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蛍光免疫染色の基礎蛍光免疫染色の基礎蛍光免疫染色の基礎蛍光免疫染色の基礎

ライフテクノロジーズジャパン株式会社

テクニカルサポート

小林 英夫

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蛍光免疫染色の概要

• タンパク質の発現の確認

• タンパク質の局在性の確認

• 上記を細胞や組織の形態と

照らし合わせて観察

• 酵素抗体法（発色）と比較して

• 両方とも高感度

• 多重染色が容易

• 長期保存は不向き

固定

膜の浸透処理

ブロッキング

１次抗体を加える

２次抗体を加える

封入する

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6穴プレートや3.5cmディッシュの底にカバーグラスを沈め、

その上で培養する。

スライドや大型のカバーガラス上にチャンバーがついて

おり、そのまま細胞培養できるようになっている。 培養

後、上部のチャンバーやシリコンパッキンを剥がして、染

色・観察する。

例） Nunc Lab-Tek Chamber Slide

プレート内にスライドグラスやカバーグラスが敷き詰めら

れており、そこでまとめて培養する。

例） CultureWell Cell Culture System

染色などの作業はカバーグラス上で行い

、顕微鏡観察前にひっくり返してスライド

グラスに載せる。

サンプルの準備 – 細胞の培養

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固定

膜の浸透処理

ブロッキング

１次抗体を加える

２次抗体を加える

封入する

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固定 (fixation)

• 細胞内の構造物やタンパク質を不動化し、生体に近い状態を保持させる。

4%パラホルムアルデヒド(PFA) in PBS

室温、15分インキュベーション

PBS-glycine で3回洗浄

各種固定剤

• パラホルムアルデヒド： アミノ基を架橋することによる固定

• グルタールアルデヒド： アミノ基を架橋。 パラホルムアルデヒドより強固だが、自家蛍光

が上がったり、抗体の反応性が変わったりすることがある。

• アセトン、アルコール： 脱水・脱脂による固定 --- 分子量の大きい物質に有効

• ホルマリン： ホルマリン = 約37％ ホルムアルデヒド + 10% メタノール

(10% ホルマリン溶液⇒約3.7% ホルムアルデヒド + 1% メタノール)

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膜の透過処理 (permeabilization)

• 抗体等が細胞内へ浸透できるように細胞膜の透過性を亢進させる。 浸透処

理ともいう。

0.1% Triton-X 100 in PBS (推奨：0.05-0.5%)

室温、5分インキュベーション

各種透過剤：

• Triton-X 100: 一般的に使用されている

• サポニンやジギトニン： Triton X よりマイルド

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はじめてのお客様向けの製品

• Image-iT Fixation/Permeabilization Kit (R37602)

- 4% formaldehyde in PBS, pH=7.3 (20mL)

- 0.5% Triton X-100 (20mL)

- 3% BSA (10×10mL)

- PBS, pH 7.4 (500mL)

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ブロッキング (blocking)

• 抗体の非特異的反応を防ぐ

• 5～10% 血清 (2次抗体の血清、Normal Goat Serum など)

• 1～3% BSA

• カゼイン

• BlockAid Blocking Solution

• Image-iT FX Signal Enhancer （標的は 荷電領域）

• 通常のブロッキング剤の代わりに用いる。

• 通常のブロッキング剤と組み合わせる。

ブロッキングなし

血清を添加

Image-iT FX

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Image-iT FX Signal Enhancer ブロッキング剤

Mouse brain cryosections

Image-iT FX 処理 Image-iT FX 未処理

Mouse anti-Hu C/D + HRP-Goat anti-mouse IgG + Alexa 488 - TSA kit

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固定

膜の浸透処理

ブロッキング

１次抗体を加える

２次抗体を加える

封入する

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一次抗体を加える

• 一次抗体を添加する。

• ブロッキング剤を少量添加したPBSで希釈し、サンプルに添加する。

例： PBS with 1% Normal Goat Serum

• 室温で1時間インキュベーション、 4℃で overnight など。

• 多重染色を行う場合には、各抗体の宿主を変える。

• ネガティブコントロール （一次抗体 添加しない）、ポジティブコントロール (必ず染まる抗体・サンプル）も用意する。

• はじめて使用する抗体は、予備実験として、濃度条件を検討しておく。

• 例： 1:100、1:200、1:500、、、 と濃度をふって染色し、ベストの条件を決めておく。

• ロットが変わった場合も、予備実験を行った方がよい。

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一次抗体の選択

• 論文などで実績がある抗体を確認する。

• モノクローナル抗体： クローン名

• ポリクローナル抗体： メーカー名、カタログ番号

• 抗体取扱メーカー各社で、該当する抗体があるかどうか探す。

• ターゲットのタンパク質

• アプリケーション（ICC, IF, IHC など)

• 交差性

• 使用時の濃度

• 宿主の生物種 (mouse, rat, rabbit, goat など)

• 実際… ポータルサイトで検索し、アタリをつけてから探す。

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Life Technologies の抗体検索サイト

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固定

膜の浸透処理

ブロッキング

１次抗体を加える

２次抗体を加える

封入する

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二次抗体を加える

• 二次抗体

• 一次抗体1分子に対して、複数の二次抗体が結合する。

• 蛍光標識した一次抗体を使用するよりも、

高感度で検出できる。

• 二次抗体を添加する。

• ブロッキング剤を少量添加したPBSで希釈し、サンプルに添加する。

例： PBS with 1% Normal Goat Serum

• 室温で30分～1 時間インキュベーション

• 一次抗体の宿主に合わせて 二次抗体を選ぶ。

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多重染色を行う場合の抗体の選択（失敗例）

抗-XX 抗体 (mouse IgG)

抗-YY 抗体 (mouse IgG)

Alexa 488 抗抗抗抗-mouse IgG 二次抗体

Alexa 568 抗抗抗抗-mouse IgG 二次抗体

もし同じ生物種を用いたらもし同じ生物種を用いたらもし同じ生物種を用いたらもし同じ生物種を用いたら… 全部同じ色に染まってしまう。全部同じ色に染まってしまう。全部同じ色に染まってしまう。全部同じ色に染まってしまう。

抗-XX 抗体 (mouse IgG)

抗-YY 抗体 (rat IgG)

Alexa 488 抗抗抗抗-mouse IgG 二次抗体

Alexa 568 抗抗抗抗-rat IgG 二次抗体

生物種が違っていても交差してしまうことがある。生物種が違っていても交差してしまうことがある。生物種が違っていても交差してしまうことがある。生物種が違っていても交差してしまうことがある。

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二次抗体の製造過程（アフィニティ精製と交差吸着）

アフィニティ精製

Mouse IgG Rat IgG

anti-mouse 抗体を含む血清

交差吸着 (交差吸収)(rat IgG に結合しなかったもの）

anti-mouse 抗体 (mouse IgGカラムに結合したもの）

二次抗体二次抗体二次抗体二次抗体

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二次抗体 – highly cross adsorbed

Cat. No. 抗体抗体抗体抗体 宿主宿主宿主宿主 吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作）吸着操作（吸収操作） 蛍光標識蛍光標識蛍光標識蛍光標識

A11001 Anti-mouse IgG Goat Human IgG and serum Alexa 488

A11029 Anti-mouse IgG*highly cross adsorbed*

Goat Bovine, goat, rabbit, ratand human IgG andhuman serum

Alexa 488

A11059 Anti-mouse IgG Donkey Bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, rat , and sheep serum

Alexa 488

A11059 Anti-mouse IgG Rabbit Human serum Alexa 488

A11059 Anti-mouse IgG Chicken Human serum and Rabbit serum

Alexa 488

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蛍光色素とスペクトル

http://www.lifetechnologies.com/spectraviewer

Alexa Fluor 594 励起スペクトル

蛍光スペクトル

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蛍光シグナルの漏れ込み (Crosstalk)

http://www.lifetechnologies.com/spectraviewer

ローダミン

フィルター

Cy5フィルター

Alexa Fluor 594 の蛍光シグナル

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蛍光色素の選択

• 定番の組合せ（１）

• 青色： DAPI

• 緑色： Alexa Fluor 488 （FITC チャンネル）

• 赤色： Alexa Fluor 594 （XRITC/Texas Red チャンネル）

• 定番の組合せ（２）

• 青色： DAPI

• 緑色： Alexa Fluor 488 （FITC チャンネル）

• 橙色： Alexa Fluor 555 （TRITC/ローダミン チャンネル）

• 赤外： Alexa Fluor 647 （Cy5 チャンネル）

• 実際のサンプルや蛍光顕微鏡によって色素の組合せは異なる場合がある。

• コントロールサンプルを用いて漏れ込みの有無を確認することが重要。

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固定

膜の浸透処理

ブロッキング

１次抗体を加える

２次抗体を加える

封入する

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封入 (mounting)

核染色も含め、染色処理の終わったカバーグラスをスライドグラスに載せる。

（あるいは処理の終わったスライドグラスにカバーグラスを載せる）

• スライドグラスに 封入剤を垂らす。

• マウント液： PBS、グリセロール、ポリ

ビニルアルコール (PVA)

• 褪色防止効果のある封入剤

• 核染色試薬 DAPIを含む場合もあり。

• カバーグラスを被せる。

• 泡が入らないように。

• カバーグラスが動かないよう、４隅だけ、

あるいは４辺全てをマニキュア等で固定

する。

*DAPI： 核の対比染色用試薬

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褪色防止効果をもった封入剤

弊社ではProLong シリーズ、SlowFade シリーズを用意しております

ProLong ®褪色防止用封入剤の光褪色防止効果褪色防止用封入剤の光褪色防止効果褪色防止用封入剤の光褪色防止効果褪色防止用封入剤の光褪色防止効果

固定したHeLa 細胞を fluorescein 標識ファロイジンで染色し、ProLong® Diamond 試薬、

ProLong® Gold 試薬、または50% PBS/グリセロール中にマウントした。画像の取得は、12秒間隔

で、20倍の対物レンズを使用して、一般的な100ワット水銀アーク灯からの連続照射を 用いて行っ

た。

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褪色しにくい蛍光色素 – Alexa Fluor シリーズ

Fluorescein Alexa Fluor 488

�明るい（高感度）。

�褪色しにくい。

Alexa Fluor の特徴の特徴の特徴の特徴

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褪色しにくい蛍光色素 – Alexa Fluor シリーズ

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顕微鏡観察・画像取得

画像を重ね合わせる。

疑似色をつける。

操作がとても簡単な

EVOS FL 蛍光顕微鏡

各チャンネルでモノクロで撮影

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まとめ

まとめ

• 細胞の蛍光免疫染色の基本的な流れをご説明いたしました。

検討課題

• 抗体の性能、各試薬の濃度、インキュベーション時間・・・

• パラホルムアルデヒドの劣化

• ブロッキング剤の検討

• 励起光による褪色

実習(ハンズオントレーニング)も行っております。 お気軽にご参

加ください。

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本セミナー終了後、ご不明な点などがございましたら、

テクニカルサポートまでご連絡ください。

電話 0120-477-392

E-mail jptech＠lifetech.com

Web http://www.lifetechnologies.com/

ご清聴ありがとうございましたご清聴ありがとうございました

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