UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICIAS Y DE LA

SALUD-IZTAPALAPA.

REPORTE FINAL DE SERVICIO SOCIAL

Presentado por:

ENRIQUE CRUZ ISLAS

,/

TELEFONO: 3-42-03-36

MATRICULA: 87344761

LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL.

TITULO DEL PROYECTO:

^ESTUDIO DEL MATERIAL CAPSULAR DE C ~ ~ Q C Q C C U S nC?QfQ?XEUlS COMO UN POSIBLE AGENTE ESTIMULANTE DE LA MEGACARIOPOYESIS In vivo E In vitro".

DIRECTORES: M. en B. E. RODOLFO VELASCO LEZAMA PROFESOR TITULAR "B" DE T. C.

Q.B.P. RAFAELA TAPIA AGUILAR PROFESOR ASOCIADO "B" DE T. C.

LUGAR DE REALIZACION:

LABORATORIO DE HEMATOL'OGIA EXPERIMENTAL (S-254) DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD UAM-IZTAPALAPA

FECHA DE INICIO: 15 JUNIO DE 1993

FECHA DE TERMINACION: 25 JUNIO DE 1994

20 HORAS SEMANALES

TRIMESTRE: 93-P

c~r--. ENRIQUE CRUZ ISLAS

DIRECTOR M. en B.E. RODOLFO VELASCO L. Q.B.P IiAFAELA TAPIA AGUILAR PROFESOR TITULAR "B" DE T. C. PROFESOR ASOCIADO "B" DE T. C. DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD

1

TITULO DEL PROYECTO

^ESTUDIO DEL MATERIAL CAPSULAR DE

CWD~QCOCCUS neoformams COMO UN POSIBLE

AGENTE ESTIMULANTE DE LA MEGACARIOPOYESIS

In vivo E In vitro. A

o

2

JUSTIFICACION

Este proyecto forma parte de la línea de investigación en

hematopoyesis que pretende conocer los agentes físicos, químicos

o biológicos que modifican la hematopoyesis, particularmente la

producción de megacariocitos y de plaquetas.

T

El presente trabajo se ubica en el campo de la investigación

básica e intenta correlacionar los hallazgos hematológicos obser-

vados en modelos experimentales con los ,signos presentados por

pacientes con C ~ ~ D ~ Q C Q C Q S ~ S y así conocer más acerca de la biolo-

gía de esta levadura y sus mecanismos de patogenicidad.

i

3

INTRODUCCION

La crigtococosis es una infección causada por la levadura

capsulada C ~ ~ ~ ~ ~ O C Q C C Z U S n e o f o m s , de distribución cosmopolita,

que afecta a una gran variedad de especies animales incluyendo al

hombre. Con base en la composición de su material capsular se

han identificado cuatro serotipos: A y 1) que corresponden a la

variedad neoformans, B y C a la variedad qattii. El agente

etiológico mundial de la criptococosis corresponde a la variedad

neoformans, ya que la variedad qattii se restringe a las re-

giones tropicales y subtropicales (1,2).

v

Las características morfológicas sobresalientes de ésta

levadura son: forma esférica u oval, ta.maño de 5 a 10 micróme-

tros, cápsula de grosor variable que puede aumentar hasta 8

veces el tamaño de la célula.

Se considera que la virulencia de éste microorganismo está

directamente relacionada con el grosor de su cápsula, ya que éSta

le permite contrarrestar los mecanismos de defensa celular del

Generalmente la levadura ingresa al hospedero por vía respi-

ratoria al inhalar partículas contaminadas con excretas de palo-

mas, se aloja inicialmente en los pulmones, en donde puede

encontrarse, sin manifestación alguna, o bien causando una infec-

ción localizada, sin embargo, al presentarse una deficiencia

inmunológica o enfermedades debilitantes como cáncer, diabetes, ,

4

tuberculosis, etc. C, neoformans manifiesta mayor capacidad

infecciosa y puede así diseminarse por el torrente sanguíneo para

depositarse en algunos órganos de gran importancia fisiológica,

con una marcada predilección' para el sistema nervioso central,

lugar que contiene los sustratos utilizados por C, neoformams

para formar grandes cápsulas ( 4 , s ) . En esta localización, la

infección suele ser gradual y manifestarse con cefalea, rigi-

dez de nuca y cuello, produce alteraciones de la conducta como

irritabilidad, apatía, delirio, posteriormente pérdida del habla,

ceguera parcial o total, meningitis y finalmente la muerte.

,

5

ANTECEDENTES

Existen reportes aislados, en la 1it.eratura que refieren

cambios hematológicos en pacientes con criptococosis ( 8 , 9 ) , por

otra parte, el grupo de investigación en hematopoyesis, utilizan-

do animales infectados con C. neoformans, ha reportado un incre-

mento en la concentración de plaquetas ( 6 ) . Se demostró también

que este microorganismo es capaz de invadir el bazo, hígado,

riñones, pulmones y cerebro de los ratclnes infectados, estos

hallazgos se correlacionan con los resultados obtenidos por

algunos autores en la necropsia de pacientes con criptococosis.

Con base a lo anterior se plantean las siguientes hipótesis

para explicar el aumento en la concentración ,de plaquetas en

ratones con criptococosis.

6

HIPOTESIS

,

1) Que el bazo, (órgano natural de destrucción plaquetaria)

al ser invadido por la levadura, quede incapacitado

para su función, por lo que las plaquetas recien

formadas y las ya existentes se acumulen en la circu-

lación, produciendo un incremento en la concentración

de plaquetas circulantes.

2 ) Que la célula levaduriforme de C. neofo-s libere parte

de SU material capsular y ést:e estimule a la célula

madre hematopoyetica pluripotencial para la producción

de megacariocitos y sus productos finales las plaque-

tas.

3) Que C, I I ~ ~ ~ Q I X I E I I I ~ aglutine a las plaqueqas del huésped

y mimetize una trombocitopenia demandando la produc-

ción de nuevas plaquetas.

7

OBJETIVO

DETERMINAR LA PARTICIPACION DEL MATERIAL

CAPSULAR DE C. neofonmns, EN :EL INCREMENTO

DE LA CONCENTF3iCION DE PLAQUETAS EN RATONES

INFECTADOS CON LA LEVADURA.

8

MATERIAL 1 EQUIPO

MATERIAL BIOLOGICC!

Ratones machos de la cepa CD-1, de 3-13 y de 8-12 semanas de

edad.

SOLUCIONES, REACTIVOS x MEDIOS DE CULTIVO

Medio ALFA-MEM con glutamina. (KC Biological Inc.)

Caldo Sabouraud. ( B ioxon)

Medio Leibovitz. (GIBCO)

Solución de antibióticos. (GIBCO)

Azul de tripan al 0.4% en amortiguador de fosfatos. (GIBCO)

Suero de Caballo. (SIGMA)

Extracto de Embrión de Bovino.

Plasma citratado de Bovino.

Medio de Littman.

Solución Salina Fisiológica.

(GIBCO

(SIGMA

MATERIAL

Material desechable de uso frecuente en laboratorio de cultivo de

te j idos.

Pipeta de Thomas para: Glóbulos rojos y Glóbulos blancos.

Equipo de disección.

9

EQUIPO

Baño metabólico con agitación.

Campana de flujo laminar horizontal.

(Forma Scientific)

(VECO)

Potenciómetro. (Beckman)

Centrifuga para microhematocrito. (Hermle)

Centrifuga Clínica. (Solbat)

Equipo de ultrafiltración molecular. (Amicon)

Cartucho de fibra hueca con capacidad de exclusión de 30 kD.

Cámaras cuenta glóbulos.

Cámara de Hatch.

Microscopio óptico con contraste de fases. (Zeiss)

Espectrofotómetro. (Perkin Elmer) .

Balanza analítica. (Ohaus )

10

METODOLOGIA Y FASES DE DESARROLLO DEL TRABAJO-EXPERIMENTAL-

1. Sangrado de ratones y cuantificación de eritrocitos, leuco-

citos, plaquetas para conocer sus concentraciones normales P

2. Cultivo de C, neofo-s y obtención del material capsular.

3. Cuantificación de proteínas y azúcares totales

4. Inoculación de levadura en ratones por vía intraperitoneal e

intracerebral.

5. Ensayo de la capacidad hematopoyetica del material capsular

en ratones sanos.

6 . Obtención de médula ósea de ratón, cuantificación de célu-

las nucleadas y megacariocitos tota.les, determinación de

viabilidad celular con azul de tripano al 0.4%.

7. Ensayo de actividad estimulante de la producción de mega-

cariocitos en cultivos de médula ósea. de ratón, estimulados

con el material capsular. b

8. Determinación de la capacidad de C. neoformans para aglu-

tinar plaquetas de ratones, In vitro.

12

,

4-7 CUAWTIFICACI4W D E

I INACTlWldN

;OYFIRYAClbl D E 111 ACT IWC I4W Ell

BDA

CENTRIFUGAC16N Y LAWDO CON SOLUCIdN %AI I N A DF I A Qlrl-SPFN3Ldf.I

LkJ AZUCARES

I

PROTEIN- TnTAI f S CUALTIVO d E MEDULA NQCUIL IdN E

OSFA DF RATON , Lb CUANTIFICACIdN DE

COLONIA3 DE

INFECCION DE RATONES CON Cryptococcus neoformans

de

Para confirmar el aumento en la concentración de plaquetas

ratones infectados con C.neoformans, reportado previamente

por el grupo de trabajo. Se utilizó la cepa L de C. neoformans

aislada y purificada del líquido cefalorraquídeo de un paciente ,

con SIDA. La levadura se cultivó en caldo Sabouraud e incubó

durante tres días a 37OC con agitación constante, se lavó con

solución salina y se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos a

temperatura ambiente. El paquete celular se resuspendió con solu-

ción salina fisiológica, se inactivó por calentamiento una

alícuota de 5 m1 y se cuantificaron las levaduras en hemocitóme-

tro, posteriormente con el cultivo no inactivado se prepararó una

suspensión celular de 5 X 10 levaduras/ml y se administró en 6

ratones macho de la cepa CD1, de acuerdo c:on el cuadro siguiente.

GRUPO

No. DE RATONES

EDAD EN SEMANAS

MATERIAL INOCULADO

VIA DE INOCULACION

VOL. INOCULADO (ml) O

DIAS DE INOCULACION

~~

1 2 3 4

10 10 10 10

3-5 3-5 8-L2 8-12

SS Cepa L SS Cepa L

IC IC IP IP

025 O. 025 0.25 O-. 2 5

O O O Y 7 O Y 7

IC= VIA INTRACEREBRAL IP= VIA INTRAPERITONEAL

SS= SOLUCION SALINA

13

Todos los ratones se sangraron el día 14 y se les cuantifica-

ron las plaquetas utilizando oxalato de amonio al 1% como di-

, luyente. Los ratones inoculados por vía intraperitoneal (IP)

fueron sangrados y cuantificadas sus plaquetas antes y después de

la infección, esto es, los días O y 14.

14

OBTENCION DEL POLISACARIDO CAPSULAR DE QyDtococms meoformans.

Para obtener el material capsular la levadura se cultivó en

caldo Sabouraud durante 3 días a 37OC con agitación constante,

se sembraron alicuotas en caldo Littman para favorecer la forma-

ción de cápsula se incubo 7 días a 37OC con agitación constante,

la composición del medio Littman es la siguiente:

KH2P04

(NH4) 2.6H20

MgC12.6h20

CaC12.4h20

MnCL2.4H20

FeC13.6H20 8

2.0 g

2.0

o. 243 o . 0:2 O. 0015

o . o 4

NaMo04.2H20 O . 0015

Tiamina o. 001 Maltosa 5.0

Sacarosa 5.0

Glutamato de Sodio 2.0

Agua destilada lC00. O ml.

NaOH 0.1N para ajustar a pH 7.0 L

Se observó el grosor de la cápsula mediante tinción negativa

con tinta china, se inactivó el cultivo a 6OoC durante una hora y

se sembraron en placas de agar dextrosa Sabouraud y en caldo

nutritivo para comprobar la inactivación de la levadura. Poste-

riormente, la suspensión celular se centrifugó a 3000 r.p.m

durante 90 minutos, los sobrenadantes se colectaron en frascos

15

estériles, se realizaron dos lavados más con solución salina

fisiológica para obtener el material capsular (9).

LOS sobrenadantes se concentraron por separado mediante ultra-

filtración con cartuchos de fibra hueca con capacidad de exclu-

I sión para moléculas menores a 30 kd, el concentrado se liofilizó

y se prepararó con el una solución de 1.0 mg/ml con solución

salina fisiológica, se filtró en membranas; Millipore de 0.22 urn y

se realizaron las siguientes determinaciones:

a). Cuantificación de proteínas totales (10).

b) . Cuantificación de azúcares totales

c). Pruebas de esterilidad en caldo nutritivo y caldo Sabou-

raud.

GRUPO A B C

NO. DE RATONES . 10 10 10

MATERIAL INOCULADO VOLUMEN (ml) .

s s / o . 0 2 Pol. / o . 0 2

DIAS INOCULACION O O O

DIA DE SANGRADO Y DE CUANTIFICACION DE PLAQUETAS.

14 14 14

16

Los ratones del grupo C se dejaron descansar y 11 días des-

pués del primer sangrado, se les inyectaron por vía intraperito-

neal 0.2 m1 del material capsular (10 mg/ml), durante tres días

alternados, 5 días después de la última inoculación se les cuan- ,

tificaron las plaquetas.

17

1.-Se sacrificaron, por dislocación cervical ratones machos de

8 a 12 semanas de edad.

2.-La médula ósea se obtuvo de fémur en condiciones de esteri-

lidad.

3.-Se limpió el fémur con un paño estiiril y se hizo un corte

transversal de la zona del cuello quirúrgico.

4 . - A tarvéz del conducto medular se inyectó 1.0 m1 del medio

MEM-complementado con suero de caballo al 2%.

5.-Se recogió la suspensión medular en un tubo de centrifuga

de 14 ml, se dispersaron las células mediante pipeteo y se

cuantificaron las células nucleadasi totales en una cámara

cuenta globulos, se ajustó la concentración a 2.0 x lO(6)

células/ml y se colocaron en tubos de ensayo a los que se

adicionaron los siguientes materiales, en el orden enlis-

t ando. I

Componentes del medio de cultivo para CFU-M Volumen

Medio Lebovitz (L-15). 1.2 m1

Suero de caballo.

Extracto de embrión de bovino.

Medio condicionado.

Suspensión celular 2 .O x 10 ( 6 ) cel/ml.

Plasma citratado de Bovino.

0.6 m1

0.3 m1

0.3 m1

0.3 m1

0.3 m1

18

6.- Se colocaron 0.5 m1 del medio con :Las células en pozos de

placas de cultivo y se incubaron durante siete días a 37

grados centígrados, con humedad relativa de 90 a 100% y

concentración de dioxido de carbono de 4 a 10%.

7.-Se cosecharon los geles con una esp6tula metálica de punta

roma, se colocaron en portaobjetos y se tiñeron mediante la

técnica de Tiocolinaesterasa-Hematoxilina.

19

,

TPNCION DE lJNIDADES PORMADOR.AS DE COLONIAS DE mGACARIOCITOS -CpU-M- WEDPAESTE LA REACCION CITOQUINICA DE TIOCOLPNAECSTEPZASA- l3RMArnXILPIMA-

1.- A los cultivos de médula ósea cosechados se les colocó un

papel filtro humedecido con amortiguador de fosfatos de pH

5.8-6.2, se fijaron con glutaraldehído al 2.5% en amorti-

guador de fosfatos 0.1M y dejaron en reposo durante 10

minutos a temperatúra ambiente.

3.-Se escurrieron las laminillas y enjuagaron con solución

amortiguadora de fosfatos 0.1M durante 1 minuto, se

dejaron secar a temperatura ambiente de 2 a 3 horas, antes

de prose guir con el siguiente paso del procedimiento.

4.-Posteriormente, las laminillas se colocaron en metanol

absoluto durante 10 minutos y se pasaron a una solución de

metanol al 50% durante 30 segundos, se escurrieron e intro-

dujeron en solución de Hematoxilina de Erlich durante 5

minutos, se lavaron por inmersión en solución de Citrato-

Fosfato agitando la solución durante 1 minuto, y se enjua-

garon bajo el flujo de agua corrient'e durante 2 minutos.

b

2 0

5.-Las laminillas se dejaron escurrir y secar, se les coloco

un cubreobjetos y se sellaron con esmalte de uñas incolo-

ro y transparente para cuantificar al microscópio de luz

el número de CFU-M.

c

2 1

? l.-Se hizo un corte en la cola de los ratones y se exprimió

esta para llenar con la sangre un pipeta para glóbulos ro jos

recubierta con silicona hasta la marca de 0.5 y se llevó

hasta la marca de 101 con oxalato de amonio al 1%.

2.-Las pipetas se colocaron en un agitador para para pipetas de

Thomas durante 3 minutos, se eliminaron las tres primeras

gotas y se llenó la camara cuenta gltjbulos, para, así cuan-

tificar las plaquetas mediante contraste de fases.

22

DETERMINACION DE LA CAPACIDAD AGLUTINANTE DE C. neoformans SOBRE PLAQUETAS DE RATON

, l.-Se sangraron ratones por punción cardiaca, la sangre fué

depocitada en tubos con EDTA al 1 % y se centrifuge a 3 5 0 0

rpm durante 15 minutos. Se separó el plasma conteniendo las

plaquetas y se centrifugo en tubos Erpendorf a g o o 0 rpm

durante 10 minutos para obtener el plasma rico en plaquetas

(PRP) .

2.- Se colocaron 0.4 m1 del concentrado plaquetario y se

adicionaron 0.1 m1 de Eosina al 0.1% de esta mezcla se

depocitaron 100 microlitros en placas multipozos, se

adicionaron 100 microlitros de una suspención inactivada de

2.0 X 10 ( 6 ) lev./ml.

3.- Las placas se incubaron a 37 grados centígrados en una

camara húmeda y se observó al invert.oscopio la interacción

levadura-plaquetas a las 2, 4 y 12 horas de la incubación. b

23

RESULTADOS

FLATONES INFECTADOS CON C. neoformans

Los ratones inoculados con la levadura por vía intracerebral

adquirieron la enfermedad y mostraron signos de la misma como:

pérdida de peso, desequilibrio, deformaciones óseas y algunos de

ellos seguera parcial o total. El 6 0 % de los ratones presentaron

todos los signos anteriores. (Figúra 1).

,

FIGURA 1. RATONES INFECTADOS CON C.neoformans EN DIFERENTES ETAPAS DE LA ENFERMEDAD.

2 4

FIGURA 2. RATONES INOCULADOS CON C. neoformans POR VIA IN- TRACERENBRAL Y UN RATON (IZQUIERDA) DEL GRUPO CONTROL.

2 5

F - La levadura se observó y recuperó del cerebro de ratones

inoculados intracerebralmente, apreciando considerablemente la

formación de cápsulas mediante tinción negativa con tinta china,

como se muestra en la figúra 3.

,

c

FIGURA 3. CEREBRO DE RATON INOCULADO CON C. neoformans. TINCION NEGATIVA CON TINTA CHINA.

2 6

Al cuantificar las plaquetas de l o s ratones tratados y del

grupo testigo inoculado con Solución Salina Fisiológica, se

obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla y gráfica #l.

CONCENTRACION DE PLAQUETAS EN RATONES INFElCTADOS CON Criptococcus neoformans.

Vía de Inoculación Intracerebral Intraperitoneal

Material Inoculado S.S C.neoformans s.s C. neoformans

Plaquetas X lo/mmc 1.60+.12 2.16+0.4 1.57+0.36 1.47+0.4 Inicial/Final 1.60+0.30 2.40+0.4

6

2 7

-10

t-

c

'.. . . ~ \ I I I 1

e n a n

n rr"

N n o A

o

RATONES TRATADOS CON EL MATERIAL CAPSULAR

Para el tratamiento de ratones inoculados con el material

capsular se siguió el esquema mostrado en el cuadro #2, los

resultados correspondientes se muestran en la tabia #2.

CUADRO 2

No. de ratones

Material inoculado/ volumen (ml)

Días de inoculacion

Día de sangrado y cuantificación de plaquetas.

A

10

O

14

B C

10 10

s.s./o.o2 Po1./0.02

O

14

O

14

TABLA 2

CONCENTRACION DE PLAQUETAS EN RATONES TARATADOS CON EL MATERIAL CAPSULAR

Grupo A B C

Material - S . S Material inoculado capsular

Plaquetas X lo/mmc 1.55+0.13 1.65;+0.26 1.94+0.22 1.94+0.22

b

6

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2 8

COMPOSICION QUIMICA DEL MATERIAL CAPSULAR

La cuantificación de proteínas y la de azúcares tomando como

referencia soluciones patrón de glucosa y manosa produjo los

resultados que se muestran en la tabla # 3 . .

,

COMPOSICION DE POLISACARIDO CAPSULAR DE C. neofornnans

MUESTRA GLUCOSA % MANOSA % PROTEINAS mg/ml mg/ml TOTALES

ul/ml

Littman 2.68 40.12 4.00 59.88 212

ler. Lavado 1.60 41.56 2.25 58.44 46

ler. LAVADO 4.70 38.75 7.58 61.24 66 concentrado

20. Lavado N.D. - N.D. - 165

Polisacárido 1.43 38.75 2.26 61.72 118 liofilizado

29

DETERMINACION DE LA CAPACIDAD ESTIMULANTE DE LA MEGA- CARIOPOYESIS DEL MATERIAL CAPSULA

Se ensayó la capacidad estimulante de los diferentes sobrena-

dantes antes y después de su liofilización en cultivos de médula I

ósea de ratón, al cuantificar el número de megacariocitos maduros

y 'Unidades Formadoras de Colonias de Megacariocitos (UFC-

Meg) desarrolladas en respuesta al material capsular, se obtuvi-

eron los resultados que se muestran en la gráfica 2 y 3. Se

consideró como una Unidad Formadora de Colonias de Megacariocitos

(UFC-Meg) a una agrupación de cuando menos 4 células Tiocolina

esterasa positivas como las que se muestran en la figura # 4 .

FIGURA 4. REACCION CITOQUIMICA DE TIOCOLINA-ESTERASA HEMATOXILINA PARA UFC-Meg. AUMENTO 1OX

3 0

r . I "i X t . ..

o . .

r.. 1.. I

L

I "'f 1

1 '. ...

c

I "I . -

: a W m

DETERMINACION DE LA CAPACIDAD AGLUTIN.ANTE DE C. neoformas

Al estudiar la interación levadura-pl'aquetas se observó que

las plaquetas se asocian entre sí y no fen torno a la levadura

independientemente de la concentración de plaquetas utilizada.

L

31

DISrnSION

Los signos de la enfermedad mostrados por los ratones infecta-

dos con C. neoformans por .vía intracerebral, realmente son

atribuibles a la enfermedad y no a un daño mecánico ocasionado

por la inoculación por sí misma, ya que el grupo testigo r

inoculado con solución salina no presentó dichos signos, aunado

al tiempo en que se desarrollaron los signos, lo que concuerda

por lo reportado por Conant y Diamond D.R. (13,14)

Los resultados muestran un incremento significativo en la

concentración de plaquetas, sin importar si los ratones

presentaron o no signos de la enfermedad, esto implica que la

presencia de la levadura efectivamente induce el incremento en la

concentración de plaquetas estimulando en algún nivel de su

diferenciación a la línea megacariocito-plaqueta.

En los ratones inoculados con el material capsular, no se

incrementó la concentración de plaquetas, lo que podría

atribuirse a: C

a) Que el material capsular, no sea el responsable de tal

aumento, o bien que en el ratan existan agentes o factores

humorales que contrarresten su accilh.

b) Que al separar el material capsular de la levadura, cambie

su conformación molecular y con 15110 su actividad como

posible agente estimulante de la producción de plaquetas.

3 2

c) Que bajo el esquema de tratamiento no se logre inducir la

estimulación de la producción de megacariocitos y plaquetas in

vivo.

! El ensayo de la capacidad megacariopoyetica del material

capsular en cultivos de médula ósea de ratón, resultó positivo en

un incremento en la formación de Unidades Formadoras de Colonias

de Megacariocitos (UFC-Meg), esto es, que el material capsular de

- C. neoformans, efectivamente posee actividad inductora, actuando

en algún nivel para promover a la célula Stem hematopoyética a

producir precursores plaquetarios, en particular, Unidades

Formadoras de Colonias de Megas, así como un incremento notorio

en la concentración de megacariocitos maduros.

De los diferentes sobrenadantes estudiados en los cultivos de

mSdula bsea de ratbn, se observa una mayor capacidad estimulante

de la megacariopoySsis en los sobrenadantes de los cultivos en

Littman, lo que nos indica que Sste medio ademzs de ser favora-

ble, para la formacibn de capsula de C. Ileoformans, algunos de

sus componentes pudieran contribuir a la estimulacibn en la b

produccbn de precursores megacariopoySticos y de megacariocitos

maduros, por lo que queda por estudiar en cultivos de mitdula bsea

de ratbn la posible actividad estimulante de la maduracibn o

produccibn de megacariocitos del medio Littman sin levadura, as1

como ensayos de cada uno de los componentes del mismo.

3 3

Del estudio de la capacidad aglutinante de neoformans

sobre plaquetas de ratan, encontramos que las plaquetas no se

agrupan al rededor de las . cslulas levaduriformes, atin en

concentraciones elevadas y en una relacian levadura-plaquetas de

1:4. Sin embargo si se observa aglutinacibn entre las plaquetas,

por lo que puede decirse que presentan esta actividad fisiolagica

pero que no reconocieron a C. neoformans.

/

3 4

1.- Se confirma el incremento significativo estadisticamente

en la concentracibn de plaquetas, aunado con la infecci6n

de ratones con C. neoformans

2.- Bajo el esquema de tratamiento seguido, el polisacsrido

capsular purificado no present6 actividad biolbgica In

vivo.

3.- En los cultivos de mSdula bsea de ratbn result6 que, de

los diferentes sobrenadantes experimentados si hay una

Induccibn en la produccibn de Unidades Formadoras de

Colonias de Megacariocitos principalmente en aquellos

obtenidos a partir del medio Littman. ,

3 5

BIBLIOGRAFIA

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