896 癌とイヒ学療法

●特別寄稿●

担癌マウスにおけるCyclophosphamideと椎茸菌糸体培養培地

　　抽出物（LEM）・霊芝菌糸体培養培地抽出物（MAK）の　　　　　　　　　　　　　　　併用による延命効果

助川　　寧＊1’2川村純一郎＊3　奥野　清隆＊2’3

〔Ipn／Cancer　Che〃zother　44（10）：896－899，0ctober，2017〕

Survival　Benefit　by　Combined　Administration　of　Cydophosphamide，　Lentinul∂edode∫My⊂elia　Extract（LEM），　and

G∂noderma／ucidum　Mycelia　Extract（MAK）in　SIO18BIO　Tumor－Bearing　Mice：Yasushi　Sukegawa＊L2，」uni⊂hiroKawamura＊3　and　Kiyotaka　Okuno＊2’3（＊11η∫亡itute　of　／mmunother∂ργfbr　C∂η⊂er，∂nd＊21η∫亡itute　of　Life∫cience，　Kin（メ∂1

（ノniversity，＊3Deρ亡，　of　Surgery，　E∂cu／ty　o　f　Medicin　e，　Kind∂iしノniver∫ity）

Summ∂ry　⊂yclophosphamide（⊂Y）was　intraperitoneally　administered　once　a　week　to⊂57BL／10mi⊂e　that　had　received　Rous　sar⊂o－

ma　virus（RSV）－indu⊂ed　SIOI　8B　10　syngeneic　tumor　transplantation　and　in　whom　tumor　diameter　ex⊂eeded　4．5mm．　SurvivaI

was　prolonged　in　a　group　of　mi⊂e　that　also　re⊂eived　a　mixture　of　LEM　and　MAK　orally．　When　spleni⊂⊂ells　were⊂ultured　under

mitomy⊂in⊂－treated　SlO1　8B　lO　stimulation　and　the　SlO1　8B　lO－directed⊂ell　k川ing　ability　was　examined、　the　effe⊂tor　cells　were

found　to　be　F4／80－D⊂／Mφcells．　Flow⊂ytometri⊂analysis　showed　that　the　proportion　of　F4／80－D⊂／Mφ⊂ells　in　the　splenic

⊂ell⊂ulture　of　the⊂Y十LEM十MAK　treatment　groupwas　higher　than　that　in　the　untreated　group．The　ratio　of　F4／80＋⊂D8a＋

⊂ells　in　the⊂Y＋LEM＋MAK　treatment　group　was　lower　than　that　in　the　untreated　group．　Key　words：⊂hemotherapy　adju－

vants，　Len　tin　uZ∂edode∫mycelia　extract，　G∂noderm∂／ucidum　myce）ja　extract

要旨　C57BL／10マウスにRous　sarcoma　virus（RSV）誘発同系腫瘍のSlO18B10を移植して腫瘍径4．5mmを超えてから

cyclophosphamide（CY）を週1回腹腔投与し，　Lentinula　edodes　mycelia　extract（LEM）とGanoderma　lucidum　mycelia

extract（MAK）の混合物を経口投与すると，無治療群に比べて延命した。脾細胞をmitomycin　C処理したSlO18B10刺激下

に培養してS1018B10に対する殺細胞能力を調べると，　effector細胞はF4／80一のDC／Mφ系細胞であった。フローサイトメ

トリー解析でCY＋LEM＋MAK治療群の脾細胞培養i中のF4／80－DC／Mφ系細胞の比率は無治療群よりも上昇していた。

CY＋LEM＋MAK治療群のF4／80＋CD8a＋細胞比率は無治療群よりも低下していた。

◆・11b◆・Pt‘’◆‘）i1’◆‘叩‘◆・‘‘‘・◆．111i◆，11‘1◆1］｜1，◆・1‘P’◆．11P＞◆・1）1．◆・bl‘1◆・‘1［・●・1‘ll◆dlll－・‘lb◆1‘1ト

はじめに

　Lentinula　edodes　mycelia　extract（LEM）とGano－

derma　lucidum　mycelia　extract（MAK）は，動物に経口

投与すると抗腫瘍効果を有することが報告1’3）されてい

る健康食品であるが，腫瘍が生育した後から投与しても

十分な抗腫瘍効果を有するかどうかは定かでない。

S1018B10はC57BL／10マウスを用いてRous　sarcoma

virus（RSV）で誘発したfibro　sarcomaである4）。

S1018B10担癌マウスに腫瘍移植前からMAKを経口投

与すると無治療群よりも延命するが3），腫瘍が育った後

からLEMやMAKを経口投与しても有意な延命は観察

されない。cyclophosphamide（CY）はregulatory　T細

胞を抑制することが報告されている5）。今回の検討にお

いて，腫瘍が生育した後にCYとの併用で標記食品を開

始して，CY単独投与に上乗せして延命する併用条件を

探り，機序を解析した。

1．方　　法

動物は雄性C57BL／10マウスを5～6週齢で日本エス

＊1近畿大学・腫瘍免疫等研究所

＊2　同　　・ライフサイエンス研究所＊3 近畿大学医学部・外科

連絡先：〒589－8511大阪府大阪狭山市大野東377－2　近畿大学・腫瘍免疫等研究所

助川　寧

Presented by Medical*Online

第44巻第10号2017年10月

○：Control（CE－2　diet　l　OOo／o）（44．8十7．9，10）（mean＋SD，　n）

●：LEM（O．90／o　LEM十99，1〔｝／o　CE－2）（622十28．4，10）

●：MAK（O．9％MAK＋99．10／o　CE－2）（85．5＃十28．5，10）

＃：p＜0．001，vs　control，　logrank　tests

0　　　8　　　6　　　4　　　2

1　　　0　　　0　　　0　　　0

　　

Φ↑ω」一〇コ〉乏⊃の①〉＝oコ一⊃E⊃O

O

　　0　　　20　　40　　60　　80　　100　120　140　　　Days　a†ter　SlO18BlOtumor　sc　inoculation

Fig．1　0verall　survival　based　on　oral　administration

　　　started　7　days　before　tumor　transplantation

エルシー株式会社から購入し，CE－2飼料で飼育した。

MAKとLEMの原末およびMAKとLEMを配合したCE－2飼料は野田食菌工業株式会社から恵与を受けた。

　実験A：C57BL／10マウス皮下にS1018B10　fibro　sarco－

Inaを2×106個移植する7日前から，　LEMまたはMAK

を0．9％含むCE－2飼料を与え生存日数を観察した。移

植28日後に脾細胞を採取し，100μg／mLのmitomycin

Cで37℃45min処理後のS1018B10をsplenic　cells　l

S1018B10＝300：1で混合することによる腫瘍抗原刺激

下に5日間培養してeffector細胞を誘導し，　S1018B10

に対するkillingを51Cr遊離法にてE／T比40／1で測定

した。

　実験B：腫瘍が4．5mm以上に生育した後にCYを週

に1回40mg／kg腹腔投与し，　CY投与開始の翌日から

LEMまたはMAKを0．9％含むCE－2飼料を与え，移植

28日後の脾細胞killingを測定した。

　実験C：腫瘍が4．5mm以上に生育した後にCYを週

に1回40mg／kg腹腔投与し，　CY投与開始の翌日から

LEM：MAK＝2：1混合物（LM　mix）を1．5g／kg連日

経口投与して，生存日数を観察した。治療群の脾細胞培

養によりeffector細胞を誘導して，　nylon　wool　column

処理抗体と補体による除去またはデプリーション

（depletion）処理，抗体添加によるblocking　test，磁気

ビーズ処理，フローサイトメーター（FCM）による細胞

分取を行って，S1018B10に対するkillingの増減を調べ

た。治療群と無治療群のマウスから誘導した脾細胞を

FCMで分析した。

皿．結　　果

実験A：平均生存日数はCE－2（control）群44．8，　LEM

897

○：Control（saline　10mL／kg／week　ip，　water　10mL／kg／day　po）

　（58．9十20．9，16）（mean十SD，　n）

▼：LM　mix（saline　ip，　LM　mix［LEM：MAK＝2：1］1　．5　g／kg／day　po）

　（71．8十26．8，10）

△：CY（cyclophosphamide　40　mg／kg／week　ip，　water　po）

　（78．3十23．4，11）

▲：LM　mix＋CY（LM　mix　po、　CY　ip）（92．7＃＄＋32．1，11）

＃：p＜O．05，vs　control，　＄：p＜O．05，　vs　CY　group，　logrank　tests

］．O

8　　　6　　　4　　　2

0　　　0　　　0　　　0

①］田」一円〉一〉」コのΦ〉＝■コ一⊃⊂」コ○

0

　　0　　　20　　40　　60　　80　　100　120　］40　　　Days　after　S1018B10tumor　sc　inoculation

Fig．2　0verall　survival　based　on　treatment　started

　　　after　the　tumor　diameter　exceeded　4．5mm

群62．2，MAK群85．5であった（Fig．1）。腫瘍移植前か

らMAKを経口投与すると有意に延命した。細胞傷害活

性の平均値（％of　killing）はcontrol群12．0，　LEM群

16．5，MAK群14．7であった。

　実験B：腫瘍移植後から治療を開始すると，細胞傷害

活性平均（％）はcontrol群8．8，　LEM群15．6，　MAK群

13．5，CY群10．6，　LEM十CY群13．6，　MAK十CY群

13．4と治療群で上昇傾向であった。

　実験C：平均生存日数はcontrol群58．9，　LM　mix群

71．8，cY群78．3，　LM　mix＋cY群（併用群）92．7（Fig．

2）。併用群で有意な延命がみられた。移植後28日の細胞

傷害活性平均（％）はcontrol群9．2，　LM　mix群13．7，

CY群19．3，併用群31．9と治療群で上昇した。細胞傷害

活性はnylon　wool非付着画分にはなく，付着画分にみ

られた（Fig．3）。磁気ビーズ分画でF4／80－，　cDllb＋，

CD19－，　CD8a一に細胞傷害活性がみられた（Fig．4）。

FCMでforward　scatter（FSC）大とFSC小に分取する

と，細胞傷害活性はFsc大で強かった（Fig．4）。誘導後

の脾細胞FCM解析でF4／80＋CD8a＋はcontro1群

3．8％，併用群1．2％で，FSC大F4／80－CD8a一はcon－

trol群8．5％，併用群22．2％であった（Fig．　5）。

皿．考　　察

　餌にLEMまたはMAKをO．9％配合することは，1g／

kg／day経口投与に匹敵する。　LEMに比べてMAKの製

造コストが高いことから，LEMとMAKを混合投与す

Presented by Medical*Online

898 癌とイヒ学療｝去

lnduction　phase　cells　　　　　　　Non　treated

depletion　tests　　　　　　Complement　only

　　　　　　　　　　　　　　Anti－CD4十complement

Ef「ector　phase　cells　　　　Complement　only

depletion　tests　　　Anti－CD4十comPlement

　　　　　　　　　　　　　　Ant卜CD8十complement

　　　　　　　　　　　　　AntトNK1．1十complement

O 5 10 15 20

Effector　phase　nylon

wool　column　　　　　　Non　treated

Nylon　wool　adherent　Nylon　wool　passed

O 20 40 60 80

Effector　phaseblocking　testAntibody（10μg／mL）

No　antibody

Anti－CD3e　Anti－CD4Anti－CD8a

0 5 10 15 20 25

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0　　　　　　20　　　　　　40　　　　　　60　　　　　　80

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　％Specific　51Cr　release

Fig．3　Specific　activation　of　killer　cells　in　LM　mix十CY　group　mice　splenic　cells　on　28　days　after　tumor　inoculation，

　　　　　were　cultured　for　5　days　with　stimulator　cells　which　were　mitomycin　C　100μg／mL　45　min　treated　S1018BlO

　　　　　tumor　cell　lines　at　a　splenic　cells：stimulator　ratio　of　300：1．　The　cytotoxic　activity　was　measured　by　13h　51Cr

　　　　　release　assay　at　an　effector：S1018B10　target　ratio　of　40：1．

F4／80一

F4／80＋

F4／80－

CD8a＋CD8a一

CD8a＋CD8a－

CD　1］b＋

CDllb－

CD19＋CD　19－

FSC（large）

FSC（small）

　　　　　　　　　　　　　　　　0　　10　　20　　30　　40　　50

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0／そ）Specific　51Cr　release

Fig．4　Cell　enrichment　and　depletion　by　magnetic

　　　　　beads　and　cell　sorting　by　flow　cytometer　were

　　　　　performed．　Specific　activation　of　killer　cells　in

　　　　　LM　mix十CY　group　mice　splenic　cells　on　28

　　　　　days　after　tumor　inoculation，　were　cultured

　　　　　for　5　days　with　stimulator　cells　which　were

　　　　　mitomycin　C　100μg／mL　45　min　treated　S1018

　　　　　BIO　tumor　cell　lines　at　a　splenic　cells：stimula－

　　　　　tor　ratio　of　300：1．　The　cytotoxic　activity　was

　　　　　measured　by　13h　51Cr　release　assay　at　an　ef－

　　　　　fector：SlO18BlO　target　ratio　of　40：1．

ることで延命に好影響があると想定して最初に行った実

験の混合比率がLEM：MAK＝2：1と製造原価を下げ

た配合であった。初めに試みた配合比率の結果がよかっ

たことから，他の配合比率は試みていない。nylon　wool

付着試験，CD4，　CD8a，　natural　killer（NK）1．1陽性細

胞除去試験blocking　test，　FCM分取試，験磁気ビーズ

分画試験の結果（Fig．3，4）から，主なeffector細胞は腫

瘍細胞で刺激されたCD4＋T細胞により活性化された

F4／80＋CD8a＋

　　F4／80＋

CD8adim　CD25＋

　　FSC　large

F4／80一CD8a一

［コ：Contro1

■：LM　mjx十CY

　　　　　　　　　　　　　　　0　　　10　　20　　30

　　　　　　　　　　　　　　　　　　Percentage　of　cells

Fig．5　Flow　cytometric　analysis　were　performed．

　　　　　Speci丘c　activation　of　killer　cells　in　LM　mix十

　　　　　CY　group　mice　splenic　cells　on　28　days　after

　　　　　tumor　inoculation，　were　cultured　for　5　days

　　　　　with　stimulator　cells　which　were　mitomycin

　　　　　ClOOμg／mL　45　min　treated　S1018B10　tu－

　　　　　mOr　cell　IineS　at　a　Splenic　cells：stimulator

　　　　　ratio　of　300　：1．

dendritic　cell（DC）／Mφ系細胞であると考えられた。活

性の主体はcytotoxic　T　lymphocyte（CTL）やNKでは

なく，CD19陽性細胞除去で活性が増強することから

antibody－dependent　cell－mediated　cytotoxicity（AD

CC）の関与も低いと考えられた。　F4／80＋のmature

macrophagesは強力なsuppressorであるとの報告があ

るが6），今回の検討で細胞傷害活性はF4／80一分画にあっ

た。induction後の脾細胞FCM分析で，　effector分画候

補としてFSC大F4／80－CD8a－，　suppressor分画候補

としてF4／80＋CD8adim　CD25＋を1則定したところ，　con－

trol群に比べてLM　mix＋CY群でFSC大F4／80－

CD8a一が増多し，　F4／80＋CD8adim　CD25＋が減少してお

り（Fig．　5），細胞傷害活性上昇と相まって延命に寄与し

たと考えられた。

Presented by Medical*Online

第44巻第10号2017年10月 899

結 語

　LEMとMAKを混合してCYと併用投与することで，

腫瘍が生育した後から治療を開始してもCY単独よりも

上乗せして延命した。

文 献

1）Tanaka　K，　Ishikawa　S，　Matsui　Y，　et　al：Oral　ingestion　of

　　Lentinula　edodes　mycelia　extract　inhibits　B16　melanoma

　　growth　via　mitigation　of　regulatory　T　cel1－mediated　im－

　　munosuppression．　Cancer　Sci　lO2（3）：516－521，2011．

2）福原千尋，神内伸也，岩田直洋・他：霊芝菌糸体培養培地

　　抽出物（MAK）のマウスメラノーマ細胞に対する抗腫瘍

　　効果日本薬学会第136年会DVD要旨集，2016，29AB－　　am373．

3）助川　寧：担癌マウスにおける霊芝菌糸体培養培地抽出　　物による延命効果（第2報）：第29回日本バイオセラピィ

　　学会学術集会総会プログラム・抄録集，2016，p80．

4）Toko　T　and　Fujimoto　S：Augmentation　of　anti－tumor　im－

　　munity　in　low－responder　mice　by　various　biological　re－

　　sponse　modifiers：analysis　of　effector　mechanism．　Ipn／

　　Cancer　Res　　80（12）：1212－1219，1989．

5）Ikezawa　Y，　Nakazawa　M，　Tamura　C，　et　al：Cyclophospha－

　　mide　decreases　the　number，　percentage　and　the　function

　　of　CD25＋CD4＋regulatory　T　cells，　which　suppress　in－

　　duction　of　contact　hypersensitivity．∫Z）ematol　Sci　39

　　（2）：105－112，2005．

6）Hamilton　MJ1，　Bosiljcic　M，　Lepard　NE，　et　al：Macrophag－

　　es　are　more　potent　imrnune　supPressors　ex　vivo　than

　　immature　myeloid－derived　suppressor　cells　induced　by

　　metaStatiC　mUrine　mammary　CarCinOmaS．∫　lmmunOl　　l92（1）：512－522，2014．

　本論文の要旨は第38回癌免疫外科研究会において発表した。

Presented by Medical*Online