cromatografía en papel de proteínas -...
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis de Posgrado
Cromatografía en papel deCromatografía en papel deproteínasproteínas
Cabib, Enrique
1951
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Químicade la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Cabib, Enrique. (1951). Cromatografía en papel de proteínas. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0662_Cabib.pdf
Cita tipo Chicago:Cabib, Enrique. "Cromatografía en papel de proteínas". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1951.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0662_Cabib.pdf
UNIVERSIDAD NACIONAL DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENC IAS EXACTAS, FISICAS Y INIATURÁIES
CROMATOGRAFIA EN PAPEL DE PROTEINAS
Tesis presentada por
ENRI UE CABIB
Wüfi" :2
para optar al titulo de Doctor en Quimica
- 1951 —
Deseo expresar mi agradecimiento al
Instituto de Investigaciones Bioquí
micas, Fundación Campomar,por haber
me concedido una beca, que hizo posi
ble la roalización de este trabajo,a1 Dr. L. F. Leloir, por su constonte
ayuda y consojos, y a los Dres. R.Caputto, C.E. Cardini y A.C. Paladini,
por muohassugestiones y críticas valiosas.
La albúmina cristalina y 1a
3.-globulina utilizadas en esta investigación fueron facilitadas por el Dr.N. Mittelman y varios de los sueros yplasmns por el Dr. A. Parodi, a quie
nes hago extensivo mi agradecimiento.
A MIS PADRES
INTRODUCCION
Desde el año 1944, en que Consden, Gordon y Martin, ba
sándose en los trabajos anteriores sobre cromatografía de partición
de Martin y Synge, publicaron su primer articulo de cromatografía en
papel (l), éste métodoha tenido un enormedesarrollo, y se ha revela
do extraordinariamente fructífero en sus aplicaciones a la quimica,especialmente en sus aspectos biológicos. Se lo ha utilizado asi para
la separación de microcantidades de las más diversas substancias: ami
noácidos, azúcares, purinas, nucleósidos y nucleótidos, compuestosfe
nólicos, ácidos orgánicos, antibióticos, cationes inorgánicos, etc.( ver p. ej. 2).
El terreno que hasta ahora se ha resistido más a esasinvestigaciones ha sido probablemente el de las proteinas. Esto se ha
debido en primer lugar a la dificultad con que se tropieza para la se
paración en el papel de moléculas grandes y muy complejas, y probable
mente en no pequeña parte también a la falta, hasta hace muypoco
tiempo, de reactivos sensibles para el revelado de los cromatogramas.
En efecto, por un lado la mayoria de las proteinas no suelen correr
en el papel comomanchas redondeadas y bien definidas, sino por lo c0
múndan manchas muyalargadas o, peor aún, estrías; por otro lado los
reactivos que se utilizan comúnmentepara identificarlas en solución
resultan muypoco sensibles cuando son aplicados al papel.
Los investigadores que se han dedicado a estos problemashan tratado de superar en varias maneraslas dificultades citadas.
Unode los primeros trabajos sobre cromatografía en pa
pel de proteinas fué el de Franklin y Quastel (3). Estos autores in
corporan heminaa la solución de proteina, antes de correrla. La he
mina forma complejos con muchas proteinas y por lo tanto se mueve en
-2el papel junto con ellas. Unavez desarrollado el cromatograma, se
lo revela con una solución de bencidina, que reacciona con la hemina,
dando una coloración azul o a veces roja o verde. Aparecen asi manchas donde se encuentran las proteinas combinadas con la hemina. De
las fotografias que acompañaneste trabajo, se deSprende que el méto
do de revelado no es muy bueno, por aparecer muchas manchas secunda
rias en lugares donde no hay proteinas. Comosolventes estos autoresutilizan distintos buffers (fosfato, citrato, oxalato, etc.) efectuando corridas a diferentes pH; experimentaron con albúmina de bovino,
X'-globulina y'fg-Jactoglobulina, y además con algunas enzimas, comopapaina, pepsina y ureasa. Consiguieron una separación buena entre
dos proteinas sólo efectuando cromatografía en dos dimensiones, condiferentes solventes. Las manchasresultaron en algunos casos ovala
das y otras veces aparecen comoestrías alargadas.
En el caso de la ureasa, su posición fué determinada en
el papel recortando tirillas transversales del mismoe incubándolas
con el substrato (urea) en un respirómetro de Warburg, determinando
asi la actividad enzimática en cada una. Se llegó asi a la conclu
sión de que la mayorparte de la actividad estaba distribuida en unazona del papel de aproximadamente 6 cm de ancho.
Posteriormente Franklin y Quastel aplicaron su método
al estudio de la combinaciónentre la tiroxina y las proteinas del
plasma (4), y más recientemente volvieron a estudiar la separación
de las fracciones proteicas de la sangre (5). De este último articulotrataremos en la discusión (pág.44 ).
En un reciente trabajo Reid (o) utilizando la técnica
de Franklin y Quastel, consiguió separar la enzima poligalacturonasade la pectina esteacaaa de hongos.
_ 3
Ya anteriormente a estos trabajos, Tiselius (7) había
encontrado que ciertas proteínas son capaces de ser fuertemente ad
sorbidas de sus soluciones, en presencia de sales en concentraciones
muchomenores que las necesarias para precipitarlas. Unode los ad
sorbentes ensayados fué el gel de sílice y otro el papel de filtro.Las sales empleadas fueron sulfato de amonio y fosfatos. La concen
tración de proteinas residual en la solución fué calculada en base a
la densidad óptica de la mismaa 280 m/u .ESe hicieron también algunas tentativas de separar proteinas en el papel, basadas en la dife
rente adsorción (llamada por Tiselius "salting out adsorption"), ten
tativas que tuvieron algunos éxitos, según el autor, el cual da sin
embargomuypocos detalles al respecto, tanto en el trabajo citado,comoen una conferencia posterior (8).
Mitchell, Gordony Haskins (9) utilizaron para la sepa
ración de enzimas una columna hecha con discos de papel de filtro superpuestos, la "cromatopila", por ellos ideada. Se embebíanen la so
lución de enzimas cierto número de discos dc papel, que se colocaban
en 1a parte más alta de 1a columna. Se desarrollaba el cromatogramahaciendo pasar solvente por 1a columna desde arriba hacia abajo. Se
sacaba luego uno de cada lO ó 20 discos y se determinaba que actividad había en cada uno, de las enzimas que interesaba separar. Se po
día construir asi un gráfico que daba la concentración de cada enzifma en función del número de discos (o de la longitud de la columna).
El solvente de mayor poder resolutivo fué una solución acuosa de sul
fato de amonio, a la cual se iba agregando continuamente agua durante
el desarrollo del cromatograma, en forma tal que la solución que penetraba a la columna era cada vez más diluída. Se creaba así a tra
vés de la columnaun gradiente de sulfato de amonio: los discos infe
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riorcs contenían concentraciones de la sal muchomás altas que los superiores. Con este métodoMitchell y colab. pudieron separar parcial
mente entre sí las enzimas adenosina deaminasa, amilasa y fosfatasa,
contenidas en un preparado de "takadiastasa". Los mismosautores en
sayaron también con resultados parecidos, aunque en general menos a
lentadores, el uso de un gradiente de pH, a concentración constante
de SO4(NI Otro solvente utilizado fué SO4(NH4)2de concentración{4)2.constante a pHfijo: este último no fué muysatisfactorio, distribu
yéndose en general cada enzima a lo largo de toda la columna y no en
una soma definida.
Los trabajos comentados se ocúpan de la separación de
las proteínas por cromatografía en papel; por otra parte han apareci
do recientemente otros artículos que tratan sobre el revelado de las
proteínas en el papel. Para eso se ha aprovechado la propiedad de lasproteínas de combinarse con varios colorantes. Jones y Michael (10)
utilizan una solución ácida de "SolwayPurple", entre otros, en lacual sumergen el papel por cierto tiempo. Lavando luego con agua ti
bia, se arrastra el colorante, excepto en los sitios dondeha quedado
fijado sobre las proteínas, que aparecen así comamanchascoloreúdasnsg
bre fondo blanco. Durrum(11), en un trabajo que trata sobre electro
foresis en papel, emplea azul de bromofenol en solución alcohólica sa
turada con Cleg, lavando luego con agua. Cremer y Tiselius (12) modificaron este métodopara hacerlo cuantitativo. El métodomodifica
do incluye una serie de lavados del papel con diferentes solventes,elución del colorante y determinación colorimétrica del mismo.
El presente trabajo se inició con el objeto de aplicar
la cromatografía en papel a la separación de enzimas. Se empezópor
_ 5
ensayar soluciones buffer comosolventes, luego Se pasó a los gradien
tes de sulfato de amonio, en general con poco éxito. Finalmente se
utilizó el alcohol etílico en solución acuosa o en mezcla con buffers,pudiéndose separar así las enzimas invertasa y fosfoglucomutasa entre
si, y desdoblar la invertasa de levadura de cerveza en dos fracciones.
A raiz de la publicación de métodos sensibles para el revelado de las
proteínas en el papel, que ya hemoscitado, se pudo extender este tra
bajo a la separación de las proteinas del suero. Se llegó a separar
con relativa facilidad la albúmina de las globulinas y se efectuó unestudio sistemático de la influencia de varios factores sobre estas
separaciones.
- 6 _
PARTE EXPERIMENTAL
Substancias utilizadas x métodos generales
Los métodos se detallarán en cada caso particular. Se
expondrán aqui sin embargo algunos que fueron de uso general en todo
el trabajo.
Substancias.
El glucosa-1-fosfato fué preparado enzimáticamente se
gún Sumnery Somers (13) y el glucosa-1,0-difosfato sintéticamentepor el métodode Leloir et al. (14).
La albúmina de suero humanoera una muestra cristalina
y la X -globulina de suero de caballo era electroforéticamente homogénea.
La sacarosa, maltosa, rafinosa, xilosa yoá-metil glucósido eran todas drogas comerciales.
Papel.
En todos los casos se usó papel Whatman NQl.
Aplicación de la solución a cromatografiar sobre el papel.
La solución fué aplicada sobre el papel en la línea de
partida, a unos 5 cm de un extremo del mismo, como una gota, o como
una banda obtenida yuxtaponiendo una serie de gotas una al lado de la
otra. Se utilizaron pipetas capilares de enrase automático de capa
cidad entre 2,5 y 0/¿1. La cantidad puesta en el papel comobandafué, en las experiencias llevadas a cabo con sulfato de amonio como
solvente, de aproximadamente 0,01 ml por cm de ancho del papel, y en
la mayoria de las con alcohol de 0,005 ml por cm.
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Unavez aplicada la solución al papel, se puso siempre
en marcha inmediatamente la cromatografía sin dejar secar las gotas,
para evitar en lo posible la desnaturalización de las proteinas.
Extractos dg levadura.
La levadura de leche Saccharomvcesfragilis se cultivó
y se secó al aire, según el método de Caputto et al. (15).
Se usó además levadura de cerVeza marca Palermo, secada
al aire a temperatura ambiente.
El jugo de Lebedev de cualquiera de las dos levaduras
se preparó en la siguiente forma: se suspende la levadura seca en
tres veces su peso dd una solución de fosfato de amonio 2,2% y se de
ja una hora a temperatura ambiente, agitando de vez en cuando, Luegose deja en la heladera 1-2 dias. Entonces se centrífuga a 4-5000
r.p.m. y se decanta el sobrenadante, que contiene las enzimas extraidas.
Para la cromatografía se utilizaba generalmente el ex
tracto dializado en capa fina por tubos de celofán 4-5 horas contra
agua, en la heladera.
¡n8
Experimentos preliminares
Los primeros experimentos se llevaron a cabo por el mé
todo de ascenso capilar (16 y 17, ver fig. 1). Comosolución de pro
teinas a fraccionar se utilizó un extracto de Lebedevde_g¿_fragilis.
Las tiras de papel eran en este caso de 4 cm de ancho por 40 cm de
largo. La solución fué aplicada al papel comogota o banda, según el
experimento.
Se ensayaron varios reactivos paracrevelar'las proteinasL
entre otros la ninhidrina, el reactivo de Folin y Ciocalteau, el dePauly, 9to.; pero con resultados muypoco satisfactorios; 1a reacción
más sensible fué la de la ninhidrina, llevada a cabo en la mismafor
ma que para la cromatografía en papel de aminoácidos (l), pero se ob
tuvieron coloraciones muydébiles (').
Con este método se ensayaron primero papeles impregna
dos con Al(OH)3 según Datta et al. (18), usando agua comosolvente yluego papeles no impregnados usando buffers de fosfato comosolventes.
En todos los casos apareció sólo una mancha o banda de proteinas, no
habiéndose éstas aparentemente separado entre si.
Estos resultados sin embargo son dudosos, debido a 1a
ineficiencia ya señalada de los métodos de revelado. Se resolvió por
lo tanto utilizar para ese fin la banda de absorción que presentan
las proteínas cerca de 280 m/L(19).Se procedió de la siguiente manera: una vez desarrollado
el cromatograma, el papel fué cortado en tiras transversales de 2 cm
de ancho. Cada tira fué colocada en un tubo de ensayo de 8 m1, al
cual se agregaron 3,5 ml de buffer de fosfatos de Sórensen (20) de
(') La reacción con azul de bromofenolapareció en la literatura cuando esta investigación se hallaba muchomás adelantada.
/A
Fig. 1 - Aparato para cromatografía por ascenso. A: cilindrode vidrio. B: tapa de vidrio. P: línea de partida.S: solvente.
DEnsIDADOPTICA
Zoorn
I
origen "‘ch
Fig. 2 - Distribución de proteínas en el papel. Cromatografíade extracto de Lebedevde S fra ilis con gradientedeóSO4(NH4)2. Concentracian inicial: 33%de saturaci n.
_ 9
pH 6,5. Se extrajo asi el papel durante 12 horas, agitando de vez en
cuando, y luego se midió la densidad óptica de la solución a 280 Elf“en el espectrofotómetro de Beckman. Representando luego la densidad
óptica en función de 1a longitud del papel, se obtiene un gráfico quemuestra la distribución de proteina en el mismo(ver fig. 2). Antes
de representar cada lectura hay que restarle la del blanco, obtenido
extrayendo un trozo de papel igual a los otros, pero sin proteinas.
Este métodoes mejor que los anteriores, pero deja bas
tante que desear en cuanto a sensibilidad. Se lo utilizó sin embargo
en algunos experimentos que se efectuaron para producir en el papel
un gradiente de SO4(NH4)2,análogo al obtenido por Mitchell et al.(9) en la cromatopila.
_10_
Cromatografias con gradiente de SO4(NH¿)2.
Métodos
Dispositivos para la cromatografía.
En la fig. 3 está representado el primer dispositivo
armado para este fin, que llamaremos dispositivo I: A es un tubo de
ensayo comúnque fué cortado por la mitad aproximadamente y al cualse hizo además un reborde. B es un tubo de vidrio abierto en los dos
extremos, en uno de los cuales se adaptó el taponcito de algodón C,
B es mantenido vertical en el centro de A por medio de un corcho ho
radado y todo el conjunto se sostiene por el reborde de A en un agujcro practicado en la tablita de maderaD. A lo largo de una arista
de la mismacorre la varilla de vidrio E, que está asegurada a la tablita por medio de dos gomitas. El tubo B contiene una solución de
sulfato de amonio de cierta concentración y en el espacio entre B y A
hay agua. La comunicación entre la solución y el papel es estableci
da por medio de una mecha compuesta de varias tirillas del mismopapel de filtro ( F ), unidas unas a otras con broches metálicos. Toda
la instalación se encuentra dentro de un caño de cemento G, cerradopor una tapa de vidrio. A1 difundirse la solución salina por‘la me
cha y el papel, baja el nivel en el tuho B y para restablecerlo entraagua de A, diluyéndose asi la solución. Este proceso se renueva cons
tantemente, determinando que lleguen al papel soluciones de SO4(NH4)2cada vez más diluidas.
Para controlar la eficacia del sistema, una vez efec
tuada la corrida, se cortó el papel en tiras transversales de 2 cm.Se extrajeron con agua o buffer ( se usaron eventualmente los mismos
extractos que servían para la determinación espectrofotométrica de
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LONGH'UD PáDEL cm
Fig. 4 - Distribución de Stivo I.ración.
o (NH )En el tubfi B 4 2
0ua Az * ¡4* Ca Q 300g 0Co .u F 0'. :3 no L /
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en el papel, usandodel mismo SO4(NH4)2 33%de satu
Dispositivo I para producir gradiente de SO4(NH4)2.
el disposi
_+14
extracto con el reactivo de Nessler. Contrariamente a lo esperado noproteinas) y se valoró el contenido en NI de una alícuota de cada
se obtuvo un gradiente continuo, sino una curva con un máximo(ver
fig. 4). Parece que el agua se difunde más rápidamente que la sala través del papel. La comprobación se efectuó haciendo una cromato
grafía por ascenso "en blanco", es decir sin colocar substancias en
el papel, y utilizando comosolvente una solución de sulfato de ame
nio al 40%de saturación (sin producir gradientes). Al determinar
luego la concentración de la sal en el papel se obtiene una curva que
está representada en la fig. 5: la concentración del sulfato de amo?nio disminuye desde el punto de partida hasta el frente del solvente.
Un efecto similar ya habia sido encontrado por Horne y Pollard (16)
y recientemente por Reid (6). Hay que advertir sin embargo que los
resultados obtenidos pueden atribuirse en parte al hecho de que el
papel está generalmente mas cargado de líquido (y por lo tanto de sal)cerca de la superficie del solvente que cerca del frente de avance.Para decidir definitivamente seria necesario determinar no sólo la
cantidad de sal sino también la de agua, en función de la longitudde papel.
Para tener un mejor control de las condiciones y sobre
todo una variación más rápida en la concentración del sulfato de amo
nio, fué ideado el aparato representado en la fig. 6, que sera llama
do dispositivo II: A es un tubo de vidrio de_unos 8 cm de ancho y 40de alto. Está cerrado arriba por 1a tapa de vidrio B y abajo por el
cierre hidraulico que efectúa el mismosolvente.. El papel está col
gado de la varilla C sostenida por dos corchos contra las paredes del
tubo A. Este a su vez está sostenido por una abrazadera unida a unsoporte, que no está representada en 1a figura. Para evitar en lo po
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Fig. 5 n Distribución de SO4(NH4)2en el papel en cromatografía"en blanco".
al Frasco deMarïotte
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Fig. 6 - ‘Dispositivo II para producir gradiente de SQ4(NH4)2.
sible que la tira de papel sea afectada por el movimientodel solven
te, se le agregaron comopeso dos portaobjetos (D), unidos por una
gomita, y separados al mismotiempo del papel por medio de dos tiras
finas de caucho. En el vaso V se coloca el SO4(NH4)2concentrado,mientras que el agua cae desde el tubo E, que está conectado con un
frasco de Mariotte, no dibujado en la figuraa para que la Velocidad
de salida sea constante. Esta velocidad se puede regular con la pinza de MohrF. El aparato está provisto ademas de un nivel constante
G, y de un agitador eléctrico H que uniformiza la concentración de lasolución.
La concentración de sulfato de amonio en el papel también aqui presentó un máximo(ver fig. 7), que no se puede atribuir
en este caso a imperfecciones del aparato. Por otra parte la concen
tración de sulfato de amonioen el solvente llegó, con 1a velocidad
de pasaje del agua de 3 m12min, desde el 60%de saturación hasta casi
ccro al finalizar la experiencia que duraba de 3 a 4 horas. En el
papel la concentración de SO4(NH4)2tiene una variación máximade 1a lO aproximadamente.
Determinaciones de actividad enzimática.
Se procedió de la siguiente manera: el papel se subdivide con trazos suaves de lapiz en la forma indicada en la fig. 8.
A lo largo de la linea PP‘ se coloca una banda de 1a solución de enzimas en la forma explicada en la pág.6. Unavez efectuada la corri
da, se retira el papel y se lo deja secar parcialmente a temperatura
ambiente; cuando todavia está húmedose lo corta cn trozos según las
lineas trazadas de antemano. Cada uno de los trozos de la tira "a",
cortado en pedacitos más pequeños, se coloca en un tubo de ensayo de
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Fig. 7 - Distribución de SO4(NH4)2en el papel, usando el dispositivo II. Concentración inicial de SQ4(NH4)2:40 %de saturación.
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Fig. 8 - Forma en que se subdivide el papel para las determinaciones de actividad enzimática.
y8 ml. al cual se agrega el substrato. nos trozos de la tira "b" se
colocan en sendos tubos con agua, como blancos. Se incuban todos los
tubos un cierto tiempo a 379 C y luego se determina la cantidad de
substrato transformada en cada uno. Ademásen un tubo se coloca el
substrato sin enzima para medir el valor del blanco del mismo. Se
puede luego representar la actividad enzimática en función de la longitud del papel, según se observa por ejemplo en la fig. 9.
Para valorar más de una enzima a la vez, basta usar
un papel más ancho y recortar una tira mas, colocando los trozos en
el substrato que corresponda. Las dimensiones dadas en la figura no
se han mantenido siempre iguales, sino se las ha variado según el
experimento efectuado. Por ejemplo, para valorar fosfoglucomutasa e
invertasa a la vez se usó un papel de 7,5 cm de ancho, que fue corta
do después de la corrida en 4 tiras longitudinales, de las cuales una
se destinó para determinación de fosfoglucomutasa, una para la inver
tasa, una para blanco y otra para SO4(NH4)2y proteinas (con las pequeñas cantidades de enzimautilizadas esta última determinación re
sultaba muydudosa). Cada tira fué cortada, comoya se explicó, en
trozos transversales, pero en este caso los trozos fueron de 3 cm
de ancho para no hacer demasiado laboriosa la determinación (aún asi
hacian falta por lo menostreinta tubos de ensayo cada vez).
Conel dispositivo I (fig. 3) se hicieron cromatogra
fías con determinación de actividad de fosfoglucomutasa y con el II
de fosfoglucomutasa e invertasa.
La fosfoglucomutasa transforma el glucosa-l-fosfato
en glucosa-G-fosfato (21) en presencia de Mgy de glucosaylyóedifosfa
tótzá),su coenzima. Comoel glucosa-G-fosfato es reductor, mientrasel glucosa-l-fosfato no lo es, se puede seguir la reacción midiendo
la reducción que aparece. El método seguido fue el ya empleado para
la mismaenzima por Cardini et al. (22), que utilizan los reactivos
de Somogyiy de Nelson para la determinación colorimétrica del poder
reductor, efectuando las lecturas con un fotocolorimetro de KlettSummersoncon filtro 52.
La enzima se inactiva en buena parte por el solo hecho
de ser puesta sobre el papel. Para reactivarla se ensayó el CNK,Se
aplicaron gotas de 0,02 ml de jugo de Lebedevdializado de S, fragi
lig diluido al á, sobre trocitos de papel; luego se colocaron los pa
peles en sendos tubos de ensayo y se agregó el substrato: éste estaba
compuesto en todos los casos por 64LMde glucosa-l-fosfato, 6ÁLMdc
Mg“, 5 x lO'é/VMde glucosa-1,6-dífosfato; además en los tubos conCNKla concentración final de éste era 0,01 M (el CNKfué neutraliza
do antes de agregarlo). Volumentotal 0,6 ml. La incubación a 3790
duró 15 minutos y la reacción se detuvo agregando 1,5 ml de reactivode Somogyi; luego se determinó reducción con el método ya indicado.
Al mismotiempo se efectuaron ensayos paralelos de actividad con la
mismacantidad de enzima, pero puesta en solución y no sobre papel.
Los resultados, representados en el cuadro I, demuestran que el CNKrestituye buena parte de la actividad. Por lo tanto la mezcla ya in
dicada, con el agregado del CNK,fué la utilizada para valorar fosfo
glucomutasa. El tiempo de incubación fué por lo general de 40 min.
a 37Q C.
En los experimentos efectuados con el dispositivo II
la mezcla de reacción fué algo diferente: habiéndose comprobadoque
la concentración del substrato estaba en gran exceso, se la disminu
yó. Comoactivador se agregó en vez de CNK,bistidina (23), que esmuy efectiva y tiene poco blanco de reducción. La mezcla usada era
Cuadro I
Eggetivación de Fosfoglucomutasa con CNK
Procedimiento descripto en el texto. Los números indican /a,Mde substrato transformado.
Sin CNK Con CNK
En solución 1,04 1,09
Sobre papel 0,52 0,84
pués la siguiente: Z/I Mde glucosa-l-fosfato, 1 x lO-é/l Mde gluco
sa-l,6ddifosfato, ZfiLMde 804Mgy 1,2/u Mde histidina. Volumentotal 0,6 ml.
En los casos en que se determinó actividad de inverta
sa el substrato estaba compuesto de 1 Mde sacarosa en 0,6 m1 de
agua. Lc glucosa y levulosa liberadas por la acción enzimática se
valoraron por reducción, con el mismométodo usado para la fosfoglucomutasa.
Estos métodos de determinación de las dos enzimas se
mantuvieron iguales prácticamente en todas las experiencias siguientes.
Preparados enzimáticos.
Con el diSpositivo I se corrió extracto de Lebedevde
Saccharomces fra i is, dializado, cuya preparación ya fué descripta.Con el aparato II la solución de enzimas empleada fué
en algunos casos la anterior y la mayoría de las veces en cambio/1afracción de proteínas de un jugo de Lebedev de levadura de cerveza,
que precipita entre 50 y 75%de saturación de sulfato de amonio y que
contiene la mayorparte de la actividad de fosfoglucomutasa e inverta
sa. Esta modificación se efectuó con el objeto de tener una prepara
ción de enzimas algo móseoncentrada y también parcialmente purificada. Se usó levadura de cerveza marca Palermo, secada al aire. El
fraccionamiento se efectuó de la siguiente manera: a un extracto de
Lebedevdializado, preparado según lq técnica ya indicada, se agregó
SO4(NH4)2sólido hasta 50fl de saturación. Se eentrifugó y se separó
el sobrenadante al cual se agregó mas SO4(NH4)2sólido hasta alcanzarel 75%de saturación. Se filtró en la heladera por papel plegado y
se suspendió el precipitado en una pequeña cantidad de agua (alrede
dor de l}10 del volumenoriginal). Se dializó por 5-6 horas en capa
fina, por tubos de colofón, contra agua en la heladera con 4-5 cam
bios de agua en el tiempo indicado. En esta diálisis el volumen de
solución aumenta bastante, de 2 a 3 veces por lo general. La solu
ción obtenida, cuya actividad en fosfoglucomutasa e invertasa es al
go mayorque la original, se utiliza directamente para la cromatograffa.
Resultados.
Con el aparato I se efectuaron varios ensayos, dos delos cuales estan representados en las figuras 9 y lO. Los gráficos
parecen indicar que la fosfoglucomutasa tiene más de un componente;
pero 1a actividad residual es tan pequeña (debido probablemente a la
acción inhibitoria de altas concentraciones de sales (21), sulfatode amonio en este caso) que poco se puede deducir de estos resulta
dos, exeepto el hecho de-que la enzima se mueve en el papel y que es
te movimientoparece depender de la concentración inicial de sulfato
A0,4 .
rHSUBSTRATOTRANSFOHHADO 1”’/5‘ ¡o I: ' ¿o ¡
ong‘an ¡renfeLOHGATUD PADEL cm
Fig. 9 - Cromatografía de Jugo de Lebedevdializado de S,fragilis.Actividad de fosfoglucomutasa. Concentración inicial deSO4(NH4)2: 30 %de saturación.
0,2
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3 o 1< .ct¡_lna:Dm \E l l ——o__ok 5 ¡o ¡5 ,origen rrcnicLONGITUD PAPEL cm
Fig. 10- Cromatografía de Jugo de Lebedevdializado de S,fragilis.Actividad de fosfoglucomutasa. Concentración inicial deSO4(NH4)2: 45 % de saturación.
de amonio en el tubo B (ver fig. 3), comopor otra parte podia eSperarse.
Con el dispositivo II se corrió primero el mismoex
tracto de Lebedevde S. fragilis con determinación de actividad de fos
foglucomutasa: en una serie de experiencias en las cuales la concen
tración inicial de SO4(NH4)2era de 40%de saturación, la fosfoglucomutasa dió la mayor parte de las veces un solo pico de actividad y
no dos comoen los casos anteriores.
A continuación se efectuaron corridas con determina
ción de dos actividades enzimátidas contemporáneamente: las de fosfo
glueomutasa e invertasa, usando el extracto de levadura de cervezacuya preparación se ha descripto en la pág. 15 . En la fig. ll se
pueden ver los resultados de dos de estos experimentos: mientras la
fosfoglueomutasa se muestra muypoco activa y no da un pico bien de
finido, la invertasa da uno o dos picos de actividad (ver más adelante, pág. 25 ).
Comola inactivación de las enzimas, especialmente de
la fosfoglucomutasa, era muygrande, debido probablemente en gran
parte a la acción inhibitoria del sulfato de amonioen alta concen
tración, lo que hacía dificil una interpretación de los resultados,
no se siguió experimentando con este método. Se comprueba, sin em
bargo, que por medio de un gradiente de sulfato de amonio y variando
la concentración inicial de la sal, las enzimas pueden moverse más o
menosen el papel, dando en varias oportunidades picos definidos deactividad.
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Fig. 11 - Cromatografía de extracto purificado de levadura de cerveza. Linea llena: actividad de fosfoglucomntasa. Líneade puntos: actividad de invertasa.
a) Concentración inicial de SO4(NH4)2:40%de saturación.b) n n n u 60% n n
Cromatografias con mezclas etanol-agua y etanol-buffer
La introducción de los solventes orgánicos miscibles
con agua en los métodos de separación de las proteinas ha significa
do un notable progreso en estos últimos, especialmente en cuanto se
refiere al fraccionamiento de las proteinas del plasma (ver p. ej.24).
Los solventes organicos muestran a menudoespecifici
dad muchomayor comoagentes de precipitación, que las sales minera
les. Sin embargotienen la propiedad de desnaturalizar las proteí
nas, con velocidad tanto mayor cuanto mayor sea la temperatura a lacual se trabaja. De ahi que sea necesario, al utilizar el alcohol
etílico o la acetona, hacerlo a temperaturas alrededor o a veces a
menos de 09 C, según la concentración del solvente.
Se pensó que, en la misma forma que era posible usar
el sulfato de amonio tanto comoagente precipitante, cuanto comosol
vente en cromatografía sobre papel de proteinas, podría también verificarse lo mismocon respecto al alcohol o la acetona.
Métodos
Dispositivos para la cromatografía.
Se adoptó el método de ascenso capilar. Comoreel-
pientes de cromatografía se utilizaron probetas de l ó 2 litros (se
gún el tamaño de los papeles) cerradas con una lámina delgada de cau
cho A (ver fig. 12), apretada con una gomita. El solvente estaba contenido en el fondo de 1a probeta. Por medio de dos cortes practica
dos en la parte inferior del papel, se le adaptó una varilla de vidrio, B, que lo mantiene vertical, por su peso. Para asegurar la sa
—19_
turación del ambiente se pegó a la pared interior de la probeta unatira de papel de filtro C, mojada con el solvente. La probeta se de
jaba en la heladera por toda la duración de la cromatografía, a una
temperatura de aproximadamente490, para evitar en lo posible la desnaturalización de las proteinas.
Papeles.Las tiras de papel fueron de varias medidas en ancho
y de unos 35 cm de largo.
Para la impregnación de papeles con buffer se procedió
de la siguiente manera: se sumerge el papel en el buffer por algunossegundos, se escurre y se cuelga a secar a temperatura ambiente. Los
papeles fueron impregnados en todos los casos en que los solventes
eran mezclas de alcohol y buffer.
Solventes.
Mezclasalcohol etílico-agua y alcohol-buffer, de va
rias concentraciones. Los buffers de fosfato fueron los de Sarensen(20) de concentración M}15. El buffer de maleato se preparó según
Smits (25).
T iempo de desarrollo de los cromatogramas.
Mientras que con las soluciones de sulfato de amonio
el solvente recorría 25 cmdel papel en unas 4 a 6 horas, con las soluciones alcohólicas se tenían tiempos de desarrollo que variaban en
tre 10 y 16 horas, aumentandoproporcionalmente a la concentraciónde alcohol en la mezcla.
Técnica de la cromatografía.
Fué en general similar a la ya descripta para los ca
sos anteriores. Las soluciones enzimáticas o de albúmina fueron a
plicadas a1 papel comobandas.
Valoración de actividad enzimática.
El método para la determinación de fosfoglucomutasa
e invortasa fué generalmente idéntico a1 utilizado en las corridas
efectuadas con gradiente de sulfato de amoniocon el dispositivo II(ver pág. 14 ).
En los casos en que se midió actividad de maltasa no
se pudo usar el reactivo de Somogyi, que es reducido por la maltosa.
Se recurrió por lo tanto al reactivo de Barfoed, modificado por Caputto et al. (15). Ademasno conviene comosolvente alcohol con bu
ffer de fosfato, porque el fosfato en altas concentraciones interfiere con el reactivo citado. Se tuvo que efectuar pues la cromatografía con mezcla de alcohol y buffer de maleato. Se comprobóprevia
mente que el extracto de enzimas utilizado (fracción del extracto de
chedev de levadura que precipita entre 40 y ¿5%de saturación de
sulfato de amonio: ver más adelante) contenía maltasa, y que el buffer de maleato no interfería en la determinación. Para eso se colo
có una gota de 0,0024 ml del extracto sobre un trocito de papel de
filtro de 2 x 3 cmy otra sobre un papel igual, pero impregnadopreviamente con buffer de maleato. Cada uno se incubó durante 30 minu
tos con 0,6 m1 de una solución de maltosa que contenía l/¿M del azúcar. La reacción se detuvo agregando 1,5 m1 del reactivo de cobre y
luego se efectuó la valoración del poder reductor. La cantidad de
substrato transformado fué 1a mismaen los dos casos, 0,33”; M. Porlo tanto la enzimaes activa y el buffer no afecta los resultados.
Para determinar maltasa después de cromatografía se
procedió en la forma 1a descripta para las otras enzimas, colocando
en cada tubo l/lM de maltosa disuelto en 0,6 m1 de agua.En los ensayos para averiguar si se hallaba presente
a sacarosa-fosforilasa, se utilizaron dos series de tubos (comoengeneral en la valoración simultánea de dos enzimas): en una serie el
substrato era lfLM de sacarosa en 0,6 ml de agua. En la otra se habia agregado además a cada tubo un buffer de fosfato de Sórensen de
pH 6,5 en cantidad tal que contenía 3/L Mde P: el volumen total
era aquí también de 0,6 ml. En las dos series se determinó activi
dad de invertasa con el método general.
Para medir actividad de rafinasa, se empleó también
el método de reducción, ya que la rafinosa no es reductora (la droga
comercial que se utilizó tenía sin embargobastante blanco de reduc
ción) mientras que si lo son sus productos de descomposición por lainvertasa, es decir melibiosa y fructosa. El substrato estaba cons
tituido por 6/1 Mde rafinosa en 0,6 ml de agua. El tiempo de incubación fué más largo que con sacarosa: 2 horas, porque la enzima eramenosactiva con rafinosa.
Soluciones de proteinas ensaxgdas.
La albúmina cristalina humanafué disuelta en agua enla concentración del 3%.
La fracción de jugo de Lebedevde S, fragilis que pre
cipita entre 40 y ¿5%de saturación de sulfato de amonio se aisló en
forma exactamente similar a la descripta para la levadura de cerveza
en la pág.15ynsig., excepto por los diferentes limites de concentración de la sal.
Con el mismométodo se preparó la fracción de Lebedev
de levadura de cerveza que precipita entre 45 y 60%de saturación de
sulfato de amonio.
Experimento cara determinar los productos de reacción en los dos p —cos de acüividad de invertasa,
Se efectuó una cromatografía en la forma habitual con
buffer de fosfato y alcohol (20%)y otra con buffer de maleato y a1cohol (25%). Se recortaron de cada papel dos trozos, cada uno de
los cuales se sabía por experimentos anteriores que correspondía aun pico de actividad. Cada trozo de papel se colocó en un tubo de
ensayo que contenía 7 ml de solución de sacarosa de 3fl.M/ml y se in
cubaron los 4 tubos por 3 horas a 379 C. Se detuvo la reacción coagulando las proteínas por calentamiento en bañomaría hirviente. Se
decantaron los líquidos resultantes de la incubación y se midió el
poder reductor de cada uno para determinar la cantidad necesaria pa
ra la sucesiva cromatografía. Se evaporaron luego a sequedad 2 ml
de cada solución en sendas concavidades de una placa de toque sobrebañomaría hirviente. Se agregó alrededor de 0,01 ml de agua a cada
residuo para redisolverlo y se procedió finalmente a efectuar la
cromatografía de estos extractos utilizando la técnica de descenso.
El solvente fué una mezcla de pitidina, acetato de etilo y agua, pre
parada según Jermyn e lsherwood (26). Se usó papel WhatmanNQl entiras de 4 em de ancho. La solución a cromatografiar fué colocada
en la línea de partida en forma de una banda de alrededor de l cmde ancho, por medio de una pipeta capilar. Con la mezcla ternaria
utilizada los Rf de los azúcares son muybajos y es necesario permitir que el solvente corra más allá del extremo del papel. Para eso
se unió a éste por medio de broches metálicos una almohadilla absor
_ 23
bente de papel secante. Comocon esta instalación no es posible cal
cular directamente el Rf de las substancias, fué necesario agregara cada papel, en el punto de partida, una banda de solución al 1%de
xilosa, que corre más que las hexosas y por lo tanto no molesta dan
do manhhusmezcladas con las de los otros azúcares, y sirve ademas co
mopunto de referencia: luego de desarrollados y revelados los croma
togramas, se mide la distancia desde el origen hasta el centro de ca
da manchaobtenida y se calcula para cada una de ellas el
distancia desde el origen hasta el centro de la manchaIi " u u n n u u n n n u de xi_
Se pueden luego comparar entre si los in comosi fue
ran RÍ, e identificar los distintos azúcares. Para esto último, enuna de las tiras de papel se colocó una banda de una solución que
contenía glucosa, fructosa, sacarosa y xilosa en la concentración del1%de cada uno, como patrones.
Para el revelado de glucosa y xilosa se pulverizó so
bre los papeles el reactivo de ftalato de anilina en butanol, segúnPartridge (27), calentando luego 10 minutos en la estufa a 105Q3. Para la revelación de fructosa y sacarosa se usó el reactivo de resor
cina en ClH según Forsyth (28), calentando en 1a estufa a 85-909 C
tres o cuatro minutos, hasta aparición del color. Para poder revelar
un mismopapel con los dos reactivos, se lo cortó por el largo en dos
tiras, una de las cuales fue tratada con ftalato de anilina, y 1a otra con resorcina.
Resultados
Las primeras corridas explorativas se efectuaron con
-24...
albúmina cristalina humanay alcohol etílico acuoso de diferentes con
centracienes. Se determinó la distribución de proteinas en el papel
cen el método de la densidad óptica a 280 mflya descripto. Los resultados estan representados en los graficos de la figura 13. Comose
ve la albúmina se mueve en el papel comouna zona bastante estrecha,
cuyo Rf depende de la concentración de alcohol utilizada y es tantomayor cuanto menor sea ésta. Estos resultados nos indujeron a repe
tir los experimentos, pero con extractos de enzimas y mediciones deactividad.
Para los primeros se usó la fracción del jugo de Lebedev
de S, fragilis, que precipita entre 40 y 65%de saturación de sulfatode amonio. El primer solvente empleado fué alcohol 40%v}v. Se obtu
vieron dos picos de actividad de fosfoglucomutasa, pero con gran di
fusión de las zonas de actividad a lo largo del papel. Se intentó
entonces llevar a cabo cromatografias con mezclas de alcohol y bufferscomosolventes y con papeles impregnados con buffer (ver 29). La idea
era que la modificación continua del equilibrio de las diferentes for
mas iónicas de las proteinas podia ser responsable de las largas "co
las" observadas, y que utilizando buffers se estabilizaria el equilibrio acido-base. Los resultados de cromatografias con buffers de fos
fato de pH7 y alcohol de diferentes concentraciones están representados en los gráficos de las figuras 14, 15 y 16. Comose ve, es posi
ble, con una concentración adecuada de alcohol (20 ó 25%) separar
fosfoglucomutasa de invertasa en forma prácticamente completa.
Se ensayó entonces la separación de las mismas enzimas
de la fracción de jugo de Lebedev de levadura de cerveza que precipita entre 40 y 65%de saturación de sulfato de amonio. En la figura
17 se puede observar el resultado de una de estas experiencias: mien
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Fig. 13 - Cromatografias de albúmina cristalina de suerohumano.Solvente: (a) etanol 70%v/v; (b) etanol 50%v/v ; (c)etanol 40%v/ví.
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Fig. 14 - Cromatografía de extracto purificado de S fra ilis. Linea llena: actividad de fosfoglucomutasa. LÏnea de puntos:actividad de invertasa. Solvente: etanol 30 %v/v en buffer de fosfato de pH 7.
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Fig. 15 - Cromatografía comoen la fig. 14, pero con etanol 25%v/V en buffer de fosfato de pH 7.
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Fig. 16 - Cromatografía comoen la fig. 14, pero con etanol 20%v/v en buffer_de fosfato de pH 7.
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Fig. 17 - Cromatografía de extracto purificado de levadura de cerveza. Linea llena: actividad de fosfoglucomutasa. L neade puntos: actividad de invertasa. Solvente: etanol 25%v/v en buffer dc fosfato de pH7.
tras 1a fosfoglucomutasa se comporta análogamente á los otros casos,
la invertasa da aqui dos picos de actividad. Este hecho llamó inme
diatamente 1a atención: por otra parte, al utilizar extracto de leva
dura de cerveza en cromatografía con gradiente de SO4(NH4)2ya se habian observado dos picos de actividad (ver pág. 17 ). Después de con
firmar los resultados, se trató de investigar si las dos zonas de ac
tividad enzimática correSpondían o no a dos diferentes enzimas. Po
dian verificarse, en efecto, varias posibilidades:
19) Unade las dos enzimas podia ser invertasa y 1a otra una C¿- glu
cosidasa. Según la teoria de Weidenhagen(30), las glucosidasas
son especificas, existiendo una para cada tipo de unión glucosi
dica. Comola sacarosa es un fig-fructofuranósido de<)(-glucosa,puede ser atacada tanto por la invertasa que es una fig-fructosi
dasa, comopor 1a maltasa, que es unaCÍv-glucosidasa: cada enzima
atacaria la molécula en un extremo diferente, pero dando al final los mismosproductos de la reacción: glucosa y fructosa. Si
uno dc los dos picos de acción enzimática correspondiera a una
0(-glucosidasa y cl otro a una /3-fructosidasa, eso se podría poner de manifiesto utilizando comosubstrato un GÁ-glucósido: con
éste sc obtendría actividad en una sola zona del papel, mientrasque con sacarosa se desarrolla poder reductor en 1a reacción cnlas dos.
A causa de intcrfcrir el fosfato con la determinación
dc poder reductor, se intentó efectuar 1a cromatografía con mez
cla de alcohol y buffer de maleato 0,1 N a pH 6,5. Comose ve en
la fig. 18 el aspecto de 1a curva de actividad, con sacarosa comosubstrato es similar al obtenido con el otro buffer. Sin embargo
al efectuar las determinaciones con maltosa, después de la corri
da,
la,este substrato, posiblemente por acción del alcohol.
se observó que la actividad con este azúcar era prácticamente nu
es decir que se inactivaba totalmente la enzima que descomponia
Otras pruebas,
efectuadas con CK-metil-glucósido comosubstrato en vez que maltosa,dieron el mismoresultado.
COD.
2Q)
30)
Tuvo pues que ser descartada la hipótesis
la cual se habian conducido los experimentos.
Unode los dos picos de actividad podria corresponder a la inver
tasa y el otro a una sacarosa fosforilasa (31): esta enzimacata
liza la siguiente reacción:.4
sacarosa e fosfato <l._ glucosa-l-fosfato o fructosa
Esto no parece de antemano muyprobable, porque al uti
lizar buffer de maleato en la corrida, en vez de fosfato, al fal
tar este último en la mezcla reaccionante, no debia haber activi
dad en uno de los picos, lo que es contradicho por la experiencia (fig. 18). Sin embargose efectuó una cromatografía con bu
ffer de maleato y alcohol y la determinación enzimática se llevó
a cabo con dos series de tubos, a una de las cuales se habia a
gregado fosfato. Comose ve en la figura 19, las dos series dieron un resultado prácticamente idéntico. Se descartó pués bam
bién esta hipótesis.
Suponiendoque se trate de dos/g-fructosidasas muyparecidas, podria ser que estas difirieran en su actividad con diferentes
/3 -fructósidos comosubstratos. Se valoró por lo tanto la actividad enzimática después de cromatografía con buffer de maleato
y alcohol, usando comosubstratos sacarosa y rafinosa; esta últi
maes el [6-9‘ -galactopiranosil- 0€-D-glucopiranosa] fi-D-fruc
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Fig. 18 - Cromatografía de extracto purificado de levadura de cerveza. Actividad de invertasa. Solvente: etanol 25%v/ven buffer de maleato de pH 6,5.
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Fig. 19 - Cromatografía de extracto purificado de levadura de cerveza. Linea llena: actividad con sacarosa. Linea de puntos: actividad con sacarosa o fosfato. Solvente: etanol25%v/v en buffer de maleato de pH 6,5.
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Fig. 20 - Cromatografía de extracto purificado de levadura de cerveza. Línea llena: actividad con sacarosa. Línea de- untos: actividad con rafinosa. Solvente: etanol 25%v/Een buffer de maleato de pH 6,5.
- 27 _
tofuranósidc y contiene por lo tanto la unión de fiZ-fructósido. La
fig. 20 muestra las curvas obtenidas en uno de estos experimentos. Co
mose ve las curvas con los dos substratos son similares. Se obtuvie
ron 1as actividades totales de cada uno de los picos sumandolos valo
res individuales correspondientes, y se vió que la relación de activi
dad entre el 19 y el 29 pico era aproximadamente la misma (entre 1,5 :
l y 1 : 1) en los dos casos.
En cambio, a1 correr la enzima con buffer de fosfato y
alcohol (20%v/v), se observó en tres experimentos efectuados que,
mientras que con sacarosa el primer pico (el mas lento) era más acti
vo que el segundo (relación de actividad aproximadamente2: 1), con
rafinosa sucedía al revés (la relación era aproximadamentel: 3).
La explicación de este hecho no es clara y no parece ser sencilla.
Para asegurarse finalmente que los productos de la redcn
ción con sacarosa eran los mismos para las dos zonas de actividad y
con cualquiera de los dos buffers, se los identificó por cromatografía
de papel. Los detalles experimentales se hallan en la pág. 22 . Se
tenian 4 papeles, cada uno de los cuales correspondía a uno de los pi
cos con uno de los buffers. En cada papel aparecieron dos manchas de
cetosas, una de aldosa y una de pentosa, esta última proveniente de
la xilmsa agregada. Se calcularon los in para cada mancha, que estánrepresentados en el cuadro II. Comose ve, en los 4 liquidos resu1-tantes de la incubación había sacarosa (substrato no transformado) glu
cosa y fructosa. Se compruebaasi que los dos picos corresponden con
toda probabilidad a actividades de invertasa.
923222.2;
Identificación de los Producto; de la Rgocción gg_
Procedimiento explicado en el texto.
los dos Picos de Actividad de Invertasa
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II
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¡Mancha NQl
Z no
Z IO
{Sacarosal
¡Glucosa
.Fructosa
inlosa
RColor Color Xi
con con .ftalato resorcina P100 I P100 II
Buffer Buffer Buffer Bufferlfosfato malea- fosfato malea
to to
- rosado 0,49 0,51 0,50 0,38
marrón — 0,66 0,65 0,65 0,65
- rosado 0,74 0,75 0,75 0,77rojizo gris azu
lado l 1 l 1
— rosado 0,52
marrón - 0,68
- rosado 0,78
rojizo gris azu- glado 1 '
Cromatografíá de proteínas del suero y plasma
¿l aparecer en la literatura reciente algunos métodos
sensibles para revelado de proteínas en el papel, se pudo extender el
presente trabajo al estudio de 1a posibilidad de separar cromatografí
camente las proteínas del plasma.
Dispositivo para la cromatografía.
En general se usó el mismoque para la cromatografía de
enzimas: método de ascenso y comorecipientes probetas de 1 ó 2 litros,
mantenidas en la heladera. Cuando se ensayaron gradientes de SO4(NH4)2se empleó el aparato I.
Papeles.
Los papeles tenían un ancho de 4 cm cuando se corría
una sola muestra y de 7,5 cm cuando se corrían 3 muestras a la vez.
En todos los casos en que el solvente contenía buffer, el papel se im
pregnó con este, según la técnica ya descripta en la pág. 19.
Solventes.
Las mezclas de alcohol etílico-agua fueron de varias
concentraciones. La acetona se usó en la concentración del 30%v}v,
Los buffers de fosfato y de maleato fueron los mismosque se utiliza
ron para la separación de enzimas. El buffer acético-acetato se obtuvo mezclando soluciones O,l N de ácido acético y acetato de sodio.
Técnica de cromatografía.
Las soluciones de proteínas fueron depositadas en el pa
pel en gota o en banda, según el método ya descripto. Las gotas fue
ron de 5/¿ l.El solvente se dejaba subir unos 20 a 25 cm, lo que tar
daba diferente número de horas según el solvente empleado (ver pág.19)
Luegose sacaba el papel de la probeta, se marcaba con lápiz el fren
te del solvente y se secaba durante 5 minutos en la estufa a lOOQC.
Revelado.
Se usó el método de Durrum (ll), que consiste en sumer
gir por 5 minutos el papel en una solución alcohólica saturada de
Cleg que contiene un 0,1% de azul de bromofenol; luego el papel se
lava en agua corriente hasta que haya desaparecido el color azul delas partes donde se sabe que no puede haber proteínas. Los sitios
donde se encuentran éstas quedan coloreados en azul sobre fondo blan
CO.
Soluciones de proteinas ensalada .
Albúmina cristalina de suero humano: solución al 6%.
8 -globulina de suero de caballo: solución al 2%.Plasma de caballo: se obtuvo haciendo sedimentar sangre
oxalatada.
Suero humano: dejando coagular sangre normal y centri
fugando.
Suero de conejo: se obtuvo por centrifugación de sangre
desfibrinada.
Separación de albúmina y globulings del suero de conejo.
A 5 m1 de suero de coneáo se agregó igual volumen de so
lución saturada de sulfato de amonio; se centrifugó, se separó el sobrenadante (fracción I) y se redisolvió el precipitado en 4 ml. de
-31_
agua. Se repitió la precipitación con SO4(NH4)2a 50%de saturación(concentración final) y la mismase efectuó dos veces más. El últi
mo precipitado se disolvió en unos 2 ml de agua y se dializó por tu
bos de celofán contra buffer de fosfato de Sórensen de pH 6,5 unas
18-20 horas en la heladera. Durante la diálisis una parte de las pra;
teinas precipitó. Se agregó entonces P04H2Ken pequeñas porciones
hasta redisolución casi completadel precipitado. Para Clarificar
la solución algo opalescenté, 99 Géflüïífufió’ el líquido Obtenido con"
tiene prácticamente todas las globulinas: el volumenfinal fué de
5,2 m1.
A la fracción I se agregó solución saturada de sulfato
de amoniohasta llegar a una concentración final del 75%de satura
ción. Se filtró por papel plegado y el precipitado se redisolvió
en el menorvolumen posible de agua y luego se reprecipitó llevándolo
de nuevo a 75%de saturación con solución saturada de sulfato de amo
nio. Se filtró, se redisolvió el precipitado en 1-2 m1de agua y se
dializó por 6-8 horas contra agua en la heladera. La fracción obtenida contenía la albúmina. El volumen final fué de 2,4 ml pero no
se llevó a los 5 ml originales porque al sacar los precipitados delos filtros se produceninevitables pérdidas de material.
Naturalmente cada una de las fracciones queda contaminada con pequeñas cantidades de la otra.
Resultados.
Mezclasalcohol etílico-agua.
Se observó en general con el suero o el plasma, que
una parte de la proteína quedaba en el origen o se movía muypoco,
dando una estría más o menos alargada, mientras que otra parte se mo
vía con mayor o menor rapidez, dando una mancha, que coincidia apro
ximadamentecon la de albúmina: esta última no dejaba estria en el
origen (ver fig. 21).La hipótesis más probable era que la estría en el ori
gen correspondía a las globulinas y la manchaa la albúmina de sueroo plasma. Comose verá más adelante, esta hipótesis fué comprobada.
La mancha de albúmina va variando su Rf según la con
centración de alcohol; también varia su forma, y se hace tanto más
alargada y difusa, cuanto más diluido es el alcohol. Ademásla al
búmina, cuando se corre suero o plasma enteros, tiene un Rf menor
que cuando se corre sola. La confirmación de este hecho y su probable eXplicación se tratarán más adelante ( pág. 43 ).
El cuadro III muestra los Rf de albúmina en diferentes
condiciones. La albúmina cristalina corrida con alcohol 40%v/v da
origen a 2 manchas, una de szzg 0,1 y la otra de Rf.C!LO,60. Estono ha tenido explicación hasta el momento.
Se observó además, y esto es general, también para los
solventes de los cuales se tratará más adelante, que, aún en el caso
en que se corre una proteina presumiblemente pura, comola albúmina
cristalina, se produce, además de una manchamás o menosnítida,
una especie de larga "cola", o sea una estria, que va desde el punto
de partida hasta 1a mancha, y que muestra una débil coloración azula
da, comosi la proteina al avanzar dejara una especie de reguero tras
si. Esta cola es muchomás pronunciada cuando se corre suero, quecuando se corre albúmina sola. (ver fig. 24).
Por lo que se refiere a las globulinas, el comporta-
miento de éstas varia sólo en cuanto la estria que originan se hacetanto más larga cuanto más diluido es el alcohol. Sin embargo no
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l \\ÑQÓQÉ% S
} “¿en¿msgid-i ® [Lanín
Í ,'7’]Ï'yl ,7",' 73% í
Fig. 21 - (a) Cromatografía de albúmina cristalina. Solvente: etanol 30%V/v. R = 0,68. (b) Cromatografía de suero hu—mano. Mismosolvente que en (a). R de la mancha de albúmina = 0,67. El rayado representa aproximadamente laintensidad de coloración de las manchas.
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‘17“)r
Fig. 22 a Cromatografía con etanol 40%v/V en buffer de fosfato depH 6,5. A: plasma caballo. B: albúmina cristalina. C:suero humano.
_ 33
hay separación visible entre las varias globulinas a ninguna de las
concentraciones ensayadas.
Vale la pena recordar, finalmente, que cuanto mas alta
sea la concentración del alcohol, tanto más intenso resulta el colorque da el reactivo con las proteinas. Aparentementeel alcohol afec
ta a las proteinas en forma tal que aumenta su capacidad de combina
ción con el colorante.
Mezclasalcohol etílico-buffer de fosfato.
Se hicieron primero experiencias a pHconstante (6,5)y variando la concentración de alcohol ( de 10 a 40%v/v). Comparan
do 1os resultados obtenidos con alcohol-agua con los de alcohol-bu
ffer a igual concentración de algéhol, se pueden observar algunasdiferencias:
19) Generalmente las manchas son más alargadas con buffer que con
agua. Las globulinas sobre todo dan estrías muchomás extendi
das.
2Q) A la concentración de 10 y 20%de alcohol en buffer la albúmi
na se separa de las globulinas y tiene un Rf poco mayor queen el caso de las correSpondientes mezclas de alcohol-agua
(ver cuadro III); al aumentar la concentración de alcohol has
ta 30 6 40%las diferentes proteinas del suero no se separan :el cromatogramatiene el aspecto representado en la fig. 22.
Las variaciones en pHtienen influencia en los resul
tados. Se ensayaron los pH4,4 , 5,3 , 6,5 (éste en los experi
mentos ya citados) y 8. El pH 4,4 fué obtenido por medio de buffer
-34
Cuadro III
Variación del Rf de la Mancha de Albúmina con la
Concgntración de Etanol
Concentración Solución Rde etanol v/v corrida f
Übn agua Con buffer
1093 Albúmina o ,86 o ,91
" Suero humano 0,80 0,88
" Plasma caballo - 0,81 g
20% Albúmina o ,81 o , 90
" Suero humano 0,75 0,78
" Plasma caballo - 0,83
30% Albúmina 0 ,68 ¿.
É " Suero humano 0,67
É 40% Albúmina 0,60
i " Suero humano 0,45 1
-35
de ácido acético-acetato de sodio 0,1 N. Los otros, todos con buffers
de fosfato. En todos estos experimentos la concentración de alcoholfué del 20%v/v}
A pH 5,3 y 8 los resultados no difieren muchode los
obtenidos a pH 6,5, como se ve de los Rf del cuadro IV. Sin embargo
hay algunas variaciones en el aSpecto de los cromatogramas: a pH 8 las
coloraciones son muydébiles: aparentemente a ese pH el colorante nose combina fácilmente con las proteinas del suero. A pH 5 se observan
colas muy largas detras de las manchas de albúmina. A pH 4,4 en cam-_
bio se obtuvieron, tanto con suero y plasma comocon albúmina, largasestrías que partian del origen, sin separación de las fracciones.
Cuadro IV
Variación del Rf de 1a Mancha de Albúmina con el pH
Concentración de etanol: 20% v/v.
Solución corrida Rf
pH 5,3 pH 6,5 pH 8
Albúmina 0,83 0,90 0,81
Suero humano 0,78 0,78 0,81
Plasma caballo 0,77 0,83 0,81
Los experimentos a pH 5,3 y 4,4 se repitieron más tar
de utilizando suero de conejo y las fracciones de albúmina y globulinas del mismo, separadas por precipitación con sulfato de amonio. A
pH 5,3 los resultados fueron parecidos a los alcanzados con suero dehombre y plasma de caballo. Se confirma que la albúmina corre dejan
do larga cola, pero dentro de ésta se puede distinguir otra mancha,
comose indica en la fig.23. Las globulinas, comoen casos anteriores,
dan una estria que parte del origen, sin separarse entre si..A pH 4,4 el comportamiento es algo diferente. Comose
ve en la fig. 24, al correr suero se obtiene una estria en el origen
y aa mancha; la estria en el origen corresponde a las globulinas, pe
ro también, comose ve, a una fracción de la albúmina, que aqui apa
rentemente se divide en dos partes.
Mezclag de alcohol con otros buffers,
Ya hemosdescripto los resultados con buffer de aceta
to. Fue ensayado también buffer de maleato a pH 6,5, con un 25%dealcohol. Con este solvente la fracción de albúmina del suero de cone
jo parece también dividirse en dos partes, la principal de las cualesda una manchabien definida, y la otra una estria larga. Las globuli
nas dejan una manchaen el origen, que posiblemente puede atribuirse
a proteina desnaturalizada "in situ" y otra, la principal, que se ale
Ja un poco: ver fig. 25. Si se corre ¡y -globulina de suero de caballo, ésta da manchas del mismoaspecto que la fracción de globulinas
totales: parece por lo tanto que tampocoen este caso ha habido separación entre las fracciones.
figgglas acetona-agua.
Se usó una mezcla que contenía el 30%v/v de acetona.
Los resultados son parecidos a los obtenidos con alcohol, con la dife
rencia que, en forma algo semejante al caso del buffer de maleato, las
globulinas dan una mancha en el origen y otra que se aleja del mismo.Unresultado tipico está representado en la fig. 26. Aqui también el
uso de la X’-globulina no aclaró las cosas.
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. 4;2¿¿¿¿¿:;:;:;:;;-_.,, :-> . |
Fig. 23 - Cromatografía de suero de conejo y sus fracciones con etanol 20%v/V en buffer de fosfato de pH 5,3. A: fraCCiónalbúmina. B: suero entero. C: fracción globulinas.
Fig. 24 - Cromatografía de suero de conejo y sus fracciones conetanol 20%v/v en buffer de acetato de pH4-4. A: fracción albúmina. B: suero entero. C: fraccion globulinas.
Fig. 25 - Cromatografía de suero de conejo y sus fracciOnes conetanol 20%v/v en buffer de maleato de pH 6,5. A: fracción albúmina. B: suero entero. C: fracción globulinas.
B 3; “'v r' %%Wfifi
L__. <9 iFig. 26 - Cromatografías con acetona 30%V/V :
(a) Fracción albúmina de suero de conejo: Rf g 0,73.
(b) A:3’-globulina de suero de caballo. z suero de conejo;Rf de la mancha de albúmina: 0,62. C: fracción globulinica del suero de conejo.
Buffers sin solvente orgánico.
Experimentos de este tipo ya fueron llevados a cabopor Franklin y Quastel (3). Corriendo suero de conejo con buffer de
fosfato de Sórensen de pH 6,5 se observa una sola mancha, de Rf 0,8O,9, seguida por una cola larga y tenue. La fracción de globulinas
del mismosuero, corrida independientemente, da una estria larga, sin
manchasdefinidas. Parece asi que este tipo de solvente no es apto pa
ra dar buenas separaciones.
Con otros sueros y con plasma los resultados son parecidos.
Soluciones de sulfato de amonio.
A1 poder efectuar eficientemente el revelado de las
proteinas, se repitieron, ésta vez con suero y sus fracciones, algunas experiencias efectuadas al comienzode este trabajo. Se produjo
un gradiente de SO4(NH4)2con el aparato I (fig. 3), colocando en eltubo B del mismo sulfato de amonio de 40%de saturación. Aunque se
obtuvo cierta separación entre albúmina y globulinas, ésta fué infe
rior a 1a conseguida con solventes orgánicos, debido a la forma muyalargada de las manchas y las colas muyextendidas. Por otra parte
el SO4(NH4)2de concentración constante, 20, 40, ó 60%de saturación,se revela comoun solvente menos conveniente aún, por un aumento ulterior de los defectos citados.
Cambio de temperatura.
Se efectuó una corrida a -SQCcon mezcla de alcohol
agua (20%de alcohol) para ver si, por menor desnaturalización de las
proteinas, variaban los resultados; pero no se obtuvo cambio aprecia—
ble en la separación ni en el Rf.
- 38
Confirmación de la separaciónpggtre albúmina y globulinas.
Para este fin se procedió a separar la albúmina dc las
globulinas del suero de conejo por precipitación diferencial con 804
(NH4)2: las globulinas son precipitadas por el sulfato de amonio a 50%de saturación, mientras que la albúmina queda en solución en esas con
diciones. Se efectuó una serie de corridas colocando en el papel, una
al lado de la otra, 3 gotas, una de la fracción albúmina, otra dc 1a
fracción globulinas y otra de suero: el resultado se puede observaren la fig. 27. Se ve perfectamente la correspondencia de las manchas
dadas por cada una de las dos fracciones con las originadas por el
suero entero.
Se observa además, comoya se vió en una oportunidad
anterior, que el Br de la albúmina es mayor cuando se la corre sola,
que cuando se encuentra en el suero. Para descartar que la proteina
hubiera sido modificada por el procedimiento de fraccionamiento em—
pleado, se mezclaron entre si cantidades iguales de las fracciones albúminay globulinas obtenidas, y se corrió la mezcla al lado de cadauna de las fracciones separadas. El resultado fué idéntico: se repro
dujo prácticamente el mismocromatograma dado por el suero, con la di
ferencia de Rf dc las dos manchas de albúmina.
Por otra parte debemos observar de nuevo que, cuando
se corre sea suero, sea una mezcla artificial de las fracciones albú
mina y globulinas, se tienen colas muchomás marcadas que cuando la
albúminase corre sola: la interpretación de estos hechos se discutirfi mas adelante (pág.‘43 ).
La separación en diferentes fracciones del suero de
conejo, sirvió ademáspara repetir experiencias con éstas, en casos
Fig. 27 - ‘Cromatografía de suero de conejo y sus fracciones conetanol 30%v/V. A: fracción albúmina: Rf g 0573. B: suero entero; Rf de la manchade albúmina: 0,66. C: fracción globulinas. _ - > .
Fig. 28 - Albúminacristalina corrida comobanda. Solvente; etanol 30% v/V/
Fig. 29 - Albúminacristalina corrida comobanda. Solvente: etanol10%V/vl. /
_ 39 _
que habian quedado dudosos después de las cromatografias con suero hu
mano, plasma de caballo y albúmina pura. Ya nos hemos referido ante
riormente a esos experimentos, comotambién a varios de los que se
efectuaron con Xr—globulina. En general, al ser corrida ésta al ladode la fracción globulinica del suero de conejo dió una manchapareci
da a la de ellas, aunque por lo comúnmenos alargada: comotanto la
-globulina sola comola mezcla de todas las globulinas se quedan
prácticamente en el origen, no es posible decidir con seguridad sihay o no alguna separación.
Diferencias provenientes de la manera de colocar la solución en el22ml.
Aunquela mayoria de las veces la solución de protei
nas fué colocada en el papel en forma de gota, han sido efectuadas
también muchasexperiencias en las cuales se ha extendido la solución
a todo lo ancho de 1a tira, en forma de una banda,.como por otra par
te se habia hecho siempre con las enzimas. Se observaron dos dife
rencias fundamentales respecto del métodoanterior: en primer lugar
el Rf de una misma proteína es algo mayor cuando se la coloca en ban
da que cuando se la deposita comogota. Algunos ejemplos están representados en el cuadro V. Otro hecho interesante es que el aspecto
de la banda, una vez desarrollado el cromatograma,varia entre ser
muyuniforme (ejemplo fig. 28) y sumamenteirregular (ejemplo fig.29), dependiendo ésto en gran parte del solvente usado. Al disminuir
1a concentración de alcohol, suele aumentar la inhomogeneidad de la
banda, que llega inclusive a dividirse en una serie de sectores (fig.29). Las irregularidades son sobre todo evidentes en los bordes del
papel, donde se pueden observar a menudolargas estrías.
- 4o
Cuadro V
Influencia de la Forma de coloca; 1a Solución
sobre e; Page;
En el caso del suero los Rf se refieren a 1a manchade albúmina.
Solvente Proteínas Rf
En gota En banda
Etanol 30 % Albúminn 0,68 0,72
" Suero humano 0,67 0,73
Etanol 40 % Albúmina 0,60 0,68
" Suero humano 0,45 0,57
Beproducibilidad de los resultados.
_ La reproducibilidad de los resultados es bastante
buena. Los Rf varían de una vez a otra, pero generalmente en no más
"del 10 %, lo cual es bastante satisfactorio en experimentos de estaclase.
_41
DISCLBIOH DE LOS RESULTADm
Cromatografía de enzimas.
Los experimentos efectuados con gradiente de sulfato
de amonio demuestran que en algunos casos es posible obtener picosdefinidos de actividad de las enzimas en el papel. Sin embargoel
método presenta varios inconvenientes: en primer lugar, a menos que
las enzimas corran con el frente, éstas se distribuyen en una zona
muyamplia del papel; en segundo lugar, la alta concentración salina
puede interferir con la actividad de muchasde ellas, y finalmente
existe la imposibilidad comprobadade obtener un gradiente continuode concentración.
El uso de mezclas de alcohol con agua y con buffer
parece representar una mejora importante: las enzimas corren mante
niéndose en zonas mas restringidas, con menos"cola"; la recupera
ción de actividad es mejor, en parte, posiblemente, debido a la baja
temperattfllaa la cual se lleva a cabo el experimento y además a cau
sa de la baja concentración de sales; el método es más sencillo, noexistiendo necesidad de emplear aparatos más o menos complicados pa
ra producir gradientes; se puede hacer variar casi a voluntad el mo
vimiento de las enzimas en el papel, cambiando la concentración dealcohol. Sin embargo, no obstante haberse comprobado1a posibilidad
de separar enzimas entre si, es indudable que el métododista de te
ner el poder resolutivo de la cromatografía en papel de azúcares ode aminoácidos, por ejemplo. Aún cn los casos mas favorables se en
cuentra la actividad enzimática distribuida a lo largo de seis o sie
te centimetros de papel, sobre una distancia total recorrida por elsolvente de unos 25 cm. No parece que el aumento de este recorrido
- 42
pueda mejorar mucholas cosas, ya que los picos tienen tendencia aachatarse y ensancharse en esas condiciones.
Por otra parte la reproducibilidad de los resultados es
bastante grande, considerando el material con que se trabaja y los errores de los métodos de valoración: en experimentos duplicados o re
petidos varias veces, las curvas obtenidas fueron esencialmente las
mismas, aunque podían variar un poco en el aspecto cuantitativo, lo
que no puede sorprender, conociendo la cantidad de factores de los
cuales depende la actividad enzimática.
Uncaso interesante parece ser el de la invertasa consus dos picos de actividad. En una reciente publicación Reid (6) ob
serva un comportamientosimilar en la enzima poligalacturonasa corri
da con los métodos de Franklin y Quastel, y afirma además que 1a misma
enzima da origen a cuatro picos diferentes de actividad, cuando se usan comosolventes mezclas de acetona y agua. Parecería pues que las
enzimas pueden existir en diferentes especies moleculares, aunque no
es posible determinar en forma definitiva si en realidad no difieren
estas moléculas en algunas propiedades enzimáticas, ademasde físicas
y estructurales. Esto último lo indicarían algunos de los experimentos descriptos con sacaroslñ y rafinosa comosubstratos.
No obstante sus imperfecciones, parece pues que el mé
todo puede tener algunas aplicaciones útiles: por ejemplo cuando se
dude de si es una sola o son varias las enzimas que actúan sobre di
ferentes substratos; y también posiblemente en casos en que se tenga
que decidir si una determinada transformación quimica se efectúa através de uno o más pasos, catalizados por diferentes enzimas.
Unfactor que es importante no olvidar, finalmente, es
que el métodopuede serrespecialmente útil en los casos en que se dis
- 43
ponga de cantidades muypequeñas de material. El volumen total de so
luciones de enzimas sometidas a cromatografía en toda esta investiga
ción no pasa de algunos mililitros.
CromatOgrafia de proteinas de la sangre.
Comoya se ha dicho, ha sido posible encontrar gran nú
mero de solventes que separan con bastante facilidad 1a albúmina del
suero de las globulinas. La diferencia de movilidad es muygrande,puesto que las globulinas se quedan practicamente en el origen. Con
ninguno do los solventes utilizados ha sido posible separar las globu
linas en varias fraccionesg ni hacerlas mover en forma más o menos compacta a lo largo del papel. Con los solventes más diluidos en alcohol
y con los buffers acuosos las globulinas se muevenmás, pero dando
largas estrías sin apariencia de separación entre los componentes9co
molo confirma por otra parte la comparación con.1a. y -globulina.Ademásse ha hecho notar en la parte experimental que
cuando la albúmina se corre junto con las globulinas, sea en el suero
o en mezclas formadas artificialmente con las fracciones separadas pre
viamente, su Rf es menor y las "colas" son más pronunciadas. La explicación más inmediata de estos hechos es que la albúmina se combina con
las globulinas, cosa por otra parte que ya se sabe que ocurre en solu
ción. El hecho que, cuanto más concentradas sean las soluciones alco
hólicas usadas para desarrollar el cromatograma,tanto mas nitidas son
las separaciones, hace pensar que el alcohol en concentraciones relativamente elevadas disocia con mayor facilidad estas combinaciones.
Ya se ha hecho referencia a las diferencias observadas
según la manera de depositar la solución de proteinas en el papel, engota o en banda. Estos fenómenos tienen probablemente su eXplicación
- 44 _
en el hecho de que el solvente no sube de manera uniforme a través de
la banda de proteina, sino que se infiltra por puntos determinados,
desplazándose después lateralmente, hasta llenar todo el ancho délpa
pel y produciendo por lo tanto movimientoshorizontales de materialproteico, que se distribuye asi irregularmente. Es lógico que estefenómeno sea más pronunciado en los casos en que el solvente sube con
mayor rapidez por el papel, que es Justamente con las soluciones alcohólicas masdiluióas.
Esta dificultad del solvente para penetrar a la solu
ción de proteinas se verifica naturalmente también cuando ésta se en
cuentra en forma de gota: aqui el solvente suele rodear la gota antes
de arrastrar las proteinas, lo que determina probablemente que los Rfresulten más pequeños.
Con los buffers sin alcohol por otra parte y con las
mezclas que contienen pequeña concentración del mismoes dable obser
var un desplazamiento lateral de las manchas, respecto del punto dcpartida, que se puede atribuir a las mismascausas.
Probablemente tienen alguna explicación parecida las dos
manchad que se producen con la albúmina corrida con alcohol 40%, según
hemos indicado en la página 32, ya que si la misma albúmina se correcomo banda, no se descompone en dos fracciones.
La dificultad que experimenta el solvente para penetrar
en la gota de solución aumenta mucho cuando se deja secar 1a misma an
tes de efectuar la corrida.
En un reciente trabajo Franklin y Quastel (5) pbtienen
una serie de resultados que podrian ser explicados por las consideraciones arriba formuladas. Estos autores extienden sus anteriores mé
todos de separación de proteinas, que ya hemoscitado, al caso del sue
ro humanoy de varios animales, por medio de la cromatografía en papelbidimensional. Para eso colocan una gota de suero, por ejemplo, en una
esquina de un cuadrado de papel de 20 cm de lado, y, una vez dejada
secar la gota, la corren en una dimensión con solución de sacarosa
0,1 N. Dejan secar luego el papel y efectúan una corrida en la otradimensión (a 909 de la primera) con tartrato sódico-potásico 0,1 N.
El revelado lo efectúan estos autores con el método que ya emplearon
otra vez (3), agregando hemina a la solución proteica y pincelando el
papel con una solución de bencidina. El resultado es un diagrama comoel representado en la fig. 30. Si se agregan detergentes sintéti
cos al suero antes de correrlo, el aspecto del cromatogramaes deltipo de la fig. 31. Aunquelos autores no lo dicen muyexplícitamen
te, parece ser que suponen que cada una de las manchas es una diferente fracción proteica. Eso no es muyprobable por varias razones:
19) Repetimos las experiencias de Franklin y Quastel (‘) con suero
de conejo y comprobamosque la reproducibilidad de los resulta
dos es muypobre: se obtiene cada vez un cromatograma de la mis
ma apariencia general, pero sin correspondencia entre las manchas.
29) Cuandoestos autores corren la fracción globulínica del plasma,
esta se muevesólo en 1a primera dirección, dando una larga estria. Por lo tanto todas las fracciones aparentemente separadas
deberian provenir de la albúmina.
39) El frente del solVente es sumamenteirregular y las manchas de
(') La única diferencia fué el métodode revelado para el cual seutilizó el azul de bromofenol.
0,1" /
SACAROSÁ
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Fig. 30 - Cromatografía bidimensional de suero humano(dibujadode una fotografía del trabajo de Franklin y Quastel (5).).
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Fig. 31 - Cromatografía bidimensional de suero humano, mezcladocon el detergente "Span 20" antes de correrlo (dibujadode una fotografía del trabajo de Franklin y QuastelCS) ).
-423
proteína se encuentran por lo general en el interior de los pequeños"golfos" formados por el mismo.
La explicación más adecuada para los resultados de
Franklin y Quastel podria ser la siguiente: al correr en la primera
dirección, con la solución de sacarosa, la proteina se extiende en una
estria larga, comosuele hacerlo con los solventes de poco poder reso
lutivo; al correr luego en la otra dirección, se verificaria el fenómenoque se ha descripto anteriormente para el caso en que la protei
na está puesta en banda sobre el papel: es decir que el solvente se
infiltraria en una serie de puntos, determinandodesplazamientos laterales de las proteinas y repitiendo en grande el resultado representa
do en la figura 29. Para verificar esta posibilidad se efectuó 1a si
guiente experiencia: se extendió una banda de suero a lo largo de un
papel de 20 cm de ancho y se la corrió en una sola dirección, con so
lución 0,1 N de tartrato, obteniéndose asi un cromatogramamuypareci
do a los de Franklin y Quastel (fige 32). Aqui sin embargono podriahablarse de separación de proteinas.
Ademásel hecho de que los autores citados dejaban se
car la solución de proteínas antes del desarrollo del cromatograma,
habla también en favor de nuestra hipótesis: ya hemosdicho que lasirregularidades Son mayores en esas condiciones.
Fig. 32 rc- Cromatografía de suero de. > b anda. ‘
G
19)
29)
39)
4Q)
59)
CONCLUSIONES
Se ha comprobadola posibilidad de correr proteínas en el papel
utilizando un gradiente de sulfato de amonio; se han ideado dos
dispositivos para formar dicho gradiente.
Se ha introducido el uso del alcohol etílico en mezclas con agua
o con diferentes buffers, comosolvente para cromatografía de
proteínas. Se ha podido así separar dos enzimas entre si, lainvertasa y la fosfoglucomutasa de levadura.
Se ha desdoblado la invertasa de la levadura de cerveza en dos
fracciones y se ha estudiado el comportamiento de las dos en di
ferentes condiciones y frente a distintos substratos.
Se ha extendido el trabajo a la cromatografía de suero y de plas
ma, consiguiéndose separar la albúmina de las globulinas. Se ha
efectuado un estudio sistemático de la influencia del pH, de la
concentración de alcohol y de otros factores sobre estas separaciones.
Se han discutido los resultados obtenidos, comparándoloscon algunos de otros autores.
10._
11,
123
13;14.
15,
16._
17,18.
19,20.
21,22.
p48_
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a;V
I y D I C E
INTRODUCCION
PARTE EXPERIMENTAL
Substancias utilizadas y métodos generales
Experimentos preliminares
Cromatografías con gradiente de SO4(NH4)2
Métodos
Resultados
Cromatografías con mezclas etanol-agua y etanolbuffer
Métodos
Resultados
Cromatografía de proteínas del suero 1 plasmaMétodos
Resultados
DISCIBION DE LOS RESULTADm
Cromatografía de enzimas
Cromatografía de proteínas de la sangre
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
«AP g.
‘H
CO03'03
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