기체크로마토그래피 - 질량분석기를

이용한 담즙산 분석 및 이를 이용한

임상에서의 활용

연세대학교 대학원

임상병리학과

장 진 연

기체크로마토그래피 - 질량분석기를

이용한 담즙산 분석 및 이를 이용한

임상에서의 활용

지도 김 종 배 교수

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

200 1년 12월 일

연세대학교 대학원

임상병리학과

장 진 연

장진연의 석사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

연세대학교 대학원

200 1년 12월

감사의 글

가장 먼저 하나님께 감사와 찬양을 올려드립니다.

저의 작은 소망을 들어주셔서 뒤늦게 학업의 길을 시작할 수 있게 모든 여건과

환경을 만들어주시고 능력없는 저에게 능력있는 친구들을 때에 맞게 붙여주시어

매 과정마다 겸손한 마음으로 마무리할 수 있게 해주심을 감사 드립니다.

저에게 배움의 길을 인도해주시고 이 논문이 완성될 수 있도록 아낌없는 가르침

과 끝없는 조언을 해주신 김종배 교수님께 진심으로 감사 드립니다. 그리고 임상

실험을 할 수 있도록 기회를 주시고 조언을 해주신 원주기독병원의 이동기 교수

님과 김현수 교수님께 감사를 드립니다. 학부 과정부터 가르침을 주신 양용석 교

수님, 오옥두 교수님, 김태우 교수님과 또 다른 세계를 보여주신 박용석 교수님께

도 감사를 드립니다.

그리고 무엇보다도 따뜻한 배려와 격려를 해주시고 기회를 주신 지현숙 과장님,

조병철 팀장님, 민원기 선생님, 전사일 선생님과 한태진 선생님께 감사를 드리며,

함께한 특수화학 선배들과 친구들인 김정은, 구금경, 한재일, 양회주, 남병무, 조수

옥, 조은주, 신은숙, 신연수, 이상희에게도 고마움과 사랑을 전합니다.

지난 5학기를 뒤돌아보며, 저에게 시작할 수 있도록 용기를 주었던 장은이와 주연

이, 1학기를 같이 시작한 재균 오빠, 은영, 현정이와 힘들 때마다 위로와 격려와

큰 도움을 주었던 근식이, 같이 있는 것만으로도 반가운 동기 혜영, 수현, 태현이,

든든했던 최현일 선생님, 심문정 선생님, 조윤경 선생님, 임지애 선생님, 장재호

선생님과 대학원에서 새롭게 만났던 후배들 - 나경, 성구, 주연, 홍성, 인식, 수용,

수인, 태섭, 승주, 호중, 재호, 현석, 준표, 대종 그리고 일일이 챙겨주고 즐거운 대

학원생활을 할 수 있도록 도와준 우리방 친구들 - 근희, 홍, 현석, 영삼 오빠, 상

욱, 용빈과 종철이에게 따뜻한 마음을 전합니다.

항상 꿈과 희망을 주시고 감사함을 가르쳐주시고 부족한 저를 끝까지 믿어주시는

가장 큰 후원자이신 아빠와 엄마에게 사랑을 전합니다.

가슴 뿌듯한 동생 진희와 기대되는 진우 !

그리고 안스러운 마음으로 지켜봐 주시고 사랑해주신 아버지와 어머니, 시동생, 동

서에게도 사랑을 전합니다.

대학원 생활중 가장 힘들 때 만나서 힘과 용기가 되어주고 배려와 격려와 사랑을

해준 평생 친구인 욱진씨에게 사랑을 전합니다.

한 얼굴, 한 얼굴을 떠올리며 다시 한번 감사와 사랑을 전하며 겸손한 마음으로

나눌 수 있는 사람이 되도록 노력하겠습니다.

2001년 12월 장 진 연

목차

표 및 그림 목차

약기호표

국문요약

I . 서 론

II . 재 료 및 방 법

1. 대상 및 검체

1- 1. 위액에서의 담즙산 분석

1- 2. 혈청에서의 담즙산 분석

2. 방법

2- 1. 위액에서의 담즙산 추출

2- 2. 혈청에서의 담즙산 추출

2- 3. 담즙산의 유도화 과정

2- 4. GC- M S (기체 크로마토그래피- 질량분석기)에 의한 분석

2- 5. 자료분석 및 담즙산 정량

III . 결 과

1. GC- M S를 이용한 담즙산 분석

1- 1. 표준담즙산의 chrom at ogram

1- 2. 표준 검량선의 평가

1- 3. 검체에 따른 담즙산 추출법

2. 위 절제술 전·후의 위액에서의 담즙산 변화

3. 담석증 환자에서 소장 통과 시간 평가

IV . 고 찰

V . 결론

V I. 참고문 헌

영문 요약

- i -

표 목차

T able 1. Ch aract er ist ics of control and pat ient s w ith ch olest erol gallstones

...................................................................................................................................................6

T able 2. GC- M S condit ion for an aly sis of bile acids .............................................7

T able 3. Bile acids ident ified by GC- M S ..................................................................10

T able 4. Sm all int est inal tr an sit t im e in control and pat ient s w ith g allst on es

.................................................................................................................................................18

- ii -

그림 목차

F ig . 1. Ch em ical st ructure of bile acids .......................................................................4

F ig . 2. P ot ential m ech anism s of ch olest erol gallstone form at ion ........................5

F ig . 3. Chrom at ogram of bile acids m ethyl est er - T M S ether s ........................11

A . T otal ion s chrom at ogram of bile acids

B. S elect ed ion s chrom atogram of bile acids

F ig . 4A . M ass spectrum of ch olic acid deriv at iv ed ................................................12

B . M ass spectrum searched w ith W iley library of ch olic acid

deriv ativ ed .

F ig . 5. Calibration curv es of select ed ion of bile acids ........................................13

F ig . 6. Chrom at ogram of bile acids in g astr ic ju ice ..............................................14

F ig . 7. Chrom at ogram of bile acids in serum ..........................................................15

F ig . 8. Proportion s of increased BA s in ga stric ju ice of g astr ect om ized

patient s ....................................................................................................................16

F ig . 9. V ariat ion s of con centr at ion s of each bile acids in gastr ic ju ice

before (filled m ark s ) and after (open m ark s ) g astr ect om y ......................17

- iii -

약 기호 표

GC- M S : Gas chrom atography m ass spectrom et er

RT : retent ion t im e

BA : bile acid

NDCA : N ordeox y ch olic acid

LCA : Lithocholic acid

DCA : Deox y cholic acid

CDCA : Chen odeoxy ch olic acid

CA : Cholic acid

UDCA : Urthodeox y cholic acid

GS : gallst on e

- iv -

국문 요약

기체크로마토그래피- 질량분석기 (g as chrom at ography - m a ss spectrom eter , GC-

M S )는 GC와 M S가 결합된 분석장비로 GC에서의 체류시간과 M S에서의 m ass

spectrum을 통해 거의 모든 혼합물의 성분분석이 가능해짐에 따라 분석화학 분야

뿐만 아니라 미량의 정성 및 정량 분석이 요구되는 임상에서 활용도가 증가하고

있는 추세이다. 본 논문에서는 GC- M S를 이용하여 위액과 혈청내의 담즙산을 분

석하여 소화기 질환중의 일종인 역류성 위염과 콜레스테롤 담석증의 병인을 연구

하는데 활용함으로써 임상에서의 유용성을 보여주고자 하였다. 먼저 이러한 소화

기 질환은 담즙산이 관련된 질환으로 GC- M S로 n ordeox y ch olic acid (NDCA ),

lithocholic acid (LCA ), deox y cholic acid (DCA ), ch enodeox y cholic acid (CDCA ),

cholic acid (CA ), urth odeox y ch olic acid (UDCA )를 정량하였다. GC- M S는 GCM S

QP - 5000을 사용하였으며 분석컬럼은 DB - 1을 사용하였다. 분석에 앞서 검체를

cholylgly cine hy drola se로 처리하여 결합형 담즙산을 가수분해한 후 위액의 담즙

산은 ethyl acet at e를 사용하여 추출하였고, 혈청의 담즙산은 S ep - P ack cart r idge

를 사용하여 추출하였다. 추출한 담즙산은 5% anhy drou s m eth anolic hy drochloric

acid로 est er ification한 후 sily lat ion하여 유도화하였다. 표준 담즙산의 m ass

spcetrum상의 선택이온과 참고이온을 선택하여 5농도의 표준 담즙산으로 검량선

을 작성하여 검체중의 담즙산을 정량하였다. 5종의 담즙산 검량선의 직선성은 우

수하였다 (R2 > 0.990).

위 절제술 전·후의 위액내의 담즙산 성분을 분석을 하기 위해 위 절제수술

을 시행받은 환자 18명을 대상으로 수술 전·후의 위액을 채취하였다. 콜레스테롤

담석증 환자의 소장 통과 시간 측정은 담낭염 및 증상을 동원한 담낭 담석증을

갖거나, 2.5 cm 이상의 무증상의 담낭 담석증 45명의 환자군과 담낭 용종중 1 cm

이상으로 예방적 담낭 절제술을 시행받은 7명의 대조군을 대상으로 실시하였으며

UDCA를 경구 복용 후 일정 시간 간격으로 채취된 말초혈액내의 UDCA가 최고

치를 보이는 시간을 소장 통과 시간으로 정의하였다.

- v -

위 절제술 후에 위액내의 담즙산 농도 변화는 CA는 증가율 83.33% (

p =0.0467), CDCA는 77.78% (p =0.0353), DCA는 77.78% (p =0.0846), LCA는 27.78%

(p =0.2977)의 증가된 결과를 보였다.

환자 및 대조군의 소장 통과 시간을 측정한 결과 52명중 혼합 콜레스테롤 담

석증은 14명이었으며 이중 10명이 240분 이상의 소장 통과 시간을 보였다.

결론적으로 GC- M S의 임상에서의 활용이 담즙산 분석뿐만 아니라 기타 미량

의 정성 및 정량 분석에 적용 가능할 것으로 기대되고 GC- M S의 활용도와 유용

성이 증가할 것으로 사료된다.

핵심되는말 : 기체크로마토그래피- 질량분석기, 담즙산, 역류성 위염, 콜레스테

롤 담석증

- v i -

I. 서론

담즙산은 st eroid 구조에 carb ox yl기와 hy drox yl기를 갖고 있으며 콜레스테롤

로부터 간에서 만들어진다(F ig . 1). 주요 1차 담즙산인 CA와 CDCA는 간에서 만

들어지며 gly cine이나 t aurine 등과 같은 아미노산과 결합한다. 1차 담즙산이 소장

과 대장을 지나면서 장내혐기성세균이 만들어내는 7α- dehy droxylase에 의해 2차

담즙산인 DCA와 LCA로 전환된다(11). 담즙산은 계면활성제로 m icelle의 친수성

부분에 cholesterol과 phosph olipid을 용해하여 흡수를 용이토록 하여 lecith in ,

gly cerides , cholest erol 및 담낭 내 물질들을 다른 장기로 운반하기 쉽게 한다.

간에서 만들어진 담즙산은 담낭에서 농축이 되고 축적되었다가 음식물 섭취후

cholecytokinin의 자극에 의해 담즙산과 같이 형성된 m icelle을 소장으로 분비하게

된다. 장관 내강에서 분비된 m icelle은 음식물의 cholesterol, fr ee fat ty acids 등을

용해하여 흡수하고 운반한다. 이러한 기능을 수행하기 위해 담즙산은 일정 최소

농도로 유지되며 회장 말단부에서 능동적 수송과 공장 및 대장에서 비이온성 확

산에 의해 재흡수가 이루어진다. 비정상적 콜레스테롤 및 담즙산 대사과정은 여러

소화기 질환을 유발할 수 있으며 그 중의 한 예가 역류성 위염과 콜레스테롤 담

석증이다.

담즙 역류성 위염은 위 절제수술 후 담즙 등의 장관내용물의 역류로 발생한

다. 위 절제수술 후 담즙 역류는 식이에 따라 위내로 불규칙하게 다양한 농도로

역류되며 담즙이나 췌장액에 포함된 화학물질이 위점막을 자극하여 다양한 증상

을 유발하고 반응성 위염을 야기한다. 위 점막이 담즙산을 포함한 담즙에 노출되

면 염증성 발적, 부종 및 출혈과 융모성 선와의 증식, 선조직의 낭종화 등 장상피

화생의 조직학적 변화를 유발하고 이는 위내 담즙산의 농도와 상관성을 보인다.

담즙염이나 담즙산이 위 점막을 손상시키는 기전으로는 위 상피세포막의 지질 성

분을 용해시키는 세정효과로 인하여 H +의 역확산을 유도하고 위 점막의 투과도를

증가시켜 위 점막 방어벽을 파괴하는 것으로 알려져있다(12,14,18). 위 점막의 손상

정도는 담즙산의 성분과 농도에 따라 다르며 소수성 담즙산이 주로 점막에 독성

을 나타낸다(21,27).

- 1 -

담즙 역류성 위염의 진단은 주로 위 내시경검사를 이용한 관찰과 조직학적

검사가 기본적 검사법이다. 또한 실제 위내의 담즙산의 농도를 측정하는 것이 염

증의 정도나 조직학적 변화와 관련되어 유용한 검사법이나 위내로 튜브나 카테터

를 넣어야 하는 번거로움과 담즙산 농도 측정의 방법상의 문제 등으로 인하여 국

내에서는 신뢰도나 반복성을 가진 담즙산 성분이나 농도의 측정에 어려움이 있다.

담즙산이 관련된 또 다른 소화기 질환으로 콜레스테롤 담석증이 있다. 담석은

담석 자체의 성상이나 담석이 발견되는 위치에 따라 몇 가지 형태로 분류하는데

대개 화학적 구성 성분과 성상에 따라 주로 콜레스테롤 담석과 색소성 담석으로

분류하고, 색소성 담석은 흑색 색소성 담석과 갈색 색소성 담석으로 분류한다(3).

서구에서는 담석 환자의 75% 정도가 화학적 조성이 중량비로 50% 이상의 콜레스

테롤이 함유된 담석이며, 이런 콜레스테롤 담석의 대부분은 중량비로 80% 이상의

콜레스테롤을 함유한다. 최근 우리나라의 경제, 사회적 수준이 향상되고 생활 양상

이 서구화되면서 담석증의 역학, 발생 양상도 점차 변화되어 가고 있다. 실제로 우

리나라의 담낭 담석증의 경우 과거에는 색소성 담석이 호발하였던 것에 비해 80

년대 이후로는 콜레스테롤 담석의 보고가 늘고 있다(1,2).

콜레스테롤 담석 형성에는 3가지 주된 결함, 즉 콜레스테롤 과포화, 핵화 촉진

및 담낭 저운동이 연관되어 있는 것으로 받아들여지고 있다(17,23,25). 콜레스테롤

담석 형성을 위해서는 간에서 콜레스테롤로 과포화된 담즙의 분비가 필요한데 이

때 과포화란 담즙내 담즙산에 비해 콜레스테롤이 절대적 또는 상대적으로 많은

것을 말한다. 이런 콜레스테롤로 과포화된 담즙이 결정이나 무정형입자의 응결 또

는 응집과정 (핵화)을 거치며, 이런 결정화는 점액 당단백과 같은 촉진 인자에 의

해 증가할 수도 있고 Apo A 1등과 같은 억제 인자에 의해 억제될 수도 있다. 과포

화 콜레스테롤 담즙으로 인해 담낭의 운동성이 저하되며 콜레스테롤 담석증 환자

의 대부분에서 담낭의 운동성이 저하되어 있는 것으로 보고되고 있다(25).

이러한 3가지 병인과 더불어 최근 콜레스테롤 담석 형성에 있어서 소장의 역

할이 연구되고 있다. 간, 담낭과 함께 소장도 또 다른 병인을 제공할 수 있는 것으

로 제시되고 있는데 실제로 콜레스테롤 담석증 환자 일부에서 소장의 운동성이

저하되어 소장 및 대장 통과 시간이 지연되어 있다는 보고가 있다(15,19,30). 과포

- 2 -

화 콜레스테롤 담즙이 소장의 수축과 이완에 장애를 초래하여 소장 통과 시간이

지연되며 이러한 결과로 담낭 수축저하에 따른 더 많은 1차 담즙산의 소장내 체

류 시간이 늘어나고 소장 운동성 저하로 상행한 혐기성세균에 의해 1차 담즙산은

2차 담즙산화되어 담즙은 더욱 담석화 경향을 띄게 된다. 2차 담즙산중 DCA는

hepat ocyt ic can alicular m em bran e에 영향을 주어 담낭 콜레스테롤의 분비를 증가

시키며, 더 나아가서 DCA는 콜레스테롤 소포를 불안정화하여 담낭 콜레스테롤 결

정화를 촉진하게 된다. 이러한 일련의 작용에 의해서 콜레스테롤 담석이 형성되게

된다(F ig . 2). 최근에 콜레스테롤 담석증 환자 뿐만 아니라 동물모델을 통해서도

담낭의 DCA의 양과 ch olest erole saturation in dex , 콜레스테롤 결정화 속도 사이

에 유의한 상관성을 보임을 확인하는 연구 등이 보고되고 있다(35).

담즙산 분석방법에는 분광법, 고성능액체크로마토그래피 (h igh perform ance

liquid chrom at ography ), 박층크로마토그래피 (th in lay er chrom at ography ), 기체크

로마토그래피 (g as chrom at ography ), 기체크로마토그래피- 질량분석기 (g as

chrom ato- graphy m a ss spectrom etry ) 등이 사용되왔다(28). 이중 GC- M S는 혼

합물을 컬럼 내에서 비활성 기체 이동상의 흐름에 따라 분리시키고 질량분석기에

서 이온화하여 다시 질량 대 전하비(m/ z)에 의해 분리시켜 스펙트럼을 얻는 분석

장비로 GC의 현저한 분리능과 M S의 물질의 원자와 분자의 조성에 관한 정성적

이고 정량적 정보와 각종 복잡한 분자 구조에 대한 정보 등을 얻을 수 있는 m as s

spectrum의 장점을 가지고 있어 미량의 정성 및 정량 분석에 민감도와 특이도가

우수하다.

본 논문에서는 GC- M S를 이용한 담즙산 분석을 통해 위 절제술 전ㆍ후 위액

에서 담즙산 성분의 농도 변화와 담석증 환자군의 담즙산의 소장 통과 시간을 측

정하여 한국인의 혼합 콜레스테롤 담석증 환자의 소장 운동성 저하를 확인함으로

써 소화기 질환에서 GC- M S의 활용도와 유용성을 보여주고자 하였다.

- 3 -

F ig . 1. Ch em ical st ructure of bile acids .

- 4 -

↓ F requ ency of int est inal migrat ing m otor com plex

↑ Int est in al t r an sit t im e

↑ Deoxy ch olic acid pool size

↑ Biliary cholesterol secretion

↑ Bile con centr at ion

Dest abilisat ion of biliary v esicles

Gallbladder hypom otility

Ch olest erol cry st alisat ion

Gallstone form at ion

F ig . 2. P ot ential m ech anism s of ch olest erol gallstone form at ion .

- 5 -

II . 재료 및 방법

1 . 대상 및 검체

1- 1. 위액에서 담즙산 분석

1999년 5월 3일부터 12월 20일까지 연세대학교 원주의대 원주기독병원 소화기

내과에서 위 절제술을 시행받은 환자 18명을 대상으로 위 절제술 전·후 경비 튜

브를 통해 위액을 채취하였다.

1- 2. 혈청에서 담즙산 분석

연세대학교 원주의대 원주기독병원 소화기 내과 재원 및 내원한 환자 52명을

대상으로 실시하였으며 남녀 비는 대조군이 3:4, 환자군이 18:27이었고, 평균 나이

는 대조군이 41.9세, 환자군이 48.5세이었다 (T able 1). 복부 초음파와 역행성 담도

내시경을 통하여 담낭염 및 증상을 동원한 담낭 담석증을 갖거나, 2.5 cm 이상의

무증상의 담낭 담석증 45명의 환자군과 담낭 용종중 1 cm 이상으로 수술의 적응

증이 되거나 선근종(adenom y om at osis ) 등의 경우 예방적 담낭 절제술을 시행받은

7명의 대조군을 대상으로 혈청내의 UDCA을 측정하였다.

모든 대상은 8시간 이상의 금식 후 UDCA (대웅제약, 250 m g ) 2T 를 경구 복

용 1시간 후부터 매 30분 간격으로 약물 복용 6시간 후 까지 말초혈액을 채취하

여 응고시킨 다음 원심 분리하여 혈청을 채취하였으며 UDCA가 가장 높게 나오

는 시간을 소장 통과 시간으로 정의하였다. 담석은 laparoscopic cholecy st ic

cholecy st ect om y 및 open cholecy st ect om y후 담낭내의 담석을 채취하였다.

T able 1. Character ist ics of control an d patient s w ith cholesterol g allst on es

Control (n =7) P at ient s (n =45)M ale : F em ale 3 : 4 18 : 27A g e (y ear s )M ean 41.9 48.5Ran ge 23- 58 18- 75

- 6 -

2 . 방법

2- 1. 위액에서 담즙산 추출

내부표준 물질인 nordeox y cholic acid〔NDCA (Steraloids , New port , RI,

U .S .A .)〕 10 ㎍을 미리 sam ple tube에 분주하여 N 2 gas로 증발시켜 준비한 후

각 sam ple 위액 100 ㎕를 분주하고 1.86% Na 2EDT A 1 m l, 40 m M sodium

acet at e (pH 5.6) 2 m l, 0.87% 2- m ercaptoethan ol 1 ml를 넣었다. Conjug at ed

gly cine이나 taurin e을 가수분해하기 위해서 cholylgly cin e hy drolase (Sigm a

Chem ical Co., St . Rouis , M O, U .S .A .)를 1.5 unit 넣은 후 37℃에서 18시간

in cubat ion하였다. 가수분해 효소인 choly gly cin e hy drolase는 40 mM sodium

acet at e에 녹여 사용하였다.

In cubat ion이 끝난 후 hex an e 5 m l을 넣고 1분 정도 심하게 진탕한 후 원심

분리하여 neutral steroids가 녹아있는 hex an e층을 제거하였다. 담즙산은 pH 1 이

하에서 회수율이 높기 때문에 남아있는 acqueou s 층에 100 ㎕ 6 N HCl를 넣어주

어 pH를 1이하로 조정하였다. 여기에 ethyl acet at e 2 m l를 넣고 1분 정도 심하

게 진탕한 후 원심 분리하여 담즙산이 녹아 있는 ethyl acetate층을 1 ml 취하여

N 2 g as로 증발시켰다. 증발시킨 후 남은 잔유물에 5% anhy drou s m eth anolic

hy drochloric acid (삼전화학, Korea ) 1 m l를 넣고 85∼90℃에서 1시간 동안 끓여

가온 처리 후 v acum n dry er로 증발시켰다. Ethyl acet at e, hex an e, m eth anol,

acet one등 유기용매는 순도가 높은 HPLC용을 사용하였다.

2- 2. 혈청에서 담즙산 추출

내부표준 물질 NDCA 10 ㎍을 미리 sam ple tube에 분주하여 N 2 ga s로 증발

시킨 후 각 sample 혈청 1 m l를 분주 후 1.86% Na2EDT A 1 ml, 40 m M sodium

acet at e (pH 5.6) 2 m l, 0.87% 2- m ercapt oeth anol 1 m l를 넣었다. 여기에

choloylgly cin e hy drolase를 1.5 unit 넣은 후 37℃에서 18시간 in cubation하였다.

S am ple중의 담즙산을 추출하기 위해 incubat ion이 끝난 sample을 S ep - P ack

cart r idge C18 RP (Millipore Co., St . M aple , MA , U .S .A .)에 붓고 acet one 2 m l로

- 7 -

용출시켰다. 담즙산 추출에 앞서 S ep - P ack cartr idg e에 m ethan ol 2 m l를 부어

solv ation을 시킨 후 증류수 3 m l를 부어 S ep - P ack cartr idg를 sample m atrix와

같은 상태로 만들어주었다. S am ple을 붓거나 acet one으로 용출시킬 때 일정한 속

도로 용출시킴으로 추출 중 오차를 최소화하였다. 용출액을 N 2 gas로 증발시킨 후

5% anhy drou s m ethan olic hy drochloric acid 1 m l를 넣고 85∼90℃에서 1시간

동안 끓여 가온 처리 후 v acum n dry er로 증발시켰다.

2- 3. 담즙산의 유도화 과정

A lcoholic HCl을 이용하여 est er ification 후 유기용매를 증발시킨 다음 남은

sam ple를 담즙산의 hy droxy기를 유도화하기 위해 N ,O- bis (t r i- m ethylsily )

t riflu oro- acetamide :t r im ethyl- chlorosilane (BST F A : T M CS =99:1 v/ v , 1% BST F A )

(Sigm a Ch em ical Co., St . Rouis , M O, U .S .A .) : N - tr im ethylsily lim idazole (Sigm a

Chem ical Co., St . Rouis , M O, U .S .A .) : pyridin e (T edia co., F airfield , OH ,

U .S .A .) (1% BST F A : T M SI : pyridin e = 3:3:8)를 각 sample에 50 ㎕씩 분주하

여 80℃에서 40분간 반응시켰다. 이때 담즙산 표준물질 lith cholic acid (LCA ),

deox y cholic acid (DCA ), ch enodeox y cholic acid (CDCA ), cholic acid (CA ),

urthodeox y cholic acid (UDCA )도 동일하게 est er ificat ion 후 유도화시켰다. 유도화

된 sam ple은 실온화하여 1 ㎕를 GC- M S로 분석하였다.

2- 4. GC- M S (기체 크로마토그래피- 질량분석기)에 의한 분석

분석 장비 GC- M S는 GCM S - QP 5000 (Shim adzu , Japan )을 사용하였으며 분

석 컬럼은 길이 30 m , 직경 0.32 m m , 필름두께 0.25 ㎛의 fu sed silica capillary

column인 DB - 1(J&W S cient ific, F olsom , CA , U .S .A .)을 사용하였다.

시료 주입부의 온도는 250℃, int erface의 온도는 300℃, 컬럼의 온도는 190℃에

서 1분 항온 후 280℃까지 분당 20℃씩 항온 후 300℃까지 3℃씩 항온하였다.

Carr ier g as로 헬륨을 사용하였으며 컬럼의 압력은 25.6 kP a , split r at io는 10:1로

조절했으며 이온화전압은 70 eV였다(T able 2).

- 8 -

T able 2. GC- M S condit ion for an aly sis of bile acids

Ins tr um en t : QP - 50 0 0 (Shim adzu , Japan )

Car r ie r g as : He (9 9 .9 99 % p ur ifie d)

Column : fu sed silica capillary colum n DB - 1

Column len g th (m) : 30

Column diam e t er (mm) : 0 .3 2

Column pr es s ur e (kP a) : 2 5 .6

Column flow (ml/ min ) : 1.0

Sp lit r a t io : 10 :1

T ot a l flow : 1 1.6

Inj e c t ion p or t t e mp er atur e : 2 50 ℃

In t e r fac e p or t t e mp er atur e : 30 0 ℃

Ov en t e mp er a tur e pr ogr am : 190 ℃ h old for 1 min

20 ℃/ min un t il 2 80 ℃

3 ℃/ min un t il 30 0 ℃

S amp le inj e c t ion v olum e (㎕) : 1

2- 5. 자료분석 및 담즙산 정량

동일한 조건에서 분석한 표준물질의 r etent ion t im e (RT )과 질량스펙트럼, 정량

이온분자 (t arget m/ z)를 프로그램화하여 각 담즙산를 확인하였고 5종의 표준 물

질 0, 2.5, 5, 10, 25 ㎍를 검체와 동일하게 esterificat ion 후 유도화하여 검량선을

작성하였다. 작성한 표준물질의 검량선의 각 담즙산 peak의 면적을 구하여 정량에

이용하였다. 모든 검체마다 내부표준물질 NDCA를 첨가하여 추출상의 오차를 최

소화하였다.

- 9 -

III . 결과

1 . GC - M S 를 이용한 담즙산 분석

1- 1. 표준담즙산의 chrom atogram

표준 담즙산을 유도화과정 후 조건화된 GC- M S로 분석한 결과 F ig . 3A에서

와 같이 분리능이 좋고 유도체가 안정한 각 담즙산별 peak를 확인할 수 있었다.

GC에서 분리된 담즙산들의 표준물질의 RT 를 비교하여 각 담즙산을 구별할 수 있

었고 M S에서 각 담즙산의 질량 스펙트럼을 W iley library로 확인한 후 유도화된

담즙산의 특정이온을 선택하여 프로그램화하였다(F ig 3, T able 3).

T able 3. Bile acids identified by GC- M S

BA s RT (m in ) S .I.(m/ z) R .I.(m/ z)NDCA 9 .0 2 3 5 6 194LCA 9 .4 5 3 7 2 3 5 7DCA 9 .9 3 3 70 2 5 5CDCA 10 .10 3 70 3 5 5CA 10 .2 3 4 5 8 3 6 8UDCA 10 .34 4 60 3 70

* RT : Retent ion t im e, S .I.(m/ z) : S elected ion , t arget ion .

R .I.(m/ z) : Reference ion .

- 10 -

F ig . 3. Chrom at ogram of bile acids m ethyl est er - T M S ether s .

A : T ot al ion s chrom atogram of bile acids ;

B : S elect ed ion s chrom at ogram of bile acids .

1= NDCA , 2= LCA , 3= DCA , 4= CDCA , 5= CA , 6= UDCA

- 11 -

F ig . 4A . M ass spectrum of ch olic acid deriv at ized .

B . M ass spectrum searched w ith W iley library of ch olic acid

deriv atized.

- 12 -

1- 2. 표준 검량량선의 평가

표준 담즙산의 검량선은 각 담즙산의 선택이온분자와 내부표준물질의 선택이

온분자의 면적비와 각 담즙산 양에서 구하였다. 각 담즙산의 검량선의 R 2 값은

LCA가 0.998689, DCA가 0.999611, CDCA가 0.990978, CA가 0.992984, UDCA가

0.998264로 직선성이 우수했다 (F ig . 5).

F ig . 5. Calibration curv es of select ed ion of bile acids .

* A s : Standard area , Ai : In tern al stan dard area ,

Cs : Stan dard concentr ation , Ci : Int ern al st an dard concentration .

- 13 -

1- 3. 검체에 따른 담즙산 추출법

위액에서 유기용매를 이용한 추출법과 혈청에서 S ep - P ack cart ridge를 이용한

추출법은 효과적으로 담즙산을 추출하여 chrom at ogram에서 각각의 분리된 RT 를

가지는 peak들을 확인할 수 있었다 (F ig . 6, 7).

F ig . 6. Chrom at ogram of bile acids in ga stric ju ice.

9= NDCA , 11= LCA , 14= DCA , 15= CDCA , 16= CA

- 14 -

F ig . 7. Chrom at ogram of bile acids in serum .

1= NDCA , 2= LCA , 3,4= ch olest erol, 5= DCA , 7= UDCA

- 15 -

2 . 위 절제술 전·후의 위액에서의 담즙산 농도 변화

위 절제술을 시행받은 환자 18명의 수술 전·후 위액에서의 담즙산 분석결과

DCA는 14명, LCA는 5명, CA는 15명, CDCA는 14명이 수술 이후에 증가된 결과

를 보였다(F ig . 8, 9).

F ig . 8. P roportion s of in creased BA s in gastr ic juice of g astr ect om ized

patient s .

- 16 -

F ig . 9. V ariat ion s of concentr at ion s of each bile acids in gastr ic ju ice

before (filled m ark s ) and after (open m ark s ) ga strectom y .

□ DCA , ○ LCA , ◇ CA , and △ CDCA .

- 17 -

3 . 담석증 환자에서 소장 통과 시간 평가

GC- M S를 이용한 UDCA측정으로 담석증 환자 및 대조군의 소장 통과 시간

측정과 채취한 담석의 분석결과 전체 52명중 혼합 콜레스테롤 담석증은 14명이었

으며 이중 10명에서 소장 통과 시간이 240분 이상의 결과를 보였다(T able 4).

T able 4. Sm all in test in al t r an sit t im e in control and patient s w ith gallst on es

Sm all

intestinal

tr ansit time

(min )

Controls

(n =7)

Black stone

(n =4)

Brow n

pigmented

stone

(n =8)

Mixed

cholesterol

stone

(n=14)

Pure

cholesterol

stone

(n =4)

None*

(n =15)

60 3 1 290 1 1 1120 1150 1 1180 1 2 1210 2240 3 3 6 3270300 1 2 5330 2 1 1360 2 2 3

* none ; g allst on es w as n ot seen or n ot obt ained from cholecy stectom y .

- 18 -

IV . 고찰

GC- M S를 이용한 담즙산 분석을 위해서는 검체에서의 담즙산 추출과 유도화,

GC- M S에서의 분석 과정이 필요하다. 체내의 담즙산은 결합형 또는 비결합형으로

존재하는데 결합형의 경우는 protein , st erols , fr ee fat ty acids , b ile pigm ent s 등과

결합되어 있어서 GC- M S 분석 전에 이러한 물질들을 제거해주어야 한다. Nair등

(22)은 alkalin e hy droly sis법을 이용하여 담즙산의 결합물을 분해하였고, Bat ta등

(7,8)은 alkalin e hy droly sis법뿐만 아니라 효소를 이용한 결합형 담즙산 분해법을

소개하였다.

본 실험에서는 alk aline hy droly sis법을 이용하여 담즙산의 결합물을 제거하고

자 하였으나 높은 온도와 압력으로 인해 담즙산 자체가 파괴되어 너무 많은 부

산물 생성하여 담즙산 peak를 확인할 수도 없었다. 반면에 담즙산의 주 결합체인

gly cine과 t aurine을 가수분해하는 choloylgly cin e hy drolase를 사용한 효소법은 위

액과 혈청에서 결합형의 담즙산을 효과적으로 분해하여 비결합형의 담즙산 peak

들을 분석할 수 있었다(F ig . 6, 7).

또한 담즙산은 체액의 종류에 따라 담즙산의 농도와 영향인자가 다르므로 추

출하는 방법에 따라 추출효율도 다르다. Bat t a등(7)은 혈청, 담즙등 체액종류에 따

라 다양한 추출방법을 소개하고 있다. 담즙처럼 담즙산이 많고 상대적으로

protein과 ch olest erol이 적은 위액에서는 유기 용매 ethyl acet at e를 이용하여 간편

하고 손쉽게 담즙산을 추출할 수 있었고 분석결과도 좋았다 (F ig 6). 이때 담즙산

추출효율을 증대시키기 위해 6N HCl을 일정량 넣어주어 산성화한 후 ethyl

acet at e로 추출하였다. 반면에 혈청처럼 담즙산량이 적고 prot ein과 ch olest erol이

많은 경우에는 이러한 간섭물질들을 효과적으로 제거하는 것이 중요하다. 이러한

문제를 해결하기 위해서 S ep - P ak cart ridge를 이용하여 혈청중의 담즙산을 추출하

였다. 분석하고자 하는 담즙산 종류에 따라 S ep - P ak cart ridge의 solid 성분과 용

출액의 종류를 선택하여 추출효율을 최대화할 수 있으며(24,29,33), 본 실험에서는

6종의 담즙산만을 분석하므로 Batt a 등(9)의 방법을 따라 C18 RP S ep - P ak을 사

용하였고 용출액도 acet one을 사용하여 추출효율을 높였다(F ig . 7).

- 19 -

담즙산은 steroid구조에 carbox yl기와 hy droxyl기를 가지고 있는데 이것들은

모두 극성이 큰 작용기이고 담즙산 자체가 비휘발성 물질이므로, 이들을 비극성의

작용기로 치환하여 분석 컬럼에 흡착하는 것을 방지하여 분리가 잘되고 높은 감

도의 결과를 얻도록 하는 과정이 필요하다. 대개 carbox yl기는 m ethyl, ethyl,

isobutyl, n - propyl등으로 est erficat ion하고 hy droxyl기는 acylation 또는 sily lat on

하는데 acylat ion은 유도체가 불안정한 단점이 있다(7,10,22). 본 실험에서는 먼저

carboxyl기를 5% anhy drou s m ethan olic hy drochloric acid로 ester ificat ion했고

hy drox yl기는 1% BST F A , T M SI와 pyridin e (3:3 :8) 혼합액으로 sily lat ion하였다.

고전적으로는 hex am ethyldisilazan e, tr im ethylchlorosilan e, pyridine를 3:1:9

(V/ V/ V ) 혼합액으로 sily lation하나(9,28), 본 실험에서는 1% BST F A , T M SI와

pyridine를 3:3:8로 혼합한 시약을 사용하였고 F ig . 3,6,7과 같이 유도체가 안정한

담즙산 peak들을 얻을 수 있었다. 위액이나 혈청뿐만 아니라 대변 등과 같은 다른

체액 등에서 효과적으로 담즙산 추출이 이뤄지고 본 실험에서 분석한 담즙산외에

추가 담즙산이나 결합형 담즙산 분석이 GC- M S에 조건화가 이뤄진다면 담즙산이

관련된 소화기질환의 병인 등을 규명하고 치료하는데 좋은 자료로 사용될 것으로

사료된다.

위 절제술을 시행받은 환자에서 나타나는 위,장관물질의 역류로 발생한는 위염

은 주요 역류물질인 담즙산의 성분, 형태와 농도등에 의해 그 질병 정도가 차이를

보인다. M asci(21,27)등은 담즙산 성분과 위점막 손상과의 상관성을 보여주었고, 1

차 담즙산보다 소수성이 큰 2차 담즙산이, g ly cine 결합형보다는 t aurine 결합형이

위 점막에 더 유독한 것으로 보고하였다(14,18,21).

본 실험에서는 위 절제술을 시행받은 환자 18명을 대상으로 위액에서 수술 전

ㆍ후의 비결합형 담즙산을 분석하여 수술 이후에 각 담즙산 성분의 농도변화를

통해 각 담즙산 성분의 증가 여부 및 증가율을 관찰하고자 하였다. 위 절제술 이

후에 위액에서 담즙산 변화는 전체 담즙산의 38% 정도를 차지하는 CA (13)는 전

체 18명중 15명에서 수술 후에 증가했고(83.33% , p =0.0467), 34% 정도를 차지하는

CDCA는 14명에서(77.78% , p =0.03535), 28%를 차지하는 DCA도 14명 (77.78% ,

p =0.0846)에서 증가했다. 그러나 LCA의 경우는 전체 18명중 단지 5명에서 약간의

- 20 -

증가정도를 보였는데(27.78% , p =0.29772), 이것은 전체 담즙산중 LCA가 차지하는

비율이 1∼2%로 낮기 때문에(13) 상대적으로 수술 후에도 변화 폭이 적은 것으로

생각된다. 주요 담즙산인 CA와 CDCA는 증가율도 83.33%와 77.78%로 컸으며 p

값이 각각 0.0467과 0.03535로 위 절제술 후에 유의하게 증가된 것으로 나타났다.

DCA는 p값이 비록 0.08463로 유의성이 적은 것으로 나타났지만 전체 18명중 14

명이 증가한 것을 고려할 때 증가경향을 보인다고 할 수 있다. 위액에서 담즙산

분석을 통해 위절제술 후에 1차 담즙산인 CA와 CDCA가 유의하게 증가되었고 전

체 담즙산 중 차지하는 비율에 따라 CA , CDCA , DCA , LCA순으로 증가율을 보

였다(F ig . 8). 기존에 담즙산 분석 방법으로는 전체 담즙산만을 측정할 수 있었으

나 GC- M S를 이용한 담즙산 분석은 각각의 담즙산 분석을 가능하게 하여 위 절

제술 이후에 위액에서 각 담즙산 성분별 농도 변화를 관찰할 수 있게 하였다 (F ig .

9).

최근 일부 콜레스테롤 담석증 환자에서 소장의 운동성이 감소되어 있다고 보

고되면서(16,35) 콜레스테롤 담석 생성의 병인으로서 소장 및 대장의 역할에 관심

이 모아지고 있다(15,34). 이미 이진우등(6)은 콜레스테롤 담석증 환자에서 소장통

과 시간을 측정하여 정상군보다 콜레스테롤 담석증 환자군에서 유의하게 소장 통

과 시간이 지연되었음을 확인하였다. 본 실험에는 갈색 색소성 담석 및 흑색 색소

성 담석뿐만 아니라 순수 콜레스테롤, 그리고 혼합 콜레스테롤 담석증 환자군에서

소장통과 시간을 측정하였다. 우리나라에 많은 혼합 콜레스테롤 담석증 환자 14명

중 10명이 240분 이상의 지연된 소장 통과 시간을 보임을 관찰할 수 있었다. 그러

나 순수 콜레스테롤 담석증 환자 4명중 2명은 180분에, 2명은 60분의 소장 통과

시간을 보이는 불일치된 결과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 순수 콜레스테롤

담석증 환자군이 4명으로 통계적 의의가 적었으며 60분의 소장 통과 시간을 보

인 결과는 실험상의 오차에 기인한 것으로 추정된다. 60분의 소장 통과 시간을 보

이는 갈색 색소성 담석증 3명, 혼합형 담석증 1명, 순수 콜레스테롤 담석증 2명이

baseline에서 UDCA가 최고치를 보이는 결과는 실험상의 오차로 추정된다. 본 실

험을 통하여 한국인 콜레스테롤 담석증 환자에서도 소장 운동성 저하로 소장 통

과 시간이 지연된 군이 있음을 알 수 있었다.

- 21 -

V . 결론

GC- M S의 우수한 분리능과 민감성이 우수한 점을 이용하여 미량의 분석이 필

요로하는 임상분야에 활용하여 담즙산 분석을 하였다. 이를 소화기 질환에 활용하

여 위 절제술 전·후의 위액에서의 각 담즙산 성분의 농도 변화와 담석증 환자의

혈청에서 UDCA를 분석하여 소장 통과 시간을 측정하고 평가하였다.

1. 표준 담즙산의 RT 는 NDCA가 9.02, LCA가 9.45, DCA가 9.93, CDCA가

10.1, CA가 10.23, UDCA가 10.34분으로 분리도가 좋았다.

2. 표준 담즙산 검량선의 R2값은 LCA가 0.998, DCA가 0.999, CDCA가 0.990,

CA가 0.992, UDCA가 0.998로 직선성이 우수하였다.

3. 위 절제술 전ㆍ후에 위액에서 각 담즙산 성분의 농도 변화는 CA와 CDCA

가 p값이 0.05 이하로 유의하게 증가하였고, DCA는 p값이 0.0846로 통계적 유의

성은 보이지 않았지만 전체 18명중 14명에서 증가한 결과를 보임으로 증가 경향

을 나타냈으며 전체 담즙산 중 낮은 비율을 차지하는 LCA는 p값이 0.29772로 유

의성이 없었다.

4. 한국인의 혼합 콜레스테롤 담석증 환자 14명 중 10명에서 소장 통과 시간이

240분 이상으로 지연됐음을 관찰할 수 있었고 이를 통해 일부 한국인의 혼합 콜

레스테롤 담석증 환자군에서 소장의 운동성이 저하되어 있음을 알 수 있었다.

결론적으로 체액의 종류에 따라 담즙산을 추출한 후 GC- M S를 이용하여 담즙

산을 분석하였고 이를 임상 소화기 질환인 역류성 위염과 콜레스테롤 담석증 병

인 연구에 활용하였다. 담즙산 뿐만 아니라 임상에서 미량의 정성 및 정량 분석에

GC- M S의 활용도와 유용성이 증가할 것으로 사료된다.

- 22 -

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Isolat ion an d characterizat ion cholic acid 7- dehy drox ylat ing fecal bacteria from

cholest erol g allst one patient s . J . of H epatology . 32: 4- 10

35. XU Q, S cot t RB, T an DT M , Shaffer EA . 1996. Slow int estinal t r an sit : a

m ot or disorder contr ibut in g to cholesterol gallst on e form at ion in the groun d

squirr el. H epatology . 23: 1664- 1672

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Abs tr a ct

B ile ac ids analy s is by GC- MS and c lin ic al app lic at io n

Jang , Jin - y e on

Dep t . of Biom e dic al Lab or a t or y s c ien ce

T h e Gr adu at e S ch ool

Yons e i Un iv er s ity

Gas chr om at ogr aph y - m as s s p e ctr om e t er (GC- MS ) is an an alys is

m e th od comb in e d w ith GC an d MS . T h e ut ility h as b e en in cr e as e d n ot on ly

in an a ly t ic ch e mis tr y ar e as b ut a ls o in c lin ica l ar e as n e e de d t o an alyze

micr o - c omp oun ds , as a ll th e mix e d c omp oun ds c ould b e an aly ze d a lm os t

w ith th e ir r e t ent ion t im es an d m as s s p e c tr ums . Bile ac ids an a lys is b y

GC- MS an d its app lica t ions w er e app lie d in s tu dies on th e p a th og en es is of

g as tr ic dis e as es - r e flux g as tr it is an d ch oles t e r ol g a lls t on e as s oc iat e d w ith

b ile a cids . Bile ac ids - n or de ox y ch olic a cid(NDCA) , lith o ch olic ac id(LCA) ,

de ox y ch olic ac id(DCA) , ch en ode ox y ch olic a cid(CDCA) , ch olic ac id(CA),

ur th ode ox y ch olic a cid(DCA) w er e an aly ze d b y GC - MS . GCMS QP - 50 00 an d

DB- 1 w er e us e d for quan t it at ion of b ile ac ids . Bile a cids in b io logic al flu id

w as h y dr olyze d with ch oly lg ly cin e h y dr olas e an d un c onj ug a t e d b ile a cids in

g as tr ic j uic e an d s er um w er e e x tr a ct e d w ith e th y l ac e t at e an d S ep - P a ck

car tr idg e r es p e c t iv e ly . Bile a cids e x tr ac t e d w as tr e a t e d with 5% anh y dr ous

m e th an olic anh y dr o ch lor ic a cid an d N ,O- bis (t r i- m ethylsily )t r ifluoroacet am ide :

t rim ethyl- chlorosilane (BST F A : T M CS =99:1 v/ v , 1% BST F A ) :

N - tr im ethyl- sily lim idazole : pyridin e (1% BST F A : T M SI : pyridine = 3:3:8) for

the deriv at ization . T he ret ention tim es an d the selected ion s of bile acids w ere

u sed for qu antitaion . T he linearities of calibr at ion curv es w ere ex cellent (R2 >

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0.990).

E igh t e en p a t ien ts w er e s tu die d for th e e x ch ang e of b ile a cids

con cen tr a t ions in g as tr ic j u ice aft e r a g as tr e c t omy . S ev en c on tr ols w ith

g a llb la dder p olyp lar g er th an 1 cm un der g on e pr oph y lac t ic ch ole cys t e ct omy

an d for ty - fiv e p a t ien ts w ith ch ole cys t it is or s ymp t omic g allb ladder

g a lls t on e or as y mp t om ic g allb ladder g a lls t on e w ith lar g er th an 2 .5 cm w er e

s tudie d for th e m e as ur e of s m all in t es t in al tr ans it t im e . Ur th o de ox y ch olic

ac id w as or a lly a dmin is t e r e d in th e fas t in g s t a t e an d s er um s p e cim ens

w er e ob t ain e d s u cc es s iv e ly ev er y 30 min ut e for 6 h our s . T h e t im e for

th e p e ak of UDCA in th e s er um w as de t e r min e d th e s m all in t es t in al

tr ans it t im e . Galls t on es of th e s ubj e c ts w er e ob t ain e d fr om

ch ole cys t e ct om y .

T h e pr op or t ions of in cr e as e d CA , CDCA , DCA an d LCA w er e 8 3 .3 3 %

(p =0 .04 6 7) , 7 7 .7 8% (p =0 .0 3 53) , 7 7 .7 8 % (p =0 .0 84 6) an d 2 7 .7 8 %

(p =0 .29 7 7) , r es p e ct iv e ly .

T h e mix e d ch oles t e r ol g alls t on e p at ien ts w er e 14 out of 5 2 s ubj e cts .

T h e s m all in t es t in al tr ans it t im es of 10 of th e 14 p at ien ts w er e pr olon g e d

ov er 24 0 min ut es .

In con c lus ion , th e ut ility of GC- MS c ould b e app lic at e d in clin ic al ar e as

n e e de d t o an aly ze m icr o - comp oun ds an d its u t ility an d av ailab ility w ould

b e in cr e as e d .

K e y w or ds : GC - MS , Bile ac id , Re flux g as tr it is , Ch oles t e r ol g alls t on e

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