Tudományos Diákköri Dolgozat

BARANYAI ZSUZSA

Mycobacterium tuberculosis tenyészetének növekedését gátló peptidkonjugátumok szintézise és

funkcionális jellemzése

Témavezetők: Dr. Bősze Szilvia, tudományos főmunkatárs Dr. Horváti Kata, tudományos munkatárs

Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar

Budapest, 2009

2

Tartalomjegyzék

1. BEVEZETÉS ............................................................................................................... 5

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................................ 7

2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium .................................................. 7

2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok

és jellemzőik .................................................................................................................... 8

2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése ....... 11

2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával ................................... 12

2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül.............................................................. 13

2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására

elméletileg alkalmazható hordozómolekulák bemutatása ................................................ 14

2.4.3. A hatóanyag – hordozó egység között kialakítható kémiai kötések

típusainak bemutatása .................................................................................................... 16

2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák

hordozóhoz történő kapcsolása során ............................................................................. 18

2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység)

való alkalmazása ............................................................................................................. 18

2.4.5. Antituberkulotikum – hordozó konjugátumok áttekintése ....................................... 20

2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek

alkalmazásával ................................................................................................................ 21

3. CÉLKITŰZÉS .............................................................................................................. 23

4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE ...................... 24

4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis ..................................................................................... 24

4.1.1. A Boc/Bzl módszer ................................................................................................ 24

4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer ........................................................................................... 25

4.1.3. A peptidkötés kialakítása a szintézis során ............................................................ 25

4.1.4. A kapcsolási reakciók követése ............................................................................. 26

4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása ................ 26

4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása ...................................... 27

4.4. Az áramlási citometria .............................................................................................. 29

3

5. A KÍSÉRLETI MUNKA ................................................................................................. 31

5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise ............................................................ 31

5.1.1. A H-GFLGC-NH2 peptidamid és származékainak szintézise

Boc/Bzl stratégiával ......................................................................................................... 31

5.1.2. A H-[TKPKG]2C-NH2 peptidamid és származékainak szintézise

Fmoc/tBu stratégiával ...................................................................................................... 33

5.1.3. Az in silico meghatározott hatóanyag jelöltek származékainak

(vegyület 102 és 103) konjugálása .................................................................................. 34

5.2. A hordozóban a cisztein oxidációs állapotának ellenőrzése a konjugálási reakciót

megelőzően ..................................................................................................................... 35

5.3. A hordozó peptiszármazék dimerizációjának követése a konjugálási

reakciót megelőzően ....................................................................................................... 35

5.4. A konjugálási reakcióban alkalmazott klóracetilezett SAK származék előállítása ..... 35

5.5. A 103-Aoa-OT10-Cys konjugálása ClAc-SAK-hoz .................................................... 36

5.6. A konjugátumok minimális gátló koncentrációjának és telepszámának

meghatározása ............................................................................................................... 36

5.7. A hordozómolekulák és a konjugátumok sejtekbe történő bejutásának,

felvételének vizsgálata áramlási citometriával ................................................................. 37

5.7.1. A Cf-GFLGC előállítása ......................................................................................... 37

5.7.2. A Cf-GFLGC konjugálása klóracetilezett SAK-hoz ................................................ 38

5.7.3. A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának

meghatározása ............................................................................................................... 38

5.7.4. A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6

humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával ........................................................ 38

5.7.5. A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6

humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával ........................................................ 39

5.8. Tisztítási és analitikai módszerek ............................................................................. 40

5.8.1. Analitikai és preparatív RP-HPLC .......................................................................... 40

5.8.2. ESI-MS spektrometria............................................................................................ 40

5.8.3. A peptidek és a konjugátumok aminosavanalízise ................................................. 41

6. EREDMÉNYEK ........................................................................................................... 44

6.1. A GFLGC, az Aoa-GFLGC és az Aoa-OT10-Cys peptidek, peptidszármazékok

előállítása ........................................................................................................................ 44

6.2. 102-Aoa-GFLGC és 103-Aoa-OT10-Cys előállítása, az előállított vegyületek

vizsgálata ........................................................................................................................ 47

4

6.3. ClAc-SAK előállítása ................................................................................................ 53

6.4. A 103-Aoa-OT10-Cys-SAK előállítása ...................................................................... 53

6.5. A vegyületek, konjugátumok MIC és CFU értékei ..................................................... 54

6.6. Cf-GFLGC és Cf-GFLGC-SAK előállítása, és a kapott konjugátumok

sejtekbe történő bejutása ................................................................................................ 55

7. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................................... 62

Rövidítésjegyzék ............................................................................................................. 63

Irodalom .......................................................................................................................... 65

Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................ 71

5

1. BEVEZETÉS

A gümőkór vagy tuberkulózis (tbc) egy fertőző betegség, melyet a Mycobacterium

tuberculosis (továbbiakban M. tuberculosis) baktérium okoz. A tuberkulózist okozó

baktériumot Robert Koch 1882-ben fedezte fel, kutatásaiért 1905-ben Nobel-díjat kapott [1]

(1. ábra). A betegség elsősorban a tüdő szöveteit érinti (pulmonáris tbc), a beteg tüdejében

rögök keletkeznek, innen a betegség magyar neve: gümőkór [2]. A baktérium

megtámadhatja a központi idegrendszert (meningitisz), a nyirokrendszert, a keringési

rendszert (miliáris tbc), az ivarszerveket, a húgyutakat, a csontokat és az ízületeket is.

1. ábra: (A és B) Robert Koch, a tuberkulózist okozó

baktérium felfedezője

A tuberkulózis a történelem során a legtöbb halálesetet okozó fertőző betegségek egyike.

A betegség gyógyítható, de napjainkban több mint kétmilliárd ember fertőzött a

baktériummal. A harmadik világ országaiban évente kilencmillió új fertőzést és kétmillió

halálesetet jelentenek. A fertőzöttek élete során kb. 10%-ban a fertőzés biztosan

megbetegedéshez vezet. A rezisztens, vagyis a gyógyszeres kezelésnek ellenálló

baktériumtörzsek okozta megbetegedések száma évről évre lassú növekedést mutat. 2006-

ra félmilliónyira tehető a multirezisztens esetek száma. A fejlettebb országokban főként az

immunrendszer csökkent védekezőképessége teszi lehetővé a tbc-s fertőzést. A legtöbb

megbetegedést Afrikának a Szaharától délre eső részéről, illetve Dél-Kelet-Ázsiából (India,

Kína) jelentik [3] (2. ábra). Ez a mutató a HIV és AIDS terjedése miatt évről évre

drasztikusan emelkedik. Világszerte az AIDS-es betegek 15%-a hal meg tuberkulózisban

[3-5].

A B

6

2. ábra: A tuberkulózis incidencia 2007-ben [3]

Magyarországon a tuberkulózis incidenciája tartósan a legmagasabb Szabolcs-Szatmár-

Bereg megyében, de kiemelkedik Hajdú-Bihar, Jász-Nagykun-Szolnok, Borsod-Abaúj-

Zemplén megye illetve Budapest is. Hazánkban a szűrési fegyelem lazulása mellett az

alkoholizmus, a romló szociális helyzet, a munkanélküliség játszanak szerepet az incidencia

emelkedésében. A szűrővizsgálattal kiemeltek korcsoportos vizsgálata azt mutatja, hogy a

legmagasabb arány az új tbc-s esetek között a fiatal és középkorú korcsoportokban van [6].

Egy tbc-ben szenvedő, kezeletlen személy évente kb. 10-15 embert fertőzhet meg [3].

Csak azok fertőznek, akiken már kitört a betegség, a látensek nem. A baktérium dormans

állapotban évekig lehet a szervezetben, amely csak az immunrendszer legyengülésére vár,

és már „robban” is.

Dolgozatomban röviden összefoglalom a tuberkulózist okozó baktérium jellemzőit,

valamint a betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumokat és legfontosabb

jellemzőiket. Bemutatom a hatóanyagok szelektív célbajuttatásának lehetőségeit.

7

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A Mycobacterium tuberculosis kórokozó baktérium

A M. tuberculosis egy lassan szaporodó, intracelluláris, obligát aerob baktérium (3. ábra).

A baktérium 16-20 óránként osztódik. Ez más baktériumok osztódási idejéhez képest

lassúnak számít. A baktériumok osztódási ideje többnyire percekben mérhető – az

Escherichia coli húszpercenként osztódik, de a szintén mikobaktériumok közé tartozó

Mycobacterium leprae húsznaponként. A M. tuberculosis pálcika alakú baktérium, ami

ellenáll a gyengébb fertőtlenítőknek. Hetekig tűri a szárazságot, de csak a gazdaszervezeten

belül képes osztódni (in vitro tenyészetet csak hosszú idő után sikerült a baktériumból

létrehozni és fenntartani) [2].

3. ábra: A M. tuberculosis mikroszkópos képe Ziehl-Neelsen festést követően,

forrás: http://www.kimicontrol.com/edu-e.html

A M. tuberculosis 60% lipidet tartalmaz, ennek jelentős része a sejtfalban lokalizált. Ez

lehet az egyik fő oka annak, hogy a baktériumsejt nagymértékben rezisztens a hőmérséklet

változásaival szemben. A sejtfal külső rétegeinek peptidláncai képezik a sejtfal tömegének

15%-át és a biológiailag fontos antigének is itt találhatók. Ezek felelősek a celluláris

immunválasz kiváltásáért. A baktérium maga beszáradt exhalációs cseppecskékben,

köpetben 6 hónapig is életképes maradhat. Rendkívül ellenálló savakkal és lúgokkal

szemben is [7].

Stewart Cole és munkatársai 1998-ban közölték a M. tuberculosis H37Rv virulens

baktériumtörzs teljes genomjának szekvenciáját [8]. A projekt során kapott információkat az

interneten hozzáférhető TubercuList (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/) adatbázisban

gyűjtik. A frissített adatok szerint [9, 10] a teljes genom ~4,4 millió bázispárból áll és

összesen 4066 gént tartalmaz. Ebből 4009 fehérje kódoló gén, 57 gén RNS-t kódol. A

fehérjéket kódoló gének elnevezése Rv kóddal kezdődik (pl. Rv2654), ami a H37Rv törzsre

utal.

8

2.2. A tuberkulózis kezelésében alkalmazott legfontosabb antituberkulotikumok és

jellemzőik

A tuberkulózisos betegeket antibiotikumokkal, ún. antituberkulotikumokkal kezelik. A ma

alkalmazott alapvető hatóanyagokat nagyrészt még az 50-es években fejlesztették ki. A

megfelelően megválasztott kezelés az esetek döntő többségében teljes gyógyulást

eredményez. A legelterjedtebben használt antituberkulotikumok a következők [11, 12] (4.

ábra):

• első vonalbeli antituberkulotikumok: izoniazid (INH), rifampicin (RAMP), pirazinamid

(PZA), etambutol (ETB), sztreptomicin (SM)

• második vonalbeli antituberkulotikumok: aminoglikozidok, polipeptidek,

fluorokinolonok, tioamidok, cikloszerin (CS), p-aminoszalicilsav (PAS)

4. ábra: Az első vonalbeli antituberkulotikumok, és néhány másodvonalbeli

antituberkulotikum szerkezeti képlete [12]

9

A M. tuberculosis baktérium szaporodását döntően befolyásolja a környezet oxigén

szintje és kémhatása. A magas oxigéntenzió és az enyhén lúgos kémhatás mellett a tüdő

kavernákban a legmagasabb a baktérium anyagcseréjének aktivitása és szaporodási

frekvenciája is. Az antituberkulotikumok hatékonyságát a M. tuberculosis szaporodási

sebessége és a környezet kémhatása nagymértékben befolyásolja. A neutrális és enyhén

lúgos közegben, gyorsan szaporodó baktérium populációkkal szemben az INH a

leghatékonyabb, bár a RAMP és a SM is hatásosnak bizonyult. A RAMP a semleges pH-jú

sajtos gócokban lassan szaporodó baktériumokkal szemben is kimagasló aktivitással

rendelkezik. A PZA intracellulárisan savas kémhatásnál fejti ki hatását [13] (5. ábra).

5. ábra: A leggyakrabban alkalmazott antituberkulotikumok feltételezett hatása az egyes

baktérium populációkra [13]

10

Sok antituberkulotikumot használtak évtizedeken keresztül, anélkül, hogy ismerték volna

a hatásmechanizmusaikat. A hatásmechanizmus kiderítésére irányuló kutatások eredményét

mutatja be vázlatosan az 1. táblázat.

Tulajdonság Antituberkulotikum

zsírsav

bioszintézis

inhibitorok

INH: prodrug, a KatG géntermék aktiválja, mikolsav (a mikobakteriális

sejtfal fontos építőeleme) szintézist gátolja, NADH-val képez

származékot, ezáltal a metabolizmust is megzavarja

PZA: szerkezete hasonlít az INH-hoz, prodrug, aktiválódik

Tioamidok (etionamid, protionamid): prodrug

arabinogalaktám

és peptidoglikán

bioszintézis

inhibitorok

ETB: arabinozil-transzferáz inhibitor, növeli a sejtfal áteresztő

képességét azáltal, hogy nem tud létrejönni a mikolsav-arabinogalaktám

komplex

D-cikloszerin: gátolja a D-alanin-racemáz és D-alanin-ligáz enzimeket,

melyek szükségesek az UDP-muramil-pentapeptid szintéziséhez (sejtfal

kialakításában van szerepe)

fehérje szintézis

inhibitorok

SM: a baktérium riboszómájának 30S alegységéhez kötődik (az emberi

sejtek riboszómája különbözik, ezért szelektív a baktériumsejtekre)

Aminoglikozidok

Polipeptidek

DNS alapú

folyamtok

inhibitora

RAMP: az RNS szintézist gátolja, a DNS-függő RNS-polimeráz béta

alegységéhez köt, ezzel megakadályozza a transzkripció folyamatát

Fluorokinolonok: az ATP-függő DNS-girázt (topoizomeráz II) és az ATP-

függő topoizomeráz IV-et gátolják, ezért akadályozzák a DNS replikációt

és a transzkripciót (eukarióta sejtekben nincsenek ilyen enzimek)

dihidrofolát-

reduktáz

inhibitorok

PAS: kötődik a mikobakteriális dihidrofolát-reduktáz enzimhez, így

gátolja a DNS szintézist, mely sejthalálhoz vezet

1. táblázat: A főbb antituberkulotikumok irodalomban leírt lehetséges hatásmechanizmusa

[12]

11

A makrofágok olyan intracelluláris kórokozók gazdasejtjei lehetnek, mint a M.

tuberculosis. A tbc megbetegedést okozó baktérium a makrofágok fagoszómáiban (sejten

belüli membránnal határolt sejtalkotó, amely a fagocitózis során jön létre) képesek kikerülni a

szervezet védekező mechanizmusait. A makrofágok reaktív oxigéngyökök, nitrogén-oxidok,

lizozim, hidrolitikus enzimek segítségével bontják le a baktériumokat savas vezikulumaikban.

Az aktivált makrofágok nem képesek elpusztítani az összes bekebelezett baktériumot. Ha a

fertőzött makrofágok elpusztulnak, a kiszabaduló baktériumok újabbakat fertőzhetnek meg

[14]. A fertőzött makrofágok eljuthatnak a környező nyirokcsomókba, illetve a véráram útján

egyéb szövetekbe is. Intracellulárisan a M. tuberculosis alacsony anyagcsereszinten,

dormans állapotban hosszú ideig életképes marad. Az antituberkulotikumok többsége az

inaktivált makrofágokból kiszabaduló extracelluláris baktériumokra hat [13].

2.3. A rezisztens, gyógyszeres kezelésnek ellenálló baktériumtörzsek megjelenése

A helytelen, rendszertelen és nem kellő ideig tartó gyógyszerszedés a rezisztencia

kialakulásának leggyakoribb oka. Az 1990-es évek során világszerte új fenyegetésként jelent

meg a multirezisztens (multidrug-resistant, MDR) tuberkulózis, amely a két leghatékonyabb

gyógyszerrel, az INH-dal és RAMP-nel szemben ellenállóvá vált M. tuberculosis törzsek

megjelenését jelenti. A tuberkulózisos megbetegedések 5%-a MDR tuberkulózis. Ennek a

formának a kezelése a másodvonalbeli antituberkulotikumokkal lehetséges. Ezek az

antituberkulotikumok azonban az első vonalbeli hatóanyagokhoz képest lényegesen kevésbé

hatékonyak, alkalmazásuk sokkal több és kellemetlenebb mellékhatással jár [11, 14]. A MDR

törzsek csoportján belül megjelent egy ún. extenzíven rezisztens (extensively drug resistant,

XDR) forma, amely már nemcsak az elsővonalas készítményekkel, de a jelenleg használt

hat fajta második vonalas gyógyszer közül hárommal szemben is ellenálló. Évente 40 ezer

XDR megbetegedést jelentenek [3].

A rezisztens törzsek többsége genetikai változások és az utólagos szelekció útján jön

létre. A spontán létrejött ellenálló mutációk szelekcióját a gátlóanyag jelenléte biztosítja. A

kemoterápia során megjelenő gyógyszerrezisztencia lehetőségének minimumra

csökkentését azzal érik el, hogy a szövetekben és szervekben a hatóanyagnak olyan magas

szintjét alakítják ki, mely elnyomja mind a kórokozó eredeti populációjának, mind az

esetlegesen létrejött mutánsainak szaporodását. Továbbá két olyan hatóanyagot igyekeznek

egyszerre alkalmazni, melyek alkalmazásakor keresztrezisztencia nem alakul ki, illetve a két

hatóanyag megakadályozza a másikkal szemben kialakuló mutánsok szaporodását [15].

12

2.4. A hatóanyagok célbajuttatása konjugátumok alkalmazásával

A betegség kezelésében alkalmazott antituberkulotikumok korlátozott mértékben,

diffúzióval juthatnak be a fertőzött makrofágokba a sejtmembránon keresztül. A betegség

kezelése hosszú (minimálisan 6-12 hónap), ezért számolni kell az antituberkulotikumok

mellékhatásaival, így a szervezet egészét érintő nem specifikus toxicitásukkal. A szervezet

kiválasztórendszere gyorsan kiürítheti a gyógyszert a véráramból. A hatóanyag

konjugátumok alkalmazása csökkentheti a mellékhatásokat, mivel lehetőséget adhat a

hatóanyagok szelektív, specifikus célbajuttatására a fertőzött makrofágokba. Továbbá a

hatóanyag fokozatos felszabadulása a konjugátumokból retard (elnyújtott) hatást

eredményez és ezáltal a hatóanyag lassabban ürül ki a szervezetből.

Hatóanyagok és a természetes, vagy a szintetikus eredetű makromolekulák konjugálása

50 évvel ezelőtt kezdődött. Jatzkewitz dipeptid spacert (más szóval: távolságtartó egységet)

használt, hogy egy hatóanyagot polivinilpirrolidonhoz kapcsoljon [16]. Mások számos

vízoldható polimer – hatóanyag konjugátumot szintetizáltak [17], hatóanyagot konjugáltak

immunoglobulinokhoz. Leírtak olyan polimereket is, melyek irányítható célbajuttatóként

használhatóak [18].

A gyógyszerhordozó rendszerek különféle egységekből épülnek fel. Inert szintetikus

polimer hordozóra kapcsolják a hatóanyagot, aminosav vagy peptid spacerrel összekötve. A

rendszer tartalmazhat még célbajuttató egységet [19] (6. ábra).

6. ábra: Egy gyógyszerhordozó rendszer sematikus ábrája

13

2.4.1. Anyagfelvétel a sejtmembránon keresztül

A kemoterápiában használt kis molekulasúlyú gyógyszerek diffúzióval bejutnak bármilyen

típusú sejtbe a sejtmembránon keresztül. A szelektivitás hiánya csökkenti ezeknek a

vegyületeknek a hatékonyságát, továbbá nem kívánatos mellékhatások kialakulásához

vezet.

Az endocitózis során az anyagok felvétele korlátozott. Endocitózisnál a sejtet határoló

membrán egy része körbeveszi, mintegy „elnyeli” a makromolekulát, majd belül leválik egy

ún. intracelluláris hólyagot formálva, mely tartalmazza a bekerített makromolekulát. A

hatóanyagok konjugációja hordozókhoz segíthet abban, hogy a gyógyszerkonjugátumokat

specifikusan azokba a sejtekbe irányítsuk, amelyekben a kívánt hatást el akarjuk érni. A

makromolekulák az endocitózist követően lizoszómákba kerülnek, ahol a hidrolítikus

enzimek találhatóak. A polimerhordozó – hatóanyag kötés érzékeny a lizoszomális

hidrolízisre, elbomlása során felszabadul a hatóanyag a célsejt citoplazmájában. Ilyen

rendszerek tervezésénél két kritériumot kell figyelembe venni: (1) olyan gyógyszer – hordozó

kémiai kötést kell tervezni, mely elbomlik a lizoszomális hidrolízis során, viszont képes

ellenállni az enzimek működésének a véráramban; (2) fontos továbbá, hogy a konjugátum

(hatóanyag – hordozó rendszer) felvétele specifikus legyen, csak a célsejtekbe kerüljön be

hatóanyag, és minimálisan jusson be más sejtekbe. Az endocitózis szelektivitása javítható a

molekula súlyának változtatásával, de nagyobb szelektivitás érhető el, ha specifikus

célbajuttató egységet építenek be a makromolekulába. Célbajuttató részek lehetnek

peptidek, fehérjék, szénhidrátok, szénhidrát származékok és antitestek, amelyek a célsejtre

jellemző sejtfelszíni struktúrákat ismernek fel [19].

A sejtek felületén specifikus receptorok és antigének találhatók, melyek felismernek és

kapcsolatba lépnek bizonyos típusú molekulákkal [19]. A hatóanyagok szelektív transzportja

– antituberkulotikumok esetén – a fertőzött makrofágokba történhet receptor mediált

endocitózissal. A hatóanyag molekulát olyan célbajuttató egységhez kapcsoljuk, amely

specifikusan a makrofágok sejtfelszínén található struktúrához, receptorhoz kötődik. Ilyen

receptorok lehetnek a scavenger és a tuftsin receptorok [20, 21]. A kötődés után a

konjugátum bekerül a sejtbe, majd lizoszomális degradáción megy keresztül [22, 23].

A scavenger receptorok főként a makrofágok és a makrofágszerű sejtek felszínén

expresszálódnak, a mintázatfelismerő receptorok közé tartoznak. Elsősorban a módosult

LDL-t (low density lipoprotein, kis sűrűségű lipoprotein), – pl. oxidált LDL, acetilezett LDL –

veszik fel a keringésből [24, 25.]. Továbbá ezek a receptorok polianionos ligandumok [26],

endogén anyagok, anionos foszfolipidek, kollagén, zsírsavak, peptidek, apoptotikus sejtek,

mikrobális lipopeptidek [27, 28] megkötésére képesek, melyek ezután bejutnak a sejtbe

endocitózissal [29, 30].

14

A makrofágokon, monocitákon megtalálható tuftsin receptor is alkalmas hatóanyagok

célzott sejtbejuttatására. A tuftsin-konjugátum (a tuftsin a γ-globulinból származó frakció, egy

tetrapeptid [31]) kötődése a receptorához nem csak az endocitózist segíti elő, hanem a

makrofág aktiválódását is eredményezi. Az aktivált makrofág már képes az intracelluláris

parazitákat elpusztítani [20, 23, 32, 33].

2.4.2. A hatóanyagok fertőzött makrofágokba történő célbajuttatására elméletileg

alkalmazható hordozómolekulák bemutatása

Az első konjugátumoknál természetes makromolekulákat használtak hordozóként. A

szintetikus polimerek alkalmazása több előnnyel jár: (1) a molekulatömeg tartomány

befolyásolható, (2) eltérően sok természetes makromolekulától, ezek a szintetikus hordozók

általában nem immunogének, (3) a polimerláncok térhálósíthatók a gélképződési szint

eléréséig [19].

Fehérjék széles köre használható hordozóként: egy mélytengeri csiga hemocianinja

(keyhole limpet hemocyanin, KLH), marha szérum albumin (bovine serum albumin, BSA),

ovalbumin (OVA), tetanusz toxoid (TT) és tisztított fehérje kivonatok (purified protein

derivative, PPD). A természetes vegyületek alkalmas hordozók, mert növelik a kapcsolt

epitóp immunogenitását, de jelentős hordozóspecifikus ellenanyagválasz kialakulása miatt,

alkalmazásuk a humán terápiában nem ajánlott. Ezekkel a természetes eredetű hordozókkal

ellentétben a szintetikus polimereknek és szekvenciális oligopeptideknek általában nincs

immunogén hatása [34].

A szintetikus hordozókat polimerizációval előállított (pl. elágazó láncú polipeptidek, N-

vinil-pirrolidon – maleinsav kopolimer) és diszkrét molekulákra oszthatjuk. Az előbbi

csoporttal kapcsolatban problémaként felmerül a megfelelő jellemezhetőség, illetve a

reprodukálhatóság hiánya, ami a klinikai alkalmazásuk komoly gátja. A kémiailag jól

jellemezhető molekulák közül a legelterjedtebbek a lizin dendrimerek és a lizin tartalmú

szekvenciális oligopeptidek.

N-(2-hidroxipropil)-metakrilamid (HPMA) alapú szintetikus polimerek a daganatterápiában

bizonyultak megfelelő hordozónak. Az ilyen polimerek oldhatóak vizes közegben és

biokompatibilisek. Továbbá N-metakriloil oligopeptidek p-nitrofenilésztereinek

hozzákapcsolásával kombinálhatók sok olyan gyógyszerrel, melyek primer aminocsoportot

tartalmaznak [35].

A kisebb méretű lineáris peptidek gyógyászatban való alkalmazását nehezíti, hogy az élő

szervezetbe kerülve igen gyorsan lebomlanak, ezért nem jutnak el a kívánt hatás helyére. A

terápiás alkalmazhatóság céljából nagy jelentősége van a peptidek makromolekuláris

hordozókhoz való konjugálásának. Szintetikus hordozóként régóta alkalmaznak elágazó

15

láncú poli-α-aminosavakat, mert ezek a vegyületek megfelelőnek bizonyultak a természetes

fehérjék modellezésére. Szemben a természetes antigénekkel, egyszerű, könnyen variálható

szerkezettel rendelkeznek, ezáltal megkönnyítik az immunológiai eredmények értelmezését.

Polilizin gerincű, elágazó láncú szintetikus polipeptideket Sela és munkatársai alkalmaztak

először hordozóként [36]. Az oldalláncok N- vagy C- terminálisa egy optikailag aktív

aminosavat tartalmaz. Az oldallánc végén lévő aminosav jelentős hatással van a molekula

fiziko-kémiai, illetve biológiai tulajdonságaira.

A peptidkonjugátumok előállításához az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban

kifejlesztett szintetikus polipeptidek alkalmasak hordozónak (általános képletük:

poli[Lys(Xi-DL-Alam)], (XAK), ahol i≅1, m≅2-4, és X: optikailag aktív aminosav). Ilyen polilizin

gerincű, elágazó láncú polipeptid a SAK és az EAK (7. ábra).

7. ábra: A SAK és EAK polipeptidek sematikus vázlata

A polilizin lánc kb. 100 lizinegységből épül fel, melyek ε-aminocsoportjaihoz átlagosan 3

DL-alaninból álló oligomer kapcsolódik. Az oldallánc N-terminálisához szerin illetve

glutaminsav van kötve. A kemotaktikus receptorok érzékenyek a ligandum szerkezeti

változásaira, megkülönböztetik a D-, L-aminosavakat [37]. Az EAK polipeptid amfoter

karakterű molekula, a SAK polikationos, vízoldékonysága nagy a hidroxil csoportot

tartalmazó szerin oldalláncok miatt. Hosszabb ideig stabilak a véráramban. Citotoxikus

aktivitásuk nincs vagy elenyésző [38].

Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban vizsgálták a makrofágok polimerfelvételét.

Összehasonlították a mintázatfelismerő scavenger receptoron keresztül a polilizin gerincű,

elágazó láncú molekulák sejtbejutását [28, 30].

16

Az 1970-es évek elején Najjar és munkatársai azonosítottak egy frakciót a

γ-globulinból (leukokinin), mely specifikusan kötődik a vér neutrofil granulocitáihoz, és

monocitáihoz. Ez a molekula egy tetrapeptid, a tuftsin, melynek szekvenciája embernél:

TKPR, kutyánál: TKPK. A szervezetben a tuftsint két enzim hasítja ki a

γ-globulinból [31]. A tuftsin befolyásolja a fagocitózist, a kemotaxist, magas koncentrációban

immunstimuláló, antimikrobális és daganatellenes hatása van. Ezek a tulajdonságok teszik a

tuftsint figyelemreméltó hordozó jelöltté a sejtspecifikus célbajuttatásnál [39]. Egyéb

természetes eredetű tuftsinanalóg tetrapeptidek (TRPR, TKPK, TRPK) is a tuftsinhoz

hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek [31].

Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a hordozóként alkalmazható szekvenciális

oligopeptidek egy új csoportját fejlesztették ki: az ismétlődő pentapeptid egységet tartalmazó

oligotuftsin származékokat: [TKPKG]n (n=2, 4, 6, 8). Ezek a vegyületek jól jellemezhetőek,

nem toxikusak, biodegradábilisak és tuftsinszerű biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek

[34].

Hatékonyan használhatók hatóanyag hordozóként fertőzött makrofágok esetében – mint

a tuberkulózis vagy leishmaniasis – a liposzómához kapcsolt tuftsinszármazékok. A TKPR

antimikrobiális aktivitása jelentősen növekedett azáltal, hogy a C-terminálishoz zsírsav

származékot kapcsoltak etiléndiamin spaceren (távolságtartó egység) keresztül. A palmitoil

tuftsint tartalmazó liposzómák bejutnak a monocitákba, a makrofágokba és a

polimorfonukleáris (PMN) leukocitákba [40].

2.4.3. A hatóanyag – hordozó egység között kialakítható kémiai kötések típusainak

bemutatása

Az antituberkulotikum hatásának megőrzésében fontos a hatóanyag és a hordozó között

lévő kötés kémiai jellege. A hatóanyag tulajdonságai előnytelenül változhatnak, ha a

molekula nem funkcionálisan aktív, megfelelő kémiai szerkezettel szabadul fel. A

konjugációnál leggyakrabban amid, észter, éter, oxim, tioéter, hidrazon és hidrazin jellegű

kötéseket alkalmaznak (8. ábra).

Az amidkötés kialakítását általában a lépésenkénti szintézis során alkalmazzák, a

hordozó szabad aminocsoportja és a peptid aktivált karboxilcsoportja között jön létre. Ez a

reakció azonban csak védett peptidekkel kivitelezhető.

Diszulfidhídon keresztül való kapcsoláshoz nem-védett peptidszármazékok is

használhatók, de a konjugátumok stabilitása nem minden esetben megfelelő.

Tioéterkötés kialakításával kemoszelektív ligációra van lehetőség. Így kémiailag stabilabb

konjugátum állítható elő és a kapcsoláshoz nem kell védett peptideket alkalmazni. A

tioéterkötést tartalmazó konjugátumok szintézise során az epitóppeptidet ciszteinnel

17

hosszabbítjuk, és ezt a származékot oldatban reagáltatjuk a hordozón kialakított

haloacetilezett aminocsoporttal [34, 41]. A stratégia hátránya, hogy a cisztein tartalmú

peptidek diszulfidhíd kialakításával dimerizálódnak lúgos közegben. Ez a mellékreakció

különösen gyors abban az esetben, amikor a cisztein a peptid N-terminálisán van, és az

N-terminális szabad aminocsoportként van jelen. A gyors dimerizáció kiküszöbölhető az

N-terminális aminocsoport acetilezésével vagy a cisztein C-terminálisra kapcsolásával [42].

Hidrazon-, tiazolidin- és oximkötések kialakítása egy aldehidcsoport és egy gyenge bázis

tulajdonságú oldallánc között megy végbe, savas közegben. Ezek a gyenge bázisos

oldalláncok lehetnek aminooxicsoportok, hidrazincsoportok a peptid N-terminálisán [43]. Az

oximkötés létrejöttét gyorsítja a poláris aprotikus oldószerek (DMF, DMSO) használata. Az

oximkötés kialakítása során mellékreakciók is fellépnek. Az egyik ilyen reakció a többszörös

aceileződés [44, 45]. Megfelelő megoldás az etoxietilidén védőcsoport használata, mely

átmeneti oximkötést hoz létre (hasítás: 5% TFA 47,5% acetonitril, 47,5% víz, 1 óra) [46]. Az

aminooxiacetil csoport stabil oximot képezhet a laboratóriumban jelen lévő aldehidekkel és

ketonokkal, mint például az aceton, ezért ezen vegyületeket jelenlétét igyekeznünk kell

kiküszöbölni a reakció alatt [47].

8. ábra: A konjugálás során a hatóanyag és a hordozó molekula között kialakítható kötések

A konjugátumból a hatóanyag felszabadulhat hidrolízissel (pl. észter- és amidkötés),

enzimatikus degradációval vagy pH kontrollált reakcióval. Tam és munkatársai hidrazon-,

tiazolidin- és oximkötést tartalmazó peptid dendrimerek stabilitásának pH függését

vizsgálták. A tiazolidinkötésű vegyület stabil pH=3-9 oldatban; az oximkötésű származék

savas és semleges pH-n stabil; a hidrazonkötésű konjugátum savas (pH=3) és lúgos (pH=9)

oldatban disszociálódik [43, 48].

oxim tioéter diszulfidhídamid

hidrazontiazolidin hidrazin

-CH=N-O--NH-CO- -CH2-S-CH2- -CH2-S-S-CH2-

-NH-N=CH- -NH-NH-CH2-

NH

S

18

Zeng és munkatársai két epitóppeptidet kapcsoltak össze különböző kötésekkel, hogy

tanulmányozzák a kötések befolyását a biológiai aktivitásra. A tioéterkötés nem változtatott a

peptidek funkcionális aktivitásán, az oximkötés enyhén, a diszulfidhíd jelentősen

csökkentette a funkcionális aktivitást [41].

2.4.4. A spacerek (távolságtartó egységek) szerepe a hatóanyag molekulák

hordozóhoz történő kapcsolása során

A hatóanyag és a polimerhordozó összekötéséhez a peptidek alkalmasnak bizonyultak.

Különböző enzimekkel (pl. kimotripszin, tripszin, papain, katepszin B) végeztek

tanulmányokat, annak érdekében, hogy kiderítsék, milyen peptidek a legmegfelelőbbek erre

a célra. A lizoszomális enzimek között nagy számban találunk proteázokat. A hatóanyag és a

hordozó közé épített peptid spacerek degradálhatóak lizoszomális enzimekkel. Az elhasított

kötés rendszerint a hatóanyag és a szomszédos aminosav között van. A lizoszomális

hidrolízis hatásfokát a spacert alkotó aminosavak minősége, száma, valamint szerkezeti

tényezők befolyásolják [19].

Irodalmi adatok alapján (elsősorban a proteolitikus enzimek peptidekkel alkotott

komplexének szerkezetéről írt tanulmányok szerint) spacerként alkalmazhatóak az alábbi

peptidek, amelyekben az alkotó aminosavakat egybetűs kódokkal jelöltem: GG, GFG, GFF,

GLG, GVA, GFA, GLF, GLA, AVA, GFLG, GFFL, GLLG, GFYA, GFGF, AGVF, GFFG,

GFLGF, GGFLGF [19].

Funkcionális vizsgálatokat folytattak különböző polimer hordozók, hatóanyagok és

spacerek kombinációira. A GFLG szekvenciájú peptid spacer több kísérlet eredménye

alapján is megfelelőnek bizonyult [19, 35].

2.4.4.1. A GFLG szekvencia spacer peptidként (távolságtartó egység) való

alkalmazása

A hatóanyagot peptid spaceren keresztül kapcsolhatjuk a hordozóhoz. A spacer

konjugálása a hordozóhoz többféleképpen történhet. A ciszteinnel hosszabbított spacer

konjugálását a tiolcsoporton keresztül szelektíven végre lehet hajtani. A diszulfidkötést

tartalmazó konjugátumok biológiai rendszerekben való stabilitása sokat vitatott, előnyösebb

a tioéterkötés kialakításán keresztül való kapcsolás. A tioéterkötés előnye, hogy nem igényel

védett peptidet, kémiailag és biológiailag stabilabb kötést biztosít, nem antigén karakterű. A

tioéterkötés kialakítása történhet a ciszteinnel hosszabbított konjugálandó peptid

tiolcsoportja és a hordozó molekulán kialakított klóracetilezett aminocsoport között [34] (9.

ábra).

19

PEPTID-NH-CH-CONH2

CH2

SH

+ Cl-CH2-CO-NH-HORDOZÓ

PEPTID-NH-CH-CONH2

CH2

S-CH2-CO-NH-HORDOZÓ

-HCl

9. ábra: Tioéterkötés kialakítása klóracetilezett hordozó és cisztein tartalmú peptid között

Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban a Herpes simplex vírus glikoproteinjének

peptidepitópjait, Alzheimer-kór specifikus β-amiloid peptidet, és tumorellenes aktivitású

GnRH-III peptidet ciszteinnel hosszabbítottak és közvetlenül, vagy spacer közbeékelésével

klóracetilezett tetratuftsin származékhoz kapcsoltak tioéterkötésen keresztül. A konjugálás

eredményességét növelte a spacer, a GFLG vagy oligoglicin szekvenciájú peptidek

alkalmazása. Tanulmányozták a spacer régiónak a peptid dimerekhez vezető diszulfidhidak

kialakulásában betöltött szerepét. A spacer szekvencia beépítésével csökkenthető a

diszulfidhíd képződés valószínűsége, mert a spacer beépítése növelheti a konjugálási

reakció sebességét, így csökkentheti a melléktermékként keletkező dimerek mennyiségét. A

cisztein helyzete jelentősen befolyásolja a konjugálási reakciót és az intermolekuláris

diszulfid dimerek létrejöttét [34].

A Kutatócsoportban előállítottak GFLG spacerrel módosított tetratuftsin származékot (Ac-

[TKPK(ClAc-GFLG)G]4-NH2). A peptid szintézise során a lizin oldallánc védőcsoportok

különbözőek voltak, a szelektív kapcsolás miatt. A 2-es pozíciójú lizin ε-aminocsoportján

2-klórbenziloxikarbonil (ClZ), a 4-es pozíción 9-fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc)

védőcsoportot alkalmaztak. Az Fmoc-csoport szelektív hasítását követően a GFLG spacert a

4-es pozíciójú lizin oldalláncán építették be. A GFLG szakasz N-terminálisát klóracetilezték,

a ciszteinnel hosszabbított epitóppeptiddel kialakították a tioéterkötést [34].

20

2.4.5. Antituberkulotikum – hordozó konjugátumok áttekintése

Az irodalomban találunk példát antituberkulotikum hordozóhoz konjugálásáról: a PAS

molekulát konjugálták maleilezett marha szérum albuminhoz (MBSA). A makrofágokon

található MBSA kötőhelyek, sejtfelszíni receptorok segítségével a konjugátum hatékonyan

bejutott a sejtekbe. A lizoszómában hidrolízis útján felszabadult a hatóanyag aktív formája. A

kísérleteket egérből származó fertőzött peritoneális makrofágokon végezték. A vizsgálatok

alapján a konjugátum százszor hatékonyabban pusztította el az intracelluláris M.

tuberculosis baktériumokat, mint a szabad PAS. Tehát a konjugátum alkalmazásával a

hatékonyság eléréséhez nem szükséges akkora mennyiség, mint a szabad PAS esetén.

Hasonló eredményeket értek el acetilezett lipoproteinek hordozóként való alkalmazásával is

[49].

A RAMP antituberkulotikum alkalmazása során tuftsinnal konjugált, foszfatidilkolinból álló

liposzóma belsejébe juttatták be a hatóanyagot, és így meghosszabbodott terápiás hatást

értek el [40].

Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban INH antituberkulotikumot tartalmazó

peptidkonjugátumokat terveztek, és ezek biológiai aktivitását vizsgálták. Hordozóként

tuftsinszármazékokat (GTKPKG (T6), és [TKPKG]4 (OT20)) [42] és az M. tuberculosis

immundomináns 16 kDa fehérjének egy T-sejt epitóppeptidjét (91SEFAYGSFVRTVSLPV106)

választották [50, 51]. Az INH hordozóhoz konjugálása során kétféle szintézis módszert

alkalmaztak. A munka célja a kémiai kötés funkcionális aktivitásra kifejtett hatásának

vizsgálata volt. Egyik esetben az epitóppeptidet szerinnel hosszabbították, majd szelektíven

oxidálták NaIO4-tal. Az INH-t közvetlenül a peptidhez kapcsolták hidrazonkötés kialakításával

(10. ábra). A másik esetben az INH-t glioxilsavval módosították, a keletkezett

izonikotinoilhidrazono-ecetsavat NaBH3CN-del redukálták izonikotinoilhidrazino-ecetsavvá.

Az aktivált (DIC/HOBt) izonikotinoilhidrazino-ecetsav reagált a még gyantán lévő peptid

aminocsoportjával, amidkötés létrejötte során (11. ábra). Ezen vegyületek segítségével

tanulmányozták a kémiai átalakítások hatását az INH in vitro antituberkulotikus aktivitására.

Mindegyik konjugátum hatásosnak bizonyult a M. tuberculosis H37Rv tenyészeten [50].

21

10. ábra: Izoniazid konjugálása peptidaldehidhez hidrazonkötés kialakításával

11. ábra: Izoniazid-peptid konjugátum kialakítása szilárdfázison hidrazidkötés létrejöttével

2.5. Új, lehetséges antituberkulotikumok meghatározása in silico módszerek

alkalmazásával

A rezisztens és multirezisztens törzsek terjedése miatt egyre nagyobb szükség van új

típusú antibiotikumokra. Új hatóanyagok keresése történhet ún. in silico módszerek

segítségével. A baktérium anyagcseréjében kis molekulatömegű vegyületek létfontosságú

enzimekhez való kötődését (és ezen keresztül közvetve ezen enzimek gátlását)

dokkolóalgoritmusok alkalmazásával lehet jósolni. Az in silico módszer lényege, hogy ismert

háromdimenziós (NMR, vagy röntgenkrisztallográfia) szerkezettel rendelkező fehérjékhez

dokkolják egy több millió molekulából álló vegyülettár elemeit. A kísérletekben használt

NH2-CH-CO-PEPTID

CH2OHNaIO4

pH 8,2O=CH-CO-PEPTID

N

CO-NH-NH2

Ser-PEPTID izoniazid

pH 4,6

N

CO-NH-N=CH-CO-PEPTID

hidrazon

N

CO-NH-NH2

O=CH-COOH

N

CO-NH-N=CH-COOH

N

CO-NH-NH-CH2-COOH

izoniazid izonikotinoi lhidrazono-ecetsav

izonikotinoilhidrazino-ecetsav

glioxilsav

NaBH3CN

DICHOBt

NH2-PEPTID-

N

CO-NH-NH-CH2-CO-NH-PEPTID-

hidrazid

22

molekulatár a nyilvános Zinc adatbázis (Zinc – a free database for virtual screening,

http://zinc.docking.org/) [52, 53]. A M. tuberculosis túléléséhez fontos enzimekhez kötődő

vegyületeket egy újonnan kifejlesztett dokkolási algoritmus segítségével az ELTE

Számítógéptudományi Tanszékén Dr. Grolmusz Vince kutatócsoportjában határozták meg. A

ligandumok dokkolása a DUTPáz enzimhez történt, mely a baktérium anyagcseréjében

kulcsfontosságú szerepet játszik [54]. Az így talált molekulák in vitro antibakteriális hatása

meghatározható. Az in vitro antibakteriális hatást mutató vegyületek hatékonysága ezután

szintetikus optimalizálási lépések sorozatával javítható, így az eredeti kiindulási vegyületek

lehetséges gyógyszer jelölt molekulákká alakíthatók.

23

3. CÉLKITŰZÉS

A dolgozatban összefoglalt munka célja a fertőzött makrofágokba való szelektív

célbajuttatásra alkalmas hatóanyag – hordozó konjugátumok előállítása és

funkcionális vizsgálata volt:

• peptid típusú távolságtartó egység és hordozómolekulák előállítása szilárdfázisú

peptidszintézissel, a vegyületek kémiai jellemzése;

• új in silico meghatározott és in vitro antituberkulotikus hatású vegyületek

származékainak oligo-, illetve polipeptid típusú hordozómolekulákhoz kapcsolása,

a konjugátumok kémiai jellemzése;

• a hatóanyag-hordozó konjugátumok in vitro antituberkulotikus hatásának

vizsgálata M. tuberculosis H37Rv tenyészetén;

• fluoreszcensen jelölt konjugátumok előállítása és kémiai jellemzése;

• fluoreszcens származékok in vitro sejtbejutásának vizsgálata áramlási

citométerrel.

24

4. A KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ELMÉLETI ALAPJAINAK ÁTTEKINTÉSE

Ebben a fejezetben foglaltam össze röviden az általam alkalmazott módszerek elméleti

hátterét. A kísérleti munkám leírásai, illetve a műszeres mérések körülményei az 5.

fejezetben olvashatók.

4.1. Szilárdfázisú peptidszintézis

A szintetikus munka során a peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő. A

szilárdfázisú szintézis lényege, hogy az első aminosavat hozzákapcsoljuk egy szilárd

hordozóhoz, majd újabb aminosavat kapcsolunk az előzőhöz, és az egyenkénti kapcsolást a

kívánt lánchossz eléréséig folytatjuk. A szintézis C-terminális – N-terminális irányban halad,

mert így kisebb az epimerizáció előfordulásának valószínűsége. A szintézis során olyan

aminosavszármazékokat használunk, melyek nukleofil oldalláncaikon állandó

védőcsoportokkal, az α-NH2 csoportjaikon pedig átmeneti védőcsoportokkal vannak ellátva.

Egy aminosav kapcsolása előtt az előző aminosavszármazékról az átmeneti Nα-

védőcsoportot eltávolítjuk és a kapcsolni kívánt aminosavszármazék karboxil-terminálisát

aktiváljuk. A kész peptidet lehasítjuk a hordozóról, és ezzel egy időben távolítjuk el az

állandó oldallánc védőcsoportokat is. A szilárdfázisú módszer nagy előnye, hogy az

aminosavakat és egyéb reagenseket a reakció végén egyszerű szűréssel el lehet távolítani.

A lehasított peptid oldatát szintén szűréssel lehet megkapni. Az oldatból a peptid

hosszadalmas tisztítási lépések mellőzésével, viszonylag tisztán különíthető el. A

szilárdfázisú peptidszintézisnek két, széles körben elterjedt stratégiája van, a

terc-butiloxikarbonil/benzil (Boc/Bzl) módszer és a 9-fluorenilmetiloxikarbonil/terc-butil

(Fmoc/tBu) módszer.

4.1.1. A Boc/Bzl módszer

A Boc/Bzl módszer a különböző erősségű savakra érzékeny (átmeneti) és kevésbé

érzékeny (állandó) védőcsoportokon alapul. A terc-butiloxikarbonil (Boc) védőcsoport

lúgokkal és nukleofil reagensekkel szemben stabil, de szervetlen vagy szerves savakkal

eltávolítható [55]. Hasítóelegyként 33% trifluorecetsav (TFA) / 67% DCM V/V elegyet

alkalmazunk. Mivel az acidolízis során az Nα-aminocsoport trifluoracetát sója jön létre, ezért

a hasítás után semlegesítenünk kell. Ekkor tercier-amin hatására jön létre a szabad Nα-

aminocsoport. Semlegesítő elegyként a 10% diizopropiletilamin (DIEA) / 90% DCM V/V

elegyét használjuk. A Boc/Bzl módszernél az oldallánc védőcsoportok a benzil-alkohol éter-,

25

észter- ill. uretán- származékai [56]. Ezek az oldallánc védőcsoportok csak erős savak

jelenlétében hasíthatóak, tehát a Boc-csoport lehasítása során stabilak maradnak. A szilárd

hordozóról a peptidet és az oldallánc védőcsoportokat hidrogén-fluorid (HF) segítségével

távolítottuk el, teflon készülékben, gyökfogók jelenlétében.

4.1.2. Az Fmoc/tBu módszer

Az Fmoc/tBu szintézis stratégia kiküszöböli a Boc/Bzl stratégia hátrányait: 1. az állandó

és átmeneti védőcsoportok is savérzékenyek, 2. a speciális készüléket igénylő HF

alkalmazása [57]. Ezen módszer esetében az aminosavszármazékok átmeneti

védőcsoportja a 9-fluorenilmetiloxikarbonil-csoport (Fmoc), mely savakkal szemben stabil,

bázisokkal szemben viszont labilis. A hasítást 2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V

hasítóelegyével végezzük. A hasítás során dibenzofulvén átmeneti termék keletkezik, mely

reaktív, de a piperidinnel stabil adduktot képez, ezáltal elkerülhetőek az alkileződési

mellékreakciók. Bizonyos peptidszekvenciák esetében a kísérletek azt igazolták, hogy a 2%

piperidint és 2% 1,8-diazabiciklo[5.4.0]-undek-7-ént (DBU) tartalmazó eleggyel gyors,

hatékony hasítás érhető el, ezen kívül csökkenthető az enantiomerizáció valószínűsége és

nagyobb az effektív hasítás mértéke térbeli gátlás esetén [58-60]. Az állandó oldallánc

védőcsoportok (tBu, OtBu, Boc, Trt, stb.) hasítása és a peptidek gyantáról való eltávolítása

általában TFA-val történik [56]. Mivel a hasítás során reaktív karbokationok keletkeznek,

gyökfogók használata szükséges.

4.1.3 A peptidkötés kialakítása a szintézis során

A peptidkötést a gyantához kötött szabad N-terminálisú aminosav vagy peptid és a

karboxilcsoportján aktivált és aminocsoportján védett aminosavszármazék között alakítjuk ki.

A kapcsolás in situ aktív észter kialakításával történik. A használt kapcsolószerek a DIC és a

HOBt. A DIC O-acil-izourea származékot képez az aminosavszármazék karboxilcsoportjával

és ez acilezi a szabad aminocsoportot HOBt jelenléte nélkül, N,N’-diizopropil-urea

képződése mellett. A karbodiimidek felhasználhatók aktív észterek kialakításhoz is,

amelyeket in situ a reakcióelegyben 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) segítségével alakítanak ki.

Ezáltal gyors kapcsolás érhető el és az aszparagin és glutamin esetében a dehidratáció

megelőzhető [61, 62].

26

4.1.4. A kapcsolási reakciók követése

A kapcsolás és védőcsoport eltávolítás végbemenetelét Kaiser (ninhidrin)-próba és

izatin-próba segítségével ellenőrizzük [63]. Kaiser-próba a szabad amino-terminálissal

rendelkező (primer aminocsoport) aminosav- és peptidszármazékok kimutatására alkalmas.

A keletkező vegyület sötét ibolya színű (abszorpciós λmax = 570 nm) primer aminocsoportot

tartalmazó α-aminosavak esetén (12. ábra). A szekunder aminocsoportot tartalmazó prolin

esetében a keletkező vegyület sárga színű (abszorpciós λmax = 440 nm), ezért a szilárdfázisú

peptidszintézisnél alkalmazott gyanták szintén sárga színe miatt nem érzékelhető. Az izatin-

próba a szabad iminocsoportok jelenlétét jelzi [64], ezt alkalmazzuk a prolin N-terminálisának

védőcsoport eltávolításának ellenőrzésére, valamint a prolin utáni aminosav kapcsolás

sikerességének ellenőrzésére.

O

O

2

OH

OH

OH

O

N

O

O

+

-RCHO

CHH2N

R

COOH

-CO2

-3 H2O

12. ábra: A ninhidrin a primer aminocsoportot tartalmazó α-aminosavakkal a fenti reakcióba

lép, a keletkező vegyület sötét ibolya színű

4.2. Szintetikus peptidekben a cisztein oxidációs állapotának meghatározása

Sok esetben a konjugátumokban a hordozót és a spacerpeptidet, vagy a hatóanyag

származékot tioéterkötésen keresztül kapcsoljuk egymáshoz. A tioéterkötés kialakítását a

cisztein tiolcsoportja és egy haloacetilezett csoport között végezzük. A szintetikus peptidek

cisztein tartalmának meghatározására a klasszikus aminosavanalízis módszere nem mindig

alkalmas, mert a cisztein a hidrolízis során cisztinné oxidálódhat. A megfelelő

jellemezhetőség érdekében pontosan ismernünk kell az adott vegyületben a cisztein

oxidációs állapotát. Az oxidáció a szintézis vagy a peptid tárolása során is bekövetkezhet,

így nem lehet megállapítani, hogy az oxidáció az analízis előtt vagy után történt. További

probléma a cisztein meghatározásánál az ioncserélő kromatográfiás elválasztást követő

ninhidrines származékképzés alapú módszer esetén, hogy a cisztein és a prolin retenciós

ideje közel azonos. Ezen problémák miatt szükséges egy módszer a szintetikus cisztein

tartalmú peptidek szabad tiolcsoportjának mérésére. Erre a célra megfelelőnek bizonyult a

szabad tiolcsoport és az N-etilmaleimid (NEM) reakciója (13. ábra). A reakció rövid idő alatt,

27

semleges vagy enyhén bázisos közegben végbemegy. A peptidet N-etilmaleimiddel

reagáltatva stabil S-(N-etilszukcinimido)-származék keletkezik, mely molekula RP-HPLC

körülmények között elválasztható a kiindulási peptidtől, és tömegspektrométerrel

azonosítható. A kvantitatív meghatározáshoz kevesebb, mint 0,1 µM peptid elegendő [65].

13. ábra: N-etilmaleimid reakciója ciszteintartalmú peptiddel

4.3. Minimális gátló koncentráció és telepszám meghatározása

Az antibiotikumok hatásának kvantitatív jellemzésére a minimális gátló koncentráció

(minimal inhibitory concentration, MIC) meghatározása szolgál. A MIC az a legkisebb

hatóanyag mennyiség, amely 1ml térfogatban gátolja a baktériumtörzs szaporodását.

Mértékegysége µg/ml, mg/l. A MIC érték meghatározását folyékony táptalajban ún. hígításos

leves módszerrel végezzük, ahol az adott antibiotikumra nézve csökkenő koncentrációjú

csöveket befertőzzük a baktérium megfelelő sűrűségű szuszpenziójával [2]. A minimális

gátló szintet annak a csőnek a vegyület koncentrációja jelenti, amelyben a kellő időtartamú

inkubálás után szabad szemmel még nem észleltünk növekedést. A minimális gátló

koncentráció értéke függ az alkalmazott táptalajtól, a táptalaj pH értékétől, az inokulum (az

oltáshoz felhasznált mikróba-sejttömeg) kolónia számától, az inkubáció hőmérsékletétől,

atmoszférájától és időtartamától. A baktériumok esetében ez a jelenség a mikroszervezetek

gyors adaptív tulajdonságával magyarázható, nem örökletes, modifikatív sajátság.

A MIC leolvasást követően a baktériumnövekedést nem mutató csövekből szilárd

táptalajra való kioltással meghatározható a telepszám (colony forming unit, CFU). A

telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy a táptalajokon kinőtt

telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és a telepek számolhatók legyenek,

vagyis a cél olyan lemeztenyészetek előállítása, amelyen az egyedülálló telepek száma 10-

300 közötti. A CFU/ml érték megadja, az adott minta esetében, az egységnyi térfogatban

jelenlévő életképes sejtek közelítő számát, amelyekből a számolható telepek kifejlődtek. A

módszer lényegét a 14. ábra foglalja össze.

+ N

O

O

Et

pH 7,0

N-etilmaleimid

N

O

O

Et

S

S-(N-et ilszukcinimido)-származékcisztein oldallánc

-NHCHCO-

H2C

SH

-NHCHCO-

H2CPBS

28

14. ábra: Minimális gátló koncentráció (MIC) és telepszám (CFU) meghatározásának

sematikus vázlata

29

4.4. Az áramlási citometria

Az áramlási citometria [66] alkalmazásával egyszerre mérhető önálló részecskék és

sejtek fényszórási és fluoreszcens tulajdonsága. A mérhető sejtek vagy részecskék átmérője

körülbelül 0,2 µm és 150 µm közé esik. Az áramlási citométer vázlatos felépítését mutatja be

a 15. ábra.

15. ábra: Egy áramlási citométer vázlatos felépítése, forrás: http://probes.invitrogen.com

Az áramlási citométer több lézert is tartalmazhat. Ezek lehetnek szilárdtest lézerek (355

nm, 405 nm, 488 nm) és gázlézerek (633 nm). A készülékben folyadékáram továbbítja a

sejteket. A hidrodinamikai fókuszálás biztosítja, hogy a sejtek vékony sugárban, egymás

után haladjanak és a lézersugár egyenként világítsa meg őket. A sejtek a lézersugár elé

kerülve kölcsönhatásba lépnek azzal, a lézersugár fénye részben szóródik, részben a sejtek

előre megfestett molekuláiból fénykibocsátást vált ki (16. ábra). Az ún. előre irányuló

fényszórás (forward scatter, FSC) a sejt relatív méretéről, míg az oldalra irányuló fényszórás

(side scatter, SSC) a relatív granuláltságáról, belső komplexitásáról ad információt. A

fluoreszcencia intenzitásból fluoreszcens anyagok, vagy fluoreszcens jelzéssel ellátott

vegyületek sejtbejutásáról kapunk információt. A sejtekben jelen vannak fluoreszcens

sajátságú molekulák (aminosavak, porfinvázas vegyületek, nukleinsavak, klorofill stb.), ezek

lézer

folyadékrendszer

optikai rendszer

detektorok

elektronika

30

adják a sejtek autofluoreszcenciáját, melyet az áramlási citométerrel detektálni lehet. A

legtöbb esetben a részecskéket és a sejteket ún. fluoreszcens festéssel teszik „láthatóvá” a

citométer számára. A megfelelő fluoreszcens festék (fluorofór) kiválasztása függ az

alkalmazott megvilágítás hullámhosszától, a fluorofórok abszorpciós és emissziós

tulajdonságától.

A sejtek és a lézerfény kölcsönhatása következtében emittálódó fényt az optikai rendszer

segítségével továbbítják a megfelelő detektorok felé.

A sejtek autofluoreszcenciájához viszonyítva a fluoreszcensen jelölt peptidszármazékok

felvételének mértéke detektálható. Fluoreszcens jelölésre sokféle fluorofór használatos. A

leggyakrabban használt az 5(6)-karboxifluoreszcein, a karboxirodamin, és ezek izotiocianát

és szukcinimidil-észter származékai. Elterjedtek még pl. danzilklorid, fluoreszkamin,

o-ftálaldehid, 9-fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc), kumarinszármazékok, nitrobenzofurán

származékok [67-70].

16. ábra: Egy sejt kölcsönhatása a lézersugárral, forrás: http://probes.invitrogen.com

előre irányuló szórás oldalirányú szórás fluoreszcencia

31

5. A KÍSÉRLETI MUNKA

5.1. A peptidek és peptidszármazékok szintézise

A következő szekvenciájú peptidamidokat állítottam elő manuális szilárdfázisú

szintézissel: H-GFLGC-NH2, és H-[TKPKG]2C-NH2. A H-GFLGC-NH2 peptidet Boc/Bzl stratégia,

a H-[TKPKG]2C-NH2 peptidet Fmoc/tBu stratégia alkalmazásával szintetizáltam.

5.1.1. A H-GFLGC-NH2 peptidamid és származékainak szintézise Boc/Bzl

stratégiával

A szintézishez 4-metilbenzhidrilamin (MBHA, kapacitása: 1,2 mmol/g) gyantát

használtam, az aminosavakat Nα-Boc-származék formájában kapcsoltam. A felhasznált Boc-

aminosavak közül csak a cisztein oldalláncán volt védőcsoport: 4-metilbenzil-védőcsoport (4-

MeBzl).

Az MBHA gyanta hidroklorid formában kerül kereskedelmi forgalomba, ezért a gyantát a

DCM-ben történő duzzasztás után 33% TFA / 67% DCM V/V hasítóelegyével kezeltem 5 +

30 percig, majd a DCM-mel való ötszöri mosást követően 10% DIEA / 90% DCM V/V

elegyével 5 x 1 percig semlegesítettem, ezután újból mostam ötször DCM-mel. A gyantához

az előkezelés után kapcsoltam az első Boc-aminosav származékot, a Boc-Cys(4-MeBzl)-

OH-t. A gyantakapacitásra számolva háromszoros moláris feleslegben adtam az

aminosavszármazékot, és az in situ aktív észter kialakításához szükséges kapcsolószereket

(DIC, HOBt) DCM-ben oldva. Az egy órás kapcsolási idő lejárta után DCM-es mosási lépés

következett. Ezután Kaiser-próbával ellenőriztem a kapcsolás sikerességét. Pozitív Kaiser-

próba esetén a kapcsolást meg kell ismételni. A Boc-védőcsoportot minden esetben a

gyanta előkezelésénél leírt hasítóeleggyel (33% TFA / 67% DCM V/V) távolítottam el, majd a

DCM-mel való mosást követően semlegesítettem 10% DIEA / 90% DCM V/V eleggyel. A

szintézis egy ciklusának menetét a 2. táblázat foglalja össze.

32

Művelet Reagens, oldószer Időtartam (perc)

Boc-védőcsoport

eltávolítása 2 x 2-4 ml hasítóelegy (33% TFA / 67% DCM V/V) 5 + 30

gyanta mosása 5 x 2-5 ml DCM 5 x 1

semlegesítés 5 x 2-5 ml elegy (10% DIEA / 90% DCM V/V) 5 x 1

gyanta mosása 5 x 2-5 ml DCM 5 x 1

kapcsolás

3 ekvivalens (gyanta kapacitásra számított)

Boc-aminosav / DCM ekvimoláris HOBt / DCM

ekvimoláris DIC / DCM

60

gyanta mosása 5 x 2-5 ml DCM 5 x 1

kapcsolási

reakció követése Kaiser (ninhidrin)-próba 5

2. táblázat: A Boc/Bzl stratégia szerint végzett szilárdfázisú peptidszintézis

egy ciklusának menete

A gyantán lévő peptid egy részére aminooxiecetsavat kapcsoltam. Lehasítottam az N-

terminális Boc-védőcsoportját, DCM-es mosás, semlegesítés, majd újabb mosás után 3

ekvivalens Boc-aminooxiecetsavat, HOBt-t, PyBOP-ot és 6 ekvivalens DIEA-t adtam NMP-

ben oldva. A kapcsolási reakció ideje 1 óra volt. A peptidhez kapcsolt aminooxiacetil

csoportról eltávolítottam a Boc-védőcsoportot a TFA tartalmú hasítóeleggyel.

A kapcsolás és védőcsoport eltávolítás végbemenetelét Kaiser-próba segítségével

ellenőriztem. A Kaiser-próbához szükséges oldatok összetétele: 1. ninhidrin / etanol 10:1

(m/V), 2. fenol / etanol 4:1 (m/V), 3. piridin / víz 98:2 (V/V) 4 µmol/liter KCN-dal. Egy kisebb

kémcsőbe kevés gyantaszemet rakunk és erre a 3 reagensből 1.-3. sorrendben 2-2 cseppet

adunk, majd a kémcsövet 105°C-on tartjuk 5 percig.

A szilárd hordozóról a peptidet, az aminooxiacetil-peptidet, és a peptidek oldallánc

védőcsoportjait hidrogén-fluorid (HF) segítségével távolítottam el. A hasítást teflon

készülékben végeztem, 0°C-on 1,5 óráig, gyökfogók (p-krezol, 1,4-DL-ditiotreitol)

jelenlétében. 0,5-1,0 g peptidre átlagosan 10 ml HF-ot számolva 0,5 g p-krezolra és 0,1 g

1,4-DL-ditiotreitolra volt szükség. Hasítás után a HF-ot a gyanta – peptid elegyről

ledesztilláltam, majd a hasítási terméket kicsaptam hideg éterrel, ezután szűrtem. A szűrés

után kevés A eluens (0,1% TFA / víz V/V) segítségével kioldottam a peptidet a szűrőn a

gyantaszemek közül. Az oldatot lefagyasztottam, majd liofilizáltam. Az amniooxiacetil-

peptidek szintézise és feldolgozása során mindvégig kerültem az aceton és egyéb ketonok,

aldehidek használatát.

33

5.1.2. A H-[TKPKG]2C-NH2 peptidamid és származékainak szintézise Fmoc/tBu

stratégiával

A szintézishez Rink Amide MBHA gyantát használtam, az aminosavakat Nα-Fmoc-

származék formájában kapcsoltam. A felhasznált Fmoc-aminosavak oldalláncai a 3.

táblázatban felsorolt védőcsoportokat tartalmazták.

aminosav funkciós csoport védőcsoport rövidítés

Lys amino terc-butiloxikarbonil Boc

Thr hidroxil terc-butil tBu

Cys tiol tritil Trt

Gly, Pro oldallánc védőcsoport nélkül

3. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia szerint végzett szintézishez használt Fmoc-

aminosavszármazékok oldallánc védőcsoportjai

A Rink Amide MBHA gyanta (kapacitása: 0,65 mmol/g) Fmoc-védőcsoporttal ellátva kerül

kereskedelmi forgalomba. Az Fmoc-védőcsoport eltávolítása érdekében a gyantát a DMF-

ben történő duzzasztás után 2% piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V hasítóelegyével

kezeltem 2 + 2 + 5 + 10 percig, majd DMF-fel ötször mostam. Az Fmoc/tBu stratégiánál nem

kell semlegesítési lépést alkalmazni. A gyantához az előkezelés után kapcsoltam az első

Fmoc-aminosav származékot, az Fmoc-Cys(Trt)-OH-t. A gyantakapacitásra számolva

háromszoros moláris feleslegben adtam az aminosavszármazékot, és az in situ aktív észter

kialakításához szükséges kapcsolószereket (DIC, HOBt) NMP-ben oldva. Az egy órás

kapcsolási idő lejárta után DMF-es mosási lépés következett. Ezután Kaiser-próbával

ellenőriztem a kapcsolás sikerességét. Pozitív Kaiser-próba esetén a kapcsolást meg kell

ismételni. A prolinhoz való kapcsolás ellenőrzéséhez az izatin-próbát alkalmaztam, mely

hasonló a Kaiser-próbához, de itt még van egy 4. reagens, melynek összetétele 3% izatin,

5% Boc-Phe-OH / benzilalkohol volt, melyet a Kaiser-próba reagnesei előtt csepegtettünk a

gyantaszemekhez.

Az Fmoc-védőcsoportot minden esetben a gyanta előkezelésénél leírt hasítóeleggyel (2%

piperidin / 2% DBU / 96% DMF V/V) távolítottam el, majd DMF-fel mostam. A szintézis egy

ciklusának menetét a 4. táblázat foglalja össze.

34

Művelet Reagens, oldószer Időtartam (perc)

Fmoc-

védőcsoport

eltávolítása

4 x 2-4 ml hasítóelegy (2% piperidin / 2% DBU /

96% DMF V/V) 2 + 2+ 5 + 10

gyanta mosása 5 x 2-5 ml DMF 5 x 1

kapcsolás

3 ekvivalens (gyanta kapacitásra számított)

Fmoc-aminosav / ekvimoláris HOBt / NMP

ekvimoláris DIC / NMP

60

gyanta mosása 5 x 2-5 ml DMF 5 x 1

kapcsolási

reakció követése Kaiser (ninhidrin)-, izatin-próba 5

4. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia szerint végzett szilárdfázisú peptidszintézis egy

ciklusának menete

A gyantán lévő peptidre Boc-aminooxiecetsavat kapcsoltam. Lehasítottam az

N-terminális Fmoc-védőcsoportját, DMF-es mosás után 3 ekvivalens Boc-aminooxiecetsavat,

HOBt-t és DIC-et adtam NMP-ben oldva. A kapcsolási reakció ideje 1 óra volt.

Az Fmoc/tBu módszernél az oldallánc védőcsoportokat, az N-terminális Boc-

védőcsoportot és a peptidet a gyantáról TFA-val távolítottam el. A hasítás során keletkező

reaktív karbokationok miatt 2,5% vizet, 2,5% TIS-t tartalmazó TFA elegyet használtam.

5.1.3. Az in silico meghatározott hatóanyag jelöltek származékainak (vegyület 102

és 103) konjugálása

A gyakorlati munkám során két, in silico meghatározott vegyület származékát kapcsoltam

peptidszármazékokhoz. A ligandumok szerkezetét nem mutatom be a dolgozatomban. A

vizsgált hatóanyag jelöltek (kódjuk: 102 és 103) in vitro antituberkulotikus hatással

rendelkeznek M. tuberculosis H37Rv törzsön. Mindkét hatóanyag jelölt heteroaromás

vegyület, és tartalmaznak aldehidcsoportot, melyeken keresztül oximkötéssel valósítható

meg a konjugálás.

A gyantáról lehasított, RP-HPLC segítségével megtisztított aminooxiacetil-GFLGC-NH2

(továbbiakban: Aoa-GFLGC-NH2) peptidszármazékhoz a 102-es kódú vegyületet kapcsoltam.

A kapcsolás oximkötés kialakításával történt. 10,4 mg Aoa-GFLGC-NH2-t feloldottam 1 ml

piridin / metanol / víz 1:4:1 V/V elegyében, majd 2 ekvivalens 102-es anyagot adtam hozzá.

A reakcióelegyet 24 órán át kevertettem. Az oldatból óránként mintát vettem, hogy a reakció

előrehaladását vizsgálhassam analitikai RP-HPLC segítségével.

35

A 103-as vegyületet az aminooxiacetil-[TKPKG]2C-NH2-hez (továbbiakban: Aoa-OT10-

Cys) kapcsoltam szintén oximkötésen keresztül. 45 mg Aoa-OT10-Cys-t feloldottam 0,5 ml

nátrium-acetát oldatban (pH=5,08). 3 ekvivalens 103-as anyagot feloldottam 0,5 ml DMF-

ben, majd az oldatokat összeöntöttem, a reakcióelegy oldószeraránya NaOAc / DMF 1:1

V/V. Az oldatból óránként mintát vettem és analitikai RP-HPLC-vel vizsgáltam a reakció

előrehaladását.

5.2. A hordozóban a cisztein oxidációs állapotának ellenőrzése a konjugálási

reakciót megelőzően

A megtisztított 103-Aoa-OT10-Cys-ből PBS pufferrel (pH=7,04) 1 mg/ml-es oldatot

készítettünk, majd felvettük az oldat analitikai RP-HPLC kromatogramját. Az oldathoz 1,1

ekvivalens NEM-törzsoldatot (10 mg/ml-es etanolos oldat) adtunk, és erről az elegyről is

készítettünk analitikai RP-HPLC kromatogramot.

5.3. A hordozó peptiszármazék dimerizációjának követése a konjugálási reakciót

megelőzően

A cisztein tartalmú peptidek bázikus közegben diszulfidhídon keresztül dimereket

képezhetnek, mely reakció verseng a tioéterkötés kialakulásával. A konjugálás előtt ezért

dimerizációs próbát végeztünk, hogy a reakció körülményeit meghatározhassuk. A

megtisztított 103-Aoa-OT10-Cys-ből 0,1 M TRIS pufferrel (pH=8,12) 0,5 mg/ml-es oldatot

készítettünk. Az oldatot kevertettük, és óránként mintát vettünk belőle. A mintákat analitikai

RP-HPLC-vel vizsgáltuk, hogy a cisztein oxidálódásának gyorsaságáról kapjunk információt.

5.4. A konjugálási reakcióban alkalmazott klóracetilezett SAK származék előállítása

A hordozón klóracetilcsoport jelenléte szükséges, hogy a ciszteinnel hosszabbított

peptideket tioéterkötésen keresztül konjugálhassuk hozzá. A hordozó molekulák

klóracetilezését klórecetsav-pentaklórfenilészter (ClAc-OPcp) reagens segítségével

állítottam elő. A reakcióban felhasznált poli[Lys(Ser0,90-DL-Ala2,60)] (SAK) jellemzői a

következők: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a

monomer számított móltömege: 409,35 g/mol. 120 mg SAK-ot feloldottam 2 ml víz és 9 ml

DMF elegyében. A monomerre számított 2 ekvivalens ClAc-OPcp-t 9 ml DMF-ben oldottam

és hozzáadtam a feloldott SAK-hoz, így az oldószerarány víz / DMF 1:9 V/V. A

reakcióelegyet egy éjszakán át kevertettem. Ezután dialízishártyába (10000 MWCO)

36

öntöttem, és 24 óráig dializáltam. A dialízis után szűrtem, majd liofilizáltam. Az előállított

klóracetilezett SAK (továbbiakban: ClAc-SAK) klórtartalmát Schöniger-módszerrel határoztuk

meg [71]. Az előállított ClAc-SAK-ot az 5.5. fejezetben leírt konjugálási reakcióban

használtam fel. Ugyanilyen módszerrel állítottam elő egy másik kiiundulási poli[Lys(Ser0,92-

DL-Ala2,89)] (SAK) klóracetilezett származékát. Ennek a kiindulási polimernek a jellemzői a

következők: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a

monomer számított móltömege: 431,70 g/mol. Ezt a ClAc-SAK-ot az 5.7.2. fejezetben leírt

konjugálási reakcióban használtam fel.

5.5. A 103-Aoa-OT10-Cys konjugálása ClAc-SAK-hoz

A konjugálási reakciót TRIS pufferben (pH=8,12) végeztem. A gyengén lúgos közegben

a hordozó (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00) ClAc-csoportja reagált a

cisztein tiolcsoportjával tioéterkötés kialakításával. A reakcióban felhasznált ClAc-SAK

klórtartalma 3,03% volt, melyet Schöniger-módszerrel [71] határoztunk meg. A dimerizáció

elkerülése érdekében a cisztein tartalmú peptidet itt is kis részletekben, adagoltam a

klóracetilezett hordozó oldatához. A reakcióelegyet 24 óráig kevertettem, majd ciszteint

adagoltam hozzá, amely reagálhat az elreagálatlan ClAc-csoportokkal, és a keletkezett

dimer peptideket is visszaredukálhatja. Ezután a reakcióelegyet 24 órán át dializáltam, majd

liofilizáltam. A konjugátum (103-Aoa-OT10-Cys-SAK) szubsztitúciófokát aminosavanalízissel

határoztuk meg.

5.6. A konjugátumok minimális gátló koncentrációjának és telepszámának

meghatározása

Kísérleteinket az Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet területén található

Bakteriológiai Laboratóriumban (Corden International Magyarország Kft.), Dr. Szabó Nóra

irányításával és Dávid Sándor közreműködésével végeztük. A steril hatóanyag oldatok az

ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport sejttenyésztő laboratóriumában készültek.

Kísérleteinkben referencia vegyületként INH-t alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz folyékony,

félszintetikus Sula táptalajt használtunk, a kémcsövek 5 ml steril tápfolyadékot tartalmaztak

[72-74]. Első lépésként a táptalajt tartalmazó csövekbe a vizsgálandó vegyület (102-es

vegyület, 103-as vegyület, OT10, SAK, 102-Aoa-GFLGC, 103-Aoa-OT10-Cys, 103-Aoa-

OT10-Cys-SAK) megfelelő koncentrációjú oldatából (0,1-50 µg/ml koncentráció-

tartományban, 10 koncentrációban) egyforma mennyiségeket, 100 µl-t pipettáztunk. A

végkoncentráció a referencia INH-ra nézve a következő sorozatnak megfelelő volt (γ [µg/ml]):

0,05; 0,1; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20; 0,22; 0,24; 0,30; 0,40.

37

A vegyületekből a törzsoldatokat és a megfelelő higításokat steril körülmények között

készítettük. A vegyületek különböző koncentrációit 2 párhuzamosban teszteltük. A MIC és

CFU értékekeket minden esetben legalább két független kísérletben határoztuk meg.

M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 4 hetes friss tenyészetéből golyós lombikban 0,5

Mcfarland (amely közelítőleg 1,5×108 sejtszámnak felel meg [75] sűrűségű szuszpenzió

készült Sauton táptalajban. A vizsgálandó vegyületet tartalmazó és a kontroll csöveket a

baktériumszuszpenzió 103–104 hígításainak 100 – 100 µl-ével fertőztük be. A mintákat 28

napig, 37°C-os termosztátban inkubáltuk.

A 28 nap elteltével meghatároztuk a vizsgált vegyületnek azt a legkisebb koncentrációját,

amely szabad szemmel vizsgálva teljes gátlást okozott, a kontrol csövekben tapasztalható

zavarosodáshoz képest (baktériumok szaporodása). A növekedést szabad szemmel

vizsgálva nem mutató csövekből szilárd Löwenstein-Jensen táptalajokra oltottunk ki, és 4 – 6

hét múlva megszámláltuk a kinövekedett kolóniák számát (CFU) [76, 77]. A kolónia vagy

telepszámnak a megfelelő baktériumszuszpenzió hígítással való szorzatát hasonlítottuk

össze a kiindulásként alkalmazott 0,5 Mcfarland szuszpenzió telepszámával (1,5×108

CFU/ml).

5.7. A hordozómolekulák és a konjugátumok sejtekbe történő bejutásának,

felvételének vizsgálata áramlási citometriával

A hordozómolekulák, illetve a konjugátumok sejtbejutásának vizsgálatára az áramlási

citometria módszerét választottuk. Az áramlási citometriás vizsgálatokhoz az

5(6)-karboxifluoreszceinnel (továbbiakban: Cf) jelöltem a konjugátumokat. Az

5(6)-karboxifluoreszcein 488 nm-en gerjeszthető a készülék szilárdtest lézerével.

5.7.1. A Cf-GFLGC előállítása

A Boc/Bzl stratégiával előállított, még gyantán lévő GFLGC peptidhez fluoreszcens

jelölőmolekulát kapcsoltam. Az utolsó aminosav N-terminális Boc-védőcsoportjának

lehasítása után 2,5 ekvivalens feleslegben használtam az 5(6)-karboxifluoreszceint, a HOBt-t

és a DIC-et. A reakcióidő 1 óra volt. A kapcsolás végbemenetelét Kaiser-próbával

ellenőríztem (5.1.1. fejezet). A peptidszármazékot a gyantáról HF-os hasítással távolítottam

el (5.1.1. fejezet).

38

5.7.2. A Cf-GFLGC konjugálása klóracetilezett SAK-hoz

A klóracetilezéshez felhasznált poli[Lys(Ser0,92-DL-Ala2,89)] (SAK) jellemzői a következők:

Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00 (aminosavanalízis alapján, 5.8.3. fejezet), a monomer

számított móltömege: 431,70 g/mol. 28,6 mg ClAc-SAK hordozó polimert feloldottam 0,1 M

TRIS pufferben (pH=8,15), és hozzáadagoltam a klórtartalomra számított 1 ekvivalens Cf-

GFLGC-t. A reakcióban felhasznált ClAc-SAK klórtartalma 1,17% volt, melyet Schöniger-

módszerrel [71] határoztunk meg. A dimerizáció elkerülése érdekében a cisztein tartalmú

peptidet kis részletekben adagoltam a klóracetilezett hordozó oldatához. Így a cisztein-peptid

koncentrációja a reakcióelegyben alacsony volt, hogy a peptid dimerizációjának a

valószínűségét csökkenthessük. A reakcióelegyhez, a Cf-GFLGC hozzáadagolása után, 2

ekvivalens ciszteint adagoltam. A cisztein reagálhat az elreagálatlan ClAc-csoporttal, és a

keletkezett dimer peptideket is visszaredukálhatja. Az oldatot 2 óra kevertetés után

dializáltuk 24 óráig, majd liofilizáltuk.

5.7.3. A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának

meghatározása

Az előállított Cf-GFLGC 100 µg-ját 6 M HCl oldattal hidrolizáltuk 110°C-on, 24 órán át,

leforrasztott, evakuált csőben kalibrálósor felvételéhez, a Cf-tartalom meghatározásához a

konjugátumban. Analitikai RP-HPLC-vel (oszlop: Eurosphere-100, C18, 100 Å, 5 µm, grad:

45-99 B%, 20 perc) különböző koncentrációjú Cf-GFLGC hidrolizátumok kromatogramját és

a vizsgált Cf-GFLGC-SAK hidrolizátum kromatogramját vettük fel. A detektálást λger = 419

nm-es abszorpciós és λem = 519 nm-es emissziós hullámhosszon végeztük. A mért

csúcsterületek alapján készítettük a kalibrációs egyenest, melybe behelyettesítve megkaptuk

az elhidrolizált Cf-GFLGC-SAK karboxifluoreszcein tartalmát [29].

5.7.4. A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6 humán

monocita sejtvonalon áramlási citometriával

A logaritmikus növekedési fázisban lévő MonoMac6 sejteket 24 lyukú szuszpenziós

lemezre osztottuk (1,5×105 sejt / 0,75 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes

médium). A vizsgálandó Cf-GFLGC peptidszármazékot fenolvörös nélküli RPMI-1640

szérummentes médiumban oldottuk. A törzsoldat végkoncentrációja 10-3 M volt. Ebből 10-

szeres tovafutó hígítással állítottuk elő a többi oldatot (10-3 M – 10-7 M). A sejtekről

centrifugálás (1250 rpm, 5 perc) után eltávolítottunk 500 µl médiumot, majd a kontrollokhoz

125 µl szérummentes médiumot és a kezelendő sejtekhez 125 µl Cf-GFLGC-oldatot adtunk.

39

1 óra inkubálás után (37°C, 5% CO2) a sejtszuszpenziót a szövettenyésztő lemez

mélyedéseiből FACS csövekbe vittük át. A csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc),

eltávolítottuk a médiumot. A vizsgált sejtek egyik feléhez 1000 µl szérummentes médiumot

adtunk, a másik feléhez 100 µl 1 mM tripszin oldatot adtunk. A tripszinnel kezelt sejteket 5

percig inkubáltuk 37°C-on, majd 900 µl teljes médiumot adtunk hozzá, hogy a tripszint

inaktiváljuk. A tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat, így az aspecifikusan

kötődött Cf-GFLGC peptidet is. Az inaktiválás után a csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5

perc). Ezután 1 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes médiumot adtunk a

csövekhez, majd mosás után a sejteket 0,5 ml megegyező médiumban vettük fel. A sejteket

BD LSR II áramlási citométerrel analizáltuk (lézer: 488 nm, Coherent Sapphire szilárdtest

lézer, 22 mW, FL1 csatorna, szoftver: BD FACSDiva 5.0.3). A kapott eredményeket WinMDI

program segítségével értékeltük ki.

5.7.5. A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának vizsgálata MonoMac6

humán monocita sejtvonalon áramlási citometriával

A logaritmikus növekedési fázisban lévő MonoMac6 sejteket 24 lyukú szuszpenziós

lemezre osztottuk (1,5×105 sejt / 0,70 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640 szérummentes

médium). A vizsgálandó Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékot fenolvörös nélküli RPMI-1640

szérummentes médiumban oldottuk. A törzsoldat végkoncentrációja 3,04⋅10-3 M volt. Ebből

3-szoros tovafutó hígítással állítottuk elő a többi oldatot (3,04⋅10-3 M - 3,75⋅10-5 M). A

sejtekről centrifugálás (1250 rpm, 5 perc) után eltávolítottunk 450 µl médiumot, majd a

kontrollokhoz 125 µl szérummentes médiumot és a kezelendő sejtekhez 125 µl Cf-GFLGC-

SAK-oldatot adtunk. 1 óra inkubálás után (37°C, 5% CO2) a sejtszuszpenziót a

szövettenyésztő lemez mélyedéseiből FACS csövekbe vittük át. A csöveket centrifugáltuk

(1250 rpm, 5 perc), eltávolítottuk a médiumot. A vizsgált sejtek egyik feléhez 1000 µl

szérummentes médiumot adtunk, a másik feléhez 100 µl 1 mM tripszin oldatot adtunk. A

tripszinnel kezelt sejteket 5 percig inkubáltuk 37°C-on, majd 900 µl teljes médiumot adtunk

hozzá, hogy a tripszint inaktiváljuk. A tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat,

így az aspecifikusan kötődött Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékot is. Az inaktiválás után a

csöveket centrifugáltuk (1250 rpm, 5 perc). Ezután 1 ml fenolvörös nélküli RPMI-1640

szérummentes médiumot adtunk a csövekhez, majd mosás után a sejteket 0,5 ml

megegyező médiumban vettük fel. A sejteket BD LSR II áramlási citométerrel analizáltuk

(lézer: 488 nm, Coherent Sapphire szilárdtest lézer, 22 mW, FL1 csatorna, szoftver: BD

FACSDiva 5.0.3). A kapott eredményeket WinMDI program segítségével értékeltük ki.

40

5.8. Tisztítási és analitikai módszerek

A lehasított peptideket RP-HPLC segítségével választottuk el a szennyezésektől. A nyers

termékek homogenitását minden esetben analitikai RP-HPLC vizsgálattal ellenőriztük. A

célvegyületet a frakciók azonosítása (tömegspektrometria) után a retenciós idő

meghatározásával (RP-HPLC) is jellemeztük. Az elkészített peptidekkel aminosavanalízist

végeztünk.

5.8.1. Analitikai és preparatív RP-HPLC

A lehasított peptideket, a peptidszármazékokat és a konjugátumokat RP-HPLC

segítségével választottam el a szennyezésektől szobahőmérsékleten. Az elválasztást

Knauer rendszeren a következő oszlop alkalmazásával végeztem: Jupiter (C18 10x250 mm)

10 µm, 300 Å. Az elúcióhoz alkalmazott elegyek a következők voltak: A eluens: 0,1% TFA /

víz V/V; B eluens: 0,1% TFA / acetonitril-víz 80:20 V/V, vagy 0,1% TFA / MeOH-víz 90:10

V/V. A detektálás abszorbancia mérésével történt 214 nm-en vagy 220 nm-en, a folyási

sebesség 4 ml/perc volt.. Az alkalmazott gradienst a tisztítandó vegyület polaritása határozta

meg (általában: 5 percig ekvilibrálás, 5-60 B% 35 perc alatt). A főkomponenst tartalmazó

elegyet vákuum alatt bepároltam, a bepárlási maradékot lefagyasztottam, majd liofilizáltam.

A tisztított termék homogenitását analitikai RP-HPLC vizsgálattal ellenőriztem. Az analitikai

RP-HPLC vizsgálatok Knauer rendszeren a fentebb ismertetett eluensek alkalmazásával

történtek. Az analitikai oszlopon (Jupiter C18 4,6x250 mm, 5 µm szilika, 300 Å, Cf-tartalom

meghatározásnál: Eurosphere-100 C18 4x250 mm, 5 µm szilika, 100 Å) lineáris gradiens

elúciót alkalmaztunk. Az A eluensben oldott 0,5-1,0 mg/ml töménységű mintákból az

oszlopra 20 µl mennyiségeket injektáltunk. Az elválasztásokat szobahőmérsékleten

végeztük, a folyási sebesség 1 ml/perc volt. A detektálás a félpreparatív tisztítási eljárásnál

alkalmazottal megegyezően abszorbancia mérésével (λ= 214 nm vagy 220 nm) történt. Az

alkalmazott gradiens: 5 percig ekvilibrálás, 35 perc alatt 5-60 B%.

5.8.2. ESI-MS spektrometria

A tömegspektrumokat electrospray ionforrással, Bruker Esquire 3000+ típusú ioncsapdás

készüléken vettük fel. A mintákat 0,1% AcOH-t tartalmazó AcN / víz 1:1 V/V

oldószerelegyben oldottuk és 10 µl/perc áramlási sebességgel injektáltuk. A spektrumokat

pozitív módban, 50-3000 m/z tartományban, 13,000 m/z/sec mintavételi sebességgel vettük

fel. A tömegspektrometriai méréseket az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban Horváti

Kata (tudományos munkatárs) végezte.

41

5.8.3. A peptidek és a konjugátumok aminosavanalízise

Az aminosavösszetétel és a konjugátum szubsztitúciófokának meghatározását

aminosavanalízissel végeztük. A konjugátum 100-250 µg-nyi mennyiségét 6 M HCl-dal,

110°C-on, 24 óra alatt hidrolizáltuk. A hidrolizátumból az aminosavösszetételt SYKAM 4300

automata aminosavanalizátor alkalmazásával határoztuk meg. Az aminosavanalíziseket az

MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban Dr. Medzihradszky Schweiger Hedvig végezte.

A szintetikus munka során használt vegyszereket, műszereket és oszlopokat az 5-7.

táblázatok foglalják össze.

42

Név, kapacitás Rövidítés Gyártó cég

terc-butiloxikarbonil- (Boc)

aminosavszármazékok Boc-aminosav

Nova Biochem

(Läufelfingen, Svájc) 4-metilbenzhidrilamin-gyanta (1,2 mmol/g) MBHA

4-(2’, 4’-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-

fenoxiacetamido-norleucil-MBHA-gyanta

(0,65 mmol/g)

Rink Amide MBHA

9-fluorenilmetiloxikarbonil-

aminosavszármazékok Fmoc-aminosav

Reanal (Budapest,

Magyarország) trifluorecetsav TFA

Kaiser-reagens alkotói (ninhidrin, etanol,

fenol, piridin, KCN)

diklórmetán DCM Molar (Budapest,

Magyarország) N,N-dimetilformamid DMF

N-metilpirrolidon NMP Merck (Budapest,

Magyarország)

klórecetsav-pentaklórfenilészter ClAc-OPcp laboratóriumban előállított

N,N’-diizopropilkarbodiimid DIC

Fluka, Sigma-Aldrich

(Budapest, Magyarország)

1-hidroxibenztriazol HOBt

benztriazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidino-

foszfónium-hexafluorofoszfát PyBOP

N,N-diizopropiletilamin DIEA

5(6)-karboxifluoreszcein Cf

p-krezol

1,4-DL-ditiotreitol DTT

hidrogén-fluorid HF

piperidin

1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én DBU

triizopropilszilán TIS

N-etilmaleimid NEM

metanol MeOH

foszfát puffer PBS

2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol TRIS

szövettenyésztő médium RPMI 1640

5. táblázat: A szintetikus munka során használt aminosavszármazékok, gyanták, oldószerek,

reagensek

43

Elnevezés Gyártó cég

Knauer RP-HPLC rendszer Knauer (Bad Homburg, Németország)

Bruker Daltonics Esquire 3000+

tömegspektrométer Bruker (Bremen, Németország)

SYKAM 4300 automata aminosavanalizátor SYKAM (Eresing, Németország)

HF teflonkészülék Peninsula Laboratories, INC. (Belmont, CA,

USA)

liofilizátor Virtis (Warminster, PA, USA)

áramlási citométer BD LSR II BD Biosciences (San Jose, CA, USA)

Snake skin dialízishártya Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA)

Sedival fénymikroszkóp Carl Zeiss (Jena, Németország)

25 cm2, 75 cm2, 175 cm2 szövettenyésztő

flaska

Sarstedt (Nümbrecht, Németország) 24 lyukú szuszpenziós szövettenyésztő

lemez

1ml, 5ml, 10ml, 25 ml szerológiai pipetta

5 ml áramlási citometriás cső

6. táblázat: A szintetikus munka során alkalmazott műszerek

Elnevezés Jellemzők Gyártó cég

Phenomenex -

félpreparatív

fordított fázisú, módosított szilika töltet

Jupiter (C18 10x250 mm) 10 µm, 300 Å Phenomenex (Torrance,

CA, USA) Phenomenex-

analitikai

fordított fázisú, módosított szilika töltet

Jupiter (C18 4,6x250 mm) 5 µm, 300 Å

Eurospher-

analitikai

fordított fázisú, módosított szilika töltet

(C18 4x250 mm) 5 µm, 100 Å

Knauer (Bad Homburg,

Németország)

7. táblázat: A szintetikus munka során alkalmazott RP-HPLC oszlopok, töltetek

44

6. EREDMÉNYEK

6.1. A GFLGC, az Aoa-GFLGC és az Aoa-OT10-Cys peptidek, peptidszármazékok

előállítása

Előállítottam a C-terminálison cisztein aminosavval hosszabbított GFLGC szekvenciájú

spacerként (távolságtartó egység) alkalmazott peptidamidot szilárdfázisú peptidszintézissel

Boc/Bzl stratégiával (5.1.1. fejezet). A 17. ábra mutatja a tisztított peptid analitikai RP-HPLC

kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b, c).

0 10 20 30 40-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

t / min

A (

220n

m)

GFLGC

a.

Rt=24,1 perc

45

b.

495.2

+MS, 0.6-2.0m in (#27-#90)

0

1

2

3

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

17. ábra: a. A tisztított GFLGC peptid analitikai RP-HPLC kromatogramja (körülmények:

Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 1 mg/ml, λ = 220 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc)

és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=494,2), c. izotópeloszlása

A GFLGC spacer N-terminálisra Boc-aminooxiecetsavat kapcsolva előállítottam az Aoa-

GFLGC peptidszármazékot (5.1.1. fejezet) (18. ábra). A 19. ábra mutatja a tisztított peptid

analitikai RP-HPLC kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b, c).

18. ábra: A Boc-aminooxiecetsav reakciója a peptid szabad N-terminálisával

495.2

496.1

497.2

+MS, 0.6-2.0min (#27-#90)

0

1

2

3

47x10

Intens.

490 492 494 496 498 500 m/z

c.

[M+H]+

Boc-NH-O-CH2-COOH

Boc-aminooxiecetsav

Boc-NH-O-CH2-CO-NH-PEPTIDNH2-PEPTID

Boc-aminooxiacet il-peptidpeptid

+- H2O

46

b.

0 10 20 30 40-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

A (

214

nm)

t / min

Aoa-GFLGC

156.2495.4

568.4

+MS, 0.0-0.3min (#2-#14)

0

1

2

3

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

19. ábra: a. A tisztított Aoa-GFLGC peptidszármazék analitikai RP-HPLC kromatogramja

(körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 1 mg/ml, λ = 214 nm,

grad: 5-60 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=567,3), c. izotópeloszlása

[M+H]+

Rt=24,6 perc

a.

568.4

569.3

570.4

+MS, 0.0-0.3min (#2-#14)

0

1

2

3

6x10Intens.

564 566 568 570 572 574 m/z

c.

47

a.

Előállítottam szilárdfázisú peptidszintézissel, Fmoc/tBu stratégiával a C-terminálison

ciszteinnel hosszabbított OT10-Cys oligotuftsin származékot (5.1.2. fejezet). Az OT10-Cys

N-terminálisára is Boc-aminooxiecetsavat kapcsoltam, így előállítva az Aoa-OT10-Cys-t

(5.1.2. fejezet) (18. ábra). A 20. ábra mutatja a nyers peptid tömegspektrumát (a, b). Ezt a

peptidet tisztítás nélkül használtam fel a konjugáláshoz.

305.2

406.5

609.0

+MS, 0.0-0.0min (#1-#2)

0

1

2

3

4

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

20. ábra: a. A nyers Aoa-OT10-Cys tömegspektruma (Mmo (számított)=1215,8), b. izotópeloszlás

6.2. 102-Aoa-GFLGC és 103-Aoa-OT10-Cys előállítása, az előállított vegyületek

jellemzése

A 102-es vegyületet az Aoa-GFLGC-hez, a 103-ast az Aoa-OT10-Cys-hez konjugáltam

oximkötés kialakításával (5.1.3. fejezet) (21. ábra). A reakció közben az oldatból óránként

mintát vettem és analitikai RP-HPLC-vel követtem a reakció előrehaladását. A

kromatogramok elemzése alapján megállapítottam, hogy a reakció egy óra alatt lejátszódott.

Az előállított és tisztított konjugátumok analitikai RP-HPLC kromatogramját és

tömegspektrumait a 22. és 23. ábrákon mutatom be.

21. ábra: Aldehidcsoportot tartalmazó hatóanyag jelöltek és aminooxiacetil-peptid

konjugálása oximkötés kialakításával

+--CHO NH2-O-CH2-CO-PEPTID --CH=N-O-CH2-CO-PEPTID

- H2O

609.0

609.5

610.0

610.4

+All, 0.3-0.8min (#11-#30)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

606 607 608 609 610 611 612 m/z

b. [M+2H]2+

[M+3H]3+

[M+4H]4+

48

b.

0 10 20 30 40-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

A (

214

nm)

t / min

102-Aoa-GFLGC

230.3381.9 636.6

779.7

+MS, 0.2-0.5min (#9-#27)

0

2

4

6

6x10Intens.

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z

22. ábra: a. A tisztított 102-Aoa-GFLGC konjugátum analitikai RP-HPLC kromatogramja

(körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, λ = 214 nm, grad: 5-60 B%, 35 perc)

és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=778,6), c. izotópeloszlása

a.

779.7

780.6

781.6

782.6

+MS, 0.2-0.5min (#9-#27)

0

2

4

6

6x10Intens.

776 778 780 782 784 m/z

c.

Rt=32,5 perc

[M+H]+

[’102’+H]+

49

b.

0 10 20 30 40

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

A (

220

nm)

t / min

103-Aoa-OT10-Cys

218.2

361.5

481.6

721.5

+MS, 0.0-0.4min (#3-#20)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

23. ábra: a. A tisztított 103-Aoa-OT10-Cys peptidszármazék analitikai RP-HPLC

kromatogramja (körülmények: Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 220 nm, grad: 5-

60 B%, 35 perc) és b. tömegspektruma (Mmo (számított)=1441,1), c. izotópeloszlás

721.5

722.0

+MS, 0.0-0.4min (#3-#20)

0

1

2

3

4

5x10Intens.

719 720 721 722 723 724 m/z

c.

[M+3H]3+

[M+4H]4+

[M+2H]2+

a. Rt=20,1 perc

50

b.

A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumban meghatároztuk a cisztein oxidációs állapotát NEM-

reagens segítségével (5.2. fejezet). A kromatogramok alapján megállapítható, hogy a

cisztein a konjugátumban szabad tiolcsoportot tartalmaz. A peptidet N-etilmaleimiddel

reagáltatva stabil S-(N-etilszukcinimido)-származék keletkezett, amelyet az analitikai RP-

HPLC körülmények között elválasztottunk a kiindulási peptidtől, és tömegspektrométerrel

azonosítottuk (24. ábra).

0 10 20 30 40

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

A (

220

nm)

t / min

N-etilmaleimid

szukcinimid származék

338.5

392.7

523.4

664.0 766.0

+MS, 0.0-0.1min (#2-#6)

0

1

2

3

4

5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

24. ábra: a. A 103-Aoa-OT10-Cys és a NEM reakciója után felvett analitikai RP-HPLC

kromatogram (körülmények: Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 220 nm, grad: 5-60

B%, 35 perc), és b. a keletkezett szukcinimid-származék tömegspektruma (Mmo

(számított)=1566,2)

[M+4H]4+

[M+3H]3+

a.

Rt1=12,3 perc

Rt2=20,9 perc

51

A 103-Aoa-OT10-Cys dimerizációs sebességét vizsgáltuk TRIS pufferben (5.3 fejezet).

Azt az eredményt kaptuk a kromatogramok analízise alapján, hogy TRIS pufferben 3 óra

elteltével a konjugátum 80%-a dimer formában van jelen (25. ábra). A 26. ábrán látható a

dimerizálódott 103-Aoa-OT10-Cys tömegspektruma.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00

20

40

60

80

100

mon

omer

%

t / h

25. ábra: A 103-Aoa-OT10-Cys dimerizációs próbája során felvett analitikai RP-HPLC

kromatogramokon a monomer mennyiségének fogyása az idő függvényében (körülmények:

Phenomenex Jupiter C18 oszlop, 300 Å, λ = 214 nm, grad: 0-80 B%, 35 perc)

338.5

412.8

481.3

577.3

663.6

+MS, 0.2-2.1min (#10-#106)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

26. ábra: A dimerizációs próba során a dimerizálódott 103-Aoa-OT10-Cys konjugátum

tömegspektruma (Mav (számított)=2880,9)

[2M-2H+7H]7+

[2M-2H+6H]6+

[2M-2H+5H]5+

52

A peptidek, peptidszármazékok és konjugátumok homogenitását RP-HPLC-vel

jellemeztük, az előállított anyagok elsődleges szerkezetét tömegspektrometriával és

aminosavanalízissel igazoltuk (8. táblázat).

Szekvencia Mmo számított Mmo mérta Rt (perc)b Aminosavanalízis

GFLGC 494,2 494,2 24,1

G 2,16 [2]; F 1,10

[1]; L 1,06 [1]; C

0,68 [1]

Aoa-GFLGC 567,3 567,4 24,6

102-Aoa-GFLGC 778,6 778,7 32,5

Cf-GFLGCc 852,5 852,6 35,1 és 35,7

Aoa-OT10-Cys 1215,8 1216,0 - T 1,90 [2]; K 4,23 [4]; P 2,00 [2]; G

2,05 [2]; C 0,84 [1] 103-Aoa-OT10-Cys 1441,1 1441,0 20,1

a monoizotópos molekulatömeg, ESI-MS, Bruker Esquire 3000+

b analitikai RP-HPLC, Phenomenex Jupiter, C18, 4,6x250 mm, 5 µm, 300 Å, grad: 5-60 B%, 35 perc

c a Cf-GFLGC származék előállítása és kémiai jellemzésének leírása a 6.6. fejezetben található

8. táblázat: Az előállított konjugátumok analitikai jellemzései

53

6.3. ClAc-SAK előállítása

A SAK hordozó molekulák klóracetilezését ClAc-OPcp reagens segítségével valósítottam

meg (5.4. fejezet). Két különböző kiindulási SAK polimert használtam: (1) poli[Lys(Ser0,90-DL-

Ala2,60)], aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,90 : 2,60 : 1,00; (2) poli[Lys(Ser0,92-DL-

Ala2,89)], aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00). Az előállított ClAc-SAK

vegyületek Schöniger-módszerrel [71] meghatározott klórtartalma: (1): 3,03% és (2): 1,17%

volt. Az alacsonyabb klórtartalmú vegyületet használtam fel a karboxifluorszcein származék

előállításához. A karboxifluoreszceint tartalmazó polimer esetében kis szubsztitúciófokra

törekedtünk, a vízoldhatóság megőrzése, valamint a karboxifluoreszcein okozta esetleges

citotoxicitás kivédése érdekében. Az előállított ClAc-SAK sematikus ábrája a 27. ábrán

látható.

27. ábra: Az előállított ClAc-SAK sematikus ábrája

6.4. A 103-Aoa-OT10-Cys-SAK előállítása

A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumot ClAc-SAK-hoz (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys =

0,90 : 2,60 : 1,00; Schöniger-módszerrel meghatározott klórtartalom: 3,03%) kapcsoltuk

tioéterkötésen keresztül, az 5.5. fejezetnek megfelelően. A konjugátum (103-Aoa-OT10-Cys-

SAK) szubsztitúciófokát aminosavanalízissel meghatározva 10,1%-ot kaptunk. Az előállított

103-Aoa-OT10-Cys-SAK sematikus ábrája a 28. ábrán látható.

54

28. ábra: Az előállított 103-Aoa-OT10-SAK sematikus ábrája

6.5. A vegyületek, konjugátumok MIC és CFU értékei

A vizsgált vegyületek MIC és CFU értékeinek meghatározását az 5.6. fejezetben leírt

módon végeztük. A kapott értékeket a 9. táblázatban foglaltam össze. Az OT10 és a SAK

hordozó nem mutatott antituberkulotikus hatást.

Vegyület MICa

γγγγ (µµµµg/ml) MIC

(µµµµmol/dm3) CFUb

INH (kontroll) 0,16 1,17 12

102-es vegyület 1,00 4,36 3

103-as vegyület 0,50 2,06 3

102-Aoa-OT10c 6,90 30,1 10

102-Aoa-GFLGC n.a.d n.a.d n.a.d

103-Aoa-OT10-Cys 10,1 41,6 n.a.d

130-Aoa-OT10-Cys-SAK n.a.d n.a.d n.a.d

a minimális gátló koncentráció M. tuberculosis H37Rv baktériumtörzsön Sula táptalajban; hatóanyag tartalomra számítva b telepszám Löwenstein-Jensen szilárd táptalajon c előállításának körülményei nem szerepelnek a dolgozatban, a 102-es hatóanyag oximkötésen keresztül kapcsolódik az OT10 hordozóhoz d meghatározása folyamatban

9. táblázat: Az előállított konjugátumok minimális gátló koncentrációja (MIC) és telepszáma

(CFU) M. tuberculosis H37Rv baktériumtörzsön

55

6.6. Cf-GFLGC és Cf-GFLGC-SAK előállítása, és a kapott konjugátumok sejtekbe

történő bejutása

A sejtbejutás követése érdekében a GFLGC spacer N-terminálisára fluoreszcens

molekulát, 5(6)-karboxifluoreszceint kapcsoltam (29. ábra), így előállítva a Cf-GFLGC-t

(5.7.1. fejezet, 8. táblázat). A 30. ábra mutatja a tisztított peptid analitikai RP-HPLC

kromatogramját (a) és tömegspektrumát (b-e). A két frakció az 5(6)-karboxifluoreszcein két

izomere, tömegspektrumuk megegyezik.

29. ábra: 5(6)-karboxifluoreszcein reakciója aminocsoporttal

0 10 20 30 40

0

500

1000

1500

2000

2500

A (

220

nm)

t / min

Cf-GFLGC

a.

Rt1=35,1 perc

Rt2=35,7 perc

56

b.

d.

99.4 338.7

418.9

563.4

733.5

853.6

+MS, 0.1-0.5min (#6-#24)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

99.4 298.0

418.9

563.4733.6

853.6

+MS, 0.0-0.2min (#3-#11)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

30. ábra: a. A tisztított Cf-GFLGC konjugátum analitikai RP-HPLC kromatogramja

(körülmények: Phenomenex Jupiter oszlop, C18, 300 Å, 0,5 mg/ml, λ = 220 nm, grad: 5-60

B%, 35 perc), b. Rt1-hez tartozó tömegspektrum (Mmo (számított)=852,5), c. izotópeloszlása, d.

Rt2-höz tartozó tömegspektrum (Mmo (számított)=852,5), e. izotópeloszlása

A ClAc-SAK-hoz (aminosavösszetétel: Ser : Ala : Lys = 0,92 : 2,89 : 1,00; Schöniger-

módszerrel meghatározott klórtartalom: 1,17%) a Cf-GFLGC fluroeszcensen jelölt peptidet

kapcsoltam tioéterkötés kialakításával (5.7.2. fejezet). Meghatároztuk a Cf-GFLGC-SAK

konjugátum Cf-tartalmát az 5.7.3. fejezetben leírt módon, a kapott érték: 6,1% (31. ábra).

853.6

854.6

855.6

856.6

+MS, 0.1-0.5min (#6-#24)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

6x10Intens.

850 852 854 856 858 m/z

853.6

854.6

855.6

856.5

+MS, 0.0-0.2min (#3-#11)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

6x10Intens.

850 852 854 856 858 860 m/z

[M+H]+

[M-H2O+2H]2+

[M+H]+

[M-H2O+2H]2+

c.

e.

57

0,000 0,004 0,008 0,012 0,0160

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Csú

cs a

latti

terü

lete

k ös

szeg

e

cCf-GFLGC

/ mg/ml

31. ábra: A Cf-GFLGC-SAK konjugátum karboxifluoreszcein tartalmának meghatározására

szolgáló kalibráló egyenes (az egyenes egyenlete: y=113,83+342752,61x; R=0,99965)

A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtekbe történő bejutását áramlási citométerrel vizsgáltuk

tripszinnel kezelt és kezeletlen MonoMac6 humán monocita sejtvonalakon (5.7.4. fejezet). A

tripszin eltávolítja a sejtfelszínhez kötődő struktúrákat, így az aspecifikusan kötődött Cf-

GFLGC peptidet is. A 32. ábra mutatja a Cf-GFLGC sejtbejutásának koncentrációfüggését,

amit a fluoreszcencia intenzitásának emelkedése jelez (a citometriás analízist megelőzően

nem történt tripszines kezelés a sejteken). A 33. ábra mutatja a tripszines kezelés nélküli és

a tripszinnel kezelt sejtek Cf-GFLGC felvételének összehasonlítását. Nem tapasztalható

jelentős különbség a tripszinnel kezelt és kezeletlen sejtek Cf-GFLGC felvételében, vagyis a

felvett Cf-GFLGC bekerül a sejtbe és nem a sejt felszínéhez kötődik aspecifikusan. A 34.

ábra a kezeletlen (kontroll) és a különböző koncentrációjú Cf-GFLGC peptiddel kezelt

sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlását mutatja be (tripszines kezelés nélkül). A

kontrollhoz viszonyítva az egyes görbék középértékének eltolódása mutatja a peptid

sejtekbe történő bejutásának koncentrációfüggését.

58

10-7 10-6 10-5 10-4 10-3

102

103

104

105

Flu

ores

zcen

cia

inte

nzitá

s

c (M)

32. ábra: A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének

meghatározása áramlási citometriával, tripszines kezelés nélkül

10-7 10-6 10-5 10-4 10-3

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

1,2x105

1,4x105 tripszin nélkültripszinnel

Flu

ores

zcen

cia

inte

nzitá

s

c (M)

33. ábra: A Cf-GFLGC peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének

meghatározása áramlási citometriával, tripszinnel nem kezelt (fekete négyzet) és tripszinnel

kezelt (piros kör) sejtek esetében

59

34. ábra: A különböző koncentrációjú Cf-GFLGC peptidszármazékkal (tripszin nélkül) kezelt

sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlása

A Cf-GFLGC-SAK sejtekbe történő bejutását is vizsgáltuk áramlási citométerrel

tripszinnel kezelt és kezeletlen sejteken (5.7.5. fejezet). A 35. ábra mutatja a Cf-GFLGC-SAK

sejtbejutásának koncentrációfüggését, amit a fluoreszcencia intenzitásának emelkedése

jelez. A 36. ábra mutatja a tripszines kezelés nélküli és a tripszinnel kezelt sejtek Cf-GFLGC-

SAK felvételének összehasonlítását. Minimális különbség tapasztalható a tripszinnel kezelt

és kezeletlen sejtek Cf-GFLGC-SAK felvételében. A különbség oka lehet az aspecifikus

kötődés. Annak tisztázása, hogy ez az eltérés jelenthet-e receptorhoz való kötődést, további

vizsgálatokat igényel (a felvétel időfüggésének vizsgálata, receptorspecifikus ellenanyaggal

való előkezelés, stb.). A 37. ábra a kezeletlen (kontroll) és a különböző koncentrációjú Cf-

GFLGC-SAK peptiddel kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlását mutatja be.

A kontrollhoz viszonyítva az egyes görbék középértékének eltolódása mutatja a peptid

sejtekbe történő felvételének koncentrációfüggését.

― kontroll ― 10-7 M ― 10-6 M ― 10-5 M ― 10-4 M ― 10-3 M

Fluoreszcencia intenzitás

Ese

mén

y / s

ejt

60

10-4 10-3 10-2102

103

Flu

ores

zcen

cia

inte

nzitá

s

c (M)

35. ábra: A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének

meghatározása áramlási citometriával, tripszines kezelés nélkül

10-4 10-3

0,0

5,0x102

1,0x103

1,5x103

2,0x103

2,5x103

3,0x103

3,5x103 tripszin nélkültripszinnel

Flu

ores

zcen

cia

inte

nzitá

s

c (M)

36. ábra: A Cf-GFLGC-SAK peptidszármazék sejtbejutásának koncentrációfüggésének

meghatározása áramlási citometriával, tripszinnel nem kezelt (fekete négyzet) és tripszinnel

kezelt (piros kör) sejtek esetében

61

37. ábra: A különböző koncentrációjú Cf-GFLGC-SAK peptidszármazékkal (tripszin nélkül)

kezelt sejtpopulációk fluoreszcencia intenzitás eloszlása

― kontroll ― 3,75x10-5 M ― 1,13x10-4 M ― 3,38x10-4 M ― 1,01x10-3 M ― 3,04x10-3 M

Fluoreszcencia intenzitás

Ese

mén

y / s

ejt

62

7. ÖSSZEFOGLALÁS

A tuberkulózis (tbc), a Mycobacterium tuberculosis okozta megbetegedés, világszerte az

egyik fő közegészségügyi probléma napjainkban. A tbc kezelése 6-12 hónapot vesz igénybe,

és a jelenleg alkalmazott antituberkulotikumok többségének számos mellékhatása ismert.

Dolgozatomban röviden ismertettem a betegséget okozó baktériumot és áttekintettem az

alkalmazott antituberkulotikumokat. A kezelés során jelentkező káros mellékhatások, és a

nagy dózisok alkalmazásának elkerüléséhez szükség van a hatóanyagok szelektív

célbajuttatására. Dolgozatomban bemutattam a fertőzött makrofágokba való szelektív

célbajuttatás egy lehetséges útját. Ismertettem a témához kapcsolódó szintetikus munkámat:

• Előállítottam szilárdfázisú peptidszintézissel a H-GFLGC-NH2 és a

H-[TKPKG]2C-NH2 (OT10-Cys) peptidamidokat.

• A H-GFLGC-NH2-hez és az OT10-Cys-hez Boc-aminooxiecetsavat kapcsoltam, majd

oximkötés kialakításával az Aoa-GFLGC-NH2-hez a 102-es jelű hatóanyagot, az Aoa-

OT10-Cys-hez a 103-as hatóanyagot konjugáltam.

• A 103-Aoa-OT10-Cys konjugátumban meghatároztam a cisztein oxidációs állapotát

NEM-reagens segítségével.

• Meghatároztam a 103-Aoa-OT10-Cys konjugátum dimerizációs sebességét.

• Előállítottam a ClAc-SAK hordozót a SAK polimer klóracetilezésével.

• Előállítottam a 103-Aoa-OT10-Cys-SAK konjugátumot a 103-Aoa-OT10-Cys és a ClAc-

SAK reakciójával tioéterkötésen keresztül.

• Meghatároztam a 102-es, a 103-as vegyületek minimális gátló koncentráció (MIC)

értékét és telepszámát (CFU). A konjugátumok MIC és CFU értékének meghatározása

folyamatban van.

• A H-GFLGC-NH2-hez fluoreszcens molekulát, az 5(6)-karboxifluoreszceint kapcsoltam.

Az Cf-GFLGC peptidszármazék sejtekbe történő bejutásának koncentrációfüggését

áramlási citométerrel határoztam meg.

• A ClAc-SAK-hoz a Cf-GFLGC fluoreszcensen jelölt peptidet kapcsoltam tioéterkötés

kialakításával. Az előállított Cf-GFLGC-SAK szubsztitúciófokát aminosavanalízis

adatok alapján határoztam meg A Cf-GFLGC-SAK sejtekbe történő bejutásának

koncentrációfüggését áramlási citométerrel történt mérések segítségével határoztam

meg.

• Az előállított konjugátumokat kémiailag jellemeztem aminosavanalízissel, RP-HPLC és

ESI-MS módszerek alkalmazásával.

63

Rövidítésjegyzék

A dolgozatban előforduló rövidítések, jelölések jegyzéke:

AcN acetonitril

AcOH ecetsav

Aoa- aminooxiacetil-

ATCC American Type Culture Collection (Global Bioresource Center)

Boc terc-butiloxikarbonil

BSA bovine serum albumin, marha szérum albumin

Bzl benzil

Cf 5(6)-karboxifluoreszcein

CFU colony forming unit, telepszám

ClAc-OPcp klórecetsav-pentaklórfenilészter

ClZ 2-klórbenziloxikarbonil

CS cikloszerin

DBU 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én

DCM diklórmetán

DIC N,N’-diizopropilkarbodiimid

DIEA N,N-diizopropiletilamin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetilszulfoxid

DTT 1,4-DL-ditiotreitol

DUTPáz dezoxiuridin 5’-trifoszfát nukleotidohidroláz (EC 3.6.1.23)

EAK poli[Lys(Glui-DL-Alam)] (ahol i≅1, m≅2-4,)

ESI-MS electrospray ionisation mass spectrometry, electrospray ionizációs

tömegspektrometria

ETB etambutol

FACS fluorescent-activated cell sorter, áramlási citométer

Fmoc 9-fluorenilmetiloxikarbonil

FSC forward scatter, előre irányuló fényszórás

HCl hidrogén-klorid

HF hidrogén-fluorid

HIV human immunodeficiency virus, humán immundeficiencia vírus

HOBt 1-hidroxibenztriazol

INH izoniazid

KCN kálium-cianid

64

KLH keyhole lympet hemocyanin

LDL low density lipoprotein, kis sűrűségű lipoprotein

Mav átlag molekulatömeg

Mmo monoizotópos molekulatömeg

MBHA 4-metilbenzhidrilamin

MBSA maleilated bovine serum albumin, maleilezett marha szérum albumin

MDR-TB multi-drug resistant tuberculosis, multirezisztens tuberkulózis

4-MeBzl 4-metilbenzil

MIC minimal inhibitory concentration, minimális gátló koncentráció

MWCO molecular weight cut off, molekulatömeg szerinti áteresztőképesség

NaOAc nátrium-acetát

NEM N-etilmaleimid

NMP N-metilpirrolidon

OT10 [TKPKG]2, dituftsin származék

OVA ovalbumin, tojásalbumin

PAS p-aminoszalicilsav

PBS phosphate buffered saline, foszfát puffer

PPD purified protein derivative, tisztított fehérje keverék

PyBOP benztriazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidino-foszfónium-hexafluorofoszfát

PZA pirazinamid

RAMP rifampicin

RP-HPLC revers phase high performance liquid chromatography, fordított fázisú

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute medium, szövettenyésztő oldat

Rt retention time, retenciós idő

SAK poli[Lys(Seri-DL-Alam)] (ahol i≅1, m≅2-4,)

SM sztreptomicin

SSC side scatter, oldalra irányuló fényszórás

tbc tuberkulózis

tBu terc-butil

TFA trifluorecetsav

TIS triizopropilszilán

TRIS 2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol

Trt tritil

XAK poli[Lys(Xi-DL-Alam)] (ahol m≈3,5, i≤1, és X: Glu vagy Ser)

XDR extensively drug resistant tuberculosis, extenzíven rezisztens

tuberkulózis

65

Irodalom

[1] R. Koch: Die Aetiologie der Tuberculose, 1882, Berliner Klinischen Wochenschrift, 19,

221-230.

[2] É. Ádám, F. D. Tóth, L. Emődy, L. Gergely, É. Gönczöl, E. Nagy, T. Pál, R. Pusztai, F.

Rozgonyi, B. Szabó: Orvosi mikrobiológia, 2003, Alliter Kiadói és Oktatásfejlesztői

Alapítvány

[3] Global tuberculosis control – epidemology, strategy, financing, 2009, WHO,

(WHO/HTM/TB/2009.411)

[4] TB/HIV Fact Sheet. WHO, 2008,

http://www.who.int/tb/challenges/hiv/tbhiv_facts08_en.pdf

[5] S. H. E. Kaufmann, S. K. Parida: Changing funding patterns in tuberculosis, 2007, Nature

Medicine, 13, 299-303.

[6] J. Jónás, K. Barsiné Fodor, P. Kiss, M. Péterfiné Tüfgyei, L. Nyári: A pulmonológiai

Intézmények 2004. évi epidemiológiai és működési adatai, 2005, Országos Korányi TBC

és Pulmonológiai Intézet

[7] I. M. Szabó: A bioszféra mikrobiológiája III., 1989, Akadémiai Kiadó, 1971-1972.

[8] S. T. Cole, R. Brosch, J. Parkhill, T. Garnier, C. Churcher, D. Harris, S. V. Gordon, K.

Eiglmeier, S. Gas, C. E. 3rd Barry, F. Tekaia, K. Badcock, D. Basham, D. Brown, T.

Chillingworth, R. Connor, R. Davies, K. Devlin, T. Feltwell, S. Gentles, N. Hamlin, S.

Holroyd, T. Hornsby, K. Jagels, A. Krogh, J. McLean, S. Moule, L. Murphy, K. Oliver, J.

Osborne, M. A. Quail, M. A. Rajandream, J. Rogers, S. Rutter, K. Seeger, J. Skelton, R.

Squares, S. Squares, J. E. Sulston, K. Taylor, S. Whitehead, B. G. Barrell: Deciphering

the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, 1998,

Nature, 393, 537-544.

[9] R. D. Fleischmann, D. Alland, J. A. Eisen, L. Carpenter, O. White, J. Peterson, R. DeBoy,

R. Dodson, M. Gwinn, D. Haft, E. Hickey, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. A. Umayam, M.

Ermolaeva, S. L. Salzberg, A. Delcher, T. Utterback, J. Weidman, H. Khouri, J. Gill, A.

Mikula, W. Bishai, Jr W. R. Jacobs, J. C. Venter, C. M. Fraser: Whole-genome

comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains, 2002, Journal

of Bacteriology, 184, 5479-5490.

[10] J. C. Camus, M. J. Pryor, C. Medigue, S. T. Cole: Re-annotation of the genome

sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, 2002, Microbiology, 148, 2967- 2973.

[11] J. Collazos, J. Mayo, E. Martinez: The chemotherapy of tuberculosis – from the past to

the future, 1995, Respiratory Medicine, 89, 463-469.

[12] Y. L. Janin: Antituberculosis drugs: Ten years of research, 2007, Bioorganic & Medicinal

Chemistry, 15, 2479-2513.

66

[13] S. Egerszegi: A tuberculosis kezelésének aktuális problámái, 1995, Magyar Infektológiai

Társaság tudományos és továbbképző folyóirata, 2, 20-26.

[14] T. R. Frieden, T. R. Sterling, S. S. Munsiff, C. J. Watt, C. Dye: Tuberculosis, 2003,

Lancet 362, 887-899.

[15] I. M. Szabó: A bioszféra mikrobiológiája II., 1989, Akadémiai Kiadó, 927-933.

[16] H. Jatzkewitz: Peptamin (glycyl-L-leucyl-mescaline) bound to blood plasma expander

(polyvinylpyrrolidone) as a new depot form of a biologically active primary amine

(mescaline), 1955, Zeitschrift für Naturforschung, 10b, 27-31.

[17] E.F. Panarin, S.N. Ushakov: Synthesis of polymer salts and amidopenicillines, 1968,

Khim.- Pharm. Zhur., 2, 28-31.

[18] H. Ringsdorf: Structure and properties of pharmacologically active polymers, 1975,

Journal of Polymer Science, Polym. Symp., 51, 135-153.

[19] J. Kopecek, P. Rejmanova, J. Strohalm, K. Urlich, B. Rihova, V. Chytry, J. B. Lloyd, R.

Duncan: Synthetic polymeric drugs, 1991, US Patent 5,037,883

[20] P. Gottlieb, E. Hazum, E. Tzehoval, M. Feldman, S. Segal, M. Fridkin: Receptor-

mediated endocytosis of tuftsin by macrophage cells, 1984, Biochemical and Biophysical

Research Communications, 119, 203-211.

[21] N. J. Bumo, V. A. Najjar, J. Reichler: The characteristics of purified HL60 Tuftsin

receptors, 1990, Molecular and Cellular Biochemistry, 92, 77-84.

[22] P. R. Taylor, L. Martinez-Pomares, M. Stacey, H. H.Lin, G. D. Brown, S. Gordon:

Macrophage receptors and immune recognition, 2005, Annual Review of Immunology,

23, 901–944.

[23] S. M. Moghimia, A. R. Rajabi-Siahboomib: Recent advances in cellular, sub-cellular and

molecular targeting, 2000, Advanced Drug Delivery Reviews, 41, 129–133.

[24] J. L. Goldstein, Y. K. Ho, S. K. Basu, M. S. Brown: Binding site on macrophages that

mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing

massive cholesterol deposition, 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America, 76, 333–337.

[25] M. Krieger, J. Herz: Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors:

macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP), 1994, Annual

Review of Biochemistry, 63, 601–637.

[26] N. Platt, R. Haworth, L. Darley, S. Gordon: The many roles of the class A macrophage

scavenger receptor, 2002, International Review of Cytology, 212, 1–40.

[27] S. Mukhopadhyay, S. Gordon: The role of scavenger receptors in pathogen recognition

and innate immunity, 2004, Immunobiology, 209, 39–49.

[28] K. J. Moore, M. W. Freeman: Scavenger receptors in atherosclerosis: beyond lipid

uptake, 2006, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 26, 1702-1711.

67

[29] R. Szabó, L. Peiser, A. Plüddemann, Sz. Bősze, S. Heinsbroek, S. Gordon, F. Hudecz:

Uptake of branched polypeptides with poly[l-Lys] backbone by bone-marrow culture-

derived murine macrophages: the role of the class A scavenger receptor, 2005,

Bioconjugate Chemistry, 16, 1442-1450.

[30] R. Szabó, G. Mező, É. Pállinger, P. Kovács, L. Köhidai, Sz. Bősze, F. Hudecz: In vitro

cytotoxicity, chemotactic effect, and cellular uptake of branched polypeptides with poly[L-

Lys] backbone by J774 murine macrophage cell line, 2008, Bioconjugate Chemistry, 19,

1078-1086.

[31] V. A. Najjar: Tuftsin, a natural activator of phagocyte cells: an overview, 1983, Annals of

the New York Academy of Sciences, 419, 1–11.

[32] S. Khare, L. K. Bhutani, D. N. Rao: Quantitative assessment of tuftsin receptor

expression and second messenger during in vitro differentiation of peripheral blood

derived monocytes of leprosy patients, 1997, Molecular and Cellular Biochemistry, 171,

1-10.

[33] K. B. Bai, O. Láng, E. Orbán, R. Szabó, L. Köhidai, F. Hudecz, G. Mező: Design,

synthesis, and in vitro activity of novel drug delivery systems containing tuftsin

derivatives and methotrexate, 2008, Bioconjugate Chemistry, 19, 2260-2269.

[34] G. Mező, M. Manea, A. Jakab, B. Kapuvári, Sz. Bősze, G. Schlosser, M. Przybylski, F.

Hudecz: Synthesis and structural characterization of bioactive peptide conjugates using

thioeter linkage approaches, 2004, Journal of Peptide Science, 10, 701-713.

[35] J. Kopecek, P. Kopecková, T. Minko, Z.-R. Lu: HPMA copolymer-anticancer drug

conjugates: design, activity, and mechanism of action, 2000, European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 50, 61-81.

[36] M. Sela: Chemical synthesis for the understanding of immune response phenomena and

for their medical application, 1980, In: C. Larrade, K. Wills, L. Oritz-Oritz, et al. eds.

Molecules, cells and parasites in immunology, New York, Academic Press, 215-228.

[37] M. Algamor, A. Ron, J. Bar-Tana: Chemotaxis in Tetrahymena thermophilia, 1981, Cell

Motility, 1, 261-268.

[38] G. Mező, J. Kajtár, I. Nagy, Zs. Majer, M. Szekerke, F. Hudecz: Carrier design: synthesis

and conformational studies of poly(L-lysine) based branched polypeptides with hydroxyl

groups in the side chains, 1997, Biopolymers, 42, 719-730.

[39] M. Fridkin, V. A. Najjar: Tuftsin: its chemistry, biology, and clinical potential, 1989,

Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 24, 1-40.

[40] C. M. Gupta, W. Haq: Tuftsin-bearing liposomes as antibiotic carriers in treatment of

macrophage infections, 2005, Methods in Enzymology, 391, 291-304.

68

[41] W. Zeng, S. Ghosh, M. Macris, J. Pagnon, D. C. Jackson: Assembly of synthetic peptide

vaccines by chemoselective ligation of epitopes: influence of different chemical linkages

and epitope orientations on biological activity, 2001, Vaccine, 19, 3843-3852.

[42] M. Manea, M. Przybylski, F. Hudecz, G. Mező: Design, structural, and immuno-analytical

properties of antigenic bioconjugates comprising a beta-amyloid-plaque specific epitope,

2008, Biopolymers, 90, 94–104.

[43] J. Shao, J. P. Tam: Unprotected peptides as building blocks for the synthesis of peptide

dendrimers with oxime, hydrazone, and thiazolidine linkages, 1995, Journal of the

American Chemical Society, 117, 3893–3899.

[44] I. P. Decostaire, D. Leliévre, H. Zhang, A. F. Delmas: Controlling the outcome of

overacylation of N-protected aminooxyacetic acid during the synthesis of an aminooxy-

peptide for chemical ligation, 2006, Tetrahedron Letters, 47, 7057–7060.

[45] C. Jiménez-Castells, B. G. de la Torre, R. G. Gallegoa, D. Andreua: Optimized synthesis

of aminooxy-peptides as glycoprobe precursors for surface-based sugar–protein

interaction studies, 2007, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17, 5155–5158.

[46] V. Duléry, O. Renaudet, P. Dumy: Ethoxyethylidene protecting group prevents N-

overacylation in aminooxy peptide synthesis, 2007, Tetrahedron, 63, 11952–11958.

[47] L. E. Canne, A. R. Ferré-D'Amaré, S. K. Burley, S. B. H. Kent: Total Chemical Synthesis

of a Unique Transcription Factor-Related Protein: cMyc –Max, 1995, Journal of the

American Chemical Society, 117, 2998-3007.

[48] K. Rose, W. Zeng, P.O. Regamey, I.V. Chernushevich, K. G. Standing, H. F. Gaertner:

Natural peptides as building blocks for the synthesis of large protein-like molecules with

hydrazone and oxime linkages, 1996, Bioconjutate Chemistry, 7, 552-556.

[49] S. Majumdar, S. K. Basu: Killing of intracellular Mycobacterium tuberculosis by receptor-

mediated drug delivery, 1991, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35, 135-140.

[50] K. Horváti, G. Mező, N. Szabó, F. Hudecz, Sz. Bősze: Peptide conjugates of

therapeutically used antitubercular isoniazid – design, synthesis and antimycobacterial

effect, 2009, Journal of Peptide Science, 15, 385-391.

[51] A. F. Cunningham, C. L. Spreadbury: Mycobacterial stationary phase induced by low

oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alphacrystallin

homolog, 1998, Journal of Bacteriology, 180, 801-808.

[52] K. Hill, C. B. Pénzes, B. G. Vértessy, Z. Szabadka, V. Grolmusz, É. Kiss: Amphiphilic

nature of new antitubercular drug candidates and their interaction with lipid monolayer,

2008, Progress in Colloid and Polymer Science, 135, 87–92.

[53] J. J. Irwin, B. K. Shoichet: ZINC − A free database of commercially available compounds

for virtual screening, 2005, Journal of Chemical Information and Modeling, 45, 177-182.

69

[54] C. M. Sassetti, D. H. Boyd, E. J. Rubin: Genes required for mycobacterial growth defined

by high density mutagenesis, 2003, Molecular Microbiology, 48, 77-84.

[55] G. Barany, N. Kneib-Cordonier, D. G. Mullen: Solid-phase peptide synthesis: a silver

anniversary report, 1987, International Journal of Peptide and Protein Research, 30, 705-

739.

[56] A. G. Grant: Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis, 1992, Synthetic

peptides A User's Guide, Oxford, University Press, 88-96.

[57] L. A. Carpino, G. Y. Han: The fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group, 1972,

Journal of Organic Chemistry, 37, 3404-3409.

[58] R. Newcomb, B. Szoke, A. Palma, G. Wang, X. Chen, W. Hopkins, R. Cong, J. Miller, L.

Urge, K. Tarczy-Hornoch, J. A. Loo, D. J. Dooley, L. Nadasdi, R. W. Tsien, J. Lemos, G.

Miljanich: Selective peptide antagonist of the class E calcium channel from the venom of

the tarantula Hysterocrates gigas, 1998, Biochemistry, 37, 15353-15362.

[59] A. K. Tickler, C. J. Barrow, J. D. Wade: Improved preparation of amyloid-beta peptides

using DBU as N alpha-Fmoc deprotection reagent, 2001, Journal of Peptide Science, 7,

488-494.

[60] J. D. Wade, J. Bedford, R. C. Sheppard, G. W. Tregear: DBU as an N alpha

deprotecting reagent for the fluorenylmethoxycarbonyl group in continuous flow solid-

phase peptide synthesis, 1991, Journal of Peptide Research, 4, 194-199.

[61] W. König, Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der

Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid unter Zusatz von 1-hydroxybenzotriazolen,

1970, Chemische Berichte, 103, 788-798.

[62] S. Mojsov, A. R. Mitchell, R. B. Merrifield: A quantitative evaluation of methods for

coupling asparagine, 1980, The Journal of Organic Chemistry, 45, 555-560.

[63] E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook: Color test for detection of free

terminal amino groups in the solid-phase peptide synthesis of peptides, 1970, Analytical

Biochemistry, 34, 595-598.

[64] E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, D. B. Olser: Color test for terminal prolyl

residues in the solid-phase synthesis of peptides, 1980, Analytica Chimica Acta, 118,

149-151.

[65] K. Horváti, Sz. Bősze, F. Hudecz, H. Medzihradszky-Schweiger: A simple method for

monitoring the cysteine content in synthetic peptides, 2008, Journal of Peptide Science,

14, 838–844.

[66] T. S. Hawely, R. G. Hawely: Methods in molecular biology, Volume: 263 (2005): Flow

Cytometry Protocols, 2nd ed., Humana Press Inc., Totowa, NJ, Chapter 1, 1-33.

70

[67] J. M. Mullins: Overwiev of fluorochromes, From: Methods in Molecular Biology, Vol. 115:

Immunocytochemical Methods and Protocols, Edited by: L. C. Javois © Humana Press

Inc., Totowa, NJ, Chapter 14, 97-105.

[68] G. B. Wisdom: Conjugation of antibodies to fluorescein or rhodamine, From: Methods in

Molecular Biology, vol. 295: Immunochemical Protocols, Third Edition, Edited by: R.

Burns © Humana Press Inc., Totowa, NJ, Chapter 10, 131-134.

[69] S. Kei Lau, F. Zaccardo, M. Little, P. Banks: Nanomolar derivatizations with

5-carboxyfluorescein succinimidyl ester for fluorescence detection in capillary

electrophoresis, 1998, Journal of Chromatography A, 809, 203-210.

[70] Classic reactive fluorescent labeling dyes and their applications, ABD Bioquest, Inc., 923

Thompson Place, Sunnyvale, CA 94085. Tel: 408-733-1055; Technical Support:

http://abdbioquest.com/images/B1200d1

[71] W. Schöniger: Eine mikroanalitische Schnellbestimmung von Halogen in organishen

Substances, 1954, Mikrochlinica Acta, 1, 123-129.

[72] L. Sula: WHO cooperative studies on a simple culture techniques for the isolation of

mycobacteria: 1. Preparation, lyophilization and reconstitution of a simple semisynthetic

concentrated liquid medium; culture technique, growth pattern of different mycobacteria,

1963, Bulletin of the World Health Organization, 29, 589-606.

[73] L. Sula: WHO cooperative studies on a simple culture techniques for the isolation of

mycobacteria: 2. Comparison of the efficacy of lyophilized liquid medium with that of

Lowenstein-Jensen (L-J) medium, 1963, Bulletin of the World Health Organization, 29,

607-625.

[74] B. Lányi: Folyékony mycobacterium tenyésztésre alkalmas standard táptalaj,

Módszertani Útmutató, 1980, Budapest, Járványügyi és Klinikai Bakteriológia

[75] J. McFarland: Nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in

suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines, 1907, Journal of

the American Medical Association, 14, 1176-1178.

[76] E. Löwenstein: Die Zachtung der Tuberkelbazillen aus dem stramenden Blute. Zentralb.,

1931, Bakteriol Parasitenkd. infektionskr. hyg. Abt. I orig., 120, 127.

[77] K. A. Jensen: Rinzuchtung und Typenbestimmung von Tuberkelbazillentamen. Zentralb.,

1932, Bakteriol Parasitenkd. infektionskr. hyg. Agt. I Orig., 125, 222.

71

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondok Dr. Perczel András tanszékvezető egyetemi tanárnak, aki lehetővé

tette, hogy az ELTE Szerves Kémiai Tanszéken dolgozhassak.

Köszönöm Dr. Hudecz Ferencnek, az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

vezetőjének, hogy lehetővé tette, hogy a kutatócsoportban folyó munkába bekapcsolódjak.

Köszönöm Dr. Horváti Kata tudományos munkatársnak és Dr. Bősze Szilvia tudományos

főmunkatársnak, témavezetőimnek, hogy segítségemre voltak a téma kidolgozásában és a

dolgozat elkészítésében.