T.C GIDA TARIM VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ

DNA Dizileme

(Sekanslama)

Dr. Eray ATIL

Vet. Hekim, Mikrobiyolog

Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü

Eğitim süresi

◦ 3 ay

Başlangıç Tarihi

◦ 08 Aralık 2013

Bitiş Tarihi

◦ 7 Mart 2014

Ülke

◦ İngiltere

Yer

◦ Leicester University

Bölüm

◦ Infection, Immunity and

Inflammation

Danışman

◦ Dr. Ahmet Yeşilkaya

Eğitim Bilgileri

2

Moleküler Genetik

Laboratuvarı

Kuruluş yılı : 2011

ABI Sistem

◦ ABI 3130 XL Genetik

Analizör

DNA Sekanslama

PENDİK VETERİNER KONTROL ENSTİTÜSÜ

3

Restriksiyon Enzimleri

PCR-RFLP

◦ (Restriction Fragment Lenght

Polymorphism)

RAPD

◦ (Randomly Amplified Polymorphic DNAs)

AFLP

◦ (Amplified Fragment Lenght

Polymorphism)

VNTR

◦ (Variable Number Tandem Repeats)

DNA Dizileme

SNP

◦ (Single Nucletide Polymorphism)

DNA Çeşitliliğinin Analiz Edilmesinde Kullanılan Metotlar

4

…ACGTGACTGAGGACCGTG

CGACTGAGACTGACTGGGT

CTAGCTAGACTACGTTTTA

TATATATATACGTCGTCGT

ACTGATGACTAGATTACAG

ACTGATTTAGATACCTGAC

TGATTTTAAAAAAATATT…

Sanger Metodu

Maxam&Gilbert metodu

True single molecule sequencing, Strand

sequencing ve diğer metotlar

DNA Dizileme Metotları

5

- Metodun Prensibi

- Enzimatik bir metod

- ddNTP lerin rastgele

DNA zincirine

bağlanmasına dayalıdır.

- DNA polimeraz ve primer

gerektirir.

- Jel elktroforez ya da

kapillar elektroforez

gerektirir

1980 Nobel Ödülü

1)DNA tek zincir olarak hazırlanır

2)Karışım 4 normal deoksinükleotid içerir

(dGTP, dATP, dTTP, dCTP)

3)Aynı karışım 4 dideoksinükleotid herbiri

farklı floresan ile etiketlenmiş)

(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)

4) DNA polimeraz

5)Buffer

Standart Dizileme Prosedürü (Sanger)

6

DNA Dizileme Tipleri

7

Tek yönlü okuma

Çift yönlü okuma

Ters tek yönlü zincir okuma

Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri

8

Genom haritalarının çıkarılması

Bireysel genotipin tanımlanması

DNA Polimorfizminin tespit edilmesi

Genetik çeşitlilik çalışmaları

Filogenetik çalışmalar

Ebeveyn ve akrabaların tespiti

Kantitatif özellikteki gen lokuslarının

saptanması

Hastalık ve genetik bozuklukların teşhisi

Adli tıp çalışmaları

Moleküler arkeoloji

DNA Dizileme Kullanım Alanları

9

• Viruslar

• 3222 (Bacteriophage phi X 174, 5386

nt – 1977)

• Bakteriler

• 2289 (Haemophilus influenza, 1.8 x 106

nt – 1995)

• Ökaryotlar

• 68 (S. cerevisiae 1.2 x 107 nt – 1995; H.

sapiens, 3 x 109 nt -2001)

• Archaea

• 152 (Methanococcus jannaschi , 1.7 x

106 nt – 1996)

DNA Dizileme (Şimdiye kadar yapıalanlar)

10

11

Moleküler Biyolojinin Temel Prensibi

RNA Protein DNA

Elimizde genomik DNA varsa, dizinin ait olduğu tür hakkında bütün

bilgiye sahip olmalı mıyız ?

James Watson’a göre

Evrimsel geçmiş

Mutasyonlar

Moleküler saat

Kullanıldığı alanlar

◦ Genler arası etkileşim çalışmaları

◦ İlaçların dizaynı

◦ Aşı çalışmalarında suş değişilikliğinde

◦ Genetik ve bulaşıcı hastalıkların epidemiyolojisi

◦ Yeni genlerin tespiti

Filogenetik: Evrimsel geçmiş

12

Root

◦ Bütün soy için ortak ata

Branch

◦ Soy ve atasal ilişkiyi gösterir.

Branch lenght

◦ Mevcut dalda meydana gelen

değişiklikleri gösterir.

Node

◦ Mevcut ya da kaybolmuş türü işaret

eden birimdir.

Clade

◦ Ortak ataları olan her iki soydan birisi.

Distance scale

◦ Organizma ya da diziler arası farkları

temsil eden birimdir.

Topology

◦ Ağacın dallanma biçimi

Filogenetik İlişki Ağaçları

13

AM911076 /Slovakia/06

EU443551/Czech Republic/06

A/chicken/Turkey/Enez ist929/2006

A/chicken/Turkey/Taflan ist15/2006

A/chicken/Turkey/Esetce ist986/2006

A/chicken/Turkey/Ipsala/563/2008

AM911090-Slovenia-06

AM911100/Slovenia/06

DQ407519/Turkey/05

EF619980/Turkey/05

A/chicken/Turkey/Sirapinar ist706/2006

EF446771/Hungary/07

EF446779/Hungary/07

DQ323672/Russia/05

DQ449632/Russia/05

EF619990/Turkey/06

A/chicken/Turkey/Misinli ist582/2006

A/chicken/Turkey/Hilvan ist271/2005

DQ434889/Russia/05

DQ449640/Russia/05

A/chicken/Turkey/Goncaaydin ist982/2006

A/chicken/Turkey/B.Cekmece ist980/2006

A/chicken/Turkey/Silivri ist962/2006

DQ358746/Russia/05

AM492165/Germany/06

DQ095617/Qinghai/05

A/bird/Turkey/Unye ist06/2006

A/seagull/Turkey/Cayeli ist04/2006

EF362418/India/06

EF362426/India/06

DQ864715/Russia/06

A/chicken/Turkey/Baklali ist955/2006

DQ864720/Russia/06

99

64

47

56

92

92

76

82

62

38

50

96

65

95

96

43

83

78

79

44

50

50

62

49

52

59

94

51

58

36

0.001

Filogenetik Network Analizi

14

Filogenetik ağaçlar

evrimsel model için

uygun olmadığında,

Kompleks evrimsel

biçimlerin görsel hale

getirilmesinde

Verilerin derinlemesine

incelenmesinde

kullanılır.

A phylogenetic network. The network was generated by Neighbor-Net for a

sequence-based data set comprising of Salmonella isolates.

Bryant et al. Algorithms for Molecular Biology 2007 2:8 doi:10.1186/1748-7188-2-8

Filogenetik Analiz Yaparken Kabul Edilen Varsayımlar

15

Nükleotid dizisi hata içermemektedir.

Analizde kullanılan diziler homologdur.

Ortak evrimsel ilişkiye sahiptir.

Nükleotid dizileri arasındaki farklılıklar daha

büyük bir grubun temsilcisidir.

Her bir nükleotid için 4 olasılık vardır, Bir

nükleotidin diğer 3 nükleotide değişme olasılığı

eşittir(Jukes Cantor)

Bioedit

◦ Dizilerin hizalanması, BLAST araştırması, plasmid çizimi, RE site haritalandırması,

ABI ve Beckman chromatogram dosyalarının görselleştirilmesi için kullanılır.

◦ http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

ChromasPro

◦ ABI ve Beckman kromatogram dosyalarının görselleştirilmesi, çoklu

kromatogram dosyalarının açılması hizalanması, enzim kesimi haritalandırılması,

ABI Genescan dosyalarının gösterilmesi için kullanılabilir.

◦ http://technelysium.com.au/?page_id=27

ClustalW2

◦ Çoklu dizilerin hizalanması için kullanılır.

◦ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

Dizi Analizi Gerekli Araçlar

16

◦ DnaSP

Populasyon içi ve dışı dizi farklılaşması ve diğer populasyon

istatistiklerinin hesaplanmasında kullanılır.

http://www.ub.edu/dnasp/

◦ MEGA

Otomatik veya manuel dizi hizalaması, filogenetik ağaçlardan sonuç çıkarılması, web

tabanlı veritabanlarında araştırma yapmak, moleküler evrim ve evrimsel hipotezleri test

etmek için kullanılır.

http://www.megasoftware.net/

◦ NETWORK

DNA dizisi, STR, RFLP ve aminoasit verileri ile filogenetik ilişki örgüsü (median-joining

network) yapabilmek için kullanılır

http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm

◦ SplitsTree4

Dizi verilerinden evrimsel ilişki örgüsü yapar. (Alignment, distance ve ağaç setleri giriş

değeri olarak kullanılarak, split decomposition, neighbor-net, consensus network …

metotları ile çalışılabilir.

http://www.splitstree.org/

Moleküler evrim ve filogenetik

analiz için gerekli araçlar

17

BLAST

◦ Dizileri arasındaki benzer bölgeleri tespit etmek,

benzerlikleri istatistiksel olarak hesaplamak, elde

edilen DNA veya protein dizilerini başka kaynaklarla

araştırmak için kullanılır.

◦ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

TreeView

◦ Yeniden Yapılandırılan filogenetik ağaçları

görselleştirmek için kullanılır.

http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html

Yardımcı Programlar

18

Teşekkür Ederim

19

İletişim:

Batı Mahallesi Erol Kaya Cad. No:1 34890, Pendik/İSTANBUL

Telefon: 0 216 390 12 80, Fax: 0 216 354 76 92

E-posta : eray.atil@gthb.gov.tr