DNS, RNS un proteīnu biosintēze

1

Trīs galvenie procesi šūnā

• Replikācija (DNS-DNS)

• Transkripcija (DNS-RNS)

• Translācija (RNS-proteīni)

2

Kurš process ir visnepieciešamākais dzīvībai?

• Translācija ?

• Transkripcija ?

• Replikācija ?

DNS

RNS

Proteīni

Informācijas plūsma

Informācijas nesēja replikācija 3

Galvenās atšķirības starp eikariotu un prokariotu šūnām

• Eikariotos kodolam un citām organellām ir sava membrāna

• Prokariotiem nav citoskeleta• Genoma organizācija ir ļoti atšķirīga• Vērojamas lielas atšķirības bioķīmiskajos

procesos, replikācijā, transkripcijā un translācijā

4

Kas notiek replikācijā?

1. DNS dubultspirāle atritinās

2. Pēc komplementaritātes principa uz abiem esošajiem DNS pavedieniem veidojas jauni

5

Replikācijas ķīmijaP

P

P

P

P

P

P

P

CH2

CH2

CH2

OH

OH

O

O

OBase

Base

Base

CH2

CH2

CH2

OH

O

O

OBase

Base

Base

5' gals

3' gals3'

5'

3'

H20+

Saites veidošanās

OHO OHO

OHO OHO

OHO

OHO

OHO

OHO

OH

P PO O

OHOH

OHOH+

6

Kas ir nepieciešams replikācijai ?

• 1) dsDNS

• 2) Oriģins – DNS rajons, kuru atpazīst replikācijas mašinērija

• 3) Replicējošie enzīmi

• 4) Nukleotīdi

7

Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes

• 5’-3’ polimerāzes aktivitāte

5’-AAGTCACC-3’ 5’-AAGTCACCG-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’

NEKAD nav 3’-5’ polimerāzes aktivitāte!

+G

5’-3’ polimerāzes aktivitāte piemīt visām DNS un RNS polimerāzēm

8

Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes

• 3’-5’ eksonukleāzes (editēšanas) aktivitāte

5’-AAGTCAC -3’ 5’-AAGTCAC-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’

A -A

• Normālos apstākļos, tiek aizvākts viens nepareizi pievienots nukleotīds (t.i., izlabota kļūda)

• 3’-5’ eksonukleāzes aktivitāte piemīt lielākajai daļai (bet ne visām) DNS un RNS polimerāžu

• Dažām polimerāzēm piemīt arī 5’-3’ eksonukleāzes aktivitāte (piemēram, DNS polimerāzei I) 9

Polimerāzes un praimeri

• DNS polimerāzes spēj tikai pagarināt esošu DNS vai RNS fragmentu (praimeri), bet nespēj uzsākt fragmenta sintēzi

• RNS polimerāzēm ir nepieciešams tikai komplimentārais pavediens

• Tādēļ, replikācijas procesu uzsāk RNS polimerāze (t.i., uzsintezē praimeri), bet turpina DNS polimerāze

10

Praimeris

Komplimentārais pavediens (matrica)

11

Topoizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu

2

3

1

4

56

7

Pol III sintezē vadošo pavedienu

Helikāze atvij spirāli

Primāze sintezē RNS praimeri

Pol III pagarina praimeri, producē Okazaki fragmentu

Pol I aizvieto RNS praimeri ar DNS

DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

DNS replikācija (E.coli)

SSB proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos

12

Topizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu

2

3

1

5

56

7

Pol sintezē vadošo pavedienu

Helikāze atvij spirāli

Primāze sintezē RNS praimeri

Pol aizvieto Pol ; producē Okazaki fragmentu

RNāze H izšķeļ RNS praimeri

DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

DNS Replikācija (Eikarioti)

4

Pol nedaudz pagarina RNS praimeri

RPA proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos

13

Atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijas dakšā

• Eikariotos RNS praimeri vispirms pagarina Pol α un tad Pol δ. Prokariotos praimeri pagarina tikai PolIII

• Eikariotos RNS praimeri izšķeļ RNāze, kamēr prokariotos – DNS PolI, kura vienlaicīgi arī aizpilda spraugu ar DNS

• Prokariotos Okazaki fragmenti ir aptuveni 2000 bp gari, bet eikariotos – aptuveni 200bp gari (nevis otrādi...)

14

Citas atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijā

• Cēloņi:

• 1. Eikariotiskās hromosomas ir daudz garākas par prokariotiskajām

• 2. Eikariotiskās hromosomas ir lineāras, nevis cirkulāras

• 3. Eikariotiskās hromosomas ir sapakotas un uztītas uz histoniem

15

Hromosomu multiplie oriģini

Baktērijas Eikarioti

16

1 l kultūrā = 4.1010 šūnu --> 400 000 km sintezētas DNS

Raugs 14 Mbp(1 cm)

3 kb/min 20 min 330 Repl. ilgtu 80st ja būtu 1 ori

Dzīves laikā (1016 šūnu dalīšanās) sintezēti 2x1013 km DNA (2 gaismas gadi)

Cilvēks 3 Gbp(2 m)

3 kb/min 7 h >10 000 ? Repl. ilgtu 1 gadu, ja būtu 1 ori

Genoms Repl. ātrums Repl. laiks Oriģini Komentāri

E. coli 4.6 Mbp 30 kb/min 40 min 1

DNS sintēzes ātrumi un nepieciešamība pēc vairākiem oriģiniem

17

Lineāras DNS replicēšanai vajag īpašus līdzekļus:

• Telomēras: īsu sekvenču atkārtojumi hromosomu galos

• Telomerāze: polimerāze, kas veido telomēras

• Kam noder telomēras un telomerāze?

Telomēras un telomerāze

18

• Telomerāze satur savu RNS fragmentu, kas darbojas kā matrica DNS galu sintēzei

• RNS fragments satur divus tiešos atkārtojumus (parādīts aaaacccc 2x atkārtojums dažos vienšūņos, mugurkaulniekiem tas ir cccctaa)

• Pēc viena nukleotīdu pievienošanas cikla, telomerāze translocējas līdz nākošajam ttttgggg atkārtojumam

• Realitātē process ir ievērojami komplicētāks...

Telomerāze darbībā

19

Vai telomerāze vienmer ir aktīva?

• Aktīva bērniem un pieaugušo dzimumšūnās un cilmes šūnās

• Neaktīva lielā daļā somatisko šūnu pieaugušajiem• Tātad hromosomas patiešām ar laiku paliek īsākas – viens

no iemesliem, kāpēc mēs novecojam• Tā paša iemesla dēļ kultivētas primārās zīdītāju šūnas

dalās ierobežotu reižu skaitu• Telomerāzes aktivācija pieaugušās pelēs paildzina to mūžu• Telomerāze ir aktīva lielākajā daļā audzēju

20

Transkripcija

21

Kas ir nepieciešams transkripcijai?

• dsDNS matrica

• promoters = transkripcijas uzsākšanas vieta

• ribonukleotīdi

• RNS polimerāze un transkripcijas faktori

22

Eksoni, introni un sekvences gēnu galos• Introni –nekodējošās sekvences eikariotu gēnu vidus daļā

• Eksoni – gēnu kodējošās sekvences

• Introni bieži tiek uzlūkoti kā “nederīga” DNS, bet tie var saturēt regulatoras sekvences vai funkcionālas nekodējošās RNS

• Parasti introni ir daudz garāki par eksoniem

• Gēnu 5’un 3’ gali satur t.s. netranslētos reģionus (UTR), kuri satur regulējošas sekvences

Eksoni

Introni

5’ UTR

(Untranslated region)3’UTR

23

Eikariotiskie promoteriTATA bokss

• Vislabāk izpētītā promoteru sekvence

• Atrodas daudzu, bet ne visu gēnu 5’ UTR sastāvā 25-35 nukleotīdus pirms transkripcijas sākuma vietas

• Piesaista t.s. TATA boksa piesaistīšanās proteīnu TBP, kas ir transkripcijas faktora TFIID sastāvdaļa

24

Citi eikariotisko promoteru elementi

• CpG salas – CG bagātas sekvences, piedalās transkripcijas regulācijā, C nukleotīds var būt metilēts

• BRE (TFII B recognition element) – tieši piesaista transkripcijas faktoru IIB

• Iniciatora elements (Inr) darbojas līdzīgi TATA boksam un arī piesaista TBP

• DPE elements (Downstream promoter element) piesaista citas TFIID subvienības- TAF9 un TAF5

• Eikariotisko promoteru sastāvā var būt viens vai vairāki no minētajiem elementiem

CpG BRE TATA Inr DPE-100 līdz -1 -37 līdz -32 -31 līdz -26 -2 līdz +4 +28 līdz +32

GGGCCACGCG TATA AAA

TPyPyAN PyPyT

A GAG

ACTT

GAC

25

Enhānseri

• Transkripciju regulējošie elementi tālu (līdz 50,000 bp) no transkripcijas sākuma vietas

• Var atrasties pirms gēna, pēc gēna vai intronā• Kalpo kā regulatoro proteīnu piesaistes vieta

26

Transkripcijas iniciācija eikariotos - pārskats

Enhancer

27

Vispārējie transkripcijas faktori (GTFi, General transcription factors)

• Nepieciešami RNS polimerāzes piesaistei un transkripcijas uzsākšanai no lielākās daļas promoteru

• Prokariotos ir tikai viens GTF – sigma faktors

• Eikariotos ir vismaz 6 GTFi – TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF un TFIIH

28

GTFu funkcijasA

B

C

D

• (A) TFIID (kura sastāvdaļa ir TBP) atpazīst TATA boksu

• (B) TFIIA un B stabilizē kompleksu, rada vietu RNS polimerāzes piesaistei

• (C) TFIIF piesaista brīvu RNS polimerāzi un kopā ar TFIIE un H piesaistās esošajam kompleksam

• TFIIE un TFIIH ir iesaistīti dsDNS pavedienu atdalīšanā

• (D) Pēc visu faktoru un RNS polimerāzes piesasitīšanās sākas transkripcija

• Pēc transkripcijas uzsākšanas, GTFi no kompleksa disociē 29

Transkripcijas trīs fāzes

• Iniciācijā pie promotera piesaistas GTFi un RNS polimerāze un izveidojas transkripcijas burbulis

• Elongācijā notiek RNS ķēdes pagarināšana

• Terminācijā polimerāze sasniedz transkripcijas «stop» sekvenci (terminatoru) un RNS ir gatava

• movie

Transkripcijas burbulis

DNS-RNS hibrīds

Augošā RNS

Start Stop

Iniciācija

Elongācija

Terminācija

30

Pēc transkripcijas...

• Prokariotos RNS ir gatava translācijai uzreiz pēc transkripcijas vai pat vienlaicīgi ar to

• Eikariotos vispirms ir jāveic RNS procesēšana un transports uz citoplazmu

31

pre-mRNS procesēšana

• 1) Kepings

• 2) Poliadenilēšana

• 3) Splasings

(1)

(2)

(3)

32

Keps (angl. cap)

• Īpaša struktūra mRNS 5’- galā• Nepieciešams translācijai

eikariotos• Pievieno kepinga enzīms un

metiltransfreāzes• Norisinās vienlaicīgi ar

transkripciju• Apzīmējums: m7Gppp

7-metil guanilāts

5’- 5’ saite ar 3 fosfātu grupām

Pirmo 2 nukleotīdu metilēšana

33

Poliadenilēšana• Gēnu 3’ galos ir t.s. poly-A signālsekvence:

AAUAAA(N)50(G/U)bagāts rajons• Sasniedzot poly-A signālu : • 1. Transkripcija tiek terminēta• 2. RNS tiek sašķelta 10-35 nukleotīdus pēc AAUAAA

sekvences• 3. Poly-A polimerāze pie RNS pievieno aptuveni 200 adenilātus• Poliadenilēšana ir nepieciešama:

– 1) transkripcijas terminācijai– 2) mRNS transportam uz citoplazmu– 3) translācijai– 4) mRNS aizsardzībai pret eksonukleāzēm

34

Splaisings: intronu izšķelšana

Konsensus sekvence splaisa saita tuvumā

YYYY

35

Splaisinga molekulārais mehānisms

• Splaisings notiek ar divu transesterifikācijas reakciju palīdzību

• Rezultātā izšķeļas «P» veida lariāta introns

• Reakciju katalizē splaisosoma – liels proteīnu un RNS komplekss

36

mRNS nukleārais transports

A A A AA

m7Gppp

mRNS

eksporteris

mRNS

Kodola membrāna

Nukleoplazma

Citoplazma

Nukleārā

pora

• Process, kurā mRNS tiek transportēta uz citoplazmu

37

Translācija

38

Ģenētiskais kods

39

Translācijas fāze• Gēna sekvence:• AGGTCATGTCTAGGTATGCCC• 1. fāze:• AGG TCA TGT CTA GGT ATG CCC• Arg Ser Cys Leu Gly Met Pro• 2. fāze:• A GGT CAT GTC TAG GTA TGC CC• Gly His Val ---- Val Cys Pro• 3. fāze:• AG GTC ATG TCT AGG TAT GCC C• Val Met Ser Arg Tyr Ala• Vēl 3 fāzes ir uz otrā dsDNA pavediena

40

Trīs galvenie RNS veidi

• mRNS – translācijas matrica

• rRNS – ribosomu sastāvdaļa

• tRNS – nolasa mRNS kodu

41

tRNS satur atbilstošās aminoskābes antikodonu – t.i. kodonam komplimentāru sekvenci

tRNS

42

Aminoskābe (Phe)

Phe aminoacil-tRNS sintetāze Phe tRNS

(tRNSPhe)

Phe un tRNSPhe

savienošana

Augstas enerģijas

estera saite

Aminoacil-tRNS

Aminoacil-tRNS sintēze

43

tRNSPhe saistās ar Phe kodonu UUU

mRNSAminoacil-tRNS

Kopējais rezultāts: Phe atpazīst savu kodonu

Ģenētiskā koda nolasīšanas mehānisms

44

Ribosoma

• Proteīnu biosintēzes mašinērija• 65% RNS, 35% proteīns• 4 dažādas RNS, 83 proteīni (eikariotiem)• Katalītisko aktivitāti veic RNS daļa

45

Translācijas faktori

• Proteīni, kuri nav ribosomu sastāvā, bet kuri ir nepieciešami dažādos translācijas etapos – iniciācijā, elongācijā un terminācijā

• Iniciācijas faktori (eIF1, eIF2...)

• Elongācijas faktori (eEF1, eEF2)

• Atbrīvošanas (angl. «release») faktori (eRF1, eRF3), nepieciešami translācijas terminācijai

46

Eikariotiskās ribosomas subvienības

eIF6 un eIF3 neļauj 60S un 40S subvienībām priekšlaicīgi apvienoties

47

Iniciācija

Preiniciācijas komplekss

Pirmās aminoacil tRNS piesaistīšana

48

Preiniciācijas komplekss

Iniciācijas komplekss

mRNS piesasitīšana

49

mRNS skanēšana un starta kodona atpazīsana

Iniciācijas komplekss

50

Lielās subvienības piesaistīšana

51

Elongācija

Nākošās aminoskābes piesaistīšana A centrā

Ribosomā ir 3 centri (E, P, A), kuros var atrasties tRNS:A – Aminoacil-tRNS piesasitīšanāsP – PeptīdaE- tRNS izejas (Eject)

52

Peptīda saites izveidošana

53

Ribosomas translokācija

54

Terminācija• Terminācijas kodonu

neatpazīst tRNS, bet atbrīvošanas faktoru eRF1-eRF3 komplekss

• Rezultātā tiek atšķelta pēdējā tRNS P saitā un atbrīvota ribosoma un proteīns

55

Movie

Ribosomas atkārtota izmantošana

56