自主研修レポート 畑 玲央（０６００１８４０５８） 研修先：Department of Biochemistry, National University of Ireland, Galway

ホスト：Ciaran M orrison, Ph.D.

Science Foundation Ireland Investigator,

Departm ent of Biochem istry,

National University of Ireland Galway,

University Road,

Galway,

Ireland.

Phone: +353 91 512334

Fax: +353 91 512 504

E-m ail: ciaran.m orrison@ nuigalway.ie

期間：２００７年７月１６日～９月２３日

内容：

・動機

友人がヨーロッパに行ったと聞き、私も行きたいなと漠然と考えていたころ、武田先生か

ら今回の研修先を紹介して頂きました。アイルランドが英語圏の国であること、そしてケ

ルト文化やパブなど魅力的に感じていたので、決断は早かったです。しかし、４月ごろに

は Project 内容が送られ、加えて日本人がいないため会話は全て英語でなされると聞き、

身の引き締まる思いだった記憶があります。

・出発前の準備

まず、春休みはほぼ毎日武田研に通いました。しかし、４月からは身の回りが忙しくなっ

てあまりまじめに通いませんでした。この点は反省しております。武田研は実験の設備が

ほぼ全て整っているし指導教官の方も親切に教えてくださるので、出来るだけ通い、ノー

トをとっておいたほうが良かったです。

生化学の勉強として、Cell Biology を読みました。しかし、エッセンシャルですらまじ

めに取り組んでなかったのでただ読んでいるだけでは分かりにくかったです。武田先生の

実験講座の講義を受けた後は、少し分かるようになりました。しかし、研修に当たっては

実験の経験のほうが大事ですので、読み流す程度でも十分だと思いました。結果的にこの

ような難しい知識はほとんど必要ありませんでした。あと武田先生の勧めでホストの先生

が書かれた論文を２つほど読みました。自力で読む場合と比べて理解度が全く違い、とて

も有意義でした。この知識は研修時も助けになりました。

英語は、NHK のラジオ講座を聞いたり、英会話の本を買ったりいろいろとあがいてみまし

たがあまり上達したとは言い難いです。実際、始めのころは英語が話せず聞き取れずと無

力さを痛感し、強烈な不安に駆られました。実感としては日本で出来ないことは海外でも

同じだということです。英検や TOEIC の勉強も結構海外生活で役立つのだなあと感じまし

た。日本で下積みがあれば上達が早いのでしょう。下積みのなかった私は、海外で２ヶ月

生活した今でも英語のニュースは全然聞き取れませんし、映画も字幕なしでは理解できま

せん。ただ、研究室内での会話やラボのミーティングは飛躍的についていけるようになり

ました。

飛行機の予約は、生協ルネ１階の海外旅行センターを利用しました。アイルランドまで

は飛行機の直行便がなく、エールフランスで、パリの CDGで乗り継いでダブリンまで行く、

というルートを取りました。費用は、観光シーズン真只中で高く、２４万円もしました。

中国やベトナムの航空会社だと１４万円くらいで主要都市までいけます。しかし、アイル

ランドの場合は飛行機を乗り換える必要があるので、結局費用はどの飛行機会社でも変わ

らないでしょう。エールフランスは乗り継ぎがとてもスムーズだったので選びました。ダ

ブリンからはゴールウェイまでバスが出ていて、４時間で行けます。バスもネットであら

かじめ予約しておく必要があります。

寮はホストの方に紹介してもらい、大学の寮に申し込みました。ゴールウェイの大学寮

は夏季に一般開放していて、留学生や観光客が利用していました。ただ、ここは９月の新

学期からは留学生は全く受け入れてもらえないので、結果的にはアパートを借りたほうが

良かったです。まさか、ゴールウェイでの新居探しで散々難航するとは予想だにしません

でした。見通しが甘かったですね。寮のほうは申し込みが遅かったためか私はツインに入

らざるを得ませんでしたが、シングルもあります。ツインが週７０ユーロ、シングルが週

１００ユーロ位でした。勿論、８月の終わりで帰国する場合は何の支障もありません。

海外生命保険は生協が斡旋している東京海上日動のものを３ヶ月単位で、VISAカードも

生協が斡旋している三井住友 VISA を申し込みました。VISAは両替する必要がない上に、

世界各国で使用できるのでとても便利でした。ただカードの発行に時間がかかりますので

前もって手続きしておくほうが良いです。

・研究

研究室内に自分の机をもらい、そこで思いのままに実験できました。朝の９時半ごろから

夜の７時まで、というのが私の主な時間帯でした。始めの１ヶ月ほどは指導教官の Carolさ

んに実験器具の使い方を全て教えていただきました。とても丁寧親切に教えていただいて

今でも感謝しております。研究室に慣れ、自分で予定を立てて実験できるようになるまで

は１ヶ月かかりました。そして後半の１ヶ月は実験がスムーズに行うことが出来ました。

２週間に１度、ラボ内でミーティングが開かれていてそこで自分の研究について発表しま

した。これは小規模なものでしたが、実験結果について教授を始め様々な方からアドバイ

スしてもらえたのでとても有意義でした。他の人がどのような研究をしているのかも分か

りました。実験中は近くにポスドクの方が２～３人おられるので、いつでも質問や相談を

することが出来ました。

・生活

大学寮は４～５人で１つのキッチンを共有する、というものでした。食器やキッチン用具

は全てそろっていました。大学までは徒歩５分ほどで、とても近かったです。隣人が友好

的であれば会話がはずんで楽しいです。私の場合は最初の２週間は、陽気なスペイン人と

一緒に過ごせてとても楽しかったのですが、残り４週間はとてもつまらなかったです。買

い物は、大学から徒歩２０分のところに大きなスーパーマーケットがありました。街の規

模からは想像できないくらい巨大で、驚きました。食材は殆ど全てそろっていて、しょう

ゆまでありました。物価は、レストランは日本の２倍ほどするのですが、スーパーの食材

や日用品は日本と同じくらいでした。なんでもそろうので食には困りませんでした。９月

からは何とか新居が見つかり、無事に引っ越すことが出来ました。こちらは２階建てで、

キッチンバスルームは共有、７人が住めるアパートでした。こちらの生活は、ハンガリー

人やキプロスの学生など様々な国籍の人がやってきてとても楽しかったです。ショッピン

グ街が近くにあり、大学からも徒歩１５分でした。本当に、後半の４週間は生活に恵まれ

ていたと思います。尚、自転車があれば生活がとても便利です。私はホストの方に頼んで、

自転車を貸していただきました。

週末は主に近くの観光名所への日帰りバスツアーを利用しました。多くの観光会社がバ

スツアーを出していて、大学寮の受付からも申し込むことが出来ました。アイルランドの

西部地方は自然の美しさで有名で、高さ２００メートルの崖や巨大な規模のフィヨルドな

どその迫力はとても印象的でした。特にコマネラ地方は国立公園にもなっているほどで、

フィヨルド、湖が見ごたえ十分でした。その他アイルランド北部（イギリス）もベルファ

ストなど観光名所が数多いです。また、ゴールウェイは空港が近いので、予定を前もって

立てたならば週末に海外旅行が出来ます。尚、７、８月は街が多くの観光客で賑わってい

ました。

・最後に

アイルランドで海外研修という貴重な経験をさせていただいた武田先生にとても感謝して

おります。さらに、現地で色々とお世話になった Morrison 教授、そして付きっ切りで教え

てくださった指導教官の Carolさん、いつも質問に答えてくれた Morrison研の方々にも心か

ら感謝しております。本当にありがとうございました。

今回の研修にかかった費用

航空券代 245,550円

旅行保険 20,380円

生活費など 1055.17ユーロ 宿泊費 730.25ユーロ

アイルランド政府に送った奨学金に対する報告書 Introduction Teromeres are specialized nucleoprotein structures essential for chromosome stability and function. In most eukaryotes, telomeres consist of specific tandem repeat (5’-TTAGGG-3’) with an average length of 5-15 kb. Telomeres are also characterized by having a 3’-overhang of the G-rich strand. Telomeres undergo progressive shortening with each replication cycle. However, new telomeric repeats are added to the chromosome end by telomerase to maintain their stability and preserve their full genomic information. In recent years, some telomere-specific proteins were identified. A complex, called Shelterin, has exquisite specificity for telomeric TTAGGG repeat and binds to the telomere sequence and generates a ‘T-loop’ structure to prevent from not only exonucleolytic degradation but also recognition as a DNA double-strand break. Key elements of the Shelterin complex are the double-stranded telomere repeat binding proteins, TRF1 (teromere repeat-binding factor 1) and TRF2, and the single-stranded telomere repeat-binding protein POT1 (protection of telomeres 1). In this project, I studied about TRF2. TRF2 plays an absolutely necessary role at telomeres. Removal of TRF2 from the telomere in mouse results in loss of the 3’-overhang, and their being processed in a manner similar to DNA double-strand break, leading to extensive chromosome fusions, cell cycle delay and death. Overexpression of TRF2 in telomerase negative cells prevents critically short telomeres from fusion and delays the onset of senescence. Objective Published work suggests that variant forms of TRF2 are expressed during chicken embryogenesis. The aim of my project was to identify additional novel TRF2 variants by RT-PCR and test whether the products of these variants of TFR2 localize differently to the full length protein using biochemical tagging experiments, and determine whether any variants localize to DNA damage sites and investigate the genomic determinants of such localization using the range of DT40 cell lines.

Methods ・RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) Total RNA was isolated from DT40 cells by TRIzol Reagent (Prepared in the lab). For first-strand synthesis, 5µgtotal RNA was added to 1µl Oligo(dT) primer (0.5µg/µl) and 1µl 10mM dNTP mix in a 10µl mixture. The mixture was incubated at 65℃ 5mins, and on ice 1mins, then added 9µl Reaction mixture(2µl 10xRT buffer, 4µl 25mM MgCl2, 2µl 0.1M DTT, 1µl RNase OUT) and incubated at 42℃ 2mins. The mixture was added 1µl SuperScriptⅡRT(invitrogen) ,and incubated at 42℃ 50mins, terminated the reaction at 70℃ for 15 mins, then added 1µl of RNase H, incubated at 37℃ 20mins. PCR were performed, using the trf2 cDNA primers(0.75µM, prepared in the lab) and Phusion polymerase (Finnzymes), for at 98℃ 150sec, 30 cycles (at 98℃ for 30 sec, 58℃ for 1min, 72℃ for 1min) , then terminated reaction at 72℃ 10mins. At terminated reaction, TAQ polymerase (SIGMA) was added to clone into pGEM T Easy vectors (Promega). ・DNA Sequence For sequencing, trf2 cDNA products were cloned into pGEM T-Easy vectors. Sequencing by PCR was performed in Cogenics Technologieo Inc (United Kingdom), using T7, SP6, and following primers: E6, 5’-GGGTAAAGCACTCAGTGG-3’; and E7, 5’-GCCGGTTCAGATATT-3’. ・Transcient Transfection 1 million cells were harvested by centrifuging at 1200rpm for 5 min, and resuspended with 500µl 1xPBS. 5µg DNA was added. The solution was transferred to Gene Pulser cuvette, incubated on ice for 10 min. Electroporation was performed at the condition of 300V, 600µF, incubated on ice 10mins. Cells were transferred to 10cm dish containing 10 ml

prewarm fresh media, incubated at 39℃, 5%CO2.

・Immunofluorescene Microscopy To observe the localization of tfr2 splice variants, cloning was performed to clone the trf2 splice variants into pEGFP-C1 vectors. Cells were adhered on poly-l-lysine coated glass coverslips and were fixed 4% paraformaldehyde prepared in phosphate-buffered saline (PBS) for 10

mins. Cell were washed 3 times in PBS, then permeabilized in PBS with 0.15% triton-X-100 for 2 mins. After washing 3 times in PBS, cells were blocked with 1%bovine serum albumin (1% BSA) for 30 mins, then incubated with appropriate primary antibodies diluted in blocking buffer (1 % BSA in PBS) at 37℃ 1 hour. Cells were washed 3 times, 5 minutes in PBS before incubation with fluorescently conjugated secondary antibodies at 37℃ for 45 mins, then washed 3 times, 5 mins each in PBS, and mounted slides in Vectashield (anti-fade) with DAPI. To detect DNA damage sites, the cells were costained with anti-γH2AX polyclonal antibody. To visualize the nuclei, DAPI (4’,6’-diamidino-2-phenylindole) was used to stain DNA. Fluorescence microscopy was performed on an Olympus IX-70 microscope. GFP-fusion proteins were prepared for analysis after fixation. Results and Discussion Numerous studies have showed the critical roles for TRF2 in mammalian telomere chromatin. Most of these studies have focused on the function of TRF2. However, the cellular localization of TRF2 has poorly understood. Recent work suggested that TRF2 protein is highly conserved between mammal and birds. In this project, I identified the tfr2 splice variants and investigate the localization in chicken DT40 cells, comparing with full length trf2.

A B

1kb ladder 1 1kb 1 2 3

4 5 6 7 8 9 10 11

1kb 12 13

14 15 16 17 18 19 20 21 22

Fig.1 (A) RT-PCR of TRF2cDNA. (B) The screen of TRF2 splice variants.

To identify novel trf2 splice variants, I performed RT-PCR using primers directed to the sequences at the 5’ and 3’ ends of the Trf2 cDNA. As shown in Figure1A, different length of tfr2 cDNA bands was appeared. The length of full length trf2cDNA is 2157bp, so shorter bands were expected to

become splice variants. Then I cloned PCR products into pGEM T Easy vectors and performed transformation. I picked up 22 colonies, and

digested plasmid DNA by NotI. Various kinds of bands were observed and 10 samples were sequenced (lane4,5,6,10,14,18,19,20,21,22). To confirm the whole sequences of splice variants, I designed new primers, E6 and E7. As shown in Fig.2, I identified three kinds of TRF2 splice variants, TRF2Δ5(Lane5), TRF2Δ7(Lane21), TRF2Δ5-10(Lane10). TRF2Δ7 have already identified in our lab, and searched its localization in DT40 cells. However, others were novel splice variants, therefore I succeeded to identify TRF2 variants.

Fig.2 Genomic organization of chicken TRF2 locus. Boxes represent exons, and the line introns

Next, I tried to clone three kinds of TRF2 cDNA (TRF2 full length, TRF2Δ 5, TRF2Δ5-10) into expression pCMV-myc vector to determine whether different forms of TRF2 could localize to telomeres. However, I succeeded only TRF2 full length cloning, so I investigated the MYC-tag expression using wild type and TRF1 null DT40 cell lines.

TRF2 Splice Variant (TRF2 !5)

Function

Dimerization Domain DNA-binding Domain

TRF2 Splice Variant (TRF2 !7)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

TRF2 Splice Variant (TRF2 !5-10)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

As shown in Fig.3, there was no difference of MYC-tag expression between in wild type and TRF1 null DT40 cells. Conclusion I identified the novel TRF2 variants. Yet I had not enough time to determine the localization of TRF2 variants in chicken DT40 cells. However, it is supposed that MYC-fusion TRF2 protein can be used to determine the localization of TRF2 in various range of DT40 cell lines. References

1. Jonathan P Konrad, Walter Mills, David J Easty, Christine J.Farr(1999) Gene 239, 81-90

2. Titia de Lange (2005) Genes and development 19, 2100-2110

• DNA TRF2 TRF2-MYC Merge

wt

TRF1

null

Fig.3, Localization of chicken TRF2 in wild type and TRF1 null cells. MYC tagged chicken TRF2 was stably expressed.