Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …library.cu.edu.tr/tezler/8929.pdf ·...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Deniz PEHLİVAN

ADANA VE MERSİN İLLERİNDE DOMATES KLOROZ VİRÜSÜ (Tomato chlorosis crinivirus, ToCV)’ NÜN SAPTANMASI VE MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU.

BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI

ADANA, 2013


ADANA VE MERSİN İLLERİNDE DOMATES KLOROZ VİRÜSÜ

(Tomato chlorosis crinivirus, ToCV)’ NÜN SAPTANMASI VE MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU

Deniz PEHLİVAN



Bu tez, …/…/2013 Tarihinde A şağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir ……………………………….. ……………………………………… Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Prof. Dr. Mehmet Ertuğrul GÜLDÜR DANIŞMAN ÜYE …………………………………………………… Yard. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Mustafa GÖK

Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç.Ü. Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2012YL18 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların

kaynak gösterilmeden kullan ımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ


ADANA VE MERSİN İLLERİNDE DOMATES KLOROZ VİRÜSÜ (Tomato chlorosis crinivirus, ToCV)’ NÜN SAPTANMASI VE MOLEKÜLER

KARAKTERİZASYONU

Deniz PEHLİVAN



Danışman : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Yıl : 2013, Sayfa: 52 Jüri : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU : Prof. Dr. Mehmet Ertuğrul GÜLDÜR : Yrd. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU

Domates Kloroz Virüsü (ToCV), Closteroviridae familyası içerisinde Crinivirus cinsine bağlı, flomde yaşan önemli bir domates virüsüdür. Konukçu dizisi geniş olup 7 bitki familyası içerisindeki 24 türde infeksiyon yapabilmektedir.

Araştırma Adana ve Mersin illerinde üretimi yapılan domateslerde zararlı ToCV’ nin yaygınlığının ortaya konulması ve farklı izolatların tanımlanmaları, sınıflandırılmaları ortaya koymak amacıyla yürütülmüştür.

ToCV’ nin ticari olarak antiserumu olmadığı için virüsü serolojik olarak saptama imkanı bulunmamaktadır. Yapılan surveylerle toplanan örnekler ELISA ile karışık infeksiyon durumlarını kontrol etmek amacıyla Hıyar Mozayik Virüsü (CMV) ve Tütün Mozayik Virüsü (TMV) virüslerine karşı testlenmiştir. Moleküler çalışmalar sonucunda ToCV ile bulaşık bulunan örkeler domates, biber ve diğer test bitkilerine mekanik inokulasyon yöntemi ile aşılanmıştır. Biyolojik indeksleme çalışmaları ToCV’ nin mekanik inokulasyon yöntemi ile taşınmadığını göstermiştir.

ToCV’ nin farklı izolatlarının RT-PCR yöntemi ile kılıf protein geni üzerinden 360 bp’ lik bir bölgeye göre karakterizasyonu yapılmıştır. RT-PCR çalışmaları domateslerde damar araları kloroz sararma, yapraklarda daha sonra kahverengileşme, beneklenme simptomlarının ToCV’ den kaynaklandığını ortaya koymuştur.

Bulunan izolatların, DNA dizilemeleri sonucunda ortaya konulan sekansları gen bankasındaki diğer izolatlarla karşılaştırıldığında, Yunanistan izolatı ile % 98,9 oranında örtüştüğü görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Domates, ToCV, RT-PCR, DNA dizileme, Filogenetik ağaç.

II

ABSTRACT

MSc. THESIS

DETECTION AND MOLECULAR CHARACTERISATION OF TOMATO CHLOROSIS VIRUS (Tomato chlorosis crinivirus, ToCV) IN ADANA

AND MERSIN

Deniz PEHLİVAN

ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION

Supervisor : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Year : 2006, Pages: 52 Jury : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU : Prof. Dr. Mehmet Ertuğrul GÜLDÜR : Asst. Prof. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU

Tomato Chlorosis Virus (ToCV) is a member of the genus Crinivirus of Closteroviridae family and important virus on tomato. ToC has large host range including ower 24 plant species in 7 plant families.

The research was conducted to disply prevalence of virus, classification of different isolates on tomato produced in Adana, Mersin provinces.

Due to lack of antiserum of ToCV commerciall, no possibility to detect of ToCV serologically. During surveys, the samples were tested with ELISA against to Cucumber Mosaic Virus (CMV) and Tobacco Mosaic Virus (TMV) to control of mix infection of tomato.

The samples found infected with ToCV by molecular techniques were inoculated to tomato, pepper and indicator plants by mechanically inoculation technique. Biological indexing showed that ToCV is not transmited by mechanically inoculation.

Different isolates of ToCV wre characterized by RT-PCR according to 360 bp fragment on coat protein gene. RT-PCR assays showed that the agent of symptoms of chloroz between veins, yellowing, browning and flecking is ToCV.

When sequences of ToCV isolates found were compared with other isolates in genebank, the result showed that our isolates are very close to Greec isolates in that rate of 98,9%.

Keywords: Tomato, ToCV, RT-PCR, DNA sequencing, Filogenetic Tree.

III

TEŞEKKÜR

Domateslerde zararlı domates kloroz virüs hastalığı (ToCV)’ nin Doğu

Akdeniz bölgesi’ nde yaygınlığının saptanması ve moleküler tekniklerle

karakterizasyonu üzerine araştırmak amacıyla yaptığım yüksek lisans tez çalışmamın

her aşamasında ihtiyacım olan bilgi ve ekipman desteğini hiçbir zaman esirgemeyen

danışman hocam sayın Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU’ na ve çalışmalarımda bana

gerekli olan desteği sağlayan ve özveri ile yardımcı olan sayın Prof. Dr. Yeşim

AYSAN’ a, Yard. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU’ na, Dr. Hakan

FİDAN’ a ve çalışmaların süresince laboratuar çalışmalarında yardımcı olan Dr.

Behçet Kemal ÇAĞLAR’ a çok teşekkür eder, saygılarımı sunarım.

Hayatımın her aşamasında olduğu gibi yüksek lisans çalışmalarım sırasında

da maddi ve manevi hiçbir desteğini esirgemeyen ve beni destekleyen aileme çok

teşekkür ederim.

Bunlara ek olarak projenin yürütülmesinde çalışmalarıma maddi olanak

sağlayan Ç.Ü. Araştırma Fonu Merkezine teşekkür ederim.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ ................................................................................................................................. I

ABSTRACT ................................................................................................................. II

TEŞEKKÜR ............................................................................................................... III

İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ .............................................................................................. VI

ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................. VIII

SİMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................. X

1. GİRİŞ ....................................................................................................................... 1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ........................................................................................ 5

3. MATERYAL VE METOD .................................................................................... 11

3.1. Materyal .......................................................................................................... 11

3.1.1. Araştırmanın Yürütüldüğü Yer ve Bitkisel Materyaller ....................... 11

3.1.2. Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal ......................................... 12

3.1.2.1. DAS-ELISA Çalışmaları ............................................................ 12

3.1.3. Biyolojik Tanı Çalışmalarında Kullanılan Materyaller......................... 12

3.1.4. RT-PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyaller ................................. 13

3.1.5. Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyaller .......... 13

3.2. Metod ............................................................................................................. 14

3.2.1. Simptomolojik Gözlemler ve Örnekleme ............................................ 14

3.2.2. Test Bitkilerinin Yetiştirilmesi ............................................................. 14

3.2.3. Virüsün Mekanik İnokulasyon Yöntemiyle Taşınması ........................ 15

3.2.4. Serolojik Çalışmalar ............................................................................. 15

3.2.4.1. DAS-ELISA Testi Çalışmaları .................................................. 15

3.2.5. Total Nükleik Asitlerin Elde Edilmesi ................................................. 17

3.2.6. Çift İplikli RNA (dsRNA) Analizlerinin Yapılması ............................ 18

3.2.7. RT-PCR Çalışmaları ............................................................................ 20

3.2.7.1. PCR İçin Materyalin Oluşturulması .......................................... 20

3.2.7.1.(1). Hedef Nükleik Asitlerin Elde Edilmesi .................... 20

3.2.7.1.(2). Primerlerin Oluşturulması ......................................... 20

V

3.2.7.1.(3). Amplifikasyon Sırasında Kullanılan Kimyasalların

Optimum Konsantrasyonlarının Ayarlanması .......... 21

3.2.7.2. Hedef Bölgelerin Çoğaltılması (Amplifikasyon) ...................... 22

3.2.7.2.(1). ToCV İzolatlarının Kılıf Protein Geni Üzerinde

Tanılama Yapılacak Bölgenin Çoğaltılması .............. 22

3.2.8. Agarose Gel Elektroforez Çalışmaları ..................................................... 23

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ............................................................................... 25

4.1. Simptomolojik Çalışmalar ............................................................................. 25

4.2. Serolojik Çalışmalar ........................................................................................ 30

4.2.1. DAS-ELISA Testi Çalışmaları .............................................................. 30

4.3. Moleküler Çalışmalar ...................................................................................... 31

4.3.1. ToCV İzolatlarının RT-PCR Ve DNA Dizilimi çalışmaları İle

Farklıklılarının Saptanması ve Filogenetik Akrabalıklarının Ortaya

Konması ................................................................................................ 31

4.3.2. ToCV İzolatlarının RT-PCR Çalışmaları İle Elde edilen DNA

Dizilimleri İle Filogenetik Akrabalıklarının Ortaya Konması .............. 32

5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA ............................................................................. 35

KAYNAKLAR .......................................................................................................... 39

ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 45

EKLER ....................................................................................................................... 46

VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan bitkisel materyallerin illere göre dağılımı ..... 11

Çizelge 3.2. Mekanik inokulasyon çalışmasında kullanılan test bitkileri ............... 12

VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil 4.1. ToCV ile bulaşık domates bitkisi ............................................................. 26

Şekil 4.2. Sağlıklı (A) ve ToCV ile bulaşık (B,C) Domates bitkisi ........................ 26

Şekil 4.3. Sağlıklı (A) ve ToCV ile bulaşık (B) domates bitksinden meyve ........... 27

Şekil 4.4. Sağlıklı (A) ve inokulasyon yapılmış domates bitkileri (B,C) ................. 27

Şekil 4.5. Mekanik inokulasyon yapılmış biber bitkisi ............................................ 28

Şekil 4.6. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış N. benthamiana (B) ...... 28

Şekil 4.7. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış N. benthamiana (B) ...... 29

Şekil 4.8. (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış, Sağlıklı (B) D.strmonium, ......... 29

Şekil 4.9. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış, (B) D.strmonium .......... 30

Şekil 4.10. PCR sonucunda elde edilen ToCV’üne ait agaroz jel görüntüsü. M :

100bp marker, Adana izolatları (a, b, c ), Mersin izolatları (d, e, f, g,

h, ı, j), Antalya izolatı (k), Kıbrıs izolatı (l), negatif kontrol (N) ............ 31

Şekil 4.11. ToCV İzolatlarının Closteroviridae Familyasına ait Filogenetik Ağaç

İçindeki Durumu. ToCV (AFA28154) [JN867337.1]: Fas izolatı

oCV (ABM67665) [ EF187609.1]: İspany .............................................. 32

Şekil 4.12. ToCV-Ada-1 ‘ e ait Filogenetik Ağaç, Tomato chlorosis virus

[162415388]: Yunanistan izolatı .............................................................. 32

Şekil 4.13. ToCV-Mer-1‘e ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus


Şekil 4.14. ToCV-Ant ‘ ye ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus


Şekil 4.15. ToCV-Kıb‘ a ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus


X

SİMGELER VE KISALTMALAR

A : Adenine

APS : Ammonium persülfate

BSA : Bovine Serum Albumin

Bp : Base pair

C : Cytosine

°C : Santigrad derece

cDNA : Komplementer Deoksiribonükleikasid

CMV : Cucumber Mosaic Virus

CP : Coat Protein (Kılıf protein)

Da : Dalton

dATP : Deoksiadenozintrifosfat

dCTP : Deoksisitidintrifosfat

dd : Double distile

dGTP : Deoksiguanozintrifosfat

DNA : Deoksiribonükleikasit

dNTP : Deoksinükleotidtrifosfat

dsRNA : Double stranded (çift iplikli)

dTTP : Deoksitimidintrifosfat

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA : Enzim-Linked Immunosorbent Assay

G : Guanine

Gr : Gram

H2O : Su

Kb : Kilo base

kDa : Kilo dalton

M : Molarite

Mg : Miligram

µl : Mikrolitre

Ml : Mililitre

XI

mM : Milimolar

M-MLV : Moloney Murine Leukemia Virus

Mol : Mol

mRNA : Messenger RNA

MW : Molekül ağırlığı

Nm : Nanometre

Nt : Nükleotit

ORF : Okunabilir açık alanlar

PBS : Potasyum fosfat-tuz tamponu

PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu

pH : Hidrojen iyonu konsantrasyonu

Pmol : Pikomol

Pr : Primer

PVY : Potato Virus Y

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA : Ribonükleikasit

RNAse : Ribonükleaz

Rpm : Dakikadaki devir sayısı

RT : Reverse Transcriptase

SDS : Sodyum dodesil sulfat

T : Thymine

TAE : Tris Asetik Asit EDTA

Taq : Termo stabil polimeraz enzimi

TMV : Tobacco Mosaic Virus

ToMV : Tomato Mosaic Virus

tRNA : Transfer RNA

TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus

u : Ünite

V : Hacim

VPg : Virion Protein G (RNA’nın 5’ ucuna bağlı protein)

W/V : Ağırlık/hacim

1. GİRİŞ Deniz PEHLİVAN

1

1. GİRİŞ

Anavatanı Güney ve Orta Amerika olan domates (Solanum lycoperesicum),

patlıcangiller (Solanacea) familyasına ait meyvesi yenebilen otsu bir bitki türüdür.

Ortalama 1–3 metre boya sahip olan domates bitkisinin hafif odunsu bir gövdesi

vardır. 10–25 cm uzunluğunda olan yapraklarının üzerinde 5–9 arasında yaprakçık

bulunur. Yaprakları tüylüdür. Uzunluğu genellikle 1–2 cm ve genellikle sarı renkli

olan domates çiçekleri bir sap üzerinde sayıları 3–12 arasında değişmektedir.

Genellikle kırmızı, yenebilen meyvesiyle yabani bitkilerde 1–2 cm çapında iken,

kültür bitkilerinde daha büyüktür. Bünyesinde bulundurduğu birçok vitamin ve

kanser önleyici yapısı sayesinde diğer bitkilerden ayrılır.

ABD’de 1983 yılında domatesi sebzelerle saklanıp yenildiğinden sebze

sınıfına almıştır; fakat gerçekte meyvedir. Bolivya ve Peru ‘da yabani sarı renkli bir

domates türü bulunmuş ve sonra Meksika’da yetiştirilip, Kristof Kolomb ‘un

Amerika’yı keşfinin ardından gemilerle Avrupa’ya gönderilmiştir. İtalyanlar onu sarı

renginden dolayı altın elma olarak adlandırsa da çok geçmeden kırmızı çeşitleri de

ortaya çıkmıştır. Domates ilk olarak Amerika ‘da Thomas Jefferson(bağımsızlık

bildirgesini yayınlayan kişi) tarafından yetiştirilse de zehirli olduğuna inanıldığı için

pek çok insan tarafından 1900 ‘lülere kadar tüketilmemiştir. Tüketilmeye ilk

başlandığı sıralarda sadece yemeklerde pişmiş şekilde kullanılmış daha sonraları

gastronomide kullanımı artıkça taze olarak da tüketilmeye başlanmıştır. Taze ve

pişirilmiş tüketimi dışında Avrupalılar bu meyveyi aşk elması olarak da tanımlamış

ve insanları romantikleştirdiklerine inanmıştır.

Ülkemizdeki tarihine gelindiğinde ise, çok fazla bilgiye ulaşamamaktayız. İlk

olarak Abdülmecit zamanında tüketildiği varsayılmaktadır. O zamanlarda kırmızı

renkte olanlar zehirli kabul edildiği için yeşil olanlar tüketilmekteydi. Zaman içinde

kabul gören domates; daha sonraları Anadolu’ nun doğusuna taşınmıştır.

Bölgemizde açık alanda ve serada yetiştirilen sebzelerden domates ekonomik

açıdan önemli bir yere sahiptir. Likopen ve demir yönünden zengin olan domates her

mevsim taze olarak tüketilmesinin yanında salça, sos, ketçap, reçel, domates suyu ve

kurutulmuş olarak da tüketilmektedir.


2

Türkiye ‘de toplam işlenen tarım alanı 20.539.000 hektar ve ekilen tarla

15.712.000 hektar iken ülkemiz 27,5 ton sebze üretimiyle önemli bir üretici

konumundadır (TÜİK, 2011). Bu üretimde domates10.052.000 tonla en yüksek paya

sahiptir. Çukurova Bölgesi % 9.110 gibi bir yüzdeyle üretimin yoğun yapıldığı yerler

arasındadır. Araştırmanın yapıldığı Adana‘ da üretim 136.404 ton, Mersin‘ de

779.338 tondur (TÜİK, 2010).

Ülkemizde ve dünyada nüfusun hızla artması ve besin kaynaklarının giderek

azalması daha fazla ürün yetiştirme zorunluluğunu da beraberinde getirmektedir.

Ekilebilir alanların çoğu kullanıma açık olduğu halde dünya nüfusunun hızlı artışı

nedeniyle artan nüfusun gereksinimlerini karşılamak kolay olmamaktadır. Üretim

alanlarının sınırlı olması nedeniyle birim alandan alınacak ürün miktarının

artırılması ve mevcut miktarın korunması gerekmektedir. Ayrıca dikimden hasat

dönemine kadar bütün aşamalarda karşılaşılan sayısız problemler nedeniyle ekim

alanlarıyla elde edilen ürün miktarı arasında paralellik görülmemektedir.(Üretim;

10.052.000 ton, üretim kaybı; 351.820 ton). (TÜİK, 2010/2011).

Sebze tarımında üretimi sınırlayan ve ürünün pazar değerinde kayıplara neden

olan birçok canlı ve cansız etmen vardır. Bu etmenler içerisinde bitki hastalıkları

önemli bir yere sahiptir. Bu hastalıklar içerisinde de son yıllarda yapılan araştırmalar

gerek hücresel protein olmaları ve gerekse de mücadele olanaklarının sınırlı olması

nedeniyle virüs hastalıklarında kaynaklanan zararın çok boyutlu olduğu görüşü önem

kazanmaktadır.( Çağlar, 2003).

Çukurova Bölgesi’ nde tarımı yapılan sebze türleri içerisinde yer alan

domates; virüs hastalıklarına oldukça duyarlı olması nedeniyle çok sayıda virüs

hastalığına konukçuluk etmektedir. Bu virüslerden Domates Mozaik Virüsü

(ToMV), Domates Sarı Yaprak Kıvırcıklık Virüsü (TYLCV), Hıyar Mozaik Virüsü

(CMV), Domates Noktalı Leke Solgunluk Virüsü (TSVW), Patates X Virüsü (PVX),

Patates Y Virüsü (PVY), Yonca Mozaik Virüsü (AMV), Domates İnfeksiyöz Kloroz

Virüsü (TICV), Domates Kloroz Virüsü (ToCV) gibi virüslerin zarar verdiği

ülkemizde ve dünyada birçok araştırıcı tarafından rapor edilmiştir (Güldür ve ark.,

1994; Yurtmen ve ark.,1998; Nie ve Singh, 2002; Mason ve ark., 2003; Çevik ve

Erkış, 2007).


3

Ülkemizde çalışma yapılmış diğer virüslerin aksine, özellikle son yıllarda

varlığının saptanmasından dolayı, Domates Kloroz Virüsü (ToCV) ile ilgili

yeterince çalışma yapılmamış olması ve bu virüsün hızla yayılması ve giderek artan

oranlarda kayıplara neden olduğunun düşünülmesi bize bu konuda çalışma fikrini

vermiştir. Buradan yola çıkarak ToCV’ nin Adana ve Mersin çevresinde domates

üretim alanlarındaki varlığı araştırılmıştır. Bulunan farklı izolatların domateste

zararları incelenmiş, izolatların moleküler düzeyde tanılanması, kılıf protein geninin

genetik karakterizasyonu, konukçuların oluşturdukları simptom şekilleri ortaya

konulmuştur.

Domates Kloroz Virüsü (ToCV), Closteroviridae familyasının Crinivirüs

genusuna ait bir virüs olup 850 nm ipliksi hafif kıvrımlı partikül yapısına sahip bir

virüstür. (Wisler ve ark., 1996). Beyaz sinekle semi-persistent olarak taşınan virüs

floemde çoğalmaktadır (phloem-limited). Bemisia tabaci,Trialeurodes vaporarium

ve T.abutilonea türleri bu virüsün dünya geneline yayılmasına neden

olmuştur.Özellikle Bemisia tabaci ‘nin B biyotipi virüsün dünya geneline

yayılmasında etkili olmuştur.Üreticilerin yetiştiricilik sırasındaki yaptıkları yanlış

uygulamalarda hastalığın yayılmasındaki önemli diğer etkenlerdendir. Virüs mekanik

inokulasyon yöntemiyle Capsicum annum, Lycopersicum esculentum, Datura

stromonium, Solanum nigrum, Nicotiana glutinosa, N. benthamiana, N. clevelandii,

N.glauca (tütün), Physalis wrightii gibi aynı zamanda bu virüsün test bitkileri olan

bitkilere taşınamamaktadır.

ToCV, RNA 1 (8594 nt) ve RNA 2 (8244 nt) den oluşan iki parçalı (bipartite)

genoma sahiptir (Fauquet and Mayo,1999).Ayrıca 9 ORF bölgesi bulunan bu virüsün

70 homolg heat shock proteini (Hsp 70h) 59kDa proteini, major ve minör kılıf

proteini vardır. RNA 1 dört ORF bölgesi içerirken RNA 2 dokuz ORF bölgesine

sahiptir. Farklı bölgelerden elde edilen izolatların benzerlik ya da farklılıkları ORF

bölgelerindeki proteinlerin incelenmesiyle ortaya çıkmaktadır. Dayanıklı çeşit

konusunda yeteri kadar bilgi bulunmamaktadır. Ancak dayanıklı çeşit geliştirmek

için çeşitli çalışmalar yapılmaya çalışılsa da dayanıklı çeşit sayısı çok sınırlıdır ve

bunun için bazı yabani çeşitler önerilmektedir. Bunun içinse germplasm yöntemi

denenmektedir.


4

Virüs, domates bitkilerinin yapraklarında damar aralarında sararmayla başlar

ve kırmızı nekrotik lekeler şeklinde devam eder zaman zaman alt yaprakların gevrek

kırılgan bir yapı almasına son olarak da kırılmalara neden olur. Hastalığın seyri alt

yapraklardan üst yapraklara doğrudur.(Wisler ve ark., 1998a ). Meyvelerde simptom

gözlenmese de bitki meyveden önceki dönemde virüsten etkilendiği için normal

boyutuna ulaşamaz ve hasat gecikir. Bazı yıllar karışık infeksiyon oluşturması

nedeniyle ciddi şekilde kayıplara neden olmaktadır. Domates Kloroz Virüsünün

simptomları Domates İnfeksiyöz Virüsüyle karıştırılmaktadır ancak serolojik olarak

bu iki virüs birbirinden ayrılır. Bu iki virüsü farklı indikatör bitkilere yapılan

mekanik inokulasyonlar sonrasında gözlenen oluşan farklı simptomlardan ayırt

edebiliriz. İlk defa 1989 yılında Simone ve arkadaşları tarafından Florida’ da

domateslerde kayıt altına alınmıştır (Simone ve ark., 1996). Sırasıyla İspanya (1997),

Portekiz (2000), İtalya (2001), Yunanistan (2002), İsrail, Tayvan (2004), Afrika

Meksika (2005), Japonya (2009)’ da hastalıkla ilgili çalışmalar yapılmıştır. Türkiye

‘de ilk kez 2007 yılında Bayram Çevik ve Gözde Erkış tarafından Antalya

bölgesinde hastalığın varlığı rapor edilmiştir.

Bu araştırmada Domates Kloroz Virüsünün (ToCV) Adana, Mersin ve

çevresinde domates üretim alanlarındaki varlığı araştırılmıştır. Bulunacak izolatların

domateslerde zararları incelenmiş, bu izolatların moleküler düzeyde tanılanması ve

kılıf protein geninin genetik karakterizasyonu ve konukçularında oluşturdukları

simptom biçimleri ortaya konulmuştur. İzolatların sequence analizleri yaptırılmış ve

filogenetik sınıflandırılması yapılmıştır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Deniz PEHLİVAN

5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Domates kloroz virüsü (ToCV) ilk olarak 1989 yılında Florida’ daki domates

seralarında ortaya çıkmışsa da 1996 yılına kadar bu rapor teyit edimelmiştir.

Daha sonra Wisler ve arkadaşları tarafından ilk olarak 1998 yılında,

beyazsinekle taşınan closterovirüs familyasının crinivirüs cinsine ait yeni bir virüs

olarak rapor edilmiştir. Araştırıcılar yaptıkları çalışmada, ToCV’ nin beyazsinek

türleriyle taşınan, floeme sınırlı iki parçalı genoma sahip ikinci bir closterovirüs

olduğu ortaya koymuşlardır.

Wisler ve ark. (1998b), ToCV’ nin TICV (Tomato infectious chlorosis)

oldukça benzer simptomlar vermesinden dolayı simptomolojik açıdan çok kolay

ayırt edilemeyeceğini, fakat nükleik asit çapraz reaksiyonları ve farklı vektör

özelleşmesinden dolayı farklı olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar, bu

virüslerin Nicotiana benthamiana ve N. clevelendii test bitkilerinde damarlar arası

klorozu simptomuna neden olduğunu, ancak TICV ile infekteli olan bitkilerde ayrıca

nekrotik lekelenmeler de gözlendiğini bildirmişlerdir.

Louro ve ark. (2000) ve Vaira ve ark. (2001) bu virüsleri laboratuvar

koşullarında dot-blot hibridizasyon yöntemi ve RT-PCR çalışmaları ile ayıt etmenin

mümkün olduğunu belirtmişlerdir.

Wisler ve ark. (1998) TICV’nin sadece sera beyazsineği olarak da bilinen

Trialeurodes vaparorium ile taşınırken, ToCV sera beyazsineğinin başka bir türü

olan Trialeurodes abutilonea ve Bemisia tabaci’nin A ve B biyotipleriyle (B.

argentifolia) ile taşındığını saptamışlardır.

Şimdiye kadar tespit edilen bitki virüsleri beyaz sineğin sadece tek genusuyla

taşınmasına rağmen crinivirüsler içerisinde yer alan ToCV adı geçen dört beyaz

sinek türüyle taşınarak diğer crinivirüs üyelerinden ayrılmaktadır (Wisler ve ark.,

1998).

Wisler ve ark. (2001) vektörlerin virüsü taşıma verimlerine bakıldığı zaman

B.tabaci’ nin B ırkı ile T.abutilonea türü B. tabaci’ nin A ırkı ve T.vaporariorum’

dan daha etkili olduğu ortaya koymuşlardır.


6

Wintermantel ve ark. (2006) taşınma sürelerinin farklılık gösterdiğini

T.abutilonea’da 5 gün B. tabaci’nin (B ırkında) 2 gün, T.vaporarium ve B. tabaci’nin

(A ırkın) da 1 gün olduğunu saptanmışlardır. B. tabaci ve T.vaporarium türleri EPPO

A2 listesinde yer almaktadır (Morris ve ark., 2005). T.vaparorium EPPO bölgesi

ülkelerinde seralarda yazları da açık alanda oldukça yaygındır (EPPO/CABI,1997).

B. tabaci’ nin EPPO ülkelerinde seralarda Kuzey Avrupa’da ise yaz aylarında açık

alanda varlığı rapor edilmiştir. T. abutilonea ise Amerika ve Küba’da varlığı tespit

edilmiştir (CABI,2000). Uluslar arası ticaretle birlikte infekteli bitkiler ekim

alanlarına taşınmıştır. Özellikle İspanya’ da görülen salgın infekteli bitki taşınmasına

ve B. tabaci’ nin populasyonun yaz aylarında artışına bağlanmıştır (Navas-Castillo

ve ark., 2000). Ayrıca virüsün B. tabaci ve T. vaparorium gibi vektörlerin

migrasyonuyla yayılması ve öngörülenden oldukça yavaş bir şekilde

gerçekleşmektedir. Virüs taşıyan beyazsinekler uzun mesafelere virüsü taşıyabilseler

de esas taşınma konukçu bitki ve konukçu olamayan bitkilerin uluslar arası

ticaretiyle taşınmaktadır.

ToCV, Avrupa’ da domateslerde infeksiyon yapan, beyazsinekle taşınan,

floeme sınırlı yeni bir geminivirüs olarak ilk defa Portekiz’ de 2000 yılında rapor

edilmiştir. Yaptıkları moleküler çalışmalar ışığında, damalar arası kloroz simptomu

gösteren domates bitkilerden topladıkları örnekleri PCR çalışmalarına tabii

tutmuşlardır. ToCV’ ye spesifik primerler kullanarak elde ettikleri 493 bp’ lik DNA

ürünlerinden elde ettikleri dizilimleri Gen bankası verileriyle karşılaştırdıklarında

etmenin ToCV ile % 99 oranında benzerlik gösterdiğini ortaya koymuşlardır. Bu

çalışmalar sonrasında bir Digoxigenin-DNA probu üretmişler ve dot-blot

hibridizasyon yönteminde kullanmışlardır. Hem PCR ve hem de dot-blot

hibridizasyon yönteminin araziden toplanan örneklerde virüsün saptanmasında hızlı

ve güvenilir yöntem olduklarını bildirmişlerdir (Louro ve ark., 2000).

Crinivirüslere dahil edilen domates kloroz virüsü ilk başlarda bir domates

hastalığı olarak bulundu ve o günden beri başta Amerika olmak üzere Avrupa ve

Güneydoğu Asya domates ekim alanlarında büyük problem olarak tanımlanmıştır.

(Wintermantes ve ark., 2005). Vektörün popülasyonun üst seviyelere çıktığı yıllarda

seralarda salgına neden olduğu rapor edilmiştir (Wintermentel ve ark.,2006).


7

Hastalığın görülme sıklığı Akdeniz ülkelerinde ve daha birçok ülkede son beş yılda

artış göstermiştir.

ToCV Avrupa birliği ülkeleri dışında Morocco, Puerto Rico, Amerika (Jones,

2003) ve Tayvan’da (Tsai ve ark., 2004) rapor edilmiştir. Aynı şekilde domates

bitkilerinde ToCV Avrupa’da Malaga ve Almeria civarında ilk kez epidemi

oluşturduğu için kayıt altına alınmıştır (Navas-Castillo va ark., 2000). Tenerife,

Kanarya adalarında ve Portekiz’ de (Louro ve ark., 2000), Sardunya, Sicilya ve

Apulia’da (Acotto ve ark., 2001), Güney Fransa ‘da (Decoin,2003) ve Yunanistan’

da (Dovas ve ark., 2002) EPPO tarafından rapor edilmiştir. Ayrıca Portekiz’ de

(Louro ve ark.,2000), İspanya’ da (Navas-Castillo ve ark., 2000), Poro Riko’ da

(Wintermantel ve ark.,2001), İtalya’ da (Acotto., 2001), Yunanistan’ da(Dovas ve

ark., 2002), Tayvan’ da (Tsai ve ark., 2004), İsrail’ de (Segev ve ark., 2004),

Meksika’ da (Alvarez ve ark., 2007), Küba’ da (Martinez-Zubiaur ve ark., 2008),

Brezilya’ da (Beze ve ark.,2011) da rapor edilmiştir.

Simptomlar kendini damarlar arası sararma, nekrotik lekeler ve yapraklarda

bronzlaşma şeklinde göstermektedir. Damarlar arası sararmaya ek olarak yapraklarda

kalınlaşma kırılganlık, beneklenme, bronzlaşma da görülmektedir. Beneklenmeler

başta alt yapraklarda gözlenirken zamanla üst yapraklara doğru ilerlemektedir.

Meyve ve çiçekte belli bir simptom gözlenmemiştir. Bitki canlılığını zamanla

yitirir.Arazinin geneline bakıldığında ise meyve boyunda küçülme, meyve sayısında

azalma ile birlikte raf ömründe kısalma şeklindeki problemlerle karşılaşılmaktadır.

Vektör böcek uçuşundan yaklaşık bir hafta sonra arazide bu tip simptomlar

gözlenmektedir (Wisler ve ark., 1998a, 1998b; Wintermantel ve ark., 2006).

Seralarda domateste görülen simptom ve zararlanmalar çeşitten çeşide farklılık

göstermektedir (Hanafi 2002). Her ne kadar virüs meyvede belirgin bir simptom ve

zarar oluşturmasa da Malaga ve Almeria ‘da meyvelerde verim kaybı ve olgunlaşma

süresinde gecikme şeklinde kayıplar İspanya’ daki bilim adamları tarafından rapor

edilmiştir. 1998–1999 yıllarındaki üretim sezonunda sararma sendromu Malaga ve

civarında geniş alanlara yayılmış ve etki alanı oldukça artmıştır.

ToCV’ nin doğal konukçuları arasında L. esculentum (domates), C. annum

(tatlı biber) ve yaygın iki yabancı ot türü D. stramonium, S. nigrum EPPO verileriyle


8

karantina listesine alınmıştır (Lozano ve ark., 2004; Font ve ark., 2004). C.annum

İspanya’da doğal konukçu olarak rapor edilmese de Tayvan’ da Zinnia tarafından

doğal konukçu olarak kabul edilmiştir (Lozano ve ark., 2004; Tsai ve ark., 2004).

ToCV 7 familyanın 24 bitki türünü içine alan geniş test bitkisi dizisine sahiptir.

Bunlar Aizoaceae, Amaranthaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae,

Plumbaginaceae, Solanaceae’ dir. ToCV’ nin TICV ve diğer crinivirüslerin aksine

marulu infekte etmediği rapor edilmiştir (Wisler ve ark., 1998a). Test bitkisi olan N.

clevelndii, N. benthamiana ve P. wrightii’ye bitki başına 30 beyazsinek kullanılarak

deneysel olarak taşınmıştır. P.wrightii virüs inokulasyonuna en çabuk simptom

gösteren test bitkisi olmuştur normal simptom oluşumundan 30 gün önce damar arası

kloroz şeklinde simptom vermiştir (Wintermantel v ark., 2006). ToCV’ nin komple

nükleotid dizilimi belirlenerek virionların kıvrımlı çubuk şeklinde olduğu ve 800–

850 nm uzunluğunda olduğu saptanmıştır. İlgili crinivirüs türleri ile mukayese

edilmiş ve iki genomu olduğu tespit edilmiştir.

RNA1 8594 geni nükleotitten 4 adet ORF’ den oluşmakta ve diğer viral

replikasyon faktörlerine benzer temelde replikasyon proteinini kodlamaktadır

(Lozano ve ark., 2006). İspanya’dan alınan AT80/90 izolatıyla RNA2 geninin 8244

nükleotitten ve 9 adet ORF’ den oluştuğu sekans analizleri sonucu ortaya konmuştur

(Lozano ve ark., 2005). Bunlar içerisinde HSP70 homologunu ve viral RNA’nın kılıf

proteinle birleşmesini sağlayan 2 adet proteini, kılıf proteini ve diğer bazı küçük

proteinleri kodlamaktadır. ToCV ve diğer crinivirüsler arasındaki benzerlikler genler

aracılığı ile ortaya konmuştur. ToCV’nin küçük kılıf protein (CPm) LIYV’ nin küçük

kılıf proteininden daha büyüktür (Wintermantes ve ark., 2005). Ayrıca ToCV

belirtilen bu özelliklerle de sweet patato chlorotic stunt virus ve cucurbit yellow

stunting disorder virüsle de benzerlik göstermektedir (Lozano ve ark., 2005). Bu tür

farklılıklar virüslerin biyolojik fonksiyonlarını hücreler arası hareketini, virüsün

hücre içerisinde oluşan kılıf proteinleri ve nükleik asitlerin birleşmesini

(enkapsidasyon) ve vektör böcek aktivitesini etkilemektedir (Wintermantel ve ark.,

2006).

Wisler ve arkadaşlarının 1998 yılında yaptıkları bir araştırmada dsRNA

(double-straned RNA) analizleri sonucunda ToCV’ nin yaklaşık 7800 ve 8200 bp


9

molekül ağırlığında ve çok sayıda küçük dsRNA’ nın olduğunu ortaya koymuşlardır.

Yaptıkları biyolojik çalışmalar sonucunda TOCV ile infekteli Nicotiana clevelendii

test bitkisinden alınan kesitte inclusion body ve cytoplasmic kesecikler oluştuğunu

saptamışlardır. Moleküler olarak yaptıkları çalışma sonucunda ToCV’ nin RNA1 ve

RNA 2 geninin LIYV (Lettuce İnfeksiyöz Yellow Virüs) ‘inin RNA 1

metiltransferazı ve RNA2 geninin HSP70 heat-shock geni ile ayrı ayrı benzerlik

göstermektedir.

Virüsün saptanması daha moleküler çalışmalar (RT-PCR) ile mümkün

olabilmektedir. Çok kısa sürede ve güvenilir bir şekilde saptanabilirliği ile ilgili

olarak Hirota ve arkadaşları 2010 yılında yaptıkları çalışmalarda birçok izolatı

tanıyabilen ve çoğaltabilen (ToCV-CF: GTGTCAGGCCATTGTAAACCAAG ve

(ToCV-CR: CACAAAGCGTTTCTTTTCATAAGCAGG) primer çiftini kullanarak

doğal olarak beyazsinekle bulaşık bitkilerde ToCV’ ne ait genin 360-bp lik

fragmentini çoğaltmışlardır.

ToCV’ nin kontrolünün ancak beyazsinek mücadelesiyle

gerçekleştirilebileceği rapor edilmiştir. Özellikle vektör böceklerde insektisit

dayanıklılığı göz önünde bulundurulunca mücadele şekillerinde alternatif yollar

aranmaktadır. Biyolojik ajan olarak Encarsia formosa (parazitik eşek arısı) T.

vaporariorum’ a karşı kullanılmaktadır. Ancak B. tabaci’ de aynı oranda etkili

değildir. Bu nedenle B. tabaci eradikasyonunda T. vaporariorum için kullanılandan

daha fazla biyolojik ajan kullanmak gerekmektedir. Delphastus pusillus B. tabaci’ye

karşı oldukça etkilidir (MAFF,2000). Bunların yanında ekim alanlarının etrafında

bulunan vektör böceklerin taşınmasını sağlayabilecek ve virüsün doğal konukçusu

olabilecek bitkilerden de arındırılmalıdır. Ayrıca fidelikler gerek üretim aşamasında

gerek transport aşamasında mümkün olduğunca infeksiyondan uzak tutulmalıdır.

Çünkü henüz ToCV’ ye dayanıklı çeşit geliştirilmemiştir (Navas-Castillo ve ark.,

2000)


10

3. MATERYAL VE METOD Deniz PEHLİVAN

11

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

3.1.1. Araştırmanın Yürütüldüğü Yer ve Bitkisel Materyaller

Araştırma Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü

Viroloji Laboratuvarı, iklimlendirme odası ve virüs araştırma serasında

yürütülmüştür.

Bu çalışmada kullanılan bitkisel materyallerin kaynağını Adana ve Mersin

illeri, ilçeleri ve köylerindeki açık alan ve seralarda ekimi yapılan domatesler

oluşturmuştur. ToCV’ nin önemli konukçuları arasında bulunan domates bitkisinin

Adana’ da açık alanda, Mersin’ de daha çok serada yetiştirilmesi ve virüs

simptomlarının domateste özellikle vejetasyon sonunda yapılan tepe kesimi sonrası

görülmesi nedeniyle surveyler ve örnek toplama çalışmaları; Adana’ da mayıs sonu

mersinde ise ekim sonunda yapılmıştır. Çalışmalarda kullanılacak olan ToCV’ nin

kaynağını araştırma alanlarında yapılan surveyler sırasında ToCV simptomu gösteren

bitkilerden alınan (125 örnek Adana’ dan, 210 örnek Mersin’ den, kontrol olarak 1

örnek Antalya’ dan ve 1 örnek Kıbrıs’ tan olmak üzere) toplam 337 adet örnek

oluşturmuştur (Çizelge 3.1). Seçilen örneklerin simptomlu genç yaprakları

toplandıktan sonra numaralandırılıp etiketlenerek buz kutusu içerisinde laboratuvara

getirilmiştir.

Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan bitkisel materyallerin illere göre dağılımı Türkçe Adı Latince Adı Adana Mersin Antalya Kıbrıs Domates

Lycopersicum esculentum Mill.

125

210

1

1

Toplam 125 210 1 1


12

3.1.2. Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal

3.1.2.1. DAS-ELISA Çalışmaları

ToCV’ nin ticari olarak antiserumu olmadığından ve toplanan örnekleri

serolojik olarak testleme imkanı bulunmadığından dolayı yapılan serolojik

çalışmalardaki örnekler mekanik inokulasyon sonrası simptom gözlenen test

bitkilerinde ToCV haricinde başka virüslerin olabileceği düşüncesi ile imkanlar

dahilinde kullanılan Hıyar Mozaik Virüsü (CMV) ve Tütün Mozaik Virüsü (TMV)

antiserumları Bioreba firmasından satın alınmıştır.

3.1.3. Biyolojik Tanı Çalışmalarında Kullanılan Materyaller

Surveyler sırasında araştırma alanlarından toplanan ve simptom gözlenen

domates örnekleri test bitkilerine (Çizelge 3.2) mekanik inokulasyon yolu ile

aşılanmıştır. Bu aşılamalar sonucunda ToCV’ nin mekanik inokulasyon yöntemi ile

taşınıp taşınmadığı kontrol edilmiştir. Biyolojik tanı çalışmalarında kullanılan,

domates, biber ve test bitkileri viroloji laboratuvarına ait sera ve iklimlendirme

odalarında yetiştirilmiştir.

Ayrıca mekanik inokulasyon çalışmasında porselen havan ve havaneli, 0,02M

fosfat tamponu için gerekli olan NaH2PO4.2H2O (MERCK), Na2HPO4.H2O

(MERCK) ve Mercaptoethanol (Merk) kullanılmıştır.

Çizelge 3.2. Mekanik inokulasyon çalışmasında kullanılan test bitkileri Türkçe Adı Latince Adı Çeşit Domates Biber Tütün Tatula bitkisi

Solanum Lycopersicum Mill. Capsicum annum L. Nicotiana benthamiana L. Datura stramonium

Standart Standart


13

3.1.4. RT-PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyaller

Total nükleik (tNA) asit ekstraksiyonu çalışmaları sonucunda elde edilen

farklı izolatlara ait nükleik asitler, çoğaltılması istenilen hedef nükleik asit

materyallerinin kaynağını oluşturmuştur.

RT-PCR çalışmaları 200 µl’ lik PCR eppendorf tüpleri, izolatlara ait NA’

ların çoğaltılması amacıyla komplamenter DNA (cDNA)’ ya dönüştürülmesi için

kullanılan Reverse Transcriptase enzimi (M-MLV, 200u/µl), Reverse Transcriptase

buffer (M-MLV buffer 5X), RNAse inhibitörü (40/µl), dNTPs (dATP, dGTP, dCTP,

dTTP (100mM)) Fermentas firmasından, RNA’ nın kılıf protein kodlayan hedef

bölgesine spesifik tek iplikli oligonükleotid reverse primeri İontek firmasından,

ayrıca cDNA’nın çoğaltılması amacıyla gerekli yüksek ısıya dayanıklı (Termostabil)

DNA polimeraz enzimi (Taq polimeraz, 5u/µl), PCR buffer (10X) gibi kimyasal ve

enzimler Fermentas firmasından (RNA’ nın hedef bölgesine spesifik tek iplikli

)oligonükleotid forward primerler İontek firmasından satın alınmıştır. Nükleik

asitlerin çoğaltım işlemleri AB marka Veriti model thermocyle aleti kullanılarak

viroloji laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.

3.1.5. Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyaller

Agaroz jel elektroforez çalışmaları ile kontrol edilecek olan materyal olarak

RT-PCR çalışmaları sonucunda çoğaltılan DNA kullanılmıştır. RT-PCR ürünlerinin

molekül ağırlıklarının kontrolü için kullanılan PCR marker, 100 bp’ lık DNA marker

Fermentas firmasından satın alınmıştır.


14

3.2. Metod

3.2.1. Simptomolojik Gözlemler ve Örnekleme

Adana ve Mersin illeri ve ilçelerinin açık alan ve seralardaki domates ekim

alanlarında yapılan surveylerde domates bitkilerinde ToCV’ nin tipik belirtileri

aranmış ve virüs ile bulaşık olduğundan şüphelenilen domates bitkilerinin genç

yaprakları toplanmıştır. Örnek alma sırasında plastik torbalar üzerine; örneğin

alındığı yer, bitki çeşidi ve tarih yazılarak numaralandırılmış ve örnekler

laboratuvara getirilmiştir.

Bu örnekler laboratuvarda hem ELISA yöntemi CMV ve TMV’ ye karşı

testlenmiş ve hem de mekanik inokulasyon yolu ile test bitkilerine (Çizelge 3.2)

aşılanmıştır. İnokulasyondan sonra simptomolojik gözlemlere devam edilmiş ve

simptomolojik gözlemler sırasında domateste, biberde ve test bitkilerinde birbirinden

farklı simptom oluşturduğu gözlenen örnekler seçilerek (ToCV’ nin) araştırma

materyali olmak üzere moleküler çalışmalarda materyal olarak kullanılmıştır.

Simptomlu ve simptomsuz bitkilerden alınan örnekler çalışma başlayıncaya kadar

+4 °C’ de muhafaza edilmiştir.

3.2.2. Test Bitkilerinin Yetiştirilmesi

Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan test bitkileri (Çizelge 3.2)’

nin, domates ve biber bitkilerinin tohumları 1:1:1 oranında hayvan gübresi, toprak ve

Ürgüp taşı karışımından oluşan elenmiş fide toprağı bulunan küvetlere ekilmiştir.

Küvetler tohumlar çimleninceye kadar iklimlendirme odasında bekletilmiştir.

Tohumlar çimlenip şaşırtma boyuna gelince domates, biber ve diğer test bitkileri 10

cm çapında ve 8,5 cm derinliğindeki plastik saksılara şaşırtılmıştır.

Bitkilerin sağlıklı büyümeleri için gerekli makro ve mikro besin elementleri

sulama suyuna ilave edilerek bitkilere verilmiştir. Değişik hastalık ve zararlılara karşı

gerektiğinde pestisit uygulamaları yapılmıştır (Anonymous, 2002b).


15

3.2.3. Virüsün Mekanik İnokulasyon Yöntemiyle Taşınması

Araştırma alanlarında yapılan surveyler sırasında ToCV simptomu gösteren

bitkilerden alınan örnekler laboratuvarda DAS-ELISA ile CMV ve TMV’ ye karşı

testlendikten bu bitkilerden alınan yaprak örnekleri %0,1’ lik 2-mercaptoethanol

içeren 0,02 M Fosfat tampon (pH 7,0)’ u ile 1:5 (w/v) oranında porselen havanda

ezilmiştir. Elde edilen ekstrakt 2 katlı tülbent ile süzüldükten sonra önceden

karborandum tozu serpilerek hazırlanan test bitkilerinin (Çizelge 3.2) yapraklarına

aşılanmıştır (Yılmaz ve Davis, 1984). İnokulasyondan sonra karborandum tozu ve

bitki özsuyu artıklarını uzaklaştırmak için bitki yaprakları piset kullanılarak çeşme

suyu ile yıkanmıştır. Bu bitkilere mekanik inokulasyon yapıldıktan sonra 24–25 °C

sıcaklık ve % 70–80 nem koşullarında yaklaşık 8.000 lux gün ışığı koşullarında, 16/8

(aydınlık/karanlık) periyodunda muhafaza edilmiştir. Bitkiler 1 ay süre ile periyodik

olarak kontrol edilmiştir.

Mekanik inokulasyon çalışmalarında ToCV’ nin mekanik inokulasyon

yöntemiyle test bitkilerine, domatese ve bibere taşınabilirliğinin kontrolü amacıyla

yapılmıştır.

3.2.4. Serolojik Çalışmalar

3.2.4.1. DAS-ELISA Testi Çalışmaları

Araziden toplanan domates, biber örnekleri ve mekanik inokulasyon yöntemi

ile aşılama yapılan test bitkilerinden aşılamadan 3 hafta sonra bitkilerin simptom

gösteren genç yapraklarından alınan örneklerin CMV ve TMV ile bulaşık olup

olmadığı DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immuno

Sorbent Assay) yöntemi ile testlenmiştir (Clark ve Adams, 1977). DAS-ELISA

testinde kullanılan tampon çözeltileri Ek.1 de verilmiştir.

ELISA testi uygulamasında izlenen basamaklar sırasıyla:


16

a. Kaplama tamponu ile kullanılacak optimum konsantrasyona göre

sulandırılmış γ-globulinden ELISA platenin her bir çukuruna 200 µl

konmuş ve plate üzeri kapatılarak 37 °C’ de 4 saat inkübe edilmiştir.

b. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 kez

yıkanmıştır. Yıkama tamponu 3 dakika süreyle çukurlarda bekletilmiş ve

ters çevrilerek plate boşaltılmıştır.

c. Alt alta gelecek şekilde her çift çukura 200 µl örnek tamponu ile

hazırlanmış örnekler düzenlenmiş plana göre konmuş ve platin üzeri

kapatılıp +4 °C’ de bir gece boyunca inkübe edilmiştir.

d. İnkübasyondan sonra plateler yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 kez


ters çevrilerek plate boşaltılmıştır.

e. Konjugate tamponu ile optimum kullanılacak konsantrasyona göre

sulandırılmış konjugatdan her bir çukura 200 µl konmuş ve plate 37

°C’ de 4 saat inkübasyona bırakılmıştır.

f. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 kez


ters çevrilerek plate boşaltılmış ve kağıt havlu üzerine vurarak kuruması

sağlanmıştır.

g. Substrat tamponunda taze olarak hazırlanmış substrattan (1mg/ml p-

nitrophenyl phosphate) her bir çukura 200 µl konmuş ve 30-60 dk veya

gerekli görüldüğünde daha uzun süre oda sıcaklığında karanlıkta inkübe

edilmiştir.

h. İnkübasyon süresi sonunda, gerekli olduğu durumlarda reaksiyonu

durdurmak için her bir çukura 20-50 µl 3 M NaOH ilave edilmiştir.

ı. Ölçümler Medispec ESR 200 marka ELISA okuyucusu ile 405 nm dalga

boyunda yapılmıştır.

Testlerde sağlıklı bitki, negatif kontrol, pozitif kontrol ve tampon çözelti

kontrol kullanılmıştır. Pozitif kontrole yakın değer veren ya da sağlıklı kontrol için


17

405 nm’ de elde edilen absorbans değerinin en az iki katı ve daha fazla absorbans

değeri veren örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir (Barbara ve Riccioni, 1993).

3.2.5. Total Nükleik Asitlerin Elde Edilmesi

Total NA ekstraksiyonu ToCV ile bulaşık olduğu saptanan domates bitkisinin

genç ve simptom gösteren yaprakları tülbentten geçirilerek elde edilen bitki özsuyu

kullanılmıştır. Total NA izolasyonu Astruc ve ark.(1996)’ nın önerdiği yönteme göre

yapılmıştır. Total NA çalışmalarında kullanılan tampon çözeltileri Ek.2’ de

verilmiştir.

İzlenen basamaklar sırasıyla:

a. Örnekler ekstraksiyon bufferı (100mM Tris-HCI pH.8.0, 50mM EDTA

pH. 7.0, 500 NaCI, 10mM 2. mercapto-ethanol 1/1000) ile 1:2 (w/v)

oranında sulandırılarak porselen hava içerisinde havaneli yardımı ile

ezilecek ve bitki özsuyu steril tülbentten süzülmüştür. Bitki özsuyundan

1ml alınarak eppendorf tüpleri içerisine yerleştirilmiştir

b. Örnekler 3 dakika 4.000 rpm’ de santrifüj edilmiştir.

c. Pellete 50 µl Sodium Dodecylsulfat (%20) ilave edilerek vortekste

karıştırılacak ve sonra tüpler 65 0C’ de 30 dakika su banyosunda

bekletilmiştir.

d. Tüplere 250 µl potasium asetate (5M) ilave edilerek 20 dakika buz

içerisinde bekletilmiştir.

e. Tüpler 15 dakika 13.000 rpm’ de santrifüj edilmiştir.

f. Süpernatanttan 500 µl alınarak yeni hazırlanan eppendorf tüplerine

konulup, üzerine % 100’ lük Ethanolden 500 µl ilave edilerek 1ml’ ye

tamamlanmıştır. Daha sonra tüpler vortekste karıştırılmıştır.

g. Sonra tüplere 50µl sodium asetate (3M) ilave edilecek ve örnekler tekrar

karıştırılarak -70 0C’ de bir gece bekletilmiştir.

h. Örnekler 15 dakika 14.000 rpm’ de santrifüj edilerek süpernatan

ortamdan uzaklaştırılmış ve eppendorf tüpleri ters çevrilerek filtre kağıdı


18

üzerinde 5 dakika kurutulup daha sonra pellet üzerine 1ml ethanol (% 70)

ilave edilmiştir.

ı. Örnekler RNA ların çökmesi için 5 dakika 13.000 rpm’ de santrifüj

edilerek tüp içerisindeki ethanol atılarak eppendorf tüpleri kurutma

kağıtları ile dikkatlice kurulanmıştır.

k. Elde edillen total NA’ lar 50 µl RNAse free distile su ile sulandırılmıştır.

Örnekler eppendorf tüpleri içerisinde -20 °C’ de muhafaza edilmiş ve

daha sonra PCR çalışmalarında kullanılmıştır.

3.2.6. Çift İplikli RNA (ds RNA) Analizlerinin Yapılması

dsRNA analiz çalışmalarında virüs ile infekteli domates bitkisinin genç

yapraklarından elde edilen bitki özsuyu kullanılmış ve selüloz kromotografi

yöntemine göre yapılmıştır (Valverde ve ark., 1990). dsRNA çalışmalarında

kullanılan tampon çözeltileri Ek.3’ de verilmiştir.

Takip edilen aşamalar sırasıyla :

a. İnfekteli domates yaprakları (3.5 gr), 6.0 ml 1x STE buffer (0.1 M NaCI,

0.05 M tris, 0.001 M EDTA) içerisinde porselen havanda havan eli ile

ezilerek homojenize edilmiştir. Bu homojen karışım 50 ml’ lik santrifüj

tüpüne aktarıldıktan sonra havan ve havaneli 2.0ml STE buffer ile

yıkanarak aynı tüp içerisine ilave edilerek her bir örnek için toplam 8.0 ml

STE buffer kullanılmıştır.

b. Her tüp içeresine 1.0 ml Sodium Dodesil Sülfat (% 10’ luk), 0.5 ml %2’

lik hazırlanmış bentonit ve 9.0 ml 1x STE-saturated fenol ilave edilerek

30 dakika karıştırılarak homojen hale getirilmiştir.

c. Daha sonra bu homojen karışım 5000 rpm’ de 15 dakika santrifüj edilip

üstteki sıvı fazdan 10 ml alınarak yeni tüplere yerleştirilmiştir.

d. Bu tüplere 2.1 ml % 95’ lik ethanol ilave edilerek homojen hale getirilip

bir gece +4 0C’ de bekletilmiştir.


19

e. İki adet 1 gr’ lık selüloz (CELLULOSE Fibrous, Medium, SIGMA)

tartılarak 50 ml’ lik tüplerde 25 ml ethanol (% 16) içeren STE buffer ile

karıştırılmıştır.

f. 20 ml hacminde 2 adet plastik şırınganın alt tarafına cam yünü ile disk

yapılarak kolonlar hazırlandıktan sonra selüloz karışımı yavaşça

koyularak kromotografiye başlanmıştır.

g. Sonra +4 0C’ de muhafaza edilen örnek, kolonun bir tanesine yavaşça

döküldü ve sıvı kısım tamamen aktıktan sonra kolon 40 ml ethanol (%16)

içeren STE buffer ile yıkanıp sıvının (DNA ve ssRNA) tamamen akması

sağlanmıştır.

h. Bu kolon üzerine 2.5 ml 1x STE buffer ilave edilerek sıvı kısım kolondan

tamamen uzaklaşıncaya kadar beklendikten sonra aynı kolona 10 ml 1x

STE buffer ilave edilerek kolondan geçen sıvı (dsRNA) toplanmıştır. Bu

toplanan sıvı üzerine 2.1 ml % 95’ lik ethanol ilave edilerek daha sonra

yukarıda bildirilen ‘g.’ basamağındaki işlemler tekrar edilmiştir. Yine 2.

kolon 40 ml ethanol (% 16) içeren 1x STE buffer ile yıkanmıştır.

ı. Kolondan 2.5 ml 1x STE buffer geçirildikten sonra, kolona 6.0 ml 1x

STE buffer ilave edilmiş ve sıvı ( dsRNA) kolondan geçtikten sonra 50

ml’ lik santrifüj tüpü içerisinde biriktirilmiştir. Daha sonra üzerine 500 µI

sodium acetate (3M) ve 20.0 ml ethanol (% 95) ilave edilmiştir.

j. dsRNAların çökmesi için karışım – 20 0C’ de 2 saat bekletildikten sonra

örnek 8.000 g’ de 25 dakika santrifüj edilmiş ve üstteki ethanol atıldıktan

sonra tüpler ters çevrilerek kurutma kağıdı üzerinde 15 dakika

bekletilmiştir. Tüplerin tabanındaki çökelti 200 µl EG buffer

(Elektroforez buffer (0.04 M tris, 0.02 M sodium acetate, 0.001 M

EDTA), Glycerol, Bromophenol blue, dH2O) ile sulandırılmış ve elde

edilen dsRNA – 20 0C’ de saklanmıştır.

dsRNA örnekleri Agarose jel elektroforez çalışmalarıyla kontrol edildikten

sonra PCR çalışmalarında kullanılmıştır.


20

3.2.7. RT-PCR Çalışmaları

RT-PCR çalışmalarında kullanılan ToCV izolatlarının genetik karakterlerinin

ve aralarındaki genetik farklılıkların ortaya konması için RNA–1 geni üzerinde kılıf

proteininin kodlandığı bölge çoğaltılmıştır. Çoğaltılan nükleik asit bölgelerinin

özellikleri ve nükleik asit dizilimi ile izolatların karakteri ve akrabalık analizleri

ortaya konmuştur. Çalışmalarda araştırıcılar tarafından daha önce yapılan ve

önerilen yöntemler kullanılmıştır.

3.2.7.1. PCR İçin Materyalin Oluşturulması

3.2.7.1.(1). Hedef Nükleik Asitlerin Elde Edilmesi

ToCV izolatları ile bulaşık domatesin, biberin ve test bitkilerinin genç

yapraklarından elde edilen total NA’lar 1/20 (V/V) oranında 1X TAE ile

sulandırılarak hedef nükleik asit olarak elde edilmiştir. Elde edilen bu NA’lar RT-

PCR çalışmalarında kullanılmıştır.

3.2.7.1.(2). Primerlerin Oluşturulması

Çalışmanın yapıldığı bölgedeki izolatların kılıf protein geni üzerindeki baz

dizilimleri bilinmediği için literatür taraması sonucunda kılıf protein geni üzerinde

çoğaltılmak istenen bölgeye spesifik primer çifti daha önceki yapılan çalışmalarda

araştırıcıların kullandığı ve spesifik olarak ortaya koydukları primer baz dizilimleri

referans alınarak dizayn edilmiş ve ticari olarak sentezletildikten sonra purifiye

edilmiştir.

RT-PCR çalışmasında Hirota ve ark. (2010)’ nın beyaz sinek ile doğal olarak

bulaşmış bitkilerideki ToCV-Tochigi, Florida, Yunanistan ve İspanya izolatlarının

kısmı karakterizasyonu için yapmış oldukları çalışmada kullandıkları primerlerin baz

dizilimleri dikkate alınarak sentezlettirilmiştir. Kullanılan (ToCV-CR) 5'- GTGTCA

GGCCATTGTAAACC AAG–3‘ ve (ToCV-CF) 5'- GTGTCAGGCCATTGTAAAC


21

CAAG -3' primer çifti ToCV’ nin kılıf protein geni üzerinde 360bp’ lik bölgeyi

çoğaltmak amacıyla kullanılmış ve bu bölge üzerinden karakterizasyon yapılmıştır.

3.2.7.1.(3). Amplifikasyon Sırasında Kullanılan Kimyasalların Optimum

Konsantrasyonlarının Ayarlanması

RT-PCR çalışmaları 200 µl’ lik PCR eppendorf tüplerinde yapılmıştır. RNA’

nın komplementer DNA’ ya (cDNA) dönüştürülmesi için yapılan Reverse

Transcriptase (RT) aşamasında 25 µl son hacim, cDNA’ nın çoğaltılması için

yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) aşamasında 50µl son hacim

kullanılmıştır.

ToCV’ nin farklı izolatlarının karakterizasyonu için sentezletilen primerler

farklı pmol/µl konsantrasyonlarda purifiye edilmişltir. Amplifikasyon sırasında her

primer pmol/µl konsantrasyonu ayarlanarak kullanılmıştır.

Viral RNA’nın cDNA’ ya dönüştürülmesi amacıyla çalışmanın Reverse

Transcriptase aşamasında kullanılan Reverse Transcriptase (M-MLV, stok 200u/µl)

enzimi çalışma son hacminde 10u-20u, M-MLV Buffer (stok 5X) çalışma son

hacminde 1X, RNase inhibitörü (stok 40u/µl) çalışma son hacminde 15’ i olacak

şekilde kullanılmıştır.

Çalışma amacına uygun olan hedef bölgelerin çoğaltımı için gerekli olan ve

100’ er mM olarak satın alınan Deoksinükleotid trifosfat (dTTP, dATP, dGTP,

dCTP)’ lardan 20’ şer µl alınarak 25 mM olan 80µl’ lik dNTP karışımına 120µl

ddH2O ilave edilmek suretiyle 200 µl’ ye tamamlanmıştır. Bu karşım sonucunda

dNTP’ ler 10 mM olarak elde edilmiş ve araştırıcıların daha önceki çalışmalarına

göre kullanılmıştır.

Reverse Transcriptase çalışması sonucunda elde edilen komplamenter

DNA’nın (cDNA) çoğaltılması sırasında kullanılan MgCI2 içeren Dream Taq green

buffer (10X) son hacimde 1X olacak konsantrasyonda, Taq DNA Polimeraz (5u/µl)

enzimi 50 µl çalışma hacminde (2,5u) ve son olarak ddH2O son hacmi tamamlayacak

miktarda kullanılmıştır.


22

3.2.7.2. Hedef Bölgelerin Çoğaltılması (Amplifikasyon)

3.2.7.2.(1). ToCV İzolatlarının Kılıf Protein Geni Üzerinde Tanılama Yapılacak

Bölgenin Çoğaltılması.

Bu çalışma Hirota ve ark. (2010)’ nın beyaz sinek ile doğal olarak

infektelenmiş bitkilerideki ToCV-Tochigi, Florida, Yunanistan ve İspanya

izolatlarının kısmi karakterizasyonu için yapmış oldukları çalışmada kullandıkları

yöntemde değişiklikler yapılarak yürütülmüştür.

Hedef genin çoğaltılması için aşağıdaki sıra takip edilmiştir:

a. Öncelikle 200µl’ lik PCR eppendorf tüpüne 5 µl total NA, 1 µl primer

(ToCV-CR) 5'-GTGTCAGGCCATTGTAAACCAAG–3‘ (10 pmol/µl,)

ve 9 µl ddH2O konularak thermocycle aletinde 95 oC’ de 3 dakika

bekletilerek nükleik asitlerin denatüre olması ve düz bir iplik haline

gelmesi sağlanmıştır. Tüpler thermocycle’ dan alınarak hemen buz

içerisine konulmuştur. Bu sayede tüp içerisindeki reverse primerin RNA

üzerindeki hedef bölgeye yapışması sağlanmıştır. Daha sonra tüp içerisine

10 µl reverse transcriptase karışımı (1µl dNTP, 0,3 µl M-MLV enzimi, 5

µl RT-buffer, 0,3 µl RNase inhibitörü, 3,4 µl ddH2O) ilave edilerek son

hacim 25 µl ye tamamlanmış ve örnekler 42 °C’ de 1 saat inkube edilerek

cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir.

Bu karışımdan (cDNA) 5 µl alınarak 1 µl dNTP(ATP, GTP, CTP, TTP), 5 µl

PCR buffer (10X), 0,25 u Taq polimeraz enzimi (5u/µl), 1µl primer (ToCV-CR) 5'-

GTGTCAGGCCATTGTAAACCAAG–3‘ ve 1µl primer (ToCV-CF) 5'- GTGTCAG

GCCATTGTAAACCAAG -3' ve 36,75 µl ddH2O ile karıştırılmış ve 50 µl lik son

hacimde PCR tüpüne konulmuştur. PCR tüpleri daha önceden programlanmış olan

thermocycle aletine yerleştirilmiştir. Örneklere uygulanan thermocycle programı;


23

94 santigrat derecede 3 dakika ........... 1 döngü

bağlı

94 santigrat derecede 1 saniye ..........

56 santigrat derecede 1 dakika ........... 35 döngü

72 santigrat derecede 1 dakika ..........

bağlı

72 santigrat derecede 10 dakika .......... 1 döngü

Çalışma sonucunda çoğaltılan nükleik asit’lerin sonuçlarının kontrolü 1X

TBE de hazırlanan % 2,5’ lik agaroz jelde yapılmıştır.

3.2.8. Agaroz Gel Elektroforez Çalışmaları

Agaroz jel elektroforez çalışması (Galitelli ve Minafra, 1994)’ nın önerdiği

yöntem dikkate alınarak yapılmıştır. Çalışmada kullanılan solüsyonlar Ek.4’ de

verilmiştir. İşlemler aşağıda belirtildiği sıraya göre yürütülmüştür.

a. Agaroz miktarı çalışmaya göre (%2,5 için 500 mg olacak şekilde) 20 ml

1x TAE içerisine konulmuştur.

b. Agaroz-TAE karışımı kaynayıncaya ve agaroz eriyinceye kadar

mikrodalgalı bir fırın içerisinde ısıtılmış ve sonra hacim 20 ml’ ye

ayarlanmıştır.

c. Karışım tekrar 60 °C’ ye kadar soğumaya bırakılmış ve tank içerisine

boşaltılarak tarak geçirilmiştir.

d. Jel donduktan sonra tarak dikkatli bir şekilde çıkartılmıştır. Daha sonra

jelin üzerini 1-2 mm kadar kaplayıncaya kadar tank içerisine TAE ilave

edilmiştir.

e. 10 µl örnek jel deki çukurlara dikkatli bir şekilde yerleştirilmiştir. İlk

çukura ticari marker (1µl yükleme tamponu + 1µl marker + 4µl H2O)

konulmuştur. Gren bufferdaki turuncu renk (orange G) jelin sonuna

gelene kadar jel tankına 30V (5 V/cm) elektrik akımı verilmiştir.


24

f. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel, oda sıcaklığında 10 dakika

100 ml H2O +30 µl (10mg/ml saf su) ethidium bromide karışımı

içerisinde boyanmıştır. Jeldeki fazla ethidium bromide uzaklaştırıncaya

kadar 5 dakika saf su içerisinde tutulmuştur.

Sonuçlar transilluminatörde kontrol edilmiştir.

4. ARAŞTIRMA BULGULARI Deniz PEHLİVAN

25

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

Dünyada ve ülkemizde virüsler verdiği zarar, neden oldukları ürün kayıpları

ve mücadelesindeki zorlukları bakımından hastalık etmenleri içerisinde ilk sırada yer

almaktadır. Fungus, bakteri ve mikoplasma gibi hastalık etmenlerinin mücadelesinde

kültürel kontrol yöntemlerinin dışında kimyasal kontrol yöntemleri

kullanılabilmektedir. Virüslerin kontrolünde ise bu mümkün değildir. Virüslerin

kontrol altına alınması veya zararın alt seviyeye indirilmesi ancak farklı kontrol

yöntemlerinin birlikte kullanılması ile mümkün olabilmektedir. Çalışmanın

yürütüldüğü kültür bitkilerinde görülen simptomların ToCV’ nin direk kendisinden

kaynaklandığı ve aynı zamanda CMV ve TMV virüsleri ile karışık infekteli olduğu

ortaya konulmuştur.

Araştırmalar süresince Adana ve Mersin illeri ve ilçelerindeki domates ekim

alanlarından toplanan örneklerde saptanan ToCV farklı izolatlarının moleküler

karakterizasyonları ve bu izolatların Closterovirüslere ait diğer cinsleri ile dünyadaki

farklı izolatlarının karşılaştırılması sonucunda filogenetik sınıflandırmada dünyadaki

izolatlar ile akrabalıkları moleküler (RT-PCR) tanılama yöntemleri ve DNA

dizilimleri kullanılarak ortaya konmuştur.

Çalışma sonucunda elde edilen bulgular aşağıda açıklanmaktadır;

4.1. Simptomolojik Çalışmalar

Çalışmanın yapıldığı bölgedeki gözlemlerde ToCV ile bulaşık domates

bitkisinde bitkinin vejetasyon döneminin sonunda yapraklarda sararma ve damar

aralarında renk açılması, damar bantlaşması simptomları (Şekil.4.1.; 4.2.),

meyvelerde renk oluşmaması ve sararma simptomları gözlenmiştir (Şekil. 4.3.).

İnokulum kaynağı olarak kullanılan ve araziden toplanan örneklerin mekanik

inokulasyon yöntemi ile domatese, bibere, Nicotiana benthamina ve Datura

stromanim gibi test bitkilerine aşılanması sonucunda karışık infeksiyondan

kaynaklanan domateste kloroz (Şekil 4.4.), biberde sararma ve mozaik (Şekil.4.5.),


26

N.benthamiana’ da damar arası renk açılması (Şekil.4.6.; 4.7.) ve D. stromanium’ da

sararma (Şekil.4.8.; 4.9.) simptomları görülmüştür.

Şekil 4.1. ToCV ile bulaşık domates bitkisi

A B C Şekil 4.2. Sağlıklı (A) ve ToCV ile bulaşık (B,C) domates bitkisi


27

A B Şekil 4.3. Sağlıklı (A) ve virüsle bulaşık (B) domates bitkisinden meyve

A B C

Şekil 4.4. Sağlıklı (A) ve inokulasyon yapılmış domates bitkileri (B,C)


28

Şekil 4.5. Mekanik inokulasyon yapılmış biber bitkisi

A B Şekil 4.6. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış N. benthamiana (B)


29

A B

Şekil 4.7. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış N. benthamiana (B)

A B

Şekil 4.8. (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış, Sağlıklı (B) D.strmonium,


30

A B

Şekil 4.9. Sağlıklı (A) ve Mekanik inokulasyon yapılmış, (B) D.strmonium,

4.2. Serolojik Çalışmalar

4.2.1. DAS-ELISA Testi Çalışmaları

Çalışmanın yapıldığı arazilerdeki surveylerde ToCV ile bulaşık olduğundan

şüphelenilen ve virüs simptomu gösteren 125 örnek Adana’ dan (Sera ve tarlalardan)

ve 210 örnek Mersin’ den (Sera) alınmıştır. ToCV’ nin ticari olarak antiserumu

olmadığı için ToCV’ ye karşı DAS-ELISA testi yapılmamıştır. Toplanan örneklerin

karışık infeksiyon durumlarını kontrol etmek amacıyla ELISA ile CMV ve TMV

virüslerine karşı testlenmiştir.DAS-ELISA testleri sonucunda Adana’ dan 30

örneğin, Mersin’ den 23 örneğin TMV ile, Adana’ dan toplanan ve TMV ile

bulaşık bulunan 30 örneğin 5 tanesi ve TMV saptanmayan 2 örneğin daha CMV ile

bulaşık olduğu saptanmıştır. Mersin ilinden toplanan örneklerde CMV

saptanmamıştır.


31

4.3. Moleküler Çalışmalar

4.3.1. ToCV İzolatlarının RT-PCR Ve DNA Dizilimi çalışmaları İle

Farklıklılarının Saptanması ve Filogenetik Akrabalıklarının Ortaya

Konması.

ToCV izolatlarının aralarındaki genetik farkınnın ortaya konulması ve

filogenetik sınıflandırmada akrabalıklarının ortaya konulması, en yakın izolatların

belirlenmesi amacıyla yapılan RT-PCR çalışmasında (ToCV-CR) ve (ToCV-CF)

primer çifti kullanılarak RNA-1 geni üzerinde 360 bp’ lik bölge çoğaltılmıştır. PCR

ürünlerinin agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilmesi ile jelde her 3 izolat içinde

beklenen 360 bp’lik DNA bandı gözlenmiştir (Şekil 4.15).

Daha sonra PCR sonucunda jelde kontrol edilen ve pozitif sonuç alınan

izolatlara ait PCR ürünlerinden elde edilen DNA dizilimi bilgisayar programı ile

dünyadaki diğer ToCV izolatları ile karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma sonucunda

filogenetik ağaç oluşturulmuş ve akrabalıklarının derecesi ortaya konulmuştur.

M a b c d e f h i j k l N

Şekil.4.10. PCR sonucunda elde edilen ToCV’ye ait agaroz jel görüntüsü. M : 100bp

marker, Adana izolatları ( a, b, c ), Mersin izolatları (d, e, f, g, h, ı, j),Antalya izolatı (k), Kıbrıs izolatı (l), negatif kontrol (N)

1000 bp

500 bp 300 bp

200 bp 100 bp

360bp


32

4.3.2. ToCV İzolatlarının RT-PCR Çalışmaları İle Elde edilen DNA Dizilimleri

İle Filogenetik Akrabalıklarının Ortaya Konması

Şekil.4.11.ToCV İzolatlarının Closteroviridae Familyasına ait Filogenetik Ağaç

İçindeki Durumu. ToCV (AFA28154) [JN867337.1]: Fas izolatı oCV (ABM67665) [ EF187609.1]: İspanya

Şekil.4.12. ToCV-Ada-1‘ e ait Filogenetik Ağaç, Tomato chlorosis virus

[162415388]:Yunanistan izolatı


33

Şekil.4.13. ToCV-Mer-1 ‘ e ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus

[162415388]:Yunanistan izolatı

Şekil.4.14. ToCV-Ant ‘ ye ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus

[162415388]: Yunanistan izolatı


34

Şekil.4.15. ToCV-Kıb ‘ a ait Filogenetik Ağaç. Tomato chlorosis virus [162415388]:

Yunanistan izolatı.

5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Deniz PEHLİVAN

35

5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA

Dünyada üretimi yapılan diğer kültür bitkilerinde olduğu gibi domates

bitkilerinde de bakteri, fungus, virüs ve viroid gibi çok sayıda etmen hastalık ve

zararlara neden olmaktadır. Bu etmenler içerisinde virüsler mücadele zorluğu ve

ürüne verdiği zarar düzeyi dikkate alındığında ayrı bir öneme sahiptir. Konukçunun

duyarlılığı, virüsün virülensliği, ırkı ve genetik yapısı hastalığın şiddetini ve zarar

seviyesini etkilemektedir. Virüslerin konukçu dizisi göz önüne alındığında TMV ve

CMV hem çok sayıda bitkide hastalık oluşturması, hem de çok sayıda ırka sahip

olması nedeniyle bitki virüsleri içerisinde en yaygın ve en zararlı virüslerdendir. Son

yıllardaki araştırmalar göstermiştir ki CMV ve TVM’ nin yanı sıra Domates Kloroz

Virüsü (ToCV)’ de domateslerde ürünün pazar değerinin düşmesine ve ciddi

ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle ToCV’ nin domates bitkisindeki

zararı dikkate alınarak ToCV araştırma konusu olarak seçilmiş ve moleküler

çalışmalar başlatılmıştır. Araştırmanın yürütüldüğü (Adana’da tarladan toplanan 125

örnekten 3’ ü Mersin’den seralardan toplanan 210 örnekten 7’si ToCV ile

infekteli)domates ekim alanlarında saptanan ToCV’ ye ait farklı izolatların

karakterizasyonları ve akrabalık ilişkileri moleküler yöntemler kullanılarak ortaya

konulmuştur.

ToCV’ nin mekanik inokulasyon yöntemiyle taşınıp taşınmadığı kontrol

edilmiş ve bu araştırmada mekanik inokulasyon yöntemi ile taşınmadığı tekrar

kanıtlanmıştır.

Toplanan domates bitkilerinde ToCV’ den farklı olarak CMV ve TMV

virüsleri de saptanmıştır.

Yapılan moleküler çalışmalarda ToCV’ ye spesifik primerlerin kullanılması

ile RT-PCR çalışmaları sonucunda beklenen 360 bp’ lik DNA bandı

görüntülenmiştir. Bu sonuç domateslerdeki söz konusu simptomların ToCV’ den

kaynaklandığını göstermiştir. DNA dizilimi sonuçlarında elde edilen filogenetik

akrabalık analiz sonuçları, Adana ve Mersin izolatlarının Yunanistan, İspanya ve Fas

izolatları ile çok yakın akraba olduklarını göstermiştir.


36

Çalışmanın yürütüldüğü domates üretim alanlarında ToCV’ nin varlığı bu

çalışma ile ilk kez saptanmış olup yaygınlığı konusunda henüz bir fikir yürütmek

mümkün değildir. Çünkü dünyada ilk kez 1989 yılında, ülkemizde ise 2007 yılında

saptanmıştır

Bu çalışma ile ilk kez saptanan bu hastalığın tanısı için yöntem standart hale

getirilmiş olup yaygınlığı için takip eden dönemde ilgili çalışmalar yapılacaktır.

Hastalığın simptomolojik tanısında besin elementi eksikliklerine (özellikle Mg ve

takiben Fe ve N eksikliğine) benzer olması arazi koşullarında tanıyı

güçleştirmektedir.

Gözlemlerimize bağlı olarak hastalığın epidemiyolojisini dikkate aldığımızda

ToCV’ nin özellikle sera yetiştiriciciliğinde daha önemli olduğu görülmektedir.

Çünkü, hastalık infeksiyondan 65 gün sonra ancak gözle görülebilir belirtiler

oluşturmaktadır. Açık alan yetiştiriciliğinde dış koşullara açık olmasından dolayı

vejetasyon daha erken sonlandığı için hastalığın belirtileri hasat sonuna denk

gelmektedir. Oysa seralarda hastalığa daha geç dönemlerde rastlandığı için

ekonomik açıdan daha önemli hale gelmektedir.

Mekanik olarak taşınmıyor olması ve saflaştırmanın henüz yapılmamış

olması nedeniyle biyolojik ve serolojik testler tanıda kullanılamamaktadır.

Sadece ve sadece moleküler tekniklerle saptanabilen hastalığın yeni

belirlenmiş olması da göz önüne alındığında hastalığı tanımak ve üzerinde çalışmak

oldukça zordur.

Beyaz sinekler ile aktif yayılan hastalığın kısa zamanda geniş bir alana

yayılması (Antalya, Mersin, ve Adana’ da kısa süre içerisinde bulunmuş olması)

beyaz sinek popülasyonu yüksek olduğu bölgemizde muhtemeldir ki yakın gelecekte

TYLCV gibi problem oluşturacaktır.

Çünkü güz dönemi domates yetiştiriciliğini sınırlayan faktör TYLCV’ dir ve

tek bir beyaz sinek bireyi bile virüsün taşımasında yeterlidir.Bu nedenledir ki beyaz

sinek ve TYLCV ilişkisinden dolayı seralarda konstrüksiyon bile değişmiş ve beyaz

sinek girişini engelleyecek ek önlemler alınmıştır.

ToCV’ de beyazsinekle taşınmakta, pratik anlamda belirtilere bakarak

TYLCV ile farklılık göstermektedir. TYLCV erken dönemde infekte ettiği bitkileri


37

bodurlaşmaya, yapaklarda küçülme ve kıvrılmaya ve sararmaya neden olmaktadır.

ToCV saramaya neden olmakla beraber bitki boyunu kısaltmaması, ve de geç

dönemde çıkması nedeniyle belirtisel olarak TYLCV’ den net şekilde ayırt

edilmektedir.

Bu çalışma da ToCV bölgemizde ilk kez saptanmış olup gelecek çalışmalar

için (karakterizasyonu, epidemiyolojisi, ekonomik zararı veya zarar şiddetinin

belirlenmesi, hastalığa dayanıklı hat seçimi ya da oluşturulması gibi çalışmalar)

başlangıç oluşturacaktır.


38

39

KAYNAKLAR

ACOTTO, G. P., VAIRA, A. M., VECCHIATI, M., EINETTI SIALER, M. M.,

GALLITELLI, D & DAVINO, M., 2001. First report of Tomato chlorosis

virus inItaly. Plant Disease.85,1208.

ALVAREZ–RUIZ, P., JİMENEZ, C. G., LEYVA–LOPEZ, N. E., MENDEZ

LOZANO, J., 2007. First report of Tomato chlorosis virus infecting tomato

crops in Sinaloa, Mexico.Plant Pathology 56:1043

ASTRUC, N., MARCOS, J.F., MACQUARİE, G., CANDRESSE, G.T. and

VICENT PALLAS, 1996. Studies on the Diagnosis of hop Stunt Viroid in

Fruit Trees: İdentification of New Host and Application of a Nucleic Acid

Extraction Procedure Based on Non-Organik Solvents. European Journal of

Plant Pathology, 102, 837-846.

BARBOSA, J. C., TEIXEIRA, A. P. M., MOREIRA, A. G., CAMARGO, L. E. A.,

BERGAMIN FILHO, A., KITAJIMA, E. W., REZENDE, J. A. M., 2008.

First report of Tomato chlorosis virus infecting tomato crops in Brazil.Plant

Disease 92:1709

CABI, 2000. Crop Protection Compendium,Global Modulen,2nd edn.CAB

International CD-ROOM Database.CAB Interationa,Wallingford (GB).

CLARCK, M. F., and ADAMS, A. N., 1977. Charecteristic of Microplate methodOf

Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Detection of Plant

Viruses,J.Gen.Virol., 34: 475-483.

ÇAĞLAR, B. K., 2002a. Çukurova Bölgesinde Kabakgillerde Zararlı SqMV

Virüsünün Biyolojik Ve Serolojik Yöntemlerle Tanılanması Ve Tohumla

Taşınması. Yüksak Lisans Tezi.

ÇAĞLAR, B. K., YILMAZ, M. A., 2002b. Detection of Squash Mosaic Comovirus

(SqMV) of Cucurbits by Biological, Serological and Advanced Techniques

Methods In Çukurova Region In Turkey. The Journal of Turkish

Phytopathology. Vol:31., No.2, 79-87.

ÇEVİK, B., ve ERKIŞ, G., 2007. First report of Tomato Chlorosis Virus in Turkey.

New Disease Report (2007), 16,18. ISSN 2044-0588.

40

DECOIN, M,. (2003) Tomates et concombres gare aux nouveaux virus.A propos de

cinq organimes ‘a lutte obligatoire’.Phytoma-la Defense des Vegetaux

no.558,27-29.

DOVAS, C. I., KATIS, N. I. & AVGELIS, A. V., 2002. Multiplex detection of

crinivirus es associated with epidemics of a yellowing disease of tomato in

Greece. Plant Disease 86.1345-1349.

DUFFUS, J. E., LIU H-Y and WISLER G. C., 1996. Tomato infectious chlorosis

virus – A New clostero-like virus transmitted by Trialeurodes vaporariorum.

Eur J Plant Pathol 102: 219–226.

EPPO/CABI, 1997. Bemisia tabaci. In:Quarantine Pests For Europe, 2nd edn, pp.

121-127.CABInternational,Wallingford (GB).

FONT, M. I., JUAREZ, M., MARTINEZ, O., JORDA, C., 2004. Current status and

newly discovered natural hosts of Tomato infectious chlorosis virus and

Tomato chlorosis virus in Spain.Plant Disease,88, 82.

FRANCKI, R. I. B., MOSSOP, D. W. and HATTA, T., 1979. CMI/AAB Descr.

Pl.Viruses No.213, 6pp.

GALLITELLI, D., and MINAFRA, A., 1994. Electroforesis. Course on Plant Virus

Dıagnosıs, 15-30 October 1994. Adana-Turkey. Page: 89-99.

GÜLDÜR, M. E., M. ÖZASLAN, S. BALOĞLU, M.A. YILMAZ, 1994. Pepper

milde mottle virus in pepper in Türkiye. 9th Congress of the Mediterranean

Phytopathological Union, Kuşadası, Aydın, Türkiye, 465-467 pp.

HANAFI, A., 2002. Inasive species:a real challenge to IPM in the Mediterrranean

region?European Studies Network Newsletter no.13,p. 4. John Innes

Centre,Norwich (GB).

HIROTA, T., NATSUAKI, T., MURAI, T., NISHIGAWA, H., NIIBORI, K.,

GOTO, K., HARTONO, S., SUASTIKA, G., and OKUDA, SEIICHI., 2010.

Yellowing disease of tomato caused by Tomato chlorosis virus newly

recognized in Japan. J Gen Plant Pathol (2010) 76:168–171.

JONES, D. R., 2003. Plant virus transmitted by whiteflies.Eur J Plant Pathol

109:195-219

41

JONES, J. B., J. P., JONES, R. E. STALL, T. A., ZITTER., 1991. Compendium of

Tomoto Diseasses. APS Press, St. Paul, Minnesota, USA, 73 p.

LOURO, D., ACOTTO, G. P. & VAIRA, A. M., 2000. Ocurrance and diagnosis of

Tomato chlorosis virus in Portugal.European Journal of Plant Pathology

106.589-592.

LOZANO, G., MORIONES, E. & NAVAS-CASTILLO, J., 2004. First report of

sweet pepper (Capsicum annum ) as a natural host plant for Tomato

cholorosis virus .Plant Disease.88,224.

LOZANO, G., MORIONES, E., NAVAS-CASTILLO, J., 2006. Complete nucleotide

squence of the RNA2 of the crinivirus tomato chorosis virus.Arch Virol

151:581-587.

MAFF, 2000. Current recommendations for eradication and containment.PHSI

Handbook of instructions. MAFF, London(GB).

MARTİNEZ-ZUBİAU, Y., FİALLO-OLIVE, E., CARILLO-TRIPP, J., RIVERA-

BUSTAMANTE, R., 2008. First report of tomato chlorosis virus infecting

tomato in single an mixed infections with Tomato yellow curl virus in

Cuba.Plant Disease 92:836.

MASON, G., P. ROGGERO, L. TAVELLA, 2003. Detection of Tomato spotted wilt

virus in its vector Frankliniella occidentalis by reverse transcription

polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 109:69-73.

MILNE, R. G., 1993. Electron Microscopy of in Vitro Preparations. In: Mathews

REF (ed) Diagnosis of Plant Virus Diseases. CRC, Boca Raton, pp 215-251.

NAVAS-CASTILLO, J. & MORIONES, E., 2000. ToCV: a new threat to European

horiculture . In:European Whitefly Studies Network Newsletter no. 3. John

Innes Centre,Norwic (GB).

NAVAS-CASTILLO, J., CAMERO, R., BUENO, M. & MORIONES, E., 2000.

Severe Yellowing outbreaks in tomato in Spain associated with infections of

Tomato chlorosis virus Plant Disease 84,835-837.

NIE, X., R. P. SINGH, 2002. A new approach for the simultaneous differentiation of

biological and Geographical strains of Potato virus Y by uniplex and

multiplex RT-PCR. Journal of Virological Methods 104:41-54.

42

SEGEV, L., WINTERMANTEL, W. M., POLSTON, J. E., LAPIDOT, M., 2004.

First report of Tomato chlorosis virus in Isreal.Plant Disease 88:1160.

SIMONE, G. W., HOCHMUTH, R. C.,WISLER, G. C., DUFFUS, J. E, LIU H-Y

and LI, R.H., 1996. A new whitefly-vectored closterovirus of tomato in

Florida. Tom Inst Proc . 71–74.

TSAI, W. S., SHIH, S. L., GREEN, S. K., HANSON, P. & LIU, H. Y., 2004. First

report of the occurance of Tomato chlorsis virus and Tomato İnfectious

chlorosis virus in Taiwan.Plant Disease 88,311

TÜİK, 2010. www. tuik.gov.tr. Tarımsal İstatistikler (Üretim, Fiyat, Değer). Türkiye

İstatistik Kurumu. Ankara.

VALVERDE, R. A., NAMETH, S. T., and JORDAN, R. L., 1990. Analysis of

Double Stranded RNA for Plant Virus Diagnosis. Plant Disease. 74:255-258.

WINTERMANTEL, W. M., WISLER, G. C., 2006. Vector specificity,host range,

and genetic diversity of Tomato chlorosis virus.Plant Disease 90:814-819.

WINTERMANTEL, W. M., WISLER, G. C., ANCHIETA, A. G., LIU H-Y,

KARASEV, A. V., TZANETAKIS, I. E., 2005. The complete nucleotide

squence and genome organization of tomato chlorosis virus. Arch Virol

150:2287- 2298.

WISLER, G. C., DUFFUS, J. E., 2001. Transmission properties of whitefl-borne

criniviruses and their impact on virus epidemiology. In:Harris KF,Smith OP,

Duffus JE (eds), Virus-insect-plant interactions. Academic Press, San Diego,

pp. 293–308.

WISLER, G. C., DUFFUS, J. E., LIU, H. Y. & LI, R. H., 1996. A new whitefly-

transmitted virus infecting tomato from Florida. Phytopathology86

(Supl.):S71.

WISLER, G. C., DUFFUS, J. E., LIU, H.-Y., LI, R. H., 1998a. Ecology and

epidemiology of Whitefly transmitted closteroviruses. Plant Dis 82:270–280

WISLER, G. C., L. I, R. H., LIU, H.-Y., LOWRY, D. S., DUFFUS, J. E., 1998.

Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite

closterovirus of tomato. Phytopathology 88: 402-409.

43

WISLER, G.C., LI, R. H., LIU, H.Y., LOWRY, D.S. & DUFFUS, J.E., 1998b.

Tomato chlorosis virus: a nw whitefly-transmitted, phloem-limited bipartite

closterovirus of tomato, Phytopathology 88,402-409.

YILMAZ, M. A., R. F. DAVIS, E. H. VARNEY, 1983. Viruses on vegetable crops

along the Mediterranean Coast of Turkey (summary). Pytopathology 73:378

YURTMEN, M., GÜLDÜR, M. E. and YILMAZ, M. A., 1998. Tomato Spotted Wilt

Virus On Pepper In İçel Provinces Of Turkey‘‘Recent Advances In Vegatable

Virus Resarch’’, Ninth Conference Of The I.S.H.S. Vegatable Virus Working

Group, Torino, İtaly, 22-27August, 1998 .P.91-92.

45

ÖZGEÇMİŞ

1986 yılında Gaziantep’te doğdu. İlkokul öğrenimini Alanya’ da Hayate

Hanım İlkokulu’ nda tamamladı. Ardından ortaokul ve lise öğrenimine Alanya Ayşe

Melahat Erkin Anadolu Lisesi’ nde devam etti.

2005 yılında Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Bitki Koruma

Bölümünde başladı ve 2009 yılında Ziraat Mühendisi olarak mezun oldu. 2011

yılında Çukurova Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim

Dalı’ nda Yüksek Lisans eğitimine başladı.

Halen araştırmalara devam etmektedir.

46

EKLER

48

Ek 1.

ELISA Testinde Kullanılan Tampon Çözeltiler

1-Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 (Fosfat tamponu) 8.0 gr NaCl

0.2 gr KH2PO4

2.9 gr Na2HPO4.12H2O veya

2.3 gr Na2HPO4.7H2O

1.44. gr Na2HPO4. 2H2O

1.15 gr Na2HPO4 (anhdrous)

0.2 gr KCl

0.2 gr NaN3

Yukarıda miktarları verilen kimyasallar 1 litre saf suda eritilip pH’ sı 0.1 N

NaOH veya 0.1 N HCl ile ayarlanmış ve 4 oC’ de saklanmıştır.

2-Coating buffer pH 9.6 (Kaplama tamponu) 1.59 gr Na2CO3

2.93 gr NaHCO3

0.2 gr NaN3

Yukarıda miktarı verilen kimyasallar 1 litre saf suda eritilip pH’ sı

ayarlanmış ve 4 oC’ de saklanmıştır.

3-Washing Buffer (Yıkama tamponu)

Bir litre PBS tamponu 0.5 ml Tween-20 ilave edilerek hazırlanmıştır.

4-Sample Extraction Buffer (Örnek tamponu) Bir litre yıkama tamponu çözeltisi içine 20 gr Polyvinylpyrolidone (PVP-40)

ilave edilerek hazırlanmıştır.

49

5-Enzyme Conjugate Buffer (Konjugat tamponu) Bir litre örnek tampon çözeltisine 2 gr ovalbumin (egg albumin) ilave

edilerek hazırlanmıştır.

6-Substrat Buffer pH 9.8 (Substrat tamponu) 97 ml Diethanolamine 800 ml saf su içine ilave edildikten sonra 0.2 gr NaN3

konmuş ve HCl ile pH 9.8’ e ayarlanarak 1 litreye tamamlanmıştır.

50

Ek. 2

Total RNA Analizlerinde Kullanılan Çözeltiler

1-Ekstraksiyon bufferı (0.1M glycine-NaOH, pH.9,0; 50mM NaCI; 10mM EDTA;

2% sodium dodecyl sulfate [SDS]; 0,2% sodium diethyldithiocarbomate [DİECA-

Na]; ve 1% sodium lauryl sarcosine).

0.750 gr glycine 80 ml saf su içerisinde eritilmiş ve NaOH kullanılarak pH’

sı 9,0 olarak ayarlanmıştır. Daha sonra bunun üzerine 0.292 gr NaCI ve 0.288 gr

EDTA ilave edilerek eriyinceye kadar karıştırılmıştır. Karışım iyice eridikten sonra

üzerine 2 gr SDS, 0,2 gr DİECA ve 1 gr sodium lauryl sarcosine ilave edilmiş bütün

karışımlar eridikten sonra son hacim 100 ml ye tamamlanmıştır.

2-Phenol/chloroform/isoamylalkol (25:24:1)

25 ml 1X TAE buffer ile sature edilmiş phenol, 24 ml chloroform ve 1 ml

isoamylalkol karıştırılmıştır.

3-Sodyum asetate CH3COONa(3M)

40.824 gr sodium asetate 60 ml su içerisinde çözülmüş ve volum 100 ml’ ye

tamamlanmıştır.

4- 1X TE buffer (10mM Tris-HCI, 1mM EDTA; pH 8,0)

0.157 gr Tris-HCI ve 0.037 gr EDTA 80 ml saf su içerisinde eritilmiştir.

Çözeltinin pH sı 8,0 olarak ayarlanıp sonra son hacim 100 ml’ ye tamamlanmıştır.

51

Ek. 3

dsRNA Analizlerinde Kullanılan Solüsyonlar

Ekstraksiyon bufferı (STE) pH 6.8 (0.1 M NaCI, 0.05 M tris, 0.001 M

EDTA). 1 Litre Stok solüsyon (10X)

Tris-base 61.0 gr

NaCI 58.0 gr

Na2EDTA.2 H2O

(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) 3.7 gr

Distile H2O 800.0 ml

Yukarda verilen miktarlar karıştırlıp HCI ile pH 6.8’ e ayarlanıp volum H2O

ile 1000 ml’ ye tamamlanmıştır.

STE-ethanol (% 16) STE 10 X 100.0 ml

Ethanol % 95 174.1 ml

Distile H2O 726.0 ml

52

Ek. 4

Agarose Gel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Çözeltiler

1- TBE buffer ( 89 mM Tris, 89 mM boric acide, 2 mM EDTA) (pH: 8,3) 1X TBE buffer hazırlamak için 10.777 gr Tris-Base, 5.502 gr boric acide ve

0.744 gr EDTA 900 ml saf su içerisinde eritilmiştir. Çözeltinin pH’ sı 8,3 olarak

ayarlandıktan sonra son hacim 1000 ml’ ye tamamlanmıştır.

2-TAE buffer (10mM Tris, 5mM Sodium acetate, 0,5 mM EDT (pH: 8.3)

1X TAE buffer hazırlamak için 1.211 gr Tris-Base, 0.680 gr sodium acetate

ve 0.186 gr EDTA 900 ml saf su içerisinde eritilmiştir. Çözeltinin pH’ sı 8,3 olarak

ayarlandıktan sonra son hacim 1000 ml’ ye tamamlanmıştır.

3-Farklı konsatrasyonlarda agaroz jel hazırlamak için; % 1,2’ lik agaroz jel için 360 mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde

% 2’ lik agaroz jel için 600 mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde

% 1,5’ lik agaroz jel için 450mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde

4-Ethidium bromide

10 mg ethidium bromide 1 ml saf su içerisinde ependorf tüpünde eritilmiştir.

Daha sonra bu ana stoktan 30 μl alınarak 100 ml saf su içerisine ilave edilmiştir.

Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ …library.cu.edu.tr/tezler/8929.pdf ·...

Documents