熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title 切除不能進行再発大腸癌患者におけるTranscription-

Reverse Transcription Concerted Reaction法を用いた

血中循環腫瘍細胞検出の有用性

Author(s) 佐藤, 伸隆

Citation

Issue date 2011-03-25

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/25164

Right

1

学 位 論 文 Doctoral Thesis

切除不能進行再発大腸癌患者における Transcription–Reverse Transcription

Concerted Reaction 法を用いた血中循環腫瘍細胞検出の有用性

(The usefulness of Transcription–reverse transcription concerted reaction method

for detecting circulating tumor cells in patients with advanced and / or metastatic

colorectal cancer)

佐藤 伸隆

Nobutaka Sato

熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学

指導教員

馬場 秀夫 教授

熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学

2011 年 3 月

2

Doctoral Thesis

論文題名：

切除不能進行再発大腸癌患者における

Transcription–Reverse Transcription Concerted Reaction 法を用いた

血中循環腫瘍細胞検出の有用性

(The usefulness of Transcription–reverse transcription concerted reaction

method for detecting circulating tumor cells in patients with advanced and /

or metastatic colorectal cancer)

著者名： 佐藤 伸隆 Nobutaka Sato

指導教員名： 熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学

馬場 秀夫 教授

審査委員名：

消化器内科学 担当教授 佐々木 裕

産科婦人科学 担当教授 片渕 秀隆

泌尿器病態学 担当教授 江藤 正俊

法医学 担当教授 西谷 陽子

2011 年 3 月

3

目次

1. 要旨 4 2. 発表論文リスト 6 3. 謝辞 9 4. 略語一覧 10 5. 研究の背景と目的 12 5-1) 大腸癌の疫学 12 5-2) 大腸癌治療の進歩 13 5-3) 大腸癌化学療法の経済的現状 15 5-4) Conversion therapy 16 5-5) 新たなbiomarkerの必要性 18 5-6) Circulating Tumor Cells (CTCs) 19 5-7) CTCs検出におけるCellSearch systemの有用性 20 5-8) TRC法 （Transcription–Reverse Transcription Concerted Reaction method） 22 5-9) 本研究の目的 25 6. 検討方法 26 6-1) 患者 26 6-2) 検体の採取 28 6-3) 大腸癌細胞株培養と健常者全血への混和 28 6-4) RNAの抽出 29 6-5) TRC 法 29 6-6) CellSerach system 31 6-7) CTCs検出陽性の定義 31 6-8) 統計学的解析 32 7. 結果 33 7-1) 大腸癌細胞株DLD1を用いたCTCs検出の感度の検討 33 7-2) TRC法とCellSearch systemでのCTCs検出の実際 34 7-3) TRC法とCellSearch systemにおけるCTCs検出結果の比較 35 7-4) CTCs検出結果と予後 37 7-5) CTCs検出におけるTRC法とCell Search systemの比較 38 8. 考察 40 9. 結論 44 10. 参考文献 45

4

1. 要旨

【背景・目的】近年、さまざまな癌腫で血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor cells: CTCs）が予後や治療効果の予測因子となりうることが報告されるようになり、臨床応用が期待されている。近年、血中の腫瘍細胞を定量的に測定できる CellSearch system が開発され、これを用いた CTCs 検出の有用性が報告されており、米国では実臨床で用いられているものの、検査にかかる費用が高額であり、本邦では日常診療

へ普及していないのが現状である。Transcription-Reverse Transcription Concerted Method (TRC 法)は、標的 mRNA の増幅および検出を 1 本のチューブ内で行える簡便な mRNA 検出法であり、迅速かつ安価に結果を得ることができる。当教室では、TRC 法を用いて CEA-mRNA を標的とした微量癌細胞の検出法を確立し、これまでにその有用性を報告してきた。大腸癌診療における TRC 法を用いた CTCs 検出の有用性を明らかにし、臨床応用の可能性について検討することを目的とした。

【方法】１．各方法の検出感度：健常人全血に CEA 産生大腸癌細胞株 DLD1 を混和した稀釈系列を作製し、CellSearch system と TRC 法を用いて CTCs 検出感度を検討した。さらに、切除不能進行再発大腸癌における CTCs 検出：臨床検体における TRC 法と CellSearch system での CTCs 検出を比較するために、2008 年 11 月から 2009 年5 月の間に切除不能進行再発大腸癌患者から採取した全 42 検体を対象に比較検討した。２．化学療法前の CTCs 検出結果と予後との関連について、2008 年 6 月から2009 年 5 月までの間に化学療法を導入し、経過中に根治的手術を受けていない切除不能進行再発大腸癌患者 25 人を対象に Kaplan-Meier 法を用いた生存曲線をもとに解析した。

【結果】１．各方法の検出感度：CellSearch system を用いて 100～104 個の DLD1 細胞を混和した健常人血液 7.5ml 中からの癌細胞検出では、1 個の癌細胞検出が可能であった。TRC 法を用いた検出では、白血球 105 個中癌細胞 1 個の検出が可能であった。切除不能進行再発大腸癌患者全血 42 検体において、TRC 反応陽性は 27 検体であった。CellSearch system で CTCs≧1 の検出を CTC positive と定義した場合、CTC positive は 27 検体であった。CellSearch system についての過去の報告に倣い、CTCs ≧3 の検出を CTC positive と定義した場合、CTC positive は 18 検体であった。TRC 法と CellSearch system での CTC positive の結果は、有意に相関した(p

5

【結論】切除不能進行再発大腸癌患者における CEA-mRNA を標的とした TRC 法による CTCs 検出は、安価であり、CellSearch system による CTCs 検出と同様に予後を予測することができることから、臨床上有用な検査方法であり、今後、実臨床におい

て CellSearch system による CTCs 検出の代替となりうる可能性がある。

6

2. 発表論文リスト

① 関連論文

1. Nobutaka Sato, MD , Naoko Hayashi, MD, PhD, Yu Imamura, MD, PhD, Yohei Tanaka, MD, Koichi Kinoshita, MD, Jyunji Kurashige, MD, Seiya Saito, MD, Ryuichi Karashima, MD, Kotaro Hirashima, MD, Yohei Nagai, MD, Yuji Miyamoto, MD, PhD, Masaaki Iwatsuki, MD, PhD, Yoshifumi Baba, MD, PhD, Masayuki Watanabe, MD, PhD, FACS, and Hideo Baba, MD, PhD, FACS. Usefulness of Transcription-Reverse Transcription Concerted Reaction Method for Detecting Circulating Tumor Cells in Patients With Colorectal Cancer Ann Surg Oncol 2011 Jul 6. [Epub ahead of print]

②英文原著論文

1. Watanabe M, Nagai Y, Kinoshita K, Saito S, Kurashige J, Karashima R, Hirashima K, Sato N, Imamura Y, Hiyoshi Y, Baba Y, Iwagami S, Miyamoto Y, Iwatsuki M, Hayashi N, Baba H. Induction chemotherapy with docetaxel/cisplatin/5-fluorouracil for patients with node-positive esophageal cancer. Digestion. 2011;83(3):146-52. Epub 2011 Jan 21.

2. Imamura Y, Hayashi N, Sato N, Kinoshita K, Kurashige J, Saito S, Hirashima K, Karashima R, Hiyoshi Y, Nagai Y, Watanabe M, Baba H. Extensive lymphatic spread of cancer cells in patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma: Detection of CEA-mRNA in the three-field lymph nodes. J Surg Oncol. 2010 Oct 1;102(5):509-15.

3. Hirashima K, Baba Y, Watanabe M, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Hiyoshi Y, Nagai Y, Hayashi N, Iyama K, Baba H. Phosphorylated mTOR Expression is Associated with Poor Prognosis for Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Ann Surg Oncol. 2010 Sep;17(9):2486-93.

4. Imamura Y, Ishikawa S, Sato N, Karashima R, Hirashima K, Hiyoshi Y, Nagai Y, Koga Y, Hayashi N, Watanabe M, Yamada G, Baba H. Adenoviral oncolytic suicide gene therapy for a peritoneal dissemination model of gastric cancer in mice. Ann Surg Oncol. 2010 Feb;17(2):643-52

5. Suyama K, Hayashi N, Shigaki H, Sato N, Hirashima K, Nagai Y, Hiyoshi Y, Sakamoto Y, Yoshida N, Toyama E, Watanabe M, Baba H. Neuroendocrine tumor of the rectum. Am J Surg. 2009 Sep;198(3):e39-41.

6. Hiyoshi Y, Watanabe M, Hirashima K, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Nagai Y, Yoshida N, Toyama E, Hayasho N, Baba H. p12CDK2-AP1 is associated with

7

tumor progression and a poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma. Oncl Rep. 2009 Jul; 22(1):35-9

7. Watanabe M, Yoshida N, Karashima R, Sato N, Hirashima K, Imamura Y, Hiyoshi Y, Nagai Y, Iwagami S, Toyama E, Hayashi N, Baba H. Transcervicaｌ superior mediastinal lymph node dissection combined with transhiatal lower esophageal dissection before transthoracic esophagectomy: a safe approach for salvage esophagectomy. J Am coll Surg. 2009 Apr; 208(4):e7-9

8. Hiyoshi Y, Kamohara H, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Nagai Y, Yoshida N, Toyama E, Hayasho N, Watanabe M, Baba H. MicroRNA-21 regulates the proliferation and invasion in esophadeal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 2009 Mar 15; 15(6):1515-12

③和文論文

1. 佐藤伸隆、 林尚子、 今村裕、 辛島龍一、 平島浩太郎、 日吉幸晴、 長井洋平、 渡邊雅之、 馬場秀夫 . 消化器系腹部領域における Oncologic Emergency. 癌と化学療法 2008; 35(13): 2316-2320.

2. 田中洋平、 佐藤伸隆、 林尚子、 渡邊雅之、 馬場秀夫. 【大腸癌 最新の研究動向】 特論 大腸癌化学療法後肝切除の経済的妥当性について. 日本臨床2011; 69 増刊 3 大腸癌 : 639-643.

3. 平島浩太郎、 渡邊雅之、 斉藤誠哉、 木下浩一、 藏重淳二、 佐藤伸隆、 辛島龍一、 今村裕、 長井洋平、 岩槻政晃、 岩上志朗、 宮本祐士、 林尚

子、 別府透、 馬場秀夫. 【術前・術後に要注意 併存疾患の手術リスクと対策】 基礎疾患併存例の手術 慢性肝疾患. 外科 2010; 72(9): 935-939.

4. 馬場秀夫、 藏重淳二、 木下浩一、 齋藤誠哉、 辛島龍一、 佐藤伸隆、 平島浩太郎、 岩槻政晃、 林尚子、 渡邊雅之. 【食道癌に対する集学的治療 最近の動向】 切除可能食道癌に対する術前化学放射線療法. 消化器外科 2010; 33(8): 1297-1303.

5. 齋藤誠哉、 別府透、 林尚子、 佐藤伸隆、 辛島龍一、 増田稔郎、 小森宏之、 近本亮、 石河隆敏、 渡邊雅之、 高森啓史、 馬場秀夫. 【最新の大腸癌補助化学療法】 大腸癌肝転移切除成績の現状 切除不能肝転移に対するサルベージ手術. 大腸癌 Frontier 2010; 3(1): 52-57.

6. 木下浩一、 渡邊雅之、 藏重淳二、 齊藤誠哉、 辛島龍一、 佐藤伸隆、 今村裕、 長井洋平、 岩上志朗、 池田貯、 林尚子、 馬場秀夫. 【エキスパートが伝える 消化器癌手術の流れと手術助手の心得】 胃癌手術の流れと手術助手の心得 幽門側胃切除における助手の役割. 臨床外科 2010; 65(3): 348-352.

8

7. 辛島龍一、 別府透、 近本亮、 石河隆敏、 齋藤誠哉、 佐藤伸隆、 増田稔郎、 林尚子、 渡邊雅之、 馬場秀夫. 【大腸癌肝転移に対する治療】 集学的治療 術前化学療法併用肝切除. 外科 2010; 72(2): 148-152.

8. 工藤啓介、 渡邊雅之、 林尚子、 外山栄一郎、 吉田直矢、 岩上志朗、 長井洋平、 今村裕、 日吉幸晴、 平島浩太郎、 辛島龍一、佐藤伸隆、 馬場秀

夫 . 遠隔転移を伴う食道癌に対する治療法の検討 . 癌と化学療法 2009; 36(12): 2454-2458.

9. 渡邊雅之、 辛島龍一、 佐藤伸隆、 平島浩太郎、 日吉幸晴、 今村裕、 長井洋平、 馬場祥史、 岩上志朗、 吉田直矢、 外山栄一郎、 林尚子、 馬場

秀夫. 手術による反回神経麻痺 回避の工夫と起こった時の対策 頚部操作先行の食道癌手術における反回神経周囲リンパ節郭清. 日本気管食道科学会会報 2009; 60(2): 131-132.

10. 渡邊雅之、 佐藤伸隆、 辛島龍一、 平島浩太郎、 日吉幸晴、 今村裕、 長井洋平、 馬場祥史、 岩上志朗、 吉田直矢、 外山栄一郎、 林尚子、 馬場

秀夫. 【胃癌 大きく変わってきたスタンダード治療】胃癌の化学療法 補助化学療法. コンセンサス癌治療 2008; 7(4): 204－208.

11. 吉田直矢、 佐藤伸隆、 山本謙一郎、 田中真一郎、 大堂雅晴、 栗崎貴、 片渕茂、 芳賀克夫、 山下眞一、 池井聰. 集学的治療により 21 カ月間無増悪で経過中の脳転移、肩甲骨転移を有する胸部食道癌の１例. 日本消化器外科学会雑誌 2008; 41(11): 1910-1915.

12. 平島浩太郎、 林尚子、 佐藤伸隆、 辛島龍一、 今村裕、 日吉幸晴、 長井洋平、 外山栄一郎、 渡邊雅之、 馬場秀夫. 【大腸癌の化学療法】大腸がん化学療法の実際 ファーストライン どう選び、どう行うか ＦＯＬFOX. 消化器の臨床 2008; 11(5): 491-498.

13. 吉田直矢、 佐藤伸隆、 山本謙一郎、 前田 健晴、 田中真一郎、 大堂雅晴、 栗崎貴、 片渕茂、 芳賀克夫、 山下眞一、 池井聰. 腸重積の解除により肛門機能温存手術が可能となった進行直腸癌の 1 例. 日本消化器外科学会雑誌 2008; 41(6): 695-699.

14. 広田昌彦、 高森啓史、 田中洋、 生田義明、 佐藤伸隆、 田中洋平、 馬場秀夫. 【合併疾患別にみる周術期管理 Q＆A 研修医からの質問 362】消化器系の合併疾患 急性膵炎（重症膵炎を含む）. 救急・集中治療 2008. 20(3-4): 381－386.

9

3. 謝辞

本研究の遂行ならびに本論文の作成にあたり、終始ご指導、ご鞭撻を賜りま

した 熊本大学大学院医学薬学研究部 消化器外科学 馬場 秀夫教授に謹んで厚く

御礼申し上げます。

熊本大学大学院医学薬学研究部 消化器外科学 林 尚子先生には、本研

究の研究デザインから実験計画、論文作成にいたるまで一貫して御指導いただき深

く感謝いたします。また、実験手技を一から御指導いただき、研究を軌道に乗せるた

めに御尽力いただいた 熊本大学大学院医学薬学研究部 消化器外科学 今村 裕

先生に心より御礼申し上げます。さらに、本研究に用いた検体採取に当たって御協力

いただいた 熊本大学医学部付属病院外科外来 看護スタッフ一同様には、厚く御礼

申し上げます。

最後に、様々な面でご協力とご指導を頂きました齋藤 誠哉先生、藏重 淳

二先生、田中 洋平先生、辛島 龍一先生、宮本 裕二先生、渡邊 雅之先生をはじ

め消化器外科学教室員の皆様に心より感謝を述べて、私の謝辞と代えさせていただ

きます。

2011 年 12 月

10

4. 略語一覧

APC, allophycocyanin

CD, cluster of differentiation

CEA, carcinoembryonic antigen

CK, cytokeratin

CT, coputed tomography

CTCs, circulating tumor cells

DAPI, 4’,6-diamino-2-phenylindole

DNA, deoxyribonucleic acid

EMR, endoscopic mucosal resection

EpCAM, epithelial cell adhesion molecule

ESD, endoscopic submucosal dissection

FACS, fluorescence activated cell sorter

INAF, intercalation activating fluorescence plobe

LV, leucovorin

MRI, magnetic resonance imaging

mRNA, messenger ribonucleic acid

MST, median survival time

11

PD, progression disease

PE, phycoerythrin

PET, positron emission tomography

PR, partial response

QALY, quality adjusted life year

SD, stable disease

TME, total mesorectal excision

TRC, transcriptionbreverse transcription concerted reaction

TSME, tumor-specific mesorectal excision

5-FU, 5-fluorouracil

12

5. 研究の背景と目的

5-1) 大腸癌の疫学

大腸癌は、世界的に罹患率・死亡率の高いがんの１つとして知られている。

GLOBOCAN 2008 によると、大腸癌罹患者数は約 120 万人と推計され、すべてのが

ん罹患者の約 10%を占めるとされる。男性では、罹患数、死亡数共に、肺癌、前立腺

癌に次いで 3 位であり、女性では、乳癌に次いで 2 位である。全体でも、罹患数、死亡

数共に、肺癌、乳癌、に次いで 3 位となっている(図 1)[1]。

図 1 世界のがん罹患数と死亡数: GLOBOCAN 2008

13

一方、本邦でも大腸癌は罹患数の多い癌の１つである。財団法人がん研究

振興財団の「がんの統計 ‘10」によると大腸癌は、男女、全体の区別なく 2 番目に罹

患の多い癌とされている[2]。死亡率においても大腸癌は上位を占めているが、年々、

その死亡率が増加しており、厚生労働省平成 22 年人口動態統計によると、男性は肺

癌、胃癌に次ぐ 3 位、女性では 1 位であった(図 2)[3]。

図 2. 主要な癌の総死亡者数の年次的推移（H22 厚生労働省人口統計）

5-2) 大腸癌治療の進歩

このように大腸癌は、全世界的に罹患数が多く、日本でもその数が増え続け

ているが、治療成績を向上させるために、さまざまな工夫がなされてきた。大腸内視

鏡機器の改良に伴い内視鏡診断が向上し、しかも、内視鏡下治療手技(EMRやEST)

の進歩によりリンパ節転移のない早期大腸癌では、手術をしなくても内視鏡的に局所

14

切除が可能になった。また、CT、PET-CT、MRI などの画像診断機器の改良により、

詳細な病期診断や再発の早期発見が可能となった。手術技術（リンパ節郭清の確立

や直腸癌における TME や TSME、側方郭清の導入など）の向上や手術におけるさ

まざまな device の開発により、出血量の減少、手術時間の短縮が可能となり、より安

全確実な手術が可能となったことなども治療成績の向上に寄与している。大腸癌研

究会の大腸全国登録の 1974-1999 年の 26 年間のデータを解析した報告がある[4]。

研究会会員施設の症例という限定されたデータに基づくものではあるが、早い Stage

の割合の増加、切除率・治癒切除率の向上が示され、5 年生存率も 55.6％から

68.2％までに改善した。

しかし、大腸癌診療におけるもっとも目覚ましい進歩は、2000 年代に入って

からの化学療法の分野である。近年の新規化学療法薬の開発、臨床導入に伴い、切

除不能進行再発大腸癌患者の予後は飛躍的に改善した。かつて切除不能進行再発

大腸癌に対する有効な化学療法が存在しなかった時代には、生存期間中央値(MST)

は 4～6 ヵ月に過ぎなかったが[5]、1980 年代に入り 5-FU/LV 療法が導入され、より有

効な投与方法が検討され、MST は 10～14 か月まで延長した[6-10]。さらに 1990 年代

に irinotecan(CPT-11)が、2000 年代に oxaliplatin(L-OHP)がそれぞれ臨床に導入され

ると、5-FU/LV に CPT-11 もしくは L-OHP のどちらかの薬物を組み合わせたレジメン

（それぞれ FOLFIRI、FOLFOX）を行うことにより、20～21 ヵ月という著明な MST の延

15

長が達成されるようになった[11-18]。さらに、bevacizumab, cetuximab, panitumumab

といった分子標的治療薬を加えることで、その MST は 2 年に迫ろうとしている(図

3)[18-20]。

図 3 切除不能進行再発大腸癌に対する主なレジメンと全生存期間中央値(月)

5-3) 大腸癌化学療法の経済的現状

このように、切除不能進行再発大腸癌患者に対する化学療法は、ここ 10 年

で劇的な延命効果を示すようになった。一方で、新薬が高額であることと、生存期間

が延長したことに伴い、高額な治療費がかかり、患者および国家の経済的負担が増

大している。代表的なレジメンの１コースの薬剤費は、身長 160cm、体重 50kg、体表

16

面積 1.5 ㎡とした場合、FOLFOX 療法は約 18 万円（約 36 万円/月）、FOLFIRI 療法

でも約 8 万円である（約 16 万円/月）。さらに、高額な薬剤である分子標的薬を併用し

た場合、一か月の薬剤費は 50 万を超え、1 年間にわたり治療を継続した場合、治療

費の総額は 500 万円を超えることになる。

5-4) Conversion therapy

近年、新規抗癌剤の優れた腫瘍縮小効果により、切除不能であった病巣が

切除可能となり根治切除となる症例も増加した。とくに、大腸癌に多い転移形式であ

る肝転移に対しては、当初は切除不能と判断した大腸癌肝転移症例に対し化学療法

を施行し、切除可能と判断できるまでの腫瘍縮小が得られれば根治的手術を行う

Conversion therapy の概念(図 4)[21]が注目されている。切除不能大腸癌肝転移にお

いて、全身化学療法後に肝切除可能となるのは肝転移単独症例の 11～37%[22-28]

とされている。切除可能となった症例では、無再発生存率が 5 年で 19％、10 年で

15％、全生存率も 5 年で 33％、10 年で 27％と報告されている[29]。大腸癌 StageⅣの

5 年生存率は 13.2％とされており[30]、Conversion therapy の臨床的意義は大きい。

17

図 4 Conversion Therapy の概念 ([21]より引用改変)

当教室で、大腸癌転移性肝転移症例における Conversion therapy の医療経

済性について検討した[31]。73 例の大腸癌肝転移症例において、化学療法導入後に

肝切除可能となった 28 例の生存期間中央値(MST)は 42 か月を超えるのに対し、切

除不能であった 45 例の MST は 21 か月であった。治療費総額としては、有意に肝切

除可能群が高額であったが、この増加分を増分費用効果比の概念に沿って検討した。

増分効果を、質調整生存年(QALY)の代わりに MST の増加分で表すと、MST 1 年の

延長のために、約 130 万円がかかることになる。イギリスやアメリカでの増分費用効

果比の限界値とされる約 500 万円に比べるとはるかに安価であり、医療経済的にも

許容される数字であった。

18

5-5) 新たな biomarker の必要性

Conversion therapy においては、切除のタイミングが重要である。一般臨床で

は、画像診断や腫瘍マーカーを用いて化学療法の治療効果と切除の可能性が判断

される。Conversion therapy が可能となった切除不能大腸癌肝転移 131 例の検討[32]

では、奏効度別の 5 年全生存率は、PR 37%、SD 30%、PD 8%と PD の予後は不良で

あった。しかし、PR であっても 5 年生存率は 37％である。より効果的な根治的切除を

行うためには、より厳密に治療効果判定と病勢の評価を行い最適な切除時期の判断

を行う必要がある。

一方、根治的切除に至らない症例においても、同一レジメンでは薬剤耐性が

出現し増悪がみられるようになる。定期的な評価をもとに病勢を把握し、必要に応じ

て治療レジメンの変更がなされる。しかし、腫瘍マーカーと画像診断結果との乖離が

あり、判断に悩むうちに効果的なレジメン変更の時期を逸してしまうことも経験する。

切除不能進行再発大腸癌患者において、より効果的な化学療法を行うために、腫瘍

の活動性や薬剤耐性の徴候の出現など、病勢をよりリアルタイムに鋭敏に評価し得

る新たな biomarker の登場が望まれる。

19

5-6) Circulating Tumor Cells (CTCs)

分子生物学の進歩により、従来の診断法では検出し得なかった微量癌細胞

の診断が可能になったことから、当教室では、以前より微量癌細胞検出の臨床的意

義について検討してきた。これまでに、癌特異的遺伝子変異や、mRNA を指標とした

PCR 法による微量癌細胞の検出法を確立し、担癌患者における血液やリンパ節中の

微量癌細胞の検出を行ってきた。その結果、早期癌患者でも血液やリンパ節中に微

量癌細胞が検出されることがあり、このような症例では病期に関係なく予後が不良で

あることを報告してきた[33, 34]。

末梢循環血中に存在する腫瘍細胞は、Circulating Tumor Cell（CTCs）と呼ば

れ、古くから、この CTCs の存在が腫瘍の病勢や臨床上の転帰、治療に対する反応

などに関連することが報告されていた[35-38]。近年の分子生物学的な解析や臨床研

究により、腫瘍形成の初期より腫瘍の周囲間質や血管内への浸潤が生じ、末梢血液

中に CTCs が存在していることが示されている。

CTCs 検出のために、免疫細胞診を用いた方法[39, 40]や FACS による方法

[41, 42]、 PCR を基にした方法[43-45]、免疫磁気を用いた方法[46, 47]など多彩な方

法が用いられてきた。癌患者のCTCsの測定が臨床上重要な予後予測因子の一つで

あり有用な marker である可能性は以前から示唆されてきたが、その臨床的意義の評

価は不確定なものであった。

20

5-7) CTCs 検出における CellSearch system の有用性

CTCs の安定した測定が可能な機器として CellSearch system (ベリデックス

社：米国)が開発された。CellSearch system は、免疫磁性選別法を用いた CTCs 検出

機器である(図 5)[48]。腫瘍細胞の細胞膜上に発現する EpCAM を標的とし、抗

EpCAM 抗体磁気ビーズで癌細胞が標識化される。標識化された癌細胞はマグネット

を用いて免疫磁気的に捕捉され、濃縮される。次いで、腫瘍細胞は、細胞質内の細

胞骨格であるフィコエリスリン(PE)標識抗サイトケラチンマウスモノクローナル抗体

（ CK-PE ） で 蛍 光 染 色 し 、 さ ら に 細 胞 核 に 存 在 す る DNA は

DAPI(4’,6-diamino-2-phenylindole)で蛍光染色される。また、白血球はアロフィコシア

ニン(APC)標識抗 CD45 マウスモノクローナル抗体(CD45-APC)で染色される。これら

の染色は同時に行われ、蛍光染色後に細胞固定され、細胞の形態は維持される。癌

細胞のサイトケラチンは PE で、白血球は表面高原の CD45 を APC で、癌細胞と白血

球内の DNA を DAPI で蛍光染色する。最後に、蛍光顕微鏡を通してモニター上に映

し出された細胞を観察し、癌細胞と白血球を判別し癌細胞が計測される。

21

図 5 CellSearch system

転移性乳癌患者における前向き試験の結果[49]、化学療法の治療効果判定、

予後予測に有用であるとして 2004 年 1 月には FDA（Food and Drug Administration:

米国食品医薬品局）の承認を受け米国の臨床現場に導入された。現在は、転移性大

腸癌(図 6)[50]、転移性前立腺癌についても承認された。このように、CellSearch

system は、さまざまな癌種において予後予測に有用であることが示されている

[51-56]。

22

図 6 CellSearch system を用いた転移性大腸癌症例における予後予測[50]

しかし、本邦においては CellSearch system は広く普及しているとはいえない。

市販されている検査は結果が出るまでに時間がかかり、1回当たりの価格も高額であ

るためである。

5-8) TRC 法（Transcription–Reverse Transcription Concerted Reaction method）

DNA を標的としたリアルタイム PCR は、機器の自動化により標的核酸の増

幅反応や増幅産物の検出という多段階に渡る操作の煩雑性は克服されているもの

の，原理的に温度サイクルという物理量の変化を伴い、結果を得るまでの所要時間

が長く臨床検査の現場で求められる迅速化には限界がある。TRC 法は、遺伝子検

査の迅速化を追及し、そのためには一定温度での核酸増幅法が有利であるとの認識

から開発された[57]。

23

TRC 法は，43℃の一定温度下で逆転写反応と転写反応のサイクルを形成

し，指数関数的な RNA の複写増幅が速やかに達成され、標的核酸と相補結合を形

成することで顕著な蛍光増感を与える INAF プローブを組合せ、RNA 増幅のリアルタ

イムにモニターすることが可能な機器である。信頼できる安定した結果を短期間に容

易に、比較的低価格で得ることができる優れた機器である(図 7)[58, 59]。

切断工程では、標的 RNA の特定の位置にシザープローブが結合し、

RNaseH 活性によって切断される。このシザープローブは、3'末端をアミノ酸で修飾す

ることで伸長反応を防止するようになっている。5'末端がトリミングされた RNA は増幅

工程に入り、2 種類のプライマー（アンチセンスプライマーとプロモータープライマー）

および逆転写酵素の働きにより T7 プロモーター配列を有する二重鎖 DNA が合成さ

れる。さらに T7 ポリメレースの働きによって RNA が合成され、この RNA から再度 T7

プロモーター配列を有する二重鎖 DNA が合成されるという増幅サイクルとなる。検出

工程では、INAF プローブと呼ばれる発蛍光プローブが増幅した RNA と特異的に結

合する。INAF プローブは、標的核酸に相補的な配列を持つＤＮＡ鎖に、リンカーを介

してインターカレーター性蛍光色素が結合している。INAF プローブは、標的ＲＮＡと二

重鎖を形成し蛍光色素が二重鎖に入り込むことにより蛍光増感する。

24

図 7 TRC 法

TRC 法は、当初、腸炎ビブリオ菌の毒素タンパクおよび結核菌を標的とした

試薬、実臨床での迅速診断を想定して市販された。後に CEA-mRNA を標的とした試

薬も開発された[57]。TRC 法を用いた、CEA-mRNA を標的とした微量癌細胞検出に

ついて、これまでにいくつかの報告がなされている(表 1)[60-64]。当教室においても、

食道癌における微小リンパ節転移の検出にこの方法を用い、報告した[60-64]。

25

表 1 CEA-mRNA を標的とした TRC 法による微量癌細胞検出

5-9) 本研究の目的

本研究にあたって、切除不能進行再発大腸癌において、血中循環腫瘍細胞

（Circulating Tumor Cells: CTCs）を測定することが、病勢評価において有用であると

いう仮説をたてた。実際に、米国では CTCs の測定機器である CellSearch system が、

転移性大腸患者の治療効果判定と予後予測が可能な機器として FDA に認可され、

実臨床で使用可能となった。しかし、本邦においては一般化しておらず、１回の測定

当たりのコストも割高である。一方で、TRC 法では、安定し信頼できる結果を短期間

に容易に、低価格で得ることができる。 TRC 法を用い、大腸癌細胞由来の

CEA-mRNA を測定することは、CellSearch system で CTCs を検出することの代替とな

り得ると考えられる。

今回、切除不能進行再発大腸癌患者における、末梢血中の CTCs 検出能に

ついて TRC 法と CellSearch system を比較し、実臨床における CTCs 検出法としての

TRC 法の有用性を検討することを、本研究の目的とした。

26

6. 検討方法

6-1) 患者

TRC 法と CellSearch system の CTCs 検出感度を比較するために、2008 年

11 月から 2009 年 5 月の間で切除不能進行再発大腸癌患者から得た全血 42 検体

を対象に検討を行った。

また、化学療法前の CTCs 検出結果が予後と相関するかどうか検討するた

めに、2008 年 6 月から 2009 年 5 月までの間に first line もしくは 2nd line の化学療法

を導入し、経過中に根治的手術を受けていない切除不能進行再発大腸癌患者 25 症

例を対象に検討を行った。25 症例の臨床病理学的背景を表 2 に示す。

27

表 2 25 症例の臨床病理学的背景

本検討については、熊本大学医学部付属病院の施設内倫理委員会の承認

をうけ、すべての患者から書面での同意を得た上で行った。

28

6-2) 検体の採取

全血の採取は、CTCs 検出の感度を比較するために 1 回の採血で 2 種類の

チ ュ ー ブ を 用 い て サ ン プ ル を 採 取 し た 。 CellSearch system 用 に は 、 CellSave

Preservative Tube (Veridex, LLC)に 7.5ml の全血を採取し、室温（ 20 ～ 25℃ ）で

保存した。TRC 法用には、EDTA 含有スピッツに 2.0ml 採取し、4℃で保存した(図

8)。

図 8 サンプル採取

6-3) 大腸癌細胞株培養と健常者全血への混和

CTCs 検出の感度と正確性について、健常人の全血と CEA 産生ヒト結腸癌

細胞株である DLD1 を用いて検討した。DLD1 の細胞培養には、培養液として

RPMI-1640 ( Invitrogen, California, USA )に 10%Fetal Bovine Serum ( Invitrogen )を

29

添加したものを用い、37℃, 5%二酸化炭素濃度の条件下で培養を行い、3 日ごとの

継代を行った。トリプシンで細胞間接着を抑えた後に、細胞数を 4 回測定し平均化し、

培養液で DLD1 細胞を希釈することで設定した細胞数(100, 101, 102, 103, 104 個)に調

節し、DLD1 細胞をそれぞれ 7.5ml(CellSerach system 用)と 0.5ml(TRC 法用)の健常

人全血と混和し、各方法で CTCs 検出を行った。

6-4) RNA の抽出

TRC 法による CTCs 検出用の全血は、EDTA 含有スピッツに採取後、4℃で

保存し、採取から 36 時間以内に RNA 抽出を行った。全血からの RNA 抽出には、

QIAamp RNA blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いた。 RNA は、2ml の

全血から 50μl の溶解液に抽出し、TRC 法での 1 回の反応に 5μl の溶解液を使用し

た。

6-5) TRC 法

TRC 法用のサンプルは EDTA で抗凝固を施した採血管に 2ml 採取し、4℃

で保存した。サンプルは直ちにライセートにまで処理し、RNA を抽出した。 今回は、

TRCR test CEA-m2 (Tosoh, Tokyo, Japan)を用いて、CEA-mRNA を標的とした計測

を行った。

30

TRC 反応は、RNA の切断工程、RNA の増幅工程、増幅 RNA の検出工程と

いう 3 つの工程から構成される。このすべての反応を、1本のチューブ内で連続して行

う。今回使用した CEAmRNA 検出用のプライマーとプローブの詳細を表 3 に示す。

表 3 プライマーとプローブ

測定の手順は、以下のとおりである。①基質試薬とプライマー試薬の等量混

合液（試薬ミックス）を 20μl ずつ分注する。②分注した試薬ミックスに RNA 抽出液を

1 検体あたり 5μl 入れ、混和後ただちに TRC モニター本体上のインキュベータに挿

入し 43℃で 5 分間予備加温する。③あらかじめ 43℃に加温しておいた酵素試薬 5μl

31

を追加することで反応が開始する。④1 チューブ内で、43℃と一定の温度のもと反応

は続く。約 20 分間で 43 回の測定を行う。

TRC 法の判定は、43 サイクルの測定の中で初回から３回目までの蛍光強

度値の平均よりも 1.2 倍高い蛍光強度値を認めたものを TRC 反応陽性と定義した。

6-6) CellCerach system

CellSearch system を用いた CTCs 検出は、外部の研究所(武田薬品工業株式

会社, つくばリサーチセンター、筑波)で行われた。

CellSave Preservative Tube に採取された 7.5ml の血液は、常温で保存し、採

取から 72 時間以内に CellSearch system を用いて CTCs を測定した。

6-7) CTCs 検出陽性の定義

TRC 法による CTCs 検出において、TRC 反応陽性を CTCs 検陽性(CTC

positive)と定義した。一方、CellSearch system を用いた検出においては、CTC positive

を 2 通りに定義し検討した。①単純に、CellSearch system で cancer cell の 1 個以上の

検出を CTC positive と定義した場合 と ②Cohen らの検討[50]で報告された、

CellSearch system で cancer cell 3 個以上の癌細胞を検出した際に CTC positive と定

義した場合 の２通りである。

32

6-8) 統計学的解析

統計学的解析は Stat View ( SAS, Washington, USA )を用いて行った。

2 群間の統計学的検定には、chi square test を用いて解析を行い、生存曲線

は Kaplan-Meier method を用いて解析した。p < 0.05 の場合を統計学的に有意差があ

ると判定した。

33

7. 結果

7-1) 大腸癌細胞株 DLD1 を用いた CTCs 検出の感度の検討

CellSearch system の検出能を検証するために、ヒト大腸癌細胞株 DLD1 細

胞を健常人から採血した全血 7.5ml に混和した稀釈系列（100, 101, 102, 103, 104 個

DLD1 細胞 / 7.5ml 健常人全血）を作製し、CellSearch system を用いて癌細胞の検出

を行った。DLD1 細胞の想定個数と実際に測定できた個数には強い相関関係を認め

た(R2=1.00, p

34

TRC 法を用いた CTCs 検出の感度は、CellSerach system の検出能検討と同

様に、DLD1細胞を健常人の全血0.5ml（白血球1x106個を含む）と混和し、TEで各々

計 2ml とした稀釈系列（0, 100, 101, 102, 103, 104 個 DLD1 細胞 / 1x106 個白血球）を

作製し、検討した。CEA-mRNA 標的とした癌細胞は、101 個の DLD1 細胞の検出が

可能であった（図 10）。血液 0.5ml 中に 1x106 個の白血球が存在すること、最終的にこ

の稀釈系の 1/10 量の RNA を解析に使用したことを考慮すると、TRC 法により 1x105

個の白血球中 1 個の癌細胞が検出可能であったことになる。

図 10 TRC 法を用いた癌細胞検出の感度

7-2) TRC 法と CellSearch system での CTCs 検出の実際

35

TRC 法で TRC positive (=CTC positive)となったのは 42 検体中 27 検体であ

った。CellSearch system を用いた CTCs 検出でも、同じく 27 検体で CTCs が検出され

(range 1- 125 個)、42 検体での癌細胞の平均検出個数は 9.0±23.4 個であった。

CellSrarch system で癌細胞が検出されなかった検体では、TRC 法で陽性となる検体

はなかった(図 11)。

図 11 TRC 法と CellSearch system を用いた CTCs 検出結果

7-3) TRC 法と CellSearch system における CTCs 検出結果の比較

36

患者血液からの、TRC 法と CellSearch system での CTCs 検出結果の関連に

ついて解析した。

CellSearch system で癌細胞が１個以上検出されたとき CTC positive とした場

合、CTC positive となったのは 27 検体であった。TRC 法で CTC positive となった症

例は、全例が CellSearch system でも CTC positive であった。

転移性大腸癌患者における CellSearch system を用いた CTC 検出の検討で

は、CTC 3 個以上の検出と 3 個未満の検出の 2 群に分けた場合、CTC 3 個以上の

群が有意に予後不良であることが報告されている[50, 65, 66]。本研究において、CTC

3 個以上が検出した場合を CTC positive とした場合、CTC positive となったのは 18 検

体であり、TRC 法の結果と有意（p

37

7-4) CTC 検出結果と予後

化学療法の経過中に経過中に根治的手術を受けていない切除不能進行再

発大腸癌患者 25 例を対象として、化学療法導入前の CTCs 検出結果が予後と相関

するかどうかについて、全生存の生存曲線を描き検討した(図 12)。

TRC 法の結果が 図 12-a である。化学療法導入前に CTC positive(TRC 反

応陽性)であったのは 9 名で、有意に予後不良であった（p=0.0317）。

CellSeaerch system を用いた検討を図 12-b,c に示す。1 個以上の CTCs が検

出されたものを CTC positive とし検討したものが図 12-b であり、3 個以上の CTCs が

検出されたものを CTC positive とし検討したものが図 12-c である。Cohen らの報告

[50]に従い、3 個以上の CTCs の検出を CTC positive とした場合、CTC positive と診

断されたのは 14 名であり、予後は有意に不良であった（p=0.0494）。

38

図 12 CTC 検出結果と予後

a) CTC positive:TRC 反応陽性, b)CTC positive:CTCs≧1, c)CTC positive: CTCs≧3

7-5) CTCs 検出における TRC 法と Cell Search system の比較

CTCs 検出における TRC 法と CellSearch system の臨床使用上の比較（判定

方法、判定までの時間、1 検体当たりのコストを表 5 に表す。

判定方法では、CellSearch system は最終的に人の目を通して癌細胞の存在

を判定するのに対して、TRC 法は、癌細胞由来の CEA-mRNA の存在を機械で判定

する。TRC 法を用いて実験室で CTCs 検出を行った場合、１検体あたり約 3000 円で

あったのに対して、CellSearch system は、検査会社に測定を依頼する際、１検体あた

39

り約 80000 円がかかる。判定までの時間は、TRC 法は、採血から RNA 抽出を行い、

TRC method を用いた判定まで、90 分以内で終了することができる。一方、CellSearch

system では、試薬の反応に時間を要するので、判定までに数時間を要する。

表 5 CTCs 検出における TRC 法と Cell Search system の比較

40

9.考察

CellSerach system で検出される CTCs が、転移性大腸癌の予後予測や治療

効果判定の新たな biomarker として期待されている。CellSearch system を用いた

CTCs検出は、簡便で、再現性のある結果を得ることが可能であり、病勢とも相関する

と報告されている[66]。また、CellSerach system による CTCs 検出結果に基づいた予

後予測や治療効果判定における有用性が報告されており[50, 67]、化学療法中の転

移性大腸癌患者において、病勢コントロールを評価する上で CellSearch による CTCs

の判定は有用であると評価され、米国では FDA で認可されている。しかし、本邦にお

いて CellSearch system による CTCs 検出は、保険収載されておらず、１つの検体を分

析するのに約 80,000 円と高額な費用が掛かり、結果が報告されるまで数日を要する

ため、日常診療への導入は現実的ではないと考えられる。

CellSearch system に代わる CTCs 検出方法として注目した TRC 法は、従来

の PCR 法を用いたものより迅速に安定した結果が安価に得られる遺伝子診断法であ

る。胃癌や大腸癌において TRC 法による腹腔内洗浄水中の癌細胞由来の

CEA-mRNA を鋭敏に検出することができたことから、TRC 法は微量な癌細胞の検

出に優れていることが示された[60, 61]。さらに、Oohashi らは、TRC 法を用いることで

迅速に結果を得ることができることから、TRC 法は、胃癌手術における腹腔内微量

癌細胞検出の術中迅速診断に適していると報告した[63]。

41

ところで、TRC 法は特定の mRNA の発現を検出する方法であり、CellSearch

system のように直接 CTCs を検出する方法ではない。 TRC 法では、CTCs に由来す

る CEA-mRNA 以外の細胞、つまり、血球や上皮細胞に由来する mRNA を検出する

可能性がある。

本研究では、CEA-mRNAを大腸癌の標的として選択した。CEA-mRNAを標

的としたCTCs検出については、術後のfollow upにおけるmembrane array methodを用

いたCTCs検出の有用性についての報告[68]があるが、この報告の中で、血清CEA

値が正常である症例であってもその80%にCEA-mRNAが検出され、CEA-mRNA検

出と予後は相関することが述べられている。また、転移性大腸癌患者において

CellSearch systemを用いCTCsの検出を行ったところ、血清CEA値が高値であっても

CTCsが検出されない症例では予後が良好であったことが、本邦から報告されている

[63]。血清CEA値が必ずしも病勢を正確に反映しないこともあり[69]、CEA-mRNAを

標的としたCTCs検出は妥当であると考える。

本研究で、TRC 法による CTCs 検出の感度が、CellSearch system による

CTCs 検出感度と同等であることを示した。 実際、切除不能進行再発大腸癌患者の

血液を用い、CTCs を TRC 法と CellSearch system の 2 つの方法で検出し、比較した。

その結果、CellSearch system で CTCs が検出された症例全てにおいて、TRC 法でも

CTC positive となり、また、いずれの方法においても CTCs が検出された症例では予

42

後が悪いことが示された。転移性大腸癌患者において、CellSearch system で CTCs を

測定することを FDA が承認するきっかけとなった報告[50]では、検出された癌細胞数

を 3 個未満（CTCs

43

TRC 法を実際に臨床応用するにはまだ検討すべき課題はあるものの、切除

不能進行再発大腸癌患者において CEA-mRNA を標的とした TRC 法による CTCs 検

出は、安価であり、CellSearch system による CTC 検出と同様に予後を予測することが

できることから、臨床上有用な検査方法であると考えられる。TRC 法の実臨床への導

入を視野に入れた今後の検討を期待したい。

44

結論

切除不能進行再発大腸癌患者における CEA-mRNA を標的とした TRC 法

による CTCs 検出は、安価であり、CellSearch system による CTCs 検出と同様に予後

を予測することができることから、臨床上有用な検査方法であり、今後、実臨床にお

いて CellSearch system による CTCs 検出の代替となりうると考えられる。

45

9. 参考文献

1. GLOBOCAN 2008: Cancer incidence and mortality worldwide. IARC Cancer Base [http://globocan.iarc.fr]. 2. が ん の 統 計 '10. 国 立 が ん 研 究 セ ン タ ー が ん 対 策 情 報 セ ン タ ー [http://ganjoho.jp/public/statistics/backnumber/2010_jp.html]. 3. 厚 生 労 働 省 平 成 22 年 人 口 動 態 統 計 . [http://ganjoho.jp/public/statistics/backnumber/2010_jp.html]. 4. 小澤平太, 固武健二郎. 【わが国の大腸癌、さまざまな統計】 わが国の大腸癌 最新の基本統計 大腸癌全国登録 1974～1999 年症例のデータから. 大腸癌Frontier 3: 293-297. 5. Venook A. Critical evaluation of current treatments in metastatic colorectal cancer. Oncologist 2005; 10: 250-261. 6. Poon MA, O'Connell MJ, Wieand HS et al. Biochemical modulation of fluorouracil with leucovorin: confirmatory evidence of improved therapeutic efficacy in advanced colorectal cancer. J Clin Oncol 1991; 9: 1967-1972. 7. Buroker TR, O'Connell MJ, Wieand HS et al. Randomized comparison of two schedules of fluorouracil and leucovorin in the treatment of advanced colorectal cancer. J Clin Oncol 1994; 12: 14-20. 8. Kohne CH, Wils J, Lorenz M et al. Randomized phase III study of high-dose fluorouracil given as a weekly 24-hour infusion with or without leucovorin versus bolus fluorouracil plus leucovorin in advanced colorectal cancer: European organization of Research and Treatment of Cancer Gastrointestinal Group Study 40952. J Clin Oncol 2003; 21: 3721-3728. 9. de Gramont A, Bosset JF, Milan C et al. Randomized trial comparing monthly low-dose leucovorin and fluorouracil bolus with bimonthly high-dose leucovorin and fluorouracil bolus plus continuous infusion for advanced colorectal cancer: a French intergroup study. J Clin Oncol 1997; 15: 808-815. 10. Louvet C, de Gramont A, Tournigand C et al. Correlation between progression free survival and response rate in patients with metastatic colorectal carcinoma. Cancer 2001; 91: 2033-2038. 11. Grothey A, Sargent D, Goldberg RM, Schmoll HJ. Survival of patients with advanced colorectal cancer improves with the availability of fluorouracil-leucovorin, irinotecan, and oxaliplatin in the course of treatment. J Clin Oncol 2004; 22: 1209-1214.

46

12. de Gramont A, Figer A, Seymour M et al. Leucovorin and fluorouracil with or without oxaliplatin as first-line treatment in advanced colorectal cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 2938-2947. 13. Goldberg RM, Sargent DJ, Morton RF et al. A randomized controlled trial of fluorouracil plus leucovorin, irinotecan, and oxaliplatin combinations in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2004; 22: 23-30. 14. Saltz LB, Cox JV, Blanke C et al. Irinotecan plus fluorouracil and leucovorin for metastatic colorectal cancer. Irinotecan Study Group. N Engl J Med 2000; 343: 905-914. 15. Douillard JY, Cunningham D, Roth AD et al. Irinotecan combined with fluorouracil compared with fluorouracil alone as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: a multicentre randomised trial. Lancet 2000; 355: 1041-1047. 16. Tournigand C, Andre T, Achille E et al. FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study. J Clin Oncol 2004; 22: 229-237. 17. Grothey A, Sargent D. Overall survival of patients with advanced colorectal cancer correlates with availability of fluorouracil, irinotecan, and oxaliplatin regardless of whether doublet or single-agent therapy is used first line. J Clin Oncol 2005; 23: 9441-9442. 18. Saltz LB, Clarke S, Diaz-Rubio E et al. Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study. J Clin Oncol 2008; 26: 2013-2019. 19. Van Cutsem E, Kohne CH, Hitre E et al. Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2009; 360: 1408-1417. 20. Douillard JY, Siena S, Cassidy J et al. Randomized, phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin (FOLFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer: the PRIME study. J Clin Oncol 2010; 28: 4697-4705. 21. Nordlinger B, Van Cutsem E, Rougier P et al. Does chemotherapy prior to liver resection increase the potential for cure in patients with

47

metastatic colorectal cancer? A report from the European Colorectal Metastases Treatment Group. Eur J Cancer 2007; 43: 2037-2045. 22. Alberts SR, Horvath WL, Sternfeld WC et al. Oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin for patients with unresectable liver-only metastases from colorectal cancer: a North Central Cancer Treatment Group phase II study. J Clin Oncol 2005; 23: 9243-9249. 23. Falcone A, Ricci S, Brunetti I et al. Phase III trial of infusional fluorouracil, leucovorin, oxaliplatin, and irinotecan (FOLFOXIRI) compared with infusional fluorouracil, leucovorin, and irinotecan (FOLFIRI) as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: the Gruppo Oncologico Nord Ovest. J Clin Oncol 2007; 25: 1670-1676. 24. Coskun U, Buyukberber S, Yaman E et al. Xelox (capecitabine plus oxaliplatin) as neoadjuvant chemotherapy of unresectable liver metastases in colorectal cancer patients. Neoplasma 2008; 55: 65-70. 25. Skof E, Rebersek M, Hlebanja Z, Ocvirk J. Capecitabine plus Irinotecan (XELIRI regimen) compared to 5-FU/LV plus Irinotecan (FOLFIRI regimen) as neoadjuvant treatment for patients with unresectable liver-only metastases of metastatic colorectal cancer: a randomised prospective phase II trial. BMC Cancer 2009; 9: 120. 26. Van Cutsem E, Rivera F, Berry S et al. Safety and efficacy of first-line bevacizumab with FOLFOX, XELOX, FOLFIRI and fluoropyrimidines in metastatic colorectal cancer: the BEAT study. Ann Oncol 2009; 20: 1842-1847. 27. Min BS, Kim NK, Ahn JB et al. Cetuximab in combination with 5-fluorouracil, leucovorin and irinotecan as a neoadjuvant chemotherapy in patients with initially unresectable colorectal liver metastases. Onkologie 2007; 30: 637-643. 28. Folprecht G, Gruenberger T, Bechstein WO et al. Tumour response and secondary resectability of colorectal liver metastases following neoadjuvant chemotherapy with cetuximab: the CELIM randomised phase 2 trial. Lancet Oncol 2010; 11: 38-47. 29. Adam R, Wicherts DA, de Haas RJ et al. Patients with initially unresectable colorectal liver metastases: is there a possibility of cure? J Clin Oncol 2009; 27: 1829-1835. 30. 大腸癌研究会(編). 大腸癌治療ガイドライン 医師用 2010 年版. In Edition 東京: 金原出版

48

2010. 31. 田中洋平, 佐藤伸隆, 林尚子 et al. 【大腸癌 最新の研究動向】 特論 大腸癌化学療法後肝切除の経済的妥当性について. 日本臨床 2011; 69: 639-643. 32. Adam R, Pascal G, Castaing D et al. Tumor progression while on chemotherapy: a contraindication to liver resection for multiple colorectal metastases? Ann Surg 2004; 240: 1052-1061; discussion 1061-1054. 33. Hayashi N, Ito I, Yanagisawa A et al. Genetic diagnosis of lymph-node metastasis in colorectal cancer. Lancet 1995; 345: 1257-1259. 34. Hayashi N, Egami H, Kai M et al. No-touch isolation technique reduces intraoperative shedding of tumor cells into the portal vein during resection of colorectal cancer. Surgery 1999; 125: 369-374. 35. Ghossein RA, Scher HI, Gerald WL et al. Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications. J Clin Oncol 1995; 13: 1195-1200. 36. Racila E, Euhus D, Weiss AJ et al. Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 4589-4594. 37. Gaforio JJ, Serrano MJ, Sanchez-Rovira P et al. Detection of breast cancer cells in the peripheral blood is positively correlated with estrogen-receptor status and predicts for poor prognosis. Int J Cancer 2003; 107: 984-990. 38. Jotsuka T, Okumura Y, Nakano S et al. Persistent evidence of circulating tumor cells detected by means of RT-PCR for CEA mRNA predicts early relapse: a prospective study in node-negative breast cancer. Surgery 2004; 135: 419-426. 39. Ross AA, Cooper BW, Lazarus HM et al. Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques. Blood 1993; 82: 2605-2610. 40. Leather AJ, Gallegos NC, Kocjan G et al. Detection and enumeration of circulating tumour cells in colorectal cancer. Br J Surg 1993; 80: 777-780. 41. Simpson SJ, Vachula M, Kennedy MJ et al. Detection of tumor cells in the bone marrow, peripheral blood, and apheresis products of breast cancer patients using flow cytometry. Exp Hematol 1995; 23: 1062-1068. 42. Gross HJ, Verwer B, Houck D et al. Model study detecting breast cancer cells in peripheral blood mononuclear cells at frequencies as low as 10(-7). Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92: 537-541.

49

43. Johnson PW, Burchill SA, Selby PJ. The molecular detection of circulating tumour cells. Br J Cancer 1995; 72: 268-276. 44. Ghossein RA, Rosai J. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer 1996; 78: 10-16. 45. Mori M, Mimori K, Ueo H et al. Molecular detection of circulating solid carcinoma cells in the peripheral blood: the concept of early systemic disease. Int J Cancer 1996; 68: 739-743. 46. Kruger W, Togel F, Rossing S et al. Improvement of breast cancer cell detection by immunomagnetic enrichment. Cytotherapy 1999; 1: 135-139. 47. Molnar B, Ladanyi A, Tanko L et al. Circulating tumor cell clusters in the peripheral blood of colorectal cancer patients. Clin Cancer Res 2001; 7: 4080-4085. 48. Allard WJ, Matera J, Miller MC et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res 2004; 10: 6897-6904. 49. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 2004; 351: 781-791. 50. Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 3213-3221. 51. Pierga JY, Bidard FC, Mathiot C et al. Circulating tumor cell detection predicts early metastatic relapse after neoadjuvant chemotherapy in large operable and locally advanced breast cancer in a phase II randomized trial. Clin Cancer Res 2008; 14: 7004-7010. 52. Dawood S, Broglio K, Valero V et al. Circulating tumor cells in metastatic breast cancer: from prognostic stratification to modification of the staging system? Cancer 2008; 113: 2422-2430. 53. Goodman OB, Jr., Fink LM, Symanowski JT et al. Circulating tumor cells in patients with castration-resistant prostate cancer baseline values and correlation with prognostic factors. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18: 1904-1913. 54. Hou JM, Greystoke A, Lancashire L et al. Evaluation of circulating tumor cells and serological cell death biomarkers in small cell lung cancer patients undergoing chemotherapy. Am J Pathol 2009; 175: 808-816.

50

55. Fan T, Zhao Q, Chen JJ et al. Clinical significance of circulating tumor cells detected by an invasion assay in peripheral blood of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol 2009; 112: 185-191. 56. Hiraiwa K, Takeuchi H, Hasegawa H et al. Clinical significance of circulating tumor cells in blood from patients with gastrointestinal cancers. Ann Surg Oncol 2008; 15: 3092-3100. 57. 保川清. 【新しい遺伝子検査法の進歩】 TRC 反応による RNA の増幅とリアルタイム検出. 医学のあゆみ 2003; 206: 479-483. 58. Ishiguro T, Saitoh J, Yawata H et al. Fluorescence detection of specific sequence of nucleic acids by oxazole yellow-linked oligonucleotides. Homogeneous quantitative monitoring of in vitro transcription. Nucleic Acids Res 1996; 24: 4992-4997. 59. Ishiguro T, Saitoh J, Horie R et al. Intercalation activating fluorescence DNA probe and its application to homogeneous quantification of a target sequence by isothermal sequence amplification in a closed vessel. Anal Biochem 2003; 314: 77-86. 60. Ishii T, Fujiwara Y, Ohnaka S et al. Rapid genetic diagnosis with the transcription-reverse transcription concerted reaction system for cancer micrometastasis. Ann Surg Oncol 2004; 11: 778-785. 61. Hayama T, Iinuma H, Watanabe T. Rapid genetic diagnosis with transcription-reverse transcription concerted reaction system for peritoneal recurrence and survival in colorectal cancer patients. Oncol Rep 2007; 18: 779-784. 62. Ishikawa T, Miyajima E, Sasaki T et al. Transcription-reverse transcription concerted reaction and minimal residual disease in axillary sentinel nodes of breast cancer. Eur J Surg Oncol 2007; 33: 430-434. 63. Ohashi N, Nakanishi H, Kodera Y et al. Intraoperative quantitative detection of CEA mRNA in the peritoneal lavage of gastric cancer patients with transcription reverse-transcription concerted (TRC) method. A comparative study with real-time quantitative RT-PCR. Anticancer Res 2007; 27: 2769-2777. 64. Imamura Y, Hayashi N, Sato N et al. Extensive lymphatic spread of cancer cells in patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma: Detection of CEA-mRNA in the three-field lymph nodes. J Surg Oncol 2010; 102: 509-515.

51

65. Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2009; 20: 1223-1229. 66. Sastre J, Maestro ML, Puente J et al. Circulating tumor cells in colorectal cancer: correlation with clinical and pathological variables. Ann Oncol 2008; 19: 935-938. 67. Matsusaka S, Suenaga M, Mishima Y et al. Circulating tumor cells as a surrogate marker for determining response to chemotherapy in Japanese patients with metastatic colorectal cancer. Cancer Sci 2011; 102: 1188-1192. 68. Wang JY, Lin SR, Wu DC et al. Multiple molecular markers as predictors of colorectal cancer in patients with normal perioperative serum carcinoembryonic antigen levels. Clin Cancer Res 2007; 13: 2406-2413. 69. Sorbye H, Dahl O. Carcinoembryonic antigen surge in metastatic colorectal cancer patients responding to oxaliplatin combination chemotherapy: implications for tumor marker monitoring and guidelines. J Clin Oncol 2003; 21: 4466-4467.

表題目次1. 要旨2. 発表論文リスト3. 謝辞4. 略語一覧5. 研究の背景と目的6. 検討方法7. 結果9.考察結論9. 参考文献