核酸シャペロン材料を利用した 高感度分子ビーコン...
TRANSCRIPT
核酸シャペロン材料を利用した 高感度分子ビーコンシステム
九州大学先導物質化学研究所 丸山厚
（名大：浅沼 浩之先生との共同開発）
核酸シャペロン活性!!
核酸ハイブリダイゼーションの
促進と厳密化
人工材料で初めて 核酸シャペロン活性を再現
核酸高次構造の維持
可溶性高分子電解質複合体
（ソフトな複合体)
核酸間静電反発の抑制
核酸間認識の強化
ハイブリッド形成の促進と
ハイブリッドの安定化
PLL: 10 wt%
Dex: 90 wt%
人工材料で初めて 核酸シャペロン活性を再現
ハイブリッド形成促進効果 数百倍加速 核酸鎖交換反応促進効果
核酸シャペロン効果で正確なハイブリッド形成 核酸ハイブリッド安定化効果
ハイブリッド形成率を高め検出感度を向上 核酸特異的結合性 検体採取の効率化、簡便化、 検体の保護
PLL: 10 wt%
Dex: 90 wt%
試料採取から検出まで遺伝子解析を総合的・多面的にサポートし、
人と場所を選ばない簡便さと迅速、信頼性を両立、 POC診断、感染症対策、個人化医療へ貢献
PLL-g-Dex
スクランブル配列
0.5 nM DNA (1 pmol ), 20 ℃, 10 mM sodium phosphate buffer ( pH 7.2 ), 150 mM NaCl
DNA alone
20 mM Mg2+
Target DNA
Probe
DNA
スクランブル配列 PLL-g-Dex
速度定数
k/106 M-1 S-1
DNA alone 5.8
20 mM Mg2+ 26.8
1 M NaCl 39.7
PLL-g-Dex 1070
くし型共重合体の核酸シャペロン活性 “ハイブリッド形成を200倍加速”
100
0
25
50
75
0 1 2 3 4 5
インキュベーション時間 / min 鎖
交換
率 (
%)
人工シャペロンあり
人工シャペロンなし
Chem. Eur. J, (2001)
J. Am. Chem. Soc., (2002)
Nucleic Acids Res., (2007)
天然のタンパク質を凌駕するシャペロン活性
相補的 一本鎖DNA
核酸塩基対の解離、再結合を顕著に促進
解離、再結合にかかわるエネルギー障壁を低めている。
→核酸シャペロン活性
2万倍の加速
（天然の400倍）
モレキュラービーコンの概要 モレキュラービーコン (MB)
末端に蛍光色素と消光色素が導入されたヘアピン構造のオリゴヌクレオチド
Stem領域 Loop領域
ターゲット遺伝子非存在下 色素同士が近接
ターゲット遺伝子存在下 色素同士が離れる
蛍光色素の発光が抑制される 蛍光色素が発光する
ターゲット遺伝子
MBの用途
・遺伝子由来の病気の検出 ・細胞内でのRNA発現解析 ・Real-Time PCR
非常に簡便なツール!!
Tyagi S and Kramer FR , Nat. Biotechnol, 1996, 14, 303-308.
モレキュラービーコンの長所・短所
MBの長所
・プローブの設計が容易 ・消光機構が内在している ・任意の蛍光色素が使用できる ・高い汎用性
MBの短所
・末端色素のBreathingによる消光能の低下 ・複数の色素の導入が困難 ・基板上に固定化する際に新たな位置への リンカー修飾が必要
従来のMBの問題
「末端」に色素が導入されているという点
色素の導入位置を「Stem領域内」に変えた新たなMBを作成
インステムモレキュラービーコンの概要 インステムモレキュラービーコン (ISMB)
D-Threoninolを足場に用いて疑似ヌクレオチド化した蛍光色素－消光色素対をStem領域内部に導入したモレキュラービーコン
H. Kashida et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 7044-7047.
Y. Hara et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 5502-5506.
ISMBの特長
・DNA塩基対間で蛍光色素と消光色素が会合する ・Breathingの抑制によってバックグラウンド蛍光が低減 ・末端の修飾が容易となる ・Stem領域の任意の場所に任意の数の色素が導入可能
従来のMBの短所を克服し、より高感度なプローブの開発に成功
本研究の目的 ISMBとシャペロンポリマーを用いた
理想的なMBシステムの構築
①高感度 －シグナル/バックグラウンド比（S/B比)が大きい－
理想的なMBシステムの条件
②応答速度が速い
Stem領域を短くすると・・・
Stem領域の丌安定化に伴いバックグラウンド蛍光が大きくなってしまう
色素対数の増加
バックグラウンド蛍光の低減 ターゲット遺伝子存在下の蛍光強度増大
Stem領域の解離速度＋ターゲットとの二重鎖形成速度が重要
戦略① -ISMB-
色素対を複数導入する＋Stem領域を長くする
ターゲット遺伝子存在下
蛍光色素の増加に伴う蛍光強度の増大
ターゲット遺伝子非存在下
Stem領域の安定化による効率的な消光
Stem領域の長鎖化 =
従来のISMB 新規ISMB
S/B比の向上が期待できる
戦略② -PLL-g-Dex-
カチオン性グラフト共重合ポリマーの併用
Poly(L-lysine)-graft-dextran
(PLL-g-Dex)
核酸と水溶性ポリイオン複合体を形成 ＋
L-lysineの正電荷によって 核酸主鎖間の静電反発を緩和
A. Maruyama et al., Soft Matter, 2008, 4, 744-747.
1. Stem領域の安定化→バックグラウンド蛍光の抑制 2. 鎖交換の促進→応答速度の向上 3. 二重鎖の安定化→蛍光強度の増大
設計配列 Target：3’-ACGCCACCAGGAACTCTTTCCCG-5’ (Survivin gene)
MBt：5’-ETGGTC-CTTGAGAAAGGGC-GACCAQ-3’
MB1：5’-TGGETC-CTTGAGAAAGGGC-GAQCCA-3’
MB2：5’-TEGGETC-CTTGAGAAAGGGC-GAQCCQA-3’
MB3：5’-GEGTEGGETC-CTTGAGAAAGGGC-GAQCCQACQC-3’
MB4：5’-GECGEGTEGGETC-CTTGAGAAAGGGC-GAQCCQACQCGQC-3’
色素
Perylene
(E)
Anthraquinone
(Q) Stem領域：9 base pairs ＆ 4 dye pairs
Stem領域：5 base pairs ＆ 1 dye pair
Stem領域：5 base pairs ＆ 1 dye pair
Stem領域：5 base pairs ＆ 2 dye pairs
Stem領域：7 base pairs ＆ 3 dye pairs
バックグラウンド蛍光の比較
Conditions
[MB] = 0.2 µM, [Target] = 0 µM
[NaCl] = 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer)
Ex. = 425 nm, Em. = 460 nm, 20 O
C
MB
従来型MBでは・・・
バックグラウンド蛍光が大きい
ISMBでは・・・
バックグラウンド蛍光が低減
MB + PLL-g-Dex
PLL-g-Dexの添加により・・・
さらに効率よく消光
ターゲット遺伝子存在下の蛍光の比較
Conditions
[MB] = 0.2 µM, [Target] = 0.8 µM
[NaCl] = 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer)
Ex. = 425 nm, Em. = 460 nm, 20 O
C
MB/Target
MB1,MB2では・・・
色素対増加に伴い蛍光強度上昇
MB3,MB4では・・・
効率的に開かず蛍光強度低下
MB/Target +
PLL-g-Dex
PLL-g-Dexの添加により・・・
蛍光強度が大幅に増大
×45
カチオン性グラフト共重合ポリマーを併用することでISMBの超高感度化に成功
S/B比の比較
S/B比＝571を達成
PLL-g-Dex存在下
×13
MBの検出限界 PLL-g-Dex存在下で最高感度を示したMB3
＋
[Target] / [MB] = 1/1000
[Target] / [MB] = 1/100
460 nmの蛍光強度比
Targetなし
Conditions
[MB] = 0.2 µM = 200 nM, [Target] = 0.2, 2 nM
[NaCl] = 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer)
Ex. = 425 nm, 20 O
C
バックグラウンド蛍光の低減により 十分な蛍光強度比が得られている
低濃度の検出が可能に!!
応答速度の評価
MB3
20oC
PLL-g-Dex非存在下
kobs = 6.1 × 10-4 [s-1]
PLL-g-Dex存在下
kobs = 7.2 × 10-3 [s-1]
Conditions
[MB] = 0.2 µM, [Target] = 0.4 µM
[NaCl] = 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer)
Ex. = 425 nm, Em. = 460 nm, 20 O
C
×10 約 5 分で平衡状態に到達
結論 色素対を複数導入したISMBとカチオン性グラフト共重合ポリマーの併用で、
・高感度化（S/B比＝571）
・反応時間の高速化
・検出限界の向上
・特異的な配列認識能の向上 を達成した。
S/B比＝571 約5分で平衡到達
