cultivo de orquídeas in vitro y principios básicos del cultivo i.v
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PROPAGACIÓNDECattleyarexENCULTIVOINVITRO Henry Manuel Vera Tudela Ramírez
Tarapoto-Perú
“PROPAGACIÓN DE Cattleya rex en CULTIVO IN VITRO”
Henry Manuel Vera Tudela Ramírez Agrónomo
TARAPOTO – PERÚ
2013
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I. INTRODUCCIÓN La actividad agrícola constituye la actividad productiva más importante de una
zona y base de una economía nacional, en un extremo de la agricultura
regional se sitúa la agricultura comercial, generalmente de pequeña y mediana
escala, en el otro extremo la agricultura de subsistencia, esto ha generado
problemas como la tala indiscriminada de los bosques con esto la destrucción
de habitads de especies de orquídeas y su comercialización ilícita.
Existe la necesidad de buscar soluciones rápidas como la introducción de
nuevas tecnologías ajustables a la realidad de la región, razón por la cual
CORPORACION G Y G E.I.R.L a través del laboratorio de CULTIVO DE
TEJIDOS VEGETALES, cuyo fin es multiplicar masivamente orquídeas y otras
plantas ornamentales, manteniendo las características genéticas.
Las técnicas de tejidos vegetales, se representa como una alternativa a las
metodologías convencionales de propagación, permitiendo la multiplicación de
individuos de una especie en periodos cortos sin tener pérdidas ya sea por
semillas u otros órganos; este método permite la propagación de especies
selectas altamente productivas. Así mismo la aplicación de métodos en cultivo
in vitro facilita la conservación de bancos de germoplasma, con la finalidad de
mantener especies con su característica genéticas originales.
Para investigaciones futuras en el campo agronómico la propagación in vitro es
una técnica aplicable en la región San Martín, esta ha servido de base a
muchos países industrializados constituyéndose hoy en una herramienta más
importante para el desarrollo de la agricultura y la floricultura.
El presente trabajo describe las actividades realizadas en el laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales de la empresa CORPORACION G Y G E.I.R.L
como parte de prácticas pre-profesionales realizada durante el periodo Junio a
Setiembre del 2013
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II. ANTECEDENTES 2.1 Cultivo de Tejidos in vitro
(Abdelnour, E; et, al. 1994) dice que, se le define como un enfoque
multidisciplinario que involucra varias ciencias (biología, bioquímica,
genética, virología, agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria
entre otras) cuyo fundamento es el uso de organismos vivos o de
compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de
valor para el hombre. El cultivo de tejidos o propagación in vitro consiste
en cultivar un inóculo con potencialidad de diferenciación bajo condiciones
asépticas en presencia de un medio nutritivo, dicha capacidad de
regenerar un nuevo individuo entero es única de las plantas. Al igual que
en otros métodos de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos
descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones, es
decir, copias genéticamente idénticas a la planta madre, mientras que en
plantas propagadas por semilla (propagación sexual), la descendencia no
es clónica puesto que cada semilla tiene su propia base genética
resultante de la mezcla de sus progenitores, por tanto cada individuo es
único.
(RUÍZ, 2003) dice, que es un grupo heterogéneo de técnicas, mediante
las cuales un explante (parte separada de un vegetal, célula, tejido,
embriones, etc.) con potencialidad de diferenciación se cultiva bajo
condiciones asépticas, en presencia de un medio de cultivo constituido
por macronutrientes, vitaminas y hormonas que se incuban bajo
condiciones ambientales controladas.
(ROCA Y MROGINSKI, 1991) menciona que las técnicas de cultivo in
vitro han contribuido no solo a un mejor entendimiento de los eventos de
diferenciación celular, si no aún mejor aprovechamiento de tales eventos
en la explotación más eficiente de las plantas. Al igual que otros métodos
de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos descendientes de
una planta madre cultivada in vitro son clones, es decir copias
genéticamente iguales entre ellas e idénticas a la madre.
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(Mejia, 1998) menciona que el cultivo de tejidos vegetales es una
importante técnica nueva de propagación de plantas que se halla a
disposición del cultivador, pero aún no es ampliamente usada debido a su
poca difusión. La reproducción vegetativa, si ocurre naturalmente o con la
intervención humana, se inicia a partir de tallos, raíces, hojas; no hay
mesclas de caracteres genéticos, la cual ocurre en la reproducción sexual
a nivel de las flores. El principio de cultivo de tejidos es simple; primero,
es necesario aislar una parte de la planta (explante); segundo, proveer al
explante de un medio ambiente apropiado (medio de cultivo adecuado y
en condiciones físicas propias de la especie) en el cual pueda expresar su
potencial intrínseco o inducido, partiendo de un stock de plantas de
sanidad aprobada. Estas son multiplicadas asépticamente bajo una
cámara de flujo laminar, se seccionan segmentos de tallos u otras partes
de la planta, son transferidos a recipientes de vidrio con medio fresco de
cultivo, los recipientes son sellados con tapas autoclavables y cintas de
parafilm.
(Aceves, J. et. al, 1994) menciona que, WHITE en el año de 1932, logra
el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos ápices de
raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos del ápice radical propiciaron
crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en
los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se
debió, como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo
y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le
da un buen impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin
embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtienen
proliferación celular en forma, los ápices de raíz solo crecen en longitud
como lo harían normalmente como parte de la raíz de la planta intacta. No
es así hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en
tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo
Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de
tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de
células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos)
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utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el
despegue de las técnicas de cultivo in vitro.
(Roca, 1991) menciona, que es útil destacar la secuencia de eventos
asociados a la multiplicación de plantas mediante la técnica de cultivo
aséptico, de la siguiente manera:
ETAPA 0
Etapa inicial, que comprende la selección de una modalidad de
pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte.
ETAPA I Es la etapa de establecimiento, el cual se establece el cultivo inicial o
primario.
ETAPA II Es la etapa de multiplicación de brotes o multiplicación simplemente.
ETAPA III Corresponde al enraizamiento o etapa de pretransplante, tiene como
objetivo producir una planta autótrofa que pueda sobrevivir a las
condiciones de transplante en el medio de cultivo.
ETAPA IV Transferencia final a la etapa de medio ambiente y que este en
condiciones de adaptarse a factores externos no controlados (luz,
humedad, etc.).
Frecuentemente las condiciones específicas del medio o cultivo
aséptico están asociadas con cada una de las etapas mencionadas, y
cuando sea posible conviene establecer una estrategia de
multiplicación basada en la interpretación de dichas condiciones. Sin
embargo, no se debe llegar a la deducción de que estas etapas son
siempre completamente distintas y separables.
2.1.1 El entorno del cultivo
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que
conforman el biotopo de la planta en la naturaleza es técnicamente
muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la
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realidad escogiendo aquellos factores que se pueda mantener
controlado.
En resumen el cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica
que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como
químico, en el que se sitúa al explante. Conviene por tanto,
conocer cuáles son los principales factores que conforman el
ambiente del explanto y que deberán ser controlados.
De estas consideraciones surge el establecimiento de los cultivos
de tejidos, es decir, la separación del explante y las operaciones
relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida
del tipo de explante y del sistema de cultivo que se emplee, lo que
a su vez dependerán del objetivo perseguido. En otras palabras,
las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son
exactamente las mismas que se usan para cultivar meristemas; del
mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran
utilidad para el logro de un objetivo pero puede no ser útil para otro
(Roca y Mroginski, 1991).
2.1.2 Micropropagacion
Cuando un inoculo con potencialidad de diferenciación se incuba
en condiciones favorables (balance hormonal apropiado) regenera
un nuevo individuo. La micropropagacion es prácticamente una
multiplicación masiva in vitro (Roca y Mroginski, 1991).
2.1.3 Ventajas de la micropropagacion (Mejia, 1998) menciona:
- Es uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para
erradicar patógenos. - Permite uniformidad genética.
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- Manejo de grandes volúmenes de plantas en un área pequeña. - Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del
año. - Se propaga masivamente plantas libres de enfermedades en
corto tiempo. - No existe la perdida de las características genéticas del material. - Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento
de los explantes en incubación. - El resultado es la obtención de plantas libres de enfermedades. - Se obtiene plantas homogéneas. - Se conservan materiales que están en proceso de extinción. - Propagación de especies de difícil multiplicación por sistemas
tradicionales.
2.1.4 Desventajas de la micropropagacion (Mejia, 1998) menciona:
- Variación de respuesta entre los genotipos.
- Se requiere de personal especializado.
- Requiere de infraestructura y equipamiento.
- Los productos químicos son de elevado costo.
- Contaminación de materiales por inadecuado desarrollo de
asepsia.
- Perdida de materiales por desperfectos de equipos (aire
acondicionado, fluorescentes, ozonizador y otros).
- Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los
cambios ambientales, de manera que el éxito o fracaso de todo el
proceso depende de la aclimatación.
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2.2 Vitropatógenos (García et al., 2007) menciona que, la contaminación microbiana es uno
de los problemas más graves en la propagación in vitro de especies
vegetales en el mundo, ya que produce cuantiosas pérdidas de material
vegetal tanto en la micropropagacion comercial como en los trabajos de
investigación. Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos,
bacterias y levaduras, que en muchos casos no son patógenos en
condiciones de campo.
2.3 Eliminación de bacterias y hongos (García et al., 2007) menciona que, Se han establecido numerosos
procedimientos tecnológicos para controlar o disminuir la presencia de
contaminantes y el empleo de productos químicos (fungicidas y
antibióticos) ha constituido una vía rápida tanto para atenuar como para
eliminar estos microorganismos (Carrazana et al., 1997). Con el fin de
atenuar el uso de estos compuestos y sus consecuentes efectos
negativos, se buscan nuevas alternativas sobre la base de productos
naturales. Se cree que la producción de aceites esenciales por las plantas
está fundamentalmente justificada como un mecanismo de defensa contra
los patógenos y plagas (Oxenham, 2003) y han mostrado un amplio
espectro de actividad contra microorganismos patógenos de plantas y
humanos (Qamar y Choudhary, 1991). Por ejemplo, el aceite esencial de
Cymbopogon nardus que es extraído de las hojas y el tallo de la planta, es
un aceite volátil con propiedades antisépticas, desodorantes, insecticidas,
tónicas y estimulantes (Shahi y Tava, 1993). Se ha demostrado que
aceites esenciales de plantas del género Cymbopogon, poseen
propiedades antimicrobianas, incluyendo a C. nardus (Saikia et al., 2001), es por eso que este trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad
antimicrobiana del aceite esencial de C. nardus para el control de
microorganismos contaminantes, aislados del cultivo in vitro de especies
vegetales.
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2.4 La autoclave y su funcionamiento 2.4.1 Esterilización
(Roca, 1991) menciona, el calor es uno de los agentes que se utiliza
con más frecuencia en la esterilización. Se puede usar en forma de
llama directa, calor húmedo (vapor) o como calor seco (aire
caliente); cuando se utiliza en calor húmedo puede ser de forma de
vapor abierto o vapor bajo presión. Ocasionalmente se puede usar
agua caliente pero no hirviendo.
2.4.2 Vapor bajo presión (autoclave) El vapor bajo presión es muy eficiente para destruir todas las formas
de bacterias y hongos y sus esporas, y es el método más utilizado
para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de
cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolábiles)
(Roca y Mroginski, 1991).
2.4.3 Funcionamiento de la autoclave (Roca y Mroginski, 1991) menciona, al utilizarlo es necesario
extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización ya
que, a presiones iguales la temperatura de una mezcla de aire y
vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del aire se
logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del
aparato antes de cerrar la válvula correspondiente. La temperatura
dentro del autoclave se regula mediante la presión y directamente
proporcional a ésta; la presión se lee en un manómetro que forma
parte del autoclave. Para esterilizar los materiales relacionados con
el cultivo de tejidos se acostumbra a usar una presión de 15 libras
(lb) durante 20 minutos, a esta presión la temperatura del vapor es
aproximadamente 121°C suficiente para matar virtualmente todas
las formas de vida en cinco minutos. La desinfección se limita al
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proceso de destrucción de los microorganismos mediante métodos
químicos; la esterilización se refiere a menudo al método físico para
la destrucción de los microorganismos. Se utiliza la palabra axénico para las preparaciones que están libres de virus, viroides o
micoplasma.
2.5 Medios de cultivo Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un
determinado explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo,
en el cual hay que considerar no solo sus componentes si no su
preparación. En la actualidad existen innumerables formulaciones cada
una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos químicos que
suministran carbono, sustancias reguladoras de crecimiento y otras
sustancias, (Roca y Mroginski, 1991). Concentraciones ideales de sustancias químicas necesarias y las
combinaciones apropiadas de nutrientes, así como su forma química
adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas las partes
de la planta en diversas especies vegetales. (Ruíz, 2003).
2.6 Consideraciones en la preparación de medos de cultivo Es necesario preparar el medio utilizando agua destilada. Se debe evitar
el almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de
contaminantes; todas las sustancias químicas usadas para su preparación
deben ser de un alto grado de pureza. Para la preparación de los medios
dependerá en primera instancia del tipo de medio, de su consistencia y de
la presencia de componentes termolábiles, (Roca y Mroginski, 1991).
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2.7 Sustancias orgánicas complejas usadas en germinación asimbiótica de semillas de orquídeas.
(Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, un gran número de
aditivos se usan para favorecer la germinación asimbiótica de semillas de
orquídeas y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos
(Arditti, 1967).
Los más frecuentes usados son el endosperma líquido de coco, el jugo de
tomate y el fruto de plátano. Steward and Simmonds (1954) reportaron
que las capas formativas del fruto del plátano poseen sustancias que
estimulan la división en células de zanahoria; con solo esta evidencia
disponible, Khalifah (1966 b) llegó a la conclusión de que estas
sustancias responsables de la división celular eran las citoquininas.
Encontraron que el fruto de plátano contiene pequeñas cantidades de
compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-
(2-isopentilamino) purina pero que comparados con el endosperma
líquido del coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este
aditivo daban una respuesta similar a 500 g de plátano. Sin embargo,
existen evidencias que el efecto del plátano sobre el desarrollo de las
orquídeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a
las citoquininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines
a giberalinas y auxinas en el mismo (Khalifah. 1966a, 1966b).
(Valmayor. 1972), reportó que el endosperma líquido del coco solamente
permite una pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda
y Cattleya, mientras que su combinación con extractos de plátano resulta
en un buen desarrollo de raíces y tallos.
2.8 Carbón activado
(Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, el carbón utilizado en el
cultivo de tejidos es el carbón resultante de la combustión de tejidos
vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc.). Actualmente
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es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo in vitro
de orquídeas, tanto para la siembra de plántulas como de protocormos
obtenidos a partir de semillas o de meristemas (Yam et. al., 1990).
Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado
cuando entran en contacto con este, el grado de adsorción depende de la
temperatura, el pH, y la composición química de la sustancia adsorbida,
siendo mayormente adsorbidos los compuestos moderamente polares y
pocos solubles, como fenoles, fitohormonas y vitaminas, en comparación
con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, etc. que no
son adsorbidos (Weatherhead et. al., 1979).
Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón
activado, pero si son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli-
valentes. Es por ello en estos casos importantes el uso de agentes
quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (Yam et. al., 1990).
Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del
carbón activado en el cultivo de orquídeas (Weatherhead et. al., 1978). En primer lugar la contribución de minerales en forma de impurezas
estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para
adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de
cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácido para
– hidro – benzoico). Tercero la adsorción de sustancias producidas
durante la esterilización en el medio de cultivo, como el hidroximetil-
furfural, resultado de la deshidratación de las hexosas que afectan el
crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno
que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y
protocormos.
Para el cultivo de orquídeas se utiliza carbón activado en medios de
cultivo para germinación de semillas y en medios para desarrollo como
para etapas posteriores (replante) a una concentración de 2 g/l.
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2.9 Experiencias en cultivo in vitro de orquídeas con medios de cultivo casero. 2.9.1 Medios de cultivo para la siembra de semillas y meristemas.
(Padilla, E. 2008) en su tesis dice que (Machado. 2003) menciona, que para un laboratorio casero, se puede preparar
medios con componentes de fácil adquisición y baratos. Estos
medios son tan eficientes y en algunos casos hasta mejores que
los medios usados tradicionalmente en el cultivo in vitro de
orquídeas. Los componentes para la preparación del medio de
cultivo casero se pueden adquirir en cualquier feria libre o mercado
de productos de primera necesidad, la preparación del medio es
tan fácil que quien sabe preparar una vitamina para su consumo
personal, sabrá también con seguridad hacer un excelente medio
para producir orquídeas.
2.9.2 Receta de un medio de cultivo para cultivar semillas.
(Machado. 2003), recomienda que todos los componentes a
usarse en la preparación de un medio de cultivo debe ser orgánico
sin agroquímicos, estos son:
Plátano seda semi maduro sin cascara, aproximadamente 50 g.
Papaya (una cuchara de sopa bien llena) aproximadamente 50
g.
Tomate cereza (cinco pequeños tomates) aproximadamente 50
g.
Agua de coco verde (1 vaso) aproximadamente 120 ml.
Azúcar (una cuchara de sopa) aproximadamente 20 g.
Agar-Agar (una cuchara de sopa) aproximadamente 10 g.
Polvo de carbón (una cuchara de sopa) aproximadamente 01 g.
Agua destilada completar para un litro.
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2.10 Características de la orquídeas 2.10.1 Clasificación taxonómica
(Dresler, 1993) menciona, Clasifica a las orquídeas de la siguiente
manera:
REYNO: Plantae
SUBREINO: Embriofitos
PHYLLIUM: Traqueofitas
SUBPHYLLIUM: Pterópsidos
CLASE: Angiosperma
SUBCLASE: Monocotiledoneas
ORDEN: Microsperma
SUBORDEN: Ginandras
FAMILIA: Orquídeas
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2.10.2 Género Cattleya (Cavero, M. et. al., 1991) menciona, que el género dedicado a
Willian Cattle, eminente horticultor y uno de los primeros
aficionados en tener una colección privada de orquídeas. Este
género es conocida por los cultivadores como “la reina de las
orquídeas”.
Crece en forma epifita o algunas veces sobre rocas; se conoce
unas 65 especies, todas en américa tropical, extendiéndose desde
México hasta Argentina.
Presentan pseudobulbos prominentes, los cuales pueden ser
unifoliados o bifoliados. En la mayoría de las especies los
pedúnculos florales emergen del extremo superior del pseudobulbo
adulto y los botones florales están envueltos en una espata simple
o doble. En casi todos los casos, los sépalos están notoriamente
extendidos y los pétalos son más anchos que los sépalos, el labelo
es grande y vistoso.
Las Cattleyas son las orquídeas más ampliamente
comercializadas. Miles de híbridos han sido producidos cruzando
Cattleyas con géneros aliados o próximos.
Para el Perú se reportan seis especies, distribuidas en Amazonas,
Cajamarca, Huánuco, Junín, Loreto, Piura, San Martín y Tumbes.
(Gutierrez et. al, 1998) menciona, el género Cattleya requiere de
una cantidad de luz del 70 – 80% y en algunos casos de luz solar
directa, mientras otras requieren de menor intensidad luminosa
como es el caso de la Phalaenopsis y Góngora. Las quemaduras
por exceso de luz causan daños irreversibles en la hoja y esta
puede llegar a secarse. Las orquídeas de climas cálidos prefieren
temperaturas mayores a 21°C y los de clima intermedio toleran
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tanto temperaturas altas como bajas. El riego de las orquídeas
debe hacerse por las mañanas para que las plantas tengan tiempo
de secarse en el transcurso del día. Regar en las tardes o en las
noches favorece la aparición de pudriciones y enfermedades
causadas por hongos y bacterias.
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III. ACTIVIDADES DESARROLLADAS 3.1 Organización del laboratorio El laboratorio de Cultivo de Tejidos de la empresa CORPORACION G Y G
E.I.R.L está constituido por 3 ambientes, distribuidos de la siguiente
manera:
3.1.1 Área de Recepción, lavado y preparación de medio de cultivo
Aquí se recepcionan los materiales vegetales para siembra
procedentes del vivero y frascos de vidrio para su lavado, para que
sean reutilizados nuevamente como frascos in vitro (conteniendo el
medio de cultivo) ; cuenta con un lavadero para agua fría, así mismo
un grifo para las actividades de lavado.
Aquí se preparan los medios de cultivo para la siembra del material
vegetal, para ello cuenta con una autoclave el cual es utilizado para
el autoclavado de los medios de cultivo, esterilización de material de
vidrio conteniendo material vegetal contaminado. Cuenta también
con un espacio para almacenar los materiales de vidrio, plástico y
reactivos químicos. Este ambiente cuenta con una mesa de trabajo
para la preparación de los medios de cultivo, así también equipos
como: pH metro, balanza analítica, autoclave, refrigeradora,
microscopio, estufa para los materiales quirúrgicos.
3.1.2 Área de Siembra y Transferencias
En esta área se realiza las siembras, el trabajo de excisión,
inoculación y transferencia de los explantes a los frascos de vidrio
que contienen el medio de cultivo. Este trabajo se realiza con altos
niveles de limpieza ambiental, esta área implementada con una
cámara de flujo laminar horizontal de aire filtrado de baja presión la
cual es útil para realizar la siembra y la transferencia de los
materiales vegetales (Orquídeas).
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3.1.3 Área de incubación
Los cultivos se incuban en un ambiente apropiado donde se
encuentran las estanderias metálicas los cuales sirven para colocar
los frascos tapados herméticamente el cual contiene las semillas de
Cattleyas ya sembradas.; esta área mantiene las condiciones
favorables para el desarrollo de los cultivos. La regulación de la
temperatura se logra por medio de equipos de aire acondicionado
de pared programables, el cual mantiene la temperatura favorable
entre 20 y 28°C. La iluminación se está aprovechando las horas de
luz del día de las 6:00 antes medidiano hasta las 18 horas, a partir
de esta hora se encienden las luces de los tubos de fluorescentes
hasta las 22 horas cumpliendo así las necesidad del cultivo de 16
horas luz y posterior 8 horas de oscuridad; el cuarto de incubación
tiene en las ventanas vidrios transparentes la cual permite la
entrada de las luz del día.
3.2 Uso de materiales y equipo de laboratorio
3.2.1 Lavado y esterilización de materiales de vidrio
Los materiales de vidrio son lavados con agua y detergente en el
lavatorio y enjuagados con agua de caño y posteriormente con agua
destilada y esterilizadas en la autoclave a una presión de 15 lb. Y a
una temperatura de 121°C durante 15 minutos; este proceso se
realiza con la finalidad de eliminar cualquier agente contaminantes
en los materiales.
3.2.2 Preparación soluciones desinfectantes para el material vegetal
Se preparó con la finalidad de desinfectar cápsulas, semillas u otro
material vegetal para que estén libres de agentes contaminantes y
posteriormente sembrarlos utilizando a cámara de flujo laminar en
los frascos conteniendo el medio de cultivo semisólido.
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La solución que se utiliza con más frecuencia en el laboratorio para
la desinfección de materiales vegetales es la lejía comercial que
contiene como ingrediente activo al Hipoclorito de Sodio al 4.9%
(NaOCl), el cual hay que baja la concentración para desinfección de
capsulas al 1% y para semillas al 0.5%. Para bajar la concentración
del Hipoclorito de Sodio se utilizó la siguiente formula:
V1.C1 = V2.C2
Dónde:
V1: volumen inicial V2: volumen final
C1: concentración inicial C2: concentración final
Pasos a seguir:
El volumen inicial (V1 en mililitros), es el volumen requerido
de lejía comercial.
La concentración inicial (C1 en porcentaje), es la
concentración de Hipoclorito de Sodio de la lejía comercial
(4.9% de NaOCl).
El volumen final (V2 en mililitros), es el volumen de agua
requerido.
La concentración final (C2 en porcentaje), es la
concentración esperada.
Para la limpieza de la mesa de trabajo de la cámara de flujo laminar,
material quirúrgico y otros materiales se utiliza alcohol medicinal de
70° y 96° (grados).
3.2.3 Uso de la balanza analítica
La balanza analítica es indispensable para el pesado de los insumos
para el preparado del medio de cultivo, donde cada peso tiene que
ser exacto según como indican la tabla de formulación.
20
La balanza nos permite pesar cantidades pequeñas como
miligramos (mg.) y que es muy imposible pesar en balanzas
convencionales.
3.2.4 Uso del pH metro
El pH metro permite medir exactamente el pH de la preparación de
los medios de cultivo ya que es indispensable para que las plántulas
se desarrollen adecuadamente. Esta constituido básicamente por un
electrodo sensible y un tablero de control el cual nos permite medir y
calibrar el pH del medio de cultivo dependiendo del requerimiento
del cultivo o especie, la calibración se realiza haciendo la aplicación
de Ácido Clorhídrico a 1 Normal (HCl al 1N) en caso de bajar el pH
del medio de cultivo, y Hidróxido de Sodio a 1 Normal (NaOH) en
caso de subir el pH del medio de cultivo, así llegar al rango de pH
requerido.
3.2.5 Uso y mantenimiento de la autoclave
La autoclave proporciona vapor bajo presión y es muy eficiente para
destruir todas las formas de vitropatógenos. Al utilizarlo, se extrae
todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización, la
extracción de aire se logra automáticamente al permitir que el vapor
expulse el aire del aparato antes de cerrar la valvula
correspondiente. La temperatura dentro de la autoclave se regula
mediante la presión; la presión se lee en un manómetro que forma
parte de la autoclave. Para esterilizar los materiales se utiliza una
presión de 15 libras (15lb) durante 20 minutos, a esta presión la
temperatura del vapor es aproximadamente 121°C suficiente para
matar todas las formas de vida (Roca y Mroginsk, 1991). El mantenimiento de la autoclave, como la limpieza interior es
importante ya que se almacena de tanto uso desperdicio de
materiales esterilizados, se debe lavar con bastante agua y
detergente y enjugar con agua corriente y posterior con agua
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destilada; luego llenar con agua destilada hasta su nivel y la
autoclave está listo para ser utilizado nuevamente.
3.2.6 Limpieza y desinfección del área de trabajo, instrumentos, recipientes y del investigador en el laboratorio.
Los contaminadores más comunes son las bacterias y las esporas
de hongos que habitan en el ambiente y el polvo que se filtra por las
ranuras de las puertas. Evitar la contaminación con
microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta
para el éxito en el establecimiento de los cultivos y su manipulación.
Área de trabajo. Los equipos como la balanza analítica, el pH
metro, microondas, mesa de trabajo, cámara de flujo laminar,
etc., deben desinfectarse con alcohol etílico de 70° o 96°antes de
realizar los trabajos en el laboratorio. El piso, las estanderias
metálicas y las paredes impregnadas de polvo se deben limpiar y
utilizar alcohol.
Los instrumentos. Los instrumentos de trabajo se deben
esterilizar antes de utilizarlos. Se debe tener en cuenta que los
instrumentos inicialmente estériles pueden contaminarse con
agentes contaminantes del aire, de superficies vegetales mal
desinfectadas, de las manos del técnico, de la exhalación del
investigador; se debe utilizar varios juegos de las mismas
herramientas y mantener la asepsia de las que se ha usado
colocando los instrumentos en alcohol etílico de 70° o 96° de 3 a
4 minutos, luego flamearlas cuidadosamente en el mechero de
alcohol ( de tres a cuatro flameadas). El exceso de flameo hace
que el metal pierda temple y oxide los instrumentos, hay que
tener mucho cuidado con este procedimiento.
El exterior de los recipientes de cultivo. Existe la posibilidad
que durante el tiempo transcurrido entre la esterilización de los
recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlos, se
localizan en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera
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que se mantenga estéril el interior de los frascos, por lo tanto, se
debe flamear obligatoriamente la boca de cada frasco antes y
después de sembrar el explante.
El investigador o técnico de laboratorio. E el principal
contaminador del ambiente del laboratorio. El investigador al
ingresar al laboratorio debe lavarse las manos con bastante agua
y jabón, usar bata limpia de laboratorio, guantes limpios y
mascarilla de boca y nariz, esto al momento de realizar la
siembra de los explantes en la cámara de flujo laminar. Otro dato
importante es que no se debe manipular los frascos en el cuarto
de incubación con las manos sucias, pueden dejar señales de
focos de contaminación al momento de las transferencias a otros
frascos en la cámara de flujo laminar.
3.3 Preparación de medios de cultivo, fase de siembra y método de
siembra La preparación de los medios de cultivo se realizó siguiendo los
protocolos ya establecidos en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la
empresa CORPORACION G y G E.I.R.L, solo variando la formulación
para cada fase (germinación, multiplicación, enraizamiento). La
formulación tomada para este trabajo fue de un medio de cultivo casero
con insumos como azúcar, complejo B, Bayfolan (fertilizante foliar),
plátano seda, carbón activado y agar; tomado de (Padilla, E., 2008).
23
3.3.1 Medio de cultivo para germinación
La formulación que se utilizó para la primera fase de iniciación o
germinación de las semillas de Cattleya es la siguiente:
Tabla N° 01
Formulación: Germinación
Volumen: 1 litro
Insumos Unidad Cantidad por Litro
Fertilizante Bayfolan (11 – 08 – 06) ml 7.10
Complejo B + Zn ml 3.00
Azúcar blanca g 20.00
Agar g Depende de la marca
Carbón vegetal molido o activado g 2.00
Plátano seda g 40.00
Agua destilada ml 1000.00
pH ------ 5.1 – 5.4
Fuente: Padilla, E., 2008
Figura N° 1. Insumos para la preparación del medio de cultivo casero
24
Protocolo de preparación de medio de cultivo para germinación de Cattleya sp.
Lavar con agua de caño los frascos de vidrio y dejar escurrir el agua
Enjuagar con agua destilada los frascos de vidrio de dejar escurrir el
agua
En un vaso de precipitado de 1 litro, dispensar 700 ml. de agua
destilada
Colocar los 700 ml. de agua destilada en el vaso de una licuadora
Agregar el plátano seda, azúcar, carbón, bayfolan, complejo B
Utilizando una licuadora, licuar los insumos hasta homogenizar la
solución
Colocar el medio licuado en el vaso de precipitado
Enrazar a un litro con agua destilada
Medir el pH del medio
Ajustar el pH con Ácido Clorhídrico (HCl) si el pH del medio esta alto, o
el Hidróxido de Potasio (KOH) si el pH está bajo
Agregar el agente gelatizante
Agitar y dispensar el medio en cada uno de los frascos de vidrio
Tapar con el papel aluminio y papel reciclado y ajustar con hilo pabilo
Autoclavar los frascos conteniendo el medio de cultivo a 15 libras de
presión por 15 minutos a una temperatura de 121°C
Agitar los frascos autoclavados y dejar enfriar a temperatura ambiente
Almacenar los frascos conteniendo los medios semisólidos
3.4 Recolección de material vegetal y pasos a seguir para su introducción a in vitro
Se recolectaron cápsulas en estado óptimo para su siembra, tanto
cápsulas abiertas (dehiscente) y cápsulas cerradas (indehiscente).
3.4.1 Cápsula cerrada (indehiscente)
El procedimiento a seguir es la siguiente:
25
Lavado de cápsula La cápsula se lava con agua corriente y enjuagada con agua
destilada para eliminar impurezas de la superficie.
Desinfección de la cápsula
Se desinfecta con una solución preparada de Hipoclorito de
Sodio al 1% (NaOCl), se sumerge la cápsula en la solución por
20 minutos y luego enjuagada con agua destilada estéril y se
deja escurrir todo el agua, y la cápsula esta lista para ser abierta
al interior de la cámara de flujo laminar con material quirúrgico
estéril.
Figura N° 3. Desinfección de cápsula en Hipoclorito de Sodio
Figura N° 2. Lavado de la cápsula antes de la desinfección con Hipoclorito de Sodio
26
Extracción de la semilla La cápsula desinfectada es abierta con una pinza y un bisturí
sobre una placa Petri estéril, es expuesta la semilla y
espolvoreada sobre otra placa Petri estéril, la semilla extraída se
le agrega agua destilada estéril en mínima proporción con la
finalidad de diseminar uniformemente la semilla al momento de la
siembra.
Figura N° 4. Enjuague de cápsula en agua destilada estéril
Figura N° 5. Cortes con el bisturí a la cápsula para la extracción de las semillas
27
Figura N° 6. Extracción de semillas de la cápsula
Figura N° 7. Agregando agua destilada estéril para diseminar las semillas
28
Siembra La siembra se realiza con una cucharita estéril el cual nos
permite recoger con facilidad las semillas de la placa Petri, se
siembra a razón de 2 a 3 cucharaditas sobre el medio de cultivo
en frascos de 250 ml de capacidad, se tapa con el papel aluminio
y se sella con el parafilm (cinta plástica), se etiqueta el frasco y
está listo el frasco con la siembra.
Figura N° 8. Diseminación de semillas con agua destilada estéril
Figura N° 9. Siembra de semillas diseminadas en agua destilada estéril
29
Incubación Los frascos se colocan en la sala de incubación a una
temperatura de 26°C, es en este lugar donde las semillas
germinan y las plántulas in vitro se desarrollan hasta la etapa
final donde tienen que salir a aclimatación en vivero.
Figura N° 10. Tapado, sellado y etiquetado de frascos sembrados
Figura N° 11. Frascos con siembras en la sala de incubación
30
3.4.2 Cápsula abierta (dehiscente)
Para el trabajo de desinfección de cápsula abierta donde las
semillas estaban expuestas al medio ambiente se utilizó la
desinfección por el método de la jeringa que detallo a continuación:
Para este método se utilizaron jeringas estériles de 20 centímetros y
nuevas adquiridas en las farmacias.
Se extrae en embolo del cuerpo de la jeringa y se introduce un
trozo de algodón al fondo del cuerpo, luego comprimir el algodón
para que quede seguro y firme.
Figura N° 12. Retiro del embolo del cilindro de la jeringa
Figura N° 13. Trozo de algodón comprimido al interior del cilindro de la jeringa
31
Se introduce las semillas al cuerpo de la jeringa.
Se coloca el embolo de la jeringa.
Figura N° 14. Introducción de semillas al cilindro de la jeringa
Figura N° 15. Introducción de semillas más el embolo al cilindro de la jeringa
32
Se succiona la solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5% (NaOCl)
y se realiza la desinfección de las semillas agitando
continuamente la jeringa (se realizó tres lavadas).
Las semillas desinfectadas se enjuagan con agua destilada
estéril. El proceso de desinfección y enjuague debe realizarse por
15 minutos y por tres veces.
Figura N° 17. . Enjuague de semillas
con agua destilada estéril
Figura N° 16. Desinfección con Hipoclorito de Sodio
33
Se quita el embolo del cilindro de la jeringa para extraer las
semillas desinfectadas y enjuagadas.
Se quita la aguja hipodérmica del cilindro y utilizando un alambre
se empuja por la boquilla de la jeringa el algodón y así se extrae
las semillas que son colocadas a una placa Petri estéril.
Figura N° 18. Extracción del embolo del cilindro de la jeringa
Figura N° 19. Extracción de semillas del cilindro de la jeringa
34
Se siembra las semillas en los frascos conteniendo el medio de
cultivo, se flamea la boca del frasco de vidrio, se tapa con el
papel aluminio y sella con la cinta plástica.
Figura N° 20. Siembra de semillas en el frasco con medio de cultivo
Figura N° 21. Flameado de boca de frasco para garantizar la esterilidad de la siembra
35
Se etiqueta y se traslada el frasco con la siembra a la sala de
incubación.
Figura N° 22. Tapado con el papel aluminio y sellado del frasco con la cinta plástica
Figura N° 23. Etiquetado de frascos
36
Se hace mención que durante el periodo de prácticas desarrollada en la
empresa, solo se llevó a cabo una etapa del desarrollo in vitro, que fue la
etapa de iniciación (FASE I) o instalación de siembras de Cattleya sp. La
cual menciono a continuación:
Fase de Iniciación o Fase I
Es la etapa o fase de iniciación o de establecimiento, se sembró las
semillas de la Cattleya sobre la superficie del medio de cultivo (medio de
cultivo casero). Es muy importante la observación continua de los frascos
para verificar que no haya, fenolizacion, vitrificación y contaminación, en
caso de que hubiera contaminación se separa los frascos, se autoclava
para matar el agente contaminante y se lava los frascos de vidrio para ser
reutilizados.
Figura N° 24. Frascos con siembras en la sala de incubación
37
IV. BIBLIOGRAFÍAS
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vegetales, Centro Internacional de Documentación e Información
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cultivo in vitro de tejidos vegetales para beneficio social de la
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38
10. Machado, D. 2003. Orquídeas. Manual práctico de reproduction. Editorial
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11. Oxenham, SK. 2003 “Classification of an Ocimun basilicum germplasm
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12. Padilla, E., 2008 Tesis “Evaluación de medios de cultivo para la
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– 265.
40
V. ANEXO
41
Anexo N° 01: Fertilizante utilizado para la preparación de medios de cultivo.
Anexo N° 02: Complejo B, utilizado como fuente de vitamina en la preparación de medios de cultivo
42
Anexo N° 03: Rompimiento de testa y desarrollo de embrión de Cattleya rex
Anexo N° 04: Sala de incubación de frascos sembrados con semillas de Cattleya rex
43
Anexo N° 05: Germinación de semillas de Cattleya rex a las pocas semanas de haberlas sembradas en medio casero
Anexo N° 06: Flor de Cattleya rex
44
GLOSARIO
CÁPSULA Fruto seco, con una o más cavidades que contienen varias
semillas y cuya dehiscencia se efectúan según el plano que
no es perpendicular al eje del fruto.
DEHISCENCIA Acción de abrirse naturalmente las anteras de una flor o el
pericarpio de un fruto, para dar salida al polen o a la semilla.
ENRAZAR Agregar, nivelar con agua u otra solución.
EMBRIÓN En las plantas fanerógamas, embozo de la futura planta,
contenido en la semilla.
IN VÍTRO Cultivo en vidrio.
TESTA Cubierta externa de la semilla, derivada del tegumento y de
consistencia y dureza variables.
MICROPROPAGACIÓN Multiplicación masiva en in vitro.
VITROPATÓGENOS Contaminantes por hongos, bacterias y otros en el proceso in
vitro.