DIVISIÓN DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA LICENCIATURA EN INGENIERÍA BIOMÉDICA

DISEÑO DE UN AMPLIFICADOR DE FIJACIÓN DE CORRIENTE PARA EL REGISTRO DEL POTENCIAL DE MEMBRANA Y

ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA CELULAR.

TESIS QUE PRESENTAN:

PINEDA ALCOCER JOSÉ CARLOS (98321494) VILLALOBOS MUÑOZ GABRIEL (98318755)

LÓPEZ SOTO DANIEL (96326053)

ASESOR:

RAFAEL GODINEZ FERNÁNDEZ

SEPTIEMBRE. 2007.

INDICE

RESUMEN ....................................................................................................................... 3

INTRODUCCION............................................................................................................ 3

ANTECEDENTES ........................................................................................................... 4

OBJETIVOS..................................................................................................................... 6

INFRAESTRUCTURA.................................................................................................... 7

CONFIGURACIONES DE LOS AMPLIFICADORES OPERACIONALES................ 8

SEGUIDOR.................................................................................................................. 8

INVERSOR .................................................................................................................. 8

SUMADOR .................................................................................................................. 9

PLAN DE TRABAJO ...................................................................................................... 9

SONDA ...................................................................................................................... 10

ETAPA 1 .................................................................................................................... 11

AMPLIFICADOR DE INSTRUMENTACIÓN .................................................... 11

DIFERENCIAL BÁSICO ...................................................................................... 13

NIVEL DE OFFSET .............................................................................................. 15

CIRCUITO PUENTE............................................................................................. 16

ETAPA 2 .................................................................................................................... 17

INYECCION DE CORRIENTE ............................................................................ 17

SUMADOR INVERSOR CONMUTADOR ......................................................... 17

ETAPA 3 .................................................................................................................... 18

GENERADOR DE ONDA TRIANGULAR.......................................................... 18

OSCILADOR (PERFORACIÓN DE MEMBRANA) .......................................... 19

CONSTRUCCION DE UNA FUENTE DE PODER .................................................... 20

CONSTRUCCIÓN DE LAS TARJETAS...................................................................... 22

PLACA DEL AMPLIFICADOR ............................................................................... 23

PLACA DE LA FUENTE .......................................................................................... 24

DISEÑO FINAL DEL AMPLIFICADOR DE FIJACIÓN DE CORRIENTE .......... 25

ESPECIFICACIONES DE DISEÑO Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.................. 26

CONCLUSIONES.......................................................................................................... 28

APENDICE 1 ................................................................................................................. 29

APENDICE 2 ................................................................................................................. 30

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................... 31

2

RESUMEN

Se presenta un sistema de Fijación de Corriente para la amplificación de los potenciales de membrana el cual permite inyectar corriente a la célula a través del mismo microelectrodo de registro del potencial. El precio comercial promedio de un amplificador de este tipo oscila entre los 5,000 dólares, tienen como desventaja que las compañías que los construyen y venden ponen una serie de restricciones para protegerlos de su divulgación, esto es, protegen sus diseños eléctricos. El diseño propuesto en este trabajo, constituye una alternativa económica y de calidad profesional.

INTRODUCCIÓN Los potenciales bioeléctricos o biopotenciales son voltajes iónicos producidos como resultado de la actividad electroquímica de ciertos tipos de células, denominadas excitables (nerviosas, musculares, y algunas glándulas). Su registro requiere del empleo de transductores y amplificadores capaces de convertir los flujos iónicos en corrientes eléctricas que proporcionen información complementaria para el diagnóstico y tratamiento médico.

La membrana celular está constituida de lípidos y proteínas. La parte lipidica de la membrana está formada por una película bio-molecular que le da estructura y constituye una barrera que impide el paso de substancias hidrosolubles. Las proteínas de la membrana están suspendidas en forma individual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva ciertas substancias.

La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo hacen que el transporte a través de ella sea selectivo, sino que también son capaces de llevar a cabo transporte activo (transferencia en contra del gradiente de concentración).

Fig. 1 Membrana celular

3

En el estudio de los bio-potenciales de las células, se mide la diferencia de potencial a través de la membrana celular. Esto se lleva a cabo con la ayuda de dos electrodos. Uno de ellos se inserta en la membrana celular (microelectrodo) y hace contacto con el líquido intracelular, el otro sirve como referencia y se coloca en el fluido que rodea a la célula.

Los microelectrodos se construyen con micropipetas cuya punta debe ser pequeña comparada con el diámetro de la célula con el objeto de evitar que ésta sufra daños y con ello se induzcan cambios en su comportamiento a si como ruido. Por otra parte, es importante conocer la resistencia eléctrica de la micropipeta ya que está en función principalmente del diámetro de su punta. La resistencia se utiliza como parámetro para establecer si la punta es suficientemente fina y por lo tanto, sirve como ayuda para determinar si es necesario o no rechazar las micropipetas para su uso en un experimento. Con frecuencia es necesario estimular eléctricamente a la célula con objeto de modificar el potencial de membrana hasta alcanzar cierto umbral y con ello generar un potencial de acción. Lo anterior se logra inyectando a la célula una corriente de valor conocido, lo que permite despolarizar la membrana en forma controlada.

La necesidad de construir un amplificador de fijación de corriente, surge del poder contar con un sistema de registro adecuado para la adquisición de potenciales de membrana y que simultáneamente permita la inyección de una corriente de magnitud y duración seleccionada por el usuario a partir de un pulso de voltaje proveniente de un convertidor A/D, posteriormente en el amplificador se dará la conversión de voltaje a corriente, de igual forma este debe asegurar la constancia de dicha corriente y poder eliminar artefactos que influyan en la señal deseada, por otra parte este amplificador también se encarga de transmitir la salida de esta señal lo mas fiel posible hasta la célula, haciendo llegar a esta con el mínimo ruido posible.

ANTECEDENTES El papel de la membrana celular en la génesis del fenómeno bioeléctrico fue postulado inicialmente por Ostwald (1890), sin embargo, la especulación básica más conocida es la de Bernstein (1902), quien dijo que las células vivas estaban rodeadas por una membrana con una permeabilidad baja para los iones, esto permitiría predecir que al aplicar una corriente eléctrica los iones pasarían principalmente alrededor de las células. Una base para la teoría moderna del potencial de la membrana es la ecuación derivada a partir de principios físico-químicos por W. Nernst (1902). Esta ecuación define, en términos de las concentraciones de un ion específico a cada lado de la membrana, el potencial al cual no habrá movimiento neto de este ion para ningún lado. En otras palabras, la ecuación define el potencial requerido para oponerse exactamente al movimiento de un ion particular a favor de su gradiente de concentración. Así, si la membrana fuera

4

exclusivamente permeable a un ion específico, entonces el potencial de la membrana será dado por el potencial de equilibrio a ese ion.

1

20 lnCC

nFRTE −=

El estudio detallado de las propiedades eléctricas de las células se ha desarrollado con el empleo de dos técnicas fundamentales: la técnica de fijación de corriente y la técnica de fijación de voltaje. Con la técnica de fijación de corriente se aplican pulsos rectangulares de corriente y se observan los cambios asociados en el potencial de membrana inducidas. Las n respuestas eléctricas inducidas en la célula por los n pulsos se almacenan en un archivo para su posterior análisis. Particularmente enfatizaremos en los protocolos para la técnica de fijación de corriente, la técnica consiste en conectar eléctricamente el amplificador a la célula a través de un microelectrodo. Al amplificador de fijación de corriente se le aplica un pulso rectangular de voltaje, el amplificador convierte este pulso en un pulso de corriente el cual es inyectado a la célula a través del micro electrodo; el cambio de potencial de membrana inducido por la corriente se mide a través del mismo microelectrodo; el voltaje de membrana de la célula es multiplicado a la salida del amplificador por un factor X. La micropipeta es un capilar de borosilicato con una punta de 1µm de diámetro aproximadamente, con una impedancia resistiva inherente muy grande (entre 1MΩ y 100MΩ) y una serie de “capacitancias parásitas” (1pF -10pF) que se distribuyen a lo largo de ella. Esta combinación resistencia-capacitancias hace que la micropipeta se comporte eléctricamente como un filtro pasa-bajas, con una respuesta lenta ante cambios rápidos en el potencial de la membrana celular, como en el caso de los potenciales de acción. Es por esto que uno de los aspectos importantes en el diseño de un amplificador para registro intracelular es la disminución del efecto de las capacitancias parásitas. La micropipeta es ideal para medir potenciales de acción. Los pulsos aplicados para el estímulo se generan utilizando un convertidor A/D (DAC). Las respuestas eléctricas de las células se obtienen como señales de voltaje, las cuales son adquiridas a través de un convertidor A/D (ADC). Las señales de estimulación como de respuesta celular serán desplegadas en un monitor de PC. El software de control de la tarjeta de conversión es sumamente importante para la generación de las señales de estimulación y la adquisición de la respuesta eléctrica celular. Normalmente se aplican pulsos de corrientes tanto negativos como positivos. Los pulsos rectangulares negativos y positivos subumbrales son indispensables para el estudio de las propiedades eléctricas pasivas de las células, y los pulsos de corriente positivos supraumbrales son necesarios para inducir potenciales de acción en las células excitables.

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OBJETIVOS Los amplificadores de fijación de corriente que son construidos por las compañías transnacionales, se encuentran sujetas a limitaciones tanto de hardware como de software, principalmente instituciones publicas que no cuentan con el presupuesto necesario para la adquisición de estos equipos, por este motivo los objetivos generales que se plantean para la realización de este proyecto hacen que el mismo sea viable para su realización ya que se desea abatir costos y con esto las instituciones con pocos recursos puedan tener acceso a este amplificador. Este diseño debe contemplar la buena interfase entre la sonda (acoplamiento eléctrico celular) y el convertidor A/D (tarjeta National) ,considerando de gran importancia las características de los elementos necesarios para su diseño y construcción, asegurando una alta impedancia de entrada del sistema así como una baja capacitancia y baja corriente de Bias, teniendo como prioridad el poder minimizar costos en la construcción de la misma con la finalidad de poder hacerla accesible a distintos centros de investigación que requieren de este sistema. En el siguiente esquema se muestra el sistema mínimo de adquisición de potencial de membrana con la técnica de fijación de corriente, la etapa en la que este proyecto basa su investigación es en la de preamplificación.

Fig. 2 Sistema de registro intracelular.

El diseño debe considerar y poseer las siguientes características:

• Adquisición de voltaje de membrana (Vm). • Inyección de corriente constante (1nA/V), con variación de magnitud y

variación en tiempo. • Fuente de alimentación de ultrabajo ruido con salida de ±15 V a 200 mA. • Interfase preamplificador-tarjeta A/D. • Acoplamiento con la sonda (preamplificador-célula).

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INFRAESTRUCTURA (Materiales y Métodos) El proyecto se realizó en el área de ingeniería biomédica de la UAM- Iztapalapa en el laboratorio de biofísica experimental que se encuentra en el edificio AT-221 y con la asesoría directa del profesor titular “C”, M.C. Rafael Godinez Fernández y con colaboración del Ing. Edmundo Gerardo Urbina Medal y el Dr. Héctor Trujillo Arriaga, profesores e investigadores de tiempo completo de la carrera en ingeniería biomédica de la misma universidad, el proyecto lo realizan los alumnos de la carrera de ingeniería biomédica: Daniel López Soto, José Carlos Pineda Alcocer y Gabriel Villalobos Muñoz. El laboratorio de biofísica experimental cuenta con el siguiente equipo y accesorios para el diseño del sistema:

2 Setup de experimentación los cuales cada uno cuenta con:

Primer Setup: - 1 Microscopio - 1 PC Pentium 1 con un software desarrollado especialmente para especificar los parámetros y adquisición del potencial de acción de las células - 1 Amplificador de fijación de corriente - 1 Tarjeta convertidor A/D - 1 PC Pentium 4 (adquisición de imágenes microscópicas) - 1 Cámara acoplada al microscopio - 1 Mesa antivibración (suspendida) Segundo Setup: - 1 Microscopio - 1 Amplificador (axón instruments) de fijación de voltaje - 1 PC Pentium 1 con un software de la compañía que desarrollo el amplificador de fijación de voltaje para especificar los parámetros y adquisición del potencial de acción de las células a estudiar - 1 Tarjeta convertidor A/D. - 1 Cámara acoplada al microscopio. - 1 Mesa antivibración (suspendida).

Mesa de diseño y experimentación electrónico.

1 Fuente de poder. 2 Osciloscopios digitales. 3 Generadores de funciones 3 Multímetros 1 PC Pentium 3 para uso de los alumnos del proyecto con acceso a

Internet Se contó con el software de diseño y pruebas electrónicas CIRCUIT

MAKER

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CONFIGURACIONES DE LOS AMPLIFICADORES OPERACIONALES

SEGUIDOR

VoutVin

Fig. 3 Seguidor

Se usa como buffer para eliminar efectos de carga ó para adaptar impedancias (conectar un dispositivo con gran impedancia a otro con baja impedancia y viceversa).

Como la tensión en las dos patillas de entradas es igual:

Vout = Vin

Zin = ∞

INVERSOR Rf

RinVin Vout

Fig. 4 Inversor

El análisis de este circuito es el siguiente:

V+ = V- = 0

Definiendo corrientes:

f

out

in

in

RV

RV 00 −−

=−

y de aquí se despeja

in

finout R

RVV −=

8

SUMADOR

Rf

Vout

RnVn

V2

V1

R2

R1

Fig. 5 Sumador

La salida está invertida Para resistencias independientes R1, R2, ... Rn

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+++−=

n

nfout R

VRV

RV

RV ...2

2

1

1

La expresión se simplifica mucho si se usan resistencias del mismo valor

Impedancias de entrada: Zn = Rn

PLAN DE TRABAJO

Se propone la construcción del amplificador de fijación de corriente utilizando amplificadores operaciones de la familia LF353 ó LF356 ya que estos presentan bajo ruido y alta impedancia de entrada y baja impedancia de salida, además de corriente de Bias baja (ver anexo). Las características que debe poseer el diseño del amplificador son las siguientes:

Registro de potencial de membrana Inyección de corriente para excitación celular Compensación del circuito puente Un adaptador en la salida de la adquisición para acoplar con un convertidor A/D

Eliminación de impedancias muy grandes Sistema guarda en la sonda El sistema debe ser de tipo ultrabajo-ruido

9

Fig. 6 Diagrama a bloques del amplificador.

SONDA Esta es el acoplamiento celular eléctrico, es decir, la interfase entre la célula y el amplificador, el diseño de la sonda así como sus características y especificaciones técnicas puede ser verificada en trabajos previos al presente, dentro del área de biofísica experimental, cabe mencionar que la sonda debe estar constituida por amplificadores operacionales con características específicas, como lo es la corriente de Bias, la Impedancia de entrada y la capacitancia de entrada, en el presente trabajo se recomienda el uso del siguiente elemento, Analog Device AD549L, este componente registra la mas alta impedancia de entrada en modo común que es de 1015 Ω y 1013 Ω en modo diferencial, una capacitancia de entrada de 0.8 pF en modo común y 1 pF en modo diferencial así como una corriente de Bias IB = 40 fA (ver anexo 2).

Etapa 3

IN S1

Etapa 2

Etapa 1

SON

DA

Amplificador de Instrumentación

Nivel Offset Circuito Puente

Inyección de corriente

Sumador Inversor

Conmutador

Oscilador Break

Generador de Onda

triangular

Vm S2 (A/D, IN)

IN

Pulso comando S3

(A/D, OUT) OUT

S4 OUT

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ETAPA 1

AMPLIFICADOR DE INSTRUMENTACIÓN Esta etapa recibe las siguientes señales: el potencial intracelular y el potencial extracelular, el cual se encuentra referido a tierra. El amplificador de instrumentación está construido con tres amplificadores operacionales y siete resistores, con una ganancia de 10. Esta etapa también recibe la señal de compensación por puente y la resta del voltaje de la sonda para eliminar el efecto del voltaje debido a la resistencia de membrana, a su vez el amplificador cuenta con un ajuste de cero y un ajuste de balance para reducir el voltaje de modo común. Tenemos que el amplificador de instrumentación esta compuesto de un amplificador diferencial básico, está etapa puede medir y también amplificar pequeñas señales que están enmascaradas con ruido. Se utilizan cuatro resistencias de precisión (1%) y dos amplificadores operacionales. Las ventajas de utilizar esta configuración para el amplificador de instrumentación son:

Incremento de la resistencia o impedancia de entrada. Esto se logra al conectar dos amplificadores operacionales, para aislar las entradas de los amplificadores operacionales, se utiliza una configuración de seguidor de voltaje como se muestra en la figura 7.

Para balancear la salida en modo común

Entrada(+)

Entrada(-)

Salida

bR

R

R

R

+

-

E1

+

-

E2

R

aR

R

A3

A2

A1

Fig.7 Amplificador de instrumentación

11

Con esto obtenemos que la salida del amplificador operacional A1 es E1 y que el voltaje de salida de A2 es E2 por lo que en la Rc tenemos el voltaje aislado en Rl de (Vo=E1-E2). En la ganancia ajustable de nuestro amplificador operacional se colocan tres resistores a la sección del amplificador diferencial como se muestra a continuación en la figura 8.

-

+

0V

Vp=E1-E2

E2

E10V

RL

+

-

E1

+

-

E2

A2

A1

Fig.8 acoplamiento de impedancias

La alta impedancia de entrada se mantiene con los seguidores de voltaje.

0V

0v

Vo=(E1-E2)(1+2/a)

E1+(E1-E2)/a

E2-(E1-E2)/a

I=E1-E2/aR

E1-E2

1

2

Entrada(-)

Entrada(+)

R

+

-

E1

+

-

E2

aR

A2

A1R

R

Fig.9 Seguidores de voltaje

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DIFERENCIAL BÁSICO Ya que el voltaje diferencial de entrada de cada amplificador operacional es 0V, los voltajes en los puntos 1 y 2 con respecto a tierra son iguales a E1 y E2, por lo tanto el voltaje a través de la resistencia aR es E1-E2. Esta resistencia puede ser fijada o puede ser un trimpot para ajustar la ganancia al valor que se requiera, en nuestro caso la ganancia debe ser fijada a 10. La corriente a través de la resistencia aR es:

aREE

I 21 −=

Esta corriente fluye a través de ambas resistencias designadas por R y el voltaje a través de las tres resistencias establece el valor de Vo.

( ) ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ +−=

aEEV 21210

Donde:

RaRa =

Por lo que tenemos una ganancia variable en el amplificador. Solo tenemos que ajustar una resistencia única aR. Esto es, tenemos que controlar el valor de nuestro potenciómetro. Con este circuito tenemos que utilizar una amplificador diferencial básico, que cambia el voltaje flotante de las resistencias, para convertirlo en un voltaje referido a tierra.

Vo/(E1-E2)=1+2/a

Para balancear la salida en modo común

Salida

bR

A3

R

R

R

Fig.10 Amplificador diferencial

13

Con esta ultima configuración colocada al final de nuestro amplificador. Diferencial se completa el amplificador de instrumentación del cual se describe en breve sus características. Para simplificar el análisis del circuito, se observa que en realidad se logra obtener colocando un amplificador diferencial básico.

OUT

-

+

diferencialbásico

AMP D'INST

RRMC

Gan

R6

R2

R4

R3 R5

R1

TRIM1

POTg

Fig.11 Etapa de ajuste de modo en rechazo común

0.000ms 0.500ms 1.000ms 1.500ms 2.000ms 2.500ms 3.000ms 3.500ms 4.000ms 4.500ms 5.000ms

125.0uV

75.00uV

25.00uV

-25.00uV

-75.00uV

-125.0uV

A: u1_1

Fig.12 Rechazo en modo común

Para la etapa del amplificador diferencial básico tenemos la siguiente ecuación, donde se observa que para A3 tenemos todas sus resistencias iguales para obtener un amplificador diferencial de ganancia unitaria. Solo el trimpot de esta etapa se hace variar para balancear eliminando cualquier voltaje en modo común. En la etapa del amplificador aislador tenemos la resistencia que hace que nuestra ganancia se ajuste a la siguiente relación.

14

aEEV 21

21

0 +=−

Donde:

RaRa =

Resumen de las características del amplificador de instrumentación:

1.- La ganancia de voltaje desde la entrada diferencial (E1 –E2) a la salida extremo único, se establece con una resistencia (Rf). 2.- la impedancia de entrada es muy alta y no cambia al variar la ganancia. 3.- el voltaje Vo no depende del voltaje común a E1 y E2 (voltaje en modo común), solo a su diferencia.

Con estas condiciones y utilizando el amplificador operacional LM353, en la simulación obtenemos un bajo ruido de 100pVolts de la terminal de salida y comparándolo con el modelo experimental se obtuvo un ruido de 200µVpp.

NIVEL DE OFFSET Debido al inicio del registro de potencial de membrana en el nivel cero de la lectura, se podrá compensar, ya sea a un nivel negativo o a un nivel positivo, si en estas condiciones se excita la célula, se tendrán errores sistemáticos en el registro y por lo tanto la lectura no será la adecuada; por este motivo se realiza la etapa de nivel de offset, este se construye con un amplificador y potenciómetros debidamente conectadas para lograr que cuando el nivel de offset se mueva, se pueda nivelar a cero.

AmpdeInst

nivelofset

+VCC

-VCC

TRIM2

R14

R8

R7

R9

R10

R11

R12

Fig.13 Nivel de offset

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CIRCUITO PUENTE Cuando se inyecta una corriente I0 para estimular a la célula, ésta genera un potencial V=IRme, al pasar por el micro electrodo, el cual tiene una resistencia Rme (Rme = Resistencia de membrana), este voltaje no deseado se suma al potencial de membrana, para eliminarlo se emplea un circuito puente, el circuito toma la señal comando I’c y la amplifica por un factor que está determinado por 3 resistores que están conectados al circuito puente; con esto se genera un voltaje de salida idéntico a V = I Rme que se resta con la señal de entrada en el amplificador de instrumentación. Una resistencia se acopla a la señal de salida del circuito puente con el amplificador de instrumentación.

AmpdeInst

Circuito puente

TARJETA A/D

Vcomando

POT1

R15

R17

R16

R13

Fig. 14. Circuito puente

0.000us 1.000us 2.000us 3.000us 4.000us

125.0mV

75.00mV

25.00mV

-25.00mV

A: v1_1B: v2_1

0.000us 1.000us 2.000us 3.000us 4.000us

125.0mV

75.00mV

25.00mV

-25.00mV

A: r6_2

0.000us 1.000us 2.000us 3.000us 4.000us

100.0mV

80.00mV

60.00mV

40.00mV

20.00mV

0.000mV

A: v2_1

Fig.15 Control de voltajes debidos al acoplamiento micropipeta- membrana

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ETAPA 2

INYECCIÓN DE CORRIENTE Esta etapa recibe una señal de voltaje comando (Vc) proveniente de la etapa de control de inyección de corriente y la convierte en una corriente proporcional a dicha señal (1pA/mV), independientemente de la señal de entrada y de la resistencia debida a la micro pipeta.

Io Vc

Inyeccion de corriente

invRm

R18

R19

Fig.16 Circuito de fijación de corriente

SUMADOR INVERSOR CONMUTADOR En esta etapa el control de inyección de corriente se encarga de proporcionar la señal comando (Vc) a partir de un pulso externo de voltaje que se aplica a través de un conector Icom, la señal comando es generada por el amplificador de ganancia unitaria. El pulso comando Vc que llega a la sonda puede ser observada con un osciloscopio a través de uno de los amplificadores de esta etapa mediante un conector que se adapta para la conexión, de esta forma se puede inyectar a la célula la corriente fijada, seleccionando la amplitud del voltaje comando Vc.

Este circuito suma el voltaje comando más un voltaje en DC, este voltaje puede ser positivo, neutro o negativo. El cual debe tener la característica de poseer un cambio de corriente con respectó al voltaje, este cambio es de 1nA / volt. La selección de la magnitud y polaridad del voltaje que se suma al voltaje comando la obtenemos con una resistencia y un potenciómetro en serie. Y a la resistencia se conecta un switch a los puntos de voltaje que se seleccionen de los siguientes: Vcc (+), Neutro (0) y Vcc (-). Para controlar los cambios de corriente, se coloca una resistencia que limita la corriente al cambio antes predispuesto. Esta corriente llega al Amplificador Operacional en la entrada inversora junto con el voltaje comando, esto es; se suma el voltaje producido por la corriente Ix y el voltaje comando.

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Sumador Conmutador

a etapade InyCorr

entradapulsocomando

sum

nivelofset

neutro

-Vcc

+Vcc

conmutadornivel DC

Vcomando

tierra

TARJETA A/D

R20 R21

R22

R23

R24 R25

R26

R28

R27

TRIM4

TRIM3

POT215V

-15V

Fig.17 Sumador conmutador

ETAPA 3

GENERADOR DE ONDA TRIANGULAR La finalidad es generar pulsos de prueba (pulsos cuadrados de corriente de 1 nA pp) que pueden aplicarse a la micro pipeta a través de un capacitor de la sonda. Para activar o desactivar estos pulsos de prueba se utiliza un interruptor que le llamaremos “PRUEBA”. La corriente a través del capacitor (Cc) de la sonda esta determinada por

dttdvCti c)()( =

Y se observa que para producir una corriente i(t) cuadrada de 1nA pp es necesario aplicar una onda v(t) triangular a través de Cc. Por consiguiente, el generador de pulsos de prueba consta de un generador de ondas triangulares con una etapa de ganancia. La ganancia de las ondas triangulares se ajusta mediante el potenciómetro de ajuste fino. Una resistencia acoplara el circuito de pulsos de prueba con la compensación de capacitancia negativo que se encontrara dentro de la sonda.

18

señal out

generador ondatriangular

control defrecuencia

control deamplitud

TRIM5 S3

C1

TRIM6

R32

R31

Fig.18 Generador “onda triangular”

Fig.19 Onda triangular

OSCILADOR (PERFORACIÓN DE MEMBRANA) La utilidad de esta etapa, es precisamente la de poder penetrar la membrana generando una oscilación en la punta de la micro pipeta para romper la pared celular y así poder evitar que la micro pipeta se obstruya. Este debe de contar con un push-botom que nos permita mantener y controlar la duración de la oscilación durante el tiempo que sea necesario.

19

señal triIN

oscilador(break mem)

inv

S4

salida ondatriangulara "sonda"

R29R30

R33POT3

S4

Fig.20 Oscilador (break)

CONSTRUCCIÓN DE UNA FUENTE DE PODER Por otro lado, se necesita de una fuente de poder para alimentar, especialmente a los amplificadores operaciones que se usan en dicho diseño, para esto se realiza un fuente con características especiales y la mas importante es que debe poseer un bajo ruido a la salida, alrededor de los pico Volts, y con fases de ±15 volts. En la figura siguiente se muestra el diseño electrónico de la fuente propuesta.

Fig.21 Fuente de alimentación de ultra bajo ruido

En esta fuente se utiliza un transformador reductor con una constante de reducción de 1 a 4, esto es, que el voltaje de entrada en el devanado primario se encuentra un voltaje de 120 V AC y en el devanado secundario se obtiene

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un voltaje de 25 V AC con respectó al TOP CENTRAL. La reducción se muestra en la siguiente figura.

Fig.22 voltaje AC de salida del transformador

La etapa que le sigue a la reducción es la etapa de rectificación de onda completa. Para esta etapa se utiliza un puente de diodos, en esta etapa la señal deja de ser AC para ser convertida en una señal de DC con un voltaje pico de 25 Vp como se muestra en la figura 23. Los capacitores en los nodos A y B, tienen como función amortiguar el rizo de la señal rectificada, esto es, dar un filtrado previo. En la siguiente figura 23 se observa como los condensadores filtran la señal antes de ser regulada. En el nodo A entra la señal DC al regulador 78LM15 para la parte positiva, y esta señal tiene un rizo de 0.6V. Este voltaje desaparece a la salida de nuestro regulador que es el nodo C y en este nodo encontramos un voltaje de 15V DC con un voltaje de rizo de 20µV, el cual es aceptable para nuestros requerimientos técnicos. En el nodo B entra la señal DC al regulador 79LM15 para la parte negativa, y esta señal tiene un rizo de 0.6V. Este voltaje desaparece a la salida de nuestro regulador que es el nodo D y en este nodo encontramos un voltaje de -15V DC con un voltaje rizo 20µV el cual es aceptable para nuestros requerimientos técnicos.

Fig.23 Voltaje DC de la fuente

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CONSTRUCCIÓN DE LAS TARJETAS Tanto la fuente de alimentación como el amplificador y la sonda deben estar montados en un chasis y en una tarjeta independiente uno con respecto a otro, ya que si se ensamblan en la misma tarjeta y por consecuencia en el mismo chasis generarán mucha interferencia y lo que se pretende con este diseño es minimizar en lo posible la interferencia y el ruido, así que si se independizan las tres etapas globales podremos evitar dichos artefactos. Para esto se propone que tanto la fuente y el amplificador se monten en chasis estándares y para la sonda un chasis llamado caja pomona el cual aísla el interior de la caja con el exterior y lo protege de artefactos como la luz natural, interferencia de lámparas, y ruido de 60 HZ. Para nuestro caso la construcción de las tarjetas se limita a distribuir los componentes electrónicos y pistas de conexión de tal forma que sean identificables, y posteriormente mostrarlas en figuras de tamaño real ya sea 1:1 o 1:2 para los componentes y tarjetas. Subsiguientemente sería el enviar dichas imágenes a alguna compañía para que construyan las pistas y los huecos pertenecientes a los componentes electrónicos. La distribución para cada placa debe tener 3 capas las cuales se indican a continuación. 1. Pistas horizontales 2. Pistas verticales 3. Componentes y etiquetas.

Para obtener mejores resultados en el tamaño de los dispositivos y del grosor de las pistas, se utilizó software especializado en diseño y manipulación de imágenes.

22

PLACA DEL AMPLIFICADOR

Fig. 24 PLACAS (las 3 capas para el Amplificador de fijación de corriente.)

23

PLACA DE LA FUENTE

Figura. 25 PLACAS (Las tres capas de la fuente)

24

DISEÑO FINAL DEL AMPLIFICADOR DE FIJACIÓN DE CORRIENTE

nivelofset

(GND)solucion "sonda"

membrana"sonda"

generador ondatriangular

oscilador(break mem)

entradapulsocomando

inv

control defrecuencia

control deamplitud

suminv

nivelofset

Gan

RRMC

seg

segAMP D'INST

neutro

-Vcc

+Vcc

salidapulso comandoa "sonda"

S1

S2

S3

S4

Vmembra OUT

conmutadornivel DC

Vcomando

tierra

TARJETA A/D

"FUENTE DE FIJACION DE CORRIENTE"

diferencialbásico

Circuito puente

salida ondatriangulara "sonda"

S1

-15V

15V

-15V

15V

S4

TRIM6

C1

S3TRIM5

POT3

S2

POT2

TRIM3

TRIM4

POT1

POTg

TRIM1

GNDtierra comun

TRIM2

R33

R31

R32

R30R29

R27

R28

R26

R25R24

R23

R22

R21R20

R19

R18

R13

R12

R14

R11

R16

R17

R15

R10

R9

R1

R5R3

R4R2

R6R7

R8

Figura 26 Diagrama “amplificador de fijación de corriente”

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ESPECIFICACIONES DE DISEÑO Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Particularmente los protocolos para la técnica de fijación de corriente, consiste en conectar eléctricamente el amplificador a la célula a través de un micro electrodo. Al amplificador de fijación de corriente se le aplica un pulso rectangular de voltaje, el amplificador convierte este pulso en un pulso de corriente el cual se inyecta a la célula a través del micro electrodo. El cambio de potencial de membrana inducido por la corriente se mide a través del mismo micro electrodo, el voltaje de membrana de la célula es multiplicado a la salida del amplificador por un factor X. La micro pipeta debe de ser lo mas pequeña posible en comparación con el diámetro de la célula con el objeto de evitar que ésta sufra daños y con ello se induzcan cambios en su comportamiento. Por otra parte, es importante conocer la resistencia eléctrica de la micro pipeta ya que esta en función principalmente del diámetro de su punta. El diámetro se utiliza como parámetro para establecer si la punta es suficientemente fina y, por lo tanto, sirve como ayuda para determinar si es necesario o no rechazar las micro-pipetas para su uso en un experimento.

En nuestro diseño no se utilizo el amplificador de instrumentación comercial ya que debido a que nuestras necesidades requerían de especificaciones particulares como impedancias y capacitancias de entrada, y gran respuesta en frecuencia, en cambio utilizamos nuestros propios diseños para cubrir nuestras necesidades haciendo uso del amplificador operacional LF353, resultando el más adecuado para nuestro fin. De acuerdo con la técnica de fijación de corriente, es frecuente y necesario estimular eléctricamente a la célula, con el objeto de modificar el potencial de membrana hasta alcanzar cierto umbral y con ello generar un potencial de acción, lo anterior se logra inyectando en la célula una corriente de valor conocido, lo que permite despolarizar la membrana en forma controlada. De aquí la justificación de la interfase tarjeta A/D y amplificador, pues con esto es posible configurar la estimulación de la célula por medio de un paquete de software afín con el propósito de estudio

La tesis se basa en tres secciones principales las cuales son: el diseño del amplificador de fijación de corriente, la construcción de la fuente de poder y la configuración de los mismos en tarjetas, para lo cual cada una de las secciones conllevan otras tareas especificas. Para el diseño del amplificador, se realiza en tres etapas, las cuales son: Etapa 1:

• Amplificador de instrumentación • Nivel de OFFSET • Circuito Puente

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Etapa 2:

• Inyección de corriente • Sumador Inversor Conmutador

Etapa 3:

• Oscilador Break • Generador de Onda triangular.

Para el amplificador de instrumentación se tomó en cuenta que recibe dos señales que son:

• potencial de membrana • referencia extracelular (tierra)

Además cuenta con una ganancia de 10, un ajuste de cero, un ajuste de balance para reducir el voltaje de modo común, así como también impedancia de entrada alta, baja capacitancias de entrada e impedancia de salida bajo, a la salida del amplificador se conecta un instrumento de despliegue para conocer los niveles de voltaje adquiridos de la membrana, ya sea conectando un osciloscopio o un voltímetro digital. Nivel de offset: esta etapa elimina el offset que se presenta al inicio del registro y con esto no se realicen errores sistemáticos en la medición. Circuito puente: La inyección de corriente para estimular a la célula, genera un potencial que se suma al potencial de membrana, debido al acoplamiento micropipeta-membrana, dicho circuito elimina el potencial generado por la inyección de corriente para que solo permanezca el potencial de membrana. Inyección de corriente: este recibe el voltaje comando, es convertido en corriente proporcional a dicha señal en 1pA/mV. Sumador inversor-conmutador. Realiza la operación de incrementar el valor del voltaje comando mas el voltaje en DC que se puede conmutar ya sea positivo, negativo ó neutro. Generador de onda triangular. Genera pulsos de prueba de 1nA pp. Para ser aplicado a la micro pipeta a través de un capacitor que se encuentra dentro de la sonda y consta de un generador de ondas triangulares con una etapa de ganancia. Oscilador break. Realiza el rompimiento de la membrana celular a través de la micropipeta para poder perforar la célula a registrar.

Para el acoplamiento final de las tres etapas se toman en cuenta las impedancias de entrada altas, pero gracias a las características ya mencionadas con anterioridad del amplificador de instrumentación se realiza con éxito el acoplamiento y el circuito final se muestra en la figura 26.

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La fuente de poder entrega a la salida un voltaje de ±15V y a alrededor de 250mA, esto debido a la carga total de los dispositivos que alimenta dicha fuente, este dispositivo de carga es el amplificador operacional LF353, así mismo la fuente entrega un voltaje de rizo de 20µV que es aceptable para nuestros requerimientos técnicos ya que nuestro amplificador de fijación de corriente trabaja en términos de mV.

Para la sección del diseño de placas se tomo en cuenta que las pistas

de nuestros 2 circuitos (amplificador y fuente) existen dos casos: las pistas verticales y las pistas horizontales así como también de etiquetas y tamaño de dispositivos, con la ayuda de circuitmaker con lo que se llevo a cabo la importación de los circuitos al software traxmaker, esto para poder adecuar las pistas y dispositivos a nuestro criterio. Por otro lado para poder adaptar el diseño de las tarjetas ya sea a tamaño 1X que corresponde al formato de este trabajo ó 2X que es usado para el ploteo de las placas, se importaron los circuitos del software traxmaker a un software de diseño y manipulación de imágenes y así concluir con éxito la adaptación de las placas para su posterior ploteo.

CONCLUSIONES La necesidad de construir un amplificador de fijación de corriente, es poder contar con un sistema de registro adecuado para la adquisición de potenciales de membrana que cumpla con las características de diseño mencionadas en los objetivos planteados para su construcción y diseño. Este diseño es una buena opción para aquellos investigadores que necesitan abatir costos y aumentar los beneficios de investigación, en especial el de contar con un sistema confiable capaz de entregar un mínimo ruido a la salida del sistema. El diseño propuesto cuenta con una herramienta, que es la de romper la membrana, esta herramienta disminuye los tiempos de registro y el de la oclusión de la membrana sobre la micropipeta.

Este sistema es compatible con cualquier convertidor A/D, esto no limita al investigador a adquirir un amplificador y el convertidor de marcas indistintas, también si llegara el caso de que se diseñe un software independiente con las especificaciones requeridas por los investigadores, el diseño del sistema de adquisición es capaz de trabajar con misma configuración diseñada originalmente. El amplificador cuenta además con el diseño de una fuente de ultra bajo ruido para asegurar la baja interferencia de ruidos que puedan influir en las mediciones que se desean adquirir, además de soportar la demanda de carga que el amplificador requiera. En nuestro país las investigaciones acerca del registro de potencial bioeléctricos son una herramienta necesaria en los campos médicos y biológicos.

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APENDICE 1 Características del componente LF353 utilizado para el diseño del amplificador.

29

APENDICE 2 Características del componente AD549 utilizado para el diseño de la sonda.

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