現変化

NUGC3 に pre-miR-200b を導入して、miR-200b を up regulate させると、ZEB2 mRNA

の発現は有意に低下し（図 14 A）、E-cadherin mRNA の発現は有意に上昇した（図 14 B）。

また、E-cadherin はタンパクレベルでも発現の上昇が確認できた（図 14 C）。

さらに、細胞蛍光免疫染色によって、E-cadherin の発現の変化をみると、miR-200b が

上昇し、細胞の形態が多角形になるに伴って、E-cadherin の発現は、細胞壁へと移動し増

強した( 図 14 D)。

次に、ルシフェラーゼアッセイを行い、ZEB2 の変化が、miR-200b の ZEB2 の 3’UTR領域への相補的結合によるものであることを確認した。NUGC3 に対して、ZEB2 3′UTR reporter + pre-miR-n.c.、empty vector miR + pre-miR-n.c.、ZEB2 3′UTR reporter + pre-miR-200b、empty vector miR + pre-miR-n.c. の 4 種類のトランスフェクトを行い、ル

シフェラーゼ活性を検討すると、ZEB2 3′UTR reporter + pre-miR-200b のみでルシフェラーゼ活性の減少が確認された（図 14 E ）。

36

図 14

図 14. miR-200b 導入よる ZEB2,E-cadherin の発現変化

NUGC3 に pre-miR-200b を導入すると A. ZEB2 の mRNA の発現は有意に減少し、 B.

E-cadherin の発現は有意に上昇した。C. E-cadherin はタンパクレベルでも上昇が見られ、

D. E-cadherinの発現は、細胞壁へと移動し増強した。E. ルシフェラーゼアッセイではZEB2

3′UTR reporter+pre-miR-200b のみでルシフェラーゼ活性の減少が確認され、ZEB2 の変化が、

miR-200b の ZEB2 の 3’UTR 領域への相補的結合によるものであることを確認した。

37

7-6）miR-200 導入による miR-200b の機能解析

胃癌細胞株に pre-miR-200b を導入して、miR-200b を up regulate させ、proliferation

assay、invasion assay、migration assay を行った。proliferation assay、migration assay

には NUGC3、AGS を、invasion assay には AGS を用いた。なお AGS は invasion assay

の際に使用する matrigel invasion chamber へ良好な浸潤性を示し、invasion assay に適し

ていたため使用した。proliferation assay では、NUGC3 はトランスフェクト 24 時間後か

ら、AGS は 96 時間後に、それぞれ有意に細胞増殖の抑制を認めた（図 15 A）。 invasion

assay では、浸潤細胞の有意な減少を認め（図 15 B ）、migration assay でも、細胞遊走

能の有意な減少を認めた（図 15 C ）。

図 15

38

図 15. miR-200b 導入よる ZEB2,E-cadherin の発現変化 NUGC3 に pre-miR-200b を導入すると A. proliferation assay では、NUGC3 はトランス

フェクト 48 時間後から、AGS は 96 時間後に、それぞれ有意に細胞増殖の抑制を認めた。

B. invasion assay では、浸潤細胞の有意な減少を認め、C. migration assay では遊走細胞

の減少を認めた、回復面積の有意な減少を認めた。

39

8．考察

今回、我々は胃癌切除検体を用いた miR-200b、miR-200c および ZEB1、ZEB2、

E-cadherin の発現解析を行うことによって、miR-200b の発現が、ZEB2 と逆相関関係、

E-cadherin と相関関係にあることを確認した。また、microRNA-200b 低発現症例では高発

現症例に比べ、diffuse type、リンパ節転移陽性、リンパ管浸潤が多く、また壁深達度が深く、

ステージが進行しており、腹膜再発が有意に多いことが判明した。また、miR-200b 低発現

群は、高発現群と比べ有意に予後不良であった。さらに、我々は、胃癌細胞株の実験にお

いて、pre-miR-200b を用いて miR-200b の発現を高発現させることによって、ZEB2、

E-cadherin の発現が変化し、細胞の浸潤、増殖が抑制されることを示した。

癌の転移、再発は前述のとおり多段階からなり、その過程には様々な分子が作用してい

る。今回、我々は、癌の EMT に注目し、EMT の過程で重要な役割を果たしている EMT

関連転写因子であるZEB1,2を標的とするmiRNAに関して研究を進めた。今回の研究では、

主に miR-200b のみの解析であったが、多くの癌種で miR-200 family の機能について解析

が行われ、miR-200 family と ZEB1、ZEB2 との関連が報告されている[34-37]。我々の結

果同様に、miR-200 family が ZEB の発現を抑制し癌転移を制御するだけでなく、ZEB 自

身もまた miR-200 family の発現制御を行い、negative-feedback 機能が働いていることも

報告されている[35]。miR-200family の発現は、TGF-βとも関わりを持っており[49]、ま

た promoter 領域のメチル化によってもその発現が制御されていることが報告されている

[50]。胃癌におけるエピジェネティックな異常に関しては、ヘリコバクターピロリ菌感染に

よる慢性炎症や EB ウイルス関連胃癌において、胃粘膜の広範な遺伝子の promoter 領域に、

高頻度に DNA メチル化を来していることが分かっている[51-52]。特に、EB ウイルス関連

胃癌は、低分化型腺癌が多くリンパ球浸潤を高度に伴うことが病理組織学的特徴として知

られており、miR-200family の promoter 領域の高度メチル化に伴う、miR-200 family の

発現低下が発癌や癌分化度決定に大きな関わりを持っていることが推測される（図 16）。

40

miR-200 family は、癌転移過程の他にも、様々な分子を制御することにより癌の発生、

浸潤などに関わっている。Shimono らは、乳癌癌幹細胞と癌幹細胞マーカー陰性の癌細胞

との miRNA の発現を比較し、miR-200c-141、miR-200b-200a-429 クラスターの発現に差

があり、乳癌幹細胞において miR-200 family が重要な関わりを持っていることを報告した

[53]。また、miR-200c は、タキサン系抗癌剤の標的分子である class III β –tubulin の発現を

制御することによって抗癌耐性にも重要な働きを持つことが報告されている[54-55]。これ

らの miR-200 family の特徴を考えると、miR-200family の補充により、癌転移の抑制、腫瘍

の進展・浸潤の抑制、抗癌剤耐性からの回復が期待され、将来的には治療への応用が期待

されている。しかし、前述したとおり、miRNA による遺伝子制御は、一つの miRNA が多

くの遺伝子を調整する「多様性」や、ある遺伝子を制御するために複数の miRNA が共同的

に相互作用する「共同性」の両側面を持っている。miR-200 family も ZEB1,ZEB2 だけでな

く BMI1[53]、SUZ12[56]などを標的としていることが報告されており、まだ報告されてい

ない新たな標的遺伝子も多く存在することが考えられる。この「多様性」と「共同性」は、

miRNA を治療に利用する困難さの原因となっている。つまり、抗腫瘍効果を期待して、ひ

とつの miR を標的として治療を行ったとしても、その他の多くの遺伝子を制御してしまう

可能性があることで多くの副作用を持つことが考えられるのである。実際に、癌転移抑制

の効果を期待された miR-200 family であるが、癌の転移の過程には、EMT と同様に、MET

も重要な機構であり、癌細胞の微小循環への浸潤を阻害する一方で、癌細胞の転移先への

生着を促進する可能性があることが最近になって報告された[57]。

しかし、現在 miRNA の制御による疾患治療の研究は急速に進んでいる。治療の戦略とし

ては、①過剰 miRNA の機能抑制と、②miRNA 自体の補充の 2 種類の方法が考えられる。

miRNA の抑制による治療では、癌細胞で高頻度に高発現している、miR-21 や miR-17-92 ク

ラスターなどを抑制する治療薬創薬の研究が進んでいる[58]。miR-21 や miR-17-92 クラスタ

ーなどのように複数の癌抑制遺伝子を標的としている miRNA を抑制することは、単独の分

41

子標的治療よりも大きな効果を生みだすことができるとも考えられる。一方 miRNA の補充

療法は、癌で下がっている miRNA の導入による治療であり、Ochiya らは miR-16 の導入に

よりマウスモデルで前立腺の骨転移を抑制できることを報告した[59]。

このように miRNA の創薬研究は、標的遺伝子の同定や、miRNA 治療薬の最適な投与形

態や代謝経路など多くの課題はあり、臨床応用へはまだまだ解明されなければならない課

題は多いが、今後の核酸医療の 1 つの核となり得る可能性を十分にもっていると思われる。

今回、我々は胃癌において、miR-200b が癌転移機構に大きな関わりを持ちまた、予後

を規定する因子であることを明らかにした。今後我々は、miR-200 family 自体の発現制御

の解明やその他の miRNA の解析をさらに進め、最終的には miRNA を応用した消化器癌に

おける新しい診断法・治療法の確立を目指したいと考えている。

42

図 16

図 16. miR-200 family による ZEB1, ZEB2 を介した EMT の制御機構

（文献 31 より抜粋、一部改変）

miR-200 family は、翻訳レベルで E-cadherin の発現を抑制する。miR-200 family 自身

は、TGFβの発現、EB virus 感染、そしてプロモーター領域の methylation レベルによっ

て発現が制御されている。

43

9. 結語

miR-200b は胃癌において、EMT 関連因子である ZEB2、E-cadherin を制御することに

より癌の浸潤、転移に大きな関わりを持ち、その予後を規定する因子であると考えられた。

また、胃癌細胞株において、miR-200b の補充は、細胞の増殖、浸潤、遊走を抑制すること

を証明した。将来的には、胃癌を含め癌治療において、miRNA が有効なターゲットとなる

ことを期待している。

44

10. 参考 文献

1. Ferlay, J., et al., Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer, 2010. 127(12): p. 2893-917.

2. Woodhouse, E.C., R.F. Chuaqui, and L.A. Liotta, General mechanisms of metastasis. Cancer, 1997. 80(8 Suppl): p. 1529-37.

3. Iwatsuki, M., et al., Epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance. Cancer Sci, 2010. 101(2): p. 293-9.

4. Mori, M., et al., Analysis of MT1-MMP and MMP2 expression in human gastric cancers. Int J Cancer, 1997. 74(3): p. 316-21.

5. Mimori, K., et al., Hematogenous metastasis in gastric cancer requires isolated tumor cells and expression of vascular endothelial growth factor receptor-1. Clin Cancer Res, 2008. 14(9): p. 2609-16.

6. Sato, N., et al., Usefulness of Transcription-Reverse Transcription Concerted Reaction Method for Detecting Circulating Tumor Cells in Patients With Colorectal Cancer. Ann Surg Oncol, 2011.

7. Tatsumi, M., et al., Immunohistochemical expression of the sialyl Lewis x antigen on gastric cancer cells correlates with the presence of liver metastasis. Clin Exp Metastasis, 1998. 16(8): p. 743-50.

8. Takahashi, Y., et al., Significance of vessel count and vascular endothelial growth factor and its receptor (KDR) in intestinal-type gastric cancer. Clin Cancer Res, 1996. 2(10): p. 1679-84.

9. Thiery, J.P., Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer, 2002. 2(6): p. 442-54.

10. Thiery, J.P. and J.P. Sleeman, Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7(2): p. 131-42.

11. Xu, J., S. Lamouille, and R. Derynck, TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res, 2009. 19(2): p. 156-72.

12. Peinado, H., D. Olmeda, and A. Cano, Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cancer, 2007. 7(6): p. 415-28.

13. Shirakihara, T., M. Saitoh, and K. Miyazono, Differential regulation of epithelial and mesenchymal markers by deltaEF1 proteins in epithelial mesenchymal transition induced by TGF-beta. Mol Biol Cell, 2007. 18(9): p. 3533-44.

14. Guilford, P., et al., E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer. Nature, 1998. 392(6674): p. 402-5.

15. Zhong, X.Y., et al., Positive association of up-regulated Cripto-1 and down-regulated

45

E-cadherin with tumour progression and poor prognosis in gastric cancer. Histopathology, 2008. 52(5): p. 560-8.

16. Graziano, F., et al., Prognostic analysis of E-cadherin gene promoter hypermethylation in patients with surgically resected, node-positive, diffuse gastric cancer. Clin Cancer Res, 2004. 10(8): p. 2784-9.

17. Kim, M.A., et al., Prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition-related protein expression in gastric carcinoma. Histopathology, 2009. 54(4): p. 442-51.

18. Ru, G.Q., et al., Upregulation of Twist in Gastric Carcinoma Associated with Tumor Invasion and Poor Prognosis. Pathol Oncol Res, 2010.

19. Castro Alves, C., et al., Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and Snail in the down-regulation of E-cadherin. J Pathol, 2007. 211(5): p. 507-15.

20. Iwatsuki, M., et al., The clinical significance of vimentin-expressing gastric cancer cells in bone marrow. Ann Surg Oncol, 2010. 17(9): p. 2526-33.

21. Spaderna, S., et al., A transient, EMT-linked loss of basement membranes indicates metastasis and poor survival in colorectal cancer. Gastroenterology, 2006. 131(3): p. 830-40.

22. Graham, T.R., et al., Insulin-like growth factor-I-dependent up-regulation of ZEB1 drives epithelial-to-mesenchymal transition in human prostate cancer cells. Cancer Res, 2008. 68(7): p. 2479-88.

23. Spoelstra, N.S., et al., The transcription factor ZEB1 is aberrantly expressed in aggressive uterine cancers. Cancer Res, 2006. 66(7): p. 3893-902.

24. Fire, A., et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998. 391(6669): p. 806-11.

25. Ambros, V., The functions of animal microRNAs. Nature, 2004. 431(7006): p. 350-5. 26. Meister, G., miRNAs get an early start on translational silencing. Cell, 2007. 131(1):

p. 25-8. 27. Zamore, P.D. and B. Haley, Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 2005.

309(5740): p. 1519-24. 28. Esquela-Kerscher, A. and F.J. Slack, Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.

Nat Rev Cancer, 2006. 6(4): p. 259-69. 29. Calin, G.A., et al., MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic

lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(32): p. 11755-60. 30. Croce, C.M. and G.A. Calin, miRNAs, cancer, and stem cell division. Cell, 2005.

122(1): p. 6-7.

46

31. Nicoloso, M.S., et al., MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nat Rev Cancer, 2009. 9(4): p. 293-302.

32. Ma, L., et al., Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nat Biotechnol, 2010. 28(4): p. 341-7.

33. Liu, C., et al., The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat Med, 2011. 17(2): p. 211-5.

34. Gregory, P.A., et al., The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1. Nat Cell Biol, 2008. 10(5): p. 593-601.

35. Bracken, C.P., et al., A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition. Cancer Res, 2008. 68(19): p. 7846-54.

36. Korpal, M., et al., The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2. J Biol Chem, 2008. 283(22): p. 14910-4.

37. Park, S.M., et al., The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2. Genes Dev, 2008. 22(7): p. 894-907.

38. Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis. Cell Res, 2008. 18(3): p. 350-9.

39. Volinia, S., et al., A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(7): p. 2257-61.

40. Voorhoeve, P.M., et al., A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors. Cell, 2006. 124(6): p. 1169-81.

41. Huang, Q., et al., The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat Cell Biol, 2008. 10(2): p. 202-10.

42. Crawford, M., et al., MicroRNA-126 inhibits invasion in non-small cell lung carcinoma cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 2008. 373(4): p. 607-12.

43. Fish, J.E., et al., miR-126 regulates angiogenic signaling and vascular integrity. Dev Cell, 2008. 15(2): p. 272-84.

44. Mayr, C., M.T. Hemann, and D.P. Bartel, Disrupting the pairing between let-7 and Hmga2 enhances oncogenic transformation. Science, 2007. 315(5818): p. 1576-9.

45. Yu, F., et al., let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell, 2007. 131(6): p. 1109-23.

46. Varambally, S., et al., Genomic loss of microRNA-101 leads to overexpression of histone methyltransferase EZH2 in cancer. Science, 2008. 322(5908): p. 1695-9.

47

47. Miura, N., et al., Clinicopathological significance of Sip1-associated epithelial mesenchymal transition in non-small cell lung cancer progression. Anticancer Res, 2009. 29(10): p. 4099-106.

48. Uchikado, Y., et al., Increased Slug and decreased E-cadherin expression is related to poor prognosis in patients with gastric cancer. Gastric Cancer, 2011. 14(1): p. 41-9.

49. Gregory, P.A., et al., An autocrine TGF-beta/ZEB/miR-200 signaling network regulates establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition. Mol Biol Cell, 2011. 22(10): p. 1686-98.

50. Davalos, V., et al., Dynamic epigenetic regulation of the microRNA-200 family mediates epithelial and mesenchymal transitions in human tumorigenesis. Oncogene, 2011.

51. Shin, C.M., et al., Role of Helicobacter pylori infection in aberrant DNA methylation along multistep gastric carcinogenesis. Cancer Sci, 2010. 101(6): p. 1337-46.

52. Kang, G.H., et al., Epstein-barr virus-positive gastric carcinoma demonstrates frequent aberrant methylation of multiple genes and constitutes CpG island methylator phenotype-positive gastric carcinoma. Am J Pathol, 2002. 160(3): p. 787-94.

53. Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.

54. Cochrane, D.R., et al., MicroRNA-200c mitigates invasiveness and restores sensitivity to microtubule-targeting chemotherapeutic agents. Mol Cancer Ther, 2009. 8(5): p. 1055-66.

55. Cochrane, D.R., et al., Loss of miR-200c: A Marker of Aggressiveness and Chemoresistance in Female Reproductive Cancers. J Oncol, 2010. 2010: p. 821717.

56. Iliopoulos, D., et al., Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells. Mol Cell, 2010. 39(5): p. 761-72.

57. Korpal, M., et al., Direct targeting of Sec23a by miR-200s influences cancer cell secretome and promotes metastatic colonization. Nat Med, 2011. 17(9): p. 1101-8.

58. Haraguchi, T., Y. Ozaki, and H. Iba, Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res, 2009. 37(6): p. e43.

59. Takeshita, F., et al., Systemic delivery of synthetic microRNA-16 inhibits the growth of metastatic prostate tumors via downregulation of multiple cell-cycle genes. Mol Ther, 2010. 18(1): p. 181-7.

表題目次1．要旨Summary2．発表論文リスト3．謝辞4．略語一覧5．研究の背景と目的6．実験方法7．実験結果8．考察9. 結語10. 参考 文献